JP3066385B2 - 新規タンパク質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falcipa
rum）によって起こるヒトマラリア感染に対して防御的
な免疫反応を誘発し得る新規タンパク質、並びに該タン
パク質をコードする遺伝子のクローニングおよび発現に
関する。本発明はさらに、該タンパク質を含む新規ワク
チンに関する。

ヒトマラリアはプラスモディウム（Plasmodium）属の
寄生虫によって起こる。ヒトに感染するプラスモディウ
ムは４種類が知られている：熱帯熱マラリア原虫（Plas
modium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P.viva
x）、四日熱マラリア原虫（P.malariae）、および卵形
マラリア原虫（P.ovale）。最も重症のヒトマラリアは
熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫が原因で起こ
り、熱帯熱マラリア原虫が最も頻繁に見られる。

マラリアの寄生虫はスポロゾイトの形で蚊によってヒ
トに伝播され、スポロゾイトは肝臓に移動し、肝細胞内
で増殖し、そこから現れ出て赤血球内で成長サイクルを
開始する。各サイクルの終わりに放出されるメロゾイト
世代の寄生虫は速やかに赤血球細胞内に再侵入する。少
数のメロゾイトは、血液食で摂取された後に、ハマダラ
カ属（Anopheles）の雌の蚊内でそれらのライフサイク
ルを完成する有性世代の寄生虫（雌雄の配偶子母細胞）
へ発達し、スポロゾイトの子孫を生産して完結する。

マラリアは体を衰弱させる病気であり、かくして１以
上の世代（各世代は免疫学的に互いに区別される）の寄
生虫に存在する表面抗原に基づいたワクチンを開発する
ことが望まれるだろう。しかしながら、この方面での努
力は今までのところ十分な成功を収めていない。

ヒトを含めた哺乳類は、照射されたスポロゾイトで予
防接種を行った場合に、プラスモディウムの攻撃から防
御されることが分かっている（Clyde et al.,Am J Trop
Med Hyg,24:397（1975）;Nussenzweig et al.,Phil Tr
an R Soc Lond B,307:117−28（1984））。この方法
は、有効であるが、スポロゾイトの培養が困難であるた
めに限られている。

スポロゾイトは種−特異的表面タンパク質のサーカム
スポロゾイト（circumsporozoite:CS）タンパク質を発
現し、このタンパク質は齧歯類の寄生虫プラスモディウ
ム・ベルゲイ（P.berghei）において初めて固定され
た。このタンパク質に対するモノクローナル抗体は感染
した蚊の攻撃からマウスを完全に防御した（Potocnjak
et al.,J Exp Med,151:1504−13（1980））。

CSタンパク質に基づいた研究が広く報告されている
（例えば、Science,225:593−９および628−９（198
4）、米国特許第4,707,357号、Science,230:815−18（1
985）、Science,228:958−62（1985）、PCT/W086/01721
およびLancet,I:1277−81（1987）を参照されたい）。
しかし、CSタンパク質またはそのサブユニットに基づい
たワクチンは商品化されたことがなく、臨床試験では思
ったほど効果のないことが立証された（“マラリアワク
チン：失敗した将来への展望",Science,247:402−３（1
990））。

最近のデータは可能性のあるワクチン候補としてのCS
タンパク質の有用性について幾つかの疑問を投げかけて
いる：すなわち、ヒトでの貧弱な免疫原性、この抗原に
対する免疫反応の（マウスに見られるような）強い遺伝
的制限、および免疫学的に関係のある配列の多型性は、
このタンパク質が、他の修飾なしでは、効果的な抗スポ
ロゾイトおよび／または抗肝臓世代ワクチンへと開発さ
れ得ないことを示唆している。従って、今日では、スポ
ロゾイトおよび／または肝臓世代寄生虫に対する防御免
疫を誘導しうる新たな赤血球外抗原の同定が、マラリア
ワクチン開発の分野ではより重要な課題であると認めら
れている（Parasitology Today,6:3,64−65（1990）お
よびImmunology Today,9:351−355（1988））。

別のまたは更なる戦略は、有性世代の寄生虫を含む血
液食で摂取された場合に、蚊の感染およびそれ故に伝播
を防ぐ抗体を誘導しうる有性世代のワクチンを調製する
ことだろう。このような伝播阻止ワクチンは予防接種を
受けた個体を感染から防御しないが、スポロゾイトおよ
び／または無性赤血球世代ワクチンと組み合わせた場合
に、これらのワクチンのいずれか１つに耐性のワクチン
誘導突然変異体の伝播の機会を低減させるだろう。

多型性は有性世代のタンパク質にはあまり見られない
ことが示唆されている。その理由は、寄生虫が蚊に取り
込まれたときだけこれらのタンパク質が発現され、それ
故にヒト免疫系（おそらくスポロゾイトの発生変化に対
して主な圧力となる）では見られないからである。

伝播阻止免疫は数種の細胞外配偶子による免疫化によ
ってうまく誘導された。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodi
um falciparum）では、３世代特異的抗原（25、45/48お
よび230kDa）が同定され、これらに対するモノクローナ
ル抗体は伝播を阻止する。これらのタンパク質は寄生虫
の有性世代の異なる時期に発現される表面タンパク質に
相当する。Kaslowら（Nature,333,74−76（1988））は
最近25kDaタンパク質をコードする遺伝子をクローニン
グした。後者のタンパク質は熱帯熱マラリア原虫の接合
子およびオーキネート上の表面タンパク質である。

伝播阻止免疫の誘導に関与した他の熱帯熱マラリア原
虫の遺伝子のクローニングは、主にペプチドの配列決定
に必要とされる十分量の寄生虫および精製タンパク質を
得ることに問題があるために、これまで実施されていな
い。

本発明者らは、ハイブリダイゼーションプローブを作
製するのにペプチド配列の利用可能性に左右されない新
規なクローニング戦略を採用した。その代わりに、有性
世代の表面抗原は無性血液世代ではおそらく発現されな
いだろうという観察に基づいて、減算ハイブリダイゼー
ション技法が使用された。

cDNAライブラリーはP.falciparum NF54から得られた
全配偶子母細胞RNAより作製し、放射性標識した１本鎖c
DNA（有性および無性血液世代の寄生虫から単離されたR
NAより作製した）とのハイブリダイゼーションにより有
性世代に特異的なコード配列の存在についてスクリーニ
ングした。無性cDNAプローブとハイブリダイズしたクロ
ーンは排除した。

その結果、本発明者らは、有性世代の寄生虫により発
現される新規遺伝子を同定した。推定一次構造の分析か
ら、この遺伝子は表面タンパク質の特徴をすべて備えて
いる16kDaのタンパク質をコードすることが明らかであ
る。免疫−電子顕微鏡実験から、配偶子母細胞および配
偶子の膜に16kDaタンパク質が存在することが明確に立
証された。これらの点を考慮すると、この特性により、
それは伝播阻止マラリアワクチンの成分として可能性が
ある。

驚いたことに、Pfs16遺伝子の生産物はP.falciparum
スポロゾイトの表面においても同定された。Pfs16の合
成ペプチドに対して調製された抗体、およびPfs16の組
換え融合タンパク質に対して調製された抗体は、ウェス
ターンブロッティングによってスポロゾイトのタンパク
質抽出物中の16kDaタンパク質を認識するばかりでな
く、最近の免疫−電子顕微鏡実験もスポロゾイト表面に
おいてその存在を明らかにした。

従って、P.falciparumの16kDa抗原（またはその組換
えDNA構築物）はスポロゾイトおよび赤血球外世代の寄
生虫並びにその有性形態に対して２重防御免疫応答を誘
起する可能性がある。

かくして、本発明は、以下に示した配列を有する16kD
aタンパク質、およびその免疫原性誘導体（突然変異体
を含む）を提供する。

用語“免疫原性誘導体”は、ヒトへの内部投与後にタ
ンパク質に対する免疫応答を誘発する能力を保持するタ
ンパク質の末端切断型あるいは他の誘導体のようなあら
ゆる分子を包含する。このような他の誘導体はアミノ酸
の付加、欠失、置換または再配列により、あるいはその
化学的修飾により製造できる。

サブユニットワクチンの製造に有用でありうるタンパ
ク質の免疫原性断片は、相応の遺伝子断片の発現によ
り、あるいはペプチド合成により、例えばMerrifield合
成（The Peptides,Vol2.,Academic Press,NY,p.3）を用
いて製造することができる。

本発明の免疫原性誘導体はハイブリッド、すなわち他
のプラスモディウムの免疫原または他のプラスモディウ
ム以外の免疫原の１以上のエピトープを有する追加の配
列を含む融合ポリペプチド、であり得る。また、本発明
の免疫原性誘導体はＢ型肝炎表面またはコア抗原のよう
なキャリアーポリペプチドに、もしくはアジュバントの
場合のように免疫刺激特性を有するか、16kDaタンパク
質またはその誘導体に対する免疫応答を増強するか、あ
るいは16kDaタンパク質またはその誘導体の発現、精製
または処方に有用な他のキャリアーに融合させることが
できる。

本発明はさらに、グルタルアルデヒドのような通常の
結合剤を使って巨大分子に化合結合させた場合の16kDa
タンパク質またはその免疫原性誘導体をも包含する（Ge
erlings et al.,（1988）J.Immunol.Methods,106,239−
244）。

本発明の別の面は、16kDaタンパク質またはその免疫
原性誘導体をコードするDNAを組換え宿主細胞内で発現
させ、生産物を回収し、その後場合により、その誘導体
を製造することから成る、16kDaタンパク質またはその
誘導体の製造方法を提供する。

このようなコード配列を含むDNA分子は本発明の別の
面を構成し、標準的なDNA合成技術を用いて、例えばD.
M.RobertsらがBiochemistry1985,24,5090−5098に記載
するような酵素連結、化学合成、in vitro酵素重合、ま
たはこれらの技術の組合わせにより合成することができ
る。

DNAの酵素重合は、必要とされるヌクレオシド三リン
酸dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを含む適当な緩衝液中10
−37℃の温度で、一般には50μｌまたはそれ以下の容量
にて、DNAポリメラーゼＩ（Klenowフラグメント）のよ
うなDNAポリメラーゼを用いてin vitroで実施される。D
NA断片の酵素連結は、0.05Mトリス（pH7.4）、0.01M Mg
Cl₂、0.01Mジチオトレイトール、1mMスペルミジン、1mM
ATPおよび0.1mg/mlウシ血清アルブミンのような適当な
緩衝液中、４℃から周囲温度までの範囲で、一般には50
μｌ以下の容量にて、T4 DNAリガーゼのようなDNAリガ
ーゼを用いて実施される。DNAポリマーまたは断片の化
学合成は、通常のホスホトリエステル、ホスファイトま
たはホスホルアミダイト化学により、Chemical and Enz
ymatic Synthesis of Gene Fragments−A Laboratory M
anual（ed.H.G.Gassen and A.Lang）,Verlag Chemie,We
inheim（1982）に記載されるような、または他の科学文
献、例えばM.J.Gait,H.W.D.Matthes,M.Singh,B.S.Sproa
t and R.C.Titmas,Nucleic Acids Research,1982,10,62
43;B.S.Sproat and W.Bannwarth,Tetrahedron Letters,
1983,24,5771;M.D.Matteucci and M.H.Caruthers,Tetra
hedron Letters,1980,21,719;M.D.Matteucci and M.H.C
aruthers,Journal of the American Chemical Society,
1981,103,3185;S.P.Adams et al.,Journal of the Amer
ican Chemical Society,1983,105,661;N.D.Sinha,J.Bie
rnat,J.McMannus,and H.Koester,Nucleic Acids Resear
ch,1984,12,4539;およびH.W.D.Matthes et al.,EMBO Jo
urnal,1984,3,801に開示されるような固相法を使って実
施される。

これとは別に、コード配列は公知技術（例えば、相補
cDNA鎖を作製するためのmRNAの逆転写）を使ってP.falc
iparumのmRNAから、あるいは市販されているcDNAキット
から誘導することもできる。

本発明は開示された特定の配列に限定されるものでは
なく、上記のように、16kDaタンパク質またはその免疫
原性誘導体をコードするあらゆる分子を含むものであ
る。

16kDaタンパク質の変異型をコードするDNAポリマー
は、G.Winter et al.,Nature 1982,299,756−758または
Zoller and Smith 1982,Nucl.Acids Res.,10,6487−650
0に記載されるような慣用法による16kDaタンパク質をコ
ードするcDNAの部位特異的突然変異誘発により、あるい
はChan and Smith,Nucl.Acids Res.,1984,12,2407−241
9またはG.Winter et al.,Boichem.Soc.Trans.,1984,12,
224−225に記載されるような欠失突然変異誘発により作
製することができる。

本発明の方法は、Maniatis et al.,Molecular Clonin
g−A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor,1982−19
89に記載されるような慣用の組換え技術により行われ
る。

特に、本方法は次の工程： ｉ）前記16kDaタンパク質またはその免疫原性誘導体を
コードするヌクレオチド配列を含むDNAポリマーを、宿
主細胞内で、発現しうる複製可能なまたは組込み型の発
現ベクターを作製すること； ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換すること； iii）形質転換された該宿主細胞を、該DNAポリマーの発
現を可能にする条件下で培養して該タンパク質を生産さ
せること；および iv）該タンパク質を回収すること から成っている。

本明細書中で用いる用語“形質転換する”は、例えば
Genetic Engineering;Eds.S.M.Kingsman and A.J.Kings
man;Blackwell Scientific Publicatoins;Qxford,Engla
nd,1988に記載されるような慣用技術を使って、適当な
プラスミドまたはウイルスベクターによる形質転換、ト
ランスフェクションあるいは感染により宿主細胞へ外来
DNAを導入することを意味する。用語“形質転換され
た”または“形質転換体”は以後、対象の外来遺伝子を
含みかつ発現する、得られた宿主細胞に対して適用され
るだろう。

発現ベクターは新規であり、これも本発明の一部を構
成する。

複製可能な発現ベクターは、本発明に従って、宿主細
胞と適合するベクターを切断して完全なレプリコンを有
する線状DNAセグメントを供給し、該線状セグメント
を、該線状セグメントと一緒になって目的産物をコード
する１またはそれ以上のDNA分子（例えば、16kDaタンパ
ク質またはその断片をコードするDNAポリマー）と、連
結条件下で結合させることにより作製し得る。

従って、DNAポリマーは、所望により、予め作製して
おいても、ベクターの構築中に作製してもよい。

ベクターの選択は、原核細胞または真核細胞であり得
る宿主細胞により幾分かは決まるだろう。適当なベクタ
ーにはプラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよ
び組換えウイルスが含まれる。

複製可能な発現ベクターの作製は、DNAの制限、重合
および連結用の適当な酵素を用いて慣例的に、例えば先
に引用したManiatisらに記載された手法により実施する
ことができる。

組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下
に本発明の複製可能な発現ベクターで宿主細胞を形質転
換することにより得られる。適当な形質転換条件は慣例
的であり、例えば先に引用したManiatisら、または“DN
A Cloning"Vol.II,D.M.Glover ed.,IRL Press Ltd,1985
に記載されている。

形質転換条件の選択は宿主細胞によって決まる。かく
して、E.coliのような細菌宿主はCaCl₂の溶液で処理す
るか（Cohen et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.,1973,69,211
0）、またはRbCl、MnCl₂、酢酸カリウムおよびグリセロ
ールの混合物から成る溶液で処理し、その後３−［Ｎ−
モルホリノ］−プロパン−スルホン酸、RbClおよびグリ
セロールで処理する。哺乳類の培養細胞は、細胞上への
ベクターDNAのカルシウム共沈により形質転換できる。
本発明はまた、本発明の複製可能な発現ベクターで形質
転換された宿主細胞を包含する。

DNAポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換
宿主細胞の培養は、例えば先に引用したManiatisらおよ
び“DNA Cloning"に記載されるような慣用法により実施
される。従って、細胞に栄養素を供給し、45℃以下の温
度で細胞を培養することが好ましい。

生産物は宿主細胞に応じて慣用法により回収される。
かくして、宿主細胞がE.coliのような細菌である場合
は、それを物理的、化学的または酵素的に溶菌し、得ら
れた溶菌液からタンパク質産物を単離する。宿主細胞が
哺乳類の細胞である場合は、一般に栄養培地または無細
胞抽出物から生産物を単離することができる。慣用のタ
ンパク質単離法には選択的沈殿、吸着クロマトグラフィ
ー、およびモノクローナル抗体アフィニティーカラムを
含むアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。

好ましくは、宿主細胞はE.coliである。また、バキュ
ロウイルスのような適当なベクターを用いて昆虫細胞内
で発現を行ってもよい。本発明の特定面では、タンパク
質を鱗翅目（Lepidoptera）の細胞内で発現させて、免
疫原性ポリペプチドを生産する。鱗翅目細胞でのタンパ
ク質の発現のために、バキュロウイルス発現系の使用が
好適である。かかる発現系では、バキュロウイルスプロ
モーターに機能しうる状態で連結されたタンパク質コー
ド配列を含む発現カセットがシャトルベクターに配置さ
れる。この種のベクターはE.coliまたは他の適当な原核
細胞宿主内でシャトルベクターを増幅させるのに十分な
量の細菌DNAを含む。また、シャトルベクターは野生型
バキュロウイルスと異種遺伝子間の組換えを可能にする
ように、目的のタンパク質コード配列に隣接して十分量
のバキュロウイルスDNAを含む。

その後、組換えベクターは野生型バキュロウイルス由
来のDNAと共に鱗翅目細胞に同時トランスフェクトされ
る。相同的組換えから生じる組換えバキュロウイルスを
標準技法により選択し、プラーク精製する。Summers et
al.,TAES Bull（Texas Agricultural Experimental St
ation Bulletin）NR 1555,May,1987を参照されたい。

昆虫細胞でのCSタンパク質の発現法はSmithKline RIT
のUSSN 287,934（WO/US89/05550）に詳細に記載されて
いる。

昆虫細胞での生産は幼虫に感染させることによっても
達成できる。例えば、本発明の組換えバキュロウイルス
を痕跡量の野生型バキュロウイルスと共に幼虫に与え、
約２日後に血リンパからタンパク質を抽出することによ
り、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）
の幼虫においてタンパク質を生産し得る。例えば、Mill
erらのPCT/WO88/02030を参照されたい。

本発明の新規なタンパク質はまた、EP−Ａ−0 278 94
1にCSタンパク質に関して記載されたようにして、酵母
細胞でも発現させることができる。

本発明のワクチンは免疫防御量の16kDaタンパク質ま
たはその免疫原性誘導体を含む。用語“免疫防御量”と
は、病気が回避または軽減されかつ／また病気の伝染が
阻止もしくは遅延されるように、その後のP.falciparum
の攻撃に対して免疫応答を誘起するのに必要な量のこと
である。本発明のワクチンでは、タンパク質の水溶液を
直接使用できる。また、前もって凍結乾燥させてまたは
させずに、タンパク質を各種の既知アジュバントと混合
もしくは吸着させることができる。このようなアジュバ
ントには水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチドおよ
びサポニン類、例えばQuil A、3D−MPL（３脱アシル化
モノホスホリルリピドＡ）またはTDMが含まれるが、こ
れらに限定されない。別の方法として、タンパク質をリ
ポソームのような微粒子内にカプセル化することもでき
る。更に別の方法として、死滅させた百日咳菌（Bordet
ella）または破傷風トキソイドのような免疫刺激性巨大
分子にタンパク質を結合させることもできる。

ワクチンの調製はNew Trends and Developments in V
accines,Voller et al.（eds.）,University Park Pres
s,Baltimore,Maryland,1978に一般的に記載されてい
る。リポソーム内へのカプセル化はFullertonの米国特
許第4,235,877号に記載されている。巨大分子へのタン
パク質の結合は、例えばLikhiteの米国特許第4,372,945
号およびArmorらの米国特許第4,474,757号に開示されて
いる。

Quil Aの使用法はDalsgaard et al.,Acta Vet Scand,
18:349（1977）に記載されている。

各ワクチン用量中に存在する本発明タンパク質の量
は、代表的なワクチンにおいて有意な副作用を示さずに
免疫防御応答を誘発する量として選択される。このよう
な量は使用する特定の免疫原およびワクチン中のアジュ
バントの有無により変化するだろう。一般に、各用量は
１−1000μｇのタンパク質、好ましくは１−200μｇを
含むと予想される。個々のワクチンの最適量は抗体価お
よび被験者における他の反応の観察を含めた標準的な実
験により決定し得る。最初の予防接種後、被験者は約４
週間で追加免疫を受け、その後感染の危険が存在する間
６カ月毎に反復追加免疫を受けることが望ましい。

以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定
するものではない。制限酵素および他の試薬類は実質的
に販売者の説明書に従って使用した。

実施例１ Pfs16遺伝子の単離およびヌクレオチド配列決定 成熟P.falciparum（NF54）配偶子母細胞を半自動懸濁
培養システム（Punnudurai et al.,1983）で生産した。
培養後14日目に、560xg、５分の遠心により感染した赤
血球を回収した。配偶子形成の誘導後（Vermeulen et a
l.,1983）、マクロガメート／接合子および配偶子母細
胞を、Vermeulen et al.（1983）に記載されるように不
連続Nycodenz（Nyegaard,Oslo）勾配を通して遠心して
別々に回収した。これらの細胞を100mM NaCl、50mMトリ
ス−HCl pH7.2、50mM EDTA、0.2％SDSおよび２％トリト
ン−X100中で溶解した後、Maniatis et al.（1982）に
記載されるようなフェノール／クロロホルム抽出および
30mM NaAc pH6.8および50mM EDTA中の5.7M CsClのクッ
ションを通した遠心によりRNAを精製した。

cDNAライブラリーはP.falciparum NF54から得られた
全配偶子母細胞RNAから作製された。オリゴ（dT）をプ
ライマーとした第１鎖合成とRNaseH−DNAポリメラーゼ
Ｉにより仲介される第２鎖合成によりcDNAを合成した
（Gubler and Hoffmann,1983）。dGTPによるホモポリマ
ーの付加後、cDNAをプラスミドpPLc24511のオリゴ（d
C）付加Sst1部位にアニーリングした。ベクターpPLc245
11はプラスミドpPLc245（Remaut et al.,1983）の誘導
体であり、221bpのSal1/Rsa1制限断片がM13mp11 DNAのS
al1/Pvu11断片により置き換えられている。E.coli MC10
61（Casadaban and Cohen,1980）への形質転換後、約2
5,000の形質転換体が得られた。このようにして作製さ
れたcDNAライブラリーは、配偶子母細胞、マクロガメー
ト／接合子および無性血液世代のNF54寄生虫から単離し
たRNAのオリゴ（dT）付加により作製された、³²P標識１
本鎖cDNAとのin situハイブリダイゼーションにより有
性世代に特異的なコード配列の存在についてスクリーニ
ングした。マクロガメート／接合子および配偶子母細胞
のcDNAとのみハイブリダイズしたクローンを同定した。
これらのクローンの１つ、GB8、は以下に示す配列の一
部を含んでいた。挿入断片を単離し、³²Pで標識し、そ
の後これを用いてP.falciparum NF54からの全配偶子母
細胞RNAのラムダーgt11cDNAライブラリーをスクリーニ
ングした。このライブラリーの作製は発表されている
（Wesseling et al.,1989）。これらのファージクロー
ンの１つ（GB8c）は以下に示すPfs16DNA配列を含んでい
た。

P.falciparum無性血液世代、配偶子母細胞およびマク
ロガメート／接合子からの全RNAのノーザンハイブリダ
イゼーション分析から、クローンGB8cは配偶子母細胞お
よびマクロガメート／接合子において約1400bpの単一の
mRNA種として発現される遺伝子を含むことが分かった。
無性血液世代からのRNAに対するハイブリダイゼーショ
ンは実際上存在しないか、または非常に弱かった。

ノーザンハイブリダイゼーションでは、３μｇの全RN
A（無性血液世代、配偶子母細胞または配偶子／接合子
から単離した）を2.2Mホルムアルデヒドを含む１％アガ
ロースゲルに負荷した。このゲルを25mM NaPO₄緩衝液
（pH7.0）中で電気泳動にかけ、20xSSPE中でニトロセル
ロース（Schleicher and Schuell）にRNAを移行させ
た。ブロットとのハイブリダイゼーションは50mM NaPO₄
（pH6.5）、0.8M NaCl、50％ホルムアミド、1mM EDTA、
0.1％SDS、2.5xDenhardt溶液、50μg/ml変性サケ精子DN
Aおよび500μg/ml酵母RNA中42℃で16時間行った。ブロ
ットを高緊縮条件（0.1％SDS,65℃）で洗浄した。

高比放射能のプローブはpGEMblueのポリリンカーに前
もって連結させた相応の制限断片のin vitro転写により
作製した。

ヌクレオチド配列解析のために、選択した組換えプラ
スミドから相応のDNA断片を消化し、M13mp10/mp11ベク
ター（Gene,26:101ー106（1983））にサブクローニング
した。ヌクレオチド配列はSanger（Sanger et al.,197
7）によって最初に開発されたジデオキシシークエンシ
ング戦略を用いて決定した。

Pfs16コード領域およびフランキング領域のヌクレオ
チド配列は添付した図１に示してある。ヌクレオチドに
はATG開始コドンのＡに対して番号が付けてある。推定
アミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示され、Luおよ
びElzinga（1977）により提案されたナンバリングシス
テムに従って番号が付けてある。実線で囲った部分は実
施例６の合成ペプチドのアミノ酸配列を表す。

推定アミノ酸配列はＮ末端のシグナル配列とメンブラ
ン・アンカー配列とＣ末端の親水性配列を含む。この配
列はアミノ酸Cys、TrpおよびTyrを欠いている。タンパ
ク質配列内に、可能なＮ−グルコシル化部位（Asn−Ｘ
−Ser/Thr）は検出されなかった。DNAレベル（EMBLヌク
レオチドデータベース；リリーズ12）およびタンパク質
レベル（NBRF/PIRタンパク質データベース；リリーズ1
2）でのコンピューターサーチ分析は、Pfs16遺伝子とそ
の誘導されたタンパク質配列がこれまでに知られたどの
DNA配列またはタンパク質配列とも有意な類似性をもた
ないことを示した。

実施例２ COS細胞での遺伝子Pfs16の発現 遺伝子Pfs16をベクタープラスミドCDM8中のCMVプロモ
ーターのすぐ下流（BstX1部位）に挿入した。適当な組
換えプラスミドの選択後、遺伝子Pfs16細胞によりコー
ドされるタンパク質（Pfs 16kDa）のCOS細胞（サル腎細
胞に由来する）での一時的生産を、免疫蛍光検定（IF
A）により調べた。これらの実験から、COS細胞表面への
トランスフェクション後に、（組換え）16kDaタンパク
質またはその断片に対して誘導された抗血清と特異的に
反応する抗原を検出し得ると断定することができた。

実施例３ 昆虫細胞での遺伝子Pfs16の発現 アメリカ産行列毛虫ヨトウガのスポドプテラ・フルギ
ペルダ（fall army worm Spodoptera frugiperda）の組
織培養細胞（Sf9細胞）でPfs16遺伝子を発現させるため
に、バキュロウイルスAcMNPVから誘導された発現系を使
用した。トランスファーベクターとして、プラスミドpJ
VP10.Z.Pfs16を使用した。このプラスミドは陽性の選択
（β−ガラクトシダーゼ）ベクターpJVP10.Zの誘導体で
あり、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化したその唯一の
NheI部位に、完全なPfs16遺伝子とフランキング配列
（すなわち、その５′末端に４個のヌクレオチドおよび
その３′末端に３個のヌクレオチド）を含む平滑末端化
PCR断片（Vialgrd et al 1990）を挿入することにより
構築される。この部位はポリヘドリンプロモーターのす
ぐ下流に存在する。

Pfs16遺伝子を含む組換えAcMNPV10.Z.Pfs16ウイルス
の選択およびクローニング後に、それをさらに増殖させ
た。その後、Sf9細胞に組換えウイルスを感染させた後
に16kDaタンパク質が生産されたかどうかを調べた。

これは実際にその事例であることが分かった。免疫蛍
光実験により、このタンパク質は主にSf9細胞の表面に
存在することが立証された。Pfs16タンパク質の分泌は
観察されなかった。AcMNPV−10.Z.Pfs16感染細胞の全細
胞抽出物から調製したウェスターンブロットの免疫学的
スクリーニングから、Sf9細胞においては少なくとも３
種の遺伝子Pfs16特異的タンパク質が生産されたことが
判明した。最大のものは多分Plasmodium falciparumの
配偶子母細胞に存在するPfs16タンパク質と共泳動する
（中間）タンパク質のプロセッシングされていない前駆
物質である。最小のタンパク質の本性は不明である。そ
の電気泳動移動度から判断して、本発明者らは、それが
宿主細胞膜に挿入する間に16kDaタンパク質の前駆体タ
ンパク質から切り離されるシグナルペプチドよりも大き
いと断定する。驚いたことに、同一の分子量を有する類
似した組のタンパク質がE.Coliでの完全Pfs16遺伝子の
発現後にも観察された。

実施例４ PFS16遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの作
製 Pfs16遺伝子の全コード配列をワクシニアトランスフ
ェクションプラスミドpSC11（１）の唯一のSmaI制限酵
素切断部位にクローニングして、組換えプラスミドpSC1
1:Pfs16を作製した。

この構築物では、Pfs16遺伝子がワクシニアウイルス
7.5プロモーター（１）の転写制御下にある。

Pfs16遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを
得るために、発表された標準方法を採用した（２）。簡
単に述べると、CV1細胞（ATCC ＃ CCL70）に野生ワクシ
ニアウイルス（WR株）を感染させ、その後プラスミドpS
C11:Pfs16でトランスフェクトした。これらの感染細胞
から得られたウイルスストックを、５−ブロモデオキシ
ウリジン（BUdR）の存在下で、RAT−２（TK^-）細胞（AT
CC ＃ CRL1764）の単層に感染させた。組換えウイルス
はTK^-，βGal⁺溶菌プラークとして選択した。さらに、
それらをRAT−２細胞上でのプラーク精製に３回かけ、
この場合も二重TK^-，βGal⁺選択を用いた。得られた精
製組換えウイルスはvSC11:Pfs16と命名した。

この組換えウイルスによるPfs16遺伝子の発現を証明
するために、CV1およびBHK21（ATCC ＃ CC110）細胞にv
SC11:Pfs16、またはPfs16遺伝子のコード配列を含まな
い対照の組換えウイルスvSC11を感染させた。感染の16
−48時間後、細胞を回収し、PAG/SDS負荷緩衝液中で溶
解し、そして細胞抽出物をイムノブロットにより分析し
た。E.coliにより生産された、精製組換え16kDaタンパ
ク質に対して誘導されたウサギ抗血清（K37S8）とブロ
ットを反応させた。この分析の結果は、ウイルスvSC11:
Pfs16を感染させたCV1およびBHK21細胞が16kDa抗原を合
成することを示す。

文献 1.CHAKRABARTI S.,BRACHLING K.and MOSS B.（1985）． “ワクシニアウイルス発現ベクター：β−ガラクトシダ
ーゼの同時発現は組換えウイルスプラークの可視スクリ
ーニングをもたらす” MOL AND CELL.BIOL.5:3403−3409 2.MACKETT M.,SMITH G.L.,and MOSS B.（1984）． “外来遺伝子を発現する感染性ワクシニアウイルス組換
え体の作製および選択方法” J.Virol.49:857−864. 実施例５ ペプチドP31/47の合成、精製および複合体形成 アミノ酸残基31−47を含む合成ペプチドをBaranyとMe
rrifield（1980）により開示された段階的固相法に従っ
て合成し、逆相高性能液体クロマトグラフィーで精製し
た。

アミノ酸組成はアミノ酸分析により証明した。この合
成ペプチドはGeerlingsら（1988）に従ってグルタルア
ルデヒドを用いてウシ血清アルブミンに結合させた。

実施例６ 組換え融合タンパク質の調製 適当なPfs16遺伝子断片（それぞれBamH1/Dral,BamH1/
Ssp1断片）を挿入したpGEX−2Tベクター（Smith et a
l.,1988）を使って、Schistosoma japonicumのグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼ（Smith et al.,1986）に
共有結合させた16kDaの部分から成る組換え融合タンパ
ク質を合成した。E.coli JM101 recAに発現させた。融
合タンパク質はグルタチオンアガロースビーズ（Sulphu
rlinkage,Sigma）への吸着およびその後の溶離により単
離した。

実施例７ ニュージーランドウサギに、フロインド完全アジュバ
ント中に乳化した200μｇのP31/47 BSA複合体のホモジ
ネートを皮下注射し、３週間の間隔でフロインド不完全
アジュバント中のP31/47 BSA複合体で追加免疫を行っ
た。それぞれの追加免疫後７日目に主な耳静脈から採血
した。血液を４℃で一夜固まらせ、使用するまで血清を
−20℃で貯蔵した。

免疫したウサギからの抗血清は、イムノブロッティン
グによりP.falciparumの配偶子および配偶子母細胞の両
方に対する反応性について分析した。配偶子および配偶
子母細胞の抽出物はSDS試料緩衝液（62.5mMトリス−HC
l,2％SDS,10％グリセロール,5％２−メルカプトエタノ
ール,0.003％ブロモフェノールブルー）中で1x10⁶個の
寄生虫を沸騰させることにより調製した。SDS（0.1％）
を含むポリアクリルアミド（10％−20％）ゲルを調製
し、Laemmli（1970）に従って変性条件下で泳動した。
記載される（Towbin et al.,1979）通りにタンパク質を
0.45μｍニトロセルロースフィルターに移した。ニトロ
セルロースフィルターをTBST（50mMトリス−HCl,200mM
NaCl,5mM EDTA,0.05％Tween−20,pH7.5）中の１％粉ミ
ルクでブロックし、その後様々なウサギ抗血清の1:100
希釈物と１−２時間インキュベートした。検出はTBST緩
衝液中のアルカリホスファターゼ−ヤギ抗ウサギIgG
（Ｈ＋Ｌ）の1:8000希釈物を用いて１時間行った。RBS
で十分に洗浄した後、100mMトリス、100mM NaClおよび5
mM MgCl₂（pH9.5）中の５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルホスフェート（ｐ−トルイジン塩、Sigma）
およびニトロブルー−テトラゾリウムクロライドを用い
て着色反応を行った。バンドが現われるまでフィルター
を展開し、その後20mMトリス−HCl（pH8.0）および5mM
EDTA中で洗った。

ウェスターンブロット分析は、合成ペプチドに対して
調製された抗体が配偶子および配偶子母細胞の両方のタ
ンパク質抽出物中のMr＝16kDaのタンパク質と強く反応
することを示した。この抗体は標準免疫蛍光検定（Moel
ans et al.,1991）において乾燥した配偶子および配偶
子母細胞とも反応した。

この結論は合成ペプチドに対して誘導されたウサギ抗
体を用いた免疫−金電子顕微鏡実験（下記参照）により
実証された。これらの実験から、16kDaタンパク質はPla
smodium falciparumの配偶子および配偶子母細胞の表面
に存在することが明らかになった。

免疫電子顕微鏡 P.falciparum（NF54）を傾斜システム（tipper syste
m）で培養し、記載される通り（Ponnudurai et al.,198
6）に同調培養を行った。配偶子母細胞を含む血液試料
を培養物から取り出し、すぐに固定した。鞭毛発生を開
始させて、配偶子を検出するために、固定前に他の試料
を室温で10−30分間維持した。全試料は0.1Mリン酸緩衝
液中の１％アクロレイン/2％パラホルムアルデヒドで２
時間固定し、10分間（1500xg）遠心分離し、その後0.1M
リン酸緩衝液中の２％（w/v）パラホルムアルデヒド中
に再懸濁した。４℃で一夜放置後、細胞をリン酸緩衝液
で十分に洗い、ペレットをゼラチン（２％w/v）に埋包
した。エタノール70％に対して脱水後、中間グレードの
L.R.白色樹脂（London Resin社）に試料を埋め込み、50
℃で重合させた。薄い切片を数滴のメタ過ヨウ素酸ナト
リウムの飽和水溶液中室温で15分間溶蝕（エッチング）
し、蒸留水ですすぎ、0.1Mリン酸緩衝液中の１％ウシ血
清アルブミンとプレインキュベートした。続いて、それ
らは湿潤チャンバー内で50μｌ滴のP31/47に対する抗体
（約25μg/mlの濃度が得られるまで適宜に希釈した）と
４℃で一夜インキュベートした。切片を十分に洗い、プ
ロテインＡ金（10mm）（Slot and Geuze,1985）と１時
間反応させた。対照切片は免疫前血清とインキュベート
した。最終洗浄後、それらを２％グルタルアルデヒドで
10分間後−固定し、洗浄し、酢酸ウラニルで染色した。

さらに、合成ペプチド31/47、BamH1/Dra1断片およびB
amH1/Ssp1断片融合タンパク質に対して誘導されたウサ
ギ抗血清を用いた、全配偶子母細胞、マクロガメート／
接合子およびスポロゾイトのタンパク質のウェスターン
ブロット分析から、16kDaタンパク質がP.falciparumス
ポロゾイトのタンパク質抽出物中に存在することが分か
った（Moelans et al 1991a）。この発見は免疫−金電
子顕微鏡分析により確認され、16kDaタンパク質はスポ
ロゾイトの表面に一様に広がっていた（Moelans et al
1991）。合成ペプチドおよびBamH1/Dral融合タンパク質
に対して誘導されたウサギ抗血清との反応が得られた。

実施例８ ワクチン処方物 16kDaタンパク質に基づいたワクチンは、次の目的の
１つまたは両方を達成するためにデザインされる： −高力価の伝播阻止抗体の生産を誘発することにより有
性世代寄生虫に対する免疫を誘起させる； −高力価の中和抗スポロゾイト抗体の生産により赤血球
外世代の寄生虫に対する防御免疫、並びに肝臓世代の寄
生虫に対する強い細胞性免疫応答を誘起させる。

本発明のワクチンは次のように調製される： ３％水酸化アルミニウムの緩衝水溶液（10mMリン酸ナ
トリウム、150mM NaCl、pH6.8;濾過滅菌済み）に、同様
の緩衝液中の本発明のP.falciparumポリペプチドを、最
終濃度が100μg/mlのポリペプチドおよび0.5mg/mlのア
ルミニウム（Al³⁺）となるように攪拌しながら加える。
pHを6.8に維持する。この混合物を約０℃で一夜放置す
る。チメロサールを加えて0.0005％の最終濃度とする。
pHをチェックし、必要ならば6.8に調整する。

本発明のワクチンは抗体応答、細胞性応答、または両
方を誘起させるためにデザインされる。CSタンパク質と
同様に、本発明の16kDaタンパク質はスポロゾイトの表
面に存在する。それ故に、それはたいてい侵入する寄生
虫によって肝細胞内に運ばれる。従って、CSタンパク質
から類推して、16kDa抗原は感染した肝細胞に対して誘
導された細胞障害性Ｔ細胞の適格な標的であり得る（Na
ture,341,323−325（1989））。細胞性応答を誘起させ
るために利用できる技法には次のものが含まれる： （ａ）対象の抗原を発現する、生きている組換えウイル
スによる免疫感作、例えばワクシニアに関してはScienc
e,224:397−９（1984）およびNature,334,258−260に、
水痘−帯状疱疹ウイルスに関してはProc.Natl.Acad.Sc
i.USA84,3896−3900（1987）に、そしてアデノウイルス
に関してはJournal of Infectious Diseases 161:27−3
0（1990）に記載されている。

（ｂ）対象の抗原を発現する、生きている組換え細菌に
よる免疫感作、例えばサルモネラ菌に関してはVaccine,
7,495−498（1989）、WO89/02924、Science,240,336−3
38（1988）およびSmithKline BeckmanのUSSN222,202（E
P−Ａ−0357208）に、そしてウシ結核菌（Mycobacteriu
m bovis）のようなミコバクテリウム属に関してはW090/
00594に記載されている。

（ｃ）免疫原性のある又はない粒子に抗原を担持させ
る。例えば、Valenzuelaら（米国特許第4,722,840
号）、EP−Ａ−0278940およびRutgersら（Bio/Technolo
gy，6:1065−70（1988））はＢ型肝炎表面抗原に融合さ
れた種々の長さのP.falciparumCS反復を教示している。
融合体はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）内でウイルス粒子として発現される。

（ｄ）別法として、Immunology Today,11,No.3（199
0）,89および次頁に記載されるリポソームのような不活
性粒子に抗原を担持させるか、またはNature,308:457−
460（1984）に記載される免疫刺激複合体（ISCOM）中に
抗原を挿入する。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 コニングス，ルドルフ ニコラス ヘン ドリック オランダ国 クァイク エヌエル―5431 ジーゼット コーウェンベルグ 36 (72)発明者 メーランス，インゲ イルマ マリア ドミニク オランダ国 ナイメーゲン エヌエル― 6541 エスエィチ スペルウェルシュト ラート 76 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61P 33/06 C07K 14/00 - 14/825 C12N 1/00 - 7/08 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下に示されるとおりのアミノ酸配列からな
   る熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）の16kDaタンパ
   ク質およびその免疫原性誘導体（突然変異体を含む）：
2. 【請求項２】配偶子とスポロゾイトの両方の膜から得ら
   れる点に特徴がある、請求項１に記載の熱帯熱マラリア
   原虫の16kDaタンパク質およびその免疫学的誘導体。
3. 【請求項３】哺乳動物においてスポロゾイトと赤血球外
   世代の寄生虫の両方に対して免疫応答を誘起させ得る点
   にさらに特徴がある、請求項１または２記載の熱帯熱マ
   ラリア原虫の16kDaタンパク質およびその免疫学的誘導
   体。
4. 【請求項４】請求項１−３のいずれか１つに記載された
   16kDaタンパク質またはその免疫学的誘導体を含む融合
   タンパク質。
5. 【請求項５】巨大分子に結合された請求項１または２に
   記載された16kDaタンパク質またはその免疫学的誘導
   体。
6. 【請求項６】請求項１−５のいずれかに記載された単離
   されたタンパク質。
7. 【請求項７】請求項１−５のいずれか１つに記載され
   た、16kDaタンパク質をコードする請求項１に示される
   とおりのDNA配列またはその免疫学的誘導体もしくは融
   合タンパク質をコードする配列。
8. 【請求項８】請求項７に記載されたDNA配列を含む発現
   ベクター。
9. 【請求項９】請求項８に記載された発現ベクターで形質
   転換された宿主。
10. 【請求項１０】請求項９に記載された細菌またはウイル
    ス宿主。
11. 【請求項１１】医薬として使用するための、請求項１−
    ５のいずれか１つに記載されたタンパク質。
12. 【請求項１２】請求項１−５のいずれか１つに記載され
    たタンパク質を適当な担体と共に含有してなるワクチン
    組成物。
13. 【請求項１３】他のプラスモディウム抗原をさらに含
    む、請求項12のワクチン組成物。
14. 【請求項１４】請求項１−５のいずれか１つに記載され
    たタンパク質を含む、熱帯熱マラリア原虫感染症に対す
    る伝播阻止ワクチン。
15. 【請求項１５】請求項１−５のいずれか１つに記載され
    たタンパク質を含む、抗−赤血球外およびスポロゾイト
    ワクチン。
16. 【請求項１６】請求項10に記載された宿主を含むワクチ
    ン。
17. 【請求項１７】アジュバントをさらに含む、請求項11−
    14のいずれか１つに記載されたワクチン。
18. 【請求項１８】請求項１−５のいずれかに記載されたタ
    ンパク質の生産方法であって、 ａ）宿主を請求項７に記載のDNA配列で形質転換し、 ｂ）該宿主を適当な培地で培養し、該培地から該タンパ
    ク質を単離することからなる方法。