JP3201523B2

JP3201523B2 - ヒト受容体における抗体−仲介異種移植拒絶を弱めるための方法および組成物

Info

Publication number: JP3201523B2
Application number: JP50461193A
Authority: JP
Inventors: グッド，エイ．ヒーサー; クーパー，デビッド，ケイ．シー．; マルコム，アンドリュー，ジェイ．
Original assignee: アルバータリサーチカウンスル; インテグリスバプティストメディカルセンター，インコーポレイテッド
Priority date: 1991-08-23
Filing date: 1992-08-21
Publication date: 2001-08-20
Anticipated expiration: 2016-08-20
Also published as: ATE232730T1; EP0661980B1; US6607723B1; US5695759A; AU2505992A; US5767093A; EP0661980A4; WO1993003735A1; AU666128B2; EP0661980A1; IL102916A; US5651968A; DE69232928D1; JPH07501237A; IL102916A0

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は移植免疫学の一般的分野におけるものであ
り、特別に異種移植にそして炭水化物異種抗原に対する
前成ヒト抗体の阻害および／または除去を通じてヒトに
おける異種移植を容易にするための組成物と方法に関連
する。

引用文献以下の文献が申請の関連部分に肩付きとして引用され
ている。

1. Agashi,T.:Presentation at American Society for
Artificial Internal Organs,37th Annual Meeting in
Chicago:April 26,1991. 2. Bannett,A.D.,McAlack,R.P.,Raja,R.,Baquero,A.,M
orris,M.:Transplant.Proc.XIX:4543−4546,1987. 3. Bensinger,W.I.,Buckner,C.D.,Thomas,E.D.,Clift,
R.A.:Transplantation.33:427−429,1982. 4. Chien,J.L.,Li,S.C.,Li,Y.T.:J.Lipid Res.20:669
−673,1979. 5. Dubois,M.,Gilles,K.,Hamilton J.K.,Rebers,P.A.,
Smith,F.:Anal.Chem.28:350−356,1956. 6. Egge,H.,Kordowicz,M.,Peter−Katalinic,J.,Hanfl
and,P.:J.Biol.Chem.260:4927−4935,1985. 7. Eto,T.,Ichikawa,Y.,Nishimura,K.,Ando,S.,Yamaka
wa,T.:J.Biochem.（Tokyo）64:205−213,1968. 8. Galili,U.,Clark,M.R.,Shohet,S.B.,Buehler,J.,Ma
cher,B.A.:Proc.Natl.Acad.Sci.84:1369−1373,1987. 9. Galili,U.,Macher,B.A.,Buehler,J.,Shohet,S.B.:
J.Exp.Med.162:573−582,1985. 10. Galili,U.,Shohet,S.B.,Kobrin,E.,Stults,C.L.,M
acher,B.A.:J.Biol.Chem.263:17755−17762,1988. 11. Holgersson,J.,Caims,T.D.H.,Breimer,M.E.,Taub
e,D.,Welsh,K.,Samuelsson,B.E.:Glycoconjugate J.８:
172,1991. 12. Holgersson,J.,Jovall,P.A.,Samuelsson,B.E.,Bre
amer,M.E.:J.Biochem.（Tokyo）108:766,1990. 13. Lemieux,R.U.,Baker,D.,Bundle,D.:U.S.Patent N
o.4,137,401,issued January 30,1979. 14. Lemieux,R.U.,Baker,D.,Bundle,D.:U.K.Patent N
o.1544908,issued August 29,1979. 15. Lemieux,R.U.,Bundle,D.,Baker,D.A.:U.S.Patent
No.4,238,473,issued December 9,1980. 16. Lemieux,R.U.,Ratcliffe,R.M.:U.S.Patent No.4,3
62,720,issued December 7,1982. 17. Mazid,M.A.:European Patent Application No.893
11540.2（Publication＃0 371 636 A2）,filed Novembe
r 8,1989. 18. Mazid,M.A.:U.S.Patent Application No.07/270,9
50,filed November ,1988. 19. Pinto,B.M.,Bundle,D.R.:Carbohydr.Res.124:313
−318,1983. 20. Platt,J.L.,Lindman,B.J.,Chen,H.,Spitalnik,S.
L.,Bach,F.H.:Transplant.50:817−822,1990. 21. Rapp,H.J.,Borsos,T.:J.Immunol.96:913−919,196
6. 22. Stellner,K.,Hakomori,S.,Warner,G.A.:Biochem.B
iophys.Res.Commun.55:439−445,1973. 23. Stults,C.L.,Sweeley,C.C.,Macher,B.A.:Methods
in Enzymology 179:167−213,1989. 24. Weetall,H.H.:Methods in Enzymology XLIV:140,1
976. 25. Cox,D.D.,Metzner,E.K.,Reist,E.J.:Carbohydr.Re
s.62:245−252,1978. 426. Dahmen,J.,Torbjorn,F.,Magnusson,G.,Noori,G.,
Carlstrom,A.:Carbohydr.Res.127:15−25,1984. 27. Garegg,P.J.,Oscarson,S.:Carbohydr.Res.136:207
−213,1985. 28. Garegg,P.J.,Oscarson,S.:Carbohydr.Res.137:270
−275,1985. 29. Jacquinet,J.,Duchet,D.,Milat,M.,Sinay,P.:J.C.
S.Perkin Ｉ:326−330,1981. 30. Koike,K.,Sugimoto,M.,Sato,S.,Ito,Y.,Nakahara,
Y.,Ogawa,T.:Carbohydr.Res.163:189−208,1987. 31. Schaubach,R.,Hemberger,J.,Kinzy,W.:Liebigs An
n.Chem.607−614,1991. 32. Laus,R.,Ulrichs,K.,Muller−Ruchholtz,W.:Int.A
rchs.Allergy Appl.Immun.85:201−207,1988. 33. Ratcliffe et al.U.S.Patent No.5,079,353,issue
d January 7,1992,for“Sialic Acid Glycosides,Antig
ens,Immunoadsorbents,and Methods for Their Prepara
tion". 34. Okamoto et al.,Tetrahedron,Vol.46,No.17,pp.58
35−5837（1990）． 35. Abbas et al.,Proc.Japanese−German Symp.Berli
n,pp.20−21（1988）． 36. Paulson,Angew.Chem.Int.Ed.Eng.,21:155−173（1
982）． 37. Schmidt,Angew.Chem.Int.Ed.Eng.,25:212−235（1
986）． 38. Ｆjedi et al.,Glycoconj.J.,４:97−108（198
7）． 39. Kameyama et al.,Carbohydr.Res.,209:C₁−C₄（19
91）． 40. Ekberg et al.,Carbohydr.Res.110:55−67（198
2）． 41. Dahmen et al.,Carbohydr.Res.118:292−301（198
3）． 42. Rana et al.,Carbohydr.Res.91:149−157（198
1）． 43. Amvam−Zollo et al.,Carbohydr.Res.150:199−21
2（1986）． 44. Paulsen et al.,Carbohydr.Res.104:195−219（19
82）． 45. Chernyak et al.,Carbohydr.Res.128:269−282（1
984）． 46. Fernandez−Santana et al.,J.Carbohydr.Chem.
８:531−537（1989）． 47. Lee et al.,Carbohydr.Res.,37:193 et seq.（197
4）． 48. Ratcliffe et al.,U.S.Patent Application Seria
l No.07/278,106,filed November 30,1988. 本明細書中で言及するすべての出版および特許申請
は、本発明に関連する技術の技術的熟練の水準を示して
いる。すへての出版および特許申請はこの中に、あたか
もそれぞれの出版または特許申請を特別にそして個々に
完全な形で引用文献で取り入れられたのと同じ程度の完
全さをもって引用文献として取り入れられている。

背景 1990年にアメリカ合衆国では15,000以上の臓器移植が
実施された。（臓器移植および臓器調達のための合衆国
科学的登録および移植ネットワークの年次報告、199
0.）適当な臓器が6,000人のドナーから得られ、そのう
ち4,500以下が死体ドナーからのものであった。アメリ
カ合衆国の臓器割当ての連合ネットワークの待機リスト
に載せられた患者数はいつの時点においても23,000人近
くに上る。したがって、多くの潜在的受容体人口が適合
臓器移植のために１年以上の期間待機することになるで
あろう。

臓器移植の成功が着実に増大するにつれ、ますます多
くの患者がこの方法に対して差し向けられ、適合臓器の
不足は従来より一層激しくなった。現在、腎臓移植では
１年間の移植片生存が優に90％を超え、心臓移植では80
％以上、そして肝臓および膵臓の移植では移植片の生存
率は80％に近づきつつある。

適当なドナーの必要性に関して一般大衆および医学専
門家を教育する努力が大いになされているにもかかわら
ず、適当な臓器への要求と利用できることとの間のギャ
ップは増大しているようである。この問題に対する一つ
の解答は動物臓器を使用することではないだろうか。こ
のような状況の中で人間以外の霊長類をドナーとして用
いることが考慮されている。

しかし、これらの動物は世界的に供給が不足してお
り、とくにより大型のサルに関していえばそれらはしば
しば絶滅の危険にさらされた種となっている。したがっ
て、臓器提供の役割を考えるには十分な数がなく、さら
に、たとい広範な捕獲飼育プログラムによるとしても数
は容易に増やすことはできないだろう。他に不利な点と
して大きさが比較的小さいことがあり、ヒト成人に対す
る臓器のドナーとしては不適切であり、またウィルス感
染の危険もある。また、これらの動物をかなり大きなス
ケールで使用することに対する世間一般のやかましい反
対もあると思われる。

ブタのような、種として人間からより遠い哺乳類は多
くの面で非常に適当と考えられる。というのはブタは適
当な大きさに成長し、飼育が容易で、特別な病原菌なし
のブタ群またはノトバイオ的（無菌）状態ですら飼育す
ることができ、またすでにヒトの消費目的のために特別
に多数が飼育されているからである。しかしながら、ブ
タとヒトのように大きく隔たった種の間の臓器移植は、
数分あるいは数時間内に抗体−仲介の過急性拒絶が起こ
り、この拒絶反応は現在利用できる免疫抑制法により阻
止または治療することはできない。抗体−仲介拒絶の問
題を克服することができるとすれば、毎年利用できるヒ
トドナーの数によって臓器移植が制限されることはなく
なるかもしれない。

そうなれば社会にとっては利益は大きいであろう。現
在、心臓移植を待っている患者の３分の１は適合した臓
器が入手できないまま死んでいる。もし動物臓器が使用
されるならば、必要と思われる時にできるだけ早く移植
を受けることができるだろうし、緊急手続きの必要なし
に理想的条件下で選択的に手術が実施できるであろう。
さらに、入手できる比較的少数のドナー臓器は理想的な
患者に使用しなくてはならないと思われているので、患
者が境界ぎりぎりの禁忌を有するときは、移植待機リス
トに書き入れられず、現在このような患者が多数に上っ
ている。ドナー臓器の数に制限がないとすれば、よりず
っと多くの候補者に対して臓器移植を確実に提供できる
であろう。従って、異種移植を容易にすると思われる構
成および方法は極めて有用なものとなるであろう。

ABO−ミスマッチ個体間の非−異種移植を容易にする
ことについて幾分成功がなされている。ヒトにおける移
植にいていくつかの特許（U.S.特許4,137,401¹³および
4,238,473¹⁵;U.K.特許1544908¹⁴;U.S.特許5,240,601）
に記載されている方法と同じ方法を用いて天然に存在す
る抗−Ａおよび／または抗−Ｂ抗体を体外除去すること
によってABO−ミスマッチ個体間の腎臓および骨髄移植
を成功裡に行うことができた（Bannett他.1987²,Bensin
ger他.1982³）。

抗−Ａ、抗−Ｂおよびその他の抗−炭水化物抗体は同
種輸液反応および皮膚移植片と移植臓器の拒絶に関与し
ている。したがって炭水化物決定基に対する抗体が異種
移植の急性拒絶において重要な役割を演ずるかもしれな
いという仮説が提出されている。いくつかの研究によっ
てある特定の炭水化物構造が異種抗体の標的であるとい
うことが示されている（Laus他.1988³²,Platt他.199
0²⁰,Holgersson他.1991¹¹）。

たくさんの糖脂質が哺乳動物細胞から純化されこれら
の構造の多くはStultsらによって論文中にレビューされ
ている（1989）²³。ウサギ、ウシ、および新世界サルか
ら得た細胞から線形Ｂ型２−様スフィンゴ糖脂質が精製
された（Etoら.1967⁷,Stellnerら.1973²²、Chienら.197
9⁴,Eggeら.1985⁶およびGaliliら.1987⁸）．ヒトから得た血漿中に抗−炭水化物抗体のたくさんの
特異性が同定されている。Galiliと共同研究者ら（198
5）^９は抗−αGal（１−３）βGal抗体が循環ヒトIgGの
１％ほどを占めることを確認した。この研究グループは
生物的適合固状支持体に結合したαGal（１−３）βGal
（１−４）βGlcNAc（線形Ｂ型２）を用いてヒトAB血清
から抗体を精製した。かれらは、これらの抗体はブタ内
皮細胞（大動脈からの）、ブタ上皮細胞（目の水晶体か
らの）および非−霊長哺乳類それに新世界サルから得た
多くの他の組織には結合するが、健常な旧世界サル、尾
長ザル、つまりヒトから得た組織には結合しないことを
見いだした（Galiliら.1988¹⁰）。

非−異種移植において、ヒト抗−Ａおよび抗−Ｂ抗体
を体外除去するために免疫吸着剤の形で固状支持体に共
有的に結合した、ＡおよびＢ血液型三糖を用いて抗−炭
水化物抗体を中和または除去すると、ABO血液型群障壁
を横切って腎臓および骨髄移植が容易になることがわか
った（Bannettら.1987²,Bensingerら.1982³およびAgash
i1991¹）。このアプローチは現在臨床治験に用いられて
いる。抗−Ａおよび抗−Ｂ抗体のin situ中和のための
ＡおよびＢ血液型三糖の注射用剤形は現在前臨床開発段
階にある。異種特異的抗体活性の研究で、固状支持体に
共有結合で付着した他のオリゴ糖を用いた場合、抗炭水
化物抗体をとくにうまく除去することができなかったこ
とが報告されている（Lausら³²）。

発明の開示本発明は異種の細胞、組織または臓器をヒトに移植す
るのを容易にするための２つの技法を含んでいる。１つ
の技法は受容体血液から異種抗体を体外除去することを
含んでいる。もう１つはin vivoで異種抗体を阻害する
ことを含む。本発明はまたこれらの方法で用いられ、ま
たはそれらから結果として生ずる組成物をも含む。

したがって、本発明の１つの局面は異種移植を受ける
ヒト受容体（ヒトレシピエント）中での抗体−仲介異種
移植拒絶を弱めるための方法でありそれは以下のことか
ら成る:1個またはそれ以上の異種抗原を同定し、その
（それらの）抗原を生物的適合固状支持体に付着させ、
受容体から抗体−含有体液を取り出し、拒絶に関与する
上述の異種移植の少くとも１個の炭水化物抗原に対する
前成抗体を、適合リンカーアームを通じて１個または複
数の抗原が結合している生物的適合固状支持体上で体液
を体外灌流させることによってその体液から除去し、つ
いで灌流したその体液を受容体に戻してやる。

本発明の他の局面は、異種移植のヒト受容体における
抗体−仲介異種移植拒絶を弱めるための方法であり、前
成抗体に対する少くとも１個の炭水化物異種抗原を同定
することを含んでおり、受容体に対する拒絶に関与する
１個またはそれ以上の抗体に結合できる少くとも１個の
炭水化物異種抗原を、抗原に対する受容体の抗体を阻害
するのに十分な量だけまた経口投与する。

本発明のさらに別の局面は、異種移植のヒト受容体に
おいて抗体−仲介異種移植拒絶を弱めるのに有用な組成
物であり、これは少くとも１個の炭水化物異種抗原の注
射可能な処方が含まれる。

さらに本発明の別の局面は、異種移植のヒト受容体の
血液から異種抗体を除去するのに有用な免疫吸着組成物
で、これによって受容体による異種移植片に対する拒絶
を弱めるためのものであり、少くとも１個の同定された
異種抗原が適合リンカーアームを通じて結合している生
物的適合固状支持体を含んでいる。

また本発明のその他の局面は、上述の異種移植の拒絶
を弱めるための異種移植のヒト受容体に輸液するのに有
用なヒト血液または血漿であり、この血液または血漿は
少くとも１個の同定された抗原に対する前成抗体が除去
されている。

図面の簡単な説明図1A−1Hはブタ心臓、ブタ腎臓および／またはブタ赤
血球ストローマから溶出したヒト抗体の結合をしらべる
のに用いた炭水化物構造を示す。

図２はブタ赤血球の抗体−仲介溶血が種々のマトリッ
クス−結合炭水化物およびマトリックス−結合炭水化物
構造体の混合物上へのヒト血漿の前吸着によって減少す
ることを示す。

図３はヒツジ、ブタおよびウシ赤血球の抗体−仲介溶
血が、マトリックス−結合炭水化物およびマトリックス
−結合炭水化物構造によるヒト血漿の前−吸着によって
減少することを示す。

図4Aおよび4Bは種々のブタ細胞型の溶血が、ヒト血漿
｛Ｏ血漿（Ａ）およびAB血漿（Ｂ）｝をマトリックス−
結合αGal（１−３）βGal（１−４）βGlcNAc−Ｒ（線
形Ｂ型２）またはαGal（１−３）βGal（１−４），β
Glc−Ｒ（線形Ｂ型６）で前−吸着したとき減少するこ
とを示す。

図５はヒト血漿（O,A,BおよびAB）をいくつかのマト
リックス−結合炭水化物抗原で前吸着したとき、ブタ腎
臓細胞株（LIC−PK₁）に対する溶血が減少することを示
す。

図６は異なるヒトAB血漿をいくつかのマトリックス−
結合炭水化物抗原で前吸着したとき、ブタ腎臓細胞株
（LLC−PK₁）に対する溶血が減少することを示す。

図７はヒト血漿（O,A,BおよびAB）をいくつかのマト
リックス−結合炭水化物抗原で前吸着したとき、ブタ腎
臓細胞株（LLC−PK₁）に対する溶血が減少することを示
す。

図8Aおよび8Bはヒト血漿｛Ｏ血漿（Ａ）およびＡ血漿
（Ｂ）｝をいくつかの可溶性炭水化物抗原とインキュベ
ートするとブタ腎臓細胞株（LLC−PK₁）に対する溶血が
減少することを示す。

図９はヒト血漿（O,A,BおよびAB）をいくつかの可溶
性炭水化物抗原とインキュベートするとブタ腎臓細胞株
（LLC−PK₁）に対する溶血が減少することを示す。

図10は異なるヒトAB血漿をいくつかの可溶性炭水化物
抗原とインキュベートするとブタ腎臓細胞株（LLC−P
K₁）に対する溶血が減少することを示す。

図11A−Ｄはヒト血漿（O,A,BおよびAB）をいくつかの
マトリックス−結合炭水化物抗原で前吸着すると、ELIS
Aで検出されるように抗体が除去されることを示す。

図12A−Ｄは異なるヒトAB血漿をいくつかのマトリッ
クス−結合炭水化物抗原で前吸着すると、ELISAで検出
されるように抗体が除去されることを示す。

発明の実行のための方法 A.定義ここで用いるときつぎの言葉は以下の意味をもつ：異種移植：ヒト受容体において通常拒絶反応をひき起こ
す非ヒト哺乳動物の細胞、組織、または臓器の移植。

拒絶：異種移植片に対する体液性および／または細胞
成分での免疫反応。

弱毒化：拒絶反応の成分のいずれか一方または両方の
減少または除去。

抗体−仲介：抗原−抗体反応からの直接または間接の
結果としての免疫反応。

阻害：拒絶反応を誘起する抗体の能力の低下または除
去。

異種抗原：異種移植の炭水化物抗原で、とくに拒絶反
応に含まれるもの、または異種移植の炭水化物抗原に結
合し得る抗体と交叉反応する抗原。

異種抗体：拒絶反応の一部として異種抗原を認識しそ
して結合する前成（存在）ヒト抗体。

生物的適合：ヒト抗体−含有体液に対する化学的不活
性。

血液：全血、血漿または血清。

適合リンカーアーム：生物適合性固体支持体からの炭
水化物抗原に場所を提供する部分であり、そこで１つの
官能基は支持体の相互官能基と結合することができ、他
の官能基は炭水化物抗原の相互官能基と結合することが
できる。

B.体液からの異種抗体の体外除去上に示したように本発明の１つの局面には以下のステ
ップが含まれる：すなわち、１個またはそれ以上の異種
抗原を同定し、それらの異種抗原を生物適合性固体支持
体に結合させ、抗体−含有体液をヒト異種移植受容体か
ら取り出し、１個またはそれ以上の異種抗原に対する前
成抗体をアフィニティクロマトグラフにより体液から除
去し、こうして得られた異種抗体−除去体液を受容体に
戻すこと。

この技法はどんな抗体含有体液にも適用できるが、通
常は血液に適用される。血液を通常行われる方法で取り
出し、凝固を防ぐために抗凝固剤（たとえば、ヘパリ
ン、クエン酸）をそれに加える。必要ならば、血液を異
種抗体除去処理に付する前に血液から細胞を除去しても
よい。

異種抗体除去は血液を１個またはそれ以上の異種抗原
を結合させてもっている固状支持体上で灌流させて達成
する。異種抗原は、異種移植材料上にヒト血液を灌流し
てヒト血液から異種抗体を分離し、異種移植片から結合
した抗体をとりわけ、これらの抗体を用いて、たとえ
ば、適当なイミュノアッセイにより候補炭水化物を選抜
することにより、同定される。このような異種抗原の例
は以下の表１にあげたまた図１に示した炭水化物であ
る。

炭水化物異種抗原の合成のための化学的方法は技術的
に知られている方法で行うことができる。これらの材料
は一般的には、好ましいグルコース、Ｎ−アセチルグル
コサミン、ガラクトーウ、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、フコースおよびラムノースまたはラクトース中間体
を含む適宜防御された個々の単糖を用いて集められる。

用いられる特異な方法は合成すべきそれぞれの構造に
対して全体的に適合させ最適化させる。一般的に、オリ
ゴ糖配糖体の全部または一部の化学合成はまず還元する
糖または単糖のアノマー炭素原子上に配糖体結合を形成
することを含む。すなわち、天然に存在するかまたは化
学的に修飾した糖構造（グリコシルドナー）の適当な防
護された形を、ハロゲン化物、トリクロロアセトイミデ
ート、アセチル、チオグリコシドなどを含む脱離基を導
入するために還元単位のアノマー中心で選択的に修飾す
る。つぎにドナーを技術的によく知られた触媒条件下で
配糖体結合が生成するその位置に１個の遊離水酸基を有
する炭水化物アクセプターの適当な形またはアグリコン
と反応させる。技術的には非常に多種類のアグリコン部
分が知られており、正しい配位をもって還元単位のアノ
マー中心に付着させることができる。

炭水化物合成の技術においてよく知られている適合遮
断基の適当な使用によって合成構造を選択的に修飾また
は追加糖ユニットあるいは糖ブロックをアクセプター構
造にさらに追加的に付着させることができる。

配糖体連鎖の生成後、糖配糖体は付加的な糖ユニット
を共役させるのに用いることができ、または選択的位置
で化学的に修飾し、あるいは伝統的な方法で脱防護した
後、酵素的合成に用いられる。一般に、天然に存在また
は化学的に修飾した糖ユニットの糖配糖体への化学共役
は文献に十分に言及されて確立された化学を用いて行わ
れる。たとえば以下を参照のこと:Okamotoら.³⁴,Ratcli
ffeら.³³,Abbasら.³⁵,Paulson³⁶,Schmidt³⁷,Fugediら.
³⁸,およびKameyamaら.³⁹,U.S.特許番号、4,137,401¹³、
4,238,473¹⁵、および4,362,720¹⁶およびDahmenら.²⁶,Sc
haubachら.³¹,Gareggら^27,28,Jacquinetら.²⁹,Cox
ら.²⁵,およびKoikeら.³⁰ 図１に示した単糖およびオリゴ糖配糖体中、Ｘは酸
素、硫黄、−NH−または共有結合を表し、Ｙは水素また
はアグリコン基（すなわち、配糖体の成分で糖でないも
の）を表す。大部分の例においてＹは一般式−Ａ−Ｚの
１つの基を表し、ここでＡは１つの結合、炭素原子が２
−10個のアルキレン基、または−（CH₂−CR₁−Ｇ）_ｎ−
を表し、ここでｎは１から５まで（１と５を含めて）の
整数である;R₁は水素、メチルおよびエチルから成るグ
ループから選択される；そしてＧは水素、酸素、硫黄、
窒素、フェニル、およびアミン、ヒドロキシル、ハロお
よび炭素原子１個〜４個のアルキル基から成るグループ
から選択された１〜３個の置換基で置換されたフェニル
から成るグループから選択され、Ｚは水素、メチルから
成るグループから選択され、Ｇが酸素、硫黄または窒素
でなくＡが結合でない場合、ＺもOH,SH,−NH₂,NHR₂,−
Ｃ（Ｏ）OR₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂,−Ｃ（Ｏ）NH−NHR₂,−Ｃ
（Ｏ）NHR₂および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（R₂）_２から成るグルー
プから選択され、そこで各R₂は独立に水素または炭素原
子１〜４個のアルキル基である。

なるべくならＸは−Ｏ−を表しＹは−Ａ−Ｚを表し、
ここでＡは２個から10個の炭素原子のアルキレンであ
り、Ｚは−Ｃ（Ｏ）OR₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂,および−Ｃ
（Ｏ）NHR₂から成るグループから選択され、そこでのR₂
は独立に水素または炭素原子１〜４個のアルキルであ
る。

図１に示した炭水化物の中でのとくに好ましい炭水化
物は式1,2,3,4,13,25,26,31,および32であり、ここでＸ
は−Ｏ−でＹは−Ａ−Ｚ、そしてここでＡは炭素原子２
個から10個のアルキレンでＺは−Ｃ（Ｏ）OR₂,−Ｃ
（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR₂から成るグループから
選択され、R₂は水素または炭素原子１〜４個のアルキル
である。

異種抗原が結合した固状支持体は連続した大きな表面
の形または粒子の形になっている。当技術分野では多く
の種類の生体適合性固体支持体材料が知られている。そ
の例としてはシリカ、穴のあるグラスのような合成珪酸
塩、珪藻土のような生物生産の珪酸塩、カオリナイトの
ような珪酸塩−含有ミネラル、およびポリスチレン、ポ
リプロピレン、および多糖体のような合成高分子があ
る。好ましい支持体はU.S.特許5,240,60に記載されてお
り、その開示は引用文献としてここに組み入れられてい
る。

異種抗原は固状支持体上に共有結合で結合するかまた
は非共有結合的（受動的）に吸着する。共有結合は支持
体上の官能基と異種抗原の適合リンカーアームとの間の
反応によって生成する。適合リンキングアームを通じて
炭水化物抗原が生物的適合固状支持体に付着することに
よって効果的に抗炭水化物抗体を除去できることが思い
もかけず見出された。間接的結合に用いられる結合部分
は好ましくは、単に固状支持体の表面からの抗原に間隔
をおく適当な長さ（少くとも１炭素原子）の有機二機能
分子である。特定のリンキングアームは決定的ではな
い。

たくさんのアグリコンリンキングアームが当技術分野
において知られている。たとえば、パラニトロフェニル
基（すなわち、−YR＝−OC₆H₄PNO₂）を含むリンキング
アームはEkborgら⁴⁰によって開示されている。合成の適
当な時点で、ニトロ基をアミノ基に還元するとそれはＮ
−トリフルオロアセトアミドとして防護することができ
る。支持体への共役に先立って、トリフルオロアセトア
ミド基を除去し、それによってアミノ基の保護が除かれ
る。

硫黄を含むリンキングアームはDahmenら⁴¹によって開
示された。すなわち、リンキングアームは２−ブロモエ
チル基から導出され、それがチオヌクレオフィルとの置
換反応で−OCH₂CH₂SCH₂CO₂CH₃および−OCH₂CH₂SC₆H₄−P
NH₂などのような種々の末端官能基をもつリンキングア
ームに導かれることがわかった。

Ranaら⁴²は６−トリフルオロアセトアミド−ヘキシル
リンキングアーム（−Ｏ−（CH₂）_６−NHCOCF₃）を開示
しており、そこではトリフルオロアセトアミド保護基が
除去できて共役に用いる１級アミノ基が現われる。

既知のリンキングアームのその他の例証として７−メ
トキシカルボニル−3,6,ジオキサヘプチルリンキングア
ーム⁴³（−OCH₂−CH₂）₂OCH₂CO₂CH₃）;2−（４−メトキ
シカルボニルブタンカルボキシアミノ）エチル⁴⁴（−OC
H₂CH₂NHC（Ｏ）（CH₂）₄CO₂CH₃）がある；またアリルリ
ンキングアーム⁴⁵（−OCH₂CH＝CH₂）があり、これは適
当なモノマーとラジカル共重合してコポリマーになる；
その他のアリルリンキングアーム⁴⁶として〔−Ｏ（CH₂C
H₂O）₂CH₂CH＝CH₂〕が知られている。さらに、アリルリ
ンキングアームは２−アミノエタンチオール⁴⁷の存在下
で誘導体化することによってリンキングアーム−OCH₂CH
₂CH₂SCH₂CH₂CH₂NH₂を供給することができる。その他適
当なリンキングアームがU.S.特許番号4,137,401¹³,4,23
8,473¹⁵,および4,362,720¹⁶およびDahmenら.²⁶とGaregg
ら²⁷に開示されている。

さらに、Ratcliffeら⁴⁸が開示したように、Ｒ基は付
加糖または還元糖末端にリンカーアームを含むオリゴ糖
でもよい。

できうれば、アグリコン部分は疎水基で、最も好まし
いのは、アグリコン部分が−CH₂）₈COOCH₃,−（CH₂）₅O
CH₂CH＝CH₂および−（CH₂）₈CH₂OHから成るグループか
ら選択された疎水基である。

炭水化物抗原の官能リンキングアームはつぎに抗原を
生物的適合固状支持体に付着させるのに用いられる。こ
のような付着は技術的によく知られており、たとえばVe
noら.,U.S.特許5,759,993に開示されており、完全な形
で引用文献として本明細書に取り入れられている。

２個あるいはそれ以上結合した異種抗原の組合せを有
する固状支持体は血液または血漿から特異性の異なる異
種抗体を除去するのに使用することができる。さもなけ
れば、血液または血漿を、異なる特異性の異種抗原を除
去するためにそれぞれが１個あるいはそれ以上の異種抗
原を結合した一連の固状支持体上を順次通過させればよ
い。そこで、実施例の結果に基づいて１個またはそれ以
上の線形Ｂ型炭水化物異種抗原とほかの型の炭水化物抗
原（たとえば、Ａ型抗原、Forssman型抗原、Rhamnose抗
原、またはグルコサミン型抗原（図１参照）との組合せ
を用いるのが好ましい。ブタの異種移植の場合、少くと
も線形Ｂ型２および線形Ｂ型６抗原が好ましい。抗原の
このような組合せは下に述べる異種抗原阻害方法におい
ても用いることができる。

支持体に結合した異種抗原と血液または血漿中に存在
する相補的な異種抗体との間の結合を促進させる条件下
で血液を固状支持体と接触させる。体外血液灌流を実施
するのに好ましい装置と技術は上述のU.S.特許5,240,60
1¹⁸に述べられている。好ましい接触温度として35℃か
ら40℃の範囲が用いられている。接触時間は典型的には
１〜６時間の範囲になるだろう。血液または血漿の非結
合部分（すなわち、異種抗体−除去血液または血漿）は
そのあと患者に再導入するために集められ、あるいは連
続して直接再導入することができる。異種移植片を異種
抗体が実質的に存在しない中で、または異種抗体が比較
的低い力価で存在する時に導入するために、受容体の血
液からの異種抗体の除去を移植に先立って実施する（典
型的には移植の前に毎日８回まで繰返す）。受容体の異
種抗体力価はイムノアッセイによりモニターできる。こ
のような条件下で移植片を入れてやれば抗体−仲介超急
性拒絶の起こる可能性を少なくすることができ（たとい
抗体力価がそのあと増加するとしても）移植片の生存を
長くさせる。この現象は“順応”、“適応”、または
“アレルギー”というようにいろいろに名付けられてい
る。異種抗体の除去は必要に応じて移植後も続けてよ
い。

シクロスポリン、メチルプレドニソロン、およびアザ
チオプリンなどのような非特異的免疫抑制剤を使用する
従来の薬理学的免疫抑制法を本発明の２つの方法のどち
らかまたは両方と組合せて用いてもよい。

C.In Vivoにおける異種抗体の阻害上に示したように、この方法は１個またはそれ以上の
同定された異種抗原を異種移植受容体に非経口的に導入
することを含んでいる。一旦血液循環中に導入されれ
ば、これらの異種抗原は前成抗体と結合してこれら異種
抗体の活性を中和する。

異種抗体除去に用いたのと同じ異種抗原を阻害法で用
いてもよい。これらの異種抗原または薬理学的に許容し
うるそれの誘導体（すなわちエステル）の１個またはそ
れ以上を従来法で使われている薬理学的に許容しうる賦
形剤（たとえば注射用水）中に注射用として製剤化す
る。製剤化は典型的には以下の操作を含む：すなわち抗
原を賦形剤と混合し、この混合物を限外濾過によって発
熱物質を除去し、脱発熱混合物を減菌濾過する。その混
合物を貯蔵のために凍結乾燥し必要に応じて減菌賦形剤
中で再構成する。

注射可能な製剤は断続的ボーラス注射または連続的静
脈輸液によって投与してよい。投与は典型的には異種移
植の血管再生の少し前に始められ移植後種々の時間の間
続けられる。移植の種類、年齢、体重、および受容者と
ドナーの病歴、および異種抗原の薬物動態に従って特定
の用量設定および投与法は異なるものとなる。典型的に
は、異種抗原を１〜20日間にわたり約100mg/hrと1000mg
/hrの間の用量で連続的に投与する。同時に薬理学的免
疫抑制を行うのがよい。前に述べたように異種抗体の体
外除去を異種抗原の非経口投与と組合せて使用してもよ
い。

D.実施例以下の例は広い範囲のヒト抗−非ヒト哺乳動物抗体が
ブタ異種移植片の細胞上の炭水化物抗原に対するもので
あること、これら抗体のいくつかは異種移植片の細胞に
対して細胞毒性（溶血的）であること、そして単糖およ
び／またはオリゴ糖のいずれか一方、または両方の組合
せを投与すると、これら細胞溶解性の抗体を十分に中和
することを示している。

これらの例においては、以下に別に定義しない限り、
用いる略語は一般的に認められている意味である。

ELISA＝酵素連鎖免疫吸着アッセイ BSA＝ウシ血清アルブミン DMF＝ジメチルホルムアミド PBS＝燐酸緩衝生理食塩水＝7.8mM Na₂HPO₄,2.2mM KH₂
PO₄,154mM NaClおよび15mM NaN₃,pH7.1〜7.3 Gal＝ガラクトース Glc＝グルコース Man＝マンノース GlcNAc＝Ｎ−アセチルグルコサミン GalNAc＝Ｎ−アセチルガラクトサミン Fuc＝フコース Rha＝ラムノース FBS＝ウシ胎児血清 rpm＝１分間当りの回転数 cpm＝１分間当りのカウントＵ＝非吸着Ｐ＝Chromosorb Pによる吸着 LacNAc＝βGal（１−４）βGlcNAc−R,ここでＲは例３中のＲ＝−（CH₂）_８−CONH−SYNSORBまたは例４中のＲ＝−（CH₂）_８−COOCH₃ SYNSORB＝−（CH₂）_８−CONH−リンキングアームを通
じてChromosorb Pに結合した合成炭水化物構造図4Aおよび4B、５−７、8Aおよび8B、９、10、11A−
Ｄ、および12A−Ｄ中の参照数字は図１に示した化合物
の化学式を表している。

これらの例はいかなる仕方にせよ本発明の範囲を制限
しようとするものではない。

実施例１ヒト抗−哺乳動物抗体を結合する炭水化物化合物の同定ａ）ヒト抗−ブタ抗体の分離ヒト抗−ブタ抗体を精製するのに２つのブタの集団か
らの臓器を使用した。そのブタの系統はポーランドチャ
イナとヨークシャーである。抗体調製物は100−200mlの
ヒト血漿（ＯまたはAB）をブタ心臓、ブタ腎臓を通して
灌流するかまたはブタ赤血球ストローマでコートした固
状支持体を含むカラムを通すことによって得た。組織を
0.15M NaClで十分に洗滌してのち、残った抗体を200ml
の3M NaSCNを用いて組織またはカラムから溶出した。抗
体を濃縮し、ついで蛋白含量を測定した。

ｂ）炭水化物抗原炭水化物抗原はPinto and Bundle（1983）¹⁹および／
またはLemieux,Bundle,Baker（U.S.特許番号4,137,40
1）¹³により記載されているように、脂肪族リンキング
アーム（CH₂）₈COOCH₃をつけた合成オリゴ糖をBSAに共
有結合させることによりつくられた（BSAの分子当り10
〜20ハプテン）。以下の実施例５は、図１の炭水化物２
に適用したこの方法について述べている。用いた単糖お
よびオリゴ糖のいくつかのものについての構造と簡略し
た名称を図１に示してある。抗体結合を検出するための
合成炭水化物構造の使用については以前にU.S.特許4,13
7,401¹³に記載されている。

ｃ）酵素連鎖免疫吸着アッセイ（ELISA）抗−炭水化物抗体を検出するためのELISAアッセイに
用いる技術はいくつかの研究グループの仕事を組合せた
ものである。96の微小滴定プレート（Flow Laboratorie
s,Inc.,McLean Virginia,L.S.A.）中の井穴を１個当り
２μｇのBSA−複合糖質またはBSA（PBS中での希釈1ml当
り20μg BSA−抱合体）で室温16時間のインキュベーシ
ョンによってコートした。コート溶液を除去し、５％BS
Aを含む井穴当り200μのPBSを添加した。４時間のイ
ンキュベーション（22℃）ののち、井穴をPBSで２回洗
滌し、ついでH₂Oで１回洗った。プレートを逆にし、乾
燥させ、そのあと室温で保管した。

テストの直前に、１％BSA（１％BSA/PBS）を含むPBS2
00μを井穴の各々に加え環境温度で10〜20分間放置し
た。ヒト抗−ブタ製剤を１％BSA/PBSの1ml当り15〜70μ
ｇの間の溶出蛋白質にまで希釈した。BSA/PBSを除去し
希釈した抗−ブタ製剤100μを適当な井穴に添加し、
ついで16時間４℃でインキュベートした。抗体製剤を除
去し、ついで井穴をPBS（１回の洗滌当り200μ）で４
回洗滌した。Sigma Chemical Company（St.Louis,Misso
uri,U.S.A.）から入手したアルカリフォスファターゼ−
抱合試薬（抗−ヒト多価（α，γおよびμ鎖特異的）、
抗−ヒトIgG（γ鎖特異的）および抗−ヒトIgM（μ鎖特
異的）をそれぞれ１％BSA/PBS中1/500に希釈した。この
混合物の100μを各井穴に添加した。２時間後、井穴
をPBSで４回洗滌し、１％BSAと500μM MgCl₂を含む1Mの
ジエタノールアミン−HCl（pH9.8）1ml当り1.0mgのｐ−
ニトロフェニル燐酸塩を井穴当り100μ添加した。１
時間後、405nmでの光学密度（O.D.）をMicroplate Auto
reader（Model EL309,BIO−TEK Instruments,Winooski,
Vermont,U.S.A.）を用いて測定した。BSA−コート井穴
についてのO.D.値は各製剤についての複合糖質−BSA−
コート井穴についての値から差引いた。アッセイは二本
立てで実施した。アルカリフォスファターゼに抱合した
抗−ヒトイムノグリブリンはテストした構造のいずれに
も有意には結合しなかった。結果は表１に報告されてい
る。

多数の炭水化物構造体がブタ心臓、ブタ腎臓および
（または）ブタ赤血球ストローマから溶出した抗体と結
合した。これらの構造のいくつかを表１に示した。表１
にみられるように、Ｂ−様炭水化物分子（とくに線形Ｂ
型２および線形Ｂ型６）は、抗−ブタ心臓および抗−ブ
タ腎臓を含めて、テストした大部分の試料に関して最も
大きな活性を示した。

個々の溶出抗体製剤に関して、ＡまたはＡ−様炭水化
物（すなわちＡ二糖、Ａ三糖、種々のＡ四糖および線形
Ａ型６）;Forssman二糖およびForssman三糖；α−Ｌ−R
hamnoseおよびRhamnose−含有構造;N−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニド（βGlcNAc）およびβGlcNAc−含有
構造（表１）を含むその他の炭水化物抗原が抗体を結合
する。しかし、これらの抗原のすべてが全製剤に関して
有意な抗体量を結合するわけではない。

抗−炭水化物抗体の数は特別の組織および吸着する血
清に従って異なるが、抗−線形Ｂ型２、抗−線形Ｂ型６
および抗−Ｂ二糖抗体はテストした抗体の製剤のいずれ
にも存在した（表１）。ELISAアッセイに基づいて、こ
れら抗−線形Ｂ型２、抗−線形Ｂ型６および抗−Ｂ二糖
抗体は抗−ブタ炭水化物抗体の最も重要なグループのよ
うに思われる。

ブタ組織から分離され、そして／または特性化された
多くのＡまたはＡ−様糖脂質および糖蛋白に関してたく
さんの論文が発表されていることから、Ａ−関連構造と
結合できる抗体の存在が期待された。ＡおよびＯ表現型
がブタについて報告されており（Holgerssonら、199
0¹²）、またＯまたはＢ表現型をもつ抗−Ａがヒトの血
清および血漿中にかなりの濃度で見出された。合成Ａ構
造に結合できる抗体についてのO.D.測定値のいくつかは
期待したよりは低かった。たとえば、ヒトＯ血漿抗−ブ
タ腎臓（表１中の試料8A^O）に対して、ブタ赤血球とヒ
ト抗−Ａ血液型試薬との凝集の結果からブタはＡ−表現
型を有していたが、O.D.の測定値はＡ三糖、Ａ型４、Ａ
型５およびＡ型６に関して0.2以下であった。しかし、
ヒトＯ血漿抗−ブタ腎臓（表１中の試料7B^O）について
のO.D.測定値はＡ三酸、Ａ型４、Ａ型５およびＡ型６に
対して比較的高かった（O.D.＞1.0）。

ヒト抗−ブタ心臓製剤の大部分において最高の測定値
のいくつかがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
（βGlcNAc）、βGlcNAc（１−４）βGlcNAc、α−Ｌ−
Rhamnose（α−Ｌ−Rha）およびα−Ｌ−Rha（１−３）
βGlcNAc（１−２）α−Ｌ−Rha（表１）に対して得ら
れた。ある臓器にとってより重要な抗−炭水化物異種抗
体がある数だけ存在するかもしれない。

１つまたはそれ以上の製剤からのブタ心臓、ブタ腎臓
および／またはブタ赤血球ストローマ（１時間後の405n
mでの光学密度≧0.5）から溶出したヒト抗体のかなりの
量を結合した単糖およびオリゴ糖構造のいくつかを表１
に列挙した。

炭水化物構造にはいろいろのものがあって製剤ごとに
これらがかなり高い抗体結合能をもつように思われた
（405nmでのO.D.≧0.5）。ヒト血漿の型、個々の血漿、
それから抗体を溶出した個々の動物および／または臓器
のすべてが多様性をつくり出すように思われた。

本願中に示した知見はまだ研究されていない他の臓器
や細胞に適用されるであろう。本発明によって企画され
ている１つの特異な態様は膵臓島細胞異種移植に関連し
てそれを用いることである。

実施例２ブタ、ウシおよびヒツジ赤血球抗原に対するヒト溶血性
抗体の測定実施例２、３および４に関する血清および血漿の熱−不
活化別に記さない限り熱不活化ヒト血清または血漿を用い
た。補体を不活化するためにそれをウォーターバス中56
℃、30分間加熱した（熱−不活化）。

実施例２のための血清の調製：ヒトＯ型血清の一部（1.2ml）を0.4g±0.01gのChromo
sorb P（Manville Corp.,Denver,Colorado）,Chromosor
b Pに結合した合成炭水化物構造（以後これをChembiome
d Ltd.の商標であるSYNSORBと呼ぶ）、またはChromosor
b Pに結合した炭水化物構造の混合物（SYNSORBの混合
物）；そして0.3mlのPBSを含む試験管に移す。以下の実
施例６に、図１の化合物２に適用されたようなChromoso
rb Pへの炭水化物の共役の技法を記述する。試料を混合
し４℃で16時間インキュベートした。これらの調製物を
1000rpmで遠心し上清を採取した。

赤血球の調製；ブタ、ウシおよびヒツジの赤血球を過剰のPBSで３回
洗滌し（各洗滌ののち1000xgで１分間遠心を用いて）、
そのあとPBS中１％BSAで３回洗滌した。最終細胞ペレッ
トをPBS中１％BSA中で１％（v/v）に希釈した。

溶血アッセイ：ついでRapp and Borsos（1966）²¹に記載されている
アッセイに基づいて溶血アッセイを行なった。吸着およ
び非吸着血清試料をPBS中１％BSA中で1/4に希釈し、つ
ぎに50μを適当な井穴に添加した（図２結果）；また
は吸着および非吸着ヒト血清試料を希釈しないかあるい
はPBS中１％BSAで1/2または1/4に希釈し、ついで適当な
井穴に100μを添加した（図３結果）。ブタ赤血球の
１％懸濁液（図２）またはブタ、ヒツジまたはウシ赤血
球の２％懸濁液（図３）をＶ型96井穴微量滴定プレート
の適当な井穴に添加した。いくつかの対照井穴として50
μの赤血球懸濁液およびPBS中１％BSA50μまたは10
0μを含むものを調製した。22℃で１時間インキュベ
ート後、プレートをBeckman TJ−6 Centrifuge（Beckma
n Instruments,Inc.,Palo Alto,California（U.S.A.）
中1100rpmで５分間遠心した。1mlの冷たい、精製水1ml
で再構成した凍結乾燥LOWTOX−Ｍウサギ補体（Cedarlan
e Laboratories Ltd.,Hornby,Ontario,Canada）1mlを用
いて補体製剤を調製し、ついでゼラチンベロナール緩衝
液（Sigma Chemical Co.）で1/5に希釈した。上清を除
去し、つぎに希釈補体200μ、ゼラチンベロナール緩
衝液、または水を井穴に添加した。清潔なピペット先端
を用いて各井穴について試料を混合し、そのあと37℃で
１時間インキュベートした。プレートを2000rpmで３分
間遠心し、ついで150μの上清／井穴を平たい底のプ
レートに移してMicrolate Autoreader（Model EL309,BI
O−TEK Instruments,Winooski,Vermont,U.S.A.）を用
いて405nmでの光学密度（O.D.）を読み取った。

溶血百分率（％）を以下のものを基にして計算した:0
％溶血＝赤血球、PBS中１％BSAおよび補体を添加した井
穴からの平均O.D.（無血清）;100％溶血＝赤血球、非吸
着血清またはChromosorb Pで吸着した血清および補体を
添加した井穴からの平均O.D.）。

マトリックスに結合した特定の炭水化物構造およびマ
トリックス−結合炭水化物の組合せをヒト血清に吸着さ
せるとブタ、ヒツジおよびウシ赤血球の溶血が減少する
（図２および３）。

図２の試料に以下のSYNSORB−結合炭水化物を吸着さ
せた：線形Ｂ型６、Ａ三糖、Ｂ三糖およびβGlcNAcの組
合せ（１）；線形Ｂ型６およびβGlcNAcの組合せ
（２）；線形Ｂ型６およびＢ三糖の組合せ（３）；線形
Ｂ型６およびＡ三糖の組合せ（４）；βGlcNAc（５）；
線形Ｂ型２（６）；線形Ｂ型６（７）;B三糖（８）;A三
糖（９）;LacNAc（10）；およびChromosorb P単独（1
1）。図１にそれらの構造を示す。

図３の試料に以下のSYNSORB−結合炭水化物を吸着さ
せた：線形Ｂ型６、Ａ三糖、Ｂ三糖およびβGlcNAcの組
合せ（１）；線形Ｂ型６およびＢ三糖の組合せ（２）；
線形Ｂ型６およびβGlcNAcの組合せ（３）；線形Ｂ型６
およびＡ三糖の組合せ（４）；線形Ｂ型２（５）；βGB
lcNAc（６）；線形Ｂ型６（７）;B三糖（８）;A三糖
（９）;LacNAc（10）；およびChromosorb P単独（1
1）。

図３にみられるように、Ａ三糖−SYNSORBと線形Ｂ型
６−SYNSORBの組合せは線形Ｂ型６−SYNSORBまたはＡ三
糖別々の場合のいずれよりもブタおよびヒツジ赤血球に
対する溶血活性の低下についてより効果的であった。す
べての血清が抗−Ａ活性を有するわけではなく、種々の
血液型をもつ個体から得た抗体の特異性と濃度には多様
性がみられ、同じ血液型の個体間でもそれがみられた。
したがって細胞溶解性抗体の大半を低下させるためには
単糖および／またはオリゴ糖の組合せを用いることが必
要かもしれない。このことから人から人、種から種、そ
して臓器から臓器にわたる炭水化物構造が最良の組合せ
になると思われる。

実施例３ブタ抗原に対するヒト細胞毒性抗体のマトリックス−結
合炭水化物による除去本実験においては、標的細胞としてブタ赤血球、リン
パ球および粘着性のブタ腎臓細胞株（American Type Cu
lture Collection,Rockville,Maryland,U.S.A.Cat,＃
CRL1392−CL101からのLLC−PK₁）を使用した。赤血球お
よびリンパ球はFicoll−Paque（Pharmacia LKB Biotech
nology Inc.Piscataway,New Jersey,U.S.A:Cat.＃ 17
−0840−02）で全ヘパリン処理したブタ血液から分離し
た。ブタ腎臓細胞株は10％FBS（Hybri−Max from Sigma
Chemical Co.:Cat.＃ CPSR−３）を含むMedium 19（G
ibco BRL Canada,Barlington,Ontario,Canada）中で培
養した。これらの標的細胞の各々を37℃１時間のインキ
ュベーションによりクロミウム−51（Amersham,Oakvill
e,Ontario,Canada:Cat.＃ CJS.11）で標識した（クロ
ミウム100μ（100μCi）で10⁶個細胞）。細胞を培地
で１回洗滌し、37℃で１時間インキュベートし、ついで
取り込まれなかったクロミウムを除去するために２回洗
滌した。

非希釈熱−不活化血漿（100μ）を96井穴Ｖ底微小
滴定プレート（Dynatech Lab.,Chantilly,Virginia,U.
S.A.:Cat.＃１−220−25X）中37℃で１時間振とう（2
0rpm）しながら100μのクロミウム−標識標的細胞
（２×10⁴細胞）とインキュベートした。各井穴に1/15
に希釈したウサギ補体（LOWTOX−M from Cedarlane Lab
oratories Ltd.,Hornby,Ontario,Canada:Cat.＃ CL305
1）を添加した。プレートを再度37℃で１時間振とうし
ながらインキュベートした。ついでプレートを1000rpm
で回転し上清についてそのクロミウム含量をBeckman γ
4000カウンター（Beckman Instruments,Inc.,Fullerto
n,California,U.S.A.）でカウントした。天然および全
遊離対照も実施した。天然カウントは常に全カウントの
５％以下であり、細胞の典型的な全カウントは10,000か
ら20,000の範囲にあった。

図4Aおよび4Bに示した結果からわかるように、非吸着
ヒトＯおよびAB血漿はクロミウム標識ブタリンパ球、赤
血球およびブタ腎臓細胞株を溶解させることができる抗
体を含有している。これらの血漿試料を心臓を通して灌
流すると細胞毒性活性が低下したが（図4Aおよび4B）こ
れはおそらく細胞毒性抗体がブタ組織に結合するためと
思われる。移植する際に、これら抗体の結合が超急性拒
絶を起こす可能性がある。

SYNSORB上に共役した炭水化物（Ａ三糖、Ｂ三糖、Lac
NAc（βGal（１−４）βGlcNAc−Ｒ）、線形Ｂ型２およ
び線形Ｂ型６）のヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を除去する
能力をしらべるために、血漿1mlを0.2gの異なるSYNSORB
と４℃で一夜吸着させた。ついで吸着血漿をクロミウム
放出アッセイでテストした。これらの例ではＡ三糖−SY
NSORB,B三糖−SYNSORB,Lac−NAc−SYNSORおよびChromos
orb Pはほとんどなんの効果も示さなかった（図4Aおよ
び4B）。線形Ｂ型２−SYNSORBおよび線形Ｂ型６−SYNSO
RBは細胞毒性活性を有意に低下させた。これらの結果は
明らかにSYNSORBに結合した線形Ｂ型２または線形Ｂ型
６がヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を結合するのに効果的で
あることを示している。

以下の実験は、使用した血漿が熱不活化でないことを
除いて、上に述べた実験方法を用いて実施した。前に述
べたように、ウサギ補体を各井穴に添加した。

ヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を除去するためにヒト血漿
（A,B,OおよびAB）試料をマトリックス−結合炭水化物
（SYNSORB）で吸着させた（用いた炭水化物化合物の構
造については図１を参照）。吸着血漿はクロミウム放出
アッセイでテストした。これらの結果を図５に示した
が、明らかにＢ二糖（図１の式４）および線形Ｂ型６
（図１の式２）SYNSORBSはすべてのヒト血液型における
細胞毒性活性を有意に低下させることを示している。

ヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を除去するために４つの異
なるABヒト血漿型をマトリックス−結合炭水化物（SYNS
ORBS）で吸着させた（用いた炭水化物化合物の構造につ
いては図１を参照）。吸着血漿をクロミウム放出アッセ
イでテストした。結果を図６に示す。Ｂ二糖および線形
Ｂ型SYNSORBSは１つの特定のAB血漿（1808035）中の細
胞毒性活性を有意に低下させた。他の血漿試料（190142
2）では、これらのSYNSORBSは細胞毒性活性をごく僅か
低下させた。試料1809451では、線形Ｂ型SYNSORBは細胞
毒性活性を低下させたが、Ｂ二糖SYNSORBSは低下させな
かった。試料7708213については、Ｂ二糖SYNSORBも線形
Ｂ型6SYNSORBもいずれも細胞毒性活性を有意に減少させ
なかった。この例は集団中の不均質性を示すものであ
る：というのはある血漿中で見出された細胞毒性抗体は
明らかにαGal（１−３）βGal（１−４）βGlc構造を
必要とするのに対して、Ｂ二糖（αGal（１−３）βGa
l）の線形Ｂバックボーンは他の血漿中の細胞毒性抗体
を吸着するのに十分だからである。

ヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を除去するためにヒト血漿
（A,B,O,およびAB）試料をマトリックス−結合炭水化物
（SYNSORBS）で吸着させた。（用いた炭水化物化合物の
構造については図１参照）。吸着血漿をクロミウム放出
アッセイでテストした。結果を図７に示す。線形Ｂ型６
および線形Ｂ型１（図１の式３）SYNSORBはヒト血漿試
料中の細胞毒性活性を有意に低下させた。Ｐ−Ｋ三糖
（図１の式37）SYNSORBはテストしたAB型およびＢヒト
血漿中の細胞毒性活性を僅かに低下させた。Ｐ−１三糖
（図１中の式40）SYNSORBはこのＡ型ヒト血漿中の細胞
毒性活性を僅かに低下させた。Ｐ−ＫおよびＰ−１三糖
SYNSORBSはこのＯ型ヒト血漿中の細胞毒性活性を低下さ
せなかった。これらの結果は、線形Ｂ構造は細胞毒性抗
体に特異的であるが、他の炭水化物は他の抗体特異性を
除去またはブロックするかもしれないことを示してい
る。

実施例４ブタ抗原に対するヒト細胞毒性抗体の炭水化物ハプテン
による除去ヒトの前成細胞毒性抗体を炭水化物ハプテンによって
阻害する可能性をしらべるためにこの方法を行った。ヒ
トの熱不活化血漿（1ml）を0.215gのＡ−三糖−Ｘ−Y,B
−三糖−Ｘ−Y,βGlcNAc−Ｘ−Y,LacNAc−Ｘ−Y,線形Ｂ
型２−Ｘ−Y,または線形Ｂ型６−Ｘ−Ｙ（Ｘ−Ｙ＝−Ｏ
−（CH₂）_８−COOCH₃または−Ｏ−（CH₂）_８−COOCH₂CH
₃で、図１におけるように、Chembiomed,Ltd.の商標であ
るSYNJECTとして引用されている）と４℃で一夜インキ
ュベートした。ついで処置および非処置血漿についてク
ロミウム放出アッセイを実施した；ブタ腎臓細胞株（LL
C−PK₁）を標的細胞として使用した。図8Aおよび8Bに図
示したように、線形Ｂ型２−Ｘ−Ｙおよび線形Ｂ型６−
Ｘ−Ｙはブタ細胞株に対する抗体の細胞毒性作用を完全
に阻害した。他のハプテンはこれら細胞毒性抗体を部分
的に阻害した（すなわち、Ｂ三糖）。これらの結果は、
可溶性炭水化物ハプテン（SYNJECT型）が前成ヒト抗−
炭水化物抗体のin situ阻害に関して有効かもしれない
ことを示している。

使用した血漿が熱不活化したものでないことを除い
て、上述の実験方法を用いて以下の実験を行なった。上
述の実施例３のように、各井穴にウサギ補体を添加し
た。

ヒト血漿（A,B,OおよびAB）試料を炭水化物ハプテン
とインキュベートしてヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を不活
化した（用いた炭水化物化合物の構造については図１参
照）。インキュベートした血漿をクロミウム放出アッセ
イでテストした。結果を図９に示す。Ｂ二糖および線形
Ｂ型６ハプテンはすべての血液型における細胞毒性活性
を低下させた。

ヒト抗−ブタ細胞毒性抗体を除去するために２つの異
なるABヒト血漿型を炭水化物ハプテンとインキュベート
した（用いた炭水化物化合物の構造については図１参
照）。インキュベートした血漿をクロミウム放出アッセ
イでテストした。結果を図10に示す。Ｂ二糖ハプテンだ
けが両血漿型における細胞毒性活性を僅かに低下させ
た。線形Ｂ型６およびＢ型６ハプテンはそれぞれ１つの
血漿型の細胞毒性活性を低下させたが、他の血漿につい
ては低下させなかった。この例はさらに集団中の不均質
性を証明するものである。

実施例５（αGal（１−３）βGal（１−４）βGlc−Ｏ−（CH₂）
₈CONH）₁₇−BSAの調製図１中の化合物２のメチルエステル型（αGal（１−
３）βGal（１−４）βGlc−Ｏ−（CH₂）₈COOCH₃）の60
mgを1.5mlのヒドラジン水和物中に溶解した。２時間
後、ヒドラジン水和物を高真空中で除去し残渣を水と共
−蒸発させ、ついで水和物をC18逆相カラム（Waters Ch
romatography Division,Millipore Corp.,Milford MA,
U.S.A.）上で精製しその後凍結−乾燥した。合成ハプテ
ン水和物19mgを0.2mlの乾燥アミンなしのDMF中に溶かし
不活性大気下−20℃で冷却した。ジオキサン中3.6MのHC
l溶液（31μｌ）と第三ブチル亜硝酸塩5.3μｌ（45μmo
les）を添加し、その溶液を20℃で30分間攪拌した。DMF
中のスルファミン酸（1.4mg）を添加してさらに15分間
攪拌した。このアシルアジド溶液を直接（水中0.2MのＮ
−チオールジエタノールアミン3ml中30mgのBSA、pH8.9
8、０〜４℃）の溶液に添加した。４℃で16時間後、そ
の溶液を水に対して透析し、ついで凍結−乾燥した。白
色粉末36mgが回収された。ハプテンの取り込みはフェノ
ール−硫酸法（Duboisら1956⁵）によって測定しBSA1モ
ル当りハプテン17モルと計算された。

この調製物を抗−線形Ｂ型６抗体を検出するために実
施例１で使用した。

実施例６効果的な免疫吸着剤（αGal（１−３）βGal（１−４）
βGlc−Ｏ−（CH₂）₈CONH）−SYNSORBの調製図１の化合物２の水和物型40mgを実施例５で述べたよ
うにして調製して0.3mlDMF中に溶解した。この溶液を不
活性大気下−20℃で冷却した。ジオキサン中HClの3.6M
溶液（62μｌ）と第三ブチル亜硝酸塩11μｌ（90μmole
s）を添加し、その溶液を30分間攪拌した。Hunigs塩基
（Aldrich Chemical Co.,Inc.,Milwaukee,Wisconsin U.
S.A.から入手のN,N−ジイソプロピルエチルアミン:Cat.
＃D12.580.6）（45μｌまたは258μmoles）を添加して
さらに２分間攪拌した。このアシルアジド溶液をアセト
ニトリル（150ml）中４℃でシリルアミノ化してか焼し
た珪藻土（Manville Corp.,Denver,Colorado）のスラリ
ーに直接添加した。（シリルアミノ化はWeetall（197
6）²⁴により記載されたプロトコールを用いて実施し
た）。４℃で２時間さらに室温で２時間攪拌してのち、
固状物を濾過で採取し、メタノール中５％の無水醋酸を
用いて未反応アミンをＮ−アセチル化し、静かに１時間
攪拌し、ついで室温で一夜インキュベートした。そのあ
とメタノールとエチルエーテルを用いて固状部分を洗滌
し、ついで風乾した。ハプテンの取り込みをフェノール
−硫酸法を用いて測定しマトリックス1g当りハプテン0.
87μmolesと決められた。

この調製物を抗−線形Ｂ型６抗体を除去するために実
施例２および３で使用した。

実施例７マトリックス−結合炭水化物での血漿吸着による炭水化
物化合物に対するヒト抗体力価低下の酵素−連鎖免疫吸
着アッセイ（ELISA）による検出平板底の96井穴免疫−プレート（Gibco−BRL,Burling
ton,Ontario,Canada）を10μg/ml BSAまたは0.05M炭酸
塩−重炭酸塩コーティング緩衝液（Sigma Chemical C
o.）、pH9.6中で希釈した炭水化物−BSA抱合体の100μl
/井穴でコートした。プレートを４℃で18時間インキュ
ベートし、ついで空にして、室温で１時間PBS中１％BSA
（Sigma）の150μl/井穴でブロックした。つぎに0.05％
ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウリン酸塩（tw
een 20;Sigma）を含むPBSで３回洗滌した。

血液型A,B,AB,およびＯからのヒト血漿の、非吸着ま
たはChromosorb P、Ｂ二糖SYNSORB、または線形Ｂ型6SY
NSORBで吸着したもののいずれかをPBS−tween 20で1:10
0に希釈し、炭水化物−BSAコート井穴上のBSA対照に三
つに分けて割りつけた。室温で２時間インキュベーショ
ンとPBS−tween 20で３回洗滌ののち、すべての井穴に
対してPBS−tween 20中1:350に希釈したヤギ抗−ヒト多
価（α、γ、およびμ鎖特異的）−アルカリ性フォスフ
ェート抱合体（Sigma）を100μｌづつ添加した。もう一
度プレートを室温で２時間インキュベートしてのちPBS
−tween 20で３回洗滌した。10％（v/v）ジエタノール
アミン緩衝液、9.8（Fisher Scientific）中1mg/mlに希
釈し、0.01％（w/v）塩化マグネシウム（Fisher Scient
ific）を含むジソジウムＰ−ニトロフェニルフォスフェ
ート（Sigma）100μｌを各井穴に添加した。イウノプレ
ートを室温で30分間暗所でインキュベートした。Titert
ek Multiskan（Flow Laboratories,McLean,Virginia）
を用いて各井穴に関して405nmでの吸収を読み取った。B
SAのみでコートした井穴に対する血漿の非−特異的結合
の測定値を図11A−Ｄおよび12A−Ｄ中に示した値から差
引いた。

SYNSORBで吸着したヒトA,B,O,およびAB血漿をハプテ
ン−BSA抱合体のパネルに対してテストした。用いた炭
水化物化合物の構造については図１を参照のこと。図11
A−Ｄに示したように、Ｂ二糖または線形Ｂ型6SYNSORBS
で吸着した血漿は、非吸着血漿またはChromosorb Pで吸
着した血漿と比較した場合Ｂ二糖、線形Ｂ型６および線
形Ｂ型2BSA抱合体に対する結合が顕著に減少している。
これらのSYNSORBSはＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニド（図１の式25）およびα−Ｌ−ラムノース（図１の
式31）BSA抱合体への結合を減少させなかった。これら
の結果からＢ二糖および線形Ｂ型6SYNSORBSが血漿から
特異的抗体を除去または減少させることができることが
証明された。

SYNSORBSで吸着したヒト血漿をハプテン−BSA抱合体
のパネルに対してテストした。用いた炭水化物化合物の
構造については図１参照。図12A−Ｄに示すように、Ｂ
二糖または線形Ｂ型6SYNSORBSで吸着した血漿は、非吸
着血漿またはChromosorb Pで吸着した血漿と比較した場
合、Ｂ二糖、線形Ｂ型６および線形Ｂ型2BSA抱合体に対
する結合が減少しているのがわかる。これらのSYNSORBS
は他のハプテン−BSA抱合体に対する結合を減少させな
かった。これらの結果はＢ二糖および線形Ｂ型6SYNSORB
Sは血漿から特異的抗体を除去または減少させることが
できたことを示している。

上に述べた態様の修飾で、移植免疫学、炭水化物化学
分野、および関連諸分野における技量の修飾であること
が明らかなものは以下の特許請求の範囲内にあるものと
みなされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 インテグリスバプティストメディカルセンター，インコーポレイテッドアメリカ合衆国73112−4481オクラホマ州，オクラホマシティ，ノースウエストエクスプレスウエー 3300 (72)発明者グッド，エイ．ヒーサーカナダ国ティー６エル１エム６アルバータ，エドモントン，シックスティーセカンドストリート 1808 (72)発明者クーパー，デビッド，ケイ．シー. アメリカ合衆国73112 オクラホマ州オクラホマシティ，ノースウエストエクスプレスウエイ 3118 (72)発明者マルコム，アンドリュー，ジェイ. カナダ国ティー６エル６ケイ２アルバータ，エドモントン，ミルウッズロードイースト 1825 (56)参考文献米国特許4238473（ＵＳ，Ａ) ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪｏｕｒｎａｌ；ｖｏｌ．７，ｐｐ85−100 （1990) ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ；，ｖｏｌ．127，ｐｐ．15− 25，（1984) Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ；ｖｏｌ. 21，Ｎｏ．３，ｐｐ335−342，（1981)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体−仲介異種移植拒絶に関与する異種移
植片の少なくとも１種の炭水化物抗原の調製物を含む，
ヒト受容体（ヒトレシピエント）における異種移植片の
異種移植拒絶を弱めるための組成物であって，上記抗原
は以下に示す式で表わされるグリコシドからなる群から
選択され，かつ同抗原は上記異種移植片の少なくとも１
種の炭水化物抗原に対して前もって形成された少なくと
も１種の抗体と結合する，組成物：上記式中,Rは酸素，硫黄，−NH−または結合を表わし，
そしてＹは水素またはアグリコン基を表す．
【請求項２】ＸはO,S,NHおよび結合からなる群より選択
され,Yはアグリコン基である請求項１に記載の組成物．
【請求項３】Ｙは，基−（Ａ）−Ｚ［式中,Aは結合,2〜
10個の炭素原子を有するアルキレン基または−（CH₂−C
R₁−Ｇ）_ｎ−（ｎは１〜５の整数であり,R₁は水素，メ
チルおよびエチルからなる群より選択され,Gは水素，酸
素，硫黄，窒素，フェニル，およびアミン，ヒドロキシ
ル，ハロ，および１〜４個の炭素原子を有するアルキル
からなる群より選択される１〜３個の置換基で置換され
たフェニルからなる群より選択される）を表わし，そし
てＺは水素，メチルからなる群より選択され，またＧが
酸素，硫黄または窒素ではなく，かつＡが結合ではない
場合には,ZはまたOH,SH,−NH₂,−NHR₂,−Ｃ（Ｏ）OR₂,
−Ｃ（Ｏ）NH₂,−Ｃ（Ｏ）NHR₂および−Ｃ（Ｏ）Ｎ
（R₂）_２（式中,R₂はそれぞれ独立に水素または１〜４
個の炭素原子を有するアルキルである）からなる群より
選択される］を表す請求項２に記載の組成物．
【請求項４】ＸはＯであり,Yは−Ａ−Ｚ（式中,Aは２〜
10個の炭素原子を有するアルキレン基であり,Zは−Ｃ
（Ｏ）OR₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR₂（式中,
R₂は水素または１〜４個の炭素原子を有するアルキルで
ある）からなる群より選択される請求項２に記載の組成
物．
【請求項５】抗原は式1,2または４のグリコシドであり,
Xは−Ｏ−であり,Yは−Ａ−Ｚ（式中,Aは２〜10個の炭
素原子を有するアルキレン基であり,Zは−Ｃ（Ｏ）OR₂,
−Ｃ（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR₂（式中,R₂は水素ま
たは１〜４個の炭素原子を有するアルキルである）から
なる群より選択される請求項１に記載の組成物．
【請求項６】異種移植片のヒト受容体（ヒトレシピエン
ト）の血液から抗体を除去し，ヒト受容体による異種移
植片の拒絶を弱めるための免疫吸着組成物であって，前
もって形成された抗体に対して同定された少なくとも１
種の抗原を適合性のリンカーアームを介して付着させた
生体適合性の固体支持体からなり，上記抗原は以下に示
す式で表わされるグリコシドからなる群から選択され，
かつ同抗原は異種移植拒絶に関与する前もって形成され
た抗体に結合し，そして同抗体を除去する組成物：上記式中,Xは酸素，硫黄，−NH−または結合を表わし，
そしてＹは水素またはアグリコン基を表わす．
【請求項７】抗原は式3,26,31および32の少なくとも１
種のグリコシドからなり,XはO,S,NHおよび結合からなる
群より選択され,Yはアグリコン基である請求項６に記載
の組成物．
【請求項８】Ｙは，基−（Ａ）−Ｚ［式中,Aは結合,2〜
10個の炭素原子を有するアルキレン基または−（CH₂−C
R₁−Ｇ）_ｎ−（ｎは１〜５の整数であり,R₁は水素，メ
チルおよびエチルからなる群より選択され,Gは水素，酸
素，硫黄，窒素，フェニルならびにアミン，ヒドロキシ
ル，ハロおよび１〜４個の炭素原子を有するアルキルか
らなる群より選択される１〜３個の置換基で置換された
フェニルからなる群より選択される）を表わし，そして
Ｚは水素，メチルからなる群より選択され，またＧが酸
素，硫黄または窒素ではなく，かつＡが結合ではない場
合には,ZはまたOH,SH,−NH₂,−NHR₂,−Ｃ（Ｏ）OR₂,−
Ｃ（Ｏ）NH₂,−Ｃ（Ｏ）NHNHR₂,−Ｃ（Ｏ）NHR₂および
−Ｃ（Ｏ）Ｎ（R₂）_２（式中,R₂はそれぞれ独立に水素
または１〜４個の炭素原子を有するアルキルである）か
らなる群より選択される］を表す請求項７に記載の組成
物．
【請求項９】Ｘは−Ｏ−であり,Yは−Ａ−Ｚ（式中,Aは
２〜10個の炭素原子を有するアルキレン基であり,Zは−
Ｃ（Ｏ）OR₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR₂（式
中,R₂は水素または１〜４個の炭素原子を有するアルキ
ルである）からなる群より選択される請求項７に記載の
組成物．
【請求項１０】抗原は式1,2または４のグリコシドであ
り,Xは−Ｏ−であり,Yは−Ａ−Ｚ（式中,Aは２〜10個の
炭素原子を有するアルキレン基であり,Zは−Ｃ（Ｏ）OR
₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR₂（式中,R₂は水素
または１〜４個の炭素原子を有するアルキルである）か
らなる群より選択される請求項６に記載の組成物．
【請求項１１】異種移植拒絶を弱めるためのヒト血液ま
たは血漿組成物であって，同組成物は以下に示す式で表
わされるグリコシドからなる群から選択される少なくと
も１種の同定された抗原に対する前もって形成された抗
体が排除されていて，同血液または血漿から除去された
前もって形成された抗体は異種移植拒絶に関与するもの
である組成物：上記式中,Xは酸素，硫黄，−NH−または結合を表わし，
そしてＹは水素またはアグリコン基を表わす．
【請求項１２】抗原は式3,26,31および32の少なくとも
１種のグリコシドからなり,XはO,S,NHおよび結合からな
る群より選択され,Yはアグリコン基である請求項11に記
載の組成物．
【請求項１３】Ｙは，基−（Ａ）−Ｚ［式中,Aは結合,2
〜10個の炭素原子を有するアルキレン基または−（CH₂
−CR₁−Ｇ）_ｎ−（ｎは１〜５の整数であり,R₁は水素，
メチルおよびエチルからなる群より選択され,Gは水素，
酸素，硫黄，窒素，フェニルならびにアミン，ヒドロキ
シル，ハロおよび１〜４個の炭素原子を有するアルキル
からなる群より選択される１〜３個の置換基で置換され
たフェニルからなる群より選択される）を表わし，そし
てＺは水素，メチルからなる群より選択され，またＧが
酸素，硫黄または窒素ではなくかつＡが結合ではない場
合には,Zは，またOH,SH,−NH₂,−NHR₂,−Ｃ（Ｏ）OR₂,
−Ｃ（Ｏ）NH₂,−Ｃ（Ｏ）NHR₂および−Ｃ（Ｏ）Ｎ
（R₂）_２（式中,R₂はそれぞれ独立に水素または１〜４
個の炭素原子を有するアルキルである）からなる群より
選択される］を表す請求項12に記載の組成物．
【請求項１４】Ｘは−Ｏ−であり,Yは−Ａ−Ｚ（式中,A
は２〜10個の炭素原子を有するアルキレン基であり,Zは
−Ｃ（Ｏ）OR₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR
₂（式中,R₂は水素または１〜４個の炭素原子を有するア
ルキルである）からなる群より選択される請求項12に記
載の組成物．
【請求項１５】抗原は式1,2または４のグリコシドであ
り,Xは−Ｏ−であり,Yは−Ａ−Ｚ（式中,Aは２〜10個の
炭素原子を有するアルキレン基であり,Zは−Ｃ（Ｏ）OR
₂,−Ｃ（Ｏ）NH₂および−Ｃ（Ｏ）NHR₂（式中,R₂は水素
または１〜４個の炭素原子を有するアルキルである）か
らなる群より選択される請求項11に記載の組成物．