JP3100203B2 - サフランのプロトプラストの作成方法 - Google Patents
サフランのプロトプラストの作成方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食用、薬用のサフランの
中の有効成分の１つである色素を培養するためのプロト
プラストの作成方法に関する。
中の有効成分の１つである色素を培養するためのプロト
プラストの作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】サフランはアヤメ科の多年生草本クロッ
カス・サティバス Ｌ. (Crocus Sativus L.）であり、
柱頭部を乾燥したものを生薬として用いる。スペイン、
フランス、イタリア、わが国では広島、香川、大分、岩
手の各県で生産されている。成分としては、カロチノイ
ド色素約２％を含み、その成分はクロシン（クロセチン
の配糖体）で、また苦味配糖体ピクロクロシン（Picroc
rocin ）約２％、精油０．４〜１．３％を含む。精油の
主成分はサフラナール（生薬特有の芳香成分）である。
カス・サティバス Ｌ. (Crocus Sativus L.）であり、
柱頭部を乾燥したものを生薬として用いる。スペイン、
フランス、イタリア、わが国では広島、香川、大分、岩
手の各県で生産されている。成分としては、カロチノイ
ド色素約２％を含み、その成分はクロシン（クロセチン
の配糖体）で、また苦味配糖体ピクロクロシン（Picroc
rocin ）約２％、精油０．４〜１．３％を含む。精油の
主成分はサフラナール（生薬特有の芳香成分）である。
【０００３】このサフランは香辛料、食品用着色料とし
て、或いは薬用として利用されているが、そのメシベの
乾燥物を利用するので天然物では、取れる量が少なく、
その単価も非常に高い。また、天然品では気候の変化を
受け、一定の品質のものが得られにくい。そこで、組織
培養が各種試みられている。
て、或いは薬用として利用されているが、そのメシベの
乾燥物を利用するので天然物では、取れる量が少なく、
その単価も非常に高い。また、天然品では気候の変化を
受け、一定の品質のものが得られにくい。そこで、組織
培養が各種試みられている。
【０００４】例えば、特開昭６２−２７５６１７号公報
には、クロッカス・サティバスＬ．すなわちサフランの
雌ずい又はそれに相当する器官をサイトカイニン又はサ
イトカイニン及びオーキシンを含有する人工培養基にて
生長、肥大成熟させる方法が開示されている。サイトカ
イニンは古くより植物培養細胞の細胞分裂を誘起する物
質として知られており、又オーキシンと併用すること
で、カルスの誘導や細胞増殖が促進されることも知られ
ている。
には、クロッカス・サティバスＬ．すなわちサフランの
雌ずい又はそれに相当する器官をサイトカイニン又はサ
イトカイニン及びオーキシンを含有する人工培養基にて
生長、肥大成熟させる方法が開示されている。サイトカ
イニンは古くより植物培養細胞の細胞分裂を誘起する物
質として知られており、又オーキシンと併用すること
で、カルスの誘導や細胞増殖が促進されることも知られ
ている。
【０００５】特開昭６３−１０９７８８号公報には、ク
ロッカス・サティバスＬ．の雌性器官を摘出してサイト
カイニンを含有する人工培養基で培養し、サフラナー
ル、ピクロクロシン及びそれらの類似体、クロシン、ク
ロセチン及びそれらの類似体よりなる群より選ばれた１
以上の物質を生産するものである。しかし、サフランの
雌ずいに、これらの物質が含まれていることは古くより
知られていることである。
ロッカス・サティバスＬ．の雌性器官を摘出してサイト
カイニンを含有する人工培養基で培養し、サフラナー
ル、ピクロクロシン及びそれらの類似体、クロシン、ク
ロセチン及びそれらの類似体よりなる群より選ばれた１
以上の物質を生産するものである。しかし、サフランの
雌ずいに、これらの物質が含まれていることは古くより
知られていることである。
【０００６】特開昭６３−１６０５８０号公報には、ク
ロッカス属植物のカルスを植物ホルモン添加のＭＳ培地
で培養するものである。植物組織の培養にオーキシンや
サイトカイニン等の植物ホルモンを使用することは古く
よりよく知られており、ムラシゲ・スクーグ培地も通常
用いられている培地である。
ロッカス属植物のカルスを植物ホルモン添加のＭＳ培地
で培養するものである。植物組織の培養にオーキシンや
サイトカイニン等の植物ホルモンを使用することは古く
よりよく知られており、ムラシゲ・スクーグ培地も通常
用いられている培地である。
【０００７】特開昭６３−２５８５７４号公報には、サ
フランの柱頭、花柱、子房、胚珠、花弁の部分を摘出
し、これを切り分けた組織をサイトカイニンとオーキシ
ンを添加したＬＳ培地又はＢ５培地に移植し、継代培養
するものである。植物の部分を摘出、切り分けて培養す
ることは古くより行なわれ、サイトカイニンやオーキシ
ンの植物ホルモンも通常使用され、リンスマイヤー・ス
クーグの培地、ガンボルグ培地なども通常用いられてい
る培地である。
フランの柱頭、花柱、子房、胚珠、花弁の部分を摘出
し、これを切り分けた組織をサイトカイニンとオーキシ
ンを添加したＬＳ培地又はＢ５培地に移植し、継代培養
するものである。植物の部分を摘出、切り分けて培養す
ることは古くより行なわれ、サイトカイニンやオーキシ
ンの植物ホルモンも通常使用され、リンスマイヤー・ス
クーグの培地、ガンボルグ培地なども通常用いられてい
る培地である。
【０００８】これらの何れの方法を試験しても、それほ
どサフランの有効成分の増殖の速度が増すことはない
し、有効成分が飛躍的に増産されるわけではない。これ
らは何れも植物体の一部を切りとり、直接培養するカル
ス培養法である。これに対し、植物に遺伝変異を与える
方法として、近年細胞レベルで行う手法が急速に発展し
ている。その中でもプロトプラストはさまざまな遺伝的
修飾を加えるのに最も適した細胞である。細胞融合には
必須であり、形質転換にも使用されている。これまでに
既に、タバコ、バレイショ、トマト、ナス、キャベツ、
ニンジン、アルファルファ、イネ等のプロトプラストか
らの植物体再生が報告されているが、サフランのプロト
プラストからの植物体再生は知られていない。またプロ
トプラストそのものに関しても、サフランについては知
られていない。
どサフランの有効成分の増殖の速度が増すことはない
し、有効成分が飛躍的に増産されるわけではない。これ
らは何れも植物体の一部を切りとり、直接培養するカル
ス培養法である。これに対し、植物に遺伝変異を与える
方法として、近年細胞レベルで行う手法が急速に発展し
ている。その中でもプロトプラストはさまざまな遺伝的
修飾を加えるのに最も適した細胞である。細胞融合には
必須であり、形質転換にも使用されている。これまでに
既に、タバコ、バレイショ、トマト、ナス、キャベツ、
ニンジン、アルファルファ、イネ等のプロトプラストか
らの植物体再生が報告されているが、サフランのプロト
プラストからの植物体再生は知られていない。またプロ
トプラストそのものに関しても、サフランについては知
られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、サフ
ランの有効成分の一つであるクロシン、クロセチンの色
素をより効率的に得られる植物体を得るため、サフラン
細胞に遺伝的修飾を加え、細胞融合や形質転換をする基
礎となる、プロトプラストの作成方法を提供することに
ある。
ランの有効成分の一つであるクロシン、クロセチンの色
素をより効率的に得られる植物体を得るため、サフラン
細胞に遺伝的修飾を加え、細胞融合や形質転換をする基
礎となる、プロトプラストの作成方法を提供することに
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、サフランの細胞を
プロトプラストにすることに成功し、それによって色素
生産性のよい、且つ増殖率の高い細胞を作り出し培養す
る道を拓いて、本発明を完成した。
解決するため鋭意研究を行った結果、サフランの細胞を
プロトプラストにすることに成功し、それによって色素
生産性のよい、且つ増殖率の高い細胞を作り出し培養す
る道を拓いて、本発明を完成した。
【００１１】すなわち本発明は、 （１） サフランカルスより再分化したメシベ組織をプ
ロトプラスト化することを特徴とするサフランのプロト
プラストの作成方法、 （２） サフランカルスより再分化したメシベ組織に２
段階の酵素処理をすることを特徴とするサフランのプロ
トプラストの作成方法、 （３） サフランカルスより再分化したメシベ組織に第
１段階で細胞接着物質溶解酵素処理を行い、第２段階で
細胞接着物質溶解酵素と細胞壁溶解酵素の混合酵素処理
を行う２段階の酵素処理をしてプロトプラスト化するこ
とを特徴とするサフランのプロトプラストの作成方法で
ある。
ロトプラスト化することを特徴とするサフランのプロト
プラストの作成方法、 （２） サフランカルスより再分化したメシベ組織に２
段階の酵素処理をすることを特徴とするサフランのプロ
トプラストの作成方法、 （３） サフランカルスより再分化したメシベ組織に第
１段階で細胞接着物質溶解酵素処理を行い、第２段階で
細胞接着物質溶解酵素と細胞壁溶解酵素の混合酵素処理
を行う２段階の酵素処理をしてプロトプラスト化するこ
とを特徴とするサフランのプロトプラストの作成方法で
ある。
【００１２】用いる細胞は培養したものでも植物体から
切り出したものでも差し支えない。植物体から切り出し
たものを利用する場合は常法で滅菌したサフランの切片
を用い、培養したものを用いる場合は例えば本出願人に
よる特願平３−１７９０５３号公報の方法も用いること
ができる。
切り出したものでも差し支えない。植物体から切り出し
たものを利用する場合は常法で滅菌したサフランの切片
を用い、培養したものを用いる場合は例えば本出願人に
よる特願平３−１７９０５３号公報の方法も用いること
ができる。
【００１３】これに用いる培地としては、特に限定され
ずムラシゲ・スクーグ（Murashigeand Skoog ）の培
地、ホワイト（White ）の培地、ガンボルグ（Gamborg
）らの培地、ニッチュ（Nitsch）の培地、ヘラー（Hel
ler）の培地、シェンク・ヒルデブランド（Schenk and
Hildebrandt）の培地、ニッチュ・ニッチュ（Nitsch an
dNitsch）の培地、ノップ（Knop）の培地、リンスマイ
ヤー・スクーグ（Linsmaier and Skoog ）の培地などの
培地がある。
ずムラシゲ・スクーグ（Murashigeand Skoog ）の培
地、ホワイト（White ）の培地、ガンボルグ（Gamborg
）らの培地、ニッチュ（Nitsch）の培地、ヘラー（Hel
ler）の培地、シェンク・ヒルデブランド（Schenk and
Hildebrandt）の培地、ニッチュ・ニッチュ（Nitsch an
dNitsch）の培地、ノップ（Knop）の培地、リンスマイ
ヤー・スクーグ（Linsmaier and Skoog ）の培地などの
培地がある。
【００１４】これらの培地に、必要により、植物生長調
節物質として知られるサイトカイニン、オーキシンを添
加してもよい。サイトカイニンとしては、ベルジルアデ
ニン、ゼアチン、カイネチン等が例示でき、これらをそ
の種類によって異なるが、添加するときは０．０１〜２
０ppm添加する。オーキシンにはナフタレン酢酸、イン
ドール酢酸、２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸等が例示
でき、これらをその種類によって異なるが添加するとき
は０．０１〜２０ppm 添加する。
節物質として知られるサイトカイニン、オーキシンを添
加してもよい。サイトカイニンとしては、ベルジルアデ
ニン、ゼアチン、カイネチン等が例示でき、これらをそ
の種類によって異なるが、添加するときは０．０１〜２
０ppm添加する。オーキシンにはナフタレン酢酸、イン
ドール酢酸、２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸等が例示
でき、これらをその種類によって異なるが添加するとき
は０．０１〜２０ppm 添加する。
【００１５】また、必要により、他の培地用薬剤も添加
することができる。また、温度は２０〜２５℃で暗所で
培養する。
することができる。また、温度は２０〜２５℃で暗所で
培養する。
【００１６】これらの方法において植物体より切り出し
た細胞或いは培養細胞を用いるが、特にサフランカルス
より再分化したメシベ細胞を用いるとよい。その方法は
上記のような培養方法で培養した細胞のうち、サフラン
カルスより再分化したメシベ組織を選択すればよい。
た細胞或いは培養細胞を用いるが、特にサフランカルス
より再分化したメシベ細胞を用いるとよい。その方法は
上記のような培養方法で培養した細胞のうち、サフラン
カルスより再分化したメシベ組織を選択すればよい。
【００１７】これに浸透圧調整用としてグルコース、サ
ッカロース、マンニトール、ソルビトール、フィコー
ル、パコール等を０．３〜０．７モル、ＰＨは４．５〜
６．５に調整した溶液の中で所定の酵素を作用させる。
酵素として細胞壁溶解酵素のセルラーゼ、ドリセラー
ゼ、マセロザイム、ペクトリアーゼ等をそれぞれ０．０
５〜２．０％を好ましくは２種類以上を合計０．１〜
６．０％、温度は２５〜３５℃で作用時間は条件によっ
て異なるが１〜５時間作用させる。
ッカロース、マンニトール、ソルビトール、フィコー
ル、パコール等を０．３〜０．７モル、ＰＨは４．５〜
６．５に調整した溶液の中で所定の酵素を作用させる。
酵素として細胞壁溶解酵素のセルラーゼ、ドリセラー
ゼ、マセロザイム、ペクトリアーゼ等をそれぞれ０．０
５〜２．０％を好ましくは２種類以上を合計０．１〜
６．０％、温度は２５〜３５℃で作用時間は条件によっ
て異なるが１〜５時間作用させる。
【００１８】特に第１段階では通常通り細胞接着物質溶
解酵素処理による酵素処理を行うが、第２段階では、細
胞接着物質溶解酵素と細胞壁溶解酵素との混合酵素によ
る酵素処理を行う２段階で処理するとプロトプラストの
得られる確率が上がる。この場合、第１段階の酵素処理
は酵素として細胞接着物質溶解酵素例えばドリセラーゼ
とペクトリアーゼをそれぞれ０．０５〜２．０％、温度
は２５〜３５℃で作用時間は条件によって異なるが１〜
３時間作用させる。その後、第２段階の酵素処理として
細胞接着物質溶解酵素例えばドリセラーゼとペクトリア
ーゼをそれぞれ０．０５〜２．０％、細胞壁溶解酵素例
えばセルラーゼを０．１〜２．０％、温度は２５〜３５
℃で作用時間は条件によって異なるが１〜３時間作用さ
せる。これによって第２段階にも細胞接着物質溶解酵素
を混合することによりプロトプラストの得られる確率が
上がる。又第２段階処理前にメッシュ瀘過を行うことで
プラストに不向きな細胞或いはその破片を除くことがで
きる。タバコ等葉肉組織よりプロトプラストを得る方法
は、葉肉組織の組織学的な性質上、酵素処理は２段階に
行われる。即ち、先づ、細胞を相互に溶着している物質
をペクチナーゼ等で溶解し細胞を単離し、続いて細胞壁
をセルラーゼ等で溶解してプロトプラストを得る。この
方法は、タバコ以外にも多くの葉肉細胞のプロトプラス
トの単離に適用されたが、植物によっては、なかなかプ
ロトプラストになり難いものもあり、個々の材料につい
てプロトプラスト単離の最適の条件を見い出す必要があ
る。一方、培養細胞のプロトプラスト化においても、培
養細胞の起源、細胞株、培養条件によって、プロトプラ
スト化の難易が支配されており、培地組成、植物生長物
質の組み合わせで変化する。サフラン培養細胞より得ら
れたメシベは、その表皮細胞が強固なこと、細胞間の細
胞壁もかなり肥厚していることが判明したので、第１段
階処理で表皮細胞を遊離させやすくし、第２段階で、表
皮細胞及び表皮より内側の細胞の両方の細胞をプロトプ
ラスト化できるような酵素溶液の配合を作成した結果、
好結果が得られた。
解酵素処理による酵素処理を行うが、第２段階では、細
胞接着物質溶解酵素と細胞壁溶解酵素との混合酵素によ
る酵素処理を行う２段階で処理するとプロトプラストの
得られる確率が上がる。この場合、第１段階の酵素処理
は酵素として細胞接着物質溶解酵素例えばドリセラーゼ
とペクトリアーゼをそれぞれ０．０５〜２．０％、温度
は２５〜３５℃で作用時間は条件によって異なるが１〜
３時間作用させる。その後、第２段階の酵素処理として
細胞接着物質溶解酵素例えばドリセラーゼとペクトリア
ーゼをそれぞれ０．０５〜２．０％、細胞壁溶解酵素例
えばセルラーゼを０．１〜２．０％、温度は２５〜３５
℃で作用時間は条件によって異なるが１〜３時間作用さ
せる。これによって第２段階にも細胞接着物質溶解酵素
を混合することによりプロトプラストの得られる確率が
上がる。又第２段階処理前にメッシュ瀘過を行うことで
プラストに不向きな細胞或いはその破片を除くことがで
きる。タバコ等葉肉組織よりプロトプラストを得る方法
は、葉肉組織の組織学的な性質上、酵素処理は２段階に
行われる。即ち、先づ、細胞を相互に溶着している物質
をペクチナーゼ等で溶解し細胞を単離し、続いて細胞壁
をセルラーゼ等で溶解してプロトプラストを得る。この
方法は、タバコ以外にも多くの葉肉細胞のプロトプラス
トの単離に適用されたが、植物によっては、なかなかプ
ロトプラストになり難いものもあり、個々の材料につい
てプロトプラスト単離の最適の条件を見い出す必要があ
る。一方、培養細胞のプロトプラスト化においても、培
養細胞の起源、細胞株、培養条件によって、プロトプラ
スト化の難易が支配されており、培地組成、植物生長物
質の組み合わせで変化する。サフラン培養細胞より得ら
れたメシベは、その表皮細胞が強固なこと、細胞間の細
胞壁もかなり肥厚していることが判明したので、第１段
階処理で表皮細胞を遊離させやすくし、第２段階で、表
皮細胞及び表皮より内側の細胞の両方の細胞をプロトプ
ラスト化できるような酵素溶液の配合を作成した結果、
好結果が得られた。
【００１９】前記の方法で得たプロトプラストを培養す
る。培養方法は前記段落番号１３〜１５に記載した方法
で行う。しかしながら、アガロースゲルに埋め込んだ状
態で培養しなければコロニーとして発育しない。
る。培養方法は前記段落番号１３〜１５に記載した方法
で行う。しかしながら、アガロースゲルに埋め込んだ状
態で培養しなければコロニーとして発育しない。
【００２０】その方法は液体培地にアガロースが０．３
〜０．７％になるように加えた培地にプロトプラストを
包埋されるように入れる。例えばプロトプラストの懸濁
液をピペットで吸い上げた後、アガロースゲルの培地に
突き刺し、その後中味を押し出してゲル中にプロトプラ
ストを包埋する。
〜０．７％になるように加えた培地にプロトプラストを
包埋されるように入れる。例えばプロトプラストの懸濁
液をピペットで吸い上げた後、アガロースゲルの培地に
突き刺し、その後中味を押し出してゲル中にプロトプラ
ストを包埋する。
【００２１】アガロースは市販のものでよく、できれば
低融点アガロースがよい。これに用いる培地としては、
特に限定されずムラシゲ・スクーグ（Murashigeand Sko
og ）の培地、ホワイト（White ）の培地、ガンボルグ
（Gamborg ）らの培地、ニッチュ（Nitsch）の培地、ヘ
ラー（Heller）の培地、シェンク・ヒルデブランド（Sc
henk and Hildebrandt）の培地、ニッチュ・ニッチュ
（Nitsch andNitsch）の培地、ノップ（Knop）の培地、
リンスマイヤー・スクーグ（Linsmaier and Skoog ）の
培地などの培地がある。
低融点アガロースがよい。これに用いる培地としては、
特に限定されずムラシゲ・スクーグ（Murashigeand Sko
og ）の培地、ホワイト（White ）の培地、ガンボルグ
（Gamborg ）らの培地、ニッチュ（Nitsch）の培地、ヘ
ラー（Heller）の培地、シェンク・ヒルデブランド（Sc
henk and Hildebrandt）の培地、ニッチュ・ニッチュ
（Nitsch andNitsch）の培地、ノップ（Knop）の培地、
リンスマイヤー・スクーグ（Linsmaier and Skoog ）の
培地などの培地がある。
【００２２】これらの培地に、必要により、植物生長調
節物質として知られるサイトカイニン、オーキシンを添
加してもよい。サイトカイニンとしては、ベルジルアデ
ニン、ゼアチン、カイネチン等が例示でき、これらをそ
の種類によって異なるが、添加するときは０．０１〜２
０ppm添加する。オーキシンにはナフタレン酢酸、イン
ドール酢酸、２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸等が例示
でき、これらをその種類によって異なるが添加するとき
は０．０１〜２０ppm 添加する。
節物質として知られるサイトカイニン、オーキシンを添
加してもよい。サイトカイニンとしては、ベルジルアデ
ニン、ゼアチン、カイネチン等が例示でき、これらをそ
の種類によって異なるが、添加するときは０．０１〜２
０ppm添加する。オーキシンにはナフタレン酢酸、イン
ドール酢酸、２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸等が例示
でき、これらをその種類によって異なるが添加するとき
は０．０１〜２０ppm 添加する。
【００２３】また、必要により、他の培地用薬剤も添加
することができる。また、温度は２０〜２５℃で暗所で
培養する。これによって、サフランのプロトプラストを
コロニーとして発育させることができた。
することができる。また、温度は２０〜２５℃で暗所で
培養する。これによって、サフランのプロトプラストを
コロニーとして発育させることができた。
【００２４】
【実施例】以下に実施例によって本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 （実施例１） ａ．細胞の選択 花芽が１０cm位に伸びたサフランの球根の外皮を剥き変
色した部分を除去した後、流水で３時間洗浄した。１０
％塩化ベンザルコニウムに３〜４秒、７０％エタノール
に１〜２秒、５％次亜鉛素酸ナトリウムに２０〜４０分
浸漬した。そののちは無菌的に行った。花芽を球根の部
分を残して切り取り滅菌水で３回洗浄した。次に花芽か
ら蕾を取り出して切開しメシベを花柱を長くつけた状態
で取り出し培地に接種した。培地はMurashige and Skoo
g の培地にサッカロース４％、寒天末０．９％、ＰＨ
５．８に調整した。これにナフタレン酢酸１０ppm 、ベ
ンジルアデニン１ppm を加えた。
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。 （実施例１） ａ．細胞の選択 花芽が１０cm位に伸びたサフランの球根の外皮を剥き変
色した部分を除去した後、流水で３時間洗浄した。１０
％塩化ベンザルコニウムに３〜４秒、７０％エタノール
に１〜２秒、５％次亜鉛素酸ナトリウムに２０〜４０分
浸漬した。そののちは無菌的に行った。花芽を球根の部
分を残して切り取り滅菌水で３回洗浄した。次に花芽か
ら蕾を取り出して切開しメシベを花柱を長くつけた状態
で取り出し培地に接種した。培地はMurashige and Skoo
g の培地にサッカロース４％、寒天末０．９％、ＰＨ
５．８に調整した。これにナフタレン酢酸１０ppm 、ベ
ンジルアデニン１ppm を加えた。
【００２５】ｂ．プロトプラスト化 この条件で培養したサフランカルスをドリセラーゼ１．
０％、ペクトリアーゼ０．１％、マンニトール０．６モ
ル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃１時間振とうさせた
後、２００メッシのナイロンメッシュで瀘過後、メッシ
ュ上に残った細胞をドリセラーゼ１．５％、ペクトリア
ーゼ０．０５％、セルラーゼ０．５％、マンニトール
０．６モル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃２時間３０
分間作用させた後２００メッシのナイロンメッシュで瀘
過後、メッシュを通過する部分を６００rpm で遠心分離
を行いプロトプラストを得た。これを密度５×１０4 ce
ll／mlになるように０．６モルマンニトール水溶液に懸
濁した。
０％、ペクトリアーゼ０．１％、マンニトール０．６モ
ル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃１時間振とうさせた
後、２００メッシのナイロンメッシュで瀘過後、メッシ
ュ上に残った細胞をドリセラーゼ１．５％、ペクトリア
ーゼ０．０５％、セルラーゼ０．５％、マンニトール
０．６モル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃２時間３０
分間作用させた後２００メッシのナイロンメッシュで瀘
過後、メッシュを通過する部分を６００rpm で遠心分離
を行いプロトプラストを得た。これを密度５×１０4 ce
ll／mlになるように０．６モルマンニトール水溶液に懸
濁した。
【００２６】ｃ．培養方法 ＭＳ培地にサッカロース４％と２，４‐ジクロロフェノ
キシ酢酸０．５ppm、カイネチン０．１ppm をｐＨ５．
８に調製し、アガロース０．６％を添加し加熱攪拌後ガ
ラスシャーレに分注し固化した。これにプロトプラスト
０．６モルマンニトール水溶液懸濁液をガラス管で吸い
上げゲルに突き刺し中身を押し出しサフランプロトプラ
ストをアガロースゲルに包埋した。これをパラフィルム
で密封し２３℃暗所で２か月培養した。
キシ酢酸０．５ppm、カイネチン０．１ppm をｐＨ５．
８に調製し、アガロース０．６％を添加し加熱攪拌後ガ
ラスシャーレに分注し固化した。これにプロトプラスト
０．６モルマンニトール水溶液懸濁液をガラス管で吸い
上げゲルに突き刺し中身を押し出しサフランプロトプラ
ストをアガロースゲルに包埋した。これをパラフィルム
で密封し２３℃暗所で２か月培養した。
【００２７】（実施例２） ａ．細胞の選択 花芽が１０cm位に伸びたサフランの球根の外皮を剥き変
色した部分を除去した後、流水で３時間洗浄した。１０
％塩化ベンザルコニウムに３〜４秒、７０％エタノール
に１〜２秒、５％次亜鉛素酸ナトリウムに２０〜４０分
浸漬した。そののちは無菌的に行った。花芽を球根の部
分を残して切り取り滅菌水で３回洗浄した。次に花芽か
ら蕾を取り出して切開しメシベを花柱を長くつけた状態
で取り出し培地に接種した。培地はMurashige and Skoo
g の培地にサッカロース４％、寒天末０．９％、ＰＨ
５．８に調整した。これにナフタレン酢酸５ppm 、ベン
ジルアデニン０．５ppm を加えてカルスより再分化した
メシベを採取した。
色した部分を除去した後、流水で３時間洗浄した。１０
％塩化ベンザルコニウムに３〜４秒、７０％エタノール
に１〜２秒、５％次亜鉛素酸ナトリウムに２０〜４０分
浸漬した。そののちは無菌的に行った。花芽を球根の部
分を残して切り取り滅菌水で３回洗浄した。次に花芽か
ら蕾を取り出して切開しメシベを花柱を長くつけた状態
で取り出し培地に接種した。培地はMurashige and Skoo
g の培地にサッカロース４％、寒天末０．９％、ＰＨ
５．８に調整した。これにナフタレン酢酸５ppm 、ベン
ジルアデニン０．５ppm を加えてカルスより再分化した
メシベを採取した。
【００２８】ｂ．プロトプラスト化 この条件で培養したサフランメシベをセルラーゼ１．０
％、ドリセラーゼ２．０％、マセロザイム０．５％、マ
ンニトール０．６モル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃
１時間振とうさせ検鏡で確認後、２００メッシのナイロ
ンを通過する部分を６００rpm で遠心分離を行いプロト
プラストを得た。これを密度５×１０4 cell／mlになる
ように０．６モルマンニトール水溶液に懸濁した。
％、ドリセラーゼ２．０％、マセロザイム０．５％、マ
ンニトール０．６モル、ｐＨ５．８の酵素液中で３０℃
１時間振とうさせ検鏡で確認後、２００メッシのナイロ
ンを通過する部分を６００rpm で遠心分離を行いプロト
プラストを得た。これを密度５×１０4 cell／mlになる
ように０．６モルマンニトール水溶液に懸濁した。
【００２９】ｃ．培養方法 実施例１の培養方法を用いて培養した。
【００３０】（実施例３） ａ．細胞の選択 実施例２の細胞の選択方法を用いてサフランの細胞を得
た。 ｂ．プロトプラスト化 実施例１のプロトプラスト化の方法を用いてプロトプラ
スト化した。 ｃ．培養方法 実施例１の培養方法を用いて培養した。
た。 ｂ．プロトプラスト化 実施例１のプロトプラスト化の方法を用いてプロトプラ
スト化した。 ｃ．培養方法 実施例１の培養方法を用いて培養した。
【００３１】プロトプラストの培養結果を表１に示す。
【表１】
【００３２】
【発明の効果】本発明によって、サフランの培養し得る
プロトプラストが得られたので、サフラン細胞に遺伝的
修飾を加え、細胞融合や形質転換をする基盤ができた。
従って色素生産性のよい且つ増殖率の高い細胞を作り出
し培養する道が拓かれた。
プロトプラストが得られたので、サフラン細胞に遺伝的
修飾を加え、細胞融合や形質転換をする基盤ができた。
従って色素生産性のよい且つ増殖率の高い細胞を作り出
し培養する道が拓かれた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 サフランカルスより再分化したメシベ組
織をプロトプラスト化することを特徴するサフランのプ
ロトプラストの作成方法。 - 【請求項２】 サフランカルスより再分化したメシベ組
織に２段階の酵素処理をすることを特徴とするサフラン
のプロトプラストの作成方法。 - 【請求項３】 サフランカルスより再分化したメシベ組
織に第１段階で細胞接着物質溶解酵素処理を行い第２段
階で細胞接着物質溶解酵素と細胞壁溶解酵素の混合酵素
処理を行う２段階の酵素処理をしてプロトプラスト化す
ることを特徴とするサフランのプロトプラストの作成方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03296652A JP3100203B2 (ja) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | サフランのプロトプラストの作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03296652A JP3100203B2 (ja) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | サフランのプロトプラストの作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05103662A JPH05103662A (ja) | 1993-04-27 |
| JP3100203B2 true JP3100203B2 (ja) | 2000-10-16 |
Family
ID=17836321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03296652A Expired - Fee Related JP3100203B2 (ja) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | サフランのプロトプラストの作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3100203B2 (ja) |
-
1991
- 1991-10-17 JP JP03296652A patent/JP3100203B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｖｏｌ．４０，ｎｏ．２（１９９０）ｐ．１５３−１５８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05103662A (ja) | 1993-04-27 |
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