JP3058667B2 - Ｄｎａプローブおよびこれを用いるｄｎａ断片検出法 - Google Patents
Ｄｎａプローブおよびこれを用いるｄｎａ断片検出法Info
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- JP3058667B2 JP3058667B2 JP2268357A JP26835790A JP3058667B2 JP 3058667 B2 JP3058667 B2 JP 3058667B2 JP 2268357 A JP2268357 A JP 2268357A JP 26835790 A JP26835790 A JP 26835790A JP 3058667 B2 JP3058667 B2 JP 3058667B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はDNAプローブおよびそれを用いた遺伝子の検
出法に関するものである。
出法に関するものである。
従来、特定塩基配列の検出には放射性標識あるいは酵
素標識されたDNAプローブが用いられていた。すなわ
ち、検体を電気泳動分離した後、セルロース膜等に転写
し、DNAプローブを対合されて対合DNAバンドのパターン
をオートラジオグラフィあるいは化学発光により検出し
ていた。このような検出方法では一般に測定の正確を期
すため１つのDNA検体に対し何種かのDNAプローブが用い
られる。しかし、放射性標識や化学発光では１種類の信
号しか与えないので、１検体をいくつかに分割し、それ
ぞれについて異なるプローブを用いた検出を行なってい
た。このような不便さを解消するため発光波長の異なる
蛍光体で標識されたDNAプローブが用いられはじめてい
る。
素標識されたDNAプローブが用いられていた。すなわ
ち、検体を電気泳動分離した後、セルロース膜等に転写
し、DNAプローブを対合されて対合DNAバンドのパターン
をオートラジオグラフィあるいは化学発光により検出し
ていた。このような検出方法では一般に測定の正確を期
すため１つのDNA検体に対し何種かのDNAプローブが用い
られる。しかし、放射性標識や化学発光では１種類の信
号しか与えないので、１検体をいくつかに分割し、それ
ぞれについて異なるプローブを用いた検出を行なってい
た。このような不便さを解消するため発光波長の異なる
蛍光体で標識されたDNAプローブが用いられはじめてい
る。
しかし、上述のように異なる発光波長の異なる蛍光体
で標識した蛍光プローブを用いた検出法においても、活
用できる蛍光体の種類および利用できる励起用レーザー
の種類が限られているため、実用的とされるのはせいぜ
い10種程度であり、より多くのDNAプローブをうまく標
識し、識別する方法の開発が望まれている。
で標識した蛍光プローブを用いた検出法においても、活
用できる蛍光体の種類および利用できる励起用レーザー
の種類が限られているため、実用的とされるのはせいぜ
い10種程度であり、より多くのDNAプローブをうまく標
識し、識別する方法の開発が望まれている。
上記目標を達成するために、本発明では二種以上の蛍
光体で１つのDNAプローブを標識し、この二種の組み合
わせで各プローブからの発光スペクトルに変化を持た
せ、波長選別して蛍光検出することによりプローブを識
別する。
光体で１つのDNAプローブを標識し、この二種の組み合
わせで各プローブからの発光スペクトルに変化を持た
せ、波長選別して蛍光検出することによりプローブを識
別する。
利用できる蛍光体が８ケの場合、従来の単独標識では
８ケのプローブを識別できるだけであるが、これを４種
ずつ２組に分け、この組み合わせを作ると合計24種のDN
Aプローブの識別が可能である。また、DNAに付着せしめ
る蛍光体の数をふやし、蛍光体の発光強度に変化を持た
せれば、更に多くのプローブを識別することができる。
８ケのプローブを識別できるだけであるが、これを４種
ずつ２組に分け、この組み合わせを作ると合計24種のDN
Aプローブの識別が可能である。また、DNAに付着せしめ
る蛍光体の数をふやし、蛍光体の発光強度に変化を持た
せれば、更に多くのプローブを識別することができる。
以下、本発明の一実施例を第１〜３図により説明す
る。標識用として用いた色素はサクシニルフルオレセイ
ン（Succinyl Fluorescein:SF）とその異性体（SF1〜
４）（発光極大波長はそれぞれ、512nm,520nm,530nmお
よび538nm）とウルトラライト（Ultralite）660,680,70
0,および720（発光極大波長はそれぞれ654nm,682nm,697
nm,および717nm、以後U1〜４と略称する）である。
る。標識用として用いた色素はサクシニルフルオレセイ
ン（Succinyl Fluorescein:SF）とその異性体（SF1〜
４）（発光極大波長はそれぞれ、512nm,520nm,530nmお
よび538nm）とウルトラライト（Ultralite）660,680,70
0,および720（発光極大波長はそれぞれ654nm,682nm,697
nm,および717nm、以後U1〜４と略称する）である。
第１図に示したように24種のDNAプローブをSFおよびU
ltraliteで標識する。図中の数字はプローブ中に含まれ
る色素の数で空欄はゼロである。
ltraliteで標識する。図中の数字はプローブ中に含まれ
る色素の数で空欄はゼロである。
検査しようとするDNA試料を酵素切断し、二本鎖を変
性させ一本鎖とし、変性条件下でアガロースゲル電気泳
動により分離する。分離後DNAバンドをフィルター上に
転写し固定する。フィルターを移動台付蛍光検出器（第
２図）にセットし、発光を観測する。励起光源にはArレ
ーザー488nm（10mW）（スペクトルフィジクス社製）とH
e−Ne（10mW日本電気製）を重畳して一本としたものを
用いた。蛍光検出にはフィルター付公電子増倍管を４本
１セットとして用いた。SF1〜４を検出器1,2で検出し、
U1〜４を検出器3,4で検出した。これらの検出器には図
に示した４種のフィルターが装着されており、各蛍光体
からの発光は波長に応じた透過率で検出器に到達する。
性させ一本鎖とし、変性条件下でアガロースゲル電気泳
動により分離する。分離後DNAバンドをフィルター上に
転写し固定する。フィルターを移動台付蛍光検出器（第
２図）にセットし、発光を観測する。励起光源にはArレ
ーザー488nm（10mW）（スペクトルフィジクス社製）とH
e−Ne（10mW日本電気製）を重畳して一本としたものを
用いた。蛍光検出にはフィルター付公電子増倍管を４本
１セットとして用いた。SF1〜４を検出器1,2で検出し、
U1〜４を検出器3,4で検出した。これらの検出器には図
に示した４種のフィルターが装着されており、各蛍光体
からの発光は波長に応じた透過率で検出器に到達する。
蛍光体の種類は２つの検出器に流れる電流の差で判定
した。第３図にその様子を示した。検出器１および２を
用いてSF1〜４を識別する。また、検出器３および４を
用いてU1〜U4を識別する。プローブ１〜８を除いて１つ
のプローブに入っているSF色素とUltraliteの比率は厳
密に1:1であり各プローブから出る蛍光がフィルターを
通して受光される強度比も一定である。１つのDNAバン
ドに２つのプローブがハイブリダイズした場合でも強度
比が一定であることを利用して、これら２種が何である
かを同定することができる。
した。第３図にその様子を示した。検出器１および２を
用いてSF1〜４を識別する。また、検出器３および４を
用いてU1〜U4を識別する。プローブ１〜８を除いて１つ
のプローブに入っているSF色素とUltraliteの比率は厳
密に1:1であり各プローブから出る蛍光がフィルターを
通して受光される強度比も一定である。１つのDNAバン
ドに２つのプローブがハイブリダイズした場合でも強度
比が一定であることを利用して、これら２種が何である
かを同定することができる。
更に多種のプローブを識別するには蛍光体の種類をふ
やすこと、あるいは発光波長帯の異なる、たとえばTRIT
C（テトラ メチル ローダミン イソチオシアネート:
Tetramethyl rhodamine isothiocyanate発光波長575n
m）とその類似体を用いて合計３つの蛍光体でDNAプロー
ブを標識するなどの方法がある。たとえば、前記８種の
蛍光体に加えてTRITCとその類似体合計３種を用い、合
計３カ所に蛍光を入れた場合には少なくとも更に３倍
（24×３＝72）のDNAプローブを区別することができ
る。
やすこと、あるいは発光波長帯の異なる、たとえばTRIT
C（テトラ メチル ローダミン イソチオシアネート:
Tetramethyl rhodamine isothiocyanate発光波長575n
m）とその類似体を用いて合計３つの蛍光体でDNAプロー
ブを標識するなどの方法がある。たとえば、前記８種の
蛍光体に加えてTRITCとその類似体合計３種を用い、合
計３カ所に蛍光を入れた場合には少なくとも更に３倍
（24×３＝72）のDNAプローブを区別することができ
る。
同じ蛍光体を２つプローブ中に入れる事を許すと、20
0近いDNAプローブを識別する事ができる。この場合、励
起光源として発光波長543nmの緑色He−Neレーザーを更
に重畳させるか、３色の波長が出るHe−Cdレーザーを使
用する。TRITCとその類似体からの発光検出用に２本の
フィルター付光電子増倍管を１セット具備する必要があ
る。
0近いDNAプローブを識別する事ができる。この場合、励
起光源として発光波長543nmの緑色He−Neレーザーを更
に重畳させるか、３色の波長が出るHe−Cdレーザーを使
用する。TRITCとその類似体からの発光検出用に２本の
フィルター付光電子増倍管を１セット具備する必要があ
る。
上記実施例はフィルターに転写されたDNAバンドにDNA
プローブをハイブリダイズさせて計測した例であるが、
試料を一体鎖とした後、プローブをハイブリダイズさ
せ、二本鎖状態で泳動させながら実時間検出する事もで
きる。
プローブをハイブリダイズさせて計測した例であるが、
試料を一体鎖とした後、プローブをハイブリダイズさ
せ、二本鎖状態で泳動させながら実時間検出する事もで
きる。
以上述べたように、DNAプローブを複数の蛍光体で標
識することにより、その組合せの数に応じて非常に多く
のDNAプローブを区別して検出できる。
識することにより、その組合せの数に応じて非常に多く
のDNAプローブを区別して検出できる。
【図面の簡単な説明】 第１図は標識色素の種類によりプローブを分類する様子
を示した図、第２図は遺伝子蛍光検出装置の概念図、第
３図は色素識別の信号強度を示す図である。 １〜４……フィルター付光検出器、５……泳動分離板、
６〜７……励起用レーザー、８……検出回路、９……デ
ータ処理装置。
を示した図、第２図は遺伝子蛍光検出装置の概念図、第
３図は色素識別の信号強度を示す図である。 １〜４……フィルター付光検出器、５……泳動分離板、
６〜７……励起用レーザー、８……検出回路、９……デ
ータ処理装置。
Claims (10)
- 【請求項１】発光波長の異なる複数の蛍光体で標識され
ることを特徴とするDNAプローブ。 - 【請求項２】請求項１に記載のDNAプローブにおいて，
前記蛍光体の種類が２又は３であることを特徴とするDN
Aプローブ。 - 【請求項３】発光波長の異なる複数の蛍光体の組合わせ
で標識される複数のDNAプローブを，発光波長の違いに
より識別して検出し,DNA断片を検出することを特徴とす
るDNA断片検出法。 - 【請求項４】請求項３に記載のDNA断片検出法におい
て，前記蛍光体の種類が２又は３であることを特徴とす
るDNA断片検出法。 - 【請求項５】DNAプローブを標識する複数の蛍光体の組
合わせを用いて，複数のDNA断片を識別して検出するこ
とを特徴とするDNA断片検出法。 - 【請求項６】請求項５に記載のDNA断片検出法におい
て，前記蛍光体の種類が２又は３であることを特徴とす
るDNA断片検出法。 - 【請求項７】２本鎖DNA試料を酵素切断して得られる２
本鎖DNA断片を１本鎖DNA断片とした後、電気泳動分離さ
れた前記１本鎖DNA断片に，発光波長の異なる複数の蛍
光体の組合わせで標識されるDNAプローブを対合させ
て，該DNAプローブを標識する前記蛍光体からの蛍光を
検出して，前記１本鎖DNA断片を検出することを特徴と
するDNA断片検出法。 - 【請求項８】請求項７に記載のDNA断片検出法におい
て，前記蛍光体の種類が２又は３であることを特徴とす
るDNA断片検出法。 - 【請求項９】２本鎖DNA試料を酵素切断して得られる２
本鎖DNA断片を１本鎖DNA断片とした後，発光波長の異な
る複数の蛍光体の組合わせで標識されるDNAプローブ
を，前記１本鎖DNA断片に対合させて対合体を得て，泳
動する状態の前記対合体を標識する前記蛍光体からの蛍
光を検出して，前記１本鎖DNA断片を検出することを特
徴とするDNA断片検出法。 - 【請求項１０】請求項９に記載のDNA断片検出法におい
て，前記蛍光体の種類が２又は３であることを特徴とす
るDNA断片検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2268357A JP3058667B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | Ｄｎａプローブおよびこれを用いるｄｎａ断片検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2268357A JP3058667B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | Ｄｎａプローブおよびこれを用いるｄｎａ断片検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04144698A JPH04144698A (ja) | 1992-05-19 |
| JP3058667B2 true JP3058667B2 (ja) | 2000-07-04 |
Family
ID=17457400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2268357A Expired - Fee Related JP3058667B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | Ｄｎａプローブおよびこれを用いるｄｎａ断片検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3058667B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102542099B1 (ko) * | 2021-02-26 | 2023-06-14 | 주식회사 멀티스하이드로 | 제철공정용 스위벨 조인트 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5376528B2 (ja) * | 2010-05-06 | 2013-12-25 | 独立行政法人日本原子力研究開発機構 | 放射線および中性子イメージ検出器 |
| EP3299472A1 (en) * | 2016-09-27 | 2018-03-28 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts | Method for labeling oligonucleotide probes |
-
1990
- 1990-10-08 JP JP2268357A patent/JP3058667B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102542099B1 (ko) * | 2021-02-26 | 2023-06-14 | 주식회사 멀티스하이드로 | 제철공정용 스위벨 조인트 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04144698A (ja) | 1992-05-19 |
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