JP3284534B2 - 根を有する多芽体を形成させて行う植物体の増殖方法 - Google Patents

根を有する多芽体を形成させて行う植物体の増殖方法

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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

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【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、農業、林業あるいは生
物学の研究等に応用可能な、組織培養による植物体の増
殖方法、特にマイクロプロパゲーションの技術に関す
る。
【0002】
【従来の技術】組織培養技術を用い、大量の植物を栄養
繁殖あるいは増殖させるマイクロプロパゲーション法
は、優良形質を備えた個体あるいは栄養繁殖性の花卉、
作物などを大量増殖させる方法として、近年盛んに用い
られている。この方法は、その増殖形態等から不定胚形
成法、不定芽形成法、メリクロン法、マルチプルシュー
ト法、マイクロチューバ法などに分けられ、その各々の
方法によって、結果として得られる植物体の増殖率や変
異頻度が異なっている。例えば、不定胚形成法は、増殖
率において最も優れており、植物種によっては一度に数
百万〜億単位の植物体を増殖させることも出来るが、不
定胚の形成にあたって未分化組織であるカルスを経由す
るため、遺伝的変異を起こす可能性が高いという欠点を
有する。一方、マルチプルシュート法では、増殖しよう
とする植物体の組織から直接、多芽体を形成させてこれ
を増殖し、また、この多芽体から伸長してくるシュート
を用いて植物体を再生する。従ってこの方法は、その過
程で未分化な組織を経由しないため、遺伝的安定性にお
いて最も優れている。しかし同時に、この方法では、植
物組織から植物体を再生するまでに相当の期間を必要と
すること等がネックとなって、高い増殖率は得られな
い。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】花卉、作物等の大量増
殖を目的とする場合におけるマイクロプロパゲーション
法の重要な利点の一つは、クローン個体の増殖により達
成される品質の均一化であり、遺伝的変異を生じやす
く、商品つまり苗の形質が不均一になるおそれのある方
法は望ましくない。従って、マイクロプロパゲーション
法の中、最も遺伝的安定性に優れるマルチプルシュート
法は、かかる目的のため、非常に有効な方法であるが、
この場合、そう高くはない増殖率をいかに向上させるか
が、大量生産に向けての大きな課題となる。
【0004】本発明は、かかる観点に立脚し、遺伝的安
定性が高く、しかも増殖率に優れたマルチプルシュート
法によるクローン植物体の増殖方法を提供することを目
的としてなされたものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
の結果、上記目的は、根を有する多芽体を形成させ、こ
れを用いて増殖を行うことにより達成されることを見出
し、本発明を完成した。
【0006】即ち、本発明は、組織培養による植物体の
増殖方法に関し、小植物体を、サイトカイニンを含む液
体培地で湿潤した多孔性培地支持体を用いて培養し、そ
の根を保持したまま多芽体を形成させて、根を有する多
芽体を形成させること、そして、この根を有する多芽体
を用いて植物体を増殖させることを特徴とする。
【0007】
【発明の実施の形態】以下、本発明をさらに詳細に説明
する。
【0008】本発明において材料として用いる植物組織
は、無菌的に培養されている小植物体であれば植物種を
問わない。また、無菌的に種子から発芽させた幼苗でも
材料として用いることが出来る。なお、本発明で小植物
体とは、試験管やフラスコ等の容器内で生育させること
のできる、高さ1〜5cm程度に伸長した植物体を意味
するものである。
【0009】これらの小植物体は、サイトカイニンを含
有する培地で培養することにより、根を保持したまま
と茎の付け根付近を中心に複数のシュートを生じ、根を
有する多芽体を形成する。この際、あらかじめ茎頂部を
切除した小植物体を用いて培養を行うと、より多数のシ
ュートが発生するようになる。
【0010】このとき、根を有する多芽体を形成させる
ため使用する培地は、サイトカイニンを必須の成分とす
る点を除き、本発明において特に限定されるものではな
く、植物組織培養の分野でごく一般的に知られている培
地、例えば、ムラシゲ・スクーグ(MS)やガンボーグ
B5等の基本培地と、5〜30g/lのショ糖等の炭素
原とを組み合わせて用いることができる。なお、サイト
カイニン類としては、カイネチン、ベンジルアミノプリ
ン(BAP)等が、多芽体形成効果に優れ、入手も容易
であるので、本発明において用いるサイトカイニンとし
て好ましい。また、多芽体形成のための環境条件として
は、温度20〜35℃、照度1000〜10000ルク
ス、培養容器内の炭酸ガス濃度200〜1000ppm
の範囲が、健全な多芽体の効率的な形成、及びその後の
シュートの健全な伸長の上から好ましい。
【0011】植物体の再生には、この根を有する多芽体
から伸長してきたシュートを用いる。即ち、上記のよう
にして形成された多芽体の培養を、同組成の培地にて続
けると、その個々のシュートが伸長してくるので、その
中から、2〜3cm以上に伸長し、かつ、2〜3節を含
むシュートを切り出し、適当な組成の発根用培地、例え
ば、MS培地もしくはガンボーグB5培地を1〜4倍に
希釈した基本培地に、炭素源としてショ糖を10〜20
g/l、植物ホルモンとしてインドール酪酸(IBA)
を0.01〜2.0mg/l添加したものに、このシュ
ートを植え付けて発根させることにより、植物体を再生
することができる。かかる増殖方法によれば、小植物体
の培養を始めてから、約2週間でこのシュートは切り出
し可能な長さとなる。なお、この発根過程を、先に本発
明者らが特開平8−252038において提唱したよう
に、適当な炭酸ガス濃度の下で行えば、炭素源の培地中
への添加を省略することもできる。
【0012】一方、シュートを切り出した後の組織は、
多芽体形成・シュート伸長に用いた培地と同組成の培地
を用いてさらに培養を続ければ、再び複数のシュートを
生じ、根を有する多芽体が再生される。シュートを切り
出してから、多芽体が再生され、そしてまた、その多芽
体の個々のシュートが伸長して切り出し可能となるまで
に要する期間は、やはり約2週間である。
【0013】即ち、本発明によれば、多芽体形成(再
生)、シュート伸長、シュートの切り出しというサイク
ルを、同組成の培地を用いて適宜継代培養を行うだけ
で、一つの小植物体に由来する材料に対し、いくらでも
繰り返すことができ、しかも、その1サイクルに要する
期間は約2週間でしかない。これは、従来法において、
同じこのサイクルに約5〜6週間を要していたのと比
べ、極めて短い期間である。
【0014】なお、本発明の増殖方法において、小植物
体から根を有する多芽体への培養は、液体培地をロック
ウール、パルプ、フェノール樹脂、ピートモス、バーミ
キュライト、セラミックファイバー等を材料とする多孔
性培地支持体に湿潤させたものを用いて行う。かかる培
地及び培地支持体を用いることにより、培養液を交換す
るだけで継代培養ができ、移植作業の手間を省くことが
できる。また、培地支持体として、寒天やゲランガムを
用いたときのように培地が固定されていないため、培地
中の成分をより有効に利用することができる。なお、か
かる多孔性培地支持体の使用は、根を有する多芽体から
得られたシュートの発根過程においても好ましい。多孔
性培地支持体により培地中には適度な空隙が与えられ
るため健全な根、ひいては健全な個体の形成が保証さ
れるからである
【0015】
【作用】従来、多芽体の形成は、材料とする植物体の一
部から組織を切り出し、この組織から複数のシュートを
誘導することにより行われてきた。しかし、本発明にお
いては、植物体全体を多芽体形成の材料とし、この植物
を、サイトカイニンを含む液体培地で湿潤した多孔性
培地支持体を用いて培養し、その根を保持させたまま複
数のシュートを誘導する。
【0016】このため、植物体自身の根の働きによっ
て、多芽体形成に用いた培地中の養分を効率よく吸収
し、利用することができ、従来の方法と比べ、速やかに
シュートの誘導、そして多芽体の形成を行うことができ
る。しかも、こうして形成された多芽体もまた、根を有
しているため、やはりその根の働きによって、その個々
のシュートの伸長が早い。さらに、植物体再生のためこ
れらのシュートを切り出した後の組織も、速やかに多芽
体を再生する。そして、植物体から多芽体が形成され、
発根可能なシュートが切り出されて再度多芽体が形成さ
れるまでの間、培地を交換するだけで継代培養を行うこ
とができ、移植作業の手間を省くことができる。
【0017】従って、本発明によれば、従来のマルチプ
ルシュート法による植物体の増殖において要していた期
間を大幅に短縮し、また、作業負担を軽減することがで
き、同法において、大幅に植物体増殖率向上させる
【0018】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明す
る。
【0019】[実施例1]Eucalyptus globulus7年生
個体の当年生枝から従来法にて得られた多芽体より、3
cm以上になったシュートを切り取り、これを、2〜4
倍に希釈したMS培地にIBA0.5mg/lのみを添
加した液体培地で湿潤させたフェノール樹脂成型品(日
本曹達(株)製『オアシス』)にさし付け、500〜1
000ppmの炭酸ガス濃度下で発根させて小植物体を
再生し、この小植物体を材料として用いた。
【0020】得られた小植物体の茎頂部を切り落とし、
培地をショ糖20g/l、BAP0.2mg/lを含む
MS液体培地に交換して、温度24℃、照度5000ル
クス、培養容器内の炭酸ガス濃度約500ppmで培養
を行ったところ、1週間で、小植物体の葉と茎の付け根
付近に複数のシュートが発生し、多芽体が形成された。
さらに、同じ培養条件で培養を続けると、これらのシュ
ートは、その後1週間で約3cmまで伸長したので、こ
れらを切り取り、2〜4倍に希釈したMS培地にIBA
0.5〜1.0mg/lもしくはジクロロインドール酢
酸0.1〜1.0mg/lのみを添加した液体培地で湿
潤させたフェノール樹脂成型品にさし付け、培養容器内
の炭酸ガス濃度を約500〜1000ppmとして、発
根に供したところ、90%以上で問題なく発根が観察さ
れ、植物体が再生された。
【0021】一方、シュートを切り出した後の組織につ
いては、培地を、新たに調製した同組成の多芽体形成用
培地(即ち、ショ糖20g/l、BAP0.2mg/l
を含むMS液体培地)に更新して、温度、照度、培養容
器内の炭酸ガス濃度とも多芽体形成時と同じ条件下で培
養を行うと、再び多芽体を形成し、その個々のシュート
を伸長させた。シュート切り出し後の組織を培養してか
ら多芽体が再生され、その個々のシュートが約3cmに
伸長するまでに要した期間は、約2週間であった。
【0022】表1に、多芽体形成(再生)のための培養
を始めてから、得られたシュートが発根過程に移される
までに要する期間を、本発明の方法と従来法とを対比さ
せて示す。
【0023】表1 *1 多芽体形成(再生)のための培養を始めてから、
多芽体が形成(再生)され、その多芽体より得られたシ
ュートが発根過程に移されるまでに要する期間 *2 1サイクル終了時に得られた、多芽体一株当たり
の発根可能なシュート数 *3 多芽体一株から1年間に生産されるシュート数
【0024】表1より明らかなように、本発明によれ
ば、多芽体形成(再生)のための培養を始めてから、得
られたシュートが発根過程に移されるまでの期間を、従
来法に対して半分以下に短縮でき、植物体再生のための
最終的な材料となるこのシュートを、年間に、従来法の
2.5倍得ることができた。従って、従来のマルチプル
シュート法では達成できなかった、植物体の高い増殖率
を達成することが可能となった。
【0025】
【効果】本発明によれば、多芽体形成(再生)のための
培養を始めてから、得られたシュートが発根過程に移さ
れるまでの期間を、従来法に対して大幅に短縮すること
ができ、従って、従来のマルチプルシュート法では達成
できなかった、植物体の高い増殖率が達成される。
【0026】しかも、本発明の増殖方法では、従来のマ
ルチプルシュート法と同様、その過程でカルス等の未分
化な組織を経ることがないため、最終的に得られる植物
体に遺伝的変異を生ずるおそれが少なく、効率的にクロ
ーン植物体を得ることができる。
【0027】さらに、本発明の増殖方法、液体培地と
ロックウール、パルプ、フェノール樹脂、ピートモス、
バーミキュライト、セラミックファイバー等を材料とす
る多孔性培地支持体とを組み合わせて培養を行うので
培養組織が培地中の成分をより有効に利用することがで
き、また、培地を交換するだけでこの組織の継代培養等
行い、移植作業の手間を省くことができる。加えて、
発根過程においてかかる培養法を採用した場合には、健
全な根を得ることができ、ひいては健全な植物体の再生
が保証される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平5−244839(JP,A) 特開 平2−257817(JP,A) 特開 平10−4811(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) A01H 4/00

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 組織培養による植物体の増殖方法であっ
    て、無菌的に得られた小植物体を、サイトカイニンを含
    む液体培地で湿潤した多孔性培地支持体を用いて培養す
    ることにより、根を保持したまま多芽体を形成させて根
    を有する多芽体を得、この根を有する多芽体を用いて植
    物体を増殖させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項2】 小植物体より形成された根を有する多芽
    体からシュートを伸長させ、このシュートを切り取って
    発根させることにより植物体を再生する、請求項1に
    載の植物体の増殖方法。
  3. 【請求項3】 シュートが切り取られた後の組織を、続
    けて同組成の培地で培養することにより再び多芽体を形
    成させる、請求項に記載の植物体の増殖方法。
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