JP3136356B2 - 改変型シグナルペプチドをコードするｄｎａ - Google Patents
改変型シグナルペプチドをコードするｄｎａInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換え型タンパク質
の分泌量を増大させるための改変型シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え型タンパク質
分泌発現用プラスミド、および該プラスミドによって形
質転換した形質転換体に関する。
の分泌量を増大させるための改変型シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え型タンパク質
分泌発現用プラスミド、および該プラスミドによって形
質転換した形質転換体に関する。
【０００２】
【従来技術】シグナルペプチドは、リボソームで合成さ
れたタンパク質を膜透過させる機能を有する。分泌性タ
ンパク質はリボソームで合成される際にそのＮ末端に１
５から３０残基のアミノ酸からなるシグナルペプチドと
連結された形の前駆体として合成される。シグナルペプ
チドは大まかに３つの構造から構成されている。Ｎ末端
に近い部分は塩基性領域あるいはＮ末端領域と呼ばれて
おり、アルギニンやリシンなどの塩基性アミノ酸が含ま
れていて、大腸菌などの原核細胞ではそれらの正電荷に
よって膜表面（負電荷を帯びている）とおそらくイオン
結合し、これを足がかりにしてシグナルペプチドは膜内
へ貫入してゆくと考えられている。そしてシグナルペプ
チドとタンパク質との結合部分が膜から出てくるとき
に、膜内に存在するシグナルペプチダーゼによって結合
部で切断され、タンパク質部分だけが膜を透過して成熟
タンパク質となる。原核細胞では膜透過は細胞外への分
泌を意味する。真核細胞では膜透過によっていったん小
胞体内に入り、細胞内輸送系によって細胞外へと分泌さ
れる。
れたタンパク質を膜透過させる機能を有する。分泌性タ
ンパク質はリボソームで合成される際にそのＮ末端に１
５から３０残基のアミノ酸からなるシグナルペプチドと
連結された形の前駆体として合成される。シグナルペプ
チドは大まかに３つの構造から構成されている。Ｎ末端
に近い部分は塩基性領域あるいはＮ末端領域と呼ばれて
おり、アルギニンやリシンなどの塩基性アミノ酸が含ま
れていて、大腸菌などの原核細胞ではそれらの正電荷に
よって膜表面（負電荷を帯びている）とおそらくイオン
結合し、これを足がかりにしてシグナルペプチドは膜内
へ貫入してゆくと考えられている。そしてシグナルペプ
チドとタンパク質との結合部分が膜から出てくるとき
に、膜内に存在するシグナルペプチダーゼによって結合
部で切断され、タンパク質部分だけが膜を透過して成熟
タンパク質となる。原核細胞では膜透過は細胞外への分
泌を意味する。真核細胞では膜透過によっていったん小
胞体内に入り、細胞内輸送系によって細胞外へと分泌さ
れる。
【０００３】従来より組換えＤＮＡ技術によって種々の
組換え型タンパク質の生産が行われている。しかし、サ
イトカインなど複雑な構造を有するタンパク質は大腸菌
などの原核細胞では正しく合成することができず、活性
や安定性の低下が問題となっている。これに対して酵母
や昆虫細胞などの真核細胞では、野生型に近い構造をも
った活性の高い組換え型サイトカインを合成することが
可能である。しかし、生産量が十分ではなく、特に分泌
生産ではバチルス・ルビウスのような原核細胞生産系と
比べて生産量は大幅に劣っている。この原因のひとつが
シグナルペプチドである。真核細胞ではシグナルペプチ
ドの構造条件がまだ十分には解明されていないため、遺
伝子組換えによってタンパク質を分泌生産する際には、
それぞれのタンパク質の固有のシグナル配列をそのまま
利用している場合が多い。しかし、サイトカインのよう
な生体内での存在量の少ないタンパク質では、分泌能の
低いシグナルペプチドが付属しているため、それをその
まま使ったのでは分泌生産量の向上が見込めず、組換え
型タンパク質製剤のコスト高の原因ともなっている。
組換え型タンパク質の生産が行われている。しかし、サ
イトカインなど複雑な構造を有するタンパク質は大腸菌
などの原核細胞では正しく合成することができず、活性
や安定性の低下が問題となっている。これに対して酵母
や昆虫細胞などの真核細胞では、野生型に近い構造をも
った活性の高い組換え型サイトカインを合成することが
可能である。しかし、生産量が十分ではなく、特に分泌
生産ではバチルス・ルビウスのような原核細胞生産系と
比べて生産量は大幅に劣っている。この原因のひとつが
シグナルペプチドである。真核細胞ではシグナルペプチ
ドの構造条件がまだ十分には解明されていないため、遺
伝子組換えによってタンパク質を分泌生産する際には、
それぞれのタンパク質の固有のシグナル配列をそのまま
利用している場合が多い。しかし、サイトカインのよう
な生体内での存在量の少ないタンパク質では、分泌能の
低いシグナルペプチドが付属しているため、それをその
まま使ったのでは分泌生産量の向上が見込めず、組換え
型タンパク質製剤のコスト高の原因ともなっている。
【０００４】一方、ニワトリリゾチームのシグナルペプ
チドは、真核細胞において最も存在量の多いタンパク質
の一つである卵白リゾチームの分泌を担っており、真核
細胞用では分泌能力の高いシグナルペプチドとして組換
え型タンパク質の分泌生産に用いられている。例えば、
野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドを用いてヒ
トリゾチームを酵母で分泌させる系が確立されている
（特開平３−７０４７４号公報）。しかしながら、この
生産系をもってしても生産量は必ずしも満足できるもの
とは言えず、分泌量を向上させるためにはさらなる改良
が必要である。
チドは、真核細胞において最も存在量の多いタンパク質
の一つである卵白リゾチームの分泌を担っており、真核
細胞用では分泌能力の高いシグナルペプチドとして組換
え型タンパク質の分泌生産に用いられている。例えば、
野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドを用いてヒ
トリゾチームを酵母で分泌させる系が確立されている
（特開平３−７０４７４号公報）。しかしながら、この
生産系をもってしても生産量は必ずしも満足できるもの
とは言えず、分泌量を向上させるためにはさらなる改良
が必要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、野生型ニワ
トリリゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列を遺伝
子操作によって改変することによって、組換え型タンパ
ク質の分泌量を増大させることを目的とする。
トリリゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列を遺伝
子操作によって改変することによって、組換え型タンパ
ク質の分泌量を増大させることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端領域
に、少なくとも一個の塩基性アミノ酸を付加することに
よってシグナルペプチドと粗面小胞体表面との親和性を
高め、組換え型タンパク質の分泌量の増大をはかること
に成功し、本発明を完成するに到った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端領域
に、少なくとも一個の塩基性アミノ酸を付加することに
よってシグナルペプチドと粗面小胞体表面との親和性を
高め、組換え型タンパク質の分泌量の増大をはかること
に成功し、本発明を完成するに到った。
【０００７】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
る野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドのアミノ
酸配列のＮ末端領域に、少なくとも一個の塩基性アミノ
酸を付加したアミノ酸配列からなる改変型シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ、詳しくは、配列番号１で表さ
れる野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドのアミ
ノ酸配列の第１、第２番目のアミノ酸の間に、少なくと
も一個の塩基性アミノ酸を付加したアミノ酸配列からな
る改変型シグナルペプチドをコードするＤＮＡである。
本発明はまた、上記ＤＮＡを含有する、組換え型タンパ
ク質分泌発現用プラスミドである。さらに、本発明は、
上記プラスミドによって形質転換された形質転換体であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
る野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドのアミノ
酸配列のＮ末端領域に、少なくとも一個の塩基性アミノ
酸を付加したアミノ酸配列からなる改変型シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ、詳しくは、配列番号１で表さ
れる野生型ニワトリリゾチームシグナルペプチドのアミ
ノ酸配列の第１、第２番目のアミノ酸の間に、少なくと
も一個の塩基性アミノ酸を付加したアミノ酸配列からな
る改変型シグナルペプチドをコードするＤＮＡである。
本発明はまた、上記ＤＮＡを含有する、組換え型タンパ
ク質分泌発現用プラスミドである。さらに、本発明は、
上記プラスミドによって形質転換された形質転換体であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の改変型シグナルペプチド
をコードするＤＮＡは、配列番号１で表される野生型ニ
ワトリリゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列（Ju
ng, A., Sippel, A.E., Grez, M. and Schutz, G. 198
0, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 77,5759-5763)を改変
したものである。本発明においてアミノ酸配列の改変
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端領域に、
少なくとも一個の塩基性アミノ酸、具体的には、当該ア
ミノ酸配列の第１、第２番目のアミノ酸の間に少なくと
も一個の塩基性アミノ酸を付加する。ここで、付加する
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、リシン、ヒスチ
ジン、好適にはアルギニンであり、付加する数は１〜３
個、好ましくは２個または３個である。
をコードするＤＮＡは、配列番号１で表される野生型ニ
ワトリリゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列（Ju
ng, A., Sippel, A.E., Grez, M. and Schutz, G. 198
0, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 77,5759-5763)を改変
したものである。本発明においてアミノ酸配列の改変
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端領域に、
少なくとも一個の塩基性アミノ酸、具体的には、当該ア
ミノ酸配列の第１、第２番目のアミノ酸の間に少なくと
も一個の塩基性アミノ酸を付加する。ここで、付加する
塩基性アミノ酸としては、アルギニン、リシン、ヒスチ
ジン、好適にはアルギニンであり、付加する数は１〜３
個、好ましくは２個または３個である。
【０００９】上記の改変されたアミノ酸配列からなるシ
グナルペプチドをコードするＤＮＡは、リン酸ジエステ
ル法などの通常のオリゴヌクレオチド化学的合成法によ
って合成すればよい。また、目的とする改変型シグナル
ペプチドのアミノ酸配列に基づいて遺伝子改変用プライ
マーを作製し、該プライマーを用いて野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むベ
クターにアニーリングし、常法にてＰＣＲを行うことに
よって、目的とする改変型シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡを含む断片を増幅して得ることができる。
グナルペプチドをコードするＤＮＡは、リン酸ジエステ
ル法などの通常のオリゴヌクレオチド化学的合成法によ
って合成すればよい。また、目的とする改変型シグナル
ペプチドのアミノ酸配列に基づいて遺伝子改変用プライ
マーを作製し、該プライマーを用いて野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むベ
クターにアニーリングし、常法にてＰＣＲを行うことに
よって、目的とする改変型シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡを含む断片を増幅して得ることができる。
【００１０】かかる改変型シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡは、その下流に所望の分泌性タンパク質をコー
ドするＤＮＡを連結し、これを適当なベクターに組み込
むことにより、分泌発現用プラスミドを構築することが
できる。改変型シグナルペプチドをコードするＤＮＡと
分泌性タンパク質をコードするＤＮＡの連結は、従来公
知の方法、例えばＴ４リガーゼなどを用いる酵素反応に
従えばよい。
るＤＮＡは、その下流に所望の分泌性タンパク質をコー
ドするＤＮＡを連結し、これを適当なベクターに組み込
むことにより、分泌発現用プラスミドを構築することが
できる。改変型シグナルペプチドをコードするＤＮＡと
分泌性タンパク質をコードするＤＮＡの連結は、従来公
知の方法、例えばＴ４リガーゼなどを用いる酵素反応に
従えばよい。
【００１１】また、改変型シグナルペプチドをコードす
るＤＮＡと分泌性タンパク質をコードするＤＮＡの連結
遺伝子を組込むためのベクターとしては、該ベクターに
挿入した連結遺伝子を宿主内で転写、翻訳できるような
ものであれば特に限定はないが、プロモーター、ターミ
ネーター、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、選
択マーカーなどが含まれているような適当なベクター、
例えば、pHIL-D2 、pHIL-S1 、pPIC9 、pESP-1、pESP-
2、pESP-3、pAUR101 、pAUR112 、pAUR123 、pAUR224
などの市販ベクターを用いることができる。
るＤＮＡと分泌性タンパク質をコードするＤＮＡの連結
遺伝子を組込むためのベクターとしては、該ベクターに
挿入した連結遺伝子を宿主内で転写、翻訳できるような
ものであれば特に限定はないが、プロモーター、ターミ
ネーター、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、選
択マーカーなどが含まれているような適当なベクター、
例えば、pHIL-D2 、pHIL-S1 、pPIC9 、pESP-1、pESP-
2、pESP-3、pAUR101 、pAUR112 、pAUR123 、pAUR224
などの市販ベクターを用いることができる。
【００１２】構築した分泌発現用プラスミドによって、
適当な宿主を公知の方法にて形質転換し、培養すること
により、融合タンパク質が細胞内（リボソーム）で合成
され、続いて細胞外に成熟タンパク質として効率よく分
泌される。上記の分泌発現用プラスミドで形質転換する
宿主としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、
ピキア・パストリス、サッカロマイセス・ポンベなどの
酵母、Spodoptera frugiperda 由来のSf9 及びSf2 、Tr
ichoplusia ni 由来のHIGHFIVE などの昆虫細胞、カイ
コなどの昆虫類、チャイニーズハムスターオバリー（Ｃ
ＨＯ）細胞などの動物細胞が挙げられる。
適当な宿主を公知の方法にて形質転換し、培養すること
により、融合タンパク質が細胞内（リボソーム）で合成
され、続いて細胞外に成熟タンパク質として効率よく分
泌される。上記の分泌発現用プラスミドで形質転換する
宿主としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、
ピキア・パストリス、サッカロマイセス・ポンベなどの
酵母、Spodoptera frugiperda 由来のSf9 及びSf2 、Tr
ichoplusia ni 由来のHIGHFIVE などの昆虫細胞、カイ
コなどの昆虫類、チャイニーズハムスターオバリー（Ｃ
ＨＯ）細胞などの動物細胞が挙げられる。
【００１３】上記の分泌発現用プラスミドで形質転換し
た宿主により分泌発現させるのに適したタンパク質とし
ては、例えば、リゾチーム、インターフェロンα、イン
ターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキ
ン1 〜18、成長ホルモン、上皮増殖因子、エリスロポエ
チンなどが例示される。形質転換した宿主を培養するた
めの培地・培養条件は、その宿主の培養に常套的に用い
られるもので行えばよい。また、培養終了後、細胞外に
分泌、蓄積された成熟タンパク質は、自体公知の方法に
従って、分離し、精製することができる。
た宿主により分泌発現させるのに適したタンパク質とし
ては、例えば、リゾチーム、インターフェロンα、イン
ターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキ
ン1 〜18、成長ホルモン、上皮増殖因子、エリスロポエ
チンなどが例示される。形質転換した宿主を培養するた
めの培地・培養条件は、その宿主の培養に常套的に用い
られるもので行えばよい。また、培養終了後、細胞外に
分泌、蓄積された成熟タンパク質は、自体公知の方法に
従って、分離し、精製することができる。
【００１４】細胞外に分泌、蓄積された成熟タンパク質
の分離は、培養上清を遠心分離により採取するか、また
はペリペラズム画分を浸透圧ショック法により採取する
ことにより行うか、あるいはグラスビーズなどによって
細胞を物理的に破砕して採取する。また、分離した成熟
タンパク質は、通常のタンパク質の精製法、例えば塩
析、電気泳動、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィーなどに従って精製する
ことができる。
の分離は、培養上清を遠心分離により採取するか、また
はペリペラズム画分を浸透圧ショック法により採取する
ことにより行うか、あるいはグラスビーズなどによって
細胞を物理的に破砕して採取する。また、分離した成熟
タンパク質は、通常のタンパク質の精製法、例えば塩
析、電気泳動、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィーなどに従って精製する
ことができる。
【００１５】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 （改変型ニワトリリゾチームシグナルペ
プチドによる組換え型タンパク質の分泌発現) (1) 改変型ニワトリリゾチームシグナルペプチドによ
る組換え型タンパク質発現用プラスミド（ｐＣＳＨＹ−
Ｒ２、ｐＣＳＨＹ−Ｒ３）の構築 ニワトリリゾチームシグナルペプチドとヒトリゾチーム
が連結されたアミノ酸配列をコードする人工遺伝子(Jig
ami, Y., Muraki, M., Harada, N., and Tanaka, H. 19
86, Gene, 43 : 273-279) を、大腸菌−酵母シャトルベ
クター（ＹＥｐ５１）及びＥＮＯ１プロモーター領域遺
伝子と連結して、野生型ニワトリリゾチームシグナルペ
プチドによるヒトリゾチーム分泌発現系（ｐＦＪ１０５
３）を構築した（図１）。
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 （改変型ニワトリリゾチームシグナルペ
プチドによる組換え型タンパク質の分泌発現) (1) 改変型ニワトリリゾチームシグナルペプチドによ
る組換え型タンパク質発現用プラスミド（ｐＣＳＨＹ−
Ｒ２、ｐＣＳＨＹ−Ｒ３）の構築 ニワトリリゾチームシグナルペプチドとヒトリゾチーム
が連結されたアミノ酸配列をコードする人工遺伝子(Jig
ami, Y., Muraki, M., Harada, N., and Tanaka, H. 19
86, Gene, 43 : 273-279) を、大腸菌−酵母シャトルベ
クター（ＹＥｐ５１）及びＥＮＯ１プロモーター領域遺
伝子と連結して、野生型ニワトリリゾチームシグナルペ
プチドによるヒトリゾチーム分泌発現系（ｐＦＪ１０５
３）を構築した（図１）。
【００１６】次に、野生型ニワトリリゾチームシグナル
ペプチドのＮ末端領域に、アルギニン残基を２つ（改変
型シグナルペプチド１）挿入したアミノ酸配列（図２、
配列番号２）、または３つ挿入した（改変型シグナルペ
プチド２）アミノ酸配列を設計した（図２、配列番号
３）。次に、上記改変型シグナルペプチド１、２のアミ
ノ酸配列に基づいてそれぞれ以下の遺伝子改変用のプラ
イマーを作成した。 遺伝子改変用プライマー１：（ctgacagctagagtcgacgtca
tgaggagaaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggct
gctctggggaaggtt : 配列番号４） 遺伝子改変用プライマー２：（ctgacagctagagtcgacgtca
tgagaaggagaaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctg
gctgctctggggaaggtt：配列番号５）
ペプチドのＮ末端領域に、アルギニン残基を２つ（改変
型シグナルペプチド１）挿入したアミノ酸配列（図２、
配列番号２）、または３つ挿入した（改変型シグナルペ
プチド２）アミノ酸配列を設計した（図２、配列番号
３）。次に、上記改変型シグナルペプチド１、２のアミ
ノ酸配列に基づいてそれぞれ以下の遺伝子改変用のプラ
イマーを作成した。 遺伝子改変用プライマー１：（ctgacagctagagtcgacgtca
tgaggagaaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggct
gctctggggaaggtt : 配列番号４） 遺伝子改変用プライマー２：（ctgacagctagagtcgacgtca
tgagaaggagaaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctg
gctgctctggggaaggtt：配列番号５）
【００１７】改変型シグナルペプチド１については、上
記遺伝子改変用プライマー１と逆プライマー１（gccaag
cttgatcattagacaccacaaccttgaacgta：配列番号６）を用
いたＰＣＲ法によってｐＦＪ１０５３中のヒトリゾチー
ム遺伝子を連結したニワトリリゾチームシグナルペプチ
ドを増幅した（図１）。また、同様に、改変型シグナル
ペプチド２については、上記遺伝子改変用プライマー２
と逆プライマー１を用いたＰＣＲ法によってｐＦＪ１０
５３中のヒトリゾチーム遺伝子を連結したニワトリリゾ
チームシグナルペプチドを増幅した（図１）。
記遺伝子改変用プライマー１と逆プライマー１（gccaag
cttgatcattagacaccacaaccttgaacgta：配列番号６）を用
いたＰＣＲ法によってｐＦＪ１０５３中のヒトリゾチー
ム遺伝子を連結したニワトリリゾチームシグナルペプチ
ドを増幅した（図１）。また、同様に、改変型シグナル
ペプチド２については、上記遺伝子改変用プライマー２
と逆プライマー１を用いたＰＣＲ法によってｐＦＪ１０
５３中のヒトリゾチーム遺伝子を連結したニワトリリゾ
チームシグナルペプチドを増幅した（図１）。
【００１８】増幅した断片を、ｐＵＣ１９にクローニン
グして塩基配列を確認したところ、予定する配列を有す
ることが確認された。これら遺伝子を制限酵素（SalI及
びHindIII)で切り出して上記と同じ大腸菌−酵母シャト
ルベクターに挿入し、改変型ニワトリリゾチームシグナ
ルペプチドによるヒトリゾチーム分泌発現系（ｐＣＳＨ
Ｙ−Ｒ２、ｐＣＳＨＹ−Ｒ３）を構築した（図１）。
グして塩基配列を確認したところ、予定する配列を有す
ることが確認された。これら遺伝子を制限酵素（SalI及
びHindIII)で切り出して上記と同じ大腸菌−酵母シャト
ルベクターに挿入し、改変型ニワトリリゾチームシグナ
ルペプチドによるヒトリゾチーム分泌発現系（ｐＣＳＨ
Ｙ−Ｒ２、ｐＣＳＨＹ−Ｒ３）を構築した（図１）。
【００１９】(2) 改変型ニワトリリゾチームシグナル
ペプチドによる組換え型タンパク質の分泌 ｐＣＳＨＹ−Ｒ２をパン酵母KK4 株に導入し、ロイシン
欠損培地で遺伝子発現コロニーを選択した。得られた組
換え型酵母を液体培地で４日間振盪培養し、培養上清を
回収した。培養上清中の組換え型ヒトリゾチームの存在
を確認するために、培養上清を細菌（M.lysodeikticus)
の細胞壁と混合し、溶菌活性を調べたところ、90ユニッ
ト以上の高い活性を示し、改変型ニワトリリゾチームシ
グナルペプチドによって組換え型ヒトリゾチームが分泌
されていることが示唆された。
ペプチドによる組換え型タンパク質の分泌 ｐＣＳＨＹ−Ｒ２をパン酵母KK4 株に導入し、ロイシン
欠損培地で遺伝子発現コロニーを選択した。得られた組
換え型酵母を液体培地で４日間振盪培養し、培養上清を
回収した。培養上清中の組換え型ヒトリゾチームの存在
を確認するために、培養上清を細菌（M.lysodeikticus)
の細胞壁と混合し、溶菌活性を調べたところ、90ユニッ
ト以上の高い活性を示し、改変型ニワトリリゾチームシ
グナルペプチドによって組換え型ヒトリゾチームが分泌
されていることが示唆された。
【００２０】培養上清を凍結乾燥で濃縮し、陽イオン交
換カラム（Mono S HR5/5, ファルマシア) で組換え型ヒ
トリゾチームを精製した。濃縮液をカラムに流したとこ
ろ、市販のヒトリゾチームを流した時と同じ塩濃度(NaC
l ; 190mM)で溶出され、培養上清中の組換型ヒトリゾチ
ームが市販のヒトリゾチームと物理化学的に同一のもの
であることが確認された。精製された組換え型ヒトリゾ
チームの吸光度（280nm)から濃度を測定したところ、分
泌量は培養液１リットル当たり4.65mgだった（図２）。
また、同様にしてｐＣＳＨＹ−Ｒ３をパン酵母KK4 株に
導入し、精製された組換え型ヒトリゾチームの吸光度
（280nm)から濃度を測定したところ、分泌量は培養液１
リットル当たり3.95mgだった（図２）。
換カラム（Mono S HR5/5, ファルマシア) で組換え型ヒ
トリゾチームを精製した。濃縮液をカラムに流したとこ
ろ、市販のヒトリゾチームを流した時と同じ塩濃度(NaC
l ; 190mM)で溶出され、培養上清中の組換型ヒトリゾチ
ームが市販のヒトリゾチームと物理化学的に同一のもの
であることが確認された。精製された組換え型ヒトリゾ
チームの吸光度（280nm)から濃度を測定したところ、分
泌量は培養液１リットル当たり4.65mgだった（図２）。
また、同様にしてｐＣＳＨＹ−Ｒ３をパン酵母KK4 株に
導入し、精製された組換え型ヒトリゾチームの吸光度
（280nm)から濃度を測定したところ、分泌量は培養液１
リットル当たり3.95mgだった（図２）。
【００２１】これに対し、野生型ニワトリリゾチームシ
グナルペプチドによるヒトリゾチーム発現系（ｐＦＪ１
０５３）では、同様にして測定した分泌量は培養液１リ
ットル当たり2.05mgだった（図２）。以上より、アルギ
ニン残基を挿入した本発明の改変型ニワトリリゾチーム
シグナルペプチドは野生型ニワトリリゾチームシグナル
に比べて約２倍の組換え型タンパク質分泌能を示した。
グナルペプチドによるヒトリゾチーム発現系（ｐＦＪ１
０５３）では、同様にして測定した分泌量は培養液１リ
ットル当たり2.05mgだった（図２）。以上より、アルギ
ニン残基を挿入した本発明の改変型ニワトリリゾチーム
シグナルペプチドは野生型ニワトリリゾチームシグナル
に比べて約２倍の組換え型タンパク質分泌能を示した。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、酵母などの宿主細胞で
の組換え型タンパク質生産量を大幅に増大させることが
可能となり、サイトカインをはじめとする種々の組換え
型タンパク質製剤のコストダウンが実現するようにな
る。
の組換え型タンパク質生産量を大幅に増大させることが
可能となり、サイトカインをはじめとする種々の組換え
型タンパク質製剤のコストダウンが実現するようにな
る。
【００２３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director General of National Institute of Animal Health ; Yoshinori Tsuchiya <120> DNA CODING FOR MODIFIED-TYPE SIGNAL PEPTIDE <130> P98-0643 <160> 6 <170> Patent in Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 1 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu 1 5 10 15 Ala Ala Leu Gly <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 3 Met Arg Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Gly <210> 4 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ctgacagcta gagtcgacgt catgaggaga aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc 60 ctgcccctgg ctgctctggg gaaggtt 87 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ctgacagcta gagtcgacgt catgagaagg agaaggtctt tgctaatctt ggtgctttgc 60 ttcctgcccc tggctgctct ggggaaggtt 90 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence ＜４００＞ ６ ｇｃｃａａｇｃｔｔｇ ａｔｃａｔｔａｇａｃ ａｃｃａｃａａｃｃｔ ｔｇａ
ａｃｇｔａ ３８
ａｃｇｔａ ３８
【図１】分泌発現用プラスミドベクターの構築工程を示
す。
す。
【図２】野生型および改変型のニワトリリゾチームシグ
ナル配列のアミノ酸配列、およびこれらによる酵母系で
のヒトリゾチームの分泌量を示す。
ナル配列のアミノ酸配列、およびこれらによる酵母系で
のヒトリゾチームの分泌量を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 特開 平３−183479（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，265 （８），ｐ．4358−4363，1990 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ．，71，ｐ401−405，1993 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ＥＮＥＳＥＱ
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列のＮ末端領域
に、少なくとも一個の塩基性アミノ酸を付加したアミノ
酸配列からなる改変型シグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号１で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列の第１、第２
番目のアミノ酸の間に、少なくとも一個の塩基性アミノ
酸を付加したアミノ酸配列からなる改変型シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号１で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列の第１、第２
番目のアミノ酸の間に付加される塩基性アミノ酸が、Ar
g−Arg である、請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号１で表される野生型ニワトリリ
ゾチームシグナルペプチドのアミノ酸配列の第１、第２
番目のアミノ酸の間に付加される塩基性アミノ酸が、Ar
g−Arg−Arg である、請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれか１項に記載の
ＤＮＡを含有する、組換え型タンパク質分泌発現用プラ
スミド。 - 【請求項６】 請求項５に記載のプラスミドによって形
質転換された形質転換体。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP10356062A JP3136356B2 (ja) | 1998-12-15 | 1998-12-15 | 改変型シグナルペプチドをコードするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10356062A JP3136356B2 (ja) | 1998-12-15 | 1998-12-15 | 改変型シグナルペプチドをコードするｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000175686A JP2000175686A (ja) | 2000-06-27 |
| JP3136356B2 true JP3136356B2 (ja) | 2001-02-19 |
Family
ID=18447136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10356062A Expired - Fee Related JP3136356B2 (ja) | 1998-12-15 | 1998-12-15 | 改変型シグナルペプチドをコードするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3136356B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2022505B1 (en) | 2001-07-31 | 2011-12-14 | The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | GLP-1, exendin-4, peptide analogs and uses thereof |
| JP6048959B2 (ja) * | 2013-01-11 | 2016-12-21 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | リゾチームの製造方法 |
| JP6413313B2 (ja) * | 2013-04-24 | 2018-10-31 | 東ソー株式会社 | シグナルペプチドおよびそれを用いたタンパク質製造方法 |
| JP6206873B2 (ja) * | 2013-09-30 | 2017-10-04 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ニワトリリゾチーム由来の分泌シグナルペプチドを用いたブタリゾチームの製造方法 |
-
1998
- 1998-12-15 JP JP10356062A patent/JP3136356B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７１，ｐ４０１−４０５，１９９３ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（８），ｐ．４３５８−４３６３，１９９０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000175686A (ja) | 2000-06-27 |
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