JP2862986B2 - ジテルペン化合物およびその製造法 - Google Patents

ジテルペン化合物およびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗腫瘍活性および抗菌活性を有し、クレロ
ダン型ジテルペンに属する抗生物質UCT−4Bならびにス
トレプトマイセス属に属する微生物からのクレロダン型
ジテルペン構造を持つ抗生物質の製造法に関する。
従来の技術 クレロダン型ジテルペン構造を有する抗生物質とし
て、キタサトスポリア属に属する微生物の生産するテル
ペンテシン（MF730−N6）〔特開昭61−285992号公報：
ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオテイックス（Th
e Journal of Antibiotics）,38巻,1664頁,1985年；同3
8巻,1819頁,1985年〕およびオイディオデンドロン属に
属する微生物の生産するクレロシデイン（PR−1350）
〔特開昭57−120522号公報;The Journal of Antibiotic
s,36巻,753頁,1983年；テトラヘドロンレターズ（Tetra
hedron Letters）,25巻,465頁,1984年〕が知られてい
る。
これらのクレロダン型ジテルペン系抗生物質は、通
常、化学的に等価である互変異性体の平衡混合物として
存在し、例えばクレロシデインの場合次式 で示されるヒドロキシアルデヒド（化合物Ａ）、ヘミア
セタール（化合物Ｂ）等のモノマーあるいはダイマー
（化合物Ｃ）等の相互間の平衡混合物であることが知ら
れている。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、抗腫瘍活性および抗菌活性を有する
新規抗生物質UCT4−Ｂならびにストレプトマイセス属に
属する微生物を用いたクレロダン型ジテルペン構造を持
つ抗生物質の製造法を提供することにある。
課題を解決するための手段 本発明はストレプトマイセス属に属し、次式（Ｉ） （式中、Ｒは-CH3または-CH2OHを表わす） で示されるクレロダン型ジテルペン誘導体を生産する能
力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該クレロ
ダン型ジテルペン誘導体を生成蓄積させ、該培養物より
該クレロダン型ジテルペン誘導体を採取することを特徴
とする該クレロダン型ジテルペン誘導体の製造法および
式（II）で示されるUCT4−８およびその化学的に等価で
ある互変異性体に関する。
次に、UCT4−Ｂおよびテルペンテシンの製造法につい
て説明する。
UCT4−Ｂおよびテルペンテシンはストレプトマイセス
属に属しUCT4−Ｂおよびテルペンテシンを生産する能力
を有する微生物を培地に培養し、培養物中にUCT4−Ｂお
よびテルペンテシンを生成蓄積させ、該培養物からUCT4
−Ｂおよびテルペンテシンを採取することによって得る
ことができる。
UCT4−Ｂおよびテルペンテシン生産菌株としては、ス
トレプトマイセス属に属し、UCT4−Ｂおよびテルペンテ
シン生産能を有する菌株であればすべて使用可能であ
り、代表的な菌株としてはＳ−464株があげられる。
Ｓ−464株の菌学的性質について以下に述べるが、該
性質の決定は、国際ストレプトマイセス属（Streptomyc
es）プロジェクト（ISP）がストレプトマイセス種の特
性決定のために推奨する方法〔E.B.シェリング（E.B.Sh
irling）およびD.ゴットリープ（D.Gottlib），インタ
ー・ジャーナル・システマィック・バクテリオロジー
（Int.J.Syst.Bacteriol.）16巻,313頁,1966年〕に従っ
た。全細胞の加水分解物中のジアミノピメリン酸の異性
体はビー・ベッカー（B.Becker）らの方法〔アプライド
・ミクロバイオロジー（Appl.Microbiol.）12巻:421頁,
1964年〕によって確認した。形態学的検討は、光学顕微
鏡を用い、特に胞子表面の形態については走査型電子顕
微鏡によって観察した。色の名称の割当には、〔カラー
・ハーモニー・マニュアル（Color Harmony Manual）コ
ンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Cont
ainer Corporation of America）編、第４版1958年］を
使用した。Ｓ−464株の菌学的性質は次の通りである。
（１）形態 気菌糸：分枝する。
基生菌糸：分枝するが、分断はない。
胞子：気菌糸上に分節胞子（10個から30個もしくはさら
に多数）の長い連鎖として着生する。連鎖の形態は屈曲
状もしくはループ状。
胞子の表面：平滑（Smooth） 胞子の運動性：なし 胞子の形・大きさ：楕円形（0.5×0.7μｍ） なお、菌核、胞子のうは観察されない。
（２）色調 気菌糸：白色 基生菌糸：淡黄色〜黄茶色 可溶性色素：淡黄色 メラニン色素：あり （３）細胞壁の化学組成 ジアミノピメリン酸の立体型:LL型 （４）生理的性質 炭素源の同化性： 同化する炭素源：グルコース、キシロース、イノシトー
ル、マンニトール、アラビノース、ラムノース、ラフィ
ノース、ラクトース、シュークロースおよびガラクトー
ス 同化しない炭素源：サリシン ＊ゼラチンの液化：陰性 スターチの加水分解：陽性 ＊脱脂牛乳の凝固：陰性 ＊脱脂牛乳のペプトン化：陽性 ＊繊維素の分解：陽性 ＊＊生育温度範囲:16〜37℃（至適28〜32℃） ＊ゼラチン、脱脂牛乳および繊維素に対する作用につい
ては28℃における１ヶ月後の試験結果を、＊＊生育温度
範囲については試験２日後の結果を示した。
（５）各種寒天培地における生育状態 各種寒天培地で28℃で28日間、Ｓ−464株を培養した
結果を第１表に示す。
なお、以下の第１表において６は生育の程度、AMは気
菌糸の着生度および色調、SMは基生菌糸の色調およびＰ
は可溶性色素の色調を表わす。
（６）Ｓ−464株の同定 Ｓ−464株からLL型のジアミノピペリン酸が検出され
ることから、該菌株は細胞壁Ｉ型の放線菌に分類される
（Int.J.Syst.Bacteriol.,20巻、435頁、1970年）。さ
らに上述の該菌株の形態学的特徴を組み合わせると、こ
の菌株はストレプトマイセス属に帰属させるのが適当で
ある。
ストレプトマイセス属における種の同定は、細菌学名
承認リスト（Int.J.Syst.Bacteriol.30巻、225頁、1980
年）で承認されている種名より、該菌株の持つ白色系の
気菌系、屈曲状もしくはループ状の胞子連鎖、平滑な胞
子表面、メタニン様色素産生、可溶性色素の産生および
炭素源の資化パターン等の諸特徴と、特徴が類似してい
る種をISPの記載内容（Int.J.Syst.Bacteriol.18巻,69
頁,1968年；同、18巻,279頁,1968年；同19巻,391頁,196
9年；同22巻,265頁,1972年およびアール・イー・ブカナ
ン（R.Buchanan）とエヌ・イー・ギボンズ（N.E.Gibbon
s）編、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイ
ティブ・バクテリオロジィ（Bergey's Manual of Deter
minative Bacteriology），第８版、ウイリアムズ・ア
ンド・ウイルキンス・コー（Williams and Wilkins C
o.）刊,1974年〕をもとに検索して行った。
以上の結果Ｓ−464株はストレプトマイセス属の新種
に属すると同定された。該菌株は、ブタペスト条約に規
定する条件で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に、平成２年７月31日付けでStreptomyces sp.S−4
64微工研条寄第3036号として寄託されている。
Ｓ−464株の培養は、通常の放線菌の培養法が一般に
用いられ、培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無
機物および必要な生育、生産促進物質を含有する培地で
あれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能であ
る。
炭素源としては、例えばグルコース、でん粉、デキス
トリン、マンノース、フラクトース、シュクロース、ラ
クトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、
糖蜜等が単独または組み合わせて用いられる。また、菌
の資化能によっては炭素水素、アルコール類、有機酸な
ども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、
尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コ
ーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単
独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応
じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウ
ム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水
素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マン
ガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さら
に使用菌の生育やUCT4−Ｂおよびテルペンテシンの生産
を促進する微量成分を適当に添加することができる。
培養法としては、液体培養法、とくに深部攪拌培養法
が適している。培養温度は16〜37℃、とくに25〜32℃が
適切であり、培養中の培地のpHは硫酸、アンモニア水、
炭酸アンモニウム溶液などを添加して、４〜10、とくに
６〜８に維持することが好ましい。
液体培養で通常１〜７日培養を行うとUCT4−Ｂおよび
テルペンテシンが培養液中および菌体中に生成蓄積され
るので、培養物中の生成量が最大に達したときに培養を
停止する。
培養物からのUCT4−Ｂおよびテルペンテシンの単離精
製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離精製する
ために常用される方法に従って行われる。
例えば培養物を過により培養液と菌体に分け、菌
体をクロロホルム、アセトンなどで抽出する。ついで、
抽出液と培養液とを合わせて、ポリスチレン系吸着剤
例えばダイヤイオンHP20（三菱化成工業社製）などに通
搭して活性成分を吸着させた後、酢酸エチル、アセトン
などで溶出する。該溶出液を濃縮した後、常用されるク
ロマトグラフィー、例えばシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどを用いて精
製し、UCT4−Ｂおよびテルペンテシンの白色粉末を得る
ことができる。
上記製造法で得られるUCT4−Ｂは、例えば下記式に示
されるような化学的に等価な各種互変異性体の平衡混合
物として存在し得るが、本発明はこれら互変異性体を含
め全ての異性体が包含される。
また下記反応式に示すように、UCT4−Ｂとオルトフェ
ニレンジアミンを反応させることにより、キノサリン環
を有する化合物２および３の平衡混合物を得、次にこれ
をアセチル化することにより互変異性体の平衡混合物が
存在し得ない単一化合物４が得られる（参考例１、２参
照）。
このことより、UCT4−Ｂの構造をより明確なものとし
た。
以下UCT4−Ｂの生物活性を試験例で説明する。
試験例１ 抗菌活性 スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス
・フエシウム、バチルス・ズブチルスおよびクレブシェ
ラ・ニュウモニアエの各種細菌に対する抗菌活性を寒天
希釈法（pH7.0）〔微生物実験マニュアル、80頁、講談
社、1986年〕により測定した。
その結果を最小生育阻止濃度（MIC）を用いて第２表
に示す。
試験例２ 急性毒性 １群５匹のddyマウス体重約20gにUCT4−Ｂを１回静脈
内投与し、投与後14日間の生死を観察し、核投与群の死
亡率より、ベーレンスーケルバー法に従いLD50を算出し
た。この結果UCT4−ＢのLD50は50mg/kg以上であった。
試験例３ リホサイティック・リューケミア（Lymphocy
tic Leukemia）に対する作用 体重22gのCDF1雄マウス１群５匹に、リホサイティッ
ク・リューケミアp388腫瘍細胞１×106個を腹腔内移植
した。移植24時間後にUCT4−Ｂの生理食塩水溶液0.2ml
または生理食塩水対照（0.2ml）を腹腔内に投与した。
実験結果は試験例の平均生存日数（Ｔ）を対照の平均
生存日数（Ｃ）で割ったT/C（％）で表わした。
結果を第３表に示す。
以下の実施例および参考例により本発明の態様を説明
する。
実施例１ ストレプトマイセス・sp.S−464を2l容量の三角フラ
スコ中の、バクト・トリプトン（Difco社製）5g/l、酵
母エキス5g/l、肉エキス3g/l、可溶性でん粉10g/l、グ
ルコース10g/l、炭酸カルシウム5g/lの組成を有する種
培地（殺菌前pH7.2）300mlに植菌し、30℃で48時間振盪
（200rpm）培養した。
このようにして得られた種培地養液を200l容量の培養
槽中下記組成の発酵培地100lに対して10％（容量）の割
合で移し、28℃で通気攪拌（回転数200rpm、通気量15l/
min）培養を行った。
発酵培地の組成：可溶性でん粉５％、KNO3、KH2PO4
0.5g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、炭酸カルシウム5g/l（上
記培地は殺菌前にNaOHでpHを7.0に調整する。） 培養中、培地のpHは4N H2SO4で７に制御し67時間培養
した後、培養物から菌体および沈澱物を別し、液10
0lを得た。液を濃縮後水で希釈しポリスチレン系吸着
剤ダイヤイオンHP20（10l）を充填したカラムに通塔し
て活性物質を吸着させた。
脱イオン水および50％メタノールで不純物を溶出後、
60％メタノールでUCT4−Ｂを溶出し、次に80％メタノー
ルでテルペンテシンを溶出した。
UCT4−Ｂを含む60％メタノール画分を濃縮後、pHを４
に調節し、酢酸エチルで活性物質を抽出した。酢酸エチ
ル層を濃縮後、シリカゲル（Lichroprepsi 60メルク社
製）を充填したカラムに通塔し、吸着させた後、約10kg
/cm3の圧力をかけながら、クロロホルム、クロロホルム
−メタノール（100:1）およびクロロホルム−メタノー
ル（50:1）の各溶媒で溶出した。得られた画分をセファ
デックスLH20を充填したカラムクロマトグラフィーに付
し、メタノールで溶出して活性画分を得た。該画分を逆
相高速液体クロマトグラフィー〔カラム:YMC−Pack,ODS
SH363−5:展開溶媒：CH3OH 0.7l＋H2O 0.3l;流速:20ml
/分；検出方法、230nmにおける紫外部吸収〕に付し、得
られた活性画分を濃縮乾固することによりUCT4−Ｂの白
色粉末100mgを得た。
得られたUCT4−Ｂの物理化学的性質は以下の通りであ
る。
前述のようにUCT4−Ｂはテルペンテシンおよびクレロ
シディンと同様に互変異性体の平衡混合物と考えられる
ので、測定条件、試料の調製方法によってその物理化学
的性質は異なってくる。以下に示す物理化学的性質は、
後述の実施例に示す方法によって調製した試料に関する
ものである。なお、測定は次の機器によって行った。
融点：柳本製作所 ミクロ融点測定装置 旋光度：日本分光工業社 DIP−370旋光計 マススペクトル：日立製作所 Ｍ−80B 紫外線吸収スペクトル：日立製作所 200−20型 分光光度計 赤外線吸収スペクトル：日本電子社 JIR−RFX 3001、または日本分光工業社 IR−8101 Hおよび13C-NMRスペクトル：ブルカー社 AM500、また
はAM400 Ａ）性状：無色粉末 Ｂ）融点：通常160〜172℃の範囲内での融点を示す。
Ｃ）旋光度：クロロホルム溶液中では ▲〔α〕27 D▼＝＋27.8°（ｃ＝0.53） であるが、50％含水アセトニトリル溶液中では溶解直後
が ▲〔α〕27 D▼＝＋23.2°（ｃ＝0.53）であるのに対し1
95分後には ▲〔α〕27 D▼＝＋12.1°（ｃ＝0.53）にまで変化し以
後はその値で一定となる。
Ｄ）EIマススペクトル:m/z 380,365,249,219,203,165,1
35,125,109,107,105 Ｅ）セカンダリーイオンマススペクトル：（メタノール
溶液、マトリックス：グリセロール）m/z 743,725,491,473,455,437,381,363,345,317,259,237,22
5,215,201 Ｆ）紫外部吸収スペクトル：（アセトニトリル溶液）末
端吸収を示すのみである。
Ｇ）赤外部吸収スペクトル：（KBr法）3431,2966,1707,
1385,1016,999cm-1 Ｈ）溶解性：メタノール、クロロホルム、酢酸エチルに
易溶、水、アセトニトリルに可溶、ヘキサンに不溶。
Ｉ）1H-NMRスペクトル：（500MHz,CD3OD溶液）第１図に
示す。
Ｊ）13C-NMRスペクトル：（125MHz,CD3OD溶液）第２図
に示す。
Ｋ）呈色反応：アニスアルデヒド、硫酸、ヨウ素、リン
モリブデン酸による各呈色に陽性、ドラーゲンドルフ反
応に陰性。
一方、テルペンテシンを含む80％メタノール溶出画分
を濃縮後、UCT4−Ｂの精製と同様の精製工程により精製
を行ったところ、テルペンテシン90mgを得た。
得られたテルペンテシンの1H-NMRスペクトルおよびIR
スペクトルは文献値（The Journal of Antibiotics,38
巻,1819頁,1985年）と一致した。
参考例１ UCT4−Ｂのオルトフェニレンジアミン付加体
（化合物２および化合物３）の調製 UCT4−B 13.4mgを50％含水アセトニトリル1mlに溶解
しオルトフエニレンジアミン8.3mgを加え室温にて１時
間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮して得られる粗生成
物を分取用薄膜クロマトグラフィー（メルク社製 キー
ゼルゲル 60F254アルト5744;展開溶媒；クロロホル
ム：メタノール、9:1）で精製し、TLCおよびHPLCで分離
不可能な化合物２および３の1:1平衡混合物5.2mgを得
た。
化合物２および化合物３の平衡混合物の物理化学的デ
ータ Rf値:0.70（メルク社製 キーゼルゲル 60F254アルト5
719;展開溶媒；クロロホルム：メタノール、9:1） 0.44（メルク社製 HPTLC CNF254S アルト16464;展開
溶媒；アセトニトリル：水、1:1） 高分解能EIマススペクトル:m/z C26H32O5N2としての 実測値 452.2298（M+） 理論値 452.2308 EIマススペクトル:m/z 452（M+）,434,201,185,173,15
7,144,129,102 赤外部吸収スペクトル：（KBr法）3425,2960,2924,138
5,1049,1014,763cm-1 1 H-NMRスペクトル：（500MHz,CDCl3溶液）δppm 化合物２ 8.81（1H,s）,8.15（1H,m）,8.01（1H,m）,7.81（2H,
m）,5.73（1H,m）,4.48（1H,m）,4.30（1H,d,J＝7.5H
z）,4.29−4.20（2H,m）,3.59（1H,br,s,D2O添加で消
失）、3.42（1H,d,J＝4.6Hz）,3.13（1H,d,J＝4.6Hz）,
2.98（1H,br,d,J＝11.1Hz）,2.35−2.20（2H,m）,1.96
（1H,d,J＝15.3Hz）,1.92（2H,m）,1.76（1H,m）,1.70
（1H,m）,1.48（3H,s）,1.09（3H,d,J＝7.1Hz）,1.03
（3H,s） 化合物３ 8.79（1H,s）,8.12（1H,m）,8.06（1H,m）,7.80（2H,
m）,5.33（1H,m）,4.46（1H,m）,4.13（1H,m）,4.08（1
H,d,J＝11.0Hz）,3.89（1H,d,J＝12.1Hz）,3.36（1H,d,
J＝4.8Hz）,3.08（1H,d,J＝4.8Hz）,2.88（1H,br,s,D2O
添加で消失）、2.35−2.20（2H,m）,2.15（1H,dd,J＝9.
1,7.4Hz）,1.85（1H,m）,1.84（2H,m）,1.77（1H,dq,J
＝12.1,7.3Hz）,1.58（1H,dd,J＝15.0,0.94Hz）,1.17
（3H,s）,0.99（3H,s）,0.88（3H,d,J＝7.3Hz） 参考例２ UCT4−Ｂのアセチル化体（化合物４）の調製 化合物２および化合物３の1:1の平衡混合物2.4mgにピ
リジン0.5mlおよび無水酢酸0.5mlを加え、室温にて15時
間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮して得られた粗生成
物を分取用薄層クロマトグラフィー（メルク社製 キー
ゼルゲル 60F254アルト5729;展開溶媒；ヘキサン：酢
酸エチル、1:1）で精製し、単一のアセチル体（化合物
４）1.9mgを得た。
化合物４の物理化学的データ Rf値:0.41（メルク社製 キーゼルゲル 60F254アルト5
719;展開溶媒；ヘキサン；酢酸エチル、1:1） 0.60（メルク社製同上：展開溶媒；クロロホルム：メタ
ノール、98:2） 高分解能EIマススペクトル:m/z C32H38O8N2として 実測値 578.2614（M+） 理論値 578.2625 EIマススペクトル:m/z 578（M+）,536,518,494,476,46
0,260,235,207 赤外部吸収スペクトル：（KBr法）2925,1747,1373,123
2,1053,1026,768cm-1 1 H-NMRスペクトル：（500MHz,CDCl3溶液）δppm 8.76（1H,m）,8.09（1H,m）,8.02（1H,m）,7.77（2H,
m）,5.88（1H,d,J＝10.2Hz）,5.75（1H,m）,5.51（1H,
m）,4.87（1H,dd,J＝12.7,1.0Hz）,4.66（1H,dd,J＝12.
7,0.7Hz）,3.30（1H,d,J＝5.0Hz）,3.10（1H,d,J＝5.0H
z）,2.91（1H,dd,J＝10.5,3.6Hz）,2.58（1H,d,J＝15.1
Hz）,2.19（2H,m）,2.15（1H,dq,J＝13.8,6.9Hz）,2.13
（3H,s）,2.12（3H,s）,2.06（3H,s）,1.79（1H,dd,J＝
15.1,10,2Hz）,1.49（3H,s）,1.16（3H,s）,1.01（3H,
d,J＝6.9Hz） 発明の効果 本発明によれば、抗菌、抗腫瘍活性を有する新規構成
物質UCT4−Ｂならびにストレプトマイセス属に属する微
生物によるクレロダン型ジテルペン構造を持つ抗生物質
の製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図;UCT4−Ｂの1H-NMRスペクトル 第２図;UCT4−Ｂの13C-NMRスペクトル
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07D 303/32 C12P 17/00 - 17/18 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ストレプトマイセス属に属し、次式（Ｉ） （式中、Ｒは-CH3または-CH2OHを表わす） で示されるクレロダン型ジテルペン誘導体を生産する能
    力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該クレロ
    ダン型ジテルペン誘導体を生成蓄積させ、該培養物より
    該クレロダン型ジテルペン誘導体を採取することを特徴
    とする該クレロダン型ジテルペン誘導体の製造法。
  2. 【請求項２】式（II）で示されるUCT4−Ｂおよびその化
    学的に等価である互変異性体。
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