JP3359203B2 - ペプチドのアミノ酸配列解析方法 - Google Patents
ペプチドのアミノ酸配列解析方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、質量分析法による
ペプチドのアミノ酸配列解析方法、及びそれに使用する
キットに関する。
ペプチドのアミノ酸配列解析方法、及びそれに使用する
キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドや蛋白質においてアミノ酸配列
に関する情報を得ることは、その機能などを理解する上
で重要なことである。近年、質量分析分野でソフトイオ
ン化法の開発によりそれまで測定がほとんど不可能であ
った蛋白質などの不安定な生体高分子の分子量や構造解
析が可能になってきた。更に、質量分析法において、衝
突活性化開裂法を用いることによりペプチドのアミノ酸
配列が決定できるようになった。アミノ酸の置換や修飾
を受けたペプチド・蛋白質の構造解析には、特に、質量
分析法が優れている。質量分析法によるアミノ酸配列解
析は、親イオンの質量データと衝突活性化開裂法により
生じたプロダクトイオンの質量データを用いて解析する
が、生じたプロダクトイオンの中にはＮ末端由来のもの
とＣ末端に由来のものが混在する上、そのいずれにも属
さないものもあるので質量データだけから配列を決定す
るのは容易ではない。この問題を解決する方法として、
Ｈ2 18 Ｏを高濃度（４０ａｔｍ％）で含む反応液中でペ
プチド又は蛋白質をプロテアーゼで加水分解することに
よりＣ末端カルボキシル基を標識し衝突活性化開裂法に
より生じるプロダクトイオンの中から同位体分布の特異
なＣ末端由来プロダクトイオンを特定する方法が提案さ
れている〔ラピッド コミュニケーション イン マス
スペクトロメトリー（RAPIDCOMMUNICATION IN MASS S
PECTROMETRY) 、第５巻、第３１２〜３１５頁（１９９
１）〕。 また、４−ブロモフェニルイソチオシアネートでペプチ
ドのＮ末端アミノ基を修飾し臭素の天然同位体分布比を
利用してこの生成物を同定する方法が報告されている
〔ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリ
ー（European Journal of Biochemistry) 、第２０巻、
第７２頁（１９７１）〕。当該方法は、衝突活性化開裂
法において、生成したプロダクトイオンからＮ末端由来
のプロダクトイオンを特定する場合にも利用できる。し
かし、ブロモフェニルイソチオシアネートで修飾された
ペプチドは荷電を持ちにくいという問題点がある。
に関する情報を得ることは、その機能などを理解する上
で重要なことである。近年、質量分析分野でソフトイオ
ン化法の開発によりそれまで測定がほとんど不可能であ
った蛋白質などの不安定な生体高分子の分子量や構造解
析が可能になってきた。更に、質量分析法において、衝
突活性化開裂法を用いることによりペプチドのアミノ酸
配列が決定できるようになった。アミノ酸の置換や修飾
を受けたペプチド・蛋白質の構造解析には、特に、質量
分析法が優れている。質量分析法によるアミノ酸配列解
析は、親イオンの質量データと衝突活性化開裂法により
生じたプロダクトイオンの質量データを用いて解析する
が、生じたプロダクトイオンの中にはＮ末端由来のもの
とＣ末端に由来のものが混在する上、そのいずれにも属
さないものもあるので質量データだけから配列を決定す
るのは容易ではない。この問題を解決する方法として、
Ｈ2 18 Ｏを高濃度（４０ａｔｍ％）で含む反応液中でペ
プチド又は蛋白質をプロテアーゼで加水分解することに
よりＣ末端カルボキシル基を標識し衝突活性化開裂法に
より生じるプロダクトイオンの中から同位体分布の特異
なＣ末端由来プロダクトイオンを特定する方法が提案さ
れている〔ラピッド コミュニケーション イン マス
スペクトロメトリー（RAPIDCOMMUNICATION IN MASS S
PECTROMETRY) 、第５巻、第３１２〜３１５頁（１９９
１）〕。 また、４−ブロモフェニルイソチオシアネートでペプチ
ドのＮ末端アミノ基を修飾し臭素の天然同位体分布比を
利用してこの生成物を同定する方法が報告されている
〔ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリ
ー（European Journal of Biochemistry) 、第２０巻、
第７２頁（１９７１）〕。当該方法は、衝突活性化開裂
法において、生成したプロダクトイオンからＮ末端由来
のプロダクトイオンを特定する場合にも利用できる。し
かし、ブロモフェニルイソチオシアネートで修飾された
ペプチドは荷電を持ちにくいという問題点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ペプチドのＮ末端アミ
ノ基とブロモフェニルイソチオシアネートを反応させ、
臭素の天然同位体分布比を利用して衝突活性化開裂法に
より生成した複雑なプロダクトイオンの中からＮ末端由
来のプロダクトイオンを特定し質量分析法によるアミノ
酸配列解析を容易にする方法において、ブロモフェニル
イソチオシアネートでペプチドを標識した場合、衝突活
性化開裂法により生成したＮ末端由来のプロダクトイオ
ンが荷電を持ちにくく、その結果として感度が低くなる
という問題点がある。本発明の目的は、プロダクトイオ
ンが荷電を持ち易い化合物（Ｎ末端標識試薬）を使用し
て、改良した質量分析法によるペプチドのアミノ酸配列
解析方法、及び当該方法に使用するキットを提供するこ
とにある。
ノ基とブロモフェニルイソチオシアネートを反応させ、
臭素の天然同位体分布比を利用して衝突活性化開裂法に
より生成した複雑なプロダクトイオンの中からＮ末端由
来のプロダクトイオンを特定し質量分析法によるアミノ
酸配列解析を容易にする方法において、ブロモフェニル
イソチオシアネートでペプチドを標識した場合、衝突活
性化開裂法により生成したＮ末端由来のプロダクトイオ
ンが荷電を持ちにくく、その結果として感度が低くなる
という問題点がある。本発明の目的は、プロダクトイオ
ンが荷電を持ち易い化合物（Ｎ末端標識試薬）を使用し
て、改良した質量分析法によるペプチドのアミノ酸配列
解析方法、及び当該方法に使用するキットを提供するこ
とにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、ペプチドのアミノ酸配列解析方法
に関する発明であって、Ｎ末端標識試薬及び衝突活性化
開裂法を併用する質量分析法によるペプチドのアミノ酸
配列解析方法において、該Ｎ末端標識試薬として、少な
くとも塩素又は臭素が結合したピリジン環を含有し、か
つプロダクトイオンが荷電を持ち易い化合物を使用する
ことを特徴とする。本発明の第２の発明は、上記第１の
発明の方法において使用するペプチドのアミノ酸配列解
析用キットに関する発明であって、質量分析法によるペ
プチドのアミノ酸配列解析方法で使用するキットにおい
て、少なくとも塩素又は臭素が結合したピリジン環を含
有し、かつプロダクトイオンが荷電を持ち易い化合物
を、Ｎ末端標識試薬として含有していることを特徴とす
る。
発明の第１の発明は、ペプチドのアミノ酸配列解析方法
に関する発明であって、Ｎ末端標識試薬及び衝突活性化
開裂法を併用する質量分析法によるペプチドのアミノ酸
配列解析方法において、該Ｎ末端標識試薬として、少な
くとも塩素又は臭素が結合したピリジン環を含有し、か
つプロダクトイオンが荷電を持ち易い化合物を使用する
ことを特徴とする。本発明の第２の発明は、上記第１の
発明の方法において使用するペプチドのアミノ酸配列解
析用キットに関する発明であって、質量分析法によるペ
プチドのアミノ酸配列解析方法で使用するキットにおい
て、少なくとも塩素又は臭素が結合したピリジン環を含
有し、かつプロダクトイオンが荷電を持ち易い化合物
を、Ｎ末端標識試薬として含有していることを特徴とす
る。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明の方法に用いるペプチドのＮ末端を標識する
試薬は、少なくとも塩素又は臭素が結合したピリジン環
を含有し、かつプロダクトイオンが荷電を持ち易い化合
物である。換言すれば、ペプチドのＮ末端アミノ基と縮
合反応する官能基を有し、ピリジン環を持ち、更に、結
合後にペプチドに導入される塩素若しくは臭素を含む化
合物である。その例には、臭素（又は塩素）置換ピリジ
ンのカルボン酸、その反応性誘導体、例えばエステル、
酸ハライド、酸無水物、若しくは塩、あるいは当該ピリ
ジン環含有のイソチオシアン酸エステルなどが挙げられ
る。その具体例としては、下記式（化１）：
る。本発明の方法に用いるペプチドのＮ末端を標識する
試薬は、少なくとも塩素又は臭素が結合したピリジン環
を含有し、かつプロダクトイオンが荷電を持ち易い化合
物である。換言すれば、ペプチドのＮ末端アミノ基と縮
合反応する官能基を有し、ピリジン環を持ち、更に、結
合後にペプチドに導入される塩素若しくは臭素を含む化
合物である。その例には、臭素（又は塩素）置換ピリジ
ンのカルボン酸、その反応性誘導体、例えばエステル、
酸ハライド、酸無水物、若しくは塩、あるいは当該ピリ
ジン環含有のイソチオシアン酸エステルなどが挙げられ
る。その具体例としては、下記式（化１）：
【０００６】
【化１】
【０００７】で表されるＮ−スクシンイミジル ５−ブ
ロモ−３−ピリジンカルボキシレート、下記式（化
２）：
ロモ−３−ピリジンカルボキシレート、下記式（化
２）：
【０００８】
【化２】
【０００９】で表される５−ブロモ−２−ピリジルイソ
チオシアネートがある。標識されたペプチドは、高速液
体クロマトグラフィーなどの操作により精製しても良い
が、揮発性試薬や溶媒を用いれば溶媒を単に留去しただ
けでも衝突活性化開裂法を含む質量分析に利用すること
ができる。
チオシアネートがある。標識されたペプチドは、高速液
体クロマトグラフィーなどの操作により精製しても良い
が、揮発性試薬や溶媒を用いれば溶媒を単に留去しただ
けでも衝突活性化開裂法を含む質量分析に利用すること
ができる。
【００１０】標識されたペプチドの衝突活性化開裂法
は、未標識のペプチドの衝突活性化開裂法と同様、従来
の方法に従って行うことができる。すなわち、生成した
イオンを加速電圧で追い出して一方向へ飛ばせておき、
そこにヘリウムやアルゴンなどの中性のガスを導入し、
これら中性ガスと運動エネルギーをもったイオンとを衝
突させればよい。
は、未標識のペプチドの衝突活性化開裂法と同様、従来
の方法に従って行うことができる。すなわち、生成した
イオンを加速電圧で追い出して一方向へ飛ばせておき、
そこにヘリウムやアルゴンなどの中性のガスを導入し、
これら中性ガスと運動エネルギーをもったイオンとを衝
突させればよい。
【００１１】得られた衝突活性化開裂法の結果の解析
は、まず、Ｎ末端由来のプロダクトイオンを選択する。
例えば、Ｎ末端由来のプロダクトイオンは図１に示すよ
うな特徴的な同位体分布を示すので容易に選択すること
ができる。すなわち、図１は、Ｎ末端由来のプロダクト
イオンの同位体分布の１例を示す図であり、縦軸は相対
強度（％）、横軸はｍ／ｚ、すなわら質量／電荷数を意
味する。なお、以下の実施例に示す図２以下の各図にお
ける縦軸及び横軸も図１と同義である。
は、まず、Ｎ末端由来のプロダクトイオンを選択する。
例えば、Ｎ末端由来のプロダクトイオンは図１に示すよ
うな特徴的な同位体分布を示すので容易に選択すること
ができる。すなわち、図１は、Ｎ末端由来のプロダクト
イオンの同位体分布の１例を示す図であり、縦軸は相対
強度（％）、横軸はｍ／ｚ、すなわら質量／電荷数を意
味する。なお、以下の実施例に示す図２以下の各図にお
ける縦軸及び横軸も図１と同義である。
【００１２】アミノ酸配列解析は、Ｎ末端由来のプロダ
クトイオンのデータを用いて解析し、その結果を基にし
てＮ末端に由来しないプロダクトイオンデータから確定
を行う。ペプチド中の酸アミド結合のフラグメント化は
一般に極めて簡単で、カルボニル基の両側での開裂が規
則的に起るだけである。そして、各アミノ酸は、そのほ
とんどのものについて、α−置換基の違いにより各フラ
グメントイオンの質量が違ってくるので、主なピークの
質量差を読めば、アミノ酸の同定を行うことができる。
クトイオンのデータを用いて解析し、その結果を基にし
てＮ末端に由来しないプロダクトイオンデータから確定
を行う。ペプチド中の酸アミド結合のフラグメント化は
一般に極めて簡単で、カルボニル基の両側での開裂が規
則的に起るだけである。そして、各アミノ酸は、そのほ
とんどのものについて、α−置換基の違いにより各フラ
グメントイオンの質量が違ってくるので、主なピークの
質量差を読めば、アミノ酸の同定を行うことができる。
【００１３】本発明による上記解析方法に使用するため
の各試薬をセットとしてキット化しておくと便利であ
る。本発明のキットは、既述のように、少なくとも上記
した特定のＮ末端標識試薬を含有していればよい。本発
明のキットには、必要に応じて他の試薬をセットしても
よい。例えば、Ｎ末端標識化反応で使用する溶媒、例え
ばジメチルホルムアミド、ピリジン、反応用緩衝液、例
えばＮ−エチルモルホリンなどが挙げられる。また、マ
ススペクトル測定に常用される内標識試薬、あるいは従
来法と対照するために、公知の４−ブロモフェニルイソ
チオシアネートなどをセットしておいてもよい。
の各試薬をセットとしてキット化しておくと便利であ
る。本発明のキットは、既述のように、少なくとも上記
した特定のＮ末端標識試薬を含有していればよい。本発
明のキットには、必要に応じて他の試薬をセットしても
よい。例えば、Ｎ末端標識化反応で使用する溶媒、例え
ばジメチルホルムアミド、ピリジン、反応用緩衝液、例
えばＮ−エチルモルホリンなどが挙げられる。また、マ
ススペクトル測定に常用される内標識試薬、あるいは従
来法と対照するために、公知の４−ブロモフェニルイソ
チオシアネートなどをセットしておいてもよい。
【００１４】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明
は、これら実施例に限定されるものではない。
は、これら実施例に限定されるものではない。
【００１５】実施例１ （１）Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジ
ンカルボキシレートの合成 ５−ブロモニコチン酸２．０２ｇとＮ−ヒドロキシスク
シンイミド１．２７ｇをテトラヒドロフラン２５ｍｌに
溶解し、０℃に保つ。これに、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド２．２７ｇを加え、５℃で２０時間
反応させる。この反応液をろ過してＮ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルウレアを除去する。ろ液を乾固し、再結晶して
Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカル
ボキシレートを得る。
ンカルボキシレートの合成 ５−ブロモニコチン酸２．０２ｇとＮ−ヒドロキシスク
シンイミド１．２７ｇをテトラヒドロフラン２５ｍｌに
溶解し、０℃に保つ。これに、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド２．２７ｇを加え、５℃で２０時間
反応させる。この反応液をろ過してＮ，Ｎ′−ジシクロ
ヘキシルウレアを除去する。ろ液を乾固し、再結晶して
Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカル
ボキシレートを得る。
【００１６】（２）ロイシンエンケファリンのＮ−スク
シンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレ
ートによるＮ末端標識 配列表の配列番号１で表されるロイシンエンケファリン
１０ｎｍｏｌとＮ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３
−ピリジンカルボキシレート１μｍｏｌをジメチルホル
ムアミド１６０μｌに溶解し、これに５０％Ｎ−エチル
モルホリンを４０μｌ加えた。３７℃で３時間反応させ
た後、コンセントレーターで反応に用いた溶媒を除去し
た。
シンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレ
ートによるＮ末端標識 配列表の配列番号１で表されるロイシンエンケファリン
１０ｎｍｏｌとＮ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３
−ピリジンカルボキシレート１μｍｏｌをジメチルホル
ムアミド１６０μｌに溶解し、これに５０％Ｎ−エチル
モルホリンを４０μｌ加えた。３７℃で３時間反応させ
た後、コンセントレーターで反応に用いた溶媒を除去し
た。
【００１７】（３）ロイシンエンケファリンの４−ブロ
モフェニルイソチオシアネートによるＮ末端標識 ロイシンエンケファリン１０ｎｍｏｌと４−ブロモフェ
ニルイソチオシアネート１μｍｏｌを５０％ピリジン２
００μｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。反応
後、コンセントレーターで反応に用いた溶媒を除去し
た。
モフェニルイソチオシアネートによるＮ末端標識 ロイシンエンケファリン１０ｎｍｏｌと４−ブロモフェ
ニルイソチオシアネート１μｍｏｌを５０％ピリジン２
００μｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。反応
後、コンセントレーターで反応に用いた溶媒を除去し
た。
【００１８】（４）Ｎ末端標識ロイシンエンケファリン
の質量分析 Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカル
ボキシレートで標識したロイシンエンケファリンの質量
分析及び衝突活性化開裂法を用いた質量分析を行った。
同時に対照実験として４−ブロモフェニルイソチオシア
ネートで標識したロイシンエンケファリンの質量分析及
び衝突活性化開裂法を用いた質量分析を行った。質量分
析装置としては、高性能四重極三連質量分析装置ＡＰＩ
・III 〔パーキン−エルマー サイエックス（Perkin-E
lmer Sciex) 社製〕を使用した。質量分析の結果をそれ
ぞれ図２、図３に示す。図２より、Ｎ−スクシンイミジ
ル ５−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレート標識反
応したロイシンエンケファリンは、測定値７３９．４を
示し、Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジ
ンカルボキシレートにより標識されていること〔理論
値：７３９．２１（モノアイソトピックマス）〕が確認
された。図３より、４−ブロモフェニルイソチオシアネ
ート標識反応したロイシンエンケファリンは、測定値７
６９．３を示し、４−ブロモフェニルイソチオシアネー
トにより標識されていること〔理論値：７６９．２０
（モノアイソトピックマス）〕が確認された。次に、Ｎ
−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカルボ
キシレート及び４−ブロモフェニルイソチオシアネート
でＮ末端標識したロイシンエンケファリンの衝突活性化
開裂法を用いた質量分析の結果をそれぞれ図４、図５に
示す。Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジ
ンカルボキシレート標識した場合、図４の結果から分か
るように、Ｎ末端標識されたすべてのプロダクトイオン
が検出されロイシンエンケファリンのアミノ酸配列が容
易に決定された。一方、４−ブロモフェニルイソチオシ
アネート標識した場合、図５の結果より、Ｎ末端由来の
プロダクトイオンは２つのピークが検出されたのみで充
分な情報は得られなかった。これは、Ｎ末端アミノ基が
４−ブロモフェニルイソチオシアネートの結合により荷
電を持ちにくくなったことによる感度の低下に起因する
と推測される。Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３
−ピリジンカルボキシレート標識の場合は、荷電を持ち
やすいピリジン環が存在するので感度良くすべてのプロ
ダクトイオンが検出されたと考えられる。
の質量分析 Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカル
ボキシレートで標識したロイシンエンケファリンの質量
分析及び衝突活性化開裂法を用いた質量分析を行った。
同時に対照実験として４−ブロモフェニルイソチオシア
ネートで標識したロイシンエンケファリンの質量分析及
び衝突活性化開裂法を用いた質量分析を行った。質量分
析装置としては、高性能四重極三連質量分析装置ＡＰＩ
・III 〔パーキン−エルマー サイエックス（Perkin-E
lmer Sciex) 社製〕を使用した。質量分析の結果をそれ
ぞれ図２、図３に示す。図２より、Ｎ−スクシンイミジ
ル ５−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレート標識反
応したロイシンエンケファリンは、測定値７３９．４を
示し、Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジ
ンカルボキシレートにより標識されていること〔理論
値：７３９．２１（モノアイソトピックマス）〕が確認
された。図３より、４−ブロモフェニルイソチオシアネ
ート標識反応したロイシンエンケファリンは、測定値７
６９．３を示し、４−ブロモフェニルイソチオシアネー
トにより標識されていること〔理論値：７６９．２０
（モノアイソトピックマス）〕が確認された。次に、Ｎ
−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジンカルボ
キシレート及び４−ブロモフェニルイソチオシアネート
でＮ末端標識したロイシンエンケファリンの衝突活性化
開裂法を用いた質量分析の結果をそれぞれ図４、図５に
示す。Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３−ピリジ
ンカルボキシレート標識した場合、図４の結果から分か
るように、Ｎ末端標識されたすべてのプロダクトイオン
が検出されロイシンエンケファリンのアミノ酸配列が容
易に決定された。一方、４−ブロモフェニルイソチオシ
アネート標識した場合、図５の結果より、Ｎ末端由来の
プロダクトイオンは２つのピークが検出されたのみで充
分な情報は得られなかった。これは、Ｎ末端アミノ基が
４−ブロモフェニルイソチオシアネートの結合により荷
電を持ちにくくなったことによる感度の低下に起因する
と推測される。Ｎ−スクシンイミジル ５−ブロモ−３
−ピリジンカルボキシレート標識の場合は、荷電を持ち
やすいピリジン環が存在するので感度良くすべてのプロ
ダクトイオンが検出されたと考えられる。
【００１９】実施例２ （１）合成ペプチドＧＹＴＷＬＥ（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）の５−ブロモ−２−ピ
リジルイソチオシアネートによるＮ末端標識 配列表の配列番号２で表される合成ペプチドＧＹＴＷＬ
Ｅ１０ｎｍｏｌと５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシ
アネート１μｍｏｌを５０％ピリジン２００μｌに溶解
し、５０℃で３時間反応させた。反応後、コンセントレ
ーターで反応に用いた溶媒を除去した。
ｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）の５−ブロモ−２−ピ
リジルイソチオシアネートによるＮ末端標識 配列表の配列番号２で表される合成ペプチドＧＹＴＷＬ
Ｅ１０ｎｍｏｌと５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシ
アネート１μｍｏｌを５０％ピリジン２００μｌに溶解
し、５０℃で３時間反応させた。反応後、コンセントレ
ーターで反応に用いた溶媒を除去した。
【００２０】（２）合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの４−ブ
ロモフェニルイソチオシアネートによるＮ末端標識 合成ペプチドＧＹＴＷＬＥ１０ｎｍｏｌと４−ブロモフ
ェニルイソチオシアネート１μｍｏｌを５０％ピリジン
２００μｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。反応
後、コンセントレーターで反応に用いた溶媒を除去し
た。
ロモフェニルイソチオシアネートによるＮ末端標識 合成ペプチドＧＹＴＷＬＥ１０ｎｍｏｌと４−ブロモフ
ェニルイソチオシアネート１μｍｏｌを５０％ピリジン
２００μｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。反応
後、コンセントレーターで反応に用いた溶媒を除去し
た。
【００２１】（３）Ｎ末端標識合成ペプチドＧＹＴＷＬ
Ｅの質量分析 ５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネートで標識し
た合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの質量分析及び衝突活性化
開裂法を用いた質量分析を行った。同時に対照実験とし
て４−ブロモフェニルイソチオシアネートで標識した合
成ペプチドＧＹＴＷＬＥの質量分析及び衝突活性化開裂
法を用いた質量分析を行った。質量分析装置としては、
高性能四重極三連質量分析装置ＡＰＩ・III （パーキン
−エルマー サイエックス社製）を使用した。質量分析
の結果をそれぞれ図６、図７に示す。 図６より、５−
ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネート標識反応させ
た合成ペプチドＧＹＴＷＬＥは、測定値９８２．３を示
し、５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネートによ
り標識されていること〔理論値：９８２．２８（モノア
イソトピックマス）〕が確認された。図７より、４−ブ
ロモフェニルイソチオシアネート標識反応させた合成ペ
プチドＧＹＴＷＬＥは、測定値９８１．３を示し、４−
ブロモフェニルイソチオシアネートにより標識されてい
ること〔理論値：９８１．２８（モノアイソトピックマ
ス）〕が確認された。
Ｅの質量分析 ５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネートで標識し
た合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの質量分析及び衝突活性化
開裂法を用いた質量分析を行った。同時に対照実験とし
て４−ブロモフェニルイソチオシアネートで標識した合
成ペプチドＧＹＴＷＬＥの質量分析及び衝突活性化開裂
法を用いた質量分析を行った。質量分析装置としては、
高性能四重極三連質量分析装置ＡＰＩ・III （パーキン
−エルマー サイエックス社製）を使用した。質量分析
の結果をそれぞれ図６、図７に示す。 図６より、５−
ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネート標識反応させ
た合成ペプチドＧＹＴＷＬＥは、測定値９８２．３を示
し、５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネートによ
り標識されていること〔理論値：９８２．２８（モノア
イソトピックマス）〕が確認された。図７より、４−ブ
ロモフェニルイソチオシアネート標識反応させた合成ペ
プチドＧＹＴＷＬＥは、測定値９８１．３を示し、４−
ブロモフェニルイソチオシアネートにより標識されてい
ること〔理論値：９８１．２８（モノアイソトピックマ
ス）〕が確認された。
【００２２】次に、５−ブロモ−２−ピリジルイソチオ
シアネート及び４−ブロモフェニルイソチオシアネート
でＮ末端標識した合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの衝突活性
化開裂法を用いた質量分析の結果をそれぞれ図８、図９
に示す。なお、図８及び図９において、測定値７１１．
２を示すＣ末端由来プロダクトイオンのペプチドのアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。また、本発明に
よる５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネート標識
した場合のスペクトルを示す図８において、測定値７２
２．１を示すＮ末端由来プロダクトイオンのアミノ酸配
列を配列表の配列番号４に、そして測定値８３５．２を
示すアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。他方、
従来の４−ブロモフェニルイソチオシアネート標識した
場合のスペクトルを示す図９において、Ｎ末端由来プロ
ダクトイオンのうち、測定値７２１．１を示すもののア
ミノ酸配列を配列表の配列番号６に、同じく測定値８３
４．１を示すものを配列表の配列番号７に示す。図８と
図９の対比より、Ｃ末端由来プロダクトイオンに対する
Ｎ末端由来プロダクトイオンのシグナル強度の比は、５
−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネートで標識した
方が４−ブロモフェニルイソチオシアネートで標識した
場合より高く、ピリジン環を持つ５−ブロモ−２−ピリ
ジルイソチオシアネートで標識した方が衝突活性化開裂
法により生じたプロダクトイオンが感度よく検出される
ことがわかる。
シアネート及び４−ブロモフェニルイソチオシアネート
でＮ末端標識した合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの衝突活性
化開裂法を用いた質量分析の結果をそれぞれ図８、図９
に示す。なお、図８及び図９において、測定値７１１．
２を示すＣ末端由来プロダクトイオンのペプチドのアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号３に示す。また、本発明に
よる５−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネート標識
した場合のスペクトルを示す図８において、測定値７２
２．１を示すＮ末端由来プロダクトイオンのアミノ酸配
列を配列表の配列番号４に、そして測定値８３５．２を
示すアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。他方、
従来の４−ブロモフェニルイソチオシアネート標識した
場合のスペクトルを示す図９において、Ｎ末端由来プロ
ダクトイオンのうち、測定値７２１．１を示すもののア
ミノ酸配列を配列表の配列番号６に、同じく測定値８３
４．１を示すものを配列表の配列番号７に示す。図８と
図９の対比より、Ｃ末端由来プロダクトイオンに対する
Ｎ末端由来プロダクトイオンのシグナル強度の比は、５
−ブロモ−２−ピリジルイソチオシアネートで標識した
方が４−ブロモフェニルイソチオシアネートで標識した
場合より高く、ピリジン環を持つ５−ブロモ−２−ピリ
ジルイソチオシアネートで標識した方が衝突活性化開裂
法により生じたプロダクトイオンが感度よく検出される
ことがわかる。
【００２３】実施例３ キットの配合例 Ｎ末端標識試薬、Ｎ末端標識試薬溶解用溶媒、反応用緩
衝液をセットにして、アミノ酸配列解析用ペプチドＮ末
端標識キット（２０回分）を表１に示すように構築し
た。なお、Ｎ末端標識試薬としてＮ−スクシンイミジル
５−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレート、Ｎ末端
標識試薬溶解用溶媒としてジメチルホルムアミド、反応
用緩衝液として５０ｍＭ Ｎ−エチルホルモリン（ｐＨ
７．５：酢酸にて調製）を使用した。
衝液をセットにして、アミノ酸配列解析用ペプチドＮ末
端標識キット（２０回分）を表１に示すように構築し
た。なお、Ｎ末端標識試薬としてＮ−スクシンイミジル
５−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレート、Ｎ末端
標識試薬溶解用溶媒としてジメチルホルムアミド、反応
用緩衝液として５０ｍＭ Ｎ−エチルホルモリン（ｐＨ
７．５：酢酸にて調製）を使用した。
【００２４】
【表１】表 １ ──────────────────────── Ｎ末端標識試薬 １ｍｇ Ｎ末端標識試薬溶解用溶媒 １００μｌ 反応用緩衝液 １ｍｌ ────────────────────────
【００２５】
【発明の効果】本発明により、質量分析法を用いたアミ
ノ酸配列解析が感度良くできるようになった。本発明の
方法は、蛋白質・ペプチドの構造解析に有用である。
ノ酸配列解析が感度良くできるようになった。本発明の
方法は、蛋白質・ペプチドの構造解析に有用である。
【００２６】
【００２７】配列番号：1 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Gly Gly Phe Leu 1 5
【００２８】配列番号：2 配列の長さ：6 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Tyr Thr Trp Leu Glu1 5
【００２９】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Tyr Thr Trp Leu Glu 1 5
【００３０】配列番号：4 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：１番目のＧｌｙのアミノ基は、５−ブロモ
−２−ピリジルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp 1
−２−ピリジルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp 1
【００３１】配列番号：5 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：１番目のＧｌｙのアミノ基は、５−ブロモ
−２−ピリジルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp Leu 1 5
−２−ピリジルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp Leu 1 5
【００３２】配列番号：6 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：１番目のＧｌｙのアミノ基は、４−ブロモ
フェニルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp 1
フェニルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp 1
【００３３】配列番号：7 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：１番目のＧｌｙのアミノ基は、４−ブロモ
フェニルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp Leu 1 5
フェニルイソチオシアネートと結合している。 配列 Gly Tyr Thr Trp Leu 1 5
【図１】Ｎ末端由来のプロダクトイオンの同位体分布の
１例を示す図である。
１例を示す図である。
【図２】本発明の１例であるＮ−スクシンイミジル ５
−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレートで標識したロ
イシンエンケファリンの質量分析の結果を示す図であ
る。
−ブロモ−３−ピリジンカルボキシレートで標識したロ
イシンエンケファリンの質量分析の結果を示す図であ
る。
【図３】従来法の１例である４−ブロモフェニルイソチ
オシアネートで標識したロイシンエンケファリンの質量
分析の結果を示す図である。
オシアネートで標識したロイシンエンケファリンの質量
分析の結果を示す図である。
【図４】図２の化合物に、更に衝突活性化開裂法を適用
した場合の質量分析の結果を示す図である。
した場合の質量分析の結果を示す図である。
【図５】図３の化合物に、更に衝突活性化開裂法を適用
した場合の質量分析の結果を示す図である。
した場合の質量分析の結果を示す図である。
【図６】本発明の１例である５−ブロモ−２−ピリジル
イソチオシアネートで標識した合成ペプチドＧＹＴＷＬ
Ｅの質量分析の結果を示す図である。
イソチオシアネートで標識した合成ペプチドＧＹＴＷＬ
Ｅの質量分析の結果を示す図である。
【図７】従来法の１例である４−ブロモフェニルイソチ
オシアネートで標識した合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの質
量分析の結果を示す図である。
オシアネートで標識した合成ペプチドＧＹＴＷＬＥの質
量分析の結果を示す図である。
【図８】図６の化合物に、更に衝突活性化開裂法を適用
した場合の質量分析の結果を示す図である。
した場合の質量分析の結果を示す図である。
【図９】図７の化合物に、更に衝突活性化開裂法を適用
した場合の質量分析の結果を示す図である。
した場合の質量分析の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋爪 克仁 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 綱澤 進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭58−146540（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−249121（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−257064（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−196858（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−233371（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−133958（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−91564（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−189784（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−53481（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−506196（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−504271（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−507394（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/68 ZNA G01N 33/58
Claims (2)
- 【請求項１】 Ｎ末端標識試薬及び衝突活性化開裂法を
併用する質量分析法によるペプチドのアミノ酸配列解析
方法において、該Ｎ末端標識試薬として、少なくとも塩
素又は臭素が結合したピリジン環を含有し、かつプロダ
クトイオンが荷電を持ち易い化合物を使用することを特
徴とするペプチドのアミノ酸配列解析方法。 - 【請求項２】 質量分析法によるペプチドのアミノ酸配
列解析方法で使用するキットにおいて、少なくとも塩素
又は臭素が結合したピリジン環を含有し、かつプロダク
トイオンが荷電を持ち易い化合物を、Ｎ末端標識試薬と
して含有していることを特徴とするペプチドのアミノ酸
配列解析用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27991595A JP3359203B2 (ja) | 1995-10-04 | 1995-10-04 | ペプチドのアミノ酸配列解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27991595A JP3359203B2 (ja) | 1995-10-04 | 1995-10-04 | ペプチドのアミノ酸配列解析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09101310A JPH09101310A (ja) | 1997-04-15 |
| JP3359203B2 true JP3359203B2 (ja) | 2002-12-24 |
Family
ID=17617691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27991595A Expired - Fee Related JP3359203B2 (ja) | 1995-10-04 | 1995-10-04 | ペプチドのアミノ酸配列解析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3359203B2 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP4524823B2 (ja) * | 1999-04-14 | 2010-08-18 | 住友化学株式会社 | タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法 |
| JP4505905B2 (ja) * | 1999-11-22 | 2010-07-21 | 住友化学株式会社 | ペプチドのアミノ酸配列決定方法 |
| JP2002168869A (ja) * | 2000-12-05 | 2002-06-14 | Sumitomo Chem Co Ltd | ペプチドのアミノ酸配列の決定方法 |
| JP4532874B2 (ja) * | 2003-10-07 | 2010-08-25 | キヤノン株式会社 | 質量分析可能な原子群を構成単位とする鎖状構造を有する分子に対して付加情報を付与して、情報記録コードとして利用する方法 |
| JP4569236B2 (ja) * | 2004-09-15 | 2010-10-27 | 株式会社島津製作所 | タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法、及びタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法 |
| JP2008196965A (ja) * | 2007-02-13 | 2008-08-28 | Kyoto Univ | 質量分析法を用いたペプチドのアミノ酸配列決定方法、該方法に使用されるペプチド誘導体化試薬、及び試薬キット |
| US10436790B2 (en) | 2011-09-28 | 2019-10-08 | Waters Technologies Corporation | Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced MS signals |
| DK3213056T3 (da) | 2014-10-30 | 2020-09-28 | Waters Technologies Corp | Fremgangsmåder til hurtig forberedelse af mærkede glycosylaminer og til analyse af glykosylerede biomolekyler, som giver samme baggrund |
| CN111796039B (zh) | 2014-11-13 | 2023-03-17 | 沃特世科技公司 | 快速标记的n-聚糖的液相色谱校准方法 |
| EP3472621A4 (en) | 2016-06-21 | 2020-03-04 | Waters Technologies Corporation | ELECTRONIZED IONIZATION METHODS OF HIGHLY BASIC AMPHIPATHIC FRAGMENT MODIFIED GLYCANES |
| US11061023B2 (en) | 2016-06-21 | 2021-07-13 | Waters Technologies Corporation | Fluorescence tagging of glycans and other biomolecules through reductive amination for enhanced MS signals |
| WO2018005139A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Waters Technologies Corporation | Methods for the rapid preparation of labeled glycosylamines from complex matrices using molecular weight cut off filtration and on-filter deglycosylation |
-
1995
- 1995-10-04 JP JP27991595A patent/JP3359203B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09101310A (ja) | 1997-04-15 |
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