JP3141999B2 - ペプチド調製物 - Google Patents

ペプチド調製物

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチド含有分子の製造に関するものであ
る。
組換えDNA技術は、商業上重要な生物学的物質の製造
に関して、過去十年間においてしだいに用いられるよう
になってきている。このために、医学的に重要な種々の
ヒトタンパク質をコードしているDNA配列群がクローン
化されている。これらは、インスリン、プラスミノーゲ
ン活性化因子、α１−アンチトリプシンおよび凝固因子
VIIIおよびIXを含むものである。現在、現れ出る組換え
DNA技術を用いても、これらのタンパク質は、例えばエ
イズ（AIDS）および肝炎をもたらすもののような感染因
子の伝搬の危険性を負う高価でかつ時間消費性のプロセ
スにより、血液および組織から通常純化される。
所望の医学的に重要なタンパク質を製造するためのバ
クテリアにおけるDNA配列の発現は、魅力的な案に思わ
れるが、バクテリア細胞中で外来タンパク質は、不安定
でかつ正確にプロセッシングされないものであるため
に、実際にはバクテリアはしばしば宿主として不適当で
あることが判明している。
この問題を認識して、哺乳類の組織培養におけるクロ
ーニングされた遺伝子の発現が試みられ、そしていくつ
かの例においては生存可能な技法が経験されている。し
かしながら、動物細胞のバッチ式の醗酵は、高価でかつ
技術的習練を必要とするプロセスである。
これゆえ、生物学的物質、例えば正確に修飾された真
核生物ポリペプチドの製造のための高収率で低コストな
プロセスが必要とされている。
宿主としての形質転換動物（［transgenic anima
l］：動物胚への組換えDNAの導入による新しい形質を持
った動物）の使用は、上記問題の潜在的な解決策として
確証されている。WO−Ａ−8800239は、価値ある薬学的
タンパク質を分泌する、この場合においては因子IXを、
形質転換ヒツジのミルク中に分泌する、形質転換動物を
開示する。EP−Ａ−0264166はまた、薬学的タンパク質
をミルク中に分泌する形質転換動物の一般的なアイデア
を開示するが、この技術が実行できるものであることの
例示は与えられていない。
WO−Ａ−8800239において開示される開拓的研究は、
それ自身の権利において印象的であるが、形質転換動物
のミルク中に産生されるタンパク質の収率を改善する商
業的目的が望まれるであろう。例えば、因子IXに関し
て、ミルク中における少なくとも50μg/mlの発現レベル
は、商業的にかなり望まれるものであり、また、α１−
アンチトリプシンに関しては、より高いレベルの発現、
例えば500μg/mlないしそれ以上の発現が、好適な高い
商業的利益を得るために適当であろう。
さらに、形質転換的な発現の確実性、ならびに発現の
量的収率を改善することがもし可能であれば、これはま
た望まれることであろう。換言すれば、最初のゼロ世代
（G0）形質転換動物、あるいはこれらの子孫の応分な割
合が、応分なレベルで発現すべきである。特に、この技
術の一般性は、仮に百の動物あるいはラインのうちのわ
ずか一しか発現しない場合には限定されるものとなるで
あろう。このことは、特に大きな動物の場合である。こ
れらの大きな動物に関しては、現在利用できる技術を用
いると、わずかな数のG0動物のみを生産するために多く
の時間のお金を費されているものである。
形質転換動物の初期の研究は、WO−Ａ−8800239によ
って表されるように、興味対照のタンパク質をコードし
ている相補的DNA（cDNA）に基づく遺伝子構築物を用い
ていた。天然遺伝子がイントロンを有すると仮定する
と、cDNAは天然遺伝子よりも小さなものであり、またこ
のことは、操作をより容易とすることの理由となる。
ブリンスターら（PANS 85 836−840（1988））は、イ
ントロンが、形質転換マウスにおける転換形質［transg
ene］の転写効率を増加させることを示している。ブリ
ンスターらは、天然遺伝子の全てのエキソンおよびイン
トロンが、十分なそして確かな（すなわち、発現のレベ
ルおよび発現する動物の割合の双方）発現のために重要
であり、そしてこのことは、これらの遺伝子中における
天然イントロンの存在に起因していることを示してい
る。いくつかの場合において、このことが、イントロン
における組織特異性規制配列の存在に起因しえないこと
が知られている。なぜなら該現象は、遺伝子の発現が、
該遺伝子が正常に発現しえない組織に対する異種プロモ
ーターによって再指向された場合に観察されるものであ
るためである。ブリンスターらは、該効果は形質転換動
物に固有のものであり、そして細胞ラインには見られな
いことを述べている。
これゆえ、発現の収率および確実性の問題を解決する
ための方法は、単にブリンスターらの教示に従い、そし
て単に哺乳類ゲノム中へ、天然外来遺伝子に基づく転換
形質を、外来cDNAに対立させて挿入することであるとい
うことが期待されるにちがいない。残念ながら、このア
プローチは、それ自身疑わしいものである。第１に、上
記したように、イントロンを有する天然遺伝子は、該遺
伝子の産物に関しコードしているcDNAよりも必然的に大
きなものであろう。これは単に、イントロンが、核から
mRNAとして輸出される前に、初期転写産物から除去され
るためである。大きなゲノムDNAを取扱うことは技術的
に難しいことである。例えば、約20kbは、λファージに
関する最大可能クローン化サイズを構成する。コスミド
などのようなその他のベクターの使用は、取扱可能なサ
イズを40kbまで増加させることが可能であるが、この場
合、不安定性のより大きな確率が生じる。真核細胞DNA
は、不安定性を確立することのできる反復DNA配列成分
を含有することに留意しなければならない。DNA片が大
きくなるほど、これらの成分の２ないしそれ以上が発生
する可能性が大きくなり、そしてこのことが不安定性を
促進する。
第２に、ゲノムDNAの大きなフラグメントを取扱うこ
とが技術的に可能であるとしても、取扱われたDNAの長
さが長くなるほど、制限サイトが一度ならず発生する可
能性が大きくなり、これによって取扱いがより困難なも
のとされる。このことは特に、多くの形質転換［transg
enic］技術において、哺乳類ゲノム中へ挿入されるべき
DNAがしばしば原核生物ベクター配列から単離される
（なぜなら、DNAは、選択のために、原核生物ベクター
において巧みに操作されているであろうからである。）
という事実を与える。原核生物ベクター配列は、発現を
抑制する傾向にあるために、通常除去されるべきであ
る。これゆえ、DNA片がより大きくなると、これを内的
に切断しない制限酵素を見出すことがより困難なものと
なる。
この問題を説明するために、α１−アンチトリプシ
ン、因子IXおよび因子VIIIが簡単に考察される。α１−
アンチトリプシン（AAT）は、成熟ペプチドとしての394
アミノ酸からなるものである。それは418アミノ酸タン
パク質前駆体として最初に発現される。このタンパク質
前駆体をコードしているmRNAは1.4kbの長さであり、そ
して本発明において用いられたAATをコードしているcDN
Aの長さ（約1.3kb）とほぼ同じ長さである。AATをコー
ドしている構造遺伝子（リバー バージョン、ペリーノ
ら、ザ エンボ ジャーナル ボリューム６、p.2767−
2771（1987）［liver version,Perlino et al,The EMBO
Journal Volume 6 p.2767−2771（1987）］）は４つの
イントロンを含有しており、そして10.2kbの長さであ
る。
因子IX（F IX）は、415アミノ酸タンパク質前駆体と
して最初に発現される。mRNAは2.8kbの長さであり、そ
してF IX構造物を形成するためにWO−Ａ−8800239にお
いて用いられたcDNAは1.57kbの長さであった。構造遺伝
子は約34kbの長さであり、そして７つのイントロンを含
有するものである。
因子VIII（F VIII）は2351アミノ酸タンパ質前駆体と
して発現され、これは2332アミノ酸の成熟タンパク質へ
と整頓される。mRNAは9.0kbの長さであり、一方構造遺
伝子は185kbの長さである。
これゆえ、cDNAに基づく構造物を用いた場合に得られ
る形質転換技術の収率および確実性を、天然遺伝子がそ
れの全てのイントロンを有することに関連するサイズの
困難性に陥ることなく、改善することが望ましい。
遺伝子中に天然に発生するイントロンの全てではな
く、そのいくつかを含有してなる構造物を用いることで
高い収率が得られることが今回発見された。
本発明の第１の観点によると、哺乳類乳タンパク質遺
伝子からの５′−フランキング配列［５′−flanking s
equence］および該乳タンパク質以外の異種タンパク質
に関し暗号化するDNAを含んでなる遺伝子構造物が提供
される。ここにおいて、前記タンパク質暗号化DNAは、
該異種タンパク質に関し暗号化する遺伝子において天然
に発生するイントロンの全てではないが少なくとも１つ
を含有してなるものであり、また前記５′−フランキン
グ配列は異種タンパクの発現を誘導するのに十分なもの
である。
該乳タンパク質遺伝子は乳清酸タンパク質、α−ラク
トアルブミン、あるいはカゼインに関する遺伝子であっ
てもよいが、特にβ−ラクトアルブミン遺伝子が好まし
い。
本明細書において、“イントロン”なる用語は、任意
の天然イントロンないしその一部の全てを包含するもの
である。
該構造物は、通常、形質転換動物において異種タンパ
ク質を発現させるのに好適に使用される。発現は唾腺あ
るいは乳腺などのごとき分泌腺中に起り得る。乳腺が好
ましい。
発現のために選択される動物種は、特に限定されるも
のではないが、当業者によって彼らの要求から適当であ
るものが選択されるであろう。本発明の好ましい実施態
様の場合におけるように、乳腺における分泌が初期の終
点であるあらば、明らかに、哺乳動物の使用が必須であ
る。操作の経験的容易さから好適な実験哺乳動物は、マ
ウスおよびラットを含むものである。より高い収率は、
例えばウシ、ブタ、ヤギおよびヒツジのような家畜から
得られるであろう。実験動物と家畜との間には、ウサギ
のような動物があり、これらはある種のタンパク質に関
して好ましい生産動物であり得る。
５′−フランキング配列は、通常、乳タンパク質（例
えばβ−ラクトグロブリン（BLG））転写開始部位を含
有するものである。BLGに関しては、BLG転写開始部位の
約800塩基対（例えば799塩基対）上流が含まれているこ
とが好ましい。特に好ましい実施態様においては、少な
くとも4.2キロ塩基対上流が含まれている。
BLG以外のタンパク質（異種タンパク質）に関し暗号
化するDNAは、興味対象の任意の所望するタンパク質に
関し暗号化するものであってよい。興味対照のタンパク
質の１つの特に好ましいカテゴリーは、血漿タンパク質
である。重要な血漿タンパク質には、セルピン［SERPI
N］科のメンバーであるといわれている、セリンプロテ
アーゼインヒビターが含まれる。このようなタンパク質
の一例としてはα１−アンチトリプシンがある。その他
のセリンプロテアーゼインヒビターもまた暗号化され得
る。セリンプロテアーゼインヒビター以外の他の血漿タ
ンパク質には、血液因子、特に因子VIIIおよび因子IXが
包含されるものである。
興味対象のタンパク質はまた、上記に述べた血漿タン
パク質とある度合の相同性（例えば、少くとも90％）を
有するタンパク質を含有するものである。その例として
は、AATなどのようなセリンプロテアーゼインヒビター
の酸化耐性変異株およびその他の類似体がある。これら
の類似体は、α１−アンチトリプシンの活性部位の修飾
によって産生された新規なプロテアーゼインヒビターを
包含するものである。例えば、AATのMet−358がVa1に変
容された場合、活性中心での酸化感受性残基の挿入バリ
ンでのこの置換は、分子抵抗性を酸化的不活性とする。
あるいはまた、Met−358が残基がArgに変容された場
合、分子はもはやエラスターゼをを阻止し得ないが、効
果的なヘパリン非依存性トロンビンインヒビターとなる
（すなわち、もはやアンチトロンビンIIIのように機能
する。）。
該タンパク質暗号化DNAは、天然イントロンあるいは
それらの一部と部分的相補性を有する。いくつかの実施
態様においては、１つを除く全てが存在することが好ま
しい。例えば最初のイントロンが欠失されるが、もちろ
ん他のイントロンが欠失されることも可能である。本発
明の他の実施態様においては、１つ以上が欠失される
が、タンパク質暗号化DNA中に少なくとも１つのイント
ロンが存在しなければならない。いくつかの実施態様に
おいては、わずか１つのイントロンが存在することが望
ましい。
好ましい３′−配列は存在する。しかしながら、特に
興味対象のタンパク質暗号化DNAがそれ自身のポリアデ
ニル化シグナル配列を有してなる場合には、存在すべき
このような配列は必須のものではない。しかしながら、
本発明のいくつかの実施態様においては、３′−配列を
提供することが必要ないしは便宜的であり、BLGの３′
−配列が好ましく選択される。しかしながら、３′−配
列はBLG遺伝子から誘導されたものに何ら限定されるも
のではない。
適当なシグナルおよび／または分泌配列（配列群）
は、必要ないしは望まれる場合に存在し得る。
本発明の第２の観点によると、ポリペプチドを含有し
てなる物質を製造する方法が提供され、この方法は、上
記に述べたようなDNA構造物を動物のゲノム中へと、タ
ンパク質暗号化DNAが該動物の分泌腺中に発現されるよ
うな方法において、導入することで構成されるものであ
る。
好ましくは、動物は哺乳動物であり、発現は乳腺にお
いて生起する。上記構造物は、雌の哺乳動物中へ、ある
いは該構造物を転換形質として負う雌の哺乳動物を繁殖
させることができる雄の哺乳動物中へ挿入される。
この方法の好ましい観点は、WO−Ａ−8800239に述べ
られるものと同様なものである。
本発明の第３の観点によると、上記したような遺伝的
構造物を含有してなるベクターが提供される。該ベクタ
ーは、プラスミド、ファージ、コスミドあるいはその他
のベクター型、例えば酵母から誘導されたものなどであ
り得る。
本発明の第４の観点によると、上記したようなベクタ
ーを含有する細胞が提供される。この細胞は原核あるい
は真核であり得る。原核である場合、細胞は例えばエシ
ェリキア・コリのような細菌性のものであり得る。また
真核である場合、細胞は酵母細胞あるいは昆虫細胞であ
り得る。
本発明の第５の観点によると、上記したような構造物
を含有してなる哺乳あるいはその他の動物が提供され
る。
本発明の第６の観点によると、ゲノム中へ組込まれた
上記したような遺伝的構造物を有してなる形質転換哺乳
あるいはその他の動物が提供される。形質転換動物が該
構造物をそれの子孫へと遺伝し、これによって少なくと
も１つの次世代の産出動物の製造が可能とされることが
望ましい。
以下、本発明をいくつかの実施例によって具体的に説
明する。これらの実施例は以下の関連する図面を参照す
る。
第１図〜第10図は、ヒツジβ−ラクトグロブリンから
のDNA配列成分および哺乳動物の乳腺において発現され
るべき興味対称の遺伝子（群）、この例においてはα１
−アンチトリプシン、を含有してなる融合遺伝子を作成
するために用いられた１つの技法を図解的に示すもので
あり、 第11図は実施例２の結果を与えるノーザンブロット
［Northern blot］を示すものであり、 第12図は実施例２において言及されるRNアーゼ保護ゲ
ルを示すものであり、 第13図は実施例２において言及される形質転換マウス
および正常マウスからの希釈ミルク試料のイムノブロッ
ト［Imuno blot］を示すものであり、 第14図は正常ヒツジおよび２匹の形質転換ヒツジから
の乳清試料のウェスタンブロット［Western blot］を示
すもの（実施例３）であり、 第15図は正常マウスおよび形質転換マウスからのTCA
沈降化乳清試料のウェスタンブロットを示すもの（実施
例３）であり、そして 第16a図、第16b図および第17〜20図は、ヒツジβ−ラ
クトアルブミンからのDNA配列成分および哺乳動物の乳
腺中に発現されるべき興味対象の遺伝子（群）、この例
においては因子IX、を含有してなる融合遺伝子を作成す
るために用いられる更なる技法を作成するために用いら
れた技法を図解的に示すものである。
実施例１ 概略 具体的な詳細については述べないが、組換え体DNA及
び分子生物学的方法については、マニアティス（Maniat
is）らによる（“モレキュラークローニング（Molecula
r Cloning）”コールドスプリングハーバー（Cold Spri
ng Habor）（1982））、“リコンビナントDNA（Recombi
nant DNA）”メソッドインエンザイモロジー（Method i
n Enzymology）Vol.68、（アール・ウー（R.Wu）編集）
アカデミックプレス（Academic Press）（1979）及び
“リコンビナントDNAパートＢ（Recombinant DNA Part
B）”メソッドインエンザイモロジー（Method in Enzym
ology）Vol.100、（ウー（Wu）、グロスマン（Gross ma
n）そしてモールドゲイブ（Moldgave）編集）アカデミ
ックプレス（Academic Press）（1983）；“リコンビナ
ントDNAパートＣ（Recombinant DNA Part C）”メソッ
ドインエンザイモロジー（Method in Enzymology）Vol.
101、（ウー（Wu）、グロスマン（Grossman）そしてモ
ールドゲイブ（Moldgave）編集）アカデミックプレス
（Academic Press）（1983）；及び“ガイドトゥモレキ
ュラークローニングテクニックス（Guide to Molecular
Cloning Techniques）”メソッドインエンザイモロジ
ー（Mechod in Enzymology）Vol.152（エス・エル・バ
ーガー（S.L.Berger）及びエー・アール・キメル（A.R.
Kimmel）編集）アカデミックプレス（Academic Press）
（1987）にならった。具体的に述べないが、すべての化
学物質はBDHケミカルズ（Chemicals）Ltd、プール（Poo
le）、ドーセット（Dorset）、英国又はシグマケミカル
カンパニー（The Sigma Chemical Company）、プール
（Poole）、ドーセット（Dorset）、英国より購入し
た。さらに、具体的には述べないが、すべてのDNA修飾
酵素及び制限酵素は、BCL、ベーリンガーマンハイムハ
ウス（Boehringer Mannheim House）、ベルレイン（Bel
l Lane）、ルイス（Lewes）、イーストサスセックス（E
ast Sussex）BN7 1LG,UK.より購入した。
［略語:bp＝塩基対;kb＝キロベースペア;AAT＝α１−ア
ンチトリプシン（alphal−antitrypsin）;BLG＝β−ラ
クトグロブリン;FIX＝ファクターIX;E.Coli＝エシェリ
キア・コリ;dNTPs＝デオキシリボヌクレオチド３リン
酸；制限酵素は、例えばBam H Iのように略される。例
えばPvu−IIのような制限酵素のサイトの後に−０を添
加することによって認識されたサイトが切断される。
A.構築準備 β−ラクトグロブリン融合遺伝子の作製 子宮のβ−ラクトグロブリンのDNA配列因子及び哺乳
類で発現させるための遺伝子からなる融合遺伝子を作製
するための方法は図１から図10に概略を示す通りであ
る。またこの方法には、λクローンつまり、ラムダSS−
１（lamda SS−１）を使用した。なお、ラムダSS−１は
ヒツジのβ−ラクトグロブリン遺伝子を含み、これの分
離及び特性の概略については、国際特許出願番号、WO−
Ａ−8800239（ファルマセティカルプロテインズリミテ
ッド（Pharmaceutical Proteins Ltd））及びアリ（Al
i）とクラーク（Clark）（1988）によるジャーナルオブ
モレキュラーバイオロジー（Journal of Molecular Bio
logy）vol.199、415〜426ページに記載してある。
AATB、AATA、BLG−BLG、AATC、AATD、FIXD、及びDELT
A−A2の７構築方法についてはセクションA1からA7に記
載されている。なお、AATBの構築については初めての実
施例に記載され、また他の構築物については順次実施例
に記載されている。
例えばAATBの名称は関連したバクテリアの（プラスミ
ド）ベクター配列のないDNA配列として一般的に使用さ
れている。ベクター配列の欠けたこのような型は、受精
卵に微小注入し、さらに、胚の染色体に導入されること
によって得られる。
A1.AAT3−pIII−15BLGgAATの構築 AATBの構築はヒツジβ−ラクトグロブリンの５′−フ
ランキング領域をヒトのα１−アンチトリプシンからの
配列に融合することによってできる配列を含むハイブリ
ッド遺伝子である。AATBの構築の概要は図６に要約され
ている。ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子の配列は推
定の“CCAATボックス”（AGCCAAGTG）［アリ（Ali）と
クラーク（Clark）（1988）によるジャーナルオブモレ
キュラーバイオロジー（Journal of Molecular Biolog
y）vol.199、ページ415〜422参照］を（推定ではある
が）含んでいる約4.2kbのSal I−Sph I断片中に含まれ
ている。さらにBLGの転写単位の５′−非転写領域中に
は、先のSph IからPvu II部位のヒツジBLG配列がある。
このSph I−Pvu II断片の配列は図５に示す。この後者
の断片には推定の‘TATAボックス’が（推定だが）あ
る。［アリ（Ali）とクラーク（Clark）（1988）による
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Journal of
Molecular Biology）vol.199、ページ415〜422参
照］。S1−マッピングやリボヌクレアーゼ（RNase）プ
ロテクションアッセイによって決定された転写開始点で
あるCACTCCとしてのメッセンジャーRNA（mRNA）のチャ
ップサイトは、またこの断片中に含まれる。ヒトのα１
−アンチトリプシンの相補的DNAやヒトのα１−アンチ
トリプシン遺伝子の配列が融合（Pvu−II−０）部位を
越えて存在する。５′−側の融合（Tag I−０）部位か
らBam H I部位へ80bp下流の配列には、α１−アンチト
リプシンの開始コドン（ATGメチオニン）がある。AAT配
列（CGACAATG…，図５参照）中の最初のヌクレオチド
（シトシン）はAAT遺伝子のエクソンＩ中の最後のヌク
レオチドと一致する。AAT配列（CGAGAATG…，図５参
照）中の２番目のヌクレオチド（グアノシン）はAAT遺
伝子エクソンII中の最初のヌクレオチドと一致する。イ
ントロンＩが除かれることはAATB（Tag−Ｉ−０からBam
H I方向）中のAAT配列の初めの80bpとして相補的DNAク
ローンp8α1ppg（下記参照）からのDNAを使用すること
によって効果的である。Bam H I部位はAAT遺伝子のエク
ソンII中の部位と一致する。Bam H I部位を越えて、約
6.5kbのヒトのAAT遺伝子（エクソンIIの残り、イントロ
ンII、エクソンIII、イントロンIII、エクソンIV、イン
トロンIV、エクソンＶそして約1.5kbの３′−フランキ
ング配列）が存在する。エクソンＶにはAATの転写終了
コドン（TAA）及び推定上のポリアデニレーションシグ
ナル（ATTAAA）がある。AATBの構築物をコードしている
ペプチドのシグナルペプチドは、ATGCCGTCTからTCCCTGG
CTまでのAATの相補的DNA配列（エクソンII中のBam H I
から2bp上流）によってコードされる。
プラスミドpSS1tgSEα1AT サブクローンpSS1tgSEα1ATは国際特許出願番号WO−
Ａ−8800239（ファルマセティカルプロテインズ（Pharm
aceutical Proteins））の実施例２中に簡潔に書いてあ
る通りに構築されていた。このクローンにはヒツジβ−
ラタトグロブリン遺伝子の５′−側の転写されない領域
が挿入されているヒトのα１−アンチトリプシンの相補
的DNA配列が存在している。α１−アンチトリプシンの
Ｍ変異をコードした全長の相補的DNAを含むプラスミドp
8α1ppgは、リカルドコルテス教授（Professor Ricardo
Cortese）、ヨーロッピアンモレキュラーバイオロジー
ラボラトリー（European Molecular Biology Laborator
y）、メーヤーホフストラーセ１（Meyerhofstrasse
1）、Ｄ−6900ハイデルベルグ（Heidelberg）、フェデ
ラルリパブリックオブジャーマニー（Federal Republic
of Germany）、（シリベルト（Ciliberto）、デンテア
ンドコルテス（Dente ＆ Cortese）、（1985）セル
（（Cell）vol.41、ページ531〜540）から調達された。
現在AATAとして知られるBLG−AAT又はpSS1tgXSTARGの構
築方法は、国際特許出願番号WO−Ａ−8800239（ファル
マセティカルプロテインズリミテッド（Pharmaceutical
Proteins Ltd））に記載されており、該方法はα１−
アンチトリプシンの相補的DNAの３′−末端のポリアデ
ニル化シグナル配列が除去されることを必要とするもの
である。
ポリアデニル化シグナルは以下の方法で除去された。
プラスミドp8α1ppg DNAをPst Iで消化し、消化された
物質を0.5μg/mlエチジウムブロマイド（シグマ製）を
含む１％アガロースゲルで電気泳動によって分離した。
約1400bpの断片を紫外ランプ（ウルトラ−バイオレット
プロダクト、インク（Ultra−Violet Products,Inc）、
サンガブリエル（San Gabriel）、カルフォルニア、USA
製）で照射することによって位置を確認した。透析膜を
該バンドの前におき、その後電気泳動されたDNA断片を
膜上に移した。DNAを膜より溶出させ、‘エルティップ
Ｄ（Elutip D）’（スクレーサーとシャル（Scleicher
and Shull）、ポストファッハ（Postfach）４、Ｄ−335
4、ダゼル（Dassal）、西ドイツ製）を用いて、業者に
すすめられた方法を用いて、分離した。1400bp Pst I
断片を精製したゲルをさらにTag Iで消化し、上記と同
様にして１％アガロースゲルで電気泳動した。ポリアデ
ニル化シグナル配列を含む３′−末端のα１−アンチト
リプシン相補的DNAからなる約300bpのTag I−Pst I断片
を溶出させ、上記と同様にしてエルティップ（Elutip）
を用いて精製し、また、相補的DNAの５′−末端を含む1
093bpのTag I−Tag I断片についても同様の処理を行な
った。プラスミドベクターpUC8（ファルマシア−LKBバ
イオテクノロジー（Pharmacia−LKB Biotechnology、フ
ァルマシアハウス（Pharmacia House）、ミッドサマー
ボウレバード（Midsummer Boulevard）、セントラルミ
ルトンキーネス（Central Milton Keynes）、ブクス（B
ucks）、MK9 3HP、UK製）をAcc I及びPst Iで消化し、
フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿
により回収した。次にp8α1ppgからの300bpのTag I−Ps
t I断片をAcc I及びPst Iで切断したpUC8にT4 DNAリガ
ーゼを用いて連結させ、連結させた物はエシェリキア・
コリDH−１（ギブコ−BRL（Gibco−BRL）、PO Box 35、
トリデントハウス（Trident House）、レンフリューロ
ード（Renfrew Road）、パイスレイ（Paisley）PA3 4E
F、スコットランド、UK製）をアンピリシン耐性に形質
転換するために用いられた。プラスミドDNAはアピシリ
ン耐性のコロニーより単離した。目的とする組換え体は
Acc IとPst Iで消化した場合における約300bpの断片の
存在により同定した。ここで作製されたプラスミドをpU
C8.3′AT.3と呼んだ。
プラスミドpUC8.3′AT.3をBst N Iで部分消化し、ア
ガロースゲルより線状化されpUC8.3′AT.3に相当する断
片を単離した。pUC8.3′AT.3には７つのBst N I部位が
あるが、うち５つがベクター由来で残りの２つがα１−
アンチトリプシンの３′−端の転写されない配列に相当
する領域中にある。Bst N Iによって線状化され、ゲル
で精製されたDNAは、更にPst Iで消化され、相補的DNA
挿入断片の３′−端と結合するpUC8のポリリンカー部を
切断する。Pst Iで消化されたDNAを過剰のdNTPc存在下
でT4 DNAポリメラーゼで修復した後、T4 DNAリガーゼで
自己連結させた。ポリアデニル化シグナル配列を含むBs
t N I−Pst I断片はこの過程で欠損した。連結材料は、
エシェリキア・コリ株DH−１をアンピシリン耐性にする
のに用いられた。プラスミドDNAはアンピシリン耐性の
コロニーより単離した。目的とするクローンは制限酵素
で切断し、pUC8.3′AT.3と比較することによって同定し
た。この目的とするクローンは、Bam H I及びHind III
の単一部位の保持、Pst I部位の欠失、Pvu II小断片の
サイズの減少によって特徴づけられた。この目的とする
クローンをpB5と呼ぶ。
プラスミドpB5をAcc Iで消化し、フェノール／クロロ
ホルムで抽出し、エタノール沈殿によってDNAを回収し
た。Acc Iで切断されたpB5 DNAは、ウシ腸アルカリフォ
スファターゼで処理し、10mM EDTAを加え、65℃10分加
熱することによって反応を止めた。DNAは２回フェノー
ル／クロロホルム処理をした後、１回クロロホルム抽出
をし、更にエタノールで沈殿させることによって回収し
た。T4 DNAリガーゼを用いて109のTag I−Tag I断片を
連結させ、Acc Iで切断し、フォスファターゼ処理したD
NA及び先の連結させた生成物を用いてエシェリキア・コ
リHB101（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））をアンピリシン
耐性に形質転換した。目的とするクローン（pUC8α1AT.
73）は制限酵素で切断し、909bp Hinf I断片、1093bp T
ag I断片及び87bp BamH I断片の存在によって同定す
る。
ポリアデニル化シグナルを欠いたα１−アンチトリプ
シンの相補的DNAはpUC8α1AT.73より1300bp Acc I−Hin
d III断片として切断され、ゲルより分離された。1300b
p Acc I−Hind III断片は、過剰のdNTPsの存在下でエシ
ェリキア−コリDNAポリメラーゼのクレノウフラグメン
トで末端を修復した。この断片をPvu IIで切断され、フ
ォスファターゼ処理されたpSS1tgSE DNA（国際特許出願
番号WO−Ａ−8800239参照（ファルマセティカルプロテ
インズリミテッド（Pharmacetical Proteins Ltd））中
に直結し、エシェリキアコリDH−１をアンピシリン耐性
に形質転換した後、pSS1tgSEα1ATを作製した。
プラスミドp III−I SpB（図１参照） pSS1tgSEα1AT DNAは、β−ラクトグロブリンの転写
単位の５′−フランキング配列に相当するDNA領域中の
プラスミドの単一部位を切断するSph−Ｉで消化し、線
状化された。DNAをフェノール／クロロホルム抽出した
後、エタノールで沈殿することによって回収されたSph
Iで線状化されたプラスミドはさらにBam H Iで消化さ
れ、α１−アンチトリプシンのメッセンジャーRNA（mRN
A）配列のDNA領域中のプラスミドの単一部位を切断す
る。α１−アンチトリプシンに融合されたβ−ラクトグ
ロブリンからなる155bp Sph I−Bam H I断片を１％アガ
ロースゲルで確認後該断片を上記のエルティップＤ（El
utip D）を用いて分離する。
プラスミドp III−I SpBはT4 DNAリガーゼを用いてSp
h I及びBam H Iで消化したプラスミドベクターpPoly II
I−Ｉ（ラテ（Lathe）、ビロレットとクラーク（Vilott
e ＆ Clark）、1987、ジーン（Gene）vol.57、ページ19
3〜201）中にサブクローンpSS1tgSEα1ATの155bp Sph I
−Bam H I断片を連結することによって得られた。クロ
ーンはアンピシリン耐性にエシェリキアコリDH5αのコ
ンピテント細胞（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））を形質
転換した後、分離された。プラスミドDNAはアンピシリ
ン耐性コロニーより調製され、目的物をスクリーニング
した。p III−I SpBはBam H I及びSph Iの制限酵素切断
部位を持ち、また、ベクターpPoly III−Ｉと比べた際
にStu Iの制限酵素切断部位があることによって確認さ
れた。Stu I部位はpSS−1tgSE α1ATより分離された155
bp Sph I−Bam H I断片中に存在する。
プラスミドp III−15BLGSpB（pAT2−３）（図２参照） p III−I SpB DNAをSph I及びSal Iで消化した。Sph
Iはβ−ラクトグロブリンの転写単位の５′−フランキ
ング配列に相当するDNA領域中のプラスミドの単一部位
を切断する。またこの部位はβ−ラクトグロブリン配列
とプラスミドベクター配列の結合部に相当するSal Iは
ベクターのポリンカー配列中のプラスミドの単一部位を
切断する。Sph I及びSal Iで消化したp III−I SpB DNA
は上記のように１％アガロースゲルに電気泳動し、約2.
2kbのSph I−Sal I断片を溶出させ、上記のようにエル
ティップ（Elutip）を用いて精製した。
プラスミドDNA pSS−1tgXS（国際特許出願番号WO−Ａ
−8800239（ファマセティカルプロテインズリミテッド
（Pharmaceutical Proteins Ltd））に記載されてい
る）をSph I及びSal Iで消化し、該DNAを0.9％アガロー
スゲルで電気泳動した。β−ラクトグロブリン遺伝子の
５′−フランキング配列からの約4.2kbのDNA配列からな
る目的とするSal I−Sph I断片は、紫外光を照射するこ
とによって位置を確認し、上記のようにエルティップ
（Elutip）を用いて回収された。
プラスミドp III−15BLGSpBは、T4 DNAリガーゼを用
いて、ゲルで精製したSal I−Sph I消化したp III−I S
pB DNAに上記約4.2kbのSal I−Sph I断片を連結させ
る。クローンはアンピシリン耐性に大腸菌DH5α（ギブ
コ−BRL（Gibco−BRL））を形質転換した後、単離し
た。プラスミドDNAはアンピシリン耐性のコロニーより
調製し、目的生成物をスクリーニングした。この生成物
は、２のBam H I部位（１はβ−ラクトグロブリンの
５′−フランキング配列を含む4.2kb断片中にあり、他
の１つはα１−アンチトリプシンのメッセンジャーRNA
（mRNA）の配列中にある）の存在によって確認された。
目的生成物をBam H Iで切断すると、クローニングの結
合部位をつなぐ約1.75kbの断片を含む２断片になる（図
２参照）。
プラスミドp III−15BLGgAAT（AATB又はG7）（図３参
照） α１−アンチトリプシンDNAのクローンであるpATp7は
カービンケルシー博士（Dr.Gavin Kelsey）、MRCヒュー
マンバイオケミカルジェネティックスユニット（Human
Bicohemical Genetics Unit）、ガルトンラボラトリー
（The Galton Laboratory）、ユニバーシティカレッジ
ロンドン（University College London）ウオルフソン
ハウス（Wolfson House）、４ステフェンソンウエイ（S
tephenson Way）ロンドンNW1 2HE、英国。により得られ
た。このクローンは、α１−アンチトリプシン転写単位
にプラスミドベクターpUC9（ファルマシア−LKB（Pharm
acia−LKB）バイオテクノロジー（Biotechnology）、フ
ァルマシアハウス（Pharmacia House）ミッドサマーボ
ーレバード（Midsummer Boulevard）、セントラルミル
トンキーナス（Central Milton Keynes）、ブックス（B
ucks）、kM9 3HP、UK）のBam H I部位に約12.3kbの断片
が挿入された348bpの５′−フランキング配列及び約150
0bpの３′−フランキング配列を加えた配列を含んでい
る。クローンpATp7への挿入はコスミドクローンαATC−
１（ケルシー（Kelsey）、ポベイ（Povey）、ビグレー
ブ（Bygrave）とロベル−バッジ（Lovell−Badge）（19
87）、ジーンズエンドデベロップメント（Genes and De
velopment）vol.1、ページ161〜171）がBam H I及びBg
IIIで部分消化されることによって調製された。クロー
ンpATp7はM1対立遺伝子をコードし、かつPi部位に最も
よく存在する遺伝子を含んでいる。この遺伝子のDNA配
列の大部分については、ロング（Long）、チャンドラ
（Chandra）、ウー（Woo）、デービー（Davie）及びク
ラチ（Kurachi）（1984）バイオケミストリー（Biochem
istry）vol.23、ページ4828〜4837で報告されている。
pATp7由来のプラスミドDNAはBam H Iで消化され、0.9
％アガロースゲルで電気泳動された。目的となるBam H
I断片は、この遺伝子のエクソンIIのBam H I部位から
３′−フランキング領域中のBam H I部位までの約5600b
pのα１−アンチトリプシン配列によりなっているが、
上記のように位置を確認後、エルティップ（Elutip）を
用いて精製された。
プラスミドp III−15BLGSpB（AT2−３として知られて
いる）はBam H Iで部分消化されることによって直線状
にされた。このプラスミド中にはBam H I部位が２箇所
あり、うち１つはβ−ラクトグロブリンの５′−フラン
キング配列にあたる配列中にあり、他の１つはα１−ア
ンチトリプシンのメッセンジャーRNA（mRNA）にあたる
配列中にある。後者の部位はpATp7の6500bpのBam H I断
片の挿入に適した部位である。プラスミドp III−15BLG
SpBのBam H Iで部分消化した断片の生成物を0.9％アガ
ロースゲルで電気泳動し、上記のように、直線のp III
−15BLGSpBにあたる断片の位置を確認後、エルティップ
（Elutip）を用いて該断片を精製した。この調製断片に
は２つのBam H Iの直線状の分子があると考えられるBam
H Iで直線状にされ、ゲルで精製されたDNAをTE（10mM
トリス塩酸、1mM EDTA、pH8）に溶解し、ウシ腸フォス
ファターゼ（BCL）で37℃30分処理し、10mM EDTAを添加
し、65℃10分加熱することによって反応を止めた。この
DNAは２回フェノール／クロロホルムで処理し、１回ク
ロロホルムで抽出したのち、エタノールで沈殿させるこ
とによって回収した。
プラスミドp III−15BLGgAATはT4 DNAリガーゼを用い
Bam H Iで直線状にされ、ゲルで精製され、フォスファ
ターゼ処理されたp III−15BLGSpB DNAにpATp7の6500bp
のBam H I断片を連結させることによって構築される。
クローンはアンピシリン耐性にエシェリキアコリDH−５
（ギブコ−BRL（Givco−BRL））を形質転換した後、単
離された。プラスミドDNAはアンピシリン耐性コロニー
より精製され目的生成物をスクリーニングした。目的と
するクローンは制限酵素による分析、特に、約1.6kbのS
ph I断片の存在によって同定した。プラスミドDNAは１
クローン（G7）として調製され、p III−15BLGgAAT（AA
TBとして知られている）と名づけられた。
1.6kb Shp I断片は、p III−15BLGgAATからM13ベクタ
ーM13tg130（キーニー（Kieny）、ラテ（Lathe）とレコ
ック（Lecocq）（1983）ジーン（Gene）vol.26、ページ
91〜99）のSph I部位にサブクローニングされた。β−
グロブリン及びα１−アンチトリプシンの融合部位から
３′方向にあるβ−ラクトグロブリンの５′−フランキ
ング領域中の配列に相当するSph I部位から180ヌクレオ
チドのDNA配列は、業者の指導によるシークエナーゼTM
キット（SequenaseTMkit）（USB、ユナイテッドステイ
トバイオケミカルコーポレーション（United States Bi
ochemical Corporation）、PO Box 22400、クリーブラ
ンド、オハイオ44122、USA）を用いた鎖ターミネーター
反応（chain terminator reaction）によって決定され
た。この領域の配列は図５に示す。
微量注入のためのDNAの調製（図４参照） β−ラクトグロブリンとα１−アンチトリプシンの融
合遺伝子の挿入部は下記のようにしてp III−15BLGgAAT
より切除された。25〜50μｇのp III−15BLGgAATプラス
ミドDNAをNot Iで消化した後、消化されたものを0.6％
アガロースゲルで電気泳動された。約10.5kbの大きい方
の断片は上記のようにして紫外光によって確認され、エ
ルティップ（Elutip）を用いて精製した。エルティップ
（Elutip）より溶出させたDNAをエタノールで沈殿させ
た後、さらにDNAを以下のようにして精製した。DNAをフ
ェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽
出した後、エタノールで２回沈殿させた。DNAを70％エ
タノールで洗浄し、真空乾燥した後、TE（10mMトリス塩
酸、1mM EDTA、pH8）に溶解した。これらの後の段階で
使用したすべての水溶液は0.22μｍフィルターで予め濾
過しておいた。またピペットのチップは使用する前に濾
過滅菌された水で洗浄しておいた。精製された挿入した
DNA濃度は、既に量のわかっているバクテリオファージ
のλDNAをアガロースゲル上でエチジウムブロマイドで
染色させ、これを比較することによって測定した。挿入
したDNAは制限酵素地図によって精製具合を確認した。
A2.AATA−pSS1tgXSα1ATの構築 AATAの構築は国際特許出願番号WO−Ａ−8800239（フ
ァルマセティカルプロテインズLtd（Pharmaceutical Pr
oteins Ltd））に記載されたBLG−FIX又はpSS1tgXSFIX
の構築と類似している。AATAの作製の概要については、
pSS1tgXSTARGの一般的な構築の２番目の実施例として国
際特許出願番号WO−Ａ−8800239（ファルマセティカル
プロテインズLtd（Pharmaceutical Proteins Ltd））の
実施例２に記載されている。AATAの構築の最初の段階
（すなわちプラスミドpSS1tgSEα1ATの作製）は“A1"に
記載されている。
A3.BLG−BLG−pSS1tgXSDELTAClaBLGの構築（図7,8を参
照） この構築は、FIXA及びAATA（一般的にはpSS1tgXSTARG
として記載され、具体的には特許WO−Ａ−8800239中のB
LG−FIX及びBLG−AATとして記載される）に類似してい
る。すなわち、ヒツジβ−ラクトグロブリンの相補的DN
AをpSS1tgXSDELTAClaの最初のエクソン中のPvu II部位
に挿入した（下記参照）。pSS1tgXSDELTAClaは、BLG−B
LG及び転写されるポリペプチドの未成熟な終結部の２つ
の推測されるシストロンのメッセージ中の２番目の塩基
の読み取り枠中で枠の移動を引きおこすエクソン３中に
あるCla Iの制限酵素認識部位が欠損したpSS1tgXSの変
異である。２つの塩基の読み取り枠をコードしているポ
リペプチドが欠損するためにこのような方法で２番目の
塩基の読み取り枠を故意に破崩する必要があった。この
ような構築物を作製するために全長のBLGの相補的DNAを
まず作製しなければならなかった。
pUC βlacA オズウエルDNAサービス（Oswell DNA Service）、デ
パートメントオブケミストリー（Department of Chemis
try）、ユニバーシティオブエジンブルグ（University
of Edinburgh）によって合成され、ヒツジβ−ラクトグ
ロブリンの相補的DNA配列の117から159塩基（ガエ（Gay
e）そ（1986）、バイオケミー（biochemie）vol.68、ペ
ージ1097〜1107）を含む２つの相補的な44ケのオリゴヌ
クレオチドはSal IとSty Iの相補的な末端に持つように
アニーリングされた。アニーリングされたオリゴヌクレ
オチドをさらにT4 DNAリガーゼを用いて等モル量のゲル
で精製されたβ−Lg931（ガエ（Gaye）らによる引用
量）の457bp Sty I−Sma I断片及びSal I−Sma Iで消化
され、ゲルで精製されたpUC19（ファルマシア−LKBバイ
オテクノロジー（Pharmacia−LKB Biotechnology、ファ
ルマシアハウス（Pharmacia House）、ミッドサマーボ
ウレバード（Midsummer Bolevard）、セントラルミルト
ンキーナス（Central Milton Keynes）、ブックス（Buc
ks）、MK9 3HP、UK）に連結させた。エシェリキアコリJ
M83（メッシング（Messing）（1979）によるリコンビナ
ントDNAテクニカルブリテン（Recombinant DNA Technic
al Bulletin）、NIHパブリケーション（Publication）N
o.79−99、２、No.2（1979）、43〜48参照）のコンピテ
ント細胞に形質転換した後、目的とする組換え体は制限
酵素による分析によって決定された。
pUC βlacB Sph I及びStu Iで消化されたpUC βlacAをT4 DNAリガ
ーゼを用いて等モルのpSS1tgSE（特許WO−ａ−8800239
に記載）からゲルで精製した163bp Sph I−Stu I断片に
連結させた。大腸菌JM83のコンピテント細胞に形質転換
した後、目的とする組換体は制限酵素による分析によっ
て決定された。
pSS1tgXSDELTACla 大腸菌DL43のコンピテント細胞（表現型はdam-,dc
m-。また、GM119とも呼ばれており、D.リーチ教授（Dr.
D.Leach）、デパートメントオブモレキュラーバイオロ
ジー（Department of molecular Biology）、ユニバシ
ティオブエジンブルグ（Lniversity of Edinburgh）、
ウエストメインロード（West Main Road）、エジンブル
グ（Edinburgh）EH9、英国よりのおくりもの）にプラス
ミドpSS1tgXSに形質転換した後、プラスミドDNAを単離
し、Cla Iで完全消化した。DNA末端を、1mMヘキサミン
コバルトクロライド、25mM KCIの存在下で（［セルフラ
イゲーションを促進させるため、（ルッシュとハワード
フランダース（Rusche ＆ Howard−Flanders）（1985）
ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Researc
h）13、1997〜2008）］T4 DNAリガーゼによる直結の前
に過剰のdNTP'sの存在下で大腸菌のDNAポリメラーゼの
クレノウフラグメントを用いて、末端修復した。連結に
よる生成物はエシェリキアコリDL43のコンピテント細胞
に形質転換された後、Cla Iの組換え体が制限酵素によ
る分析によって決定された。
pSS1tgSE−BLG Pvu IIで完全消化し、ウシ腸のフォスファターゼ（BC
L）によって脱リン酸化した後等モルのゲルで精製され
たpSS1tgSEをT4 DNAリガーゼを用いてpUCAlacBのゲルで
精製された580pbのPvu II−Svu断片に連結した。エシェ
リキアコリDH5αのコンピテント細胞（ギブコ−BRL（Gi
bco−BRL））に形質転換した後、目的とする組換え体を
制限酵素による分析によって決定した。
PSE−BLG−３′ Eco R Iで完全に消化した等モルのゲルで精製されたp
SS1tgSE−BLGをT4 DNAリガーゼを用いて、pSS1tgSXDELT
AClaをEco R Iで部分消化したもののうち、３つ（〜4.3
−5.3kb）のゲルで精製した生成物に連結した。エシェ
リキアコリDH5α（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））のコン
ピテント細胞に形質転換した後、目的とする組換体を制
限酵素による分析によって決定した。
pSS1tgXSDELTAClaBLG PSE−BLG−３′のゲルで精製された約3kb Sph I−Hin
d III断片をT4 DNAリガーゼを用いてpSS1tgDELTAphXS
（ベクターpPoly1のポリリンカー中のSph I制限酵素認
識部位を欠損したpSS1tgXSの誘導体）の等モルのゲルで
精製した約9.6kbのSph I−Hind III断片に連結した。エ
シェリキアコリDL43のコンピテント細胞に形質転換した
後、目的とする構築物は制限酵素による分析によって決
定された。
微量注入のためのDNA断片の単離 pSS1tgXSDELTAClaBLGをBg III及びXba Iで完全に消化
し、ベクターの挿入部を切り出した。この挿入部を電気
泳動によるアガロースゲルから透析膜に回収した（スミ
ス（1980）をメソットインエンザイモロジー（Methods
in Enzymology）65、371−380）。膜より離脱させた
後、DNAをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈殿させ、微小注入のために100μの水に再度
溶解させる。
A4.AATC−pSS1pUCXSTGA.AAT（図９参照） この構築物はヒツジβ−ラクトグロブリン（BLG）遺
伝子の２番目のエクソンに挿入されたヒトα１−アンチ
トリプシンをコードした相補的配列を含んでいる。目的
はBLGのプロモーターより１サイト離れたAATの相補的DN
A配列を挿入することによって発現量が増加するか否か
を決めることであった。そして、この構築物はBLG遺伝
子の完全な最初のエクソン及び最初のイントロンからな
る。この構築物には最初のBLGエクソン（つまりAATをコ
ードしている配列の前）中に２つのATGコドン（正常のB
LG開始のメチオニンを含む）があるので、枠内の（‘in
−flame'）終結コドン（TGA）はBLGとAATの間の結合部
位で誘導された。BLGとAATの間の融合タンパクの生成を
防止する必要があると考えられた。AATタンパクを目的
の転写物から生成するために、転写の再開始（AATの元
々の開始ATGでの）がこのコドンで終結した後に行なわ
れなければならないと考えられる。
pSS1tgSE.TGA ２つのオリゴヌクレオチド（５′CTTGTGATATCG3′及
び５′AATTCGATATCAC3′）がオズウエルDNAサービス（O
swell DNA Service）、デパートメントオブケミストリ
ー（Department of Chemistry）、ユニバシティオブエ
ジンブルグ（University of Edinburgh）によって合成
された。アニーリング後、オリゴヌクレオチドはTGA終
止コドン及びEco R V部位を含み、Sty I及びEco R I部
位の付着端を持つ。アニーリングされたオリゴヌクレオ
チドはpSS1tgSE（pSS1tgSEは国際特許出願番号WO−Ａ−
8800239（ファルマセティカルプロテインズLtd（Pharma
ceutical Proteins Ltd）に記載されている）から単離
された約3.2kbのゲルで生成されたSty I−Eco R I断片
に連結された。BLG−エクソンIIの20〜25ヌクレオチド
からなり、プラスミドpSS1tgSE.TGAを生成し、さらにそ
の中にはTGA終止コドンがBLGをコードしている配列と共
に枠内にある（‘in flame'）Sty I部位での配列を挿入
した。BLGのSty I部位の３′側の配列はこの段階でヌク
レオチドに変っている。この連結による生成物は、アン
ピシリン耐性にエシェリキアコリDH5α（ギブコ−BRL
（Givco−BRL））を形質転換するために用いられた。目
的となるクローン（pSS1tgSE.TGA）は制限酵素による分
析−特にEco R I及びSph I部位の保持及びEco R V部位
の獲得−によって同定された。
pSS1tgSpX.TGA pSS1tgSE.TGAをEco R Iで切断し、付着末端を過剰のd
NTPsの存在下でエシェリキアコリDNAポリメラーゼのク
レノウフラグメント中に入れることによって末端修復さ
れた。末端修復後、調製物をSph Iで切断し、約800bpの
挿入断片（Sph I）Eco R I（ブラント末端）をゲル上で
単離した。プラスミドpBJ7（本特許では下記のA4を参
照）をSph I及びPvu IIで切断し、さらに大きな断片
（約4.3kb）を単離した。この断片は、pPolyベクター配
列を含むことに注意する。pSS1tgSE.TGAより切り出され
たSph I−Eco R I断片（ブラント末端）を、T4 DNAリガ
ーゼを用いてpBJ7より単離したSph I−Pvu II断片に連
結し、連結された生成物は、アンピシリン耐性にエシェ
リキアコリDH5α（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））を形質
転換するために用いられた。目的とする組換えプラスミ
ドpSS1tgSpX.TGAはBLG遺伝子のエクソンＩ、イントロン
Ｉ、エクソンIIの一部、オリゴヌクレオチド、エクソン
５の一部及びエクソン６と７を含んでおり、制限酵素に
よる分析によって同定された。
pSS1pUCXS.TGA 約4.2kbのBLGの５′側のSal I−Sph I断片をpSS1tgXS
（WO−Ａ−8800239）より単離し、等モルのpSS1tgSpX.T
GAのSph I−Xba I挿入部及びSal I−Xba Iで切断された
プラスミドベクターpUC18（ファルマシア−LKBバイオテ
クノロジー（Parmacia−LKB biocechnology）、ファル
マシアハウス（Pharmacia House）、ミッドサマーボウ
レバード（Midsummer Boulevard）、セントラルミルト
ンキーナス（Central Milton Keynes）、ブックス（Buc
ks）、MK9 3HP、UK）に連結された。連結された生成物
はアンピシリン耐性にエシェリキアコリDH5αギブコ−B
RL（Gibco−BRL））を形質転換するために用いられた。
目的とするクローンであるpSS1pUCXS.TGAは制限酵素に
よる分析によって同定された。
pSS1pUCXSAAT.TGA（AATC） pSS1pUCXS.TGAは、枠内（‘in flame'）のTGAより1bp
下流のプラスミドを切断する２番目のエクソン中に挿入
された単一のEco R V部位（オリゴヌクレオチド由来）
を含んでいる。これゆえ、相補的DNAを２番目のエクソ
ン中のBLG配列の下流のプラスミド中に挿入することが
できる。このことは、pUC8α1AT.73（この特許はA1を参
照）由来のAcc I−Hind III断片をEco R V部位に挿入さ
れたpSS1pUCXSAAT.TGA（AATC）の構築によって例示され
ている。pUC8α1AT.73のプラスミド（A1に記載）をAcc
I及びHind IIIで消化し、ポリアデニル化シグナルの欠
けたα１−アンチトリプシンの相補的DNAを含む生成断
片を過剰のdNTPsの存在下でエシェリキアコリDNAポリメ
ラーゼのクレノウフラグメントを用いて末端修復した。
このブラント端断片はゲルで精製され、T4 DNAリガーゼ
を用いてゲルで精製したEco R Vで切断したpSS1pUCXS.T
GAに連結し、さらに再度環化しないように脱リン酸化を
行なった。この連結した生成物をエシェリキアコリDH5
αのコンピテント細胞（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））
に形質転換した後、目的とするクローンを制限酵素によ
る分析によって決定した。
A5.AATD（pBJ16）の構築（図10参照） この構築物はBLG配列側にヒトのα１−アンチトリプ
シンの相補的DNAを含んでいる。この５′−フランキン
グ配列はAATA及びAATBにも存在するSal IからPvu II−
０までのBGL配列を含んでいる。BLGとAAT配列の間の融
合点はAATA、FIXA、及びAATBの場合と同様、BLGの最初
のエクソンの５′−転写されない領域中に存在する。ま
た、３′−フランキング配列はBLGのエクソン６及び7Xb
a I部位までのBLG遺伝子の３′−フランキング配列より
なる。この構築物はイントロンがなく、上記の５′及び
３′側のBLG配列がAATの時に例示されたようにヒトの血
漿タンパク質をコードしている相補的DNAのヒトに特異
的な発現に十分直接効果があるかどうかを検討するため
に作製された。
プラスミドpSS1tgSpX pSS1tgXS（特許WO−Ａ−8800239に記載）の約6.6kbの
ゲルで精製されたShp I−Xba Iの制限酵素切断断片は、
T4 DNAリガーゼを用いて、Sph I及びXba Iで消化したゲ
ルで精製したpPoly I（ラテ、ビロッテ及びクラーク（L
athe,Villote ＆ Clark）、1987、ジーン（Gene）57、1
93−201）（また特許WO−ａ−8800239に記載）に連結さ
れた。［ベクターpPoly Iは、R.ラテ教授（Professor
R.Lathe）、エルジーエムイー−シーエヌアールエスエ
ンドU184アイエヌエスイーアールエム（LGME−CNRS and
V184 INSERM）、11、ルーヒューマン（rue Humann）、
67085、ストラスブルグ（Strasbourg）、フランスより
いただき、自由に使用できる］エシェリキアコリDHRα
のコンピテント細胞（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））に
形質転換した後、目的とするクローンを制限酵素による
分析によって決定した。
プラスミドpBJ5 pSS1tgSpXの元の複製を含むゲルで精製されたPvu II
で切断された断片を1mMヘキサミンコバルトクロライド
及び25mM KCIの存在下で［自己連結を促進するため、
（ルッシュアンドハワード−フランダース（Rusche ＆
Howard−Flanders）（1985）ヌクレイックアシッドリサ
ーチ（Nucleic Acids Research）13、1997−2008）］T4
DNAリガーゼを用いて自己連結させた。エシェリキアコ
リDHRα（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））のコンピテント
細胞に形質転換した後、目的とするクローンを制限酵素
による分析によって決定した。
プラスミドpUC βlacA 実施例1.A3のpUC βlacAの記載を参照。
プラスミドpBJ7 pUC βlacAよりゲルで精製したHinc II−Sma I切断断
片をSma Iで部分消化し、直線状にし、ゲルで精製したp
BJ5にT4 DNAリガーゼを用いて連結した。エシェリキア
コリDH5α（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））のコンピテン
ト細胞に形質転換した後、目的とするクローンを制限酵
素による分析によって決定した。
プラスミドpBJ8 pBJ7より元の複製を含むゲルで精製したPvu II切断断
片を1mMヘキサミンコバルトクロライド及び25mM KCIの
存在下で［自己連結を促進させるため（ルッシュアンド
ハワード−フランダース（Rusche ＆ Howard−Flander
s）（1985）ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic A
cids Research）13、1997〜2008）］T4 DNAリガーゼを
用いて自己連結した。エシェリキアコリDHRα（ギブコ
−BRL（Gibco−BRL））のコンピテント細胞に形質転換
した後、目的とするクローンを制限酵素による分析によ
って決定した。
プラスミドpBJ12 プラスミドpUC8α1AT.73（上記A1に記載）をAcc I及
びHind IIIで消化し、ポリアデニル化シグナルを欠いた
α１−アンチトリプシンの相補的DNAを含む生成断片を
過剰のdNTPsの存在下でエシェリキアコリDNAポリメラー
ゼのクレノウフラグメントを用い末端修復した。このブ
ラント端断片をゲルで精製し、T4 DNAリガーゼを用いて
Pvu IIで直線化され、ゲルで精製したpBJ8に連結した。
エシェリキアコリDH5α（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））
のコンピテント細胞に形質転換した後、目的とするクロ
ーンを制限酵素による分析によって決定した。
プラスミドpBJ1 プラスミドpSStgSpS（本特許中のA7に記載参照）をBg
IIIで消化し、過剰のdNTPsの存在下でエシェリキアコ
リDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて末
端を修復した。ブラント端をHind IIIの合成リンカー
（ニューイングランドバイオラブスインク（New Englan
d Biolabs Inc）、32トーチァーロード（Tozer Roa
d）、ビバリー（Beverly）、MA01915−5510、USA）を用
いて修飾し、生成断片を1mMヘキサミンコバルトクロラ
イド、25mM KCIの存在下で［自己連結を促進するため
（ルッシュアンドハワード−フランダース（Rusche ＆
Howard−Flanders）（1985）ヌクレイックアシッドリサ
ーチ（Nucleic Acids Research）13、1997−2008）］T4
DNAリガーゼを用いて自己連結した。エシェリキアコリ
DHRα（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））のコンピテント細
胞に形質転換した後、目的とするクローンを制限酵素に
よる分析によって決定した。
プラスミドpBJ16（AATD） pBJ1はゲルで精製されたHind III−Sph I断片及びpBJ
12よりゲルで精製されたSph I−Xba I断片をHind III及
びXba Iで消化し、ゲルで精製したpUC19（ファルマシア
−LKBバイオテクノロジー（Pharmacia−LKB Biotechnol
ogy、フアルアシアハウス（Pharmacia House）、ミッド
サマーボウレバード（Midsummer Boulevard）、セント
ラルミルトンキーナス（Central Milton keynes）、ブ
ックス（Bucks）、MK9 3HP、UK）にT4 DNAリガーゼを用
いて連結した。エシェリキアコリDH5α（ギブコ−BRL
（Gibco−BRL））のコンピテント細胞に形質転換した
後、目的とするクローンを制限酵素による分析によって
決定した。
微量注入のためのpBJ16からのAAT−Ｄ断片の単離 プラスミドpBJ16をHind III及びXba Iで消化し、生成
した8.0kbのAATD断片をDE81紙（ドルチェン（Dretzen）
ら、（1981）アナリティカルバイオケミストリー（Anal
ytical Biochemistry）112、285−298）を用いて、ゲル
より単離した。DE81紙より分離した後、DNAをフェノー
ル／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、微
小注入のためにTEバッファー（10mMトリス塩酸、1mM ED
TA、pH8）に最終的には再溶解させた。
A6.FIXD−pBJ17の構築 ペプチドがコードしているDNA配列がファクターIX（F
actor IX）をコードしている以外は実施例1A5（AATDの
構築）の方法と同様にして行なう。p5′G3′CVI［国際
特許出願番号WO−Ａ−8800239（ファルマセティカルプ
ロテインズリミテッド（Pharmaceutical Proteins Lt
d））参照］の1553bpの挿入部位からなるNhe I−Hind I
II断片をpBJ12として上記に示したようにpBJ8のPvu II
部位に挿入した。
A7.DELTA−A2−pSS1tgXDELTA−Ava II（DELTA A2）の構
築 この構築物は、乳汁を分泌している間形質転換したマ
ウス中に組織特異的に発現するタンパク質として表われ
る最小限のヒツジβ−ラクトグロブリン配列を含んでい
る。この構築物の完全な配列は、ハリス、アリ、アンダ
ーソン、アーチバルドエンドクラーク（Harris,Ali,And
erson,Archibald ＆ Clark）（1988）、ヌクレイックア
シッドリサーチ（Nucleic Acids Research）16（出版
中）に示されている。
プラスミドpSS1tgSpS pSS1tgXS（特許WO−ａ−8800239に記載）より単離さ
れた約4.2kbのゲルで精製されたSal I−Sph I切断断片
を、Sal I及びSph Iで消化された等モルのゲルで精製さ
れたpPoly I（ラテ、ビロッテ＆クラーク（Lathe,Vilot
te ＆ Clark）、1987、ジーン（Gene）57、193−201）
と、T4 DNAリガーゼを用いて連結させた。［ベクターpP
oly IはR.ラテ教授（Professor R.Lathe）、エルジーエ
ムイー−シーエヌアールエスエンドU184アイエヌエスイ
ーアールエム（LGME−CNRS and U184 INSERM）、11ルエ
ヒューマン（rue Humann）、67085ストラスブルグ（Str
asbourg）、フランスよりいただき自由に使用できる］
エシェリキアコリDH1（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））の
コンピテント細胞に形質転換した後、目的とするクロー
ンを制限酵素による分析によって決定した。
プラスミドpSS1tgSpDELTA−Ava II プラスミドpSS1tgSpSをAva Iで部分消化した後、Sal
Iで完全消化した。生成したDNA断片の両端を、過剰のdN
TPsの存在下でエシェリキアコリDNAポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントを用いて末端修飾した。1mMヘキサア
ミンコバルトクロライド及び25mM KCIの存在下で［自己
連結を促進するため、（ルシュアンドハワード−フラン
ダース（Rusche ＆ Howard−Flanders）（1985）ヌクレ
イックアシッドリサーチ（Nucleic Acids Research）1
3、1997−2008）］T4 DNAリガーゼを用いて連結した
後、DNAをエシェリキアコリDH1（ギブコ−BRL（Gibco−
BRL））のコンピテント細胞に形質転換した。目的とす
るAva I欠損組み換え体を制限酵素による分析によって
決定した。
プラスミドpSS1tgXDELTA−Ava II pSS1tgSpDELTA−Ava IIよりゲルで精製した約800bpの
Sph I−Bg III断片及びpSS1tgXSの約6.5kbのSph I−Xba
I断片、及びBg IIIとXba Iで消化されたpPoly Iをおお
よそ等モルの割合いでT4 DNAリガーゼを用いて連結し、
エシェリキアコリDH1（ギブコ−BRL（Gibco−BRL））の
コンピテント細胞に形質転換した。目的とする組換え体
は制限酵素による分析によって決定した。
注入のためのDNA断片の単離 pSS1tgXDELTA−Ava IIをBg III及びXba Iで完全消化
し、ベクターから約7.4kbの挿入断片を切り出した。挿
入断片はDE81紙（ドレチェン（Dretzenら、（1981）ア
ナリティカルバイオケミストリー（analytical Biochem
istry）、11、295〜298）を使用してアガロースゲルよ
り回収した。DE81紙より分離した後、DNAをフェノール
／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた後、
微小注入のために100μ TEバッファーに再溶解した。
その他の方法としては、挿入断片を電気泳動によるアガ
ロースゲルより透析膜に回収した。（スミス（Smith）
（1980）メソッドインエンガイモロジー（Methods in E
nzymology）65、371−380）膜より溶出させた後、DNAを
フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿
させた後、微量注入用として100μ水に再溶解させ
た。
B.形質転換動物の構築 マウス ホーガン、コンスタンチニとレイシーの記載方法と類
似方法で行なう（Hogan,Constantini and Lacy in “Ma
nipulating the Mouse Embro:A Laboratory Manual"Col
d Spring Harbor Laboratory（1986））。
受精卵の収集 受精卵の収集に使用されるマウスは、マウスのC57BL/
6とCBAとの同系交配のF1ハイブリッドである。メスC57B
L/6とオスCBAは、ハーランオラック社（Harlan Olac Lt
d,Shaw's Farm,Bicester 0x6 OTP,England）から得て、
F1ハイブリッドの同系交配に使用した。マウスから光を
調節した条件下で育てた（03.00時間光をあてて、17.00
時間光をさえぎった）。超排卵を誘発するために、成人
メスマウスには蒸留水0.1ml中のプレグナントマーレス
セラムゴナドトロピン（Pregnant Mares Serum Gonadot
ropin,Cat.No.4877,Sigma Chemical Company,Poole,Dor
set,England）の５国際単位を15.00時に注射し、46〜48
時間後に0.1ml蒸留水中のヒトコリオニックゴナドトロ
ピン（HCG,Human Chorionic Gonadotropin,Cat.No.CG−
10,Sigma Chemical Company,Poole,Dorset,England）の
５国際単位を注射した。HCG注射後、交配のためにメス
は個々に成熟C57BL/6×CBAF1オスと育てた。翌朝、交配
したメスは膣栓の存在によって確認される。
交配したメスは、頚部脱臼により殺される。その後の
全工程は、細菌と菌類の汚染を避けるように警告して行
なう。
卵管は除かれ、M12培養培地上に置かれる（Hogan,Con
stantini and Lacy“Manipulating the Mouse Embryo:A
Laboratory Manual"Cold Spring Harbor Laboratory
（1986）pp254−256）。つぼ状の卵管から受精卵を切り
取って300μg/mlのハイアルロニダーゼを含有するM2（T
ype IV−S,Cat.No.H3884,Sigma Chemical Company,Pool
e,Dorset,England）へ入れ、受精卵を囲む細胞の塊を除
く。卵から塊が除かれると、ハイアルロニダーゼがなく
なるまで洗浄され、注射されるまで湿度調整されたイン
キュベーターかまたは95％空気、５％CO2の雰囲気下
で、鉱物油（Cat.No.400−5,Sigma Chemical Company,P
oole,Dorset,England）のもとの１滴（100〜200μ）
の培地No.16（Hogan,Constantini and Lacy“Manipulat
ing the Mouse Embryo:A Laboratory Manual"Cold Spri
ng Harbor Laboratory（1986）pp254−255、and 257）
の存在下で37℃において保持される。
DNA注射 注射されるDNAは、0.2μｍ細孔径フィルター（Cat.N
o.SM 16534,Sartorious,18 Avenue Road,Belmont,Surry
SM2 6JD,england）のロ過で予め無菌化したアナラール
水（Analar water,Cat.No.10292 3C,BDH Chemicals,Bur
mfield Avenue,Glasgow G467TP,Scotland）でほぼ1.5μ
g/mlに希釈される。DNAと希釈剤の取り扱いに使用する
全てのマイクロピペットチップ（先端）とマイクロ遠心
分離試験管を0.2μｍロ過水で洗浄し、注射ピペットを
潜在的に閉塞する微粒子を除く。希釈DNAを12000×ｇで
少なくとも15分間遠心分離にかけ、いかなる微粒子をも
沈降または浮かび上がらせた。水面直下から20μアリ
コートを除き、注射ピペットを充填するために使用す
る。
使用する日と同日に、注射用ピペットは、マイクロエ
レクトロ−トプラー（Campden Instruments,186 Campde
n Hill Road,London,England）を使用してフィラメント
（Cat.No.GC100TF−15;Clark Electromedical Instrume
nts,PO Box 8,Pangbourne,Reading,RG8 7HU,England）
で15cmの長さ、1.0mm外直径、薄壁、ホウケイ酸ガラス
キャピラリーから作られる。DNA（約１μ）は幅広い
末端において注射ピペットに導入され、フィラメントに
沿ってキャピラリー作用でチップへ運ばれる。DNA溶液
から水の蒸発を防ぐために、約20μフルロリナート
（Fluorinert）FC77（Cat.No.F4758,Sigma Chemical Co
mpany,Poole,Dorset,England）はDNA溶液上に広げられ
る。満たされた注射ピペットは必要になるまで４℃で保
存される。
保存ピペット（微小注射用に卵を固定するために使
う）は、10cmの長さ、1.0mm外径、ホウケイ酸ガラスキ
ャピラリー（Cat.No.GC100−10;Clark Electromedical
Instruments,PO Box 8,Pangbourne,Reading RG8 7HU,En
gland）から作る。ガラスは小さな炎上で熱し、手で引
張って80−120μｍ直径、２−4cm長さのセクションを有
するように作る。ベンド（bends）をピペットに入れ、
ガラスを切り、チップは小炉で磨いた（Research Instr
uments,Kernick Road,Penryn TR10 9DQ,England）。
カバースリップチェンバーは卵を手ぎわよく処理する
ように作られる。カバースリップチェンバーの基礎は26
×76×（１−1.2）mm顕微鏡スライド（Cat.No.ML330−1
2,A and J Beveridge Ltd,5 Bonnington Road Lane,Edi
nburgh EH6 5BP,Scotland）であり、製造業者の指示に
従って２％ジメチルジクロロシラン（Cat.No.33164 4V,
BDH Chemicals,Burnfield Avenure,Glasgow G46 7TP,Sc
otland）でケイ素化されている。２枚のガラス支持体
（25×３×1mm、顕微鏡スライドから切った）は、スラ
イドの長い方に平行でかつ約2mm、スライドの長さに沿
った半分に、高真空シリコーングリース（Cat.No.33135
3N,BDH Chemicals,Burnfield Avenue,Glasgow G46 7T
P,Scotland）でスライドに固定される。さらに、２枚の
ガラス支持体は最初の対の頂上で固定され、頂上表面は
シリコーングリースを塗る。培地M2（300μ）をピペ
ットで支持体間の隙間へ入れ、22×22mmカバースリップ
（Cat,No.ML544−20,A and J Beveridge Ltd,5 Bonning
ton Road Lane,Edinburgh EH6 5BP,Scotland）は支持体
上へ降ろし、グリースでシールする。ダウ−コーニング
流体（50cs）（Cat.No.63006 4V,BDH Chemicals,Burnfi
eld Avenue,Glasgow G46 7TP,Scotland）をピペットで
チェーンバーの開口端から入れて培地を覆う。
卵のバッチ（30〜100）をマニピレーションのために
カバースリップチェンバーに投入する。そのチェンバー
は顕微鏡に取り付けられており（Diapoht,Nikon（UK）L
td,Haydrooke,Telford,Shropshire,England）、その顕
微鏡には４×明視野、10×位相差および40×微分干渉差
（DIC）対物レンズと10×アイピースが取り付けられて
いる。機械ミクロマニピレーター（Cat.Nos.520 137と5
20 138,E.Leitz（Instruments）Ltd,48 Park Street,Lu
ton,England）は顕微鏡の近くに取りつけられており、
保持ピペットおよび注射ピペットの位置を制御するため
に使用される。
保持ピペットとDNA含有注射ピペットは修正インスツ
ルメントチューブ（Cat.No.520 145,E.Leitz（Instrume
nts）Ltd,48 Park Street,Luton,England）に設けられ
ており、それぞれ単一ユニット（Cat.No.520 142,E.Lei
tz（Instruments）Ltd,48 Park Street,Luton,Englan
d）と二重ユニット（Cat.No.520 143,E.Leitz（Instrum
ents）Ltd,48 Park Street,Luton,England）インスツル
メントホルダーを介してミクロマニピレーター上に順に
設けられている。インスツルメントチューブは、クレイ
アダムス「イントラメディック（Intramedic）」アダプ
ター（0.2−3.5mm tubing to female Luer,Cat.No.7543
D,Arnold R.Horwell Ltd,2 Grangeway,Kilburn High Ro
ad,London NW6 2BP,England）へ接着することによって
修正され、それはインスツルメントチューブを約2mのポ
リエチレンチューブに結びつけるために使用され（1.57
mm内径、2.9mm外径、Cat.No.F21852−0062,R.B.Radley
＆ Co.Ltd,London Road,Sawbridge worth,Herts CM21 9
JH,England）、さらに「イントラメディック」アダプタ
ーはポリエチレンチューブ他端に接続して保持ピペット
と注射ピペットを制御するために使用されるシリンジへ
の接続を促進するように使用される。
注射は20mlまたは100mlのガラスシリンジ（Cat.Nos.M
611/20とM611/31,Fisons,Bishop Meadow Road,Loughbor
ough LE11 ORG,England）で制御され、そのプランジャ
ーには高真空シリコーングリース（Cat.No.331353N,BDH
Chemicals,Burnfield Avenue,Glasgow G46 7TP,Scotla
nd）が若干付けてある。
卵の保持はアグラマイクロメーター（Cat.No.MS01,We
llcome Diagnostics,Temple Hill,Dartford DA1 5AH,En
gland）で制御され、プランジャー周囲の軽いスプリン
グで固定されている。アグラシリンジは３方向ストップ
コック（Cat.No.SYA−580−L,Gallenkamp,Belton Road
West,Loughborough LE11 OTR,England）を介して「イン
トラメディック」アダプターに接続されており、そのス
トップコックの第３の部分はフルロリナート（Fluorine
rt）FC77（Cat.No.F4758,Sigma Chemical Company,Pool
e,Dorset,England）容器に接続され、それはアグラシリ
ンジ、ポリエチレンチューブ、インスツルメントチュー
ブと保持ピペットを満たしている。
注射ピペットのチップは保持ピペットに対して折り取
られており、DNA溶液を自由に通過させ、かつ、卵に対
する致命的な損傷なしに注射を許容する大きさ（１μ
ｍ）にチップの直径を増大させてある。DNAのピペット
のチップを通過する流れは、位相差条件で観察すること
で調べられ、一方圧力は注射シリンジに適用される（DN
A溶液はピペットのチップから生ずる明るい羽毛状とし
て現われるだろう）。
１個ずつ受精卵を保持ピペットに取り上げ、１若しく
は両方の前核は注射ピペットと同一焦点に設定される
（40倍の対物とDIC条件を使用する；対物補正リングは
最適分解能を得るように調整される）。注射ピペットは
核小体を避けるように前核の１つに挿入し、注射シリン
ジに加圧し、前核膨潤が観察されるとただちに圧力を解
放し、注射ピペットをすぐに引き抜く。ピペットが詰ま
ると、注射シリンジに高圧を適用しまたはチップの他の
部分を切って封鎖上体は解消される。封鎖状態が解消さ
れず、またはピペットチップがよごれれば、ピペットを
変える。
注射後、卵は５％CO2雰囲気下、油のもとでNo.16培地
で一夜培養される。１夜培養中に二つの細胞に分割する
卵は、偽妊娠の育ての母に移植される。
ランダム−ブレッドアルビノ（MF1,Harlan Olac Ltd,
Shaw's Farm,Bicester,0x6 OTP,England）メスマウス
は、精管切除（Hogan,Constantini and Lacy“Manipula
ting the Mouse Embryo:A Laboratory Manual"Cold spr
ing Harbor Laboratory（1986）;Rafferty,“Methods i
n experimental embryology of the mouse",The Johns
Hopkins Press,Baltimore,USA（1970））MF1オスマウス
と交配させた。超排卵ドナーの交配より１日遅れて交配
は行なわれる。翌朝検出可能な膣栓を有するMF1メスは
育ての母として使用される。育ての母の理想体重は、25
〜30gである。各育ての母はフレックネル（Flecknell,V
eterinary Record,113,574）（Hypnorm:Crown Chemical
Co Ltd,Lamberhurst.Kent TN3 8DJ,England;Hypnovel:
Roche Products Ltd,PO Box 8,Welwyn Garden City,Her
ts AL7 3AY,England）の勧める濃度2/3でハイプノーム
／ハイプノーベル（Hypnorm/Hypnovel,10μ/gの体
重）の腹腔内注射によって麻酔をかけ、20〜302−細胞
卵はホーガン、コンスタンチニとレイシイの記載方法に
よって１卵管へ転移させる（Hogan,Constantini and La
cy,“Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Ma
nual"Cold Spring Harbor Laboratory（1986）。任意に
卵巣嚢からの瀉血を最少にするために、蒸留水に溶解し
た0.2μの0.01％（W:V）エピネフリン酒石酸水素塩
（Cat.No.E4375,Sigma Chemical Company,Poole,Dorse
t,England）は、断裂前数分に卵巣嚢へ適用する。養育
母は自然に子孫を分娩し、卵転移19日迄に分娩しなけれ
ば子宮摘出によって子供を分娩させて育てる。正常なマ
ウス畜産に続き、子供を３〜４週令で離乳させ、同性の
他のマウスとだけで育てる。
形質転換メスマウスは、標準的な方法および／または
ミルクおよびRNAの収集によって、形質転換マウスのそ
の後に生ずる世代を育てるために使用してよい。
形質転換オスマウスは、標準的な方法によって形質転
換マウスのその後の世代を育てるために使われる。その
後の世代の形質転換マウスは、下記の如く、尾から調製
されたDNA分析によって確認される。
ヒツジ 形質転換羊の出産は、国際特許出願WO−Ａ−8800239
（Pharmaceutical Proteins Ltd）およびサイモンス、
ウイルマット、クラーク、アーキバルド、ビショップと
ラーセ（Simons,Wilmut,Clark,Archibald,Bishop ＆ La
the（1988）Biotechnology 6,179−183）によって詳細
に記載されている。
C.形質転換個体の確認 マウス 子が少なくとも４週令の時、尾の生検材料はDNA調製
用に採用される。その子は、フレックネル（Flecknell,
Veterinary Record,113,574）の勧める濃度1/2でハイプ
ノーム／ハイプロベル（Hypnorm/Hyprovel,10μ／体
重1g）の腹腔内注射で麻酔処置される。麻酔後、尾の１
部（１−2cm）をブンゼンバーナーで熱した小刀で切断
して除く。熱した小刀は傷を焼灼し、瀉血を防ぐ。
尾のセグメントは、37℃で振盪しながら１夜テールバ
ッファー（0.3M Naアセテート（未検定）、10mM Tirs−
HCl pH7.9、1mM EDTA pH8.0、１％SDS）中でプロテアー
ゼK200μg/ml（Sigma）を用いて消化した。翌日、消化
物を簡単に撹拌して破片を分解する。アリコートの消化
した尾をフェノール／クロロホルムで１度抽出し、クロ
ロホムで１度抽出し、その後DNAを等容量のイソプロパ
ノールで沈降させて回収する。
「テノールDNA」を制限酵素で消化し、アガロースゲ
ル電気泳動処理する。その後、分離DNAをアマーシャム
ハンドブック（Amersham Handbook,‘Membrane transfe
r and detection methods'（P1/162/86/8 published by
Amersham International Plc,P0 Box 16,Amersham,Buc
kinghamshire HP7 9LL、UK）に記載の如くハイボンド
（商標）Ｎ（Amersham）ナイロンメンブランに「サザ
ン」法でブロットする。メンブランに結合したDNAは、
適切な32PラベルDNA配列（例えば構造DNA）へハイブリ
ダイズしてプローブされる。DNAプローブは、「モレキ
ュラークローニング：アラボラトリーマニュアル」
（（1982）、by Maniatis,Fritsh and Sambrook,Publis
hed by Cold Spring Harbor Laboratory,Box 100,Cold
Spring Harbor,USA）に記載の如くニックトランスレー
ション法によって32Pでラベル化する。または、DNAプロ
ーブは、ファインベルクとボーゲルシュタイン（Feinbe
rg and Vogelstein（1984）Analytical Biochemistry 1
37,266−267）の記載の方法によってランダムプライマ
ーを用いてラベル化する。簡単に言うと、プラスミドま
たはファージは適当な制限酵素で開裂し、特定フラグメ
ントをアガロースゲルから単離する。ラベル化反応は、
次の薬品を順番に加えて室温で実施する:H2O、６μ O
LB＊、1.2μ BSA、DNA（最大25ng）、４μ 32Pラベ
ルdCTP（PB10205,Amersham plc,Amersham UK）、１μ
（１ユニット）クレノウポリメラーゼ（BCL）、最終容
量30μ。
＊OLBは次組成からなる。溶液A:625μ 2M Tris,pH
8.0＋25μ 5M MgCl2＋350μ H2O＋18μ 2−メル
カプトエタノール（シグマ）；溶液B:2M HEPES（シグ
マ）、NaOHでpH6.6へ滴定；溶液C:ヘキサデオキシリボ
ヌクレオチド（Pharmacia−LKB Biotechnology Cat No.
27−2166−01）。ラベル化反応は、一夜行ない、その後
70μの停止溶液（20mM NaCl、20mM Tris pH7.5、2mM
EDTA、0.25％SDS、１μM dCTP）を加えて反応を停止さ
せる。合体はTCA沈降によって評価し、セレンコーフ（C
erenkov）放出を計数する。
ハイブリダイゼーションは、チャーチとギルバート
（Church and Gilbert（1984））の記載方法を修正して
密閉プラチックバック中で行なう。ナショナルアカデミ
ーオブサイエンスの手順（USA 81,1991−1995）。簡単
に言うと、プローブは1.5×106セレンコーフカウント／
ハイブリダイゼーションバッファー1ml（HB:0.5Mリン酸
ナトリウムpH7.2、７％SDS、1mM EDTA）濃度で使用され
る。最初に、メンブランを65℃でプラスチックバッグ中
において、HB（メンブラン20cm2当りバッファー15ml）
中で５分間プレハイブリダイズする。プローブは沸騰し
て変性し、同容量の新しいHBに加える。プラスチックバ
ッグを切ってあけ、プレハイブリダイゼーション溶液を
抜き出し、その後HB＋プローブを加え、再度バッグをシ
ールした。バッグとその内容物を65℃でロータリーシェ
イカーを用いて一夜インキュベートする。ハイブリダイ
ゼーション後、メンブランを65℃で40mMリン酸ナトリウ
ム、１％SDSと1mM EDTA中で３回、10分間洗浄し、最終
洗浄はその温度で15−30分間行なう。洗浄はポータブル
ガイガーカウンターで観察する。洗浄の精度は実験の特
別な必要性に応じて調節してもよい。最終洗浄後、メン
ブランの水分を除いて乾燥し、その後、ワットマンロ紙
上に置き、サランラップで包む。そのメンブランを−70
℃で１日若しくはそれ以上Ｘ−線カセットを用いてＸ−
線フィルム（Agfa CURIX RP−１）に露光する。
同一方法で処理された構造DNAの既知量との比較によ
って、形質転換個体からのDNAは確認でき、そしてゲノ
ムへ組込まれた構造DNAのコピー数を評価できる。
初代形質転換個体の形質転換の子を確認するために同
一方法が使用される。
ヒツジ 形質転換ヒツジの確認法は、国際出願WO−Ａ−880023
9（Pharmaceutical Proteins Ltd）に詳細に記載されて
いる。
D.発現一方法の分析 マウスミルクの補集 メスマウス（少なくとも７週令）は、交配のために成
人オスマウスと個々に育てられる。17日後、オスマウス
をかごから出し、毎日メスマウスから子供の誕生を観察
する。ミルクおよび／またはRNAは分娩後11日に収集す
る。
ミルクの収集のために、子を授乳するメスのマウスか
ら離して乳腺におけるミルクの増加を図る。少なくとも
３時間後、蒸留水0.1ml中の0.3国際単位のオキシトシン
（Sigma.Cat.No.04250）を腹腔内投与し、10分後フレッ
クネル（Flecknell,Veterinary Record,113,574）の勧
める濃度2/3でハイプノーム／ハイプノーベル麻酔（Hyp
norm/Hypnovel、体重1g当り10μ）を腹腔内投与す
る。十分に麻酔した後、乳腺をマッサージしミルクを出
し、それを50μのキャピラリー管に集める（Drummond
Microcaps,Cat.No.PP600−78,A and J Beveridge Ltd,
5 Bonnington Road Lane,Edinburgh EH65BP,Scotlan
d）。
マウスのミルクを蒸留水で1:5に希釈し、エッペンド
ルフ5415遠心分離（BDH）で処理して脂肪を除く。乳清
を作るために、1.0M HClを加えて最終pHを4.5としてカ
ゼインを沈降させ、その後エッペンドルフ5415遠心分離
で処理してそのカゼインを除く。希釈ミルクまたは乳清
試料は、不連続SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（Laemmli（1970）Nature 277,680−684）とイムノブロ
ット分析法（Khyse−anderson（1984）Journal of Bioc
hemical and Biophysical Methods 10,203−209）の前
に負荷バッファー中で沸騰して可溶化した。ヒトアルフ
ァ１−アンチトリプシン（AAT）は、ヤギ抗−AT血清［P
rotein Reference Unit,Royal Hallamshire Hospital,S
heffield SIO 2JF］とホースラディッシュペルオキシダ
ーゼに接合した抗−羊／ヤギIgG血清［Scottish Antibo
dy Production Unit,Glasgow and West of Scotland Bl
ood Transfusion Service,Law Hospital,Carluke,Lanar
kshire ML8 5ES］を用いてイムノブロットフィルター上
で確認された。
マウスミルク中のヒトアルファ１アンチトリプシン
（AAT）量は、LC−パーティゲン（partigen）ラジアル
イムノディフュージョンプレート（Behring Diagnosti
c,Hoescht UK Ltd,50 Salisbury Road,Hounslow,Middle
sex TW4 6JH］を用いて測定した。ラジアルイムノディ
フュージョン（RID）法は、体液中の８−125μg/mlのAA
Tの検出用に設計されたものであり、製造業者の指示に
従って行なわれる。標準的なヒト血清の３つの希釈液
［LC−V,Behring Dignostics］はリン酸塩緩衝液食塩水
（PBS）中で調製されて、検定の検出範囲内に入るAAT濃
度となる。
試験ミルク試料は蒸留水で1:5に希釈し、エッペンド
ルフ5415遠心分離（BDH）中で簡単にスピンして脱脂し
た。次の対照実験は、AAT検出に関するミルク環境の影
響を評価するために行なった（主に方法は血清中のAAT
の測定用に設計されている）。形質転換しないマウスか
らのミルク試料は所定量の添加AATを加えまたはなしで
検定された。試料（20μ）をウエルに入れ、そのプレ
ートを10−20分間開放して放置した。その後そのプレー
トを備え付けのプラスチック蓋でシールし、室温で放置
した。沈降ゾーンの直径は、レンズレティクルを備えた
低出力両眼顕微鏡を使って、２−３日の拡散時間後、測
定した。少なくとも３の独立の読みとりが記録され、平
均測定値（mm）が計算され、２乗された（mm2）。AATに
対するゾーン測定値（mm2）をプロットする検量線は、
標準ヒト血清の希釈により得られた値を作って構成し
た。この直線は試験試料中のAAT濃度計算に使用され
た。
RNAの調製 RNAは、授乳後直ちにマウスから、または授乳しなか
ったマウスから調製される。授乳メスマウスは、試料の
交互汚染を避けるように注意して、頚部を脱臼、組織を
切断して殺した。その方法は、チャーグウイン、プロジ
ビィラ、マクドナルドとラッター（Chirgwin,Przybyla,
MacDonald and Rutter（1979）Biochemistry 18,5294−
5299）記載のプロトコールに基づいている。
興味ある組織を切断し、無菌30ml使いすてプラスチッ
ク試験管中のグアナジンチオシアネートの4M溶液、4ml
中に投入した。組織はウルトラ−ターラックス（Ultra
−TurraxR）ホモジナイザーを使い、室温で30−45秒最
高速度で均質化した。均質物は、5mlポリアロマ−超遠
心分離用試験管（Sorvall Cat.03127:Du Pont（UK）Lt
d,Wedgwood Way,Stevenage,Hertfordshire SG1 4QN,U
K）内の1.2ml、5.7M CsCl溶液上に層を形成させる。RN
Aは、ソーバルAH650またはベックマンl80超遠心分離器
のエックマンSW50.1スウィングアウトロータを用い、20
℃において36,000rpmで12時間遠心分離してCsClのクッ
ションを介してペレット化する（Beckman Instruments
（UK）Ltd,Progress Road,Sands Industrial Estate,Hi
gh Wycombe,Bucks HP12 4JL,UK）。遠心分離後、上清は
無菌ディスポーザルプラスチック5mlピペットで除き、
その後試験管は十分に注意して排水される。試験管底で
乳白光を発するペレットとして目視されるべきRNAは、
7.5Mグアニジン塩化水素2ml中で激しく撹拌しながら再
懸濁させる。再懸濁には15分以上かかる。その調製物は
15ないし30mlの熱殺菌コレックス（Corex）（Du Pont）
遠心分離管に移し、1M酢酸50μと100％エタノール1ml
を加え、−20℃で一夜インキュベートして沈降させる。
RNAは、ソーバルRCB5冷凍遠心分離器（Du Pont）のソー
バルSS34ローター（Du Pont）を用い、２℃において10,
000rpmで10分間処理してペレット化する。RNAペレット
を2mlのジエチルピロカーボネート（Sigma）（DEPC）処
理蒸留水中へ撹拌しながら再懸濁させる。RNAは600μ
の1M酢酸ナトリウム（DEPC−処理）と３容積の100％エ
タノールを加えて再沈降させ、DEPC処理水へ再懸濁さ
せ、再び沈降させる。DEPC水からの第２回沈降後、RNA
ペレットをDEPC水に再懸濁させて所定の最終容量とする
（通常100μ−500μ）。RNA濃度は、スペクトロフ
ォトメトリー的に測定する（OD260nm＝１は40μg/mlに
対応する）。RNAは−70℃で冷凍して貯えられる。
RNAの分析 導入された軽質転換遺伝子の発現は、前記方法で調製
されたRNA試料の「ノーザン」ブロット法によって、多
くの異なる組織で調べられた。アリコート（10μｇ−20
μｇ）の全RNAは変性され、変性MOPS/フォルムアルデヒ
ド（１−1.5％）アガロースゲル中で分離され、アマー
シャムハンドブック（‘Membrane transfer and detect
ion methods'（PI/162/86/8 published by Amersham In
ternational plc,PO Box 16,Amersham,Bucking hamshir
e HP7 9LL,UK）に記載の如く、ハイボンドＮ（Amersha
m）ナイロンメンブランに移された。メンブランに結合
したRNAは、適当な32PラベルDNA配列にハイブイズする
ことによってプローブされる（例えばBLG,FIXまたはAAT
をエンコードする）。ラベリングとハイブリダイゼーシ
ョン法は、前記IC節に述べられている。
ある場合にRNA転写は、リボヌクレアーゼ保護検定法
で検出された。このことは、遺伝子の転写開始点を決定
する。その方法は、必然的にメルトン、クリーク、レバ
グリアティ、アニアチス、ジンとグリーン（Melton,Kri
eg,Rebagliati,Maniatis,Zin and Green（1984）Nuclei
c Acids Research 18,7305−7054）の記載方法を受け入
れる。例えば、FIXに対しBLGとFIXの５′融合点をスパ
ンするpS1tgXSFIX（WO−Ａ−8800239）からの145bp Sp
h I−Eco R VフラグメントをSph I−Sma I開裂pGEM4に
クローンした（ProMega Biotec,2800 South Fish Hatch
ery Road,Madison,Wisconsin 53791−9889,USA）。192
ヌクレオチド長32Pラベル、アンチセンスRNA転写は、SP
6ポリメラーゼを使って行ない、リボヌクレアーゼ保護
検定に使用された。アンニール後、試料は、37℃で１時
間、リボヌクレアーゼ（RNAase）Ａ（BCL）（40μg/m
l）とリボヌクレアーゼT1（BCL）（２μg/ml）で消化し
た。フェノール／クロロホルム精製試料は、８％ポリア
クリルアミド／尿素配列ゲルで電気泳動処理した。
実施例2:軽質転換マウスにおけるAATB構造の発現 軽質転換マウスミルク中のヒトプラズマタンパク質の
効果的な発現は、AATBを構築することによって例証され
る。AATBの詳細な構造は、実施例１で与えられる。すな
わち、AATBは、羊ベータラクトグロブリン遺伝子プロモ
ーターに融合した。ヒト（肝臓）アルファ１−アンチト
リプシン遺伝子マイナスイントロン１のゲノム配列を含
んでいる。融合点は、BLG遺伝子の５′非翻訳域にあ
る。AATイントロンが存在するとその構造の発現レベル
を高揚することは予想された。大きな最初のAATイント
ロン（約5kb）は、構築物のDNAマニピュレーションを促
進し、かつ、全AATイントロンが効果的な発現に要求さ
れるか否か決定するために、除かれた。他に述べられな
ければ、発現の分析結果は一覧表に示される。「＋」
は、適当なmRNA転写（ノーザンブロット法で検出）また
はタンパク質（ラジアルイムノ拡散法（RIO）またはイ
ムノブロット法（Western blotting））の存在によって
測定される発現を示す。「−」は、発現が検出されなか
ったことを示す。
AATB構築物を有する軽質転換マウス 実施例１に記載のAATB構築物は、実施例１に述べられ
た方法によって形質転換マウスを作るために使用され
た。AATB構築物DNAは、1987年８月と1988年７月との間
に７回受精マウス卵に微小注射された。993個の卵の全
数は注射を受け、そのうち747個は受容性擬妊娠マウス
に移した。122の子供の全ては乳離れさせた。尾の生検
から調製されたDNAの分析は、実施例ICに記載されてい
るように、122の世代ゼロ（G0）子供21が形質転換体と
してAATB構築物を有することを示した（第１表参照）。
形質転換マウスは、ゲノムに組込まれた１と720のコピ
ーのAATB構築物を有した。
次の方策は、AATB構築物発現研究に採用された。初代
形質転換G0個体がオスの場合に、そのオスは非形質転換
メスと交配してG1子孫を生誕させる。G1個体からのテー
ルDNAは、形質遺伝子を遺伝したか否か決定するため
に、測定された。メス形質転換G1マウスは、実施例1Dの
記載の方法によって、AATB形質転換体の発現分析に使用
された。初代形質転換G0個体がメスの場合に、そのメス
は実施例１に記載の如く直接的に発現分析に使用され
た。この方策の採用は、マウス系が初代G0動物がオスの
場合にだけ確立されたことを意味する形質遺伝子のその
後の世代への伝達は、初代G0マウスがオスの場合にだけ
決定される。４つのAATB G0オスの伝達データは第１表
に示される。
発現の分析 15個のG1メスはAATB形質転換体の発現について測定
し、実施例１の記載の方法によって８個はミルクのタン
パク分析、７個はRNA分析であった。さらに５のG0メス
は、ミルクのタンパク質分析とRNA分析の両方で分析し
た。９の異種形質転換マウスまたはマウス系の全ては測
定した。
RNA分析 次の組織−乳腺、肝臓、腎臓、脾臓、唾液線および心
臓−から単離されたRNAはAATB転写物の存在について調
べた。これらの組織からの全試料（10μｇ）はノーザン
ブロット法によって分析した。代表的なノーザンブロッ
トは第11図として示される［レーン１と２および３と４
は対照マウスからの乳（Ｍ）、および肝臓（Ｌ）試料を
含む。レーン５−９は、AATB26.1乳（Ｍ）、肝臓
（Ｌ）、腎臓（Ｋ）、脾臓（Ｓ）および唾液（Sa）RNA
試料を含む。レーン10−14は、AATB17.3乳（Ｍ）、肝臓
（Ｌ）、腎臓（Ｋ）、脾臓（Ｓ）および唾液（Sa）RNA
試料を含む。約1400ヌクレオチドのAAT転写は矢印で示
す］。ヒトAAT cDNAプローブ、p8α1ppg,は肝臓RNA試料
の内因性マウスAAT転写と交差ハイブリダイズする。AAT
B26.1とAATB17.3からの唾液試料中のAAT転写の存在は、
肝臓特異そして唾液特異プローブでフィルターを再プル
ーブすることによって証明されるように、肝臓または乳
腺物質の汚染からは生じない。この分析結果は第２表に
示される。
観察された転写がAATB構築物のベータラクトグロブリ
ン開始部位において開始することを確認するために、マ
ウスAATB17.20の乳腺およびマウスAATB26.1の唾液腺か
ら単離されたRNAは、実施例1Dに記載の如く、リボヌク
レアーゼ保護検定法によって測定された。肝臓（AATB1
7.20とAATB26.1）とこれらのマウス乳腺（AATB26.1）と
から単離されたRNAは、非形質転換肝臓、乳腺と唾液腺
からのRNAと同様に、リボヌクレアーゼ保護によって測
定された。アンチセンスプローブは、AATA構築物５′端
由来の155bp Sph I−Bam H Iフラグメント含有pGEMベ
クター（Promega Biotec,2800 South Fish Hatchery Ro
ad,Madison,Wisconsin 53791−9889）を転写することに
よって産生した。この155bpフラグメントはAATB中で見
い出されたものと同じである（p III−I spB、実施例1A
参照）。アンニーニングは標準的な条件下で実施し、単
一鎖RNA加水分解はリボヌクレアーゼＡとリボヌクレア
ーゼT1（BCL）で行なった。同様に、センス転写は転写
され、そして定常状態mRNAレベルの評価を提供するため
に20μｇの対照RNA試料とともに各種の量の転写が含ま
れる。代表的なリボヌクレアーゼ保護ゲルは第12図に示
される［レーン１と２、AATB17.20 20μｇと10μｇの全
乳腺RNA;レーン3,4,5と６、1000pg、200pg,100pgと50pg
のコントロールセンス転写；レーン７と８、AATB26.1
20μｇと10μｇの全唾液RNA;レーン９と10と11、５μｇ
アリコートの乳腺ポリＡ＋AATB15.2,AATA5.20とAATA31
からのRNA;レーンＭハエル消化Φ×174DNAマーカートラ
ック］。リボヌクレアーゼ保護検定法では、ベータラク
トグロブリン転写開始部位が、系AATB17の乳腺組織と系
AATB26の唾液組織で予想されるように、使用されること
が認められた。AATB17.20の肝臓およびAATB26.1の肝臓
と乳腺中のAATB転写の欠失は、同様にリボヌクレアーゼ
保護検定法によって確認された。
ミルクのタンパク質分析 8G1メスと5G0メスからのミルク試料は、実施例1Dに記
載のイムノブロット法によってヒトアルファ１−アンチ
トリプシンの存在が検定された。この分析結果は第３表
に要約されている。形質転換マウスと正常マウスからの
希釈ミルク試料の代表的なイムノブロットは第13図とし
て示される［レーン1,プールしたヒト血清;2、対照マウ
スミルク;3、AATB15.10ミルク;4、AATB17.24ミルク;5、
AATB17.23ミルク;6、AATB15.20ミルク;7、対照マウスミ
ルク;8と９、マーカータンパク質］。ヒトAAT（矢印）
はマウスAATB17.23とAATB17.24から作られたことの明ら
かな証拠であり、マウスAATB15.10からのミルク中にほ
ぼ目視される。抗−ヒト血清の内因性マウスAATへの交
差反応（ヒト類似物より若干速く移動する）は同様に明
らかである。
形質転換マウスミルク中のヒトアルファ１−アンチト
リプシン量は、実施例1D（第３表参照）に記載の如く、
LC−パーティゲンラジアルイムノディヒュージョンプレ
ート［RID］（Berring Diagnostics,Hoescht UK Ltd,50
Salisbury Road,Houslow,Middlesex TW4 6JH］で評価
した（第３表参照）。ヒトアルファ１−アンチトリプシ
ン含有または無しの正常マウスミルク試料は対照として
含まれた。
試験した９の異種AATB形質転換マウスまたはマウス系
の中で、５つはミルク中のヒトアルファ１アンチトリプ
シン発現を効果的に導いた。同様に、６系（AATB15）は
乳腺発現を示したがそのレベルは低かった。この分析結
果は、AATB構成物が形質転換マウス乳腺におけるヒトア
ルファ１−アンチトリプシンの効果的に発現する十分な
情報を含むことを証明する。乳腺と同様に唾液腺中で作
用させるようなBLGプロモーターの組織特異性の若干の
弛緩があるようである。AAT遺伝子の最初のイントロン
は、ハイブリッド遺伝子AATBの効率的な発現に必要では
ない。BLG遺伝子のイントロンと３′フランク配列は、B
LGプロモーターからの効果的な乳腺の発現に必須ではな
いことが明らかである。BLG遺伝子の５′非翻訳部にお
けるSal IからSph Iを通ってPvu II部位までのBLG遺伝
子の５′フランク配列は、AATで例証されたように、異
種遺伝子の効率的な乳腺発現を導くのに十分である。
実施例3:BLG構造物の比較発現 形質転換マウスのミルク中におけるヒト血漿タンパク
質の十分な発現は、構造物AATBによって例示される。こ
の章において、ヒト血漿タンパク質、すなわちF IXある
いはAATを暗号化する種々の構造物の発現分析が与えら
れる。これらの構造物の詳細は実施例1Aにおいて与えら
れる。BLG遺伝子の２つの配置の発現分析がまた与えら
れ、そして乳腺における発現に関し必要とされるBLG配
列をより限定するために利用される。特にことわらない
限り、発現の分析は図表化される。“＋”は適当なmRNA
転写（ノーザンブロットによって検知される）あるいは
タンパク質（ラジオイムノアッセイ（RIA）、放射免疫
拡散（RID）、クーマシーブルー染色あるいはウェスタ
ンブロットによって検知される）の存在によって測定さ
れた発現を示すものである。“−”は、発現が検知され
なかったことを示すものである。
F IX A: この構造物の構築および発現はWO−ａ−8800239中に
詳細に述べられるものである（pSS1tgXS−F IXあるいは
pSS1tgXS−TARGと呼称される。）。これは、BLG遺伝子
の最初のエキソン中へと挿入された、ヒト血液凝固因子
IX（F IX）を暗号化するcDNA配列を含有してなるもので
ある。この構造物を負う形質転換ヒツジが生産され、そ
してこれらが哺乳類RNAのノーザンブロットおよびミル
クのラジオイムノアッセイによって、ヒトF IXの発現に
関し分析された。
［a:1987におけるRIAによる分析、b:1988における分
析、＊:1IU＝５μｇ、＠：形質転換雄6LL225の雌の子
供］ 形質転換ヒツジミルク中のヒトF IXはウェスタンブロ
ットによって視認化され、そして生物学的活性を有する
ことがまた示された。しかしながら、ミルク中のタンパ
ク質レベルは商業的利用に必要とされるものよりもはる
かに低いものである。
AATA: この構造物は、BLG遺伝子の最初のエキソン中へ挿入
された、ヒトAATを暗号化するcDNAを含有してなるもの
である。これは、F IX Aと等価なものであり、そしてそ
れゆえWO−Ａ−8800239において述べられるpSS1tgXS−T
ARGと呼称される一般化された構造物の一例として考え
られることのできるものである。これは形質転換ヒツジ
およびマウスを生産するために用いられた。
ヒツジ 種類 RNA ATTタンパク質＊ 6LL237 G0雌 − − 6LL167 G0雌 nd ＋（２−10μg/ml） 7LL183 G0雌 nd nd ＊：ミルク試料のウェスタンブロットによって検知さ
れ評価されたタンパク質、nd:実施せず 分析された正常ヒツジおよび２匹の形質転換ヒツジか
らの乳清試料のウェスタンブロットが第14図に示される
（第１レーン,7LL167（AATA）；第２レーン，対照ヒツ
ジ乳清；第３レーン，ヒト血清プール；第４レーン,7LL
167（AATA）；第５レーン、6LL273（AATA）；第６レー
ン，対照ヒツジ乳清）。
ヒトATT（矢示）は6LL167からの乳清試料中において
は極めて明白であるが、6LL273からのものあるいは対照
ヒツジミルク中には存在しない。これらの条件下におい
て、ヒツジミルク中に存在する内在AATは、抗ヒト血清
によって検出され、そしてそれのヒト対照物よりも大き
な電気泳動度を有する。
形質転換ヒツジミル中に存在すると評価されたヒトAA
Tのレベルは低く、そして商業的利用に十分なものでは
ない。
AATA構造物の発現はまた、形質転換マウスにおいても
研究された。
正常および形質転換マウスからのTCA沈降化乳清試料
からのウェスタンブロットは第15図に示される［第１レ
ーン，ヒトα１−抗トリプシン抗原（シグマ［sigm
a］）＋第２レーン，ヒト血清；第３レーン，マウス血
清；第４レーン,ATAA1.8.1乳清；第５レーン,ATAA1.5.1
0乳清；第６レーン，ヒトおよびマウス血清；第７レー
ン，対照マウス乳清；第８レーン,AATA5.30乳清；第９
レーン、AATA1乳清；第10レーン，ヒト血清、第10レー
ン，マウス血清］。ヒトAAT（矢示）は、マウスラインA
ATA5からの沈降物からの沈降物において極めて明白であ
るが、マウスラインAATA1.8.においてはほぼ視認化され
たにすぎない。抗ヒト血清の内在マウスAAT（それのヒ
ト相同物よりもわずかに早く移住する）との交差反応が
また明白である。
マウスラインAATA5において観察される発現のレベル
は、形質転換ヒツジ7LL167において観察されるものと同
様の規模であり、そしてこれゆえヒツジのような家畜に
おいて得られる場合においても商業的に実験されないで
あろう。
BLG−BLG この構造物はBLG構造遺伝子のエクソン１中に挿入さ
れたBLG cDNAを含有してなるものである。この構造物
は、BLGの相補的構造遺伝子が該cDNA挿入物と共に存在
するAATAおよびF IX A（すなわち、pSS1tgXS−TARG）に
相同するものである。しかしながら、この場合、該挿入
物は他の組織中に通常は発現される遺伝子からのcDNAと
いうよりむしろミルクタンパク質を暗号化するcDNAであ
る。この構造物の発現は、形質転換マウスにおいて評価
された。
マウス 種類 RNA BLGタンパク質＊ BB4 G0 雌 ＋ ＋（＜.005mg/ml） BB5 G0 雌 ＋ ＋（〜.005mg/ml） BB19 G0 雌 ＋ ＋（＜.005mg/ml） BB47 G0 雌 ＋ ＋（＜.005mg/ml） BB55 G0 雌 nd ＋（＜.005mg/ml） ＊：ウェスタンブロットにより検知され評価された nd＝測定せず 該構造物は、RNAが分析された４匹のマウスにおいて
組織特異的に発現された。５匹のすべての動物におい
て、BLGの低いレベルが、ミルク中に検知された。これ
らのBLGのレベルは、正常な構造BLG遺伝子の発現ととも
に観察されるもの（例えば、WO−Ａ−8800239の実施例
７を参照のこと）よりもかなり低いものである。このデ
ータは、“Ａ−タイプ”構造物がBLG（乳腺において非
常に高い発現ができるものとして知られている）のよう
な天然の乳タンパク質を暗号化する場合においてすら、
形質転換マウスの乳腺中に十分に発現されないことを示
すものである。このことは、これが、cDNA（F IX、AAT
あるいはBLGのいずれか）の、このタイの構造物の発現
の低いレベルに関し信頼のあるゲノムBLG配列での配置
（すなわち第１のエキソンへの挿入）であることを示唆
するものである。
AATD この構造物は、５′BLG配列に融合されそしてBLGのエ
キソン６および７からの３′配列を有するAAT cDNA、
ならびにBLG遺伝子の３′−フランキング配列を有して
なるものである。この遺伝子はイントロンを全く含有し
ていない。発現に関するそれの能力が、形質転換マウス
において評価された。
マウス 種類 RNA ATTタンパク質＊ AATD12 G0 雌 − − AATD14 G0 雌 − − AATD31 G0 雌 − − AATD33 G0 雌 − − AATD9 マウスライン − − AAT21 マウスライン − − AATD41 マウスライン − − AATD47 マウスライン − − ＊：ウェスタンブロットにより評価された AATDを負う形質転換マウスのいずれも転換形質を発現
しなかった。
F IX D これはAATDに相同する構造物であり、BLG5′および
３′配列（エクソン６および７を含む）に融合されたF
IX cDNAを含有してなるものであり、またイントロンを
全く含有しない。発現は形質転換マウスにおいて評価さ
れた。
マウス 種類 RNA F IXタンパク質＊ F IX D11 G0 雌 − − F IX D14 G0 雌 − − F IX D15 G0 雌 − − F IX D16 G0 雌 − − F IX D18 G0 雌 − − F IX D20 マウスライン − − F IX D23 マウスライン − − F IX D24 マウスライン − − F IX D26 マウスライン − − ＊：ウェスタン ブロットによって評価された F IX Dを負う形質転換マウスのいずれも転換形質を発
現しなかった。
BLG5′および３′配列と、標的cDNA配列（すなわち、
F IXないしAAT）との単純な配列（イントロンが全く存
在しない）は、形質転換動物の乳腺中に、あったとして
も十分に発現されないものであろうことを、これらのデ
ータは、AATDからのデータと共に示唆するものである。
AATC この構造物は、BLGの第２のエキソン中に挿入されたA
AT cDNAを含有してなるものである。これは、プロモー
ターから離れた部位（すなわち、第１のエキソン中とい
うよりむしろ第２のエキソン中）での標的cDNA（この場
合においてはAAT）を挿入することが、発現のレベルを
改善するか否かを調べるために構築されたものである。
発現は形質転換マウスにおいて評価された。
マウス 種類 RNA ATTタンパク質＊ AATC14 G0 雄 − − AATC24 G0 雄 − − AATC25 G0 雄 − − AATC30 G0 雄 − − AATC4 マウスライン ＋ − AATC5 マウスライン − − AATC27 マウスライン − − ＊：ウェスタンブロットにより評価された ７つの“ライン”のうちのわずか１つがRNAによって
測定された際に、転換形質を発現した。このラインにお
いてAATタンパク質は検知されなかったが、これは恐ら
くAAT配列の開始ATGからの再開始が生起しなかったため
と思われる。RNA発現系において、発現は低レベルでは
あるが乳腺においてのみ起こると思われる。これらのデ
ータは、標的cDNAの挿入部位を第２のエキソンへ移動す
ること（およびこれゆえBLGのイントロン１を含有す
る）は、標的cDNA（この場合AAT）の発現のレベルを改
善しないことを示唆するものである。
DELTA A2 この構造物は、乳腺中におけるBLGの十分でかつ組織
特異性の発現のために必要とされることが形質転換マウ
スにおいてこれまでに示されていた最小ヒツジBLG配列
を含有するものである。これはpSS1tgXSの５′欠失誘導
体であり（WO−Ａ−8800239）、また公知のmRNAキャッ
プ部位を側面に有するわずか799bpの配列を有するもの
である（Ali and Clark,（1988）J.Mol.Biol.199,415−
426）。このpSS1tgXSの欠失型は、形質転換マウスを産
出するために用いられた。
マウス 種類 RNA BLGタンパク質＊ DELTA A2/1 G0 雌 ＋ ＋ 〜2mg/ml DELTA A2/28 G0 雌 ＋ ＋ 〜3mg/ml DELTA A2/38 G0 雌 ＋ ＋ ＜0.15mg/ml ＊：クーマシーブルー染色によって検出：濃度計によっ
て評価 DELTA A2構造物は、799bpの５′−フランキング配列
が、形質転換マウスの乳腺におけるBLGの正しくかつ効
果的な発現に十分であることを示す。この構造物はまた
BLGの4.9kb転写単位および1.9kbの３′−フランキング
配列を含有するものである。哺乳類発現に関する重要な
規制配列がこれらの領域中に存在することが考えられ
る。（しかしながら、これらの配列がないにもかかわら
ず、十分な哺乳類発現が得られたAATBでの結果に留意す
べきである。） 実施例4:因子IX構造物の調製 構築法 BLG−F IXと呼ばれるヒト因子IX遺伝子の形質転換ヒ
ツジにおける発現は、WO−Ａ−8800239およびクラーク
ら［Clark et al］（1989）（Biotechnology,7 487−49
2）中に開示されている。この双方の記載は、法の許す
限りにおいて、関連により本明細書中に取込まれる。こ
の構造物は、F IX Ａとすでに呼称されているので、こ
の術語をそのまま維持する。本質的に、F IX Ａの構築
は、完全な（すなわち全てのエクソンおよびイントロン
が存在する）ヒツジβラクトグロブリン（BLG）遺伝子
の第１のイントロンへのヒトF IX cDNAの挿入から構成
されるものである。この実施例は、このF IX Ａの修飾
に関するものであり、ヒトゲノムF IX遺伝子を適当な位
置でF IX cDNA中へ挿入し、これによって新しい遺伝子
の転写において、１つのイントロンを含有する初期の転
写体を形成しようとするものである。この転写体が正確
にスプライシングされた場合、翻訳においてオリジナル
のF IX Ａ構造物と正確に同じタンパク質を生起する転
写体が生起される。
以下に示す構築経路は複雑なものであるが、用いられ
た方法は実施例１において述べたものと同様のものであ
る。困難性は、ヒトF IXゲノムDNAフラグメントの大き
さ、およびBLGおよびF IX DNA配列の好適な取扱いを許
容する新規なシャトルベクターを発展させるための要求
により引起されるものである。
A. 目的 ａ）pUC PM…修飾されたクローニングベクター ｂ）pUC XS…BLGゲノムDNAを含有するpUC PM ｃ）pUC XS/RV …BLG ５′非翻訳領域中の単一EcoR V制限部位を含有
するpUC XS の構築 詳細 ｉ 酵素に対する制限部位を以下の順序、すなわち、Ec
o R I、Pvu I、Mlu I、Sal I、Eco R V、Xba I、Pvu
I、Mlu I、Hin d III（第16a図参照）、で含有する２重
鎖合成リンカーDNAが、Eco R I/Hin d III消化されそし
てゲル精製されたpUC18（Boehringer）中へ連結され、p
UC PMが形成された（第16a図参照）この挿入は、制限
酵素による分析および直接的配列決定の双方によってチ
ェックされた。
ii pSS1tgXSから精製されたSal I−Xba Iフラグメント
（これは、pPOLY III.I中のXba I−Sal I BLGゲノムフ
ラグメントを含む（WO−Ａ−8800239の第３図参照））
が、Sal I/Xba I消化されそしてCIP（ウシ腸フォスファ
ターゼ）（第16a図参照）処理されさらにゲル精製され
たpUC PM中へ連結され、pUC XSが与えられた。これは
制限酵素による分析によりチェックされた。
iii 合成Eco R Vリンカー がPvu II消化されたpSS1tgSEの単一Pvu II部位中へ連結
された（WO−Ａ−8800239を参照のこと−pSS1tgSEは、p
POLY III.I中へ挿入されたBLGのSph I−Eco R Iフラグ
メントを含有してなるものである;Pvu II部位はBLの第
１のエキソン中のキャップ部位の30塩基対下流であ
る。）。第16b図を参照せよ。
iv Eco R Vリンカーを含有するSph I−Not Iフラグメ
ントは、pSS1tgSE/RVからゲル精製され、そしてSph Iお
よびNot Iで消化されまたCIP処理されさらにゲル精製さ
れたpUC XS中へ連結された。第16b図を参照せよ。これ
は制限酵素による分析によってチェックされた。
B. 目的 ａ）クローン９−３、B6および9H11 …F IXゲノムDNAの種々の部位の転移からのクローニン
グビヒクル ｂ）クローン11−６…これはpUC9中に挿入されたF IXの
エクソン１、２、３およびイントロン１、２を含有して
なる。
の構築 詳細 ｉ コスミドクローンcIX2（F IX遺伝子の一部を含有す
る）は、ジー ブラウニー［G.Brownlee］から得られ
た。（GB−Ｂ−2125409を参照のこと。ピーアール ウ
ィンスリップ、オックスフォード大学博士論文、および
アンソンら、1988年、ENBO J.7 2795−2799［P.R.Winsl
ip,D.Phil Thesis,Oxford,and Anson et al（1988）ENB
O J.7 2795−2799］もまた参照のこと。） 注：以下の記載において、制限部位に付された塩基数
は、該部位が第１のF IXエキソン中のキャップ部位のい
くつ上流（マイナス記号）あるいは下流に位置するかを
示す塩基数である。これらの数は、ヨシタケ［Yositak
e］らの公知のF IX配列（Yositake et al（1985）Bioch
emistry 24 3736−3750）から類推によって得られたも
のである。
ii クローン９−３は、cIX2からのゲル精製されたBam
H I（−2032）−Eco R I（5740）フラグメトを、Bam H
I/Eco R I消化され、CIP処理され、そしてゲル精製され
たpUC9中に連結させることによって、形成された（第17
図参照）。
iii クローン9H11はcIX2からのゲル精製されたHin d I
II（810）−Hin d III（8329）フラグメントを、Hin d
III消化され、CIP処理され、そしてゲル精製されたpUC9
中に連結させることによって、形成された（第17図参
照）。
iv クローン９−３はBam H IおよびHpa Iで消化され、
クレノウ酵素で末端を満され、そしてラージフラグメン
トがゲル精製され、さらにクローンB6を形成するために
連結された（第17図参照）。これの実際効果は、−2032
と−830の間のF IX配列を除去することである。
ｖ クローン9H11は、Sal IおよびBgl IIで消化され、C
IP処理され、そして次に、ベクターSal I部位とF IX B
gl II部位（3996）の間の領域を今や欠損するものとな
ったラージフラグメトがゲル精製された。これは、クロ
ーンB6からのゲル精製されたSal I（ベクター）−Bgl I
I（3996）フラグメントと連結され、F IX配列−830〜−
8329（すなわち、エキソン1,2,3およびイントロン1,2）
を含有するクローン11−６（第17図参照）が形成され
た。
C. 目的 ａ） クローンC8（F IX cDNAの５′部位を取込んでい
る） ｂ） クローンC81.SK（F IX cDNAの５′部位およびF
IXイントロン１を取込んでいる。） の構築 詳細 ｉ F IX Ａ（BLG遺伝子中のF IX cDNA、クラーク
ら、1989年、バイオテクノロジー ７ 487−492［Clar
k et al,（1989）Biotechnology 7 487−492］中におい
てはBLG F IXと呼ばれる。WO−Ａ−8800239も参照のこ
と。）がSph 1/Bst Y1で消化された。スモールフラグメ
ントがゲル精製され、そしてこれを、Sph I/Bam H I消
化され、CIP処理されたpUC18（Boehringer）に連結さ
せ、クローンC8（第18図参照）に形成した。DNAはdam-
エシェリキア・コリ宿主（SK383）中でBc1消化がなされ
るように培養することによって調製された。
注:C8は、F IX cDNAの多くおよび３つのBcl I部位のう
ちの２つ（GB−Ｂ−2125409の第９図中に示されるF IX
cDNA配列の第１のAUGの第１のヌクレオチドの２およ
び81上流位置；これらはゲノムDNAのBcl部位46（エクソ
ン１）および6333（エクソン２）と等価である。）を含
む。
ii C8は、Bcl Iで消化され、CIP処理され、そしてゲル
精製後ラージラグメントが残された。
iii クローン11−6DNAはエシェリキア・コリ宿主SK383
（dam-）から調製され、そしてイントロン１を含有する
Bcl Iフラグメントが精製され、上記iiで述べたラージ
フラグメントと連結されて、C81 SKが形成された（第1
8図参照）。Bcl結合はBcl部位の再構築を確認すること
で配列決定された。
4. 目的 ａ） F IX Ａ（pUC PMに転移されたF IX挿入物） ｂ） SP F IX（イントロン１のＪ F IX Ａへの転移
のためのクローニングビヒクル） の構築 詳細 ｉ F IX ＡからのSpa I−Not Iフラグメント（F IX
cDNAを含有しかつBLG配列を側方に有する）をゲル精製
し、そしてこれを、Sph I/Not I消化され、CIP処理さ
れ、ゲル精製されたpUC XS/RV中へ連結させることによ
って、Ｊ F IX Ａ（第19図参照）を形成した。
ii Ｊ F IX ＡからのF IX cDNAを含有するSph−Nru
Iフラグメントをゲル精製し、そしてこれをSph I/Eco
R V消化され、CIP処理されたpSP72（progema Biotech）
中へ連結させることによって、SP F IX（第19図参照）
を形成した。
E. 目的 ａ） b11…F IXイントロン１を含有するクローニング
ビヒクル ｂ） Ｊ F IX A1…形質転換体の構築のための最終的
な“微小遺伝子［minigene］” 詳細 ｉ SP F IXおよびC81.SKがSph Iで完全に消化され、
次にSsp 1＊で部分消化された。F IXイントロン１を含
有するC81.SKからの7.2kbフラグメントが、CIP処理され
さらにゲル精製されたSP F IXのラージフラグメントと
連結され、完全F IX cDNAおよびF IXイントロンを含有
するクローンb11（第20図参照）が形成された。
ii F IX配列を含有するb11からのSph I−Not Iフラグ
メントをゲル精製し、そしてこれをSph I/Not I消化さ
れ、CIP処理されたＪ F IX Ａ中へ連結して、Ｊ F I
X A1（第20図参照）を形成した。
＊注 SP F IXには、示される部分消化フラグメント中
に切出されなかった、ベクター中の１つのSsp I部位が
存在する。C81.SKのおけると同様に、F IXイントロン中
には４つのSsp I部位が存在する。7.2kフラグメントは
これらの４つのすべての部位を含み、そして実際にゲノ
ムF IX配列の30830bに位置するSsp I部位でターミネー
トしている。
F. 形質転換マウスが実施例1Bにおいて述べられるように
して構築され、そして実施例1Cにおいて述べられるよう
にして同定された。１匹の雄および１匹の雌の形質転換
マウスが最初に同定された。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ハリス，ステファン イギリス国，スコットランド，イーエッ チ３ ９ピーディー，エジンバラ リー ミングトンロード３ (72)発明者 マッククレナガン，マルガレット イギリス国，スコットランド，イーエッ チ９ １ピーエイ，エジンバラ，リビン グストーンプレイス８ (72)発明者 シモンズ，ジョン，ポール イギリス国，スコットランド，イーエッ チ９ １イーティー，エジンバラ，ワレ ンダーパークロード94 (72)発明者 ウィッテロウ，クリストファー，ブルー ス，アレキサンダー イギリス国，スコットランド，イーエッ チ10 ４エルエイ，エジンバラ，ビュウ フォース43 (56)参考文献 国際公開88／239（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（1988．２）Ｖｏｌ．85, ｐ．836−840 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A01K 67/027 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】哺乳類乳タンパク質遺伝子からの５′−フ
    ランキング配列、およびヒトアルファ１−アンチトリプ
    シンについてコードしているDNAを含有してなり、この
    ヒトアルファ１−アンチトリプシンについてコードして
    いるDNAが該ヒトアルファ１−アンチトリプシンについ
    てコードしている遺伝子において天然に生じるイントロ
    ンの全てではなく少なくとも１つを含有しており、また
    前記５′−フランキング配列が該ヒトアルファ１−アン
    チトリプシンの発現を誘導するのに十分な配列であるこ
    とを特徴とする遺伝子構造物。
  2. 【請求項２】哺乳類乳タンパク質遺伝子からの５′−フ
    ランキング配列、およびヒト血液凝固因子IXについてコ
    ードしているDNAを含有してなり、このヒト血液凝固因
    子IXについてコードしているDNAが該ヒト血液凝固因子I
    Xについてコードしている遺伝子において天然に生じる
    イントロンの全てではなく少なくとも１つを含有してお
    り、また前記５′−フランキング配列が該ヒト血液凝固
    因子IXの発現を誘導するのに十分な配列であることを特
    徴とする遺伝子構造物。
  3. 【請求項３】前記乳タンパク質遺伝子がβ−ラクトグロ
    ブリン遺伝子である請求の範囲第１項または第２項に記
    載の構造物。
  4. 【請求項４】前記β−ラクトグロブリンの転写開始部位
    の上流約800塩基対を含有するものである請求の範囲第
    ３項に記載の構造物。
  5. 【請求項５】前記β−ラクトグロブリンの転写開始部位
    の上流約4.2キロ塩基対を含有するものである請求の範
    囲第３項に記載の構造物。
  6. 【請求項６】天然イントロンのうちの１つを除く全てが
    存在するものである請求の範囲第１項または第２項に記
    載の構造物。
  7. 【請求項７】天然イントロンのうちの１つのみが存在す
    るものである請求の範囲第１項または第２項に記載の構
    造物。
  8. 【請求項８】３′−配列を含有してなる請求の範囲第１
    項または第２項に記載の構造物。
  9. 【請求項９】ポリペプチドを含有してなる物質を産出す
    る方法であって、請求の範囲第１項または第２項に記載
    される遺伝子構造物を、該タンパク質についてコードす
    るDNAがヒト以外の動物の分泌腺において発現するよう
    に、該動物のゲノム中へと導入することを含んで構成さ
    れることを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】動物がヒト以外の哺乳類であり、また分
    泌腺が乳腺である請求の範囲第９項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】請求の範囲第１項または第２項に記載の
    遺伝子構造物を含有してなるベクター。
  12. 【請求項１２】請求の範囲第11項に記載のベクターを含
    有してなる細胞。
  13. 【請求項１３】請求の範囲第１項または第２項に記載の
    遺伝子構造物を含有してなる動物細胞。
  14. 【請求項１４】ゲノム中に組込まれた請求の範囲第１項
    または第２項に記載の遺伝子構造物を含有してなるヒト
    以外の形質転換動物。
  15. 【請求項１５】前記遺伝子構造物を子孫に伝えることの
    できるものである請求の範囲第14項に記載の形質転換動
    物。
  16. 【請求項１６】ポリペプチドを含有してなる物質を産出
    する方法であって、請求の範囲第14項に記載の形質転換
    動物から該物質を採集することを含んで構成されること
    を特徴とする方法。
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