JP3362261B2 - 検査試料中のカルシウム検定のための比色法と試薬 - Google Patents

検査試料中のカルシウム検定のための比色法と試薬

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】本発明はカルシウムイオン測定、特に血
液および他の生理学的流体中のカルシウムイオンの測定
に有用な新規の方法および試薬に関する。
【０００２】
【先行技術の説明】カルシウムはその監視が患者の健康
の評価において医師を援助する重要な電解質である。大
部分の体液において通常比較的安定なカルシウム水準
（血液において８．２〜１０．３ｍｇ／ｄｌ）での変化
は種種な病理学的状態の存在を示してもよい。正常より
有意義に低いカルシウム水準は上皮小体機能減退病、ビ
タミンＤ欠乏または腎炎を示してもよい。正常より大き
い価は上皮小体機能亢進症、ビタミンＤ中毒または骨髄
腫を示してもよい。それ故、異常なカルシウム水準によ
り明らかにされるどんな病気でも早期に検出するため
に、カルシウム測定方法は非常に正確で精密でなければ
ならない。
【０００３】カルシウム測定には多くの化学的および物
理的方法が知られている。直接的な比色法が手間のかか
る沈殿法、重量法または滴定法より好ましい。一般にそ
のような比色法は染料のカルシウムイオンとの醋体形成
を伴い、その染料の吸収において測定可能なシフトを与
える。
【０００４】大部分の流体中のカルシウムイオンの測定
における潜在的問題は潜在的に妨害するイオン（例えば
マグネシウムまたは鉄）あるいは大分子（例えば蛋白質
またはビリルビン）の存在である。マグネシウムイオン
はカルシウムイオンと醋体形成する同じ化合物と醋体形
成する傾向がある故に、特に困難な問題を与える。従っ
て、先行技術はカルシウム測定に先立ち検査試料から物
理的にマグネシウムイオンを除去できるかあるいはマグ
ネシウム特異的醋体形成試薬を用いマグネシウムイオン
を遮蔽できる方法を開発した。
【０００５】カルシウムイオンについて非常に選択的な
化合物はＢｉｏｃｈｅｍ．，１９，２３９６−２４０４
頁（１９８０）でＴｓｉｅｎにより記述されている。そ
こに記載されている親化合物は普通ＢＡＰＴＡとして知
られている、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エ
タン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸である。これら
の化合物は電磁スペクトルの紫外領域において吸収す
る。このことは、アナライト（ａｎａｌｙｔｅ）溶液例
えば血漿、髄液、尿および他の体液中に見出される他の
種例えばビリルビン、ヘモグロビン、他のポルフィリン
種およびポルフィリンの代謝副生物もまたＵＶおよび電
磁スペクトルの短可視波長部分で吸収し、標準的比色器
機および方法に対するバックグラウンド妨害を作り出す
故に、重大な障害である。それ故、より長波長で検出さ
れ、カルシウムと醋体形成した場合他の波長にシフトす
る高度に選択的なカルシウム醋体形成化合物を持ち、Ｕ
Ｖおよび短波長可視光吸収種からの妨害なしでカルシウ
ムの分析を可能にすることが望ましいと考えられてい
た。Ｔｏｎｅｒ等に対する米国特許第４，７９５，７１
２号はそのようなカルシウム醋体形成染料を記載してい
る。すなわち溶液および乾式検定においてカルシウムイ
オン測定に有用な１，２−ビス（ｏ−アミノアリールオ
キシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸の色原
体誘導体が開示されている。これらの化合物は、直接酢
酸置換窒素原子に結合し、その化合物に、醋体形成前は
４００ｎｍより一般に大きい波長で最大吸収を示すこと
を可能にする染料成分を包含している。この化合物がカ
ルシウムイオンと醋体形成すると吸収はより短波長にシ
フトする。
【０００６】テトラカルボキシ化合物に基ずく蛍光細胞
内カルシウム指示薬が米国特許第４，８４９，３６２号
に報告されている。その化合物は、それを混合細胞群中
の細胞内カルシウムイオン濃度の多重パラメーター流通
式細胞測定分析に有用にさせるより長い吸収波長特性を
持っている。
【０００７】初めにＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １
９５４，３７，１１３においてＡ．Ｇ．Ｆｌａｎｓｃｈ
ｋａ等により記述されたテトラカルボン酸キレートに基
ずくオルソクレゾールフタレインコンプレキソン法（Ｃ
ＰＣ法）は臨床検査室に最も受入れられる方法であると
考えられる。その広範囲な使用にも拘らず、この方法は
比較的短い試薬安定性、二酸化炭素に対する敏感さ、お
よび化学量論依存の、低濃度端における非直線性に悩ま
されている。さらにこの方法は自働化臨床分析器におけ
る試料処理数（分析速度または１時間当りの検査数）を
減少させている。本発明の色原体イオノフォアは試薬の
安定性を延長し、全範囲で直線性のある単一試薬法の開
発を可能にした。
【０００８】新規のカルシウム発色イオノフォアについ
ての可能性のある合成候補の計画の間考慮しなければな
らない主要な要素はカルシウムとの醋体形成での最大波
長（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｍａｘｉｍｕｍ）の深色シ
フトである。文献に報告されている多数の化合物は、通
常ＢＡＰＴＡとして知られている、１，２−ビス（ｏ−
アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テトラ
酢酸から導体されている。この構造を持つ色原体類似体
は受感（Ｓｅｎｓｉｎｇ）窒素原子に対しパラ位にある
発色団を含有し、カルシウム結合して最大波長の浅色シ
フトを示す。このことそれ自体、より短い波長にある潜
在的なスペクトル干渉のため望ましくない特性である。
更に加えて、試薬の初めの吸光度は通常非常に高い。
【０００９】ＣＰＣ法は２つのフェノールサブユニット
とフェノール性水酸基に対しパラ位についている発色団
とを結合しているテトラカルボン酸化合物を用いる。そ
のキレート部署と発色団システムとのそのような配置
は、陽イオンがそのリガンドの励起状態を安定化する故
に、カルシウムとの醋体形成で深色シフトを保証する。
それ故新しい化合物の開発において、同じ発色団配置を
保存するが、構造の中に比較的剛いテトラおよびトリア
リール骨格を組込むことが有利であろう。そのテトラお
よびトリアリールサブユニットは以前、ナトリウムおよ
びカリウム選択的結合剤の構成に用いて成功していた
し、フェノール性の受感原子に関し、カルシウムイオン
と極性の“巣”状相補物を形成するキレート化部署の高
度な事前構成を期待させる。キレート化基としてカルボ
ン酸成分を用いる新規の構造を選択した。
【００１０】本発明の化合物は一般に色原体オクタデン
タートテトラカルボキシル−ジフェノールとカルシウム
イオンとの相互作用で可視領域に色変化を生じさせるフ
ェノール化合物として記述できる。発色イオノフォアは
構造的には他のカルシウム醋体形成化合物とは異る。そ
れは４つの酢酸キレート化基と１つまたは２つの、剛い
テトラアリールまたはトリアリール骨格に結合するニト
ロフェニルアゾフェニル発色団とを組込んでいる。その
色原体化合物はカルシウムイオンと反応し、深色シフト
と、カルシウム濃度に比例した、５５０ｎｍにおいての
吸光度の増加とを生じさせる。
【００１１】従って、本発明の色原体化合物はカルシウ
ムイオンに対して感受性を示すことが見出された。その
色原体化合物は自働化された臨床分析器での使用に適合
する単一液体試薬中に組込み生理学的流体試料例えば血
液中のカルシウム濃度を決定できる。
【００１２】
【発明の目的】カルシウムイオン、特に血液および他の
生理学的流体中のカルシウムイオン測定に有用な新規の
検定方法および試薬組成物を提供するのがこの発明の目
的である。
【００１３】この発明の他の目的はそのイオンの迅速な
検定を可能にする、前記のような検定方法と試薬組成物
とを提供することである。
【００１４】本発明の尚他の目的は高度な選択性をもつ
前記のような検定方法と試薬組成物とを提供することに
ある。
【００１５】本発明の更に他の目的は特に測光臨床分析
器に適合する前記のような検定方法と試薬組成物とを提
供することにある。
【００１６】本発明の尚更な目的は在来の方法の代り
の、正確で、精密で、便利な方法を提供する前記のよう
な検定方法と試薬組成物とを提供することである。
【００１７】本発明の尚更な目的は前記のように試薬組
成物をマトリックス中に組込んだ乾式検査法を提供する
ことにある。
【００１８】本発明のその上の目的は均一な単一相溶剤
システム中、試料の前処理を必要としない分光測光法に
よる血清および他の生物学的流体中のカルシウム定量測
定を可能にする、前記のような検定法と試薬組成物とを
提供することにある。
【００１９】本発明の他の目的および特徴は以後一部分
明らかにそして一部分指摘されよう。
【００２０】
【発明の要約】簡単に述べれば本発明は構造式
【化１３】 （この式で、Ｒは水素原子、低級アルキル基または低級
アルケニル基であり、ＸはＣＨ2，ＣＨ2ＣＨ2，ＣＨ＝
ＣＨ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ2，Ｓ−ＳまたはＮＲであり、Ｗは
ＣＨ，Ｃ−ＯＨまたはＮであり、Ｍはｐ−ニトロフェニ
ルアゾ基、２，４−ジニトロフェニルアゾ基、２，４，
６−トリニトロフェニルアゾ基、ｐ−ニトロスチリール
基、ｐ−ベンゾキノンイミノ基、ビス−（４−ジメチル
アミノフェニル）ヒドロキシメチル基、３−フェニルイ
ソチアゾリル−５−アゾ基、チアゾリル−５−アゾ基ま
たはイソチアゾリル−５−アゾ基であり、ｋは０または
１であり、ｊは０または１であり、ｎは０または１であ
る）で表わされる新しい色原体化合物（Ｉ）の発見に存
する。
【００２１】血液中のカルシウム測定で特別に有用であ
ることがわかった、本発明の好ましい色原体化合物は、
Ｒが水素原子であり、ＸがＣＨ2であり、ＷがＣＯＨで
あり、Ｍがｐ−ニトロフェニルアゾ基であり、ｋとｊと
ｎとが凡て１である構造式（Ｉ）に基く色原体２標識テ
トラ酸ジフェノールである。この発色イオノフォアは結
合されている発色団２つを持つ比較的剛いテトラアリー
ル骨格を持ち、化学的にはビス［２−ヒドロキシ−３−
（２−アミノフェニル）−５−（４−ニトロフェニルア
ゾ）］メタンＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸として同
定される。
【００２２】構造式（Ｉ）で表わされる化合物は溶解さ
れているカルシウムの存在の検出のための試薬に組入れ
てもよい。そのような試薬組成物は構造式（Ｉ）で表わ
される化合物と１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のマグネシウム遮
蔽剤と緩衝剤とを包含している。好ましい試薬組成物は
前記の好ましい色原体２標識テトラ酸ジフェノールと約
０．０５ｖｏｌ％のマグネシウム遮蔽剤とこの試薬のｐ
Ｈを約８．５〜約９．２に調節する量で存在する緩衝剤
とを含む。カルシウムに対する感度増加のためこの試薬
組成物に界面活性剤を添加してもよい。若し所望ならば
また酸化防止剤を包含させてもよい。
【００２３】本発明の更にその上の態様は本発明の種種
な色原体化合物を合成する方法である。
【００２４】化合物と試薬組成物およびその使用と合成
と調製および実験結果を包含する本発明の範囲を以下に
述べる。
【００２５】
【好ましい態様の説明】以下の定義は本発明の範囲を明
らかにし、その処方と使用とを可能にするために提供さ
れる。
【００２６】ここで用いるように、“色原体”とは外部
刺戟に対する応答で検出可能な応答を発生させる化学シ
ステムの特性を意味する。それ故、イオノフォアはイオ
ンとの醋体形成に当り検出可能の応答を示すことができ
る場合それは色原体であり、その検出可能の応答は以下
に定義されるごとき色の変化にだけには限定されない。
【００２７】“検出可能の応答”なる術語は、直接の観
察または器機的の何れかにより認知でき、水性検査試料
中の特異のイオンの存在の関数である、そのシステム中
の性状の変化または外観の変化を意味する。検出可能の
応答の幾つかの例は一般に色原体応答とされている色、
蛍光、燐光、反射率、化学発光または赤外スペクトルに
おける変化または外観の変化である。検出可能の応答の
他の例は電気化学的性質、ｐＨおよび核磁気共鳴におけ
る変化であってもよい。
【００２８】本開示中に用いる術語“低級アルキル基”
は炭素原子約１〜４個を含有する、置換されているまた
はされていないアルキル部分を含む。低級アルキル基の
意味にはメチル基とエチル基とｎ−プロピル基とイソプ
ロピル基とｎ−ブチル基とｓｅｃ−ブチル基とｔｅｒｔ
−ブチル基とが含まれる。これらは置換されてなくても
よくあるいは、置換基がカルシウムイオン検出能力の点
で本請求の検査法または装置の操作または機能を妨害し
ないという条件の下で置換されていてもよい。ここで用
いる“アリール基”とは炭素原子６〜１２個を含有する
置換または置換されていないアリール部分例えばフェニ
ル基とトリル基とブチルフェニル基とナフチルエチル基
とクロロフェニル基とニトロフェニル基とカルボキシフ
ェニル基とを含む。“低級アルケニル基”はビニル基ま
たは低級アルキル置換ビニル基を意味する。
【００２９】構造式（Ｉ）で表わされる化合物は構造の
部分として、カルシウムイオンと構造式（Ｉ）で表わさ
れる化合物とにより醋体が形成された場合その物理化学
的特性を変化させることが出来る特別な種類の化学的に
配置された部分を含んでいる。即ち、若し他のイオンが
存在しようとしまいと、検査試料中にカルシウムイオン
が存在すれば、その物理化学的性状に検出可能な変化が
起る。そのような醋体形成に対する応答を示すこの能力
が、アナライトまたは目的イオンの検定における化合物
（Ｉ）の有用性に非常に貢献している。
【００３０】前記の構造式（Ｉ）で表わされる化合物
は、水性溶液として調製されて、カルシウムイオンの存
在の検出に有用であることが判っている試薬組成物中に
組入れることができる。構造式（Ｉ）で表わされる化合
物はカルシウムイオンと同様にマグネシウムイオンと醋
体形成する傾向を示す故に、人血清および他の生物学的
流体中に存在するマグネシウムイオンからのスペクトル
的妨害除去のため遮蔽剤が必要である。好ましい試薬組
成物は好ましい色原体２標識テトラ酸−ジフェニルに加
えて、濃度０．０５％（重量／容量）のマグネシウム遮
蔽剤を含む。適当な遮蔽剤の例は８−ヒドロキシキノリ
ンと８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸である。
本発明に用い得る他の適当な遮蔽剤は技術に熟達した人
人には容易に思い浮ぶであろう。
【００３１】試薬組成物はまた約８．５〜約９．２のｐ
Ｈ環境を提供するため緩衝剤を含む。
【００３２】試薬に界面活性剤を添加することが試料中
のカルシウムのより一層正確で精密な分析を可能にし
て、カルシウムに対するこの発色イオノフォアのスペク
トル的応答を増大することが発見された。界面活性剤例
えばポリエチレンオキシアルキルエーテル例えば商標Ｂ
ｒｉｊ３５とＴｅｒｇｉｔｏｌ ＴＭＮ６とＴｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００との下に販売されている界面活性剤を用
いてもよい。
【００３３】その上試薬中に酸化防止剤を包含させても
よい。その上試薬組成物は製造賦形剤と安定剤と他の不
活性成分とを含有していてもよく、それらの凡ては技術
に熟達した人の知識中には容易にるか、あるいは過度の
実験の必要なしに機械的に決めることができるものであ
る。
【００３４】その試薬組成物は用いる時液体の形でもよ
く、あるいは検査装置を形成するための適当な担体中に
含浸させてもよい。その装置は尿に就いての試験紙（ｄ
ｉｐａｎｄ ｒｅａｄ ｓｔｒｉｐ）あるいは自働化血
液分析と共に用いる検査スライドのような形式を採るこ
とができ、あるいは米国特許第３，９９２，１５８およ
び４，２９２，２７２号に記載のような多層構造物を形
成することもできる。
【００３５】
【実験】以下の実施例は本発明の種種な態様を述べてい
る。以下の処方および方法は単に説明の目的のために提
供されたものであること、および他の成分と割合と方法
とがこの発明の開示に従って採用できることが理解され
よう。
【００３６】
【材料並に方法】他に指定しない限り、試薬級反応原系
および溶剤は化学薬品提供者から受取ったまま用いた。
トルエンとアセトニトリルとは分子篩（４−Ａ）上で乾
燥した。アセトンは無水炭酸カリウム上で乾燥した。遊
離基のないテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は用いる前に
ベンゾフェノンケチルナトリウムから蒸溜した。
【００３７】融点はＴｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ毛細管
装置で測定した。1Ｈ ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａ
ｎ Ｇｅｍｉｎｉ ２００ＭＨｚスペクトルメーターで
測定し、化学シフトはテトラメチルシランからの百万分
の１（δ）のずれ（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ）で報告されて
いる。元素分析はＥａｇｌｅ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＩ．の
ＳＰＡＮＧ Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙにより行った。
【００３８】
【Ｉ．色原体２標識テトラ酸−ジフェノール（９）の合
成】合成順序は図１に示されていて、以下述べる。
【００３９】化合物（２）の調製 −３０℃の乾燥トルエン（２５０ｍｌ）中ｔ−ブチルア
ミン（１４．６ｇ、２００ｍ ｍｏｌ）の溶液に臭素
（１６．０ｇ、１００ｍ ｍｏｌ）を滴下して加える。
その溶液を−７５℃に冷却し、ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍ
ｌ）中のビスフェノール（１）（１０．０ｇ、４９．９
ｍ ｍｏｌ）溶液を添加し、その反応混合物を一夜室温
に温めさせる。水（５０ｍｌ）を加え、２０分間猛しく
撹拌後その有機層を分離し、１５％ＮａＯＨ（２×３０
ｍｌ）で洗浄する。合併した水性抽出液を−２０℃に冷
却し、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ約２に酸性とし、ＣＨ2Ｃｌ2
（２×３０ｍｌ）で抽出する。有機抽出液を乾燥し（Ｍ
ｇＳＯ4）、溶剤を真空中除去し、残渣を、溶離剤とし
て石油エーテル／ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）を用い、シリカ
ゲルカラム上で精製すると、ｍｐ．９２−９３．５℃の
白色固体としてジブロミド（２）（１２．８ｇ、７２
％）を得る。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ４．０２
（ｓ，ＣＨ2，２Ｈ），５．７５（ｂｒ ｓ，ＯＨ，２
Ｈ），６．７３（ｔ，ＡｒＨ，２Ｈ），７．０９（ｄ，
ＡｒＨ，２Ｈ），７．３３（ｄ，ＡｒＨ，２Ｈ）；元素
分析．計算値Ｃ13Ｈ10Ｂｒ2Ｏ2：Ｃ，４３．６１；Ｈ，
２．８２．測定値：Ｃ，４３．６３；Ｈ，２．７３。
【００４０】化合物（３）の調製 乾燥アセトン中のジブロミド（２）（１５．２ｇ、４
２．４ｍ ｍｏｌ）と臭化ベンジル（２４．２５ｇ、１
４１．６ｍ ｍｏｌ）と無水Ｋ2ＣＯ3（２１．３ｇ、１
５４ｍ ｍｏｌ）との混合物を撹拌し、アルゴンの下で
４８時間還流させる。溶剤と過剰の臭化ベンジルを減圧
の下に留去する。残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水との間に分配す
る。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、粗生成物を、溶離
剤としてＣＨ2Ｃｌ2−石油エーテル（１：１〜３：１）
を用い、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにか
けると、無色粘稠な油として（３）（２２．８ｇ、１０
０％）を得る。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ４．０２
（ｓ，ＡｒＣＨ2Ａｒ，２Ｈ），４．８２（ｓ，ＡｒＣ
Ｈ2Ｏ，４Ｈ），６．７５−７．０２（ｍ，ＡｒＨ，４
Ｈ），７．２８−７．５２（ｍ，ＡｒＨ，１２Ｈ）；元
素分析．計算値Ｃ27Ｈ22Ｂｒ2Ｏ2：Ｃ，６０．２５；
Ｈ，４．１２．測定値：Ｃ，６０．３６；Ｈ４．２１。
【００４１】化合物（４）の調製 ｎ−ブチルリチウム（２．４Ｍ）（２２ｍｌ、５２ｍ
ｍｏｌ）を−７８℃で乾燥ＴＨＦ（３００ｍｌ）中の化
合物（３）（１１．５ｇ、２２．１ｍ ｍｏｌ）溶液に
添加する。１０分後、その溶液をこれもまた−７８℃に
冷却されているＴＨＦ（８０ｍｌ）中の硼酸トリメチル
（６３．４ｇ、６１０ｍ ｍｏｌ）溶液中に注入する。
得られた混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、１時間に
亘って０℃に温めさせ、２Ｎ ＨＣｌ（１６０ｍｌ）を
加える。１時間撹拌した後エーテル（１５０ｍｌ）を加
え、更に４時間撹拌を続ける。有機層を分離し、水性層
をエーテル（３×５０ｍｌ）で抽出する。合併したエー
テル層を３Ｎ ＮａＯＨ（３×１００ｍｌ）で抽出し、
水性抽出液を合併し、０℃で濃ＨＣｌを用いて酸性にす
る。白色固体懸濁液を一夜４℃の冷蔵庫中におき、濾
過、水での洗浄、そして真空の下で乾燥して、白色固体
としての硼素酸［ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ］（４）
（６．４ｇ、６２％）を生成させる。1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
Ｄ3ＯＤ）：δ４．００（ｓ，ＡｒＣＨ2Ａｒ，２Ｈ），
４．７０（ｓ，ＡｒＣＨ2Ｏ，４Ｈ），６．９５−７．
５０（ｍ，ＡｒＨ，１６Ｈ）。
【００４２】化合物（５）の調製 ｏ−ヨードアニリン（５．００ｇ、２２．８ｇ）と硼素
酸（４）（４．８６ｇ、１０．４ｍ ｍｏｌ）とテトラ
キス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．３４
ｇ、０．３０ｍ ｍｏｌ）と２Ｍ水性Ｎａ2ＣＯ3（３０
ｍｌ）とＥｔＯＨ（１６ｍｌ）とベンゼン（６０ｍｌ）
との混合物をアルゴンの下で４８時間８５℃に加熱す
る。更に触媒５０ｍｇを２４時間後に追加して加える。
有機層を分離し、水性層をＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。合併
した有機抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、溶剤を真空で
除去し、残渣を、溶離剤として石油エーテル−ＥｔＯＡ
ｃ（５：１）を用い、シリカゲル上でクロマトグラフィ
ーにかけると、淡黄色ガラス状物としてジアミン（５）
（４．４８ｇ、７７％）を得る。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）：δ３．７８（ｂｒ ｓ，ＮＨ2，４Ｈ），４．１
７（ｓ，ＡｒＣＨ2Ａｒ，２Ｈ），４．３９（ｓ，Ａｒ
ＣＨ2Ｏ，４Ｈ），６．７０−７．００（ｍ，ＡｒＨ，
８Ｈ），７．０５−７．３７（ｍ，ＡｒＨ，１６Ｈ）；
元素分析．計算値Ｃ39Ｈ34Ｎ2Ｏ2：Ｃ，８３．２５；Ｈ
６．０９．測定値：Ｃ，８３．２４；Ｈ，６．２１。
【００４３】化合物（６）の調製 乾燥ＣＨ3ＣＮ中のジアミン（５）（９．０５ｇ、１
６．１ｍ ｍｏｌ）と臭化酢酸エチル（２６．９ｇ、１
６１ｍ ｍｏｌ）とルチジン（１７．２ｇ、１８．７ｍ
ｍｏｌ）との溶液を２日間還流する。更に臭化酢酸エ
チル５ｍｌを加え、加熱をもう１日追加して続ける。溶
剤を真空中で除去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水との間に分
配する。有機層を分離し、水性層をＣＨ2Ｃｌ2で抽出
し、合併した有機層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、溶剤を真
空で除去し、残渣を溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2−ＥｔＯＡ
ｃ（９８：２〜９５：５）を用い、シリカゲル上でクロ
マトグラフィーにかけると淡黄色ガラス状物としてテト
ラエステル（６）（７．１０ｇ、４９％）を得る。1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１０（ｔ，ＣＨ3，１２
Ｈ），３．６０−４．４５（ｍ，ＣＨ2Ｎ＋ＣＨ2Ｏ＋Ａ
ｒＣＨ2Ａｒ，２２Ｈ），６．８５−７．６０（ｍ，Ａ
ｒＨ，２４Ｈ）；元素分析．計算値Ｃ55Ｈ58Ｎ2Ｏ1 0：
Ｃ，７２．８３；Ｈ，６．４４．測定値：Ｃ，７２．７
２；Ｈ，６．４９。
【００４４】化合物（７）の調製 テトラエステル（６）（４．９５ｇ、５．４６ｍ ｍｏ
ｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（０．５２ｇ）と酢酸（１ｍｌ）
とＥｔＯＨ（１２５ｍｌ）との混合物を圧力５０ｐｓｉ
の水素の下で１８時間振盪する。触媒をセライトを通す
濾過により除去し、溶剤を真空で蒸発し、淡黄色ガラス
状物として化合物（７）（４．０ｇ、１００％）を得
る。（７）の分析試料は溶離剤としてＣＨ2Ｃｌ2−Ｅｔ
ＯＡｃ（９７：３）を用いるシリカゲル上のクロマトグ
ラフィーで得た。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１
５（ｔ，ＣＨ3，１２Ｈ），３．４０−４．３０（ｍ，
ＣＨ2Ｏ＋ＣＨ2Ｎ＋ＡｒＣＨ2Ａｒ，１８Ｈ），６．８
７（ｔ，ＡｒＨ，２Ｈ），７．０２−７．３３（ｍ，Ａ
ｒＨ，１２Ｈ），７．９９（ｓ，ＯＨ，２Ｈ）；元素分
析．計算値Ｃ41Ｃ46Ｎ2Ｏ10：Ｃ，６７．７５；Ｈ，
６．３８．測定値：Ｃ６７．８４；Ｈ，６．５５。
【００４５】化合物（８）の調製 ＴＨＦ−Ｈ2Ｏ（１：１、２０ｍｌ）中のテトラエステ
ル（７）（０．９４ｇ、１．２９ｍ ｍｏｌ）とＮａＨ
ＣＯ3（２．６ｇ）との混合物を０〜５℃に冷却し、冷
ＴＨＦ−Ｈ2Ｏ（１：１、３２ｍｌ）中のｐ−ニトロベ
ンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラート（２．００
ｇ、８．４４ｍ ｍｏｌ）の懸濁液を４０分かけて滴下
して加える。無色から赤褐色に変ったその混合物を２時
間室温で撹拌する。溶剤を真空で除去し、残渣をＣＨ2
Ｃｌ2と水との間に分配する。水性層をＣＨ2Ｃｌ2で２
回抽出し、合併した有機層を２Ｎ ＨＣｌで洗浄し、乾
燥する（Ｎａ2ＳＯ4）。溶剤を真空で除去し、残渣を、
ＣＨ2Ｃｌ2−ＥｔＯＡｃ（９８：２）を用いシリカゲル
上でのクロマトグラフィーで精製すると暗橙色ガラス状
物として化合物（８）（０．５３ｇ、４０％）を与え
る。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１４（ｔ，ＣＨ
3，１２Ｈ），３．７０−４．２５（ｍ，ＣＨ2Ｎ＋ＣＨ
2Ｏ，１６Ｈ），４．３７（ｓ，ＡｒＣＨ2Ａｒ，２
Ｈ），７．１３−７．４８（ｍ，ＡｒＨ＋ＯＨ，９
Ｈ），７．８３（ｓ，ＡｒＨ，４Ｈ），８．１０（ＡＢ
ｑ，ＡｒＨ，８Ｈ），８．９２（ｓ，ＯＨ，１Ｈ）；元
素分析．計算値Ｃ53Ｈ52Ｎ8Ｏ14：Ｃ，６２．１０；
Ｈ，５．１１．測定値：Ｃ，６２．２７；Ｈ，５．１
２。
【００４６】化合物（９）の調製 ジオキサン（１９ｍｌ）中テトラエステル（８）（０．
５０ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）溶液に水（４ｍｌ）を添加
する。その混合物を氷浴中で冷却し、ＬｉＯＨ（０．３
０ｇ、１２．５ｍ ｍｏｌ）を加える。直に紫色に変っ
たその混合物を一夜室温で撹拌する。その溶剤を真空で
除去し、残渣をエーテルと希薄ＨＣｌ（ｐＨ約４）との
間に分配する。エーテル層を分離し、溶剤を真空で除去
すると褐赤色泡状物としてテトラ酸（９）（０．４８
ｇ、約１００％）を生成する。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3Ｏ
Ｄ）：δ３．５０−４．３５（ｍ，ＣＨ2Ｎ＋ＡｒＣＨ2
Ａｒ，１０Ｈ），７．０４−７．４４（ｍ，ＡｒＨ，８
Ｈ），７．８５（ｄ，ＡｒＨ，４Ｈ），８．１２（ＡＢ
ｑ，ＡｒＨ，８Ｈ）；元素分析．計算値Ｃ45Ｈ36Ｎ8Ｏ
14・０．５Ｈ2Ｏ：Ｃ，５８．６３；Ｈ，４．０５．測
定値：Ｃ，５８．４８；Ｈ，４．２２。
【００４７】
【ＩＩ．色原体１標識テトラ酸−ジフェノール（１１）
の合成】１標識テトラ酸−ジフェノール（１１）は図２
に示すように、ジアゾ化カップリング反応のために１：
１化学量論を用い、つづいてエステル基を加水分解する
ことによりテトラエステル（１０）を経て、図１に記載
の合成により、中間体テトラエステル−ジフェノール
（７）から得られる。この混合物はＲが水素原子であ
り、ＸがＣＨ2であり、ＷがＣＯＨであり、Ｍがｐ−ニ
トロフェニルアゾ基であり、ｎが１であり、（ｉ）ｋが
１であって、ｊが０であるかあるいは、（ｉｉ）ｋが０
であってｊが１であるいずれかである構造式（Ｉ）で表
わされる。
【００４８】
【ＩＩＩ．色原体テトラ酸−フェノール（１８）の合
成】図３は本発明のトリアリールテトラ酸−フェノール
の合成を説明する。 化合物（１４）の調製 硼素酸（１２）（６．８４ｇ、２５．１ｍ ｍｏｌ）と
２−ヨードアニリン（１３）（１１．０２ｇ、５０．３
ｍ ｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）
パラジウム（０．８５ｇ、０．７４ｍ ｍｏｌ）と２Ｍ
水性Ｎａ2ＣＯ3（７１ｍｌ）とトルエン（１４２ｍｌ）
とエタノール（３５ｍｌ）とをアルゴンの下で４８時間
９０℃に加熱する。２４時間後パラジウム触媒９０ｍｇ
を追加して加える。有機層を分離し、水性層をＣＨ2Ｃ
ｌ2で抽出する。合併した有機層を乾燥し（ＭｇＳ
Ｏ4）、溶剤を真空で除去し、残渣を溶離剤として石油
エーテル−ＥｔＯＡｃ（４：１ ２：１）を用いてシリ
カゲル上のクロマトグラフィーにかけると、ｍ．ｐ１３
０〜１３２℃を持つ灰色固体としてジアミン（１４）
（３．６ｇ、３９％）を得る。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）：δ３．４３（ｂｒ ｓ，ＮＨ2，４Ｈ），４．２
８（ｓ，ＣＨ2Ｏ，２Ｈ），６．５８（ｄ，ＡｒＨ，２
Ｈ），６．７２−６．８９（ｍ，ＡｒＨ，４Ｈ），７．
０１−７．３８（ｍ，ＡｒＨ，１０Ｈ）；元素分析．計
算値Ｃ25Ｈ22Ｎ2Ｏｘ３．５Ｈ2Ｏ：Ｃ，６９．９１；
Ｈ，６．８１．測定値：Ｃ，６９．７４；Ｈ，６．４
７。
【００４９】化合物（１５）の調製 アセトニトリル（１００ｍｌ）中のジアミン（１４）
（３．４８ｇ、９．５０ｍ ｍｏｌ）と臭化酢酸エチル
（１５．９ｇ、９５．２ｍ ｍｏｌ）とルチジン（１
０．２ｇ、９５．２ｍ ｍｏｌ）との溶液を５日間還流
させる。２４時間および４８時間後に臭化酢酸エチル
（７．５３ｇ、４５．１ｍ ｍｏｌ）とルチジン（５．
０６ｇ、４７．２ｍ ｍｏｌ）との追加量を加える。溶
剤を真空で除去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水との間に分配
する。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、溶剤を真空で除
去し、残渣を石油エーテル−ＥｔＯＡｃ（４：１ ３：
１）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ
るとｍｐ１２０−１２２℃を持つ白色結晶としてテトラ
エステル（１５）（４．７ｇ、６９％）を得る。1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１０（ｔ，ＣＨ3，１２
Ｈ），３．６０−４．２５（ｍ，ＣＨ2Ｏ＋ＣＨ2Ｎ，１
８Ｈ），６．５１（ｄ，ＡｒＨ，２Ｈ），６．９５−
７．６２（ｍ，ＡｒＨ，１４Ｈ）；元素分析．計算値Ｃ
41Ｈ46Ｎ2Ｏ9：Ｃ，６９．２８；Ｈ，６．５２．測定
値：Ｃ，６９．３４；Ｈ，６．５７。
【００５０】化合物（１６）の調製 テトラエステル（１５）（４．５０ｇ、６．３３ｍ ｍ
ｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（０．４５ｇ）と酢酸（１ｍ
ｌ）とエタノール（６５ｍｌ）との混合物を圧力５０ｐ
ｓｉの水素の下、２４時間に亘り振盪する。触媒（２０
０ｍｇ）の追加量を添加し、更に２４時間水素化を続け
る。触媒を濾過し、溶剤を真空で除去し、残渣を石油エ
ーテル−ＥｔＯＡｃ（４：１）を用いるシリカゲル上の
クロマトグラフィーにかけると、淡黄色油として（１
６）（３．０５ｇ、７８％）を生成する。1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3）：δ１．１４（ｔ，ＣＨ3，１２Ｈ），
３．９４（ｂｒ ｓ，ＣＨ2Ｎ，８Ｈ），４．０４
（ｑ，ＣＨ2Ｏ，８Ｈ），６．９０−７．３５（ｍ，Ａ
ｒＨ，１１Ｈ），８．０３（ｂｒ ｓ，ＯＨ，１Ｈ）；
元素分析．計算値Ｃ34Ｈ40Ｎ2Ｏ9：Ｃ，６５．７９；
Ｈ，６．５０．測定値：Ｃ，６６．０２；Ｈ，６．４
８。
【００５１】化合物（１８）の調製 ＴＨＦ−Ｈ2Ｏ（１：１、５０ｍｌ）中のテトラエステ
ル−フェノール（１６）（２．６０ｇ、４．１９ｍ ｍ
ｏｌ）とＮａＨＣＯ3（４．１ｇ）との混合物を０〜５
℃に冷却し、冷ＴＨＦ−Ｈ2Ｏ（１：１、５０ｍｌ）中
のｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラ
ート（３．１５、１３．３ｍ ｍｏｌ）の懸濁液を滴下
して加える。その混合物を一夜撹拌し、溶剤を真空で除
去し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2と水との間に分配する。有機層
を２Ｎ ＨＣｌと振盪し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、溶剤
を真空で除去する。その残渣を石油エーテル−ＥｔＯＡ
ｃ（３：１ １：１）を用いるシリカゲル上でのクロマ
トグラフィーにかけると、次の段階には更に精製するこ
となく受入れられるやや不純のテトラエステル（１７）
（〜１．６ｇ）を得る
【００５２】少量のテトラエステル（１７）（０．７４
ｇ、０．９６ｍ ｍｏｌ）をＬｉＯＨ（０．５９ｇ、２
４．５ｍ ｍｏｌ）を含有するジオキサン（３２ｍｌ）
と脱イオン水（８ｍｌ）との混合物中に溶解する。この
混合物を室温で一夜撹拌し、溶剤を真空で除去し、残渣
をエチルエーテルと水との間に分配する。水性層を追加
のエチルエーテルで抽出し、２Ｎ ＨＣｌでｐＨ３．４
に酸性とする。水性層をエチルエ−テル（３×２０ｍ
ｌ）で抽出し、溶剤を合併した抽出液から真空で除去す
る。粗生成物をＤｏｗｅｘ ５０×８酸性陽イオン交換
カラムを通過させると暗赤色ガラス状物としてテトラ酸
（１８）（０．１８ｇ）を得る。1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3Ｏ
Ｄ）：δ３．９９（ｂｒ ｓ，ＣＨ2Ｎ，８Ｈ），７．
０−８．５（ｍ，ＡｒＨ，１４Ｈ）；元素分析．計算値
Ｃ32Ｈ27Ｎ5Ｏ11ｘ２Ｈ2Ｏ：Ｃ，５５．４１；Ｈ，４．
５０．測定値：Ｃ，５５．１９；Ｈ，４．８６。
【００５３】この化合物はＲが水素原子であり、ＸがＣ
Ｈ2であり、ＷがＣＯＨであり、Ｍがｐ−ニトロフェニ
ルアゾ基であり、ｎが０であり、ｋが１である構造式
（Ｉ）で表わされる化合物である。
【００５４】
【ＩＶ．分析研究】１Ｍ水酸化テトラメチルアンモニウ
ム（ＴＭＡＯＨ）はＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００およびＢｒｉｊ−３５はＩＣＩよ
り受取り、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＴＭＮ６はＵｎｉｏｎ
Ｃａｒｂｉｄｅより購入した。カチオンに対するカルシ
ウム発色イオノフォアの応答測定には分析級塩化カルシ
ウムおよび塩化マグネシウムを用いた。２−（シクロヘ
キシルアミノ）−エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）はＣａ
ｌｂｉｏｃｈｅｍから得た。３，３′−チオジチオプロ
ピオン酸はＳｉｇｍａから得た。凡ての材料は受取った
ままで用いた。
【００５５】Ａ．カルシウム発色イオノフォアのスペク
トル性状 種種な形のカルシウム発色イオノフォアのＵＶ−ＶＩＳ
スペクトルは水中のこの化合物の１．０×１０-4Ｍ溶液
で測定された。化合物の１．０×１０-2Ｍ原溶液は０．
０５Ｍ ＴＭＡＯＨ中に調製された。典型的には溶液は
次の如く調製された。原溶液０．０２ｍｌを適当な試薬
２．０ｍｌに添加する。酸の形（ＨＬ）を得るには０．
１Ｎ ＨＣｌを用い、塩基の形（Ｌ）には０．１Ｍ Ｔ
ＭＡＯＨを用いる。得られた溶液はＣａｒｙ−３分光光
度計で７００ｎｍから３００ｎｍまで走査された。最適
ｐＨでのカチオン錯体（ＬＭ+）のスペクトルは試薬２
ｍｌを含有するそれぞれのセルに、共に１．０Ｍである
ＣａＣｌ2，ＭｇＣｌ2 ０．０２ｍｌを添加し、７００
ｎｍから３００ｎｍまで走査することにより得られる。
【００５６】１．本発明の色原体化合物を含有する試薬
のスペクトル的応答 非イオン界面活性剤はアゾフェノール発色団とは非常に
強く相互作用することが知られている故に、カルシウム
醋体の最大吸収波長へのその影響を本発明の種種な色原
体イオノフォアについて調べた。
【００５７】ａ．色原体２標識−テトラ酸ジフェノール
（９） 次の如き試薬処方を用いた。 ５．０×１０-5Ｍ色原体ジ標識テトラ酸−ジフェノール
（９） ０．１Ｍ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０） スペクトル応答は次の通りである。 形 λmax（ε） λmax（ε）（１％ Brij-35） Ｌ 394.0(35,160) 407.0(35,900) ＬＣａ2+ 497.0(31,400) 536.0(43,700) ＬＭｇ2+ 427.0(27,300) 502.0(33,300) ここで、Ｌは醋体形成されていない発色イオノフォアで
あり、ＬＣａ2+はカルシウム発色イオノフォア醋体であ
り、ＬＭｇ2+はマグネシウム発色イオノフォア醋体であ
る。
【００５８】ｂ．色原体１標識テトラ酸−ジフェノール
（１１） 次の処方 １．０×１０-4Ｍ色原体１標識テトラ酸−ジフェノール
（１１） ０．１Ｍ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０） を用い、スペクトル応答は次の通りである。 形 λmax（ε） λmax（ε）（１％ Brij-35） Ｌ 390.0(17,050) 407.0(18,050) ＬＣａ2+ 499.0(20,630) 512.0(20,600) ＬＭｇ2+ 474.0(16,500) 480.0(16,600)
【００５９】ｃ．テトラ酸−フェノール（１８） 次の試薬処方 １．０×１０-4Ｍ色原体テトラ酸−フェノール（１８） ０．１Ｍ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．２） を用い、スペクトル応答は次の通りである。 形 λmax（ε） λmax（ε）（１％ Brij-35） Ｌ 393.0(25,930) 396.0(25,200) ＬＣａ2+ 404.0(21,080) 469.0(19,030) ＬＭｇ2+ 400.0(23,040) 404.0(21,240)
【００６０】Ｂｒｉｊ−３５の添加はそのイオノフォア
のカルシウムとの醋体形成に当り吸収最大の波長のより
一層大きい深色シフトを起させ、その効果は内因性のス
ペクトル妨害を減少させるために望ましい。
【００６１】２．カルシウム検定に対するＢｒｉｊ−３
５の影響 非イオン界面活性剤はカルシウム醋体の吸収の実質的増
大と、試薬の感度の附随的増大とを起すことが発見され
た。次の表は１．０×１０-4Ｍ２標識色原体テトラ酸ジ
フェノール（９）、０．１Ｍ ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０の
処方、種種なカルシウム水準について試薬２．０ｍｌ＋
試料０．０８ｍｌ、に対するカルシウム応答へのＢｒｉ
ｊ−３５の影響を示している。 ΔＡ500nm Ｃａ+2ｍｇ／ｄｌ （界面活性剤なし） ０．１％ Brij-35 ０．０ ０．０ ０．０ ４．０ ０．１３４ ０．４４３０ ８．０ ０．２４５６ ０．７４００ １２．０ ０．３４６６ ０．９６５１ １６．０ ０．４４４６ １．１４１０
【００６２】これらの結果は図４で説明されている。
【００６３】３．カルシウム検定に関する好ましい試薬 カルシウムの分析における、好ましい色原体２標識テト
ラ酸−ジフェノール（９）を含有する試薬の性能を評価
するため一連の実験を実施した。次の処方を用いた。 ２．５×１０-4色原体テトラ酸−ジフェノール（９） ０．１Ｍ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０） ２．０ｍＭ ８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸 ０．１％（ｗ／ｖ）３，３′−チオジプロピオン酸 ２．０％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
【００６４】試料は本出願の譲受人Ｍｉｌｅｓ Ｉｎ
ｃ．から入手出来るＴＥＣＨＮＩＣＯＮ ＲＡ−ＸＴTM
（ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ ＲＡ−ＸＴはＭｉｌｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの登録商
標である）で評価した。次の器機パラメーターを用い
た。 試薬体積 ３９０μｌ 試薬体積 ６μｌ 遅れ ２分 フィルター ５５０ｎｍ 型 Ｅｎｄｐｏｉｎｔ 透過長さ ７ｍｍ
【００６５】試料中で変化するカルシウム濃度に対する
試薬組成物のスペクトル応答は図５に説明されている。
【００６６】試薬組成物の感度もまた測定され、そのデ
ータを次に示す。 Ｃａ2+（ｍｇ／ｄｌ） ΔＡ550 ０．０ ０．００ ２．０ ０．０６２９ ４．０ ０．１２８４ ６．０ ０．１９１７ ８．０ ０．２５７０ １０．０ ０．３２０１ １２．０ ０．３８２２ １４．０ ０．４４０９ １６．０ ０．５０９１
【００６７】４．１標識テトラ酸−ジフェノール（１
１）含有試薬のカルシウムに対するスペクトル応答 次の処方 ２．０×１０-4Ｍ色原体１標識テトラ酸−ジフェノール
（１１） ０．１Ｍ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０） を用い、試料０．０４ｍｌを試薬２．００ｍｌと混合し
た場合、その結果は次の通りである。 Ｃａ2+（ｍｇ／ｄｌ） ΔＡ500 ０．０ ０．０００ ４．０ ０．１４６ ８．０ ０．２５７４ １２．０ ０．４１３６ １６．０ ０．４９２０
【００６８】５．テトラ酸−フェノール（１８）含有試
薬のカルシウムに対するスペクトル応答 次の試薬処方 １．１×１０-4色原体テトラ酸−ジフェノール ０．１Ｍ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．２） １．０％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ−３５ を用い、試料０．０５ｍｌを試薬２．００ｍｌと混合し
た場合、結果は次の如くである。 Ｃａ2+（ｍｇ／ｄｌ） ΔＡ532 ０．０ ０．００ ４．０ ０．１３２ ８．０ ０．１６３ １２．０ ０．２２２ １６．０ ０．２６７
【００６９】６．２標識テトラ酸−ジフェノール（９）
含有試薬を用いる方法とＡＡＳ法との相関 ＩＶ Ａ３の試薬処方を用いた。
【００７０】Ｃａ+2 ８ｍｇ／ｄｌ以下の試料は希釈剤
（水性１４０ｍＭ ＮａＣｌ／４ｍＭ ＫＣｌ）を用
い、Ｂｉｏｃｅｌｌの人混注血清を希釈して得た。１１
ｍｇ／ｄｌより大きいカルシウム値をもつ試料はその人
混注血清に１．０Ｍ ＣａＣｌ2のアリコートを添加し
て得た。ＲＡ ＳｙｓｔｅｍTM校正器の主検定値を相関
関係の間の試薬の校正に用いた。新しいカルシウム法対
原子吸光分析（ＡＡＳ）規準の相関は非常に良好である
（図６）。
【００７１】前記の記載から明らかな本発明の幾つかの
有利さには、均一単一試薬法で分光測光法により血清お
よび他の生物学的流体中のカルシウムの定量測定を可能
にする、色原体オクタデンタートテトラカルボキシルフ
ェノールおよびジフェノールを用いる検定法と試薬組成
物とが含まれる。その結果得られた検定法および試薬組
成物は容易に、自働化されている臨床血液分析器に用い
るのに適合できる。
【００７２】前記の組成物と方法とには、本発明の範囲
から逸脱することなく種種な変更をすることができるか
ら、前記の記載中に含まれるあるいは附随する図で示さ
れている凡ての事項は説明としてであって限定的意味で
ではないと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の色原体２標識テトラ酸−ジフェノール
を合成するための反応経路を記述する説明図。
【図２】本発明の色原体１標識テトラ酸−ジフェノール
を合成するための反応経路を記述する説明図。
【図３】本発明の色原体テトラ酸−フェノールを合成す
るための反応経路を記述する説明図。
【図４】界面活性剤が存在および存在しない、色原体２
標識テトラ酸−ジフェノールを含む試薬処方物のカルシ
ウムに対する吸収応答を説明する説明図。
【図５】色原体２標識テトラ酸−ジフェノールを含む試
薬組成物のカルシウムに対する直線スペクトル応答を説
明する説明図。
【図６】原子吸光分光測定１次規準法（ＡＡＳ）と比較
した、色原体２標識テトラ酸−ジフェノールを含む試薬
組成物についての相関図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブラニスロウ、ピー、ツェク アメリカ合衆国ニューヨーク州10566、 ピークスキル、ミリングタン・ロウド 253番 (72)発明者 ウォロディミア、アイ、ズァズラク アメリカ合衆国ニューヨーク州11370、 イースト・エルムハースト、トウェンテ ィファースト・アヴィニュー 49−17番 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/84 G01N 21/78 G01N 31/00 G01N 31/22

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 構造式 【化１】 （この式で、Ｒは水素原子であるかまたは炭素原子１〜
    ４個を含有する置換されているまたはされていない低級
    アルキル基であり、ＸはＣＨ2，ＣＨ2ＣＨ2，ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ2，Ｓ−ＳまたはＮＲであり、ＷはＣ
    Ｈ，Ｃ−ＯＨまたはＮであり、Ｍはｐ−ニトロフェニル
    アゾ基、２，４−ジニトロフェニルアゾ基、２，４，６
    −トリニトロフェニルアゾ基、ｐ−ニトロスチリール
    基、ｐ−ベンゾキノンイミノ基、ビス−（４−ジメチル
    アミノフェニル）ヒドロキシメチル基、３−フェニルイ
    ソチアゾリル−５−アゾ基、チアゾリル−５−アゾ基ま
    たはイソチアゾリル−５−アゾ基であり、ｋは１であ
    り、ｊは０または１であり、ｎは０または１である）で
    表わされる色原体化合物。
  2. 【請求項２】 Ｒが水素原子であり、ＸがＣＨ2であ
    り、ＷがＣＯＨであり、Ｍがｐ−ニトロフェニルアゾ基
    であって、ｋとｊとｎとが１である、請求項１に記載の
    色原体化合物。
  3. 【請求項３】 請求項１〜２の何れかに記載の化合物と
    マグネシウム遮蔽物と界面活性剤と、試薬組成物のｐＨ
    を８．５〜９．２に調節するための緩衝剤とを包含す
    る、溶解しているカルシウムイオンの存在を検出するた
    めの組成物。
  4. 【請求項４】 界面活性剤が２重量／容量％の濃度で存
    在する、請求項３に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 界面活性剤がポリエチレンオキシドアル
    キルエーテルである、請求項３に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 その上、酸化防止剤を含む、請求項３に
    記載の組成物。
  7. 【請求項７】 段階 （ａ）検査試料を、検査陽イオンと選択的に錯体を形成
    し、構造式 【化２】 （この式で、Ｒは水素原子であるかまたは炭素原子１〜
    ４個を含有する置換されているまたはされていない低級
    アルキル基であり、ＸはＣＨ2，ＣＨ2ＣＨ2，ＣＨ＝Ｃ
    Ｈ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ2，Ｓ−ＳまたはＮＲであり、ＷはＣ
    Ｈ，Ｃ−ＯＨまたはＮであり、Ｍはｐ−ニトロフェニル
    アゾ基、２，４−ジニトロフェニルアゾ基、２，４，６
    −トリニトロフェニルアゾ基、ｐ−ニトロスチリール
    基、ｐ−ベンゾキノンイミノ基、ビス−（４−ジメチル
    アミノフェニル）ヒドロキシメチル基、３−フェニルイ
    ソチアゾリル−５−アゾ基、チアゾリル−５−アゾ基ま
    たはイソチアゾリル−５−アゾ基であり、ｋは１であ
    り、ｊは０または１であり、ｎは０または１である）で
    表わされる化合物を含む試薬組成物と接触させ、 （ｂ）検出可能な応答を測定し、そして、 （ｃ）そうして検出された応答を、既知量のカルシウム
    イオンを含有する一連の標準組成物とその化合物とを反
    応させた場合に測定される応答と比較するを包含する、
    検査試料中のカルシウムイオンの存在を選択的に測定す
    る方法。
  8. 【請求項８】 Ｒが水素原子であり、ＸがＣＨ2であ
    り、ＷがＣＯＨであり、Ｍがｐ−ニトロフェニルアゾ基
    であり、ｋとｊとｎとが１である、請求項７に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 試薬組成物がその上マグネシウム遮蔽物
    と界面活性剤と、その試薬組成物のｐＨを８．５〜９．
    ２に維持するための緩衝剤とを含む、請求項７に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】 界面活性剤が２重量／容量％の濃度で
    存在する、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 界面活性剤がポリエチレンオキシドア
    ルキルエーテルである、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 試薬組成物が更に酸化防止剤を含む、
    請求項７に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 （ａ）構造式 【化３】 で表わされる化合物（２）を用意し、 （ｂ）化合物（２）のフェノール基を保護して構造式 【化４】 で表わされる化合物（３）を与え、 （ｃ）化合物（３）をリチウム化し、硼素化して、構造
    式 【化５】 で表わされる化合物（４）を与え、 （ｄ）化合物（４）と構造式 【化６】 で表わされる化合物（５）とを触媒存在の下に反応させ
    て、構造式 【化７】 で表わされる化合物（６）を形成させ、 （ｅ）化合物（６）をアルキル化して構造式 【化８】 で表わされる化合物（７）を形成し、 （ｆ）化合物（７）のフェノール基を脱保護基して構造
    式 【化９】 で表わされる化合物（８）を形成し、 （ｇ）化合物（８）を構造式 【化１０】 で表わされる化合物（９）とカップリングさせて化合物
    （１０） 【化１１】 を形成し、 （ｈ）化合物（１０）を加水分解して色原体化合物
    （Ｉ）を形成させる段階を包含する、構造式 【化１２】 （これらの式で、Ｒは水素原子であるかまたは炭素原子
    １〜４個を含有する置換されているまたはされていない
    低級アルキル基であり、Ｒ’はベンジル基、アリル基、
    メトキシメチル基またはエトキシエチル基であり、Ｒ''
    は炭素原子１〜４個を含有する置換されているまたはさ
    れていない低級アルキル基またはアリール基であり、
    Ｒ'''は電子求引基（ＮＯ2，ＣＦ3，ＳＯ2Ｒ，ＣＯＯ
    Ｒ）であり、ＬはＣｌ，ＢｒまたはＢＦ4であり、Ｘは
    ＣＨ2，ＣＨ2ＣＨ2，ＣＨ＝ＣＨ，Ｏ，Ｓ，ＳＯ2，Ｓ2
    またはＮＲであり、ＹはＣｌ，ＢｒまたはＩであり、Ｍ
    はｐ−ニトロフェニルアゾ基、２，４−ジニトロフェニ
    ルアゾ基、２，４，６−トリニトロフェニルアゾ基、ｐ
    −ニトロスチリール基、ｐ−ベンゾキノンイミノ基、ビ
    ス−（４−ジメチルアミノフェニル）ヒドロキシメチル
    基、３−フェニルイソチアゾリル−５−アゾ基、チアゾ
    リル−５−アゾ基、またはイソチアゾリル−５−アゾ基
    であり、ｋは１であり、ｊは０または１であり、ｎは０
    または１である）で表わされる色原体化合物（Ｉ）の調
    製方法。
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