JP3308526B2 - 血液脳関門のモデル - Google Patents

血液脳関門のモデル

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1989年９月27日に出願された米国特許出願
第097/413,274号の一部継続出願である。
従来の技術 発明の分野 本発明は一般に内皮細胞のインビトロのモデルに関す
る。より詳細には、本発明は、血液脳関門を構成する脳
の微小血管内皮細胞の特徴をシミュレートする、インビ
トロのモデルに関する。
関連分野の説明 脊椎動物の脳は、身体のあらゆる他の器官と異なって
独特の毛細血管系を有する。この独特の毛細血管系は
「血液脳関門」（BBB）を形成する、形態学的および生
化学的特徴を有する。BBBは血液から脳の間質空隙を分
離するように働く。この障壁は、脂溶性でないか、また
は特定のキャリアータンパク質によって輸送されない血
中の分子が、脳に入ることを妨げる（Betz,A.L.ら,Ann.
Rev.Physiol.,48:241（1986）;Pardridge,W.M.,Ann.Re
v.Pharmacol.Toxicol.,28:25（1988））。
BBBを形成する脳の毛細血管の特徴には、（ａ）細胞
の間の分子の輸送をブロックする、脳の内皮細胞間の高
抵抗性の密着結合（tight junction）；および（ｂ）末
梢の毛細血管で生じるものと比べて、細胞を横断する輸
送の量が制限されていること、が含まれる。
BBBの密着結合は、内皮細胞周囲の分子およびイオン
の受動的拡散を妨げる。こうして、他の身体の組織に対
しては容易に透過するほとんどの親水性薬物およびペプ
チドは、脳への侵入を妨げられ、あるいはそれらの侵入
速度は遅い。従って、BBBでは、毛細血管の内腔から毛
細血管周囲の腔外組織に容易に透過する物質はただ、内
皮細胞の内に選択的な輸送系が存在する分子、および脂
溶性の化合物のみである。このような化合物は、その本
来の脂質親和性のために、内皮細胞の形質膜内に分け入
り、腔外側に移行することが可能である。BBBのこれら
の独特の性質は、中枢神経系（CNS）の疾患、例えばア
ルツハイマー病およびパーキンソン病、に対する治療剤
の開発の主要な障害となってきた。
治療薬剤のCNSへの侵入について試験する能力は、２
つの一般的な状況において重要である。第一に、CNS疾
患の広く増加していることと、このような疾患を治療す
るための新しい分子生物学的および生化学的手法の導入
とは、中枢神経系に作用する新規な薬物の開発を導く。
これらの薬物はそれらの脳に到達する、即ち、BBBを透
過する能力について試験されなければならない。第二
に、これまで末梢の疾患に用いられてきた多くの薬物
は、望ましくないCNSに対する副作用を有する。これら
の薬物の代替品を開発する際には、CNSへの透過性もま
たスクリーニングしなければならない。もちろん、この
場合の目的は、脳に侵入しない、末梢作用性薬物を開発
することである。
様々な化合物を慣用の技術で脳への透過についてスク
リーニングすることは実用的ではない。一般に、化合物
は頸動脈内に入れられ、次にそれらの脳内濃度が測定さ
れる。これは各々の個々の化合物に対して多くの動物が
注射され、解剖されることを意味する。インビボでの動
物試験は重要であるが、多くの化合物が試験されなけれ
ばならない場合にはそれは最適なスクリーニング系では
ない。
従って、比較的短時間で多数の薬物を効率よく安価に
スクリーニングすることが可能なように、BBBのインビ
トロでのモデルを得ることが高度に望まれるであろう。
試験系は細胞間の密着結合および同様の透過特性を有す
る点でインビボでのBBBの形態学的および生理学的特徴
を模似していなければならず、また所定の細胞タイプか
ら構成されていなければならない。
インビトロのモデルの他の望ましい特徴は、内皮細胞
の血液側から脳側への薬物の透過を増加させ、または減
少させることに関する性質についての、内皮細胞の操作
を試験するための系が提供されるべきであることであ
る。
BBBのインビトロのモデルを構築しようとする以前の
試みは、上記に概説した問題を直視していなかった。本
来の脳の微小血管は（Kumagai,A.K.J.Biol.Chem.,262:1
5214（1987））、内皮細胞および星状細胞（astrocyt
e）だけでなくマスト細胞も含有するようである。さら
に、微小血管の内腔容積および断面が限られていること
は、方向性をもつ輸送の研究にそれらを使用できなくし
ており、従ってBBBの実用的なモデルとして最適ではな
いものにしている。
幾つかの研究室が、標準的な生育培地の存在下に脳の
毛細血管内皮細胞を用いてBBBのインビトロのモデルを
開発したと主張している（Audus,K.L.ら,Ann.N.Y.Acad.
Sci.,507:9（1987）;Van Bree,J.B.B.H.ら,Pharm.Res.,
5:369（1988）;Hart,M.N.ら,J.Neuropath.Exp.Neurol.,
46:141（1987））。グルタルアルデヒド処理されたコラ
ーゲンゲルの透過性支持体上に生育させた、ウシ脳毛細
血管内皮細胞のクローンは、高い内皮細胞透過抵抗性を
示したと報告された（Rutten,M.J.ら,Brain Res.,425:3
01（1987））。しかし、これらの研究は脳の毛細血管の
本来の形態学的、生化学的および機能的特徴のただ一つ
または少数を実証しただけである。また一部には、使用
した系が一時細胞培養物または細胞系のポピュレーショ
ンを不完全にしか特徴付けていなかったために、さらに
一部には、脳の毛細血管内皮細胞が適切な環境中で生育
されなかったために、このような系から得られるデータ
はしばしば矛盾している。
脳の星状細胞は脳の毛細血管内皮細胞の性質に影響を
与えることが知られている。Janzerら（Janzer,R.C.,Na
ture,325:253（1987））は、フィルター上で培養し同系
動物またはニワトリヒナ胚漿尿膜の眼に移植された新生
児のラットの脳のＩ型星状細胞は、内因性の内皮細胞に
よって血管新生を生じ、そしてその内皮細胞に色素エバ
ンスブルーの排除を起こさせることを開示した。
エバンスブルーまたは他のアルブミン結合性のカチオ
ン性色素の排除は、脳の内皮細胞の一つの特性である。
これらの結果は、星状細胞が内皮細胞に、一般に低いマ
クロ分子輸送速度を示すようにさせ得ることを予想させ
る。これらのことは、しかし、内皮細胞が、これもまた
インビボでのこれらの細胞の特徴である高い抵抗値の密
着結合をつくるように誘導されることを、必ずしも示す
わけではない。
他のインビトロでの研究では、脳の星状細胞の、内皮
細胞の電子顕微鏡構造的性質に対する影響が調べられ
た。脳の星状細胞は、培養された脳由来の内皮細胞の間
に形成された密着結合の、頻度、長さ、および複雑さを
増大させる（Tao−Cheng,J.−H.ら,J.Neurosci.,7:3293
（1987））。さらに、内皮細胞マトリックスでコートさ
れた基質上でラット脳星状細胞馴化培地中に生育させ
た、継代４代目のラット脳毛細血管内皮細胞培養物は、
密着結合の生物学的発生を示した（Arthur,F.E.ら,Dev.
Brain Research,36:155−９（1987））。両方の研究
は、全く、処理細胞の個々の群についての電子顕微鏡的
観察に基づいており、密着結合の抵抗値について見るこ
とを怠っていた。
従って、インビボでの状況を疑似するモデルとして必
要な以下の全ての基準にかなう、BBBのインビトロでの
モデルに対して、重大な必要性が未だ存在する:1）全て
が密着結合で連結した、内皮細胞の単層;2）通常はBBB
を通過しない成分に対する拡散障壁；および３）イオン
の受動的拡散を妨げる密着結合の存在を示す、高い内皮
細胞を通過する電気抵抗の障壁。
発明の要旨 本発明に従って、脳のBBBの重要な形態学的および透
過性の特徴を疑似し、効率のよい安価な中枢神経系薬剤
のスクリーニングを可能にし、およびBBBに対する操作
を試験することを可能にする脊椎動物BBBのインビトロ
のモデルが開示される。
本発明は脳の微小環境の、脳の毛細血管内皮細胞の特
殊な特性に対する影響に基づく。より詳細には、本発明
は一部には、インビトロの単層系での、脳の星状細胞と
脳の毛細血管内皮細胞との間の相互作用の再構築に基づ
く。
本発明はさらに、培養された脳の内皮細胞内に有効な
サイクリックAMP濃度を生じさせる処置を、特に、内皮
細胞の成分と脳の星状細胞による馴化培地との存在と組
合わせて行うと、高い電気抵抗、パロイジンによる細胞
周囲の染色、および通常はBBBを通過しないことが知ら
れている物質に対する拡散障壁、のようなインビボでの
BBBの特性を示す密着結合が、著しく増加されて生じる
という発見にも基づく。
本発明はさらに、サイクリックAMPの有効細胞内濃度
を減少させるか、サイクリックAMPの生理学的作用を妨
害するか、サイクリックGMPの有効細胞内濃度を増加さ
せるか、またはサイクリックGMPの生理学的作用を促進
する薬剤によって、脳の微小血管の内皮細胞間の密着結
合が崩壊し得て血液脳関門がより透過性になり得るとい
う発見、およびこのような操作が血液脳関門を通過する
薬剤のたやすい移送を可能にするという発見にも基づ
く。
従って、本発明の目的は、細胞タイプ間の生理学的相
互作用が可能な装置内に並べられた、微小血管内皮細胞
の単層培養物と脳の星状細胞とを分離する、多孔性の固
体支持体を含有するBBBのインビトロのモデルを開示す
ることである。
本発明の他の目的は、内皮細胞または星状細胞による
馴化増殖培地に接触したフィルターに付着した、微小血
管内皮細胞の単層を含有する、BBBのインビトロのモデ
ルを開示することである。
本発明のさらに他の目的は、インビトロのモデルに特
に適した内皮細胞および星状細胞を選択するための基準
を提供することである。
本発明の目的はさらに、本発明のインビトロのモデル
中の細胞の単層培養物のための基質（substrata）を選
択するための基準を提供することである。
インビトロのモデルの微小血管内皮細胞において有効
な細胞内サイクリックAMP濃度を増加させる手段を提供
することもまた、本発明の他の目的である。
本発明のさらに他の目的は、本発明のインビトロのモ
デルにおける密着結合の発生を試験する基準を提供する
ことである。
本発明のさらに他の目的は、脳の毛細血管以外の血管
からの内皮細胞を用いた、インビトロのBBBのモデルを
提供することである。
本発明のさらに他の目的はまた、インビボおよびイン
ビトロにおいて血液脳関門を開け、それによりこのよう
な関門を通る薬物の移送を可能にするために、サイクリ
ックAMPおよびサイクリックGMPレベル、またはその生理
学的効力を操作することに含まれる組成物および方法を
提供することである。
本発明のこれらのおよび他の目的は、以下の開示およ
び添付の請求の範囲によって明らかにされる。
図面の説明 図１は、ウシ脳の毛細血管内皮細胞培養物を用いた本
発明のBBBモデルの、単層を通過する電気抵抗を示す。
図２は、ウシ網膜内皮細胞およびMDCK内皮細胞の単層
培養物についての、アルブミン流出データを示す。
図３は、密着結合を有する脳の内皮細胞を通過するシ
ョ糖およびクロランブシルの流出データを示す。
図４は、動物のモルヒネ無痛覚症に対する、サイクリ
ックAMP濃度を低める薬剤の効果を示す。
図５は、サイクリックAMPに誘導された密着結合に対
する、サイクリックGMPの内皮細胞レベルの上昇の効果
を示す。
図６は、モルヒネ無痛覚症に対するサイクリックGMP
の内皮細胞レベルの上昇の効果を示す。
図７は、BBBのインビトロのモデルにおける脳の内皮
細胞の密着結合に対する、異なるクラスのサイクリック
AMPホスホジエステラーゼ阻害剤の効果を示す。
図８のパネルＡおよびＢは、ヒト腫瘍細胞の頭蓋内注
射によりMSタイプの炎症が誘導された脳部位からの切片
の顕微鏡写真である。ヒトおよびマウスのリンパ球を切
片に接触させ、そして、パネルＡに示されるように、そ
れに曝された脳の内皮細胞と選択的に結合した。パネル
Ｂでは、リンパ球はヒトVLA−４レセプター（抗ヒトβ
−１インテグリン）を阻害する抗体で処理し、図からわ
かるように、ヒトリンパ球（大きい細胞）の結合は実質
的に阻害された。
図９は、脳の内皮細胞培養物における、リンパ球の結
合および結合の阻害を示す写真である。パネルＡは、BB
Bモデルの内皮細胞に対するリンパ球の低レベルの結合
を示している。パネルＢでは、内皮細胞が炎症性薬剤で
処理されており、リンパ球の結合が実質的に増加してい
る。パネルＣでは、リンパ球は抗ヒトβ−１インテグリ
ンに対するモノクローナル抗体で予め処理されており、
それらの内皮細胞への結合は実質的に阻害されている。
図10は、炎症誘起された脳の組織切片中の血管、およ
び比較の基準としての正常リンパ節組織に対する、リン
パ球の結合の相対的程度を示すグラフである。「無添
加」のカラムは無処理のリンパ球が添加された脳の組織
（斜線）およびリンパ節内皮（黒枠）を示す。結合の程
度を100％とする。次の２つのカラムでは、リンパ球は
予め抗VLA−４薬剤で処理された。中央のバーは抗β−
１モノクローナル抗体で前処理されたリンパ球を示し、
右側のバーは抗α−４モノクローナル抗体で前処理され
たリンパ球を示す。両方の場合に、リンパ球の脳組織へ
の結合はコントロールと比較して、ほとんど完全に阻害
されている。しかし、リンパ球のリンパ節内皮への結合
は、両方の場合に、有意には阻害されない。
図11は、BBB系中の脳の内皮細胞に対する、Jurkat T
細胞リンパ球の結合の相対的程度を示すグラフである。
容易にわかるように、抗β−１抗体は、TNF−αに活性
化された脳の内皮細胞に対する、白血球の結合を有効に
阻害した。一方、コントロールとしての抗β−２は、無
処理のコントロールに近かった。簡潔にいえば、β−１
サブユニットは、脳におけるVLA−4/VCAM−１相互作用
を防ぐための有効なターゲットを提供する。
発明の詳細な説明 本発明は、電気抵抗の高い密着結合および他のインビ
ボでのBBBの特性を有する、混合あるいはクローン化さ
れた内皮細胞のインビトロモデルを包含する。
本発明の１つの実施態様は、多孔性の固体支持体によ
って少なくとも２つの区画に分けられたチャンバーを包
含し、その１方の区画の支持体の表面では、特定の基質
上で混合あるいはクローン化脳微小血管内皮細胞の実質
的にコンフルエントな単層細胞が、そしてチャンバーの
第２の区画では、チャンバーの２番目の表面あるいは多
孔性固体支持体の下側表面上に実質的にコンフルエント
な脳星状細胞の単層細胞が収容される。両方の細胞型の
細胞単層は十分近位にあり、そのため各細胞型の産生物
は容易に他の細胞型の細胞に到達し得る。我々は「多孔
性」よって、そこに入っている細胞は通れないが水およ
び溶質が通りぬけられる間隙を有することを意味する。
別の実施態様では、内皮細胞に接触している増殖培地は
部分的に、星状細胞あるいは内皮細胞由来の馴化培地あ
るいはその相当物を含む。「馴化培地」によって、培養
細胞が細胞由来の物質を分泌した組織培養増殖培地を意
味する。「相当物」によって、別の環境では細胞外に分
泌され得る細胞由来の物質を含有する、細胞あるいは組
織抽出物を意味する。馴化培地および相当物の調製例
は、下記に提供する。このモデルのこれらの実施態様で
は、以下に述べるように細胞間電気抵抗は直接測定し得
る。これらのモデルの構築の詳細を下記に提供する。
本発明の他の実施態様では、混合あるいはクローン化
微小血管内皮細胞はまた、Ryanら（Ryan,J.ら、Tissue
Cell,12:619（1980））に従って、例えばCytodex−３ミ
クロキャリアー（Pharmacia,Uppsala,Sweden）のような
コートされたミクロキャリアービーズ上で生育され得
る。このモデルでは細胞間抵抗値は直接測定し得ない
が、例えば標識されたアルブミン、陽イオン化アルブミ
ン、あるいはグリコシル化アルブミン、および、トリパ
ンブルーあるいはエバンスブルーのような色素の高分子
の経細胞輸送を測定し得る（Kempski,O.ら、Acta Neuro
pathol.,74:329（1987）;Bioadjieva,S.ら、Lab Inves
t.,50:239（1984）;Smith,R.K.ら、Pharm.Res.,5:466
（1988））。ミクロキャリアー上で生育される内皮細胞
への星状細胞の影響は、先ず新生ラット１型星状細胞の
ような脳星状細胞をビーズ上で増殖させ、次にそれらの
細胞外マトリックスを残して星状細胞を取り除くことに
より、同定し得る。これは、１％のトリトンＸ−100を
含む5mMトリスバッファー,pH7.4中で星状細胞を15分間
溶解するか、あるいは10mM EDTAを含むリン酸バッファ
ー（PBS）中で30分間星状細胞をインキュベートするこ
とにより、成し得る。これらの溶液はどちらも、アプロ
チニンおよびフェニルメチルスルホニルフルオリドのよ
うなプロテアーゼ阻害剤を含有する。コートされたビー
ズはPBSで３回洗浄し得、次いで25mMのNH4OHで処理され
る。再度PBSで洗浄した後、ビーズを、実質的に単層の
培養内皮細胞でコートする。一度コンフルエンスに達す
ると、内皮細胞は培養星状細胞を含む増殖培地で、ある
いは、星状細胞あるいは内皮細胞由来の馴化培地で、維
持される。
別の実施態様では、混合あるいはクローン化微小血管
内皮細胞は、ホローファイバー細胞増殖装置（Amicon C
orp.,Danvers,MA）に使用されているもののような多孔
性の管様構造物上で増殖し得る。さらにホローファイバ
ーの表面は星状細胞でコートされ得、それから星状細胞
の細胞外マトリックス（ECM）を上述のように調製し得
る。次に内皮細胞は星状細胞BCM上で増殖させ得、そし
て星状細胞あるいは内皮細胞由来の馴化培地に曝され
る。この実施態様では、細胞間電気抵抗はホローファイ
バーの内側と外側にある電極間に電流を通じることによ
り測定され得る。高分子のフラックス（flux）は、標識
高分子をファイバーの外側に加え、それらの内皮細胞の
向こう側のファイバー内への輸送を追いかけることによ
り測定し得る。
星状細胞の由来 新生齧歯類脳１型星状細胞を、Lillienら（Lillien,
L.E.ら、Neuron,1:485（1988））の方法に準じて調製し
た。簡単に述べると、大脳皮質を新生ラットから採り、
白質を捨て、灰白質を機械的に、そして酵素（トリプシ
ン消化）によって遊離させた。細胞をポリリジンでコー
トしたフラスコに蒔き、ダルベッコの改変イーグル培地
（DMEM）および10％の牛胎児血清（FCS）を加えた。５
日後、フラスコを振って緩く付着している細胞を除去
し、付着している細胞を新しいフラスコに継代し、そし
て活発に増殖している夾雑細胞を除去するためにシトシ
ンアラビノシド（抗細胞分裂剤）で処理した。最後に、
星状細胞を化学的に特定された培地で維持し、週に２回
培地を加えた。細胞型は特定のセットの抗体との反応性
で同定した。例えば、１型星状細胞は神経膠繊維酸性タ
ンパク質に対する抗体で蛍光標識されるが、モノクロー
ナル抗体A2B5（２型星状細胞を標識する）あるいは抗ガ
ラクトセレブロシド抗体（オリゴデンドロサイトを標識
する）では標識されない（Raff,M.C.ら、J.Neurosci.,
3:1289（1983））。
毛細血管内皮細胞の由来 内皮細胞は種々の動物およびヒトの原料から調製され
る。例えば、内皮細胞の混合集団は齧歯類およびウシの
脳、ウシの網膜、ウシの副腎、ウシ大動脈、および、ヒ
ト大網あるいはヒト臍帯静脈から単離した毛細血管から
調製し得る。大量の組織が採取でき、新鮮な組織が容易
に入手でき、そしてウシの毛細血管細胞の透過性がヒト
のそれに相当する細胞の透過性に類似しているので、ウ
シ原料は特に適している。
ウシ脳微小血管細胞は、Audusら、Pharm.Res.,3:51
（1986）のように分離した。簡単に述べると、Liebovit
zのＬ−15培地中の脳灰白質のスラリーをホモジナイズ
し、そして微小血管細胞を含有する特定の画分をデキス
トランクッションで分離した。毛細血管を再懸濁してホ
モジナイズし、次いで一連のナイロンフィルターに通し
た。毛細血管をさらにコラゲナーゼおよびトリプシンで
消化して遊離の混合内皮細胞集団を得た。これらの細胞
をコラーゲンあるいはフィブロネクチンで処理した基質
に撒き、10％のウマ血漿由来血清（PDHS）を含むダルベ
ッコの改変イーグル培地（DMEM）を加えた。同様にラッ
ト脳微小血管内皮細胞をBowmanら（Bowman,P.D.ら、In
Vitro,17:353（1981））に従って調製した。簡単に述べ
ると、脳灰白質を細かく刻み、コラゲナーゼで消化して
分散させる。粒状の物質を25％のウシ血清アルブミン
（BSA）のクッション上で分離し、ペレットはさらにコ
ラゲナーゼおよびDNアーゼで消化する。最後に、内皮細
胞をパーコール勾配で分離し、洗浄した細胞をコラーゲ
ンで処理した基質に撒き、DMEM＋20％血漿由来ウマ血清
（PDHS）＋150μg/ml内皮細胞増殖用添加物（ECGS、Sig
ma Chemical Co.,St.Louis,MOより入手可能）（McGuir
e,P.G.ら、Lab.Invest.,57:94（1987））を加える。
混合ウシ大動脈内皮細胞を調製するために、大動脈か
ら外膜および結合組織を切除し、切り開いて内膜層を露
出し、そして内部をRPMI 1640中の0.1％コラゲナーゼに
接触させた。37℃で20分間インキュベートした後、ゆる
められた細胞をDMEM＋10％ウシ胎児血清（FCS）中に剥
離させ、組織培養フラスコに撒いた。齧歯類大動脈細胞
では、露出させた内膜層をコラーゲン処理した表面に置
き、最少限の量の増殖培地（DMEM＋20％FCS＋150μg/ml
ECGS）を加えた。内皮細胞は体外移植組織から成長
し、この増殖培地中で増殖する。
ヒト内皮細胞の混合集団はまた、新鮮な臍帯静脈から
分離し得る。静脈にカニューレを入れ、RPMI 1640培地
を流した後、内膜層を、RPMI 1640中の1mg/mlコラゲナ
ーゼにさらす。約37℃で15分後、剥がれた細胞を静脈か
ら洗い出し、遠心して集め、細胞のペレットをDMEM＋20
％FCSに浮遊させ、そしてコラーゲン処理した基質上に
細胞を撒く（Gimbrone,M.A.ら、J.Cell Biol.,60:623
（1974））。また、これらの細胞は市販されている（Cl
onetics,San Diego,CA）。
細胞は、抗フォン・ウィルブランドタンパク質（Beri
ng Diagnostics,La Jolla,CAのウサギ血清）での免疫蛍
光アッセイ、および、ジ−Ｉ−標識したアセチル化LDL
（Molecular Probes,Junction City,OR）の取り込みに
よって内皮細胞であると同定される。内皮細胞は、典型
的には週に１度継代し、DMEM＋10％あるいは20％のFC
S、あるいは10％PDHSで維持する。
所望ならば、培養内皮細胞はクローニングリング法を
使用してクローン化し得る。細胞を低密度（プレート10
cm当り細胞1000個）で10％FCS中に撒く。シリコーング
リースに漬けたプラスチッククローニングリングを、１
個あるいは１対の細胞を囲んで単離するように、倒立顕
微鏡下で細胞上に置く。クローンが増殖し始めたらリン
グ内で細胞をトリプシン消化して剥し、マルチウェル培
養ディスクのウェルに移す。ウシ脳、ウシ大動脈、ラッ
ト大動脈およびラット脳の微小血管内皮細胞の複数のク
ローンをこの方法で単離し得る。
星状細胞由来馴化培地 新生ラット脳１型星状細胞をポリ−Ｄ−リジンでコー
トした75cm2フラスコでコンフルエントになるまで増殖
させた。新鮮な培地を細胞に加え、２−４日後に採取し
た。その培地を0.2μのミリポアフィルターで濾過し、
そして少量に分注して−80℃で凍結保存した。
内皮細胞由来馴化培地 ウシ大動脈あるいは網膜内皮細胞を75cm2フラスコで
コンフルエントになるまで増殖させた。新鮮な培地を細
胞に加え、上述のように馴化培地を採集し保存した。
星状細胞抽出物 新生ラット脳の１型星状細胞を上述のように増殖させ
た。細胞をディッシュから3mlの氷冷DMEM中に剥離し、
ドンスホモジナイザー中氷浴温度でホモジナイズした。
ホモジネートをBeckman Instruments SW40ローターで4
0,000rpmで30分間遠心した後、上澄み液を0.2μのミリ
ポアフィルターで濾過し、そして少量に分注して−80℃
で凍結保存した。
脳抽出物 新生ラット脳皮質を取り出し、DMEM中（3ml/gm組織湿
重量）でホモジナイズした。ホモジネートを遠心し、上
述の星状細胞抽出物のように処置した。
サイクリックAMP濃度の上昇 内皮細胞培養物を、サイクリックAMP濃度を上昇させ
ることが知られている１つあるいはそれ以上の物質で処
理した。これらには以下のものが含まれるが、これらに
限定されない:1）イソプロテレノールのような、細胞表
面上の特定のβ−アドレナリン作動性レセプターに結合
し、そしてアデニル酸シクラーゼのＧタンパク質介在性
の活性化を刺激する、約10から約100μＭのβ−アドレ
ナリン作動薬;2）５−ヒドロキシトリプタミンのような
セロトニン作動性化合物;3）直接アデニル酸シクラーゼ
を活性化する物質であるフォルスコリン（Sigma Chem.C
o.,St.Louis,MO）;4）副甲状腺ホルモン；および５）カ
ルシトニン遺伝子関連ペプチド（calcitonin gene rela
ted peptide;CGRP））。サイクリックAMPホスホジエス
テラーゼの阻害剤を加えると、サイクリックAMPをアデ
ニル酸に分解する酵素は上述の様式によるサイクリック
AMP上昇効果を強調する。そのような阻害剤の例には、
４−（３−ブトキシ−４−メトキシベンジル）−２−イ
ミダゾリジノン（Hoffman−LaRoche,Nutley,N.J.）、テ
オフィリンおよびメチルイソブチルキサンチン（Sigma
Chem.Co.）、ロリプラム（Rolipram）（Berlex,Inc.）
およびRO−20−1724（BioMol,Inc.,Phymouth Meeting,P
A）がある。さらにある種のサイクリックAMPの誘導体
は、そのような細胞中でのサイクリックAMPの有効濃度
を上昇させるのに使用し得る。そのような誘導体には８
−ブロモサイクリックAMP（Sigma Chem.Co）および８−
（４−クロロフェニルチオ）サイクリックAMP（Boehrin
ger−Mannheim Corp.,Indianapolis,IN）が含まれる。
「有効なサイクリックAMP」によって、我々は内因性サ
イクリックAMP、あるいは内皮細胞を透過してそのよう
な細胞内で内因性サイクリックAMPのように生理学的に
作用するサイクリックAMP誘導体を意味する。「有効な
サイクリックGMP」によって、内因性サイクリックGMP、
あるいは内皮細胞を透過してそのような細胞内で内因性
サイクリックGMPのように生理学的に作用するサイクリ
ックGMP誘導体を意味する。サイクリックAMPあるいはサ
イクリックGMPあるいはこれらの誘導体の「生理学的作
用」によって、我々はこれらのサイクリックヌクレオチ
ドの、それらによるとされている生理学的作用を、最終
的に引き起こす即時の生化学的反応を意味する。例え
ば、サイクリックAMPは、特定のタンパク質のセリン、
スレオニンおよびチロシンのようなヒドロキシアミノ酸
残基のリン酸化を触媒する、ある種のプロテインキナー
ゼを活性化する。そのようなリン酸化はこれらのタンパ
ク質を活性化する。サイクリックAMPの効果は、上述の
ヒドロキシアミノ酸残基を含有するタンパク質の脱リン
酸化を触媒するホスホプロテインホスファターゼによっ
て解消される。
脳毛細血管内皮細胞を多孔性の固体支持体上でPDHSお
よび細胞内サイクリックAMPの実際の濃度あるいは有効
濃度を上昇させる１つあるいはそれ以上の上述の物質を
含有する、増殖培地で増殖させた場合、単層間電気抵抗
値は、約50から約350オーム−cm2に、約７倍増加した
（図１）。しかし、この系でウシ大動脈内皮細胞由来馴
化培地（BAEC−CM）がさらに存在した場合、単層を通過
する電気抵抗値は約10倍に上がった（実施例５）。単層
内皮細胞を星状細胞細胞外マトリックス上で増殖させる
と、サイクリックAMPおよびBAEC−CMの効果が強化さ
れ、26倍に昇る抵抗値の増加を生んだ（実施例５）。従
って本発明のBBBモデルは、少なくとも200オーム−c
m2、好ましくは300オーム−cm2より高く、さらに好まし
くは約1000オーム−cm2から約1500−2000オーム−cm2よ
り高い単層間電気抵抗値を提供し得る。
さらに、電気抵抗測定によって同定される混合内皮細
胞間の密着結合の形成を結果的に伴う、サイクリックAM
Pの実際の濃度あるいは有効濃度の上昇はまた、ファロ
イジンにより辺縁が実質的に染色されることを伴うこと
も発見された。ファロイジンとは、繊維状アクチンに結
合してそれらの脱重合化を防ぐことが知られている、Am
anita phalloidesが産生する毒素である（Stryer,L.,
“Biochemistry",3d.W.H.Freeman,N.Y.1988,p.940）。
これらの処置された内皮細胞中のファロイジン染色の帯
様パターンは、高い抵抗値の密着結合を示す上皮細胞中
に見られるそれと類似している。（Gumbiner,B.,J.Cell
Biol.,107:1575（1985））さらに、内皮細胞由来ある
いは星状細胞由来馴化培地およびサイクリックAMPを促
進する物質で内皮細胞を増殖させて、細胞辺縁のファロ
イジン染色が実質的に存在する場合、単層を通過する電
気抵抗は馴化培地がない場合に得られる電気抵抗より上
昇した。
さらに、分離された時から内皮細胞を星状細胞由来馴
化培地（ADCM）で増殖させた場合、本発明の血液脳関門
モデルの内皮細胞の密着結合の形成が実質的に促進され
ることが発見された。従って、例えばCostarのフィルタ
ーのようなフィルター上で内皮細胞を継代すると、それ
らは、10％のウシ胎児血清および50％N2（化学的に特定
された培地）を含有するMEM中で調製された50％ADCMを
含有する培地中で好ましく増殖させ得る。フィルター上
で２−３日増殖させた後、それらはサイクリックAMPの
アナログおよびサイクリックAMPホスホジエステラーゼ
阻害剤（例えばロリプラムあるいはRO 20−1724）で処
置し得る。
さらに、他の目的で培養する場合に一般的に使用され
る10％よりも実質的に低濃度（例えば0.5％から５％）
のウシ胎児血清で、内皮細胞を培養すると、本発明の血
液脳関門モデルの細胞の抵抗性の上昇が得られることが
発見された。
低下したサイクリックAMP濃度または生理学的活性 上記示されたように、組織におけるサイクリックAMP
の上昇は、どのような手段によって起こるものであろう
と（例えば、サイクリックAMPアナログの添加、内因性
アデニル酸シクラーゼ活性を刺激する化合物の添加、ま
たはサイクリックAMPホスホジエステラーゼ活性を抑制
する化合物を添加すること、これによるサイクリックAM
P分解の抑制）、脳内皮細胞間の密着結合形成を増進さ
せる。
サイクリックAMPアナログを除いたり、あるいは本発
明の血管−脳モデルの内皮細胞培養物からのサイクリッ
クAMPレベルを上昇させる物質を取り除くと、抵抗がた
だちに低下し、密着結合の透過性が上がったことを示す
ことが、また発見されている。
これらの発見は、脳内皮細胞間の密着結合を調節する
アプローチへと導いた。即ち、（ａ）アデニル酸シクラ
ーゼにより内因性サイクリックAMPの形成を抑制する化
合物；（ｂ）サイクリックAMPの競合性阻害物質；
（ｃ）サイクリックAMPで活性化される酵素であるプロ
テインキナーゼの阻害物質；および（ｄ）リン酸化され
たタンパクを脱リン酸化し、これによりサイクリックAM
Pシステムによって活性化される酵素であるタンパクホ
スファターゼの刺激物質、である。
上記アプローチ（ａ）の基本は、下記の通りである。
形質膜でのアデニル酸シクラーゼ活性を調節するシステ
ムは、以下のものから構成される。即ちGTP;GTPと結合
するとアデニル酸シクラーゼ活性を抑制するGi調節タン
パク質;GTPと結合するとアデニル酸シクラーゼを活性化
するGs調節タンパク質；およびGiまたはGsへのGTPの結
合を増加させるアゴニストである。α−アドレナリン作
動性物質およびアデノシンA1レセプターアゴニスト［例
えば、シクロペンチルアデノシン（CPA）およびN6−
（フェニルイソプロピル）−アデノシン（Ｒ−PIA）の
（−）立体異性体］のようなGiへのGTP結合を増加させ
るアゴニストが、特に後者のアゴニストが、脳内皮細胞
の抵抗を減少させる効果があることが現在発見されてい
る。そのような観察は、本発明の血管−脳モデルでイン
ビトロでなされ得るし、あるいは下記インビボ実施例で
示されるようにマウスでのインビボでの脳灌流および行
動試験システムで、なされ得る。例えば、サイクリック
AMPの細胞内産生をおそらく抑制するGiアゴニストは、
痛覚消失を生じさせるためにマウスに経静脈的に投与さ
れるべきモルヒネの量を低下させることが見い出された
（モルヒネは、脳にあまり透過しない）。他のインビボ
試験システムは、試験薬物を麻酔されていない動物に経
静脈的に投与することを包含し、この注入物はさらに通
常BBBを通過しない標識された追跡物質を含んでいる。
その後、実験動物は麻酔剤を注入され、次いでリン酸緩
衝生理食塩水および組織固定液を注入される。次に脳を
摘出、切断し、追跡物質の量を測定する。これらの試験
システムによる観察から、アデニル酸シクラーゼを抑制
しサイクリックAMP産生を減少させる物質が、密着結合
の透過性を上昇させ、かつ血液脳関門を開かせて、これ
により薬剤到達システムを提供することが提案される。
上記アプローチ（ａ）はまた、阻害物質を使って、例
えばGsシステムを刺激するノルエピネフリンの様な内因
性リガンドの前述したGsシステムのレセプターへの結合
をブロックすることを含む。この手段により、サイクリ
ックAMPの内因的産生は減少せられ、これにより脳微小
血管の内皮細胞間の密着結合形成を低下させる。アプロ
ーチ（ａ）はまた、合成ヌクレオシドジデオキシアデノ
シンのようなアデニル酸シクラーゼを直接的に阻害する
物質を含む。
上記アプローチ（ｂ）の基本的事項は、サイクリック
AMP作用の競合的阻害剤が、密着結合の透過性を上昇さ
せ、これにより血液脳関門を開かせるということであ
る。本発明の血管−脳モデルで試験され得るこのタイプ
の化合物には、サイクリックAMPのRpジアステレオマー
を含む。
上記アプローチ（ｃ）の基本は、下記の通りである。
サイクリックAMPは、１つまたはそれ以上のプロテイン
キナーゼを活性化し、それがかぎとなるタンパク質のリ
ン酸化を触媒することにより、生理学的に作用すること
が知られている。従って、プロテインキナーゼの阻害剤
は脳内皮細胞間での密着結合形成におけるサイクリック
AMPの効果を無効なものとする。下記実施例において詳
述されるように、K252aおよびnM（10−200nM）濃度のス
タウロスポリンのようなプロテインキナーゼ阻害剤は、
脳内皮細胞培養物の抵抗値を著名に低下させ得る。両阻
害剤とも可逆的であった。光学顕微鏡レベルでは、サイ
クリックAMPの除去、あるいはプロテインキナーゼ阻害
剤の添加は内皮細胞密着結合を明らかに分離させること
が発見された。
上記アプローチ（ｄ）の基本は、リン酸化がサイクリ
ックAMP活性化プロテインキナーゼにより触媒されたそ
れらのかぎとなるタンパク質の脱リン酸化が内皮細胞間
の密着結合を維持するのに不活性なリン酸化されていな
いタンパク質を産生することである。
サイクリックGMPの濃度あるいは活性の上昇 他の調節性環状ヌクレオチドであるサイクリックGMP
は、酵素グアニル酸シクラーゼによりGTPから産生され
る。
脳内皮細胞内のサイクリックGMPの濃度あるいは生理
学的活性を上昇させると、電気抵抗の低下、そしてそれ
による密着結合透過性の上昇がもたらされることが今で
は見い出されている。脳内皮細胞サイクリックGMPの濃
度の上昇または生理学的活性の上昇は、例えば下記によ
り達成される。即ち、８−ブロモ−サイクリックGMP、
心房性ナトリウム利尿因子およびニトロプルシドナトリ
ウムによって、およびジピリダモル（dipyridamole）
（Research Biochemicals,Inc）またはZaprinast（Rhon
e−Poulenc）のようなサイクリックGMPホスホジエステ
ラーゼ阻害剤によって達成され得る。例えば、本発明の
血管−脳モデルの脳内皮細胞の抵抗値を上昇させること
に対する、0.1から100μＭの濃度のニトロプルシドがサ
イクリックAMPアナログであるRO−20−1724を著名に抑
制するのが観察された。そのような物質は、上述のイン
ビボ試験システムの試験動物の血液脳関門を開かせるこ
とに対する効果を決定するのに使用され得る。例えば、
後述するインビボでのモルヒネによる痛覚消失試験シス
テムは、以下のことを明示するために使用され得る。即
ち、ニトロプルシドナトリウムはモルヒネに対して血液
脳関門を開かせること、および脊椎動物にある内因性ア
ヘン誘導体で末梢循環系に投与された場合脳には有意に
透過しないエンケファリンに対してジピリダモルは血液
脳関門を開かせる、ということを明示するために使用さ
れ得る。
チャンバーBBBモデルの構築 本発明の一般的実施態様において、脳毛細血管内皮細
胞は、例えばフィルターや膜などの、基質にコーティン
グを施した多孔性固体支持体の上で生育される。内皮細
胞はNucleoporeポリカーボネートフィルター（Costar,I
nc.,Cambridge,MA）、Millicell CMおよびHA多孔性ニト
ロセルロースフィルター（Millipore Corp,Bedford,M
A）、およびコラーゲン膜（ICN Biomedical,Inc.,Costa
Mesa,CA）に付着し、生育しえることが知られていた。
Millicell CMおよびNucleoporeポリカーボネートフィル
ターは、前処理、即ち例えばフィルターへの細胞の接着
を促進させるための成分である細胞外マトリックス物質
（ECM、下記を参照）によるコーティングを必要とし
た。Nucleoporeフィルターは、フィルター越しの培地交
換を促進し、そして通過するための細胞のプロセスを可
能にする。フィルターは、チャンバーの２つの区画の操
作を分離させることができるので、細胞が血管側および
大脳側のドメインをより完全に確立するのを可能にす
る。
多孔性の固体支持体は、下記ものの水性溶液の中に浸
すことによりECMでコーティングされ得る。即ち、ラミ
ニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチン（典型的
には、約10から約50μg/ml）,PBS中のMatrigelR（Colla
borative Res.,Bedford,MAから入手したEHS肉腫からの
抽出物），希酢酸中のラットの尾のタイプＩコラーゲン
あるいはタイプIVコラーゲン（Collaborative Researc
h,Inc.,Collagen Corp,およびNew York Blood Bank,N.
Y.）、あるいは星状細胞細胞外マトリックス（AECM）の
水性溶液である。
好ましい実施態様においては、フィルターは、下記の
方法で星状細胞によって合成される星状細胞細胞外マト
リックス（AECM）でコーティングされた。ラット脳のＩ
型星状細胞は上述のように産生され、化学的に特定され
た培地でフィルター上に生育された。細胞がいったんコ
ンフルエントに達すると、それらを例えばTriton X−10
0のような非イオン性界面活性剤を含む弱イオン強度の
緩衝液で溶解し、そしてアプロチニンのようなプロテア
ーゼ阻害剤を含むPBSですすいだ。これは細胞を除去
し、フィルターの上にコーティングとしてAECMが残っ
た。あるいはまた、AECMは非イオン性の界面活性剤でコ
ンフルエントな単層の星状細胞を溶解し、次いで6Mの尿
素、6MのグアニジンHClあるいは2MのMgCl2のような変性
物質で細胞外マトリックス成分の残渣を抽出することに
より調整された。この抽出物は、フィルターの上で培養
されている内皮細胞に添加する前に、あるいは内皮細胞
を加えるのに先だってフィルターをコートするのに使用
される前に、生理的食塩水に透析された。
本発明のBBBのチャンバータイプのインビトロモデル
での１つの実施態様では、実質的にコンフルエントな単
層のラット脳Ｉ型星状細胞は多孔性固体支持体の一方の
側に配置され、そして実質的にコンフルエントな単層の
内皮細胞は逆側の多孔性固体支持体のECMコーティング
上に配置された。このようにして得られた共培養装置は
チャンバー内に固定されて、チャンバーを少なくとも２
つの区画に効果的に分割し、一方は脳側（内皮細胞側）
を、そして他方はBBBの血液側を表すようにされた。細
胞はその後、好ましくはPDHSを含む増殖培地に接触する
ように置かれた。
他の実施態様では、ECMコーティングされた多孔性固
体支持体がチャンバー内に固定された。多孔性固体支持
体のECMコーティングされた１つの表面の上には、培養
星状細胞が配置され；次いで内皮細胞が低密度（約105
細胞/30mmフィルター）で逆側のECMコーティングされた
表面に置かれた。星状細胞は、内皮細胞に接している増
殖培地を“馴化”し、そして密着結合形成を含む内皮細
胞の適当な分化的変化を誘導し得る。この細胞は、血
清、好ましくはPDHSを含む培養培地の中で生育された。
他の実施態様では、微小血管の内皮細胞は、コーティ
ングされていない、あるいはEMCコーティングされた固
体支持体の上に上述のように配置され、そして支持体は
チャンバー内の培養脳星状細胞が置かれている表面に固
定された。増殖培地は、共培養物が生化学的に相互作用
するように内皮細胞および星状細胞の両方に接触しなけ
ればならない。
さらに他の実施態様においては、微小血管の内皮細胞
は上述のようにECMコーティングされた多孔性固体支持
体の上に配置されたが、星状細胞は多孔性固体支持体の
対側またはチャンバーの表面のどちらかには配置しなか
った。そのかわり、チャンバーの血液区画、即ち、内皮
細胞を収めている逆側の区画での増殖培地は、０％から
100％の星状細胞由来あるいは内皮細胞由来の馴化培地
に補足されるか、あるいは必要に応じて上述したように
得られる脳または他の組織抽出物で補足された。
内皮細胞内でサイクリックAMPの細胞内濃度を上昇さ
せるための物質または有効なサイクリックAMP濃度を上
昇させるための物質が増殖培地に添加され得、それらは
例えばトリパンブルーやエバンスブルーのような色素
や、または密着結合の抵抗性を試験するために使われる
他の巨大分子であり得る。
内皮細胞に接している増殖培地のブドウ糖濃度は、脊
椎動物での生理学的濃度、即ち約100mg/dl以上でないこ
とが好ましい。
密着結合の定量 BBBモデルの内皮細胞層における密着結合の存在は、
密着結合に付随するタンパク質を認識する試薬を使用す
ることにより検知し得る。例えば、ZO−１密着結合タン
パク質に対して作られたモノクローナル抗体40.76は、
ウシおよびマウスの両者の内皮細胞上にある抗原を特異
的に認識する（Anderson,J.M.ら,J.Cell Biol.,106:114
1（1988）;Stevenson,R.B.ら,J.Cell Biol.,103:755（1
986））。このアプローチは、使用者が内皮細胞の小さ
なサブセット間の密着結合形成を検知するのを可能に
し、そして密着結合形成を促進するために培養条件を改
善するのを可能にする。
密着結合の密着の度合いは、細胞間電気抵抗の測定に
よってもまた評価し得る。内皮細胞間の抵抗測定のため
に、細胞は例えば、フィルターまたは膜のような多孔性
固体支持体の上で生育された。この支持体はCostar Tra
nswell器具またはICN Cellogenのような細胞単層を適切
に懸濁するための支持装置に付着した。単層間の抵抗
は、例えばPerkinsらの装置を使って測定される（Perki
ns,F.M.ら,Am.J.Physiol.,241:C154（1981））。細胞
は、増殖培地または生理的食塩水の中で維持され、そし
てそれぞれの内皮細胞の上でカロメル電極が飽和KCl−
３％アガーブリッジにより連結された。電流は２つのAg
−AgCl電極間を流れ、電圧はKeithlyマルチメーターで
測定された。短い電流パルス（10−100μamp）が適用さ
れるとき誘導される単層間の電圧の変化から計算され
る。フィルターまたは膜単独の抵抗は差し引く。フィル
ターまたは膜の表面領域の相乗効果を受けて、抵抗はオ
ーム−cm2単位の抵抗を生じる。
上記の通り、ファロイジン毒素の辺縁での結合は、内
皮細胞間の密着結合の特徴である帯様の線維状アクチン
の存在を示している。ファロイジンによる線維状アクチ
ンの染色は、ファロイジンクマリンフェニルイソチオシ
アネートまたは蛍光FITC−ファロイジンまたはTRITC−
ファロイジン（Signma Chem.Co.,St.Louis,MO）のよう
な誘導体を使って可視化し得る。
内皮細胞間の密着結合形成を評価する他の手段は、血
管先端側から脳管腔側にかけての巨大分子の運搬を決定
することである。例えば、アルブミンに強く結合する水
溶性色素であるエバンスブルー（mol.wt.960）（Freedm
an,F.B.ら,Am.J.Physiol.,216:675（1969））は、新し
く形成された内皮細胞結合の密着度を評価するのに使う
ことができる。即ち、色素を排除するか、あるいは限ら
れた運搬を示す密着結合のある組織は白いままで残り、
他方、密着結合をもたないか、またはかなりの運搬能力
を発揮する組織は、色素が結合部を通過するので青く染
まる。密着結合形成の他の水に可溶な巨大分子マーカー
には、デキストランに結合した蛍光イソチオシアネート
（FITC−dextran.mol.wt.20,000,Sigma Chem.Co.）およ
び125I−で標識したアルブミン（DuPont/NEN,Wilmingto
n,DE）が含まれる。他の大きさの蛍光デキストランおよ
びナトリウムフルオレセインそれ自身も同様に使用され
得る。本発明の血管−脳モデルにおける内皮細胞間の結
合密着度を評価するさらにもう１つの手段は、単層の内
皮細胞がある場合およびない場合のフィルターを通過す
るショ糖のような親水性化合物、およびクロラムブシル
のような同様の大きさの疎水性化合物の運搬を比較する
ことである。単層間の電気抵抗が高いとき、ショ糖の運
搬は、クロラムブシル（または同様のサイズの他の疎水
性化合物）に比較して低いはずである。あるいは、電気
抵抗が高いとき、ショ糖の運搬は細胞のついていないフ
ィルターを通過するときよりも非常に低い（例えば、50
倍またはそれ以上）はずである。反対に、「漏れのあ
る」細胞結合部においては、ショ糖の相対的な運搬度は
実質的に増大する。
リガンド結合、トランス膜動輸送（transcytosis）およ
び薬物移送の評価 本発明のモデルにおいて、分化した内皮細胞の両面ま
たはECMコーティングされた多孔性固体支持体の両面に
アクセスすることにより、特異的結合のアッセイおよび
先端（管腔）面または基底外側（管腔）面からの放射線
標識したリガンドの取り込みをアッセイすることが可能
になる。さらに、標識されたプローブを多孔性固体支持
体の片側に加えることによって、単層の一方から他方へ
と膜動輸送されるプローブの能力を評価することができ
る。
このモデルはまた、脳実質用の潜在的な新しい治療薬
評価試験を可能とする。例えば、Ｌ−DOPAのようなアミ
ノ酸運搬体により認識され運搬される薬剤は、BBBを通
過することができる。脂質親和性薬剤はまた、BBBを通
過できる。しかし、上述したように、脂質親和性でなく
特異的運搬メカニズムも存在しない潜在的な治療的薬剤
は、BBBを通過できないか、または脳内での治療的薬剤
レベルを維持するのに不十分な割合しか通過しない。本
発明のBBBのインビトロモデルはまた、密着結合崩壊性
組織物を試験するために使用され得る。マウスの細胞接
着分子であるＥ−カドヘリンに免疫学的に関連する分子
は、マウスの内皮細胞上にあることが免疫組織学的方法
により見出されていた。Ｅ−カドヘリン様分子の発現
は、上昇した電気抵抗を示す脳内皮細胞の培養で促進さ
れる（実施例９）。
血管性脳浮腫 脳浮腫は密着結合透過性の上昇（抵抗の減少）および
／またはピノサイトーシスの上昇により引き起こされる
と一般に考えられている。密着結合の強化が重要である
範囲においては、脳微小血管内皮細胞におけるサイクリ
ックAMPの濃度または生理学的活性を上昇させる物質
は、治療的価値を有し得る。これらに含まれるものとし
ては、サイクリックAMPアナログ、Gs調節性タンパク質
に連結するレセプターに結合するアゴニスト、アデニル
酸シクラーゼ活性化因子、サイクリックAMP特異的ホス
ホジエステラーゼ阻害剤、プロテインホスファターゼ阻
害剤、およびプロテインキナーゼ促進物質がある。これ
に関連して、我々は以下のことを発見した。即ち、脳微
小血管内皮細胞でのサイクリックAMPの分解の主原因で
あるホスホジエステラーゼはType IIIサイクリックGMP
非抑制性ホスホジエステラーゼと称されるクラスのメン
バーの１つであり、そしてこの酵素は上記のロリプラム
Rolipramおよび上記のRO−20−1724のような化合物によ
り抑制されるということである。
本モデルの他の使用 前記のものは本発明を実施する好まれる様式を説明し
たものであるが、本発明の基本的概念の他の実施態様も
また実践され得る。例えば、このモデルは肺動脈または
大動脈の内皮細胞と、例えば平滑筋のような血管壁の他
の細胞の共培養に、細胞間運搬や薬剤透過性だけでな
く、２つタイプの細胞間の形態学的および代謝的相互作
用を研究するために、使用されることができる。このモ
デルはまた、多発性硬化症のようなCNSの疾患を分析す
るために、脳内皮細胞の単層を通じての脳内リンパ球の
移動を研究する走化性チャンバーとして使用され得る。
このモデルはさらに、精巣および網膜のような、他の内
皮細胞の関門を試験することに使用される。このモデル
のさらにもう１つの使用は、下記の実施態様に記述され
ているように、白血球の脳内皮への接着を調節する組成
物をスクリーニングするために使用するなど、脳の炎症
を防止または改善するために有用な試薬をスクリーニン
グすることである。
脳内皮細胞への白血球付着の調節 本発明の血液脳関門モデルは、さらに脳の炎症を予防
あるいは改善するために有用な薬剤のスクリーニングに
用いられた。この血液脳関門モデルは、炎症性の白血球
細胞が脳内皮に付着することを防ぐ薬剤の選択に用いら
れた。このモデルは、脳組織の分析と連係して、白血球
が脳内皮細胞に付着するために使用するレセプターの１
つを同定した。このレセプターが同定されると、炎症を
改善あるいは予防するために有用な薬剤および方法およ
び多発性硬化症などの脳の炎症性疾患の治療に有用な治
療用組成物が突きとめられた。
白血球細胞（白血球）は、全身循環で継続的に移動す
る。損傷部位あるいは他の炎症性の刺激部位で、血管を
なす細胞（内皮細胞）は、白血球に付着性である分子を
発現するようにの提示が活性化される。従って、炎症性
の刺激の後、白血球は活性化された内皮に結合する。一
旦結合されると、白血球は血管壁を通過して損傷部位へ
入り、毒性の媒介物質を放出して感染と戦う。不運にし
て、白血球の毒素はまた無差別に組織損傷を引き起こさ
せる。このようなケースは多発性硬化症（MS）に起こ
る。MSにおいては、多くの白血球が脳内の血液流から流
出して、広範囲の組織の損傷を引き起こす。Hickey,W.
F.,Psychneuroimmunology II,Academic Press（1990）
を参照のこと。
白血球がどこかの組織に入るためには、まず血管内皮
に結合しなければならない。最初の外傷にもかかわら
ず、もし白血球が損傷部位の内皮に結合することが阻止
されれば、白血球は組織に入らず、そしてさらに、損傷
がかなり避けられることが、他の疾患系において示され
た。Simpsonら、J.Clin.Invest.81:624−629（1988）に
は、白血球の細胞への付着を促進する糖タンパク質に結
合するモノクーローナル抗体（Mol;CD11b/CD18）の投与
は、白血球（好中球）の心臓組織への結合が減少するの
で、心臓組織の損傷を軽減したことが記載されている。
内皮細胞への白血球の付着のメカニズムには、一部に
は、白血球上の細胞表面レセプターの、内皮上の対応す
る細胞表面レセプターへの結合が含まれる。白血球およ
び内皮細胞の両者は、種々の刺激に応答して、様々なと
きに種々の付着促進レセプターを発現することが知られ
ている。免疫系の付着レセプターの総説として、一般的
には、Springer,Nature 346:425−434（1990）、および
Osborn,Cell 62:3−６（1990）を参照のこと。この両方
は、本明細書に参考文献として援用されている。細胞付
着分子の発現は、予測し得ないし、そして個々の炎症性
刺激に対応して広く変化し、および解剖学的配置におい
て広く変化し得る。例えば、Tuomanenら、J.Exp.Med.17
0:959−968（1989）には、付着促進レセプターのCD18フ
ァミリーに対して誘起される抗体が、細菌起源の急性炎
症性刺激に応答して、白血球が血液脳関門を通過するの
をブロックすることが示されている。抗CD18は、白血球
が肺へ移動するのはブロックしないことが示されてい
る。Vedderら、Surgery 106:509（1989）。
循環白血球はVLA−４レセプターを発現し得、そして
これは、サイトカインで活性化されたヒト内皮細胞上の
VCAM−１レセプターに結合することが示されている。El
icesら、Cell 60:577−584（1990）。脳の炎症の間に、
血液脳関門の内皮細胞上に誘導される分子の様々なタイ
プ、およびMSのような慢性炎症性脳疾患におけるその役
割についてはよく解明されていない。
A.脳の炎症の改善あるいは予防 本発明の実施態様は、脳内での白血球の付着を調節す
る薬剤の発見に向けられている。本発明の血液脳関門モ
デルは、使用される１種のシステムである。このモデル
を用いて、本明細書の記載に従って調製された脳内皮細
胞サンプルを炎症媒介物質によって活性化した。これら
の活性化された細胞サンプルのパネルに、各々のサンプ
ルに別個の推定のレセプター−ブロッカーの存在下に、
白血球を加えた。個々のサンプルについて、白血球付着
の存在あるいは程度をアッセイした。ここでは、試験し
た種々の試薬の中で、VLA−４（白血球細胞付着分子）
に対して誘起された２種の抗体が、リンパ球が脳内皮に
結合するのをブロックすることが示された。
別のアッセイは同じ結果を示した。本質的には、脳組
織の断片を、推定の細胞付着モデュレターの存在下で、
白血球を結合させる能力について分析した。このシステ
ムにおいて、本発明のもう１つの新規な面が開発され
た。ラットにヒト腫瘍細胞を注射して、脳内に炎症を誘
導した。かっては、この方法は、血液脳関門を通過して
脳内へ浸入することを誘導し得ることは知られていなか
った。さらに、誘導された炎症のこのタイプは、活性化
されたほとんど立方体様の内皮を有する小さな血管であ
ることに特徴がある多発性硬化症患者に見られる炎症に
最もよく似ているようである。血管はリンパ系組織に見
られる「高内皮細静脈」によく似ている。さらに、血管
はリンパ球の尖頭で取り囲まれ、活性なリンパ球の輸送
が明かになる。MSタイプの炎症は観察されたが、以前に
はこの方法では誘導されなかった。従って、腫瘍細胞を
用いての脳の炎症の誘導は、多発性硬化症のインビトロ
モデル用の組織を得るのに多大な有用性がある。
適切な時間経過後、炎症が誘導されたラットの脳を取
り出して切片標本にした。これらの切片標本に、スクリ
ーニングされるべき推定の細胞付着モデュレーターの存
在下に、白血球を加えた。さらにここでは、抗VLA−４
抗体が白血球の付着を阻害することもまた認められた。
この阻害は、図中にグラフで示されている。図８のパ
ネルＡは、抗体を加えていない脳の切片標本を示す。小
さな黒点は、炎症を起こしている脳の内皮細部の背景に
対する白血球である。一見できるように、白血球は炎症
組織の血管に非常に濃密に結合している。図８のパネル
Ｂは、VLA−４のβ１サブユニットに対して誘起された
抗体の結合による阻害を示す。図９は、リンパ球が結合
した脳内皮の培養物を示す。パネルＡは、刺激されてい
ない内皮への結合を図示している。パネルＢは、TNFα
によって12時間刺激された内皮への結合を図示してい
る。パネルＣにおいて、リンパ球が抗β−１インテグリ
ンにより前処理され、そして刺激された内皮への結合が
大きく阻害されていることを示す。下記の実施例21に記
載されているように、ヒト白血球の脳切片標本への結合
密度はマウス白血球の内部標準集団を用いて確認した。
この集団は抗ヒト薬剤では確認されない。この定量化
は、抗VLA抗体が、多発性硬化型の炎症が誘導された脳
の切片標本に白血球が結合するのを防ぐことの肉眼での
観察を確認した。（図10）。さらに、培養された内皮へ
の白血球の結合は、細胞を125Iで前もって標識して定量
した。抗βの阻害効果は図11に示されている。
種々の刺激に応答して、個々の細胞付着分子が、それ
ぞれの組織で発現される。脳特異性は、治療目的で白血
球付着モデュレーターを投与するうえに有利であり得
る。VLA−４白血球付着分子は種々の条件下で体中で発
現されることが知られている。脳組織以外の他の組織
は、抗α−４抗体あるいは抗β−１抗体のいずれかがこ
れらの組織であらゆる免疫反応を有するかどうかを決定
するのに分析された。実施例22にさらに詳細に記載され
ているように、抗α−４は、リンパ球が正常の腸リンパ
系組織に結合するのを阻害したが、正常リンパ節に結合
するのには影響しなかった。抗β−１抗体はリンパ節に
結合するのは阻害しないし、腸リンパ系組織への結合に
は影響するとは考えられない。
VLA−４は、細胞付着分子のβ１インテグリンファミ
リーのメンバーであり、各々α鎖およびβ鎖の２つのサ
ブユニットを有する。少なくとも６種のβ１インテグリ
ンがあり、同じβ１鎖を共有し、そしてそれぞれは異な
るα鎖を有する。これらの６つのレセプター全ては、種
々の細胞マトリックス分子、例えば、フィブロネクチ
ン、ラミニンおよびコラーゲンのそれぞれの補体に結合
する。VLA−４は、例えば、フィブロネクチンに結合す
る。しかし、VLA−４はさらに、内皮細胞によって発現
される非マトリックス分子に結合する点が独得である。
この分子はVCAM−１と呼ばれ、種々の刺激に応答して様
々の場所の内皮上に発現されると考えられている。VLA
−４の異なるエピトープは、フィブロネクチンおよびVC
AM−１への結合活性を担当し、そしてそれぞれの活性は
独立して阻害され得る。
現在用いられているモノクローナル抗体の１つ、HP2/
1は、VLA−４のα鎖に反応して、VLA−４のVCAM−１へ
の結合のみをブロックする。VLA−４のフィブロネクチ
ンへの結合に影響しないし、そしてβ１インテグリンフ
ァミリーの他のメンバーの活性にも影響しない。しか
し、VLA−４のα鎖はさらにβｐと呼ばれる別のβ鎖と
相互作用する。このレセプターは、全てのリンパ球が腸
のリンパ系組織へ結合するのを媒介する。他の用いられ
ている抗体で、VLA−４αと反応するモノクローナル抗
体HP2/1は、この分子の活性をブロックする。すなわ
ち、VLA4αβｐの腸内皮への結合を阻む（表12に示され
ている）。モノクローナル抗体AIIB2は、β１インテグ
リンの全てのメンバーに共通するβ１鎖と反応するし、
そしてフィブロネクチンおよびVLA−４のVCAM−１への
結合活性を含む、ファミリーの全体と免疫反応する可能
性がある。しかし、このモノクローナル抗体はβｐに結
合しないので、リンパ球が腸内皮に結合するのを阻害す
るとは考えられない。
VLA−4/VCAM−１標的に対して選択的に反応する薬剤
もまた考えられる。例えば、β１鎖に関連して、VLA4α
のVCAM−１結合ドメインと相互作用する抗体は、多発性
硬化症の脳などの炎症部位へのリンパ球の移動のみをブ
ロックする。さらに、この薬剤はマトリックス相互作用
（β１インテグリンの全てのメンバーに媒介される）に
影響しないし、そして正常な腸の免疫（VLA−４αβｐ
に媒介される）にも影響しない。この薬剤およびこのよ
うな薬剤の生産は、当分野の技術範囲内である。
B.VLA−4/VCAM−１で誘起される細胞付モデュレーター
および使用 脳の炎症（特に、MSタイプの脳の炎症）に役割を有す
るVLA−4/VCAM−１分子は、種々の使用にあて得る分子
標的物を提供する。このように、本発明はこれらの使用
を含み、組成物に関する。
実施例23に示されているように、まず、VLA−４リガ
ンドに対するレセプターが、脳内皮細胞への白血球の付
着を調節するために使用し得る。本明細書の用語「レセ
プター」は、リガンドに結合する生物学的に活性な分子
を示すために用いられている。例えば、VLA−４分子と
免疫反応する抗体あるいはその断片は、白血球が脳の内
皮細胞に結合するのを阻むのに有用であり得る。細胞性
付着分子に結合し得るペプチドあるいはペプチド類似物
または関連の化合物もまた考えられ、これらは、当分野
には公知の方法によって合成され得る。VLA−４リガン
ドと反応する他のレセプターは当業者には明らかであ
る。
さらに、VCAM−１リガンドに対するレセプターは、脳
の内皮細胞への白血球の付着を調節するのに用い得る。
なぜなら、細胞付着分子がブロックされると白血球の付
着の経路が阻害される。
治療目的として、脳の炎症を阻むあるいは改善するた
めの、VLA−４あるいはVCAM−１で誘起されるレセプタ
ーを含む治療上有効な組成物は、本発明の範囲内にある
と考えられる。例えば、少なくとも１種のVLA−４レセ
プターあるいはVCAM−１レセプターを含む治療用組成物
および他の治療用組成物は、脳内皮細胞の炎症を阻むか
あるいは改善するために使用され得た。他の例は、MSあ
るいは他の炎症状態を治療するのに有用な薬剤が結合さ
れたVCAM−１レセプターをドラッグデリバリー媒体へ使
用することであり、これはまた、VCAM−１分子への白血
球の付着を阻む。１方のあるいは他方の細胞付着分子、
まねるように働くペプチドあるいはペプチド類似物また
は他の分子は、競合治療に用い得る。この治療では、こ
のようなペプチドあるいはペプチド類似物（あるいは他
の化合物）が、白血球（VCAM−１を実質的にまねるなら
ば）あるいは内皮細胞（VLA−４を実質的にまねるなら
ば）のいずれかの表面上の利用可能な位置を競合する。
適切な薬学的キャリヤーおよびその処方物は、Marti
n,RemingtonのPharmaceutical Sciences,第15編（Mack
Publishing Co.,Easton 1975）に記載されている。この
ような組成物は、一般に、宿主へ適切に投与するために
適切な投与形態を調製するために、キャリヤーの適切な
量とともに、活性化合物の有効な量を含有する。このよ
うな薬学的組成物を調製するための有用な薬学的キャリ
ヤーは、固形、液体あるいは気体であり得る。従って、
組成物は、錠剤、ピル、カプセル、粉末、基本的には被
覆あるいは他の保護された調合物（イオン交換樹脂ある
いは他のキャリヤーに結合して、または油脂タンパク質
小胞中に包囲して、あるいは他の末端アミノ酸を添加し
て）、持続放出調合物、溶液（例えば目薬）、懸濁液、
エリクシール、エアロゾルなどの形態をとり得る。水、
生理食塩水、水溶性デキストロース、およびグリコール
が好ましい液体キャリヤーである。特に（等張の場合）
注射溶液に好ましい。キャリヤーは、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ごま油などの、石油、動物、植物あるいは
合成起源の油を含む種々の油から選択され得る。適当な
薬学的賦形剤には、デンプン、セルロース、タルク、グ
ルコース、ラクトース、ショ糖、ゲラチン、モルト、コ
メ、コムギ粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マ
グネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモ
ノステアリン酸、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、
グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール
などが含まれる。組成物は、滅菌などの従来の薬学的処
置を受けられ得て、そして防腐剤、安定剤、湿潤剤ある
いは乳化剤、浸透圧調節のための塩類、緩衝剤などの従
来の薬学的添加剤を含有し得る。
本発明の治療法の実施において、その誘導体および塩
を含む活性化合物の有効量、あるいはこれを含有する薬
学的組成物は、上記記載のように、当分野に公知の通常
でかつ容認の任意の方法によって、単独で、あるいは本
発明の単数あるいは複数の他の化合物、または抗炎症剤
あるいは炎症などに有効であることが知られている他の
治療剤と組み合わせて、投与される。従って、これらの
化合物あるいは組成物は、経口的に、舌下的に、局所的
に（例えば、皮膚の上あるいは目の中に）、非経口的
（例えば、筋肉内、静脈、皮下あるいは皮内）に、ある
いは吸入によって、そして上記においてより詳細に議論
されたように、錠剤、懸濁液、およびアエロゾルを含
む、固体、液体あるいは気体のいずれかの投与形態で投
与され得る。投与は、継続治療に単独単位投与量に、あ
るいは随意的な治療に単独投与量で行われ得る。
１つの好ましい実施態様では、本発明の治療法は、症
状の緩和が特に要求されるか、あるいは切迫していると
きに、実施される。他の好ましい実施態様においては、
本発明の方法は、継続治療あるいは予防処置として効果
的に実施される。
本発明の治療法の実施において、患者に投与される薬
学的組成物の特定の投与量は、病気の性質、その重篤
さ、投与計画、患者の年齢および体質などを含む様々な
考慮に依存する。適切な投与量は、医学分野ではよく知
られている臨床研究により確立され得る。投与は注射あ
るいは経口摂取によってなされる場合、患者の体重1kg
当り0.1から100mgの範囲の化合物の投与量が有効であっ
て、一般的には、1kg当り１から100mgの範囲が好ましい
と現在信じられている。局所投与は、適した毎日数回の
付与により、一般的には、液体キャリヤーあるいは賦形
剤の1ml当り0.1mgのような少量の化合物を含有する処方
物が用いられる。
さらに、画像試薬も考慮される。ラジオグラフあるい
は他の画像技術で検出し得るトレーサー分子が、脳中の
活発な白血球の移動の領域を検出するために、抗VCAMあ
るいは抗VLA−４薬剤に結合された。これは例えば、診
断のプロトコールおよび病気の進行あるいは治療効果の
決定に有用である。
他の使用、処方、組成物および工程は、当業者には容
易に明白である。
以下の実施例は本発明の数個の実施態様を示したもの
であって、請求の範囲に記載されているように、いかな
る方法においても本発明を限定すると解釈されるべきで
はない。
実施例１ サイクリックAMPで処理した内皮細胞の培養物の電気抵
抗 ウシの脳の毛細血管内皮細胞を、５％あるいは10％PD
HSを含む馴化培養培地中のポリカーボネートのフィルタ
ー上で培養した。コントロールでは、培養培地は５％PD
HS（□）あるいは10％PDHS（■）を含む。実験培養物に
は、培養培地に５％PDHS＋250μM 8−（４−クロロフェ
ニルチオ）サイクリックAMP（○）か、あるいは10％PDH
S＋250μM 8−（４−クロロフェニルチオ）サイクリッ
クAMP＋35μM RO−20−1724、サイクリックAMPホスホジ
エステラーゼ阻害剤（●）を補った。次に、単層を通過
する電気抵抗を測定した；これらを図１に示す。
サイクリックAMPアナログのみで、単層を通過する電
気抵抗を大きく増加させたが、このことは密着結合が形
成されたことを示している。約400ohm−cm2の抵抗値
は、サイクリックAMPアナログおよびサイクリックAMPの
減成を阻害する薬剤（RO−20−1724）の両方で処理した
単層で得られた。
実施例２ 単層を通過する電気抵抗の関数としての内皮細胞を通過
する標識アルブミンの輸送 孔径が0.4μであるポリカーボネートのフィルター上
に置いたウシの網膜内皮細胞およびMadin−Darby犬の腎
臓内皮細胞の一次培養物の単層を通過する、125I標識の
アルブミンの流出を、各細胞の型の単層を通過する電気
抵抗に示される密着結合の関数として測定した。この実
験結果を図２にプロットする。ヒストグラムのバーの高
さは細胞間の接合を通るアルブミンの漏出を表してお
り、バーが高ければ高いほど、アルブミンの漏出も大き
い。
当然のことながら、コントロールの無細胞フィルター
ではアルブミンの流出は最も小さかった。
ウシの網膜細胞の単層を通過するアルブミンの流出
は、実質的には電気抵抗が20ohm−cm2の場合のみ起こっ
た。そして、この流出は電気抵抗が60ohm−cm2の培地で
は75％まで減少した。
これとは対照的に、200ohm−cm2以上の単層を通過す
る電気抵抗が観察されるMDCK細胞の単層では、アルブミ
ンの流出は事実上完全に停止された。
実施例３ 内皮細胞を通過する電気抵抗に対する種々の薬剤の効果 ウシの脳の毛細血管内皮細胞を３μｍのポリカーボネ
ートフィルターあるいは0.4μｍのニトロセルロースフ
ィルター上で、実質的にコンフルエントになるまで培養
した。
培養物は24時間無処理（コントロール）か、あるいは
250μM 8−（４−ククロフェニルチオ）サイクリックAM
P＋35μM RO−20−1724（cAMP）あるいはこれらの二つ
の薬剤プラス50％（W/V）ウシの大動脈内皮細胞由来の
馴化培地（cAMP−BAEC−CM）を含む培養培地に24時間培
養した。次に、単層を通過する電気抵抗を測定した。こ
の結果を表１に示す。
この結果は、cAMP単独では単層を通過する抵抗値が約６
倍増加し、約200ohm−cm2になることを示している。BAE
C−CMおよびcAMPの組み合わせでは、ポリカーボネート
のフィルター上で抵抗値が約10倍にまで増加し、約350o
hm−cm2になった。
実施例４ 内皮細胞を通過する電気抵抗に対する細胞内サイクリッ
クAMP濃度の上昇効果 ウシの脳の毛細血管の内皮細胞を0.4μｍのポリカー
ボネートのフィルター上で本質的にコンフルエントにな
るまで培養した。
培養物は24時間無処理（コントロール）か、あるいは
250μM 8−（４−クロロフェニルチオ）サイクリックAM
P（cAMP）、10μＭイソプロテレノール（ISO）、10μM
5−ヒドロキシトリプタミン（５−HT）、あるいは10μ
Ｍフォルスコリンで24時間処理した。全ての培養物中に
は、35μM RO−20−1724も存在していた。次に、単層を
通過する電気抵抗を測定した。第２の数値はそれぞれ、
３回の繰り返し実験の平均を示しており、コントロール
細胞を抵抗値100として比較した。
この結果は、細胞内サイクリックAMPの有効な濃度を
上昇させる薬剤はいずれも、単層を通過する電気抵抗を
少なくとも４倍にまで高めることを示した。最大増大抵
抗値（８倍以上）はアデニル酸シクラーゼを直接活性化
する化合物、フォルスコリンによって得られた。
実施例５ 内皮細胞を通過する電気抵抗に対するサイクリックAM
P、馴化培地および星状細胞の細胞外基質の効果 ウシの脳の毛細血管内皮細胞を、ニトロセルロースあ
るいはポリカーボネートのフィルター上で、本質的にコ
ンフルエントになるまで培養した。ＡとＢでは、フィル
ターを最初にＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンで
コートした。次にＣとＤでは、生まれたばかりのラット
の脳の星状細胞Ｉ型をこれらのコラーゲンおよびフィブ
ロノネクチンでコートしたフィルター上でコンフルエン
トになるまで培養した。Ｃの場合には、この星状細胞を
25℃で30分間、pH7.5の5mM Tris緩衝液中１％Triton X
−100で溶解した。再び、このフィルターをPBS中で洗っ
た。Ｄの場合は、星状細胞をＣの場合と同様に培養した
が、次に細胞を除去するために、37℃で30分間、PBS中5
mM EDTAで処理した。これらのフィルターをまた、25mM
NH4OHで処理し、そしてPBSで洗った。ウシの脳内皮細胞
を、それぞれの型のフィルター上でコンフルエントにな
るまで培養した。Ｂ、ＣおよびＤの場合には、表１に示
すように細胞を250μM 8−（４−クロロフェニルチオ）
サイクリックAMP（cAMP）、35μM 35μM RO−20−172
4、およびウシの内皮細胞馴化培地（BAEC−CM）で処理
した。内皮細胞を通過する電気抵抗を測定した；表３で
は、抵抗値をコントロール値100に対比させた。
サイクリックAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害
剤およびBAEC−CMの組み合わせにより、単層を通過する
電位抵抗が実質的に増加した。Ｃに記載したように調製
した星状細胞の細胞外基質上で細胞を培養すると、更に
その効果が高まった。Ｄのように調製した星状細胞の細
胞外基質上で細胞を培養すると、コンフルエントに増殖
しなかった（従って、単層を通過する抵抗値は小さかっ
た）。他の型の細胞（例えば、内皮細胞のような）から
調製した基質上で細胞を培養すると、抵抗値は増加しな
かった。
実施例６ 脳内皮細胞の電気抵抗に対する星状細胞由来の馴化培地
の効果 新たに分離したウシの脳内皮細胞（BBEC）を、星状細
胞由来の馴化培地（ADCM）が存在しない場合、あるいは
存在する場合で組織培養ディッシュ上に蒔いた。次に、
再び細胞を、ADCMの存在しない場合あるいは存在する場
合で、コラーゲン−フィブロネクチンでコートしたフィ
ルター上に蒔いた。細胞がコンフルエントに達した後、
サンプルを250μM 8−（４−クロロフェニルチオ）サイ
クリックAMPおよび35μM RO−20−1724（表４中の＋cAM
P）で処理した。
表４のデータは、最大抵抗値が、細胞を最初にADCMに
蒔いた時に得られることを証明している。
実施例７ 脳の内皮細胞電気抵抗に対する仔ウシ血清の減少による
還元の効果 ウシ脳の内皮細胞を分離し、50％MEM/FCS−50％ADCM
の組織培養ディッシュ上に蒔いた。次に、細胞をコラー
ゲン−フィブロネクチンでコートしたフィルター上に継
代し、表５に示した培地で培養した。条件は、いくつか
の細胞を50％無血清限定培地（N2）で培養した以外、実
施例６と同じであった。この結果を表５に示す。
このデータは次のことを証明している。すなわち、最
大抵抗値は、仔ウシ血清を減少させたとき、ADCMおよび
サイクリックAMPアナログで培養した細胞によって得ら
れた。これと同じ結果は、限定培地がN2からMEMに替わ
っても得られた。
実施例８ 電気抵抗の高い単層を通過する輸送データ 図３は、標識ショ糖（360ダルトン、親水性）および
標識クロランブシル（304ダルトン、穏やかな疎水性の
抗腫瘍化合物）を用いた、本発明の血液脳モデルのフィ
ルター上に高い電気抵抗を有するウシの内皮細胞の単層
を通過する輸送データを示す。
これらの化合物は同じ大きさであるが、無細胞のフィ
ルターを通過する輸送速度を比べると、疎水性化合物
は、細胞を有するフィルターを通過する親水性化合物よ
りもよく輸送された。
ショ糖は、細胞の間に漏れることはほとんどなかっ
た。これは、従来のモデルに対して次の点で大きな進歩
を有する。すなわち、従来のモデルでは密着結合が漏れ
やすいために、細胞を有する、および有しないフィルタ
ーを通過するショ糖の速度には３倍から５倍の差があ
る。
実施例９ 脳内皮細胞の電気抵抗に対するプロテインキナーゼ阻害
剤の効果 上述した実施例１、３および５に記載したように、ウ
シの脳内皮細胞を、本発明の血液脳モデルのフィルター
上にコンフルエントになるまで培養し、電気抵抗に対す
るプロテインキナーゼ阻害剤、K252aおよびスタウロス
ホリン（staurosphorine）の効果を測定した。これらの
化合物は、プロテインキナーゼＡおよびＣ、MLCK、など
を非特異的に阻害する。この結果を表６に示す。
両方の化合物、特にスタウロスポリン（staurosporin
e）は、抵抗値を減少させる、すなわち密着結合を開く
のに非常に効果的であった。阻害剤の効果は両方とも可
逆的であった。
光学顕微鏡レベルでは、サイクリックAMPの除去ある
いはプロテインキナーゼ阻害剤の添加により、内皮細胞
の密着結合は明かに分離した。
実施例10 インビボにおける脳の取り込みに対するプロテインキナ
ーゼの効果 スタウロスポリンを頸動脈内注射によって投与した。
次に、3H−ショ糖および125I−BSAの輸送を測定した。
表７のデータは、注射および洗浄後、脳に残存する放射
能の量を示している。各カテゴリーには動物３−４匹の
平均を用いた。
この結果は、サイクリックAMPで活性化されたプロテ
インキナーゼ活性の阻害の結果、スタウロスポリンは小
さい（ショ糖）および大きい（BSA）分子両方の、脳へ
の取り込みを高めることを示した。
実施例11 インビボ試験系における、血液脳関門に対するサイクリ
ックGMPを増加させるGiレセプターアゴニストおよび薬
剤の効果 被験化合物を尾静脈経路で、動けないようにした無麻
酔のマウス（30−35g）に投与した。この注入物はま
た、通常インビボではBBBを通過しないトレーサー物質
として、10μCi 3H−ショ糖および１μCi 125I−BSAを
含んでいる。注入後15あるいは60分に、２％アベルチン
（Avertin）で麻酔した動物をリン酸緩衝化生理食塩水
で静脈穿刺し、次に固定剤で灌流した。直ちに脳を取り
出し、髄質、脳橋、および視床下部を摘出し、残りの組
織を3ccの注射筒を用いて、1.5ml Soluene（Packard）
を含有する予め重量を測定したシンチレーションバイア
ルの中に移して、ホモジナイズした。バイアルを秤量
し、湿組織重量を測定した。75℃で一晩インキュベーシ
ョン後、10mlのInst−Gel（Packard）を各サンプルに加
えた。液体シンチレーション分光測定法により、サンプ
ルをDPMとしてカウントした。数値をDPM/gm組織で示
す。最小限４匹動物／群を各実験に用いた。データを、
処理した値をコントロール値で割って得られた何倍増加
したかの平均で示す。括弧内の数字は特定の条件で実施
した実験の数を示す。
この結果は、アデノシンGiレセプターアゴニスト（例
えば、シクロペンチルアデノシン、CPA）およびN6−
（フェニルイソプロピル）−アデノシンの（−）立体異
性体（Ｒ−PIA）により、小さい（ショ糖）および大き
い（BSA）分子の、脳による取り込みがちょうど300％ま
で増加したことを示している。
実施例12 行動アッセイに対する密着結合の透過性モヂュレーター
の効果 行動アッセイは、治療効果を発揮するのに充分なレベ
ルで、脳実質中への薬剤の送達を証明するように設計さ
れている。モルヒネ、および天然に存在するオピオイド
ペプチド、エンドルフィンおよびエンケファリンは脳の
μオピオイドレセプターに結合し、そして痛覚を抑制す
る。この鎮痛薬の効果はマウスによるホットプレートア
ッセイで証明し得る。55℃に均等に温めた表面にマウス
を置く。マウスが前足あるいは後足をなめることによ
り、熱刺激に反応するのに要した時間を測定する。１−
10mg/kgの投与量のモルヒネの静脈内注射（700MW）によ
り鎮痛効果が得られ、注射後15分の測定では、熱刺激に
対する反応の潜伏期は増加した。潜伏期を無痛覚（％）
で示す。
これらの実験の目的は、モルヒネの投与量反応曲線が低
投与量にシフトし、そして次に末梢に達すると鎮痛薬の
活性を有する推定のBBB開裂能を試験することである。
この実験（図４）では25μg/kgのCPAは、特に低投与量
のモルヒネレベルでモルヒネの効果を高めた。●はモル
ヒネ単独を示し;XはCPA＋モルヒネを示す。
このように、CPAはサイクリックAMPの産生を減少させ
るが、鎮痛剤として投与されるモルヒネの量を低下させ
た。すなわちCPAは血液脳関門を開いた。
実施例13 ニトロプルシドによる、内皮細胞の密着結合に対するサ
イクリックAMPの効果の阻害 前もってサイクリックAMPアナログで処理していない
ウシの脳内皮細胞の、フィルター上でコンフルエントに
達したレイヤーを、サイクリックAMPレベル、および電
気抵抗値あるいは無処理の細胞（−RO）を増加させるた
めに、実験開始時にRO−20−1724（図５プラスRO）で刺
激した。他の培養物を種々の濃度のRO−20−1724プラス
ニトロプルシドナトリウム（NitroP）で処理した。ニト
ロプルシドはGi系の活性を増加することが知られてい
る。次に細胞の抵抗値を上述の方法で測定した。
結果を図５に示すが、ニトロプルシドは投与量依存的
にサイクリックAMPの上昇による抵抗値の増加を阻害す
ることを示している。
実施例14 モルヒネで誘導された無痛覚に対するニトロプルシドナ
トリウムの効果 マウスにモルヒネで誘導された無痛覚に対して、サイ
クリックGMPレベルを増加させる薬剤、ニトロプルシド
ナトリウムの効果を実施例12のアッセイ系で測定し、そ
して図６に示す。ニトロプルシド（＋NP）は無痛覚の産
生に必要なモルヒネの量を減少させるが、このことは前
者は後者に対して血液脳関門を開いたことを示唆するも
のである。
実施例15 内皮細胞に対するＥ−カドヘリンの出現 ウシの脳内皮細胞を、コントロール培地（電気抵抗の
低い培養物）、あるいは実施例１、３、および５に示す
効果を高めた条件であるサイクリックAMPプラス内皮細
胞の馴化培地（電気抵抗の高い培養物）中のフィルター
上でコンフルエントになるまで培養した。内皮細胞を通
過する抵抗値を測定後、培養物を固定し、ヤギ抗ウサギ
イムノグロブリンの蛍光FITC結合物を用いたマウスのＥ
−カドヘリンに対して調製したウサギ抗体で標識した。
抵抗値の高い培養物は、抵抗値の低い培養物よりもＥ−
カドヘリン用により鮮明に染色された。そしてまた、細
胞境界の周囲にＥ−カドヘリンがいくつか局在してい
た。Ｅ−カドヘリンは特に脳の内皮細胞に特に現される
ように思われるので、これらの観察はさらに、培養物の
脳内皮細胞の電気抵抗を増加させる処理により、BBBの
もう一つの特性も採用させることを証明している。
実施例16 エンケファリンで誘導された無痛覚に対するサイクリッ
クGMPホスホジエステラーゼの阻害効果 実施例12に記載された行動アッセイを内因性の鎮痛
剤、エンケファリン（20mg/kg）を用いてモルヒネより
も強力に無痛覚が得られるように改変したが、これをサ
イクリックGMPホスホジエシテラーゼの阻害剤、ジピリ
ダモールで処理したマウスに投与した。この結果を表９
に示す。
これらの結果は、サイクリックGMPの細胞内レベルの
上昇により、脳の微小血管内皮細胞の密着結合のモルヒ
ネに対する透過性が増加するという理論と一致してい
る。
実施例17 インビボ試験系における血液脳関門に対するサイクリッ
クGMPホスホジエステラーゼの阻害効果 実施例11のインビボにおけるトレイサー実験を繰り返
した。ただし、被験化合物はサイクリックGMPホスホジ
エステラーゼ阻害剤、ジピリダモールとした。
この結果は、サイクリックGMPホスホジエステラーゼ
の阻害はサイクリックGMPの細胞内レベルを上昇させる
が、小さい（ショ糖）および大きい（ウシ血清アルブミ
ン）分子の両方の、血液脳関門を通過しての輸送を増加
させることを示している。
実施例18 インビトロにおける、脳微小血管の内皮細胞の密着結合
に対する異なるクラスのホスホジエステラーゼ阻害剤の
効果 ウシ脳の微小血管の内皮細胞を単離し、本発明のBBB
インビトロモデル中の透過フィルターにおいて増殖し
た。細胞は星状細胞の馴化培地で維持したが、そのよう
な細胞でサイクリックAMPのレベルを上げる物質による
処置はされなかった。
実験の開始時（即ち低い電気電気抵抗の状態）には、
細胞を無処置のまま（図７におけるblk）か、あるいは1
7.5μＭのロリプラム（Rolipram）もしくはRO−20−172
4（図７におけるRO）（サイクリックAMPホスホジエステ
ラーゼの特異的阻害剤）により処置した。電気抵抗をそ
の後、種々の時間に測定した。２回の実験（図７）で、
30分経過後すでに、これら化合物で処置した細胞におい
て電気抵抗は実質的に高かった。それに比較して、サイ
クリックGMPホスホジエステラーゼの特異的阻害剤であ
る、ザプリナスト（zaprinast）、ジピリダモール（dip
yridamole）およびミルリノン（milrinone）は類似の条
件下で効果がなかった。このことにより、脳内皮細胞に
おいてサイクリックAMPの分解を行う主要なホスホジエ
ステラーゼは、タイプIIIのサイクリックGMPに阻害され
ないホスホジエステラーゼであることが示唆され、また
この種の酵素の阻害剤は血管原性脳浮腫の治療に有効で
あり得ることが示唆される。
実施例19 インビトロの血液脳関門モデルにおける、ヒト脳の微小
血管の内皮細胞の電気抵抗 ヒトてんかん患者からの脳の生検材料は、MEM−抗生
物質培地に入れて手術室から実験室へ運んだ。髄膜から
切り離して、灰色質を洗浄し、その後前記に記載された
ようにＬ−15培地中でホモジナイズした。ホモジネート
を、50μｍのナイロンフィルターに透過させた。残渣は
さらに２回、50μｍのフィルターに透過させた。最終残
渣は前記ウシ脳の内皮細胞についての記載と同様にし
て、遠心により沈澱させた後、コラゲナーゼ、トリプト
シンおよびDNアーゼを含む溶液5ml中に懸濁した。単離
された毛細血管の断片および細胞は、遠心分離し、再懸
濁して、コラーゲン−フィブロネクチンでコートしたフ
ラスコ上のラットの星状細胞の馴化培地を含む増殖培地
中に撒いた。該細胞は、その後、前記ウシ脳の細胞につ
いての記載と同様にして維持した。
該細胞を透過性支持体に移し、コンフルーエントにな
るまで増殖させた後、そのいくつかは前記に詳述される
ようにクロロフェニル−チオ−サイクリックAMP＋RO−2
0−1724で処置した。
サイクリックAMPレベルを上げる前の、細胞の電気抵
抗（６つの反復試験の平均）は、62.5ohm−cm2であっ
た。処置後の細胞の電気抵抗（６つの反復試験の平均）
は、平均357.8ohm−cm2であった。
この実験は、サイクリックAMPに反応して密着結合が
形成されるという点に関して、ヒト脳の微小血管の内皮
細胞が、相当するウシ脳からの細胞と同様にして反応し
たことを示している。
実施例20 サイクリックAMP上昇物質を除去した後の脳微小血管の
内皮細胞の電気抵抗における効果 実施例１、３および５に記載の標準のプロトコールを
用いて、本発明の血液脳関門のフィルター上にウシ脳の
内皮細胞をコンフルーエントまで増殖した。その後、細
胞を48時間、クロロフェニル−チオ−サイクリックAMP
＋RO−20−1724で処置した。これらのサイクリックAMP
上昇物質を含む培地を取り去り、該細胞を新鮮な成長培
地で洗浄した。ある細胞には成長培地のみを添加し、他
はサイクリックAMPのアナログおよびRO−20−1724を含
む成長培地を添加した。細胞単層の電気抵抗を定期的に
測定した。結果を表11に示す。
細胞内のサイクリックAMPレベルを減少させると（表1
1における培地のみの場合）、電気抵抗は極めて急速に
下降し、これは、恐らくサイクリックAMPに活性化され
たタンパク質を脱リン化する、迅速に作用するホスホプ
ロテインホスファターゼの存在によるものであろう。洗
浄された細胞が細胞内のサイクリックAMP源（培地＋
“サイクリックAMP"）にさらされ続けると、電気抵抗は
高い値を維持した。
実施例21 炎症を起こした脳内皮細胞に対する白血球の付着の調節 ここでの好ましい実施態様においては、インビボでMS
−タイプの炎症を誘発させるための新規なシステム、お
よび血液脳関門モデルを用いることにより、VLA−４に
対する抗体は脳内皮細胞に対する白血球の付着を実質的
に防止することが示された。
明示しないかぎり、ここで使用するすべての技術的お
よび科学的用語は、本発明に係る技術の通常の当業者に
よって一般に理解されるのと同じ意味を持つ。ここで記
載されるのと類似または同等のあらゆる方法および材料
が本発明の実施または試験に使用され得るが、より好ま
しい方法および材料を今から記載する。前記に説明され
るように、参照とされるすべての刊行物がここに参考文
献として取り入れられている。
材料および方法 リンパ球：マウスもしくはラットのリンパ球を、結合
アッセイの直前に、標準の方法で腸間膜、頸部、上腕の
リンパ節から単離し、２枚のスライドガラスの曇った末
端の間で押しつぶした。ヒトのリンパ球は、Mono/Poly
分離培地（Flow Labs,Mclean,VA）を用いて、ヘパリン
化あるいはEDTA処理した全血から単離し、すぐに使用し
た。
リンパ球細胞株：すべての細胞株はサンフランシスコ
のカルフォルニア大学の細胞培養設備から入手し、10％
FBSを含むRPMI−1640中（37℃、10％CO2）で維持した。
RPMI−1640は、サンフランシスコのカルフォルニア大学
より購入した。カルフォルニア大学のこれらの細胞株は
すべて公共で入手できる。詳細には、サンフランシスコ
のカルフォルニア大学から得られる細胞株は、Jurkat T
−細胞株、U937、THP−１、FRO、HL60およびHUT78であ
る。これらの細胞株はまた、他の筋からも入手し得る。
モノクローナル抗体:AIIB2はヒトβ１インテグリン
（“anti−β−1"）に対するものであり、サンフランシ
スコのカルフォルニア大学の口腔生物学講座のCaroline
Damsky教授から入手できる。HP2/1はVLA−４のVCAM−
１結合ドメイン（“anti−α−4"）に対するものであ
り、AMAC,Inc.（Westbrook ME,Product ＃ 0764）から
購入した。AP2/1はまた、ネズミリンパ球とも交差反応
をする。P4H9はヒトβ２インテグリン（“anti−β−
2"）に対するものであり、Talios,Inc.（San Diego,CA
Product ＃ A052）より購入した。このβ２インテグリ
ンに対する抗β−２は、VLA−４のいかなるサブユニッ
トとも反応しないとされている。
リンパ球の処置に使用される場合には、抗β−１のハ
イブリドーマ培養上清は、1:2に希釈して用いた。抗α
−４抗体は製造業者により精製されており、５μg/mlの
濃度で使用した。抗β−２は製造業者により精製されて
おり、５μg/mlの濃度で使用した。リンパ球の処置のた
めには、リンパ球を前記濃度の抗体と混合し、使用前に
30分間、氷上でインキュベートした。該細胞を洗浄して
未結合の抗体を除去し、RPMI中に、典型的には107cells
/mlの濃度で再懸濁した。
他の組織片：凍結した脳の切片のインビトロでのアッ
セイにおいて、脳の切片の調製について下記に記載す
る。リンパ節および腸管の組織をラットから取り出し、
脳の組織についての下記の記載に従い、切片化した。
A.インビトロでの凍結脳の切片のアッセイ 免疫細胞が大数浸潤した炎症性の脳の病巣を確立する
ために、ラットの脳内に、ヒト腎細胞株293（American
Type Culture Collection,“ATCC",1573）を注入した。
この方法は、予測可能な時間経過をとって、あらゆる白
血球種が脳へ浸入するのを刺激することが見出された。
注入による損傷は、好中球および単核細胞の侵入を数分
内に誘発し、それは約24〜約48時間続く。ヒト細胞の存
在は、免疫系への持続的な刺激として働き、リンパ球を
含む、白血球のさらなる浸潤を刺激する。典型的には約
６日目までに、リンパ球および単核細胞が主要な浸潤白
血球種となり、注入部位に隣接する脳の小血管の周囲に
細胞のカフスを生じるほどの多数で侵入する。この方法
は、その速さおよび予測性によって下記に記載されたイ
ンビトロのアッセイに使用し得る脳組織を得るために理
想的とされた。このアッセイにおいては、脳は迅速に凍
結され、切片化される。次に、白血球（細胞株として永
存させ増殖させるか、あるいは前記に記載されるように
齧歯類あるいはヒトから新しく単離される）が切片にさ
らされ、それらが適当なレセプターを発現している場
合、炎症性病巣に隣接する活性化された内皮の、さらさ
れた側面に選択的に付着する。白血球は炎症性病巣から
離れた脳の切片内、または刺激を受けないコントロール
の脳の切片内にある活性化されない内皮には結合しな
い。
ラット（オスSprague−Dawley種、275−300g）をネン
ブタール（60mg/kg−i.p.）で麻酔し、定位デバイスの
中に置いた。頭部の毛を刈り、頭蓋の背部が現れるよう
に切開した。壁の皮層（parietal cortex）をおおって
いる頭蓋の左および右側に穴をあけた。PBSで懸濁した1
07個のヒト腎由来細胞（ATCC 1573細胞株）のうち、体
積10μｌを壁の皮質に移入した。他の同種異系細胞ある
いは細胞株もまた、これらの方法によって、ここに示し
たMS−タイプの症状を誘発すると考えられている。例え
ば、我々は初代のウシ微小血管内皮細胞を用いて、類似
の炎症反応を誘発させた。
切開部は縫合され、動物は１〜10日間、回復に処され
た。適当な日に、ハロタンで麻酔し、心臓を穿刺して殺
した動物から脳を取り出した。小脳を取り去った後、吻
側を下にしてトラガカントゴム（水と混合し、一様な厚
いペースト状にした）の台上に置き、ドライアイスで冷
却した２−メチルブタンに60秒間液浸して凍結した。脳
はその後、密封した試験管内に−80℃で保存した。
アッセイの直前に、10ミクロンの厚さの脳切片をクリ
オスタット上で切断し、薄いエポキシコーティング（カ
タログ＃100314、Carlson Scientific,Inc.,Peotone,I
L）内にあらかじめ形成された14mmウェルの中央に移動
し、室温で空気乾燥させた。まだ低温ナイフの刃に付い
たままの切片にスライドを（室温で）接触させて、切片
は移動された。コントロール組織の切片（注入されてい
ないラットから単離し、前記に記載したのと同様にして
凍結し保存した末梢リンパ節およびPeyer斑）は、通
常、脳切片に近隣して同じウェルに置かれた。スライド
を、氷の上に横たえた金属製のトレーの上に置き、ウェ
ルを100μｌの適当な細胞懸濁液で満たした。金属トレ
ーおよびそれを支えている氷をその後、約50〜約80rpm
で30分間、オービタルシェイカー（Lab Line Instrumen
ts,Inc.,Model 3520,回転半径１インチ）上で回転させ
た。次に細胞懸濁液をデカントし、氷冷したグルタルア
ルデヒド2.5％PBS溶液中に注意深く縦に20分間置いた。
スライドをその後５回、PBS中に浸し、0.5％トルイジン
ブルー（20％エタノール）溶液に１分間置き、100％エ
タノール中に２回、短時間浸して脱色し、Immu−mount
TM封入剤（Shandon,Sweickley,PA）で覆い、カバーをの
せた。
ここで用いられた細胞懸濁液は、新しく単離されたラ
ット、マウスあるいはヒトの骨髄リンパ球、U937Tヒト
細胞株およびJurkatヒトＴ細胞株であった。細胞株THP
−１、FRO、HL60およびHUT78は刺激された脳の切片に結
合しないことがわかり、脳の切片のアッセイにはこれ以
上分析されなかった。
リンパ球の結合の程度は２つの方法のうちの１つを用
いて定量された。第１の方法は、Butcherら、J.Immunol
123:1996−2003（1979）による記載と類似の、細胞の
内部参照個体群（internal reference population）に
よった。第２の方法は、ある組織片内の血管に結合され
たリンパ球の絶対数に基づいた。内部参照法では、リン
パ系細胞株の個体群を異なる種の新しく単離したリンパ
球と（例えば、ヒト細胞株をマウスのリンパ球と）混合
し、両者の最終濃度を３〜５×107/mlとした。次に、混
合した個体群の一部分を、種に特異的な抗体で30分間氷
上で処置した。通常、細胞は結合アッセイの前に抗体を
洗い流された。結合度は血管に結合した白血球の２つの
異なる個体群の比を決定することにより定量された。白
血球の個体群は、大きさで容易に区別できるように準備
された−リンパ系細胞株は大きい細胞で通常直径が20μ
ｍ以上であり、リンパ球は小さい細胞で直径10μｍ以下
である。従って、ヒトＴ−細胞をラットリンパ球と混合
した実験においては、抗ヒトモノクローナル抗体で生じ
た阻害の程度（コントロール抗体あるいは未処置のもの
と比較して）は、小さい細胞の結合に対する大きい細胞
の結合の比を決定することにより定量された。得られた
結果を下記の表12に示す。見てのとおり、抗VLA−４試
薬を使用することにより、MSタイプの炎症を示す脳細胞
に対する免疫細胞の結合が著しく阻害された。これらの
結果はまた、図10にも示されている。図10では、抗VLA
−４試薬の阻害効果が明瞭に示されている。
第２の定量方法は、近隣のアッセイのウェルにおいて
異なる方法で処置された、単一の白血球の個体群を比較
する。阻害の程度は、処置および未処置の条件下で、あ
る組織片のあらゆる血管に結合した白血球数を比較する
ことにより決定された。組織片は前記に記載したのと同
様にして調製された。結合度は切片内の血管に結合した
実際の細胞数として定量した。これらのデータを、下記
の表13に示す。
加えて、リンパ節組織もまた試験した。これらの結果
を図11に示す。試薬のすべては前記に記載したのと同様
にして調製した。ここで抗β−１抗体および抗α−４抗
体は、両者ともJurkat T−細胞のリンパ球が脳切片に結
合するのを阻害するが、リンパ節切片では阻害しないこ
とが示された。
これらのデータは、抗VLA−４試薬がMS−タイプの炎
症の特徴を呈する脳組織に白血球が結合するのを実質的
に阻害することを確認している。
B.血液脳関門の内皮細胞培養物に対する白血球の結合 ウシあるいはヒトの脳内皮細胞は、本明細書中に記載
された血液脳関門モデルに従って維持された。内皮を活
性化する実験においては、５μｌの刺激剤が培養系の下
部チャンバーの培地（800μｌ）に直接添加された。こ
こで、TNFα（Amgen Biologicals,Thousand Oaks,CA）
が下部チャンバーに、最終濃度が400μ/mlとなるまで添
加された。活性化する場合に、PMA−Ｓ（DMSO中）はリ
ンパ球の結合を刺激するのには有効でないことがわかっ
たが、他の活性化剤については、当業者には周知であり
明白であろう。
この様にして、内皮細胞は内腔外表面が薬剤に、脳に
おける炎症反応の間の典型的な状況と同じくしてさらさ
れた。アッセイの直前に培養の電気抵抗を測定し、フィ
ルター（内皮細胞を支持する）を室温で、１％FBSを含
むＤ−MEMおよび20mMのHepes（それぞれ200ml）の入っ
た３つの別々の容器に浸すことによって洗浄した。フィ
ルターはその後、同じ培地を含む新しいウェルに置か
れ、室温でアッセイが行われた。
典型的には、試験試薬の存在下または非存在下に、10
μｌの白血球（好ましくは107/mlの濃度で）を培養系の
上部チャンバーに添加し、白血球が、脳血管系における
のと同様にして、内皮の内腔即ち血液側に出会うように
された。ここで白血球は、前記に記載したようにラッ
ト、マウスあるいはヒトのリンパ球、U93Tヒト骨髄単球
細胞株およびJurkatヒトＴ−細胞株であった。リンパ球
は、前記に記載したのと同様にして、抗β−１あるいは
抗β−２抗体で前処理された。
細胞株THP−１およびFROもまた、TNFαで刺激された
脳の内皮細胞に結合したが、HL60およびHUT78はそのよ
うに結合しなかった。U937の結合は、抗β−１にさらさ
れることにより阻害はされないことが見出された。
培養プレートを約100rpmで30秒間旋回振盪機に置き、
その後室温で約30分間静置させた。アッセイは、１％グ
ルタルアルデヒドを含むPBS中でフィルターを穏やかに
洗浄する（異なる角度で液浸と注入を３回行う）ことに
よって、停止させた。グルタルアルデヒドによって細胞
は、下記に記載のように、適当な光学条件下では蛍光を
発するようになる。フィルターはグルタルアルデヒド溶
液中に60分間、静置した。
白血球のフィルターに対する結合の程度は、２つの方
法のうち１つを用いて試験した。第一の方法では、結合
した細胞を直接に可視化した。フィルターは、培養ウェ
ル装置から切り離され、Immu−mountTMを加えたスライ
ドガラスの上にのせられた。フィルターは、ローダミン
あるいはフルオレセイン光学用にセットされた免疫蛍光
顕微鏡で試験され、グルタルアルデヒドが誘導する自己
蛍光によって細胞を観察した。
免疫蛍光のアッセイの結果は図８において見ることが
できる。容易に見られるように、抗β−１抗体で前処置
されたJurkat T−細胞のリンパ球の密度（パネルＡ）
は、未処置の白血球に対する結合密度（パネルＢ）より
もはるかに低い。これは、試薬がVCAM−1/VLA−４によ
る脳内皮細胞と白血球との間の相互作用を妨げるのに用
いられる場合の、解剖学的および生理学的反応を写真に
よって示している。
第２の方法では、白血球は放射性トレーサーで予めラ
ベル化され、結合度は培養フィルター上の全ての内皮細
胞表面と結合した放射能量を測定することにより定量さ
れた。リンパ系細胞株を予めラベル化するのには、イリ
ノイ州、アーリントンハイツにあるアマシャムコーポレ
ーションから購入した、12IUDR（アマシャム＃XX）1uCi
/mlを、アッセイの約12〜20時間前に標準培地に添加す
ることにより行った。細胞は、新鮮なベンチ培地（５％
FBSのRPMI−1640溶液および25mMのHepes）15mlの３つの
別々の洗浄液で洗浄し、混合されないラベルが洗い流さ
れた。濃度はその後、試験用試薬の存在下もしくは試験
用試薬を用いずに、107cells/mlに調節された。再び、
上記リンパ球のすべて（ラット、マウスあるいはヒトの
リンパ球、U937Tヒト骨髄単球細胞株およびJurkatヒト
Ｔ−細胞株）は前記に記載したのと同様にして用いられ
た。リンパ球は、前記に記載したのと同様にして抗β−
１あるいは抗β−２抗体で前処置された。リンパ球はま
た、前記に記載したのと同様にして抗VLA−α−４で前
処置された。
最後に、単離されたフィルターを試験管内に置き、ガ
ンマー計数管（Beckman Corporation,Model 5500B）の
中で１分間計数する以外は、前記と同様にしてアッセイ
を行った。結果を下記の表14に示す。見ての通り、抗VL
A−α−４試薬を含むサンプルは、コントロールに比べ
はるかに低い放射能値を示している。これらのデータ
は、前記蛍光のデータから得られた結果を確証してい
る。すなわち、抗VLA−α−４のVCAM−１レセプターに
対する結合は、その部位に対して結合を妨げる試薬によ
って実質的に阻害されることがわかる。
これらのデータはまた、図11にも示されている。図11
では、BBB系における、Jurkat T−細胞リンパ球の脳内
皮細胞に対する結合の相対的程度を示している。
容易にわかるように、抗β−１抗体は、TNF−αに活
性化された脳内皮細胞に対する白血球の結合を効果的に
阻害した。コントロールとしての抗β−２は他方で、未
処置のコントロールに近い。簡潔に言うと、β−１サブ
ユニットは脳におけるVLA−4/VCAM−１の相互作用を妨
げる有効な標的となり得る。
本発明の前記論述は、主として本発明の好ましい実施
態様および実験に向けられている。ここに記載される概
念を実施するに当たっては、下記のクレームにより限定
される本発明の意図および範囲をはずれなければ、さら
なる変形および修正が容易に行い得ることは、当業者に
とってはすぐに明白となるであろう。
フロントページの続き (72)発明者 ポーター，セス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94044 パシフィカ，ファスラー アベ ニュー 913 (72)発明者 ホーナー，ハイジ シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94062 レッドウッド シティー，デュ アン ストリート 150，＃９ (72)発明者 イェドノック，セオドア エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94030 フェアファクス，クレスト ロ ード 46 (56)参考文献 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ｉｅｗｓ，114（Ａｐｒｉｌ，1990）, ｐｐ．45−65 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，85 （６），ｐｐ．2019−2022 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/00 - 39/395 A61P 1/00 - 43/00 C12N 5/00 - 5/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】脳の炎症を予防し、改善し、あるいは治療
    するための薬剤を調製するための組成物であって、VLA
    −４分子のVCAM−１分子への結合を阻害する、少なくと
    も１種の試薬を含有し、該試薬が白血球細胞表面レセプ
    ターVLA−４に対するモノクローナル抗体である、組成
    物。
  2. 【請求項２】前記モノクローナル抗体がVLA−４のα−
    ４サブユニットに結合する、請求項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】前記脳の炎症が多発性硬化症と関連する、
    請求項１に記載の組成物。
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