JP3102612B2 - 凍結小胞体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ドラッグデリバリーシ
ステムとしての生体内でのターゲッティングあるいは徐
放性材料としての利用やヘモグロビン（以下、Ｈｂとい
う。）溶液を内包させた人工酸素運搬体への利用等、多
くの利用価値のあるリン脂質小胞体（以下、小胞体とい
う。）の長期安定保存を可能とする凍結体、即ち、凍結
リン脂質小胞体（以下、凍結小胞体という。）に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】小胞体は薬物のキャリアとしての応用の
検討が数多く進められているが、凝集や融合または各種
刺激による破壊があるなど不安定なものであり、長期保
存を可能にするには、添加剤や重合性リン脂質成分の高
分子化により安定化するのが一般的な手段である。

【０００３】小胞体の凍結体としの保存安定性について
は、例えば、糖やグリセロールを凍結保護剤として添加
すると凍結保存を行なうことができる（Ｋ．Ｍｉｙａｊ
ｉｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．，３４，２６８９（１９８６）；Ｇ．Ｓｔｒａｕｓ
＆ Ｈ．Ｈａｕｓｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，２４２２（１９８６）；
Ｄ．Ｊ．Ａ．Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ ＆ Ｅ．Ｍ．Ｇ．ｖ
ａｎ Ｂｏｍｍｅｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｒｅｓ，１５９（１９８４））。しかし、小胞体に対す
るその添加量は、１００ｍＭ以上を必要とし、ここに得
る分散溶液は粘性や浸透圧が高くなることが問題とされ
ている。

【０００４】また、二糖類を親水部に有するコレステロ
ール誘導体を小胞体表面に導入すると、凍結融解したと
き、もとの小胞体構造を維持してはいるものの、糖鎖が
短いため充分な安定性を得るには小胞体に対し該コレス
テロール誘導体の３０ｍｏｌ％の添加を必要とする
（Ｒ．Ｐ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ，Ｊ．５３ １２１ａ（１９８８）；Ｒ．Ｐ．Ｇ
ｏｏｄｒｉｃｈ ＆ Ｊ．Ｄ．Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅ
ｄｅｒ，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，２２，３６７（１９
９１））。

【０００５】さらに、三糖類の末端アノマー位にホスフ
ァチジルエタノールアミンを結合した糖脂質を小胞体に
導入すると、凍結融解を行なった後の内包色素分子（カ
ルセイン）の漏出が低く抑えられることが報告されてい
る（Ｙ．Ｓ．Ｐａｒｋ ＆Ｌ．Ｈｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１２４，２４１
（１９９２））。しかし、糖鎖長が短いので充分な安定
性を得るためには小胞体に１００ｍＭのトレハロースの
添加を必要としている。

【０００６】一方、多糖類にアルキル鎖を結合した糖脂
質で小胞体表面を被覆することにより凍結融解後も粒径
が維持されることが報告されているが（Ｍ．Ｇ．Ｌ．Ｅ
ｌｆｅｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１０６，２３（１９９
２））、構造が不明確であり、効果との相関を特定付け
ることは困難である。

【０００７】ポリビニルアルコールを親水部にもつ界面
活性剤で表面を被覆した小胞体は、凍結融解しても封入
インスリンの漏出と粒径の変化が低く抑えられることが
報告されているが（川島嘉明ら，日本薬学会第１１３年
会講演要旨集４、２９ＦＣー１６ー１（１９９３））、
その効果は充分ではない。また、ポリビニルアコールの
体内での代謝径路も明らかとされていない。

【０００８】本発明者らは、小胞体の安定化剤として、
長鎖アルキルを、構造の明確なオリゴ糖にエステル結合
したオリゴ糖脂質（以下、糖脂質という。）（特開平１
ー２９４７０１号公報）やオリゴ糖鎖末端アノマー位に
エーテル結合（特願平４ー１２６７１６号発明および特
願平４ー２０６１３６号発明）した糖脂質、同アミド結
合（特願平４ー１４８９２２号発明および特願平４ー１
９１３６４号発明）ならびに同エステル結合（特願平５
−７５０１６号発明）した糖脂質が小胞体の凝集や融合
の抑制剤等に使用できることを開示した。これは、小胞
体表面から伸びたオリゴ糖鎖が、小胞体間または小胞体
と細胞や蛋白質との間の接近を妨げる効果を利用したも
のであり、糖鎖が２〜３０単位数のものが優れた抑制効
果があることも開示した。さらにまた、これら糖脂質を
導入した小胞体は、減圧乾燥することにより小胞体の構
造を維持した安定な乾燥体とすることができ、純水を添
加して振盪すれば、もとの分散液系に復元し得ることも
開示した（特願平５−７５０１７号発明）。一方、該糖
脂質を安定化剤とした小胞体の凍結体に係る事項につい
ての既往の開示はない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明におい
ては、長時間保存可能で、しかも，単に融解するのみで
もとの構造と機能を保持・発現することのできる凍結小
胞体を得ることを技術的課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、前記する課題
を解決するために、糖質液を介することなしに得ること
ができる凍結小胞体に関するものである。即ち、本発明
は、小胞体に糖脂質を導入し凍結したことを特徴とする
凍結小胞体に係るものである。

【００１１】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
に使用する糖脂質は、その構造が糖単位数４〜３０の整
数で構成された還元糖の還元性末端基であるアルドース
のアノマー位に長鎖アルキルもしくは長鎖アルケニル
基、グリセロ骨格またはコレステロール等の疎水性基が
結合しているものであれば、生体からの抽出物であって
も、化学合成物であってもよい。生体由来糖質として
は、例えば、グリセロ糖脂質やスフィンゴ糖脂質などが
挙げられる。好ましくは、炭素数１２〜２２の長鎖アル
キルもしくは１から４の不飽和結合をもつ炭素数１２〜
２２の長鎖アルケニルをオリゴ糖鎖末端アノマー位にエ
ステル結合した構造の明確な糖脂質、同アルキルもしく
はアルケニルをオリゴ糖鎖末端アノマー位にエーテル結
合した構造の明確な糖脂質、同アルキルもしくはアルケ
ニルをオリゴ糖鎖末端アノマー位にアミド結合した構造
の明確な糖脂質、あるいは、２本の長鎖アルキルを有す
るアミドのＮ位にオリゴ糖鎖末端アノマー位に結合した
構造の明確な糖脂質がそれぞれ有効である。

【００１２】次に、糖脂質、即ち、糖単位数４〜３０の
整数で構成された糖脂質を小胞体膜成分として導入する
方法を記す。糖脂質とリン脂質など小胞体成分とをクロ
ロホルム、エーテルまたはこれらとメタノールとの混合
溶媒に溶解し、これをナス型フラスコ内で減圧乾燥し、
該フラスコの内壁に混合脂質の薄膜を形成させる。ある
いは、前記糖脂質と小胞体成分とをシクロヘキサン、ベ
ンゼン、ジオキサンまたはこれらとメタノールとの混合
溶媒に溶解し、これを凍結乾燥することにより混合脂質
の粉末を得る。糖脂質の含有量は総脂質に対し０．１〜
５０ｍｏｌ％、好ましくは１〜１０ｍｏｌ％とする。ま
た、糖脂質とリン脂質などの混合脂質をベンゼンなどの
有機溶媒に溶解後、少量のマンニトールを添加し、スプ
レードライ法により混合脂質粉末を得る。

【００１３】小胞体に内包せしめる機能性物質およびプ
ローブが水溶性である場合には、前記混合脂質薄膜また
は粉末に機能性物質およびプローブ（例えば、ビタミン
Ｃ、グルタチオン、カルボキシフルオレセイン（以下、
ＣＦという。）、グルコース、カルセイン、セファクロ
ル、セファゾリンナトリウム、ダウノマイシン、アドリ
アマイシン等）の水溶液を添加し振盪または攪拌して多
重層小胞体を得る。

【００１４】同様に、小胞体に内包せしめる機能性蛋白
質（例えば、インスリン、カタラーゼ、スーパーオキサ
イドディムスターゼ、Ｈｂ、エラスチン、コラーゲン
等）水溶液も前記操作により小胞体の内水相として多重
層小胞体を得ることができる。

【００１５】ここで、好ましくは前記内水相水溶液に、
グルコース、マルトース、ショ糖等の糖類を５０ｍＭ以
上、好ましくは、７５〜１５０ｍＭ添加することにより
凍結時の機能性物質の失活を抑えることができる。この
際、外水相には糖は全く必要がない。さらに、混合脂質
のエーテルまたはジクロロメタン溶液を該機能性物質水
溶液に添加して逆相法により多重層小胞体を調製するこ
ともできる。

【００１６】機能性物質またはプローブが脂溶性である
場合（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、
ビタミンＫ、サリチル酸、プロゲステロン、テストステ
ロンプロピオネート、エストラジオオール、ニフェジピ
ン（以下、ＮＦという。）、エリスロマイシン、プロス
タグランジン）では、該機能製物質を混合脂質を含んだ
有機溶媒の溶液に溶解し、次いで、前記した方法により
凍結乾燥粉末、または、薄膜、あるいは、スプレイドラ
イ粉末となし、これに純水または緩衝溶液あるいは生理
食塩水を添加して、振盪または攪拌することにより多重
層小胞体を得ることができる。

【００１７】ここに得たそれぞれの多重層小胞体分散液
は超音波照射するか、または、マイクロフルイダイザー
で処理するか、あるいは、エクストルージョン法により
多段階的に孔径の異なるフィルター通過を行なわせるこ
とにより所望の粒径に制御することができる。次いで、
外水相の未内包物質をゲルろ過カラムあるいは血漿分離
用ホローファイバーモジュールにより除去したあとその
まま用いるか、遠心洗浄で外水相部分を除去し、さら
に、超遠心機により濃縮することにより濃厚な糖脂質導
入小胞体を得ることができる。また、他の調製方法に
は、機能性物質内包小胞体分散液に糖脂質の分散液を添
加して静置することにより、外水相に面した小胞体膜表
面に糖脂質を導入する方法もある。このとき、機能性物
質内包小胞体分散液の混合脂質濃度（以下、脂質濃度と
いう。）は、０．０５〜１５ｇ／ｄｌを必要とする。

【００１８】機能性物質内包小胞体の凍結方法は、ドラ
イアイスと有機溶剤（例えば、メタノール、アセトン、
エタノール）を単独若しくは混合した冷媒、あるいは、
液体窒素、液体ヘリウムなどに試料の入った容器を浸漬
し瞬時に凍結させる。ここに得る凍結小胞体を−５℃以
下の温度で冷凍保存すると少なくとも１カ月間以上、ほ
ぼ１カ年間は安定に保存することができる。

【００１９】本発明の凍結小胞体の再生は、これを室温
で放置すればよいが、迅速に再生を行なうには、３０℃
以上の温水、好ましくは、３５〜６０℃の温水に容器ご
と浸漬して振盪すればよい。また、凍結小胞体の安定性
は再生して得られた小胞体の光散乱測定や透過型電子顕
微鏡観察による粒径の変化、分散液の濁度変化の測定、
あるいは、小胞体に内包させた機能性物質の漏出量の測
定から評価することができる。その漏出量は、分散液を
ゲルろ過し、全分画の機能性物質の量と小胞体分画中の
機能性物質の量の差分として求めることができる。さら
に、濃度消光したＣＦやカルセイン等の内包蛍光物質は
漏出すると蛍光を発するので、これを蛍光測定により検
出して算定する。本発明により得た凍結小胞体の粒径
は、凍結・解凍操作の前後に殆ど変化なく、解凍後も漏
出率が５％以下と極めて低く抑えることができる。

【００２０】

【作用】効率よく小胞体の表面を糖鎖で覆うためには、
小胞体の安定化剤として糖脂質を用いることが有力手段
である。糖脂質の糖鎖長に関しては、凍結小胞体となし
たとき糖単位数が３以下のものは十分な効果が無く、高
分子になると小胞体の凝集を誘発する。従って、糖脂質
は糖鎖がオリゴマー程度であり糖単位数が４〜３０のオ
リゴ糖鎖、好ましくは５〜１５のオリゴ糖鎖を有するも
のがよく、そのときは、小胞体の凍結体に十分な安定性
を賦与することができる。即ち、それぞれの目的に利用
される小胞体を固体として保存することが可能であり、
使用時に融解すれば、凍結操作前の分散液に戻すことが
できる。

【００２１】本発明により、不安定な機能性物質を小胞
体に担持または内包させたまま凍結保存することが可能
となるために、機能性物質の活性を失うことなく長期保
存が可能であり、緊急時には該凍結製剤を融解させて使
用が可能となり、該機能性物質の活性度の高い状態で迅
速に対処できる。また、小胞体を多量に体内投与する際
には、小胞体分散液の浸透圧が生理条件と同一で、しか
も小胞体濃度が高いことが要求されるが、本発明の凍結
小胞体では添加糖質を必要としないため、浸透圧上昇は
起こらず、融解して直ちに使用することができる。ま
た、融解後の粒径の増大が起こらないため、小胞体の血
中滞留時間が低下することがなく、内包物が漏出しない
ので運搬効率も低下しない。さらに、少量の糖脂質の導
入で凍結小胞体を安定保存することが可能であるため、
該小胞体の物理的特性を大きく変化させることはない。

【００２２】

【実施例】以下に実施例をもってさらに詳細に説明す
る。 実施例１．ヘキサデシルマルトペンタオンアミド（以
下、ＣＭＰＡという。）８. ８ｍｇをメタノール１ｍｌ
に溶解させ、ジパルミトイルグリセロホスファチジルコ
リン（以下、ＤＰＰＣという。）１００ｍｇを含むクロ
ロホルム溶液と混合し（モル比：ＤＰＰＣ／ＣＭＰＡ＝
５０／３）、該混合溶液についてロータリーエバポレー
ターを用いてナス型フラスコの内壁に薄膜を形成せしめ
た。ここに、少量のガラスビーズとともに、トリス緩衝
溶液（２０ｍＭ、ｐＨ７. ４）を用いて調製したＣＦ水
溶液（５０ｍＭ）１０ｍｌを添加し、５０℃にて攪拌し
た。進んで、前記の如くして得た小胞体分散液はエクス
トルージョン法により粒径１１７±３１ｎｍ（商品名：
Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ｎ４−ＳＤ；コ
ールター社製）のＣＦ内包小胞体分散液となした．つい
で、未内包ＣＦはゲルろ過（１０ｍｍｄ×１００ｍｍ
ｈ、商品名：セファロース ＣＬ−４Ｂ；ファルマシア
社製）により除去し、脂質濃度を０. １ｇ／ｄｌとし
た。

【００２３】前記ＣＦ内包小胞体分散液１ｍｌをドライ
アイス／メタノール寒剤にて凍結し、直ちに、２５℃に
て融解させた後、該小胞体分散液の蛍光強度を測定し
た。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名：キシ
ダ化学製）を用いて小胞体を破壊したときの蛍光強度か
ら、ＣＦの漏出率を測定したところ、４. ８％であり、
粒径は１２１±４５ｎｍであった。

【００２４】前記実施例１の結果を後記する比較例１お
よび比較例２の結果と比較する。 比較例１．実施例１のＣＦ内包小胞体分散液についてＣ
ＭＰＡを含まない系について同様の凍結融解を行った。
その結果、融解後のＣＦ漏出率は５８. ９％とかなり高
いものであった。

【００２５】比較例２．実施例１のＣＦ内包小胞体分散
液について、ヘキサデシルマルトトリオンアミド（以
下、ＣＭＴＡという。）を糖脂質として用いた系につい
ても同様の凍結融解を行った。融解後のＣＦ漏出率は２
７. ９％とかなり高いものであり、三糖誘導体では凍結
融解に対する小胞体の安定化効果は不十分であった。従
って、実施例１において小胞体に糖脂質を導入したこと
により、該小胞体は凍結融解に対してより安定なものに
なったということができる。

【００２６】実施例２．ＣＭＰＡ９６ｍｇをメタノール
２ｍｌに溶解し、ＤＰＰＣ、コレステロール（以下、Ｃ
ｈｏｌ. という。）およびパルミチン酸（以下、ＰＡと
いう。）からなる混合脂質（モル比：ＤＰＰＣ／Ｃｈｏ
ｌ. ／ＰＡ／ＣＭＰＡ＝７／７／２／１. ５）５００ｍ
ｇを含むクロロホルム溶液２０ｍｌと混合した。該混合
溶液につきロータリーエバポレーターを用いてナス型フ
ラスコの内壁に薄膜を形成せしめた。得られたナス型フ
ラスコ内壁の薄膜に、濃度４０ｇ／ｄｌの精製したスト
ローマ除去Ｈｂ水溶液１０ｍｌを添加・振盪したのち、
エクストルージョン法により粒径２０７±８６ｎｍのＨ
ｂ内包小胞体分散液を得た。外水相Ｈｂはゲルろ過にて
除去し、超遠心処理（５００００×ｇ、６０分）して上
澄みを除去し、生理食塩水を添加、再分散し、総脂質濃
度を１０ｇ／ｄｌとした。

【００２７】前記Ｈｂ内包小胞体分散液０. ５ｍｌをド
ライアイス／メタノール寒剤にて凍結した後、該凍結小
胞体を２５℃にて静置し融解させ、ゲルろ過した。その
Ｈｂ小胞体分画とＨｂ溶液分画のＨｂ濃度（シアン−メ
トヘモグロビン法により定量）から、Ｈｂ漏出率を算出
したところ、２. ５％であった。また、粒径分布は１９
９±７０ｎｍであり、凍結融解前後において粒径の変化
は殆ど認められなかった。この凍結小胞体をアンプル瓶
中に窒素下封入して−５℃にて保存したが、１年後、融
解したところ、粒径分布は２１２±８９ｎｍであり、漏
出率は３. ０％であったので、本発明により小胞体の長
期保存が可能であることが明かとなった。

【００２８】前記実施例２の結果を後記する比較例３お
よび比較例４の結果と比較する。 比較例３．実施例２のＨｂ小胞体分散液において、糖脂
質を含まない系について実施例２と同様の凍結融解を行
った。融解後のＨｂ漏出率は１１. ５％であった。ま
た、外水相にマルトースを血液の浸透圧（３００ｍＯｓ
ｍ）を超える４００ｍＭに相当する量を添加しても、Ｈ
ｂ漏出率は５. １％に抑えられる程度であった。ただ
し、この場合、浸透圧バランスが崩れるため、コロイド
浸透圧の調整が必要となり、このままでは容易に使用で
きない。

【００２９】比較例４．セロトリオースのアノマー位に
ドデシルアルコールをエーテル結合させた糖脂質（１−
Ｏ−セロトリオーシルドデカン（以下、ＣＴＤとい
う。））を使用してベンゼン溶液からの凍結乾燥により
得た混合脂質（モル比：ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ. ／ＰＡ／
ＣＴＤ＝７／７／２／１. ５）５００ｍｇより、実施例
２と同様の方法に従い、濃厚Ｈｂ内包小胞体分散液（脂
質濃度１０ｇ／ｄｌ、平均粒径２２５±８８ｎｍ）を調
製し凍結融解を行った。該凍結小胞体の融解後のＨｂ漏
出率は８. ６％であり、平均粒径は２５９±１２１ｎｍ
と多分散になり、濁度が上昇していた。従って、凍結す
る小胞体に導入する糖脂質としては、単糖類の誘導体は
凍結小胞体の安定性賦与に不適当であった。

【００３０】実施例３．糖脂質として糖鎖末端アノマー
位に疎水性基をエーテル結合したステアリルラミナリー
ヘプタオース（以下、ＳＬＨという。）を、ジミリスト
イルグリセロホスファチジルコリン（以下、ＤＭＰＣと
いう。）、Ｃｈｏｌ. 、ジパルミトイルグリセロホスフ
ァチジン酸（以下、ＤＰＰＡという。）とともに（モル
比：ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ. ／ＤＰＰＡ／ＳＬＨ＝７／７
／２／１）ベンゼン／メタノール混合溶媒に溶解し、凍
結乾燥した。得られた混合脂質凍結乾燥粉末１０ｇにグ
ルコース水溶液（１０ｍＭ）１００ｍｌを添加し、マグ
ネチックスターラーを用いて４℃にて２４時間攪拌し
た。ここで得た小胞体分散液をマイクロフルイダイザー
を用い、４℃、８０００ｐｓｉ、１０分の条件で処理
し、平均粒径１０４±３９ｎｍの小胞体分散液を得た。
外水相のグルコースをホローファイバーモジュールを用
いて除去後濃縮し、脂質濃度５ｇ／ｄｌとした。これを
凍結融解させたところ、グルコースセンサーを用いて測
定したグルコースの漏出率は３. ９％その平均粒径は１
０３±４１ｎｍであった。さらに、凍結したものを−３
０℃にて１年間保存後、融解した小胞体の粒径分布は１
０７±４３ｎｍ、漏出率は３. ６％であり、極めて安定
なものであった。

【００３１】実施例４．１, ２−ジ−Ｏ−オクタデシル
−３−α（β）−マルトエイコサペンタオニル−ｒａｃ
−グリセリド９. ６ｍｇとＤＰＰＣ粉末５０ｍｇとをメ
タノール／ジオキサン混合溶媒に溶解し、凍結乾燥して
乾燥粉末を得た。カルセインを４０ｍｇ含むリン酸緩衝
液（５０ｍＭ、ｐＨ７. ４）を２. ５ｍｌ添加し、窒素
雰囲気下、０℃にて３０分間超音波照射することにより
平均粒径５１±１１ｎｍの小胞体分散液を調製した。こ
のとき、孔径０．２２μｍの滅菌フィルターを通過させ
た。そして、ゲルろ過により外水相の未内包カルセイン
を除去した。該小胞体分散液を１０回凍結融解させたと
ころ、内包物の漏出率は５. ０％であり、平均粒径は６
２±３１ｎｍであって、本実施例で得た小胞体は凍結融
解に対して極めて安定したものであった。

【００３２】実施例５．モノシアロガングリオシド（商
品名：ＧＭ１；シグマ社製）と混合脂質（モル比：ＤＰ
ＰＣ／Ｃｈｏｌ. ／ジパルミトイルホスファチジルグリ
セロール＝５／４／１）とを混合し、メタノール／クロ
ロホルム混合溶媒に溶解し、実施例１と同様に薄膜を形
成せしめた。これをボルテックスにより多重層小胞体分
散液としたあと、スプレードライにより混合脂質粉末を
得た。この粉末を７０ｍＭのカルセインを含む１０ｍＭ
のトリス緩衝液（ｐＨ７. ４）５０ｍｌを添加し、６時
間室温で攪拌した。エクストルージョン法にて平均粒径
を２００±３５ｎｍとし、遠心分離（１０００００×
ｇ、３０分）による洗浄と濃縮により脂質濃度６ｇ／ｄ
ｌの平均粒径１９９±３７ｎｍの小胞体分散液を得、実
施例１記載の方法と同様にして凍結融解を行った。凍結
小胞体を窒素で封入し、−２０℃にて保存した。３０日
後にこの凍結小胞体を融解させたところ、平均粒径は２
０２±３９ｎｍ、カルセイン漏出率は２.４％と低く抑
えられ、安定したものであった。

【００３３】実施例６．マルトペンタオースの還元性末
端基を酸化してカルボン酸とし、これにＣｈｏｌ．をエ
ステル結合させたマルトペンタオースモノコレステリル
エステル（以下、ＭＰ−Ｃｈｏｌ. という。）を小胞体
に導入する糖脂質として使用した。該糖脂質１０９ｍｇ
をメタノール２ｍｌに溶解し、これをＤＰＰＣ、Ｃｈｏ
ｌ. 、およびＰＡからなる混合脂質（モル比：ＤＰＰＣ
／Ｃｈｏｌ. ／ＰＡ／ＭＰ−Ｃｈｏｌ. ＝７／５／２／
２）５００ｍｇを含むクロロホルム溶液２０ｍｌと混合
する。以下、実施例１と同様に該混合液につきロータリ
ーエバポレーターを用いてナス型フラスコの内壁に薄膜
を形成せした。ここに、濃度４０ｇ／ｄｌの精製したス
トローマ除去Ｈｂ水溶液１０ｍｌを添加・振盪し、エク
ストルージョン法により粒径２０５±７４ｎｍのＨｂ内
包小胞体分散液を得た。未内包Ｈｂをホローファイバー
モジュール（商品名：ＳＬＰ ｓｅｒｉｓｅ；旭硝子
製）を用いて除去した後、超遠心処理（５００００×
ｇ、６０分）により濃縮し、総脂質濃度を１０ｇ／ｄｌ
とした。

【００３４】前記Ｈｂ内包小胞体分散液０. ５ｍｌをド
ライアイス／メタノール寒剤にて凍結した後、該凍結小
胞体を２５℃にて静置し融解させ、ゲルろ過した。その
Ｈｂ小胞体分画とＨｂ溶液分画のＨｂ濃度定量から、Ｈ
ｂ漏出率を算出したところ、２. ３％であった。また、
粒径分布は２０７±７９ｎｍであり、凍結融解前後にお
いて粒径の変化は殆ど認められなかった。この凍結小胞
体をアンプル瓶中に窒素下封入して−２０℃にて保存し
半年後に融解したところ、粒径分布は２１１±８５ｎｍ
であり、漏出率は３. ０％であったので、本発明の凍結
小胞体は長期保存が可能であることが明かとなった。

【００３５】実施例７．平均分子量５０ｋＤａのプルラ
ン（林原生物化学研究所製）をプルラナーゼ（商品名：
プルラナーゼ アマノ；天野製薬製）を用いて加水分解
処理したのち、ゲルろ過カラム（商品名：ＴＳＫｇｅｌ
ＰＷ−３０００；東ソー製）およびオクタデシル基化
学結合型シリカゲルカラム（商品名：ＹＭＣｐａｃｋ
ＯＤＳ−ＡＱ；ＹＭＣ社製）にて糖重合度１５のプルラ
ンを分離精製し出発原料とした。ここに得たプルランの
還元性末端基を酸化脱水して１，５−ラクトンとし、こ
れにジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを
アミド結合させたプルランジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミド３４. １ｍｇをメタノ−ル２ｍｌに
溶解し、ＤＰＰＣ１００ｍｇを含むクロロホルム溶液４
０ｍｌと混合し、該混合溶液に、ＮＦ５. ０ｍｇを含む
クロロホルム溶液５ｍｌを添加した。該混合溶液につ
き、ロータリーエバポレーターを用いてナス型フラスコ
の内壁に薄膜を形成せしめたのち、生理食塩水２０ｍｌ
を添加し、エクストルージョン法により粒径１００±２
７ｎｍのＮＦ包埋小胞体分散液を得た。該小胞体分散液
０. ５ｍｌを凍結乾燥させ、得られた粉末にメタノール
を添加し、１００ｍｌに定容する。この液５ｍｌを正確
に量り、メタノールを加えて１００ｍｌに定容する。こ
の溶液の３５０ｎｍ付近の吸収極大波長における吸光度
を測定したところ、添加したＮＦの１００％が小胞体二
分子膜中に包埋されたことが確認された。

【００３６】前記小胞体分散液２ｍｌを液体窒素にて凍
結させ４０℃にて融解させた。ゲルろ過後、ＮＦの定量
分析を行ったところ、二分子膜中への保持率は９９. ８
％であった。粒径は１０５±３１ｎｍであり、凍結融解
に対する安定性は極めて高いものであった。また、この
凍結小胞体をアンプル瓶中に窒素封入下−５℃にて保存
したが、１８０日後に融解してもＮＦ保持率は９９. ７
％、粒径は１０７±３３ｎｍであり、長期保存が可能で
あることが確認された。

【００３７】実施例８．ヘキサデシルマルトペンタオネ
ート９３. ８ｍｇをメタノール１ｍｌに溶解し、水素添
加大豆レシチン（以下、ＨＳＰＣという。）、Ｃｈｏ
ｌ. およびステアリン酸（以下、ＳＡという。）からな
る混合脂質（モル比：ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ. ／ＳＡ＝５
／４／１）５００ｍｇを含むベンゼン溶液５０ｍｌと混
合し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥粉末に１５０ｍ
Ｍにてトレハロースを含む３８. ５ｍｇ／ｄｌ中性イン
スリン水溶液（リン酸緩衝液、ｐＨ７. ４）１０ｍｌを
添加し、４℃にて１２時間攪拌した。ここに得たインス
リン内包小胞体分散液につき、エクストルージョン法に
より粒径を１９８±７７ｎｍとした。ゲルろ過により未
内包インスリンを除去した後、超遠心処理（３００００
０×ｇ、３０分）により脂質濃度を５. ０ｇ／ｄｌとし
た。

【００３８】前記インスリン内包小胞体分散液を液体窒
素中にて凍結させ、３７℃にて融解した。融解後の小胞
体分散液をゲルろ過し、漏出したインスリンを定量した
ところ、漏出率は２. １％、粒径は２０１±８１ｎｍで
あった。この凍結小胞体を−３０℃にて保存し、３０日
後に２５℃にて融解した。その時、インスリンの漏出率
は２. ８％、粒径は２０８±９５ｎｍであって極めて安
定したものであった。。

【００３９】実施例９．１, ２−ｄｉ−Ｏ−ヘキサデシ
ル−３−Ｏ−ラミナリーヘキサオーシル−ｒａｃ−グリ
セロール２３５. ４ｍｇをメタノール３ｍｌに溶解し、
ＨＳＰＣ１ｇを含むクロロホルム溶液と混合し、該混合
溶液をロータリーエバポレーターを用いてナス型フラス
コの内壁に薄膜を形成せしめた。この薄膜に１００ｍＭ
のマルトースを含むセファクロル水溶液（濃度：４ｇ／
ｄｌ）１０ｍｌを添加し、超音波照射により粒径８５±
７ｎｍの小胞体分散液を得た。小胞体分散液中の未内包
のセファクロルをゲルろ過にて除去した後、超遠心処理
（４５００００×ｇ、６０分）により脂質濃度を１０ｇ
／ｄｌまで濃縮した。

【００４０】前記の如くして得た小胞体分散液をドライ
アイス／メタノール寒剤にて凍結させ、６０℃にて融解
させた。融解後、小胞体分散液をゲルろ過したところ、
セファクロルの漏出率は３. ８％、粒径は９９±２１ｎ
ｍであった。また、この凍結小胞体を−５℃にて保存
し、１８０日後に６０℃にて融解したところ、セファク
ロルの漏出率は４. ３％、粒径は１０７±３５ｎｍであ
って、極めて安定的に保存されたことが明らかとなっ
た。

【００４１】実施例１０．Ｎ−マルトペンタオシル，Ｎ
−ステアリルラウルアミド２２６．４ｍｇをメタノール
５ｍｌに溶解させ、ＤＰＰＣ、Ｃｈｏｌ. およびＰＡよ
りなる混合脂質（モル比：ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ. ／ＰＡ
＝７／７／２）１ｇを含むベンゼン／メタノール溶液と
混合し、スプレードライを行った。得られたスプレード
ライ粉末に１５０ｍＭのショ糖を含むセファゾリンナト
リウム水溶液（濃度２５ｇ／ｄｌ）１０ｍｌを添加し、
４０℃にて８時間攪拌したのち、エクストルージョン法
により粒径２１７±５６ｎｍの小胞体分散液を得た。該
小胞体分散液を超遠心分離（４５００００×ｇ、６０
分）により洗浄濃縮を行い、その脂質濃度を５. ０ｇ／
ｄｌとした。

【００４２】前記小胞体分散液をドライアイス／メタノ
ール寒剤を用いて凍結させ、５０℃にて融解させた。こ
れをゲルろ過したところ、セファゾリンナトリウムの漏
出率は４. １％であり、粒径は２１９±５７ｎｍであっ
た。また、得られた小胞体をアンプル瓶中にて窒素封入
下、−３０℃にて１年間保存したところ、融解後のセフ
ァゾリンナトリウムの漏出率は４. ３％、粒径は２２０
±５９ｎｍであって、その安定性は優れて実用性に富む
ものであった。

【００４３】

【発明の効果】本発明の凍結小胞体、即ち、リン脂質小
胞体に糖脂質を導入し、かつ、機能性物質を内包あるい
は該小胞体二分子膜中に保持せしめたのち急速冷凍して
得た凍結小胞体は、−５℃以下の温度で長時間保存して
も、解凍時に小胞体の粒径の変化や内包物の漏出が殆ど
なく、その安定性は顕著なものがある。従って、本発明
は、当業界に貢献するところ甚だ大きいものがある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 武岡 真司 東京都新宿区西早稲田１丁目３番19号 201 (72)発明者 酒井 宏水 東京都練馬区関町南１丁目６番29号 (72)発明者 土田 英俊 東京都練馬区関町南２丁目10番10号 (56)参考文献 特開 平１−294701（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−30708（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ，1106，（1992），Ｍａｒｉｅｋ ｅ Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ”Ｔｈｅ ｓ ｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔ ｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏ ｍｕｓ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｘ ｔｒａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｂ ｅａｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｎｃｈｏｒ ｇｒｏｕｐｓ”，ｐ. 23−30 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 47/26 A61K 47/28 A61K 47/42

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リン脂質小胞体に糖脂質を導入し、該分散
   液を凍結した凍結小胞体であって、糖脂質が糖単位数４
   〜３０の整数で構成された還元オリゴ糖の還元性末端基
   であるアルドースのアノマー位に疎水性基を結合したオ
   リゴ糖脂質である凍結小胞体。
2. 【請求項２】疎水性基の結合がエステル結合である請求
   項１記載の凍結小胞体。
3. 【請求項３】疎水性基の結合がエーテル結合である請求
   項１記載の凍結小胞体。
4. 【請求項４】疎水性基の結合がアミド結合である請求項
   １記載の凍結小胞体。
5. 【請求項５】疎水性基が炭素数１２〜２２のアルキル鎖
   で構成されたものである請求項１、請求項２、請求項３
   または請求項４記載の凍結小胞体。
6. 【請求項６】疎水性基が１から４の不飽和結合をもつ炭
   素数１２〜２２のアルケニル鎖で構成されたものである
   請求項１、請求項２、請求項３または請求項４記載の凍
   結小胞体。
7. 【請求項７】疎水性基がコレステロールである請求項
   １、請求項２、請求項３または請求項４記載の凍結小胞
   体。
8. 【請求項８】疎水性基がグリセロ骨格で構成されたもの
   である請求項１、請求項２、請求項３または請求項４記
   載の凍結小胞体。
9. 【請求項９】リン脂質小胞体の内水相に水溶性の蛋白質
   を内包させたことを特徴とする請求項５、請求項６、請
   求項７または請求項８記載の凍結小胞体。
10. 【請求項１０】リン脂質小胞体の内水相に水溶性の低分
    子薬剤を内包させたことを特徴とする請求項５、請求項
    ６、請求項７または請求項８記載の凍結小胞体。
11. 【請求項１１】リン脂質小胞体の二分子層中に脂溶性薬
    剤を溶解させたことを特徴とする請求項５、請求項６、
    請求項７または請求項８記載の凍結小胞体。