JP3175796B2 - 新規ピロリドンポリカルボン酸化合物及びその検出方法、並びに腸炎ビブリオの検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規のピロリドンポリ
カルボン酸化合物、及びそのピロリドンポリカルボン酸
化合物の検出方法、並びに腸炎ビブリオの検出方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】鉄は、ほとんど全ての生物において増殖
に必須な元素であり、外界から摂取することが必要な成
分である。細菌性食中毒の原因となる腸炎ビブリオ（ビ
ブリオパラヘモリティクス；Vibrio parahaemolyticus
）も、鉄の制限下で培養すると、増殖が極度に抑制さ
れる。鉄は自然環境のｐＨ（中性〜弱アルカリ性）で水
不溶性のポリマーを形成しているので、細菌がこれをそ
のまま利用することはできない。また、細菌の宿主であ
るヒトや家畜などの体内では、遊離鉄濃度が１０^-15 Ｍ
程度の極めて低いレベルに保たれている。これは、細菌
感染に対する生体の防御機構の一つである。従って、鉄
を生体から効率よく獲得するなんらかの手段を有してい
る細菌が、病原菌となり得る。実際に、三価鉄キレータ
ーを自ら産生して分泌し、菌体外でそのキレーターによ
って三価鉄を取り込んだ鉄キレート化合物を生成させ、
一方、それと同時に鉄キレート化合物に特異的に結合す
る外膜タンパク質を発現し、その外膜タンパク質を介し
て鉄を獲得する系が多数の病原菌で知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】腸炎ビブリオは、我が
国の細菌性食中毒において最も頻度高く分離される病原
菌である。しかし、この菌がどのような方法で鉄を獲得
しているかは、従来、まったく明らかにされていなかっ
た。本発明者らは、腸炎ビブリオを鉄制限下で培養する
と、鉄を取り込むキレーターを産生、分泌することを見
出した。そして、この化合物を単離、精製して、構造決
定したところ、新規化合物であることを見出した。本発
明は、こうした知見に基づくものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（１）

【化４】 で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物（以下、本
発明ピロリドンポリカルボン酸化合物と略称することが
ある）に関する。

【０００５】また、本発明は、式（１）

【化５】 で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物と担体との
結合体を免疫原として調製した抗体を用いることを特徴
とする、前記式（１）で表されるピロリドンポリカルボ
ン酸化合物の検出方法に関する。

【０００６】更に、本発明は、式（１）

【化６】 で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物と三価鉄イ
オンとからなり、標識を付したキレート化合物を用いる
ことを特徴とする、腸炎ビブリオ（ビブリオ パラヘモ
リティクス；Vibrio parahaemolyticus ）の検出方法に
関する。

【０００７】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物
は、ピロリドリン環の４位炭素原子に置換した水酸基
（又はカルボキシル基）の立体配置に関して２つの異性
体（α異性体及びβ異性体）が存在し、更に不斉炭素に
基づいて光学異性体が存在する。従って、本発明ピロリ
ドンポリカルボン酸化合物は、これらの異性体のそれぞ
れ分離されたもの及びそれらの混合物を包含する。

【０００８】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物
は、例えば、ビブリオ属（Vibrio）中の腸炎ビブリオ
（ビブリオ パラヘモリティクス；V. parahaemolyticu
s ）を鉄欠乏条件下に培養して産生させ、単離し、精製
することによって調製することができる。前記のビブリ
オ属中の腸炎ビブリオを、常温（例えば、３０〜３７
℃）にて、２０〜２４時間、炭素源としてコハク酸など
を用い、１〜３％食塩存在下で、鉄欠乏条件下（０．２
５〜０．５μＭ−ＦｅＣｌ₃ 存在下）にて、液体培地で
振とう培養すると、細菌が本発明ピロリドンポリカルボ
ン酸化合物を産生して培養液中に分泌する。

【０００９】続いて、培養液を遠心処理して上清を取
り、この上清から各種のクロマトグラフィーの手法を使
って分離、精製することができる。例えば、前記の培養
上清を陰イオン交換樹脂（塩基性樹脂）で処理すると、
本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物が樹脂に吸着す
る。その樹脂を有機酸（例えば、ギ酸）に浸すと、本発
明ピロリドンポリカルボン酸化合物が溶離する。溶離液
を減圧下で濃縮乾固してから少量の水に溶かし、この溶
液をゲル濾過カラムに乗せ、水で溶出し、活性分画を得
る。更に、この活性成分を減圧濃縮し、濃縮液を再び有
機溶媒を利用できるタイプのゲル濾過カラムに乗せ、水
／低級アルコール〔例えば、水／メタノール（９：１，
ｖ／ｖ）〕で溶出する。得られた活性分画を陽イオン交
換樹脂（酸性樹脂）に通し、脱塩すると遊離体のピロリ
ドンポリカルボン酸化合物が得られる。これらのカラム
クロマトグラフィーによる単離、精製操作を、必要に応
じて、反覆して実施することができる。

【００１０】なお、本発明ピロリドンポリカルボン酸化
合物は、水溶液中で三価鉄を取り込み、キレート化合物
を形成することができる。従って、この鉄キレート化合
物を鉄制限状態の腸炎ビブリオが取り込んで増殖するこ
とを指標として、前記の活性成分の分離を行うことがで
きる。更に、本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物
は、化学的に合成して調製することもできる。

【００１１】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物
は、水溶液中で三価鉄を取り込み、キレート化合物を形
成することができるので、鉄キレーターとして用いるこ
とができる。また、本発明ピロリドンポリカルボン酸化
合物は腸炎ビブリオの外膜リセプターと結合することが
できるので、適当な信号を発する化合物、例えば放射性
同位元素（例えば、⁵⁵Ｆｅ又は⁵⁹Ｆｅ）を用いてキレー
ト化合物を形成させると、腸炎ビブリオ検出のマーカー
として用いることができる。更に、放射性同位元素（³²
Ｐ、³⁵Ｓ又は ³Ｈ等）、酵素（ペルオキシダーゼ又はア
ルカリホスファターゼ等）、ビタミン（ビオチン等）、
蛍光物質（ＦＩＴＣ等）又は化学発光物質（アクリジニ
ウム等）をピロリドンポリカルボン酸に標識することに
より、腸炎ビブリオ検出のマーカーとして用いることが
できる。従って、本発明は、前記式（１）で表されるピ
ロリドンポリカルボン酸化合物と三価鉄イオンとからな
り、標識を付したキレート化合物を用いることを特徴と
する、腸炎ビブリオの検出方法にも関する。

【００１２】本発明による腸炎ビブリオ検出方法におい
て、被検試料としては、腸炎ビブリオを含む可能性のあ
るものなら制限されないが、特には、食品、生体試料
（例えば、血液、血清、血漿、尿、糞便、腸管内容物）
を挙げることができる。これらの食品又は生体試料など
をそのまま、或いはリン酸緩衝生理食塩水等の適当な緩
衝液で抽出するか、更には必要に応じて鉄欠乏条件下に
て培養等の処理を行い、被検試料液を調製することがで
きる。

【００１３】また、本発明ピロリドンポリカルボン酸化
合物をハプテンとし、適当な担体と組み合わせて抗体
（例えば、抗血清又はモノクローナル抗体）を調製する
ことができるので、これらの抗体を用いて、被検試料中
のピロリドンポリカルボン酸化合物を免疫学的に検出す
ることもできる。更に、酵素標識した二次抗体及びピロ
リドンポリカルボン酸化合物を利用すると、腸炎ビブリ
オ検出のマーカーとしてもハプテン抗体を用いることが
できる。従って、本発明は、前記式（１）で表されるピ
ロリドンポリカルボン酸化合物と担体との結合体を免疫
源として調製した抗体を用いることを特徴とする、前記
式（１）で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物の
免疫学的検出方法にも関する。

【００１４】抗体調製に用いる担体としては、生体高分
子（免疫グロブリン又はアルブミン等）や、金属コロイ
ド（金コロイド等）を挙げることができる。本発明ピロ
リドンポリカルボン酸化合物と担体との結合体は、例え
ば、従来公知の化学結合法又は電気的結合により調製す
ることができる。前記の結合体で、哺乳動物（例えば、
マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマ）を免疫し、抗
血清を調製することができる。或いは、前記の結合体で
免疫した哺乳動物の脾臓から取り出した脾臓細胞を用い
て、モノクローナル抗体を調製することもできる。

【００１５】本発明によるピロリドンポリカルボン酸化
合物の検出方法においても、被検試料としては、前記式
（１）で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物を含
む可能性のあるものなら制限されないが、特には、食
品、生体試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、糞便、
腸管内容物）を挙げることができる。

【００１６】本発明によるピロリドンポリカルボン酸化
合物検出方法は、ピロリドンポリカルボン酸化合物に特
異性を示す抗体を用いることを除けば、それ以外の点で
は従来公知の免疫学的検出法にそのまま適用することが
できる。具体的には、例えば、 （１）試料をそのまま、或いはリン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．４）等の適当な緩衝液で抽出、更には必要に
応じて鉄欠乏条件下にて培養等の処理を行い、被検試料
液を調製する工程、 （２）ピロリドンポリカルボン酸化合物に特異性を有す
る抗体と、前記被検試料液とを接触させる工程、 （３）標識を有する既知量のピロリドンポリカルボン酸
化合物を前記工程（２）と同時又は前記工程（２）の終
了後に前記抗体と接触させる工程、 （４）前記抗体と結合した標識化ピロリドンポリカルボ
ン酸化合物と、前記抗体と結合していない標識化ピロリ
ドンポリカルボン酸化合物とを分離する工程、 （５）前記工程（４）で分離したいずれか一方の標識化
ピロリドンポリカルボン酸化合物が有する標識からの信
号を検出する工程を含む、試料中のピロリドンポリカル
ボン酸化合物の検出方法（競合法及び非競合法）からな
る。更に、本発明方法の具体的態様としては、例えば （１）試料をそのまま、或いはリン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．４）等の適当な緩衝液で抽出、更には必要に
応じて鉄欠乏条件下にて培養等の処理を行い、被検試料
液を調製する工程、 （２）ピロリドンポリカルボン酸化合物に特異性を有す
る第１抗体を、不溶性担体に固定させる工程、 （３）前記被検試料液を前記工程（２）の固定化第１抗
体に接触させる工程、 （４）前記ピロリドンポリカルボン酸化合物に対して、
前記第１抗体とは異なる部位で結合すると共に標識を有
する第２抗体を過剰量で添加する工程、 （５）第１抗体とピロリドンポリカルボン酸化合物との
複合体上の標識の信号を検出する工程を含む、試料中の
ピロリドンポリカルボン酸化合物の検出方法（サンドイ
ッチ法）を含む。本発明は、その他公知の免疫反応検出
方法に広く応用することができる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。以下の実施例記載の菌株の表示において、ＡＴＣＣ
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）、ＲＩＭＤは、
大阪大学微生物研究所（Research Institute for Micro
bial Diseases ）、ＡＱは大阪空港検疫所（Osaka Airp
ort Quarantine）（菌株は大阪大学微生物研究所に保
存）、そしてＯＫＡは岡山大学薬学部（Faculty of Pha
rmaceutical Sciences, Okayama University）である。
なお、大阪大学微生物研究所及び岡山大学薬学部に保存
されている菌株は、請求により分譲されるので、入手可
能である。

【００１８】実施例１ （１）菌の培養 菌の培養及び本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物の
精製に用いる全てのガラス器具は６Ｍ塩酸で一夜処理
し、イオン交換−蒸留水で数回洗って使用した。水とし
ては、全てイオン交換−蒸留水を使用した。１リットル
当り、トリスヒドロキシアミノメタン１２．１ｇ、塩化
カリウム３．７ｇ、塩化アンモニウム１．１ｇ、リン酸
２水素カリウム０．２７２ｇ、塩化カルシウム２水和物
０．１５ｇ、硫酸ナトリウム０．１４２ｇ、塩化マグネ
シウム６水和物０．１ｇ、コハク酸ナトリウム５ｇ、及
び食塩２０ｇを含む液体培地（ｐＨ７．４）を調製し、
この鉄不含液体培地を２リットル容量の坂口フラスコ１
０本に各々１リットルづつ分注し、１２０℃で２０分間
滅菌した。フィルター濾過滅菌した１ｍＭ−ＦｅＣｌ₃
０．３ｍｌを、それぞれ滅菌した鉄不含液体培地１リッ
トルに加えた（Ｆｅ³⁺濃度：０．３μＭ）。前記の鉄不
含液体培地で腸炎ビブリオ（V.parahaemolyticus）ＡＱ
３３５４株を培養して、ＯＤ＝０．２〜０．３まで増殖
させた。続いて、０．３μＭ鉄を含有する前記の液体培
地に、この腸炎ビブリオ前培養液を２０ｍｌ加えて、３
７℃で２４時間振とう培養した。

【００１９】（２）ピロリドンポリカルボン酸化合物の
精製 得られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心し、得
られた上清１０リットルを１Ｍ塩酸でｐＨ７．０に調整
した。この上清に９００ｍｌ容量のＤｏｗｅｘ−１×８
（ＨＣＯＯ^- ；１００−２００メッシュ）を加え、室温
で３０分間攪拌した。樹脂をガラスフィルターで濾取
し、水、次いで１％ギ酸各１リットルで洗浄した。樹脂
を三角フラスコに移し、これに３Ｍギ酸１リットルを加
え、３０分間攪拌した。３Ｍギ酸溶出液をガラスフィル
ターで濾過した。ガラスフィルター上の樹脂を三角フラ
スコに集め、この溶出操作を再度繰り返した。続いて、
樹脂を濾去し、濾液を減圧下にて４０℃で乾固した。残
渣を水２ｍｌに溶かし、不溶物を遠心処理によって除去
した後、溶液をＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラム（２．２×８
０ｃｍ）に乗せた。水を２０ｍｌ／時間の速度で流し、
１０ｍｌずつのフラクションを取った。活性分画を集
め、４０℃で減圧下にて濃縮し、約２ｍｌとした。濃縮
液を、水／メタノール（９：１，ｖ／ｖ）で平衡化した
TSK-gel Toyopearl HW-40Fカラム（２．２×５０ｃｍ）
に乗せ、同じ溶媒を２０ｍｌ／時間の速度で流した。活
性フラクションを集め、Amberlite CG−１２０（Ｈ＋）
１０ｍｌのカラムに通し、脱塩した。４０℃で減圧下に
て乾固すると、無色透明な油状物が得られた。上清１０
リットルからの収率は２５〜４０ｍｇであった。純度
は、セルローズプレイト（Ｍｅｒｃｋ製）及びｎ−ブタ
ノール／ギ酸／水（２０：２０：１，ｖ／ｖ）を用いる
薄層クロマトグラフィーによって調べた。無水酢酸に４
％の割合で溶かしたｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒ
ド（アルトマン試薬）を噴霧し、１４０℃で１〜２分間
加熱すると、活性物質はオレンジ色を呈し、Ｒｆは０．
３６を示した。なお、アルトマン試薬で他に呈色物が存
在する場合は、前記条件で薄層クロマトグラフィーを行
ない、バンドをかきとり、メタノールで抽出することも
できる。

【００２０】前記の鉄不含液体培地に加える鉄（Ｆ
ｅ³⁺）濃度を、０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１
μＭ、２μＭ、５μＭ及び１０μＭとし、培養を３７℃
にて２２時間行うこと以外は前記と同様の操作を実施し
たところ、Ｆｅ³⁺濃度が０．２５〜０．５μＭにおい
て、本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物の全産生量
が最も多かった。これらの結果を図１に示す。図１にお
いて、○は培養上清１リットルから得られた精製物の加
水分解生成物〔封管中で６Ｍ−ＨＣｌ（５ｍｌ）によ
り、１１０℃で１６時間加水分解〕中のアラニン量であ
り、□は５４０ｎｍにおける吸光度（増殖カーブに相
当）であり、△はアラニン量／吸光度（単位吸光度当り
の菌体によるピロリドンポリカルボン酸産生量に相当）
である。

【００２１】前記実施例１（２）における生物活性の検
定は、ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロバイオ
ロジー〔J. Med. Microbiol., 8, 477-490（1975）〕に
記載の方法に準じ、以下の方法で行った。その原理は、
強力な合成鉄キレーターであるエチレンジアミン−ジ−
（オルト−ヒドロキシフェニル酢酸）（ＥＤＤＡ）によ
って増殖を抑制されている細菌が、被験鉄キレーターに
よって増殖を回復することに基づいている。具体的に
は、ＥＤＤＡ（１００μｇ／ｍｌ）と腸炎ビブリオＡＱ
３３５４株（約１０⁴ ｃｆｕ／ｍｌ）とを含むＭＭＯＦ
寒天培地〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケイション（Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 87, 1102-1108 (1979)）に記載の組成に準じて作
成〕上に、被験フラクションなどを含ませたペーパーデ
ィスクを置き、３７℃で培養する。１２時間後にペーパ
ーディスクのまわりの増殖環を測定する。

【００２２】（３）構造解析 前記実施例１（２）で分離、精製された化合物の構造を
解析するために、図２に示す各種の条件で加水分解を行
ったところ、図２に示す４種の基本成分と、２種の部分
分解生成物が得られた。図２で、Ａｌａはアラニン、Ｅ
Ａはエタノールアミン、ＣＡはクエン酸、２−ＫＧは２
−ケトグルタル酸であり、２−ＫＧ／Ａｌａ／ＥＡは２
−ＫＧとＡｌａとＥＡとが未分解の部分分解生成物であ
り、２−ＫＧ／Ａｌａは２−ＫＧとＡｌａとが未分解の
部分分解生成物である。なお、以下のＮＭＲ解析におい
て、水素原子及び炭素原子の番号は図２の構造式に示し
た番号を意味する。２−ＫＧ／Ａｌａ／ＥＡモノメチル
エステルの ¹Ｈ−ＮＭＲを図３に示す。７〜８ｐｐｍに
２個の水酸基（３級水酸基及び１級水酸基がそれぞれ１
個づつ）に由来するピークが認められたが、Ｄ₂ Ｏ置換
すると消失した。更に、２−ＫＧ／Ａｌａ／ＥＡモノメ
チルエステルの ¹Ｈ−¹³Ｃロングレンジ・シフト・コリ
レーション・スペクトル（平均Ｊ＝８Ｈｚ；ＣＤＣｌ₃
中）を調べた（図４）。エタノールアミン（ＥＡ）部分
が、ピロリドン環上のカルボキシル基と結合した構造
〔図４の（Ｉ）〕ではなく、ピロリドン環窒素原子に置
換したエチル基上のカルボキシル基と結合した構造〔図
４の（II）〕であることが判明した。更に、ＦＡＢ−Ｍ
Ｓを測定したところ、〔Ｍ＋Ｚ〕⁺ がｍ／ｚ２７５に認
められ、図４の（II）に示す構造であることを支持し
た。

【００２３】２−ＫＧ／Ａｌａジメチルエステルのガス
クロマトグラフィーを行ったところ、２つのピークが現
れた（図５）。また、それらのマススペクトルにおける
フラグメントは非常に類似しており（図６）、構造異性
体の可能性が示唆された。そこで、下記の経路で２−Ｋ
Ｇ／Ａｌａジメチルエステルを合成し、同じ条件でガス
クロマトグラフィーとマススペクトルフラグメントとを
調べたところ、前記と全く同じ結果が得られた。なお、
ガスクロマトグラフィーは、ＯＶ−１でコートした２５
ｍ（内径０．２５ｍｍ）の毛細管カラムを用い、カラム
温度を１００℃から毎分５℃の割合で２３０℃まで昇温
させ、イオン源２５０℃及び加速電圧４０ｅＶの条件で
実施した。ピークのＩＳは内部標準物質（Ｎ−イソブチ
ルオキシカルボニル−４−アミノ酪酸）であり、ＣＡは
クエン酸である。

【００２４】

【化７】

【００２５】前記実施例１（２）で分離、精製された化
合物を、塩酸−メタノールで処理してメチルエステル化
した後、 ¹Ｈ−ＮＭＲを測定した（図７）。３．５〜
３．７ｐｐｍに二重線の（duplicate した）ＣＯＯＣＨ
₃ に由来する３本のピークが認められ、３つのＣＯＯＨ
基の存在が示された。また、３級水酸基（５．７，及び
７．１ｐｐｍ付近）が２個観察され、それぞれのピーク
はＤ₂ Ｏ置換によって消失した（図７）。更に、 ¹Ｈ−
¹³Ｃロングレンジ・シフト・コリレーション・スペクト
ル（平均Ｊ＝７Ｈｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆ 中）を調べた（図
８）。その結果、クエン酸（ＣＡ）部分が、ピロリドン
環上の３級水酸基と結合した構造〔図８の（II）〕では
なく、エタノールアミン（ＥＡ）残基の１級水酸基と結
合した構造〔図８の（Ｉ）〕であることが判明した。

【００２６】前記実施例１（２）で分離、精製された化
合物のＵＶ吸収スペクトルを測定した（図９）。溶媒と
しては１５％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢
酸を用いた。図９において、実線はピロリドンポリカル
ボン酸化合物２００ｎｍｏｌ／ｍｌの結果、破線はピロ
リドンポリカルボン酸化合物２００ｎｍｏｌ／ｍｌにＦ
ｅＣｌ₃ ２００ｎｍｏｌ／ｍｌを加えた場合の結果を示
す。

【００２７】更に、前記実施例１（２）で分離、精製さ
れた化合物の理化学的性質を以下に示す。 性状：無色透明、液体 溶解性：水、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキ
シドに可溶 呈色反応：ヨード、硫酸、アルトマン試薬に陽性；ニン
ヒドリン試薬に陰性；塩化第二鉄で僅かに黄色を呈す 塩基性、中性、酸性の区別：酸性 分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₂Ｏ₁₂Ｎ₂ （分子量＝４３４） 質量分析スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）： トリメチルエステル体（Ｃ₁₉Ｈ₂₉Ｏ₁₂Ｎ₂ ）ｍ／ｚ４７
７〔（Ｍ＋１）⁺ 〕 図１０（グリセロールマトリクス，陽イオンモード） ピロリドンポリカルボン酸の核磁気共鳴スペクトル（ ¹
Ｈ−ＮＭＲ）：図１１（重アセトン中，５００ＭＨｚ） ピロリドンポリカルボン酸の核磁気共鳴スペクトル（¹³
Ｃ−ＮＭＲ）：図１２（重アセトン中，５００ＭＨｚ）

【００２８】以上の結果から、前記実施例１（２）で分
離、精製された化合物の構造は、以下の式（１）で表さ
れることが分かった。

【化８】 以下の実施例においては、本発明ピロリドンポリカルボ
ン酸化合物として実施例１（２）で分離、精製された、
前記式（１）で表される化合物を用い、それをピロリド
ンポリカルボン酸化合物（１）と称する。

【００２９】実施例２ 前記実施例１（１）で用いた腸炎ビブリオ（V.parahaem
olyticus）ＡＱ３３５４株に代えて、腸炎ビブリオ（V.
parahaemolyticus）ＡＴＣＣ１７８０２株、ＲＩＭＤ２
２１０５２１株、ＲＩＭＤ ＷＰ−１株、ＡＱ３２９６
株、ＡＱ３３２１株、ＡＱ３３６０株、ＡＱ３６３７
株、又はＯＫＡ８０−２１１株を用いること以外は、す
べて前記実施例１と同様の操作を繰り返して行ない、活
性化合物を精製して化学構造を解析したところ、いずれ
の生成物も前記式（１）で表される化合物であることを
確認した。

【００３０】実施例３ ⁵⁵ ＦｅＣｌ₃と１０倍モル量のピロリドンポリカルボン
酸化合物（１）とを、１５％アセトニトリル−０．１７
％トリフルオロ酢酸水溶液中にて３７℃で１時間反応さ
せ、キレート化合物を調製した。反応液をシリカゲル６
０プレート上にて、７０％メタノールで展開し、プレー
トをラジオクロマトスキャナー（Aloka製）でモニター
した。対照用として、⁵⁵ＦｅＣｌ₃〔１５％アセトニト
リル−０．１％トリフルオロ酢酸水溶液〕のみを、前記
と同様にシリカゲル６０プレート上にて展開した。結果
を図１３に示す。図１３において、Ｏはスポットした個
所であり、Ｆは展開溶媒の先端である。反応液にはピロ
リドンポリカルボン酸化合物と三価鉄とのキレート化合
物に由来するピーク〔図１３の左側（Ａ領域）の⁵⁵Ｆｅ
−ＶＦ〕がＲｆ＝０．６５に認められ、対照用に現れる
⁵⁵ＦｅＣｌ₃に由来するピーク〔図１３の右側（Ｂ領
域）の⁵⁵Ｆｅ〕は全く認められなかった。これはピロリ
ドンポリカルボン酸化合物（１）が三価鉄のキレート化
合物を形成し、展開されたことを示している。

【００３１】実施例４ （１）前記実施例１（１）に記載の鉄不含液体培地に１
ｍＭ−ＦｅＣｌ₃を加え、Ｆｅ³⁺濃度が２０μＭの液体
培地（鉄豊富培地）と、Ｆｅ³⁺濃度が０．５μＭの液体
培地（鉄欠乏培地）とを調製した。これらの各培地中
で、腸炎ビブリオ（V.parahaemolyticus）ＲＩＭＤ２２
１０５１９株を３７℃にて２２時間培養した。次に、培
養した２種類の菌体を遠心して集め、これらの菌体を、
エネルギー源として１ｍＭコハク酸を含む取り込み用緩
衝液〔前記実施例１（１）で用いた鉄不含培地組成から
塩化アンモニウム（窒素源）を除き、コハク酸濃度を
０．０２５％とした緩衝液：ｐＨ７．４〕にそれぞれ濁
液（Ａ₅₄₀）が０．４になるように懸濁した。各懸濁液
１００μｌに、ピロリドンポリカルボン酸化合物（１）
と三価鉄（⁵⁵Ｆｅ）とから調製したキレート化合物をＦ
ｅとして２．５μＭの濃度で加え、⁵⁵Ｆｅの取り込み活
性を比較した。また、鉄欠乏培地による培養菌体につい
ては、培養温度を３７℃とする前記の実験に加え、培養
温度を０℃とし、それ以外は前記と同様の操作を行う実
験を行った。それらの結果を図１４に示す。図１４にお
いて、○は鉄欠乏培地で３７℃にて培養した菌体の取り
込み活性であり、△は鉄欠乏培地で０℃にて培養した菌
体の取り込み活性であり、そして□は鉄豊富培地で３７
℃にて培養した菌体の取り込み活性である。図１４から
明らかなように、鉄欠乏状態で３７℃にて培養した菌体
においてのみ、鉄の取り込みが示された。また、０℃で
は鉄取り込みが著しく抑制されたので、エネルギー依存
の輸送であることが分かる。

【００３２】（２）次に、鉄欠乏培地で３７℃にて培養
した菌体に関し、ピロリドンポリカルボン酸化合物
（１）と三価鉄とのキレート化合物の濃度を変化させ
て、鉄の取り込みのキネティクスを測定したところ、キ
レート化合物濃度の増加に応じて鉄の取り込みが増加し
なくなる飽和曲線を示したので、外膜レセプタータンパ
ク質の関与が示された。得られた飽和曲線の結果をライ
ンウェーバー・バーク（Lineweaver− Burk ）プロット
すると、キレート化合物に対するＫｍ値は６７ｎＭと計
算され、極めてアフィニティーが高いことが判明した。

【００３３】（３）腸炎ビブリオ（V.parahaemolyticu
s）のＲＩＭＤ２２１０５１９株、ＡＱ３３３７株及び
ＲＩＭＤ ＷＰ−１株を、前記（１）の鉄豊富培地（２
０μＭ）及び鉄欠乏培地（０．５μＭ）で培養して、菌
体を集めた。得られた各培養菌体から、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー〔J. Bacteriol., 115, 717-722
(1973）〕に記載のサルコシル法に準じて外膜タンパク
質分画を調製し、前記のキレート化合物との結合活性を
調べた。外膜タンパク質１００μｇに、ピロリドンポリ
カルボン酸化合物（１）と三価鉄（⁵⁵Ｆｅ）とから調製
したキレート化合物をＦｅとして２．５μＭの濃度で加
え、３７℃（又は０℃：この場合は表１に示す）で１０
分間処理した。また、プロテイナーゼＫ（和光純薬製；
１５０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１５分間プレインキ
ュベートした後、キレート化合物をＦｅとして２．５μ
Ｍの濃度で加え、更に３７℃で１０分間処理した。表１
に示すように鉄欠乏培地で培養した各菌体の外膜タンパ
ク質分画は、その他の条件の外膜タンパク質分画と比べ
て、約１０倍或いはそれ以上の強い結合活性を示した。

【００３４】

【表１】

【００３５】（４）更に、プロテイナーゼＫ処理の影響
を調べるため、腸炎ビブリオ（V.parahaemolyticus）Ｒ
ＩＭＤ２２１０５１９株から、前記（１）の鉄欠乏培地
（０．５μＭ）で調製した外膜タンパク質分画（１００
μｇ／０．６ｍｌ）をプロテイナーゼＫ（和光純薬；１
００μｇ）の存在下又は不在下で３７℃にて所定時間
（図１５に記載）インキュベーションし、続いて前記の
キレート化合物をＦｅとして２．５μＭ加えて更に１０
分間インキュベーションした。プロテイナーゼＫで処理
していない場合の⁵⁵Ｆｅ−ピロリドンポリカルボン酸化
合物（１）の結合活性（ｃｐｍ）を１００％とし、これ
に対する相対活性として算出した結合活性（％）を図１
５に示す。図１５において、○はプロテイナーゼＫ不在
下、●はプロテイナーゼＫ存在下の結果である。この活
性はプロテイナーゼＫで処理すると時間依存的に低下す
るので、キレート化合物が結合する物質はタンパク質で
あり、外膜受容体の存在が明らかとなった。

【００３６】実施例５：ピロリドンポリカルボン酸の免
疫学的検出方法 抗ピロリドンポリカルボン酸抗体は従来公知の操作によ
って得た。即ち、抗原としてピロリドンポリカルボン酸
（４）と三価鉄とからなるキレート化合物を常法により
牛血清アルブミンと結合させた複合体を生理食塩水に溶
解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合乳化
し、この乳化液を用いてウサギを常法に従って免疫し、
抗体力価が上昇した血清を分離した。この血清に塩析操
作を行い、カラム処理（プロテインＡ）して夾雑物を除
去した後、透析することによって抗ピロリドンポリカル
ボン酸抗体（ＩｇＧ分画）を得た。この抗ピロリドンポ
リカルボン酸抗体（ＩｇＧ分画）を１０μｇ／ｍｌにな
るように、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
６）に溶かし、９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ
／ウエルの量で分注し、３７℃で２時間〔４℃で一夜
（約１８時間）でも同じ結果が得られた〕放置して抗体
を固相化した。各ウエルをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４）〔以下ＰＢＳ（−）という〕２５０μｌで３回
洗浄した後、ＰＢＳ（−）に溶かしたゼラチン溶液（１
０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌを各ウエルに分注し、３７℃
で２時間放置してブロッキングを行った。各ウエルをＰ
ＢＳ（−）２５０μｌで５回洗浄した後、ピロリドンポ
リカルボン酸をＰＢＳ（−）に溶かした標準溶液１００
μｌを各ウエルに加え、３７℃に放置して１時間抗原抗
体反応を行った後、ＰＢＳ（−）２５０μｌで５回洗浄
した。次に、常法によりパーオキシダーゼで標識したピ
ロリドンポリカルボン酸をＰＢＳ（−）に溶かした溶液
（５０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウエルに加え、室温
で１時間放置した。続いて、ＰＢＳ（−）２５０μｌで
５回洗浄した後、基質溶液〔3,3’，5,5’−テトラメチ
ルベンチジン１００ｍｇをジメチルホルムアミド１０ｍ
ｌに溶かした溶液１００μｌを０．１Ｍ酢酸ナトリウム
溶液（ｐＨ５．５）９．９ｍｌで希釈した後、３％過酸
化水素水溶液１５μｌを加えて調製〕１００μｌを各ウ
エルに分注し、室温で２０分間反応させ、１Ｎ硫酸１０
０μｌを加えて反応を止めた。反応液の吸光度を波長４
５０ｎｍにて測定し、検量線を作成した（図１６）。そ
の結果、上記抗体は正しく抗原を認識して、正常な抗原
抗体反応を行うことが認められた。

【００３７】実施例６：腸炎ビブリオ検出方法 前記実施例１（１）に記載の鉄不含液体培地に１ｍＭ−
ＦｅＣｌ₃を加えて、Ｆｅ³⁺濃度が０．５μＭの液体培
地を調製した。この培地中で腸炎ビブリオ（ＲＩＭＤ２
２１０５１９株）を３７℃にて２２時間培養した。次に
菌体を遠心して集め、エネルギー源として１ｍＭコハク
酸を含む取り込み用緩衝液〔前記実施例１（１）で用い
た鉄不含培地組成から塩化アンモニウム（窒素源）を除
き、コハク酸濃度を０．０２５％とした緩衝液（ｐＨ
７．４）〕に濁度（Ａ₅₄₀）が０．４になるように懸濁
した。この懸濁液５００μｌにピロリドンポリカルボン
酸化合物（１）と三価鉄（⁵⁵Ｆｅ）とから調製したキレ
ート化合物をＦｅとして２．５μＭの濃度で加え、３７
℃で６０分間培養した。菌体を濾過（０．４５μＭフィ
ルター）して集め、フィルターを ＰＢＳ（−）５ｍｌ
で３回洗浄した後、そのフィルターを室温で乾燥し、菌
体のもつ放射活性を液体シンチレーションカウンターに
より測定した。上記腸炎ビブリオ株に換えて、Vibrio c
holerae non-01(ATCC35971)、Vibrio alginolyticus(AT
CC17749) 、Vibrio cincinnatiensis(ATCC35912) 、Vib
rio vulnificus(ATCC27562)、Vibrio mimicus(ATCC3365
3) を用いて同様の操作を行った結果、腸炎ビブリオ株
についてのみ放射活性が測定された。

【００３８】実施例７：腸炎ビブリオ検出方法 前記実施例６と同様に腸炎ビブリオを培養し、菌体を遠
心して集め、ＰＢＳ（−）に懸濁してその５００μｌを
取り、菌体を超音波によって破砕した。沈殿をＰＢＳ
（−）で洗浄した後、常法によりアルカリホスファター
ゼを標識したピロリドンポリカルボン酸化合物（１）と
三価鉄とのキレート化合物をＦｅとして２．５μＭの濃
度で溶かした溶液５００μｌを加え、３７℃で３０分間
反応させた。沈殿をＰＢＳ（−）で５回洗浄した後、基
質溶液〔ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム１０ｍ
ｇを９．７％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８；
０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ₂含有）１０ｍｌに溶かし
て調製〕５００μｌを加え、室温で１０分間反応させた
後、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液５００μｌを加え反応を
停止させた。反応液の吸光度を波長４１５ｎｍにて測定
した。上記腸炎ビブリオ株に換えて、実施例６に示した
各菌体を用いて同様の操作を行った結果、腸炎ビブリオ
株についてのみ強い発色が見られた。

【００３９】

【発明の効果】本発明のピロリドンポリカルボン酸化合
物は三価鉄とキレート化合物を形成するので、鉄キレー
ターとして用いることができる。また、腸炎ビブリオの
マーカーとしても有用であり、本発明の検出方法によれ
ば、腸炎ビブリオを直接に高感度で精度よく検出するこ
とができる。更に、本発明の免疫学的検出方法によれ
ば、ピロリドンポリカルボン酸化合物を特異的に高感度
で精度よく検出し、定量することができる。従って、腸
炎ビブリオの診断に有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】培地に添加する鉄濃度の差異によるピロリドン
ポリカルボン酸化合物産生量の変化を示すグラフであ
る。

【図２】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物から得
られる加水分解生成物を示す説明図である。

【図３】ジメチルスルホキシドｄ６中での、２−ＫＧ／
Ａｌａ／ＥＡモノメチルエステルの ¹Ｈ−ＮＭＲ及びＤ
₂ Ｏ置換した結果を示すグラフである。

【図４】２−ＫＧ／Ａｌａ／ＥＡモノメチルエステルの
¹Ｈ−¹³Ｃロングレンジ・シフト・コリレーション・ス
ペクトルの結果を示すグラフである。

【図５】２−ＫＧ／Ａｌａジメチルエステルのガスクロ
マトグラフィーの結果を示すグラフである。

【図６】２−ＫＧ／Ａｌａジメチルエステルのマススペ
クトルの結果を示すグラフである。

【図７】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物のトリ
メチルエステル体の ¹Ｈ−ＮＭＲ及びＤ₂ Ｏ置換した結
果を示すグラフである。

【図８】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物のトリ
メチルエステル体の ¹Ｈ−¹³Ｃロングレンジ・シフト・
コリレーション・スペクトルの結果を示すグラフであ
る。

【図９】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物のＵＶ
吸収スペクトルの結果を示すグラフである。

【図１０】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物のト
リメチルエステル体のＦＡＢ−ＭＳの結果を示すグラフ
である。

【図１１】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物の ¹
Ｈ−ＮＭＲの結果を示すグラフである。

【図１２】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物の¹³
Ｃ−ＮＭＲの結果を示すグラフである。

【図１３】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物と三
価鉄とのキレート化合物の薄層クロマトグラフィーの結
果を示すグラフである。

【図１４】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物と三
価鉄とのキレート化合物の腸炎ビブリオによる取り込み
の時間変化を示すグラフである。

【図１５】プロテイナーゼＫ処理による結合活性の変化
を示すグラフである。

【図１６】本発明ピロリドンポリカルボン酸化合物の検
量線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 207/28 G01N 33/53 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（１） 【化１】 で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物。
2. 【請求項２】 式（１） 【化２】 で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物と担体との
   結合体を免疫原として調製した抗体を用いることを特徴
   とする、前記式（１）で表されるピロリドンポリカルボ
   ン酸化合物の検出方法。
3. 【請求項３】 式（１） 【化３】 で表されるピロリドンポリカルボン酸化合物と三価鉄イ
   オンとからなり、標識を付したキレート化合物を用いる
   ことを特徴とする、腸炎ビブリオ（ビブリオ パラヘモ
   リティクス；Vibrio parahaemolyticus ）の検出方法。