JP3100202B2

JP3100202B2 - サフランの細胞融合方法

Info

Publication number: JP3100202B2
Application number: JP03296651A
Authority: JP
Inventors: 啓二高木
Original assignee: 御木本製薬株式会社
Priority date: 1991-10-17
Filing date: 1991-10-17
Publication date: 2000-10-16
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: JPH05103664A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はサフランの細胞融合方法
に関する。更に詳しくは増殖速度の早いサフラン細胞と
色素生産の多いサフラン細胞など、特性の異なる２種以
上のサフランのプロトプラストを細胞融合させ、色素を
効率的に得る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】サフランはアヤメ科の多年生草本クロッ
カス・サティバスＬ．(Crocus Sativus L.）であり、
柱頭部を乾燥したものを生薬として用いる。スペイン、
フランス、イタリア、わが国では広島、香川、大分、岩
手の各県で生産されている。成分としては、カロチノイ
ド色素約２％を含み、その成分はクロシン（クロセチン
の配糖体）で、また苦味配糖体ピクロクロシン（Picroc
rocin ）約２％、精油０．４〜１．３％を含む。精油の
主成分はサフラナール（生薬特有の芳香成分）である。

【０００３】このサフランは香辛料、食品用着色料とし
て、或いは薬用として利用されているが、そのメシベの
乾燥物を利用するので天然物では、取れる量が少なく、
その単価も非常に高い。また、天然品では気候の変化を
受け、一定の品質のものが得られにくい。そこで、組織
培養が各種試みられている。

【０００４】例えば、特開昭６２−２７５６１７号公報
には、クロッカス・サティバスＬ．すなわちサフラン
の雌ずい又はそれに相当する器官をサイトカイニン又は
サイトカイニン及びオーキシンを含有する人工培養基に
て生長、肥大成熟させる方法が開示されている。サイト
カイニンは古くより植物培養細胞の細胞分裂を誘起する
物質として知られており、又オーキシンと併用すること
で、カルスの誘導や細胞増殖が促進されることも知られ
ている。

【０００５】特開昭６３−１０９７８８号公報には、ク
ロッカス・サティバスＬ．の雌性器官を摘出してサイ
トカイニンを含有する人工培養基で培養し、サフラナー
ル、ピクロクロシン及びそれらの類似体、クロシン、ク
ロセチン及びそれらの類似体よりなる群より選ばれた１
以上の物質を生産することが開示されている。しかし、
サフランの雌ずいに、これらの物質が含まれていること
は古くより知られていることである。

【０００６】特開昭６３−１６０５８０号公報には、ク
ロッカス属植物のカルスを植物ホルモン添加のＭＳ培地
で培養することが開示されている。植物組織の培養にオ
ーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンを使用する
ことは古くよりよく知られており、ムラシゲ・スクーグ
培地も通常用いられている培地である。

【０００７】特開昭６３−２５８５７４号公報には、サ
フランの柱頭、花柱、子房、胚珠、花弁の部分を摘出
し、これを切り分けた組織をサイトカイニンとオーキシ
ンを添加したＬＳ培地又はＢ５培地に移植し、継代培養
することが開示されている。植物の部分を摘出、切り分
けて培養することは古くより行なわれ、サイトカイニン
やオーキシンの植物ホルモンも通常使用され、リンスマ
イヤー・スクーグの培地、ガンボルグ培地なども通常用
いられている培地である。

【０００８】これらの何れの方法を試験しても、それほ
どサフランの有効成分の増殖の速度が増すことはない
し、有効成分が飛躍的に増産されるわけではない。これ
らの方法は、植物体の一部を切りとり、適当な条件下で
培養して得られる、いわゆるカルス誘導法に属するもの
である。サフランのプロトプラストの細胞融合に関する
ものは見当らない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、サフ
ランの有効成分の一つであるクロシン、クロセチンの色
素を効率的に得られるサフランの株を得るため、遺伝的
修飾を加えるのに適したプロトプラストの細胞融合の方
法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【００１０】本発明者は、前記課題を解決するため鋭意
研究を行った結果、サフランの細胞をプロトプラストに
し、さらにこれを細胞融合することによって、色素生産
性の高い且つ、増殖率の高い融合細胞を選択培養するこ
とによって所期の目的を達成できることを知見し、本発
明を完成した。

【００１１】すなわち本発明は、（１）サフランの、少なくとも増殖速度の速い細胞
と、色素生産の多い細胞をそれぞれプロトプラスト化
し、両者のプロトプラスト懸濁液を混合し、細胞融合剤
を添加し、融合したプロトプラストを培養することを特
徴とするサフランの細胞融合方法、（２）プロトプラスト作成時に、第１段階で細胞接着
物質溶解酵素による酵素処理、第２段階で細胞接着物質
溶解酵素と、細胞壁溶解酵素との混合酵素による酵素処
理を行なう２段階の酵素処理をすることを特徴とする上
記（１）に記載のサフランの細胞融合方法、（３）細胞融合したプロトプラストをアガロースに埋
め込んだ状態で培養することを特徴とする上記（１）ま
たは（２）に記載のサフランの細胞融合方法、（４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細
胞融合方法により得られる、増殖速度が速く、かつ、色
素生産量が多いサフランの融合細胞、である。

【００１２】先づサフランのプロトプラストの作成方法
について述べる。用いる細胞は培養したものでも植物体
から切り出したものでも差し支えない。植物体から切り
出したものを利用する場合は常法で滅菌したサフランの
切片を用い、培養したものを用いる場合は例えば本出願
人による特願平３−１７９０５３号の方法も用いること
ができる。

【００１３】これに用いる培地としては、特に限定され
ずムラシゲ・スクーグ（Murashigeand Skoog)の培地、
ホワイト(White) の培地、ガンボルグ(Gamborg) らの培
地、ニッチュ(Nitsch)の培地、ヘラー(Heller)の培地、
シェンク・ヒルデブランド(Schenk and Hildebrandt)の
培地、ニッチュ・ニッチュ(Nitsch and Nitsch) の培
地、ノップ(Knop)の培地、リンスマイヤー・スクーグ(L
insmaier and Skoog) の培地などの培地がある。

【００１４】これらの培地に、必要により、植物生長調
節物質として知られるサイトカイニン、オーキシンを添
加してもよい。サイトカイニンとしては、ベンジルアデ
ニン、ゼアチン、カイネチン等が例示でき、これらをそ
の種類によって異なるが、添加するときは０．０１〜２
０ppm添加する。オーキシンにはナフタレン酢酸、イン
ドール酢酸、２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸等が例示
でき、これらをその種類によって異なるが添加するとき
は０．０１〜２０ppm 添加する。

【００１５】また、必要により、他の培地用薬剤も添加
することができる。また、温度は２０〜２５℃で暗所で
培養する。

【００１６】これにより植物体より切り出した細胞或い
は培養細胞を用いるが、特にサフランカルスより再分化
したメシベ組織を用いるとよい。その方法は上記のよう
な培養方法で培養した細胞のうち、サフランカルスより
再分化したメシベ組織を選択すればよい。

【００１７】これに浸透圧調整用としてグルコース、サ
ッカロース、マンニトール、ソルビトール、フィコー
ル、パコール等を０．３〜０．７モル、ＰＨは４．５〜
６．５に調整した溶液の中で所定の酵素を作用させる。
酵素として細胞壁溶解酵素のセルラーゼ、ドリセラー
ゼ、マセロザイム、ペクトリアーゼ等をそれぞれ０．０
５〜２．０％、好ましくは２種類以上を合計０．１〜
６．０％、温度は２５〜３５℃で作用時間は条件によっ
て異なるが１〜５時間作用させる。

【００１８】特に第１段階では通常通り、細胞接着物質
溶解酵素による酵素処理を行うが、第２段階で、細胞接
着物質溶解酵素と、細胞壁溶解酵素との混合酵素による
酵素処理を行う２段階で処理するとプロトプラストの得
られる確率が上がる。この場合、第１段階の酵素処理は
酵素として細胞接着物質溶解酵素例えばドリセラーゼと
ペクトリアーゼをそれぞれ０．０５〜２．０％、温度は
２５℃〜３５℃で作用時間は条件によって異なるが１〜
３時間作用させる。その後、第２段階の酵素処理として
ドリセラーゼとペクトリアーゼをそれぞれ０．０５〜
２．０％、細胞壁溶解酵素例えばセルラーゼを０．１〜
２．０％、温度は２５〜３５℃で作用時間は条件によっ
て異なるが１〜３時間作用させる。これによって第２段
階にも細胞壁溶解酵素を混合することによりプロトプラ
ストの得られる確率が上がる。又第２段階処理前にメッ
シュ濾過を行うことでプラストに不向きな細胞或いはそ
の破片を除くことができる。タバコ等葉肉組織よりプロ
トプラストを得る方法は、葉肉組織の組織学的な性質
上、酵素処理は２段階に行われる。即ち、先づ、細胞を
相互に溶着している物質をペクチナーゼ等で溶解し細胞
を単離し、続いて細胞壁をセルラーゼ等で溶解してプロ
トプラストを得る。この方法は、タバコ以外にも多くの
葉肉細胞のプロトプラストの単離に適用されたが、植物
によっては、なかなかプロトプラストになり難いものも
あり、個々の材料についてプロトプラスト単離の最適の
条件を見い出す必要がある。一方、培養細胞のプロトプ
ラスト化においても、培養細胞の起源、細胞株、培養条
件によって、プロトプラスト化の難易が支配されてお
り、培地組成、植物生長物質の組み合わせで変化する。
サフラン培養細胞より得られたメシベは、その表皮細胞
が強固なこと、細胞間の細胞壁もかなり肥厚しているこ
とが判明したので、第１段階処理で表皮細胞を遊離させ
やすくし、第２段階で、表皮細胞及び表皮より内側の細
胞の両方の細胞をプロトプラスト化できるような酵素溶
液の配合を作成した結果、好結果が得られた。

【００１９】上記の方法を用いて例えば増殖速度の早い
細胞と色素生産の多い細胞をそれぞれプロトプラスト化
する。得られたプロトプラストはナイロンメッシュで濾
過と遠心分離で精製し、プロトプラスト化したときと同
様な浸透圧とｐＨに調整した液で密度を１×１０³〜１
×１０⁴にそれぞれ懸濁する。両方のプロトプラスト懸
濁液を混合し、５〜３０分間静置する。この混合液に細
胞融合剤を添加し１〜５分軽く撹拌し、５〜３０分静置
する。細胞融合剤にはポリエチレングリコール（分子量
３００〜６０００）ポリビニルアルコール等を種類によ
って異なるが、１０〜５０％濃度で作用させる。

【００２０】その後、プロトプラスト化したときと同様
な浸透圧調整と高めのｐＨ即ちｐＨ９〜１１に調整した
液で、液を１０〜５０倍に希釈して、細胞融合剤を除去
して、５〜３０分間静置する。この融合した細胞を培養
する。この場合、液体培地にアガロースが０．３〜０．
７％になるように加えた培地にプロトプラストを包埋さ
れるように入れて培養する。サフランプロトプラスト
は、このようにアガロースゲルに埋め込んだ状態で培養
しないと、コロニーとして発育しない。例えばプロトプ
ラストの懸濁液をピペットで吸い上げた後、アガロース
ゲルの培地に突き刺し、その後中身を押し出してゲル中
にプロトプラストを包埋する。

【００２１】アガロースは市販のものでよく、できれば
低融点アガロースがよい。アガロースは、〔Ｃ₁₂Ｈ₁₄Ｏ
₅（ＯＨ）₄〕_nの式で表わされる多糖類で、ほとんど
Ｄ‐ガラクトースと、３，６‐アンヒドロ‐Ｌ‐ガラク
トースのみからなり、その存在比は１：１である。これ
に用いる培地としては、特に限定されずムラシゲ・スク
ーグ（Murashigeand Skoog)の培地、ホワイト(White)
の培地、ガンボルグ(Gamborg) らの培地、ニッチュ(Nit
sch)の培地、ヘラー（Heller）の培地、シェンク・ヒル
デブランド(Schenk and Hildebrandt)の培地、ニッチュ
・ニッチュ(Nitsch and Nitsch) の培地、ノップ(Knop)
の培地、リンスマイヤー・スクーグ(Linsmaier and Sko
og)の培地などの培地がある。

【００２２】これらの培地に、必要により、植物生成調
節物質として知られるサイトカイニン、オーキシンを添
加してもよい。サイトカイニンとしては、ベンジルアデ
ニン、ゼアチン、カイネチン等が例示でき、これらをそ
の種類によって異なるが、添加するときは０．０１〜２
０ppm添加する。オーキシンにはナフタレン酢酸、イン
ドール酢酸、２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸等が例示
でき、これらをその種類によって異なるが添加するとき
は０．０１〜２０ppm 添加する。

【００２３】また、必要により、他の培地用薬剤も添加
することができる。また、温度は２０〜２５℃で暗所で
培養する。

【００２４】

【実施例】以下に実施例によって本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではい。（実施例１）ａ、細胞の選択花芽が１０cm位に伸びたサフランの球根の外皮を剥き変
色した部分を除去した後、流水で３時間洗浄した。１０
％塩化ベンザルコニウムに３〜４秒、７０％エタノール
に１〜２秒、５％次亜塩素酸ナトリウムに２０〜４０分
浸漬した。そののちは無菌的に行った。花芽を球根の部
分を残して切り取り滅菌水で３回洗浄した。次に花芽か
ら蕾を取り出して切開しメシベを花柱を長くつけた状態
で取り出し培地に接種した。培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅ
ａｎｄＳｋｏｏｇの培地にサッカロース４％、寒天
末０．９％、ＰＨ５．８に調整した。これにナフタレン
酢酸１０ppm 、ベンジルアデニン１ppm を加えた。

【００２５】ｂ、プロトプラスト化この条件で培養したサフランカルスをドリセラーゼ１．
０％、ペクトリアーゼ０．１％、マンニトール０．６モ
ル、ｐＨ５．５の酵素液中で３０℃１時間振とうさせた
後、２００メッシのナイロンメッシュで濾過後、メッシ
ュ上に残った細胞をドリセラーゼ１．５％、ペクトリア
ーゼ０．０５％、セルラーゼ０．５％、マンニトール
０．６モル、ｐＨ５．５の酵素液中で３０℃２時間３０
分間作用させた後２００メッシのナイロンメッシュで濾
過後、メッシュを通過する部分を６００rpm で遠心分離
を行いプロトプラストを得た。これを密度５×１０⁴ce
ll／mlになるように０．６モルマンニトール水溶液に懸
濁した。これを増殖速度の早い細胞と色素の生産が多い
細胞について行いこのプロトプラストを混合した。

【００２６】ｃ、細胞融合この液にポリエチレングリコール１５４０を５０％とな
るように加えて５分間軽く撹拌し、２５分間放置した。
その後０．６モルマンニトールｐＨ１０．５の水溶液を
１０倍量加えて３０分間放置した。

【００２７】ｄ、培養方法ＭＳ培地にサッカロース４％と２，４‐ジクロロフェノ
キシ酢酸０．５ppm、カイネチン０．１ppm をｐＨ５．
８に調製し、アガロース０．６％を添加し加熱撹拌後ガ
ラスシャーレに分注し固化した。これにプロトプラスト
０．６モルマンニトール水溶液懸濁液をガラス管で吸い
上げゲルに突き刺し中身を押し出しサフランプロトプラ
ストをアガロースゲルに包埋した。これをパラフィルム
で密封し２３℃暗所で２か月培養した。

【００２８】（実施例２）花芽が１０cm位に伸びたサフ
ランの球根の外皮を剥き変色した部分を除去した後、流
水で３時間洗浄した。１０％塩化ベンザルコニウムに３
〜４秒、７０％エタノールに１〜２秒、５％次亜塩素酸
ナトリウムに２０〜４０分浸漬した。そののちは無菌的
に行った。花芽を球根の部分を残した切り取り滅菌水で
３回洗浄した。次に花芽から蕾を取り出して切開しメシ
ベを花柱を長くつけた状態で取り出し培地に接種した。
培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇの培地
にサッカロース４％、寒天末０．９％、ＰＨ５．８に調
整した。これにナフタレン酢酸５ppm 、ベンジルアデニ
ン０．５ppm を加えてカルスより再分化したメシベを採
取した。

【００２９】ｂ、プロトプラスト化この条件で培養したサフランメシベをセルラーゼ１．０
％、ドリセラーゼ２．０％、マセロザイム０．５％、マ
ンニトール０．６モル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃
１時間振とうさせ検鏡で確認後、２００メッシのナイロ
ンメッシュで濾過後、メッシュを通過する部分を６００
rpm で遠心分離を行いプロトプラストを得た。これを密
度５×１０⁴cell／mlになるように０．６モルマンニト
ール水溶液に懸濁した。上記の手段を増殖速度の早い細
胞と色素の生産が多い細胞について行いこのプロトプラ
ストを混合した。

【００３０】ｃ、細胞融合この液にポリエチレングリコール１５４０を５０％とな
るように加えて５分間軽く撹拌し、２５分間放置した。
その後０．６モルマンニトールｐＨ１０．５の水溶液を
１０倍量加えて３０分間放置した。

【００３１】ｄ、培養方法実施例１の培養方法を用いて培養した。

【００３２】（実施例３）ａ、細胞の選択実施例２の細胞の選択方法を用いてサフランの細胞を得
た。ｂ、プロトプラスト化実施例１のプロトプラスト化の方法を用いてプロトプラ
スト化した。ｃ、細胞融合実施例１の細胞融合を用いて培養した。ｃ、培養方法実施例１の培養方法を用いて培養した。

【００３３】（比較例１）実施例１を細胞融合せず、混
合したプロトプラストをそのまま培養した。（比較例２）実施例１の培養方法で、アガロースに包埋
せず培養した、

【００３４】その培養結果を表１に示す。

【表１】

【００３５】

【発明の効果】増殖速度の早い細胞のプロトプラスト
と、色素の生産が多い細胞のプロトプラスト等、特性の
異なるプロトプラストを融合させて、遺伝的修飾を行っ
たプロトプラストを培養することにより、両者の特徴を
兼ね備えたサフランの株を作ることができ、サフランの
有効成分の１つである色素を効率的に生産できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 5/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】サフランの、少なくとも増殖速度の速い
細胞と、色素生産の多い細胞をそれぞれプロトプラスト
化し、両者のプロトプラスト懸濁液を混合し、細胞融合
剤を添加し、融合したプロトプラストを培養することを
特徴とするサフランの細胞融合方法。
【請求項２】プロトプラスト作成時に、第１段階で細
胞接着物質溶解酵素による酵素処理、第２段階で細胞接
着物質溶解酵素と、細胞壁溶解酵素との混合酵素による
酵素処理を行なう２段階の酵素処理をすることを特徴と
する請求項１に記載のサフランの細胞融合方法。
【請求項３】細胞融合したプロトプラストをアガロース
に埋め込んだ状態で培養することを特徴とする請求項１
または２に記載のサフランの細胞融合方法。
【請求項４】請求項１ないし３のいずれかの項に記載の
細胞融合方法により得られる、増殖速度が速く、かつ、
色素生産量が多いサフランの融合細胞。