JP3149787U - 抗体精製用チップ - Google Patents
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Description
遠心分離により吸着、洗浄、脱着工程を行うことができれば、HPLC装置を用いたり注射器を用いる場合と比べて操作が簡単であり精製時間も短縮することができる。
本考案は、遠心分離でも通液可能で分離能も高い遠心チップ型抗体精製カラムを提供する。
無機系多孔質連続体を円盤状に成型し、その表面にまずアミノ基を修飾しさらにこのアミノ基に抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質を結合することにより抗体精製用無機系多孔質連続体を作製する。
抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質としては、Staphylococcus aureus由来のプロテインA(A. Forsgren and J. Sjoquist, J. Immunol. (1966) 97, 822-827.に記載)、Streptococus sp. Group C/G由来のプロテインG (欧州特許出願公開第0131142A2号明細書(1983)に記載)、Peptostreptococcus magnus由来のプロテインL(米国特許第5965390号明細書(1992)に記載)、group A Streptococcus由来のプロテインH(米国特許第5180810号明細書(1993)に記載)、Haemophilus influenzae由来のプロテインD(米国特許第6025484号明細書(1990)に記載)、Streptococcus AP4由来のプロテインArp (Protein Arp 4)(米国特許第5210183号明細書(1987)に記載)、group C Streptococcus 由来のStreptococcal FcRc(米国特許第4900660号明細書(1985)に記載)、group A streptococcus, Type II strain 由来のタンパク質(米国特許第5556944号明細書(1991)に記載)、Human Colonic Mucosal Epithelial Cell由来のタンパク質(米国特許第6271362号明細書(1994)に記載)、Staphylococcus aureu , strain 8325-4由来のタンパク質(米国特許第6548639号明細書(1997)に記載)、Pseudomonas maltophilia由来のタンパク質(米国特許第5245016号明細書(1991)に記載)等が知られているが、抗体結合を有するペプチドもしくはタンパク質の種類には依存しない。
円盤状に成型するには、切削加工、打ち抜き等の公知の方法により行うことができる。
この円盤状の抗体精製用無機系多孔質連続体を遠心チップに装着する。この場合、抗体精製用無機系多孔質連続体の負荷圧は円盤の厚さにより決定される。無機系多孔質連続体の体積は抗体精製量を決める。円盤状無機系多孔質連続体の直径は遠心チップのサイズで決定されるので、無機系多孔質連続体の体積を大きくし精製量を大きくしようとすれば無機系多孔質連続体の厚さを大きくしなければならない。しかしながら無機系多孔質連続体の厚さを大きくすれば負荷圧が大きくなり遠心分離では通液ができなくなってしまう。よって、無機系多孔質連続体の厚さは直径に対して0.1から1.0の比の範囲が適当である。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル-ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のpHを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液10gに対し、0.05〜0.8g、好ましくは0.1〜0.7gである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には40〜200℃で、加熱後の溶媒のpH値は、6.0〜12.0が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
実施例1
まず、無機系多孔質体を以下の方法で作製した。水溶性高分子であるポリエチレンオキシド(アルドリッチ製 商品番号85,645-2)0.90gおよび尿素0.90gを0.01規定酢酸水溶液10gに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン4mlをかくはん下で加えて、加水分解反応を行った。数分かくはんしたのち、得られた透明溶液を内径6ミリメートルのガラスチューブ内に注入し40℃の恒温漕中に保持したところ約30分後に固化した。
固化した試料をさらに数時間熟成させ、密閉条件下で120℃に1時間保った。この処理の後、ゲルを40℃で3日間乾燥し、100℃/hの昇温速度で800℃まで加熱し、直径4.5mmの棒状の無機系多孔質体を得た。
得られた多孔質体中には中心孔径2μm(=2000nm)程度の揃った貫通孔が3次元網目状に絡み合った構造で存在していることが確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径25nm程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。この棒状の無機系多孔質体を厚さ1.5mmに切断することにより円盤状の無機系多孔質体を得た。
この円盤状の無機系多孔質体に以下の方法で「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質(製品名称:IBP“Amano”2)」を修飾した。まず、アミノプロピルトリエトキシシランをトルエン溶媒で20%の濃度に希釈した溶液に円盤状の無機系多孔質体を浸漬し、6時間加熱還流して反応させることにより円盤状の無機系多孔質体の表面にアミノ基を導入した。次に、アミノ基修飾した円盤状の無機系多孔質体30個を、プロテインA20mgを0.5M/Lのホウ酸バッファ5mlに溶解した溶液に浸漬し、室温で20時間反応させることにより円盤状の無機系多孔質体表面に「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質(製品名称:IBP“Amano”2)」を結合させた。
図1に示すようにこの円盤状の「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質(製品名称:IBP“Amano”2)」修飾抗体精製用無機系多孔質体1を容量500μLの遠心チップ3にシリコンゴム製のスペーサ2を用いて装着した。シリコンゴムスペーサのサイズは外径8mm、内径4.3mm、厚さ1.5mmであった。無機系多孔質体の細孔径は連続細孔が約3μm、メソ細孔が60nmであった。
この遠心チップに、ヒトIgGを加え卓上遠心分離機で30秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。続いて、洗浄溶媒を加え卓上遠心分離機で30秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。続いて、脱着溶媒を加え卓上遠心分離機で30秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。ヒトIgGの濃度は0.2、0.5、1.0、2.
0mg/mLになるように吸着溶媒で希釈した。試料、洗浄溶媒、脱着溶媒の量はをそれぞれ500μLとした。脱着溶媒から回収した溶液に含まれる抗体の量を、UV吸収率より溶液の抗体濃度を測定することにより求めた。精製操作により回収できた回収率とともに表1に示した。「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質(製品名称:IBP“Amano”2)」修飾抗体精製用無機系多孔質体装着遠心チップを用い遠心分離という簡単な操作のみで抗体の精製が可能であった。
実施例1と同様の方法で「アマノエンザイムで製造販売しているタンパク質(製品名称:IBP"Amano"2)」修飾抗体精製用無機系多孔質体を装着した遠心チップを作製し、この遠心チップに濃度が0.2mg/mLのヒトIgGを500μL加え卓上遠心分離機で30秒遠心する操作を1回、2回、3回繰り返す操作を行った後、洗浄溶媒を加え卓上遠心分離機で30秒遠心し、続いて、脱着溶媒を加え卓上遠心分離機で30秒遠心し、遠心チップを通過した液を回収した。それぞれの脱着溶媒から回収した溶液に含まれる抗体の量を、UV吸収率より溶液の抗体濃度を測定することにより求めた。また、精製操作により回収できた回収率、カラム体積あたりの回収量を表2に示した。吸着回数が増えるとともに回収量も増えており、抗体の回収が可能であった。
2:スペーサ
3:遠心チップ
Claims (3)
- 反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体を用いた抗体精製用カラムであって、前記無機系多孔質連続体を円盤状に成型し、円盤状の無機系多孔質連続体表面を抗体結合能を有するペプチドもしくはタンパク質で修飾し、遠心チップ内に装着したことを特徴とする抗体精製用チップ。
- 無機系多孔質連続体の厚さと外径との比が0.1から1.0の範囲であることを特徴とする抗体精製用チップ。
- 円盤状の無機系多孔質連続体を弾性を有するスペーサを用いて遠心チップに固定することを特徴とする抗体精製用チップ
Priority Applications (1)
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JP2008008179U JP3149787U (ja) | 2008-11-21 | 2008-11-21 | 抗体精製用チップ |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011232098A (ja) * | 2010-04-26 | 2011-11-17 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 溶液中のイムノグロブリン量の測定方法 |
JP2014002008A (ja) * | 2012-06-18 | 2014-01-09 | Renaissance Energy Investment:Kk | 抗体精製方法、及び、抗体精製用カラム |
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2008
- 2008-11-21 JP JP2008008179U patent/JP3149787U/ja not_active Expired - Lifetime
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