JP2808493B2 - 検体中の生体数の測定方法 - Google Patents
検体中の生体数の測定方法Info
- Publication number
- JP2808493B2 JP2808493B2 JP1648191A JP1648191A JP2808493B2 JP 2808493 B2 JP2808493 B2 JP 2808493B2 JP 1648191 A JP1648191 A JP 1648191A JP 1648191 A JP1648191 A JP 1648191A JP 2808493 B2 JP2808493 B2 JP 2808493B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- maleimide
- light
- sample
- living
- wavelength
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品、排水、工業用純水
などの検体（液中）に存在する生体（微生物）の数を迅
速に計数する検査方法に関する。
などの検体（液中）に存在する生体（微生物）の数を迅
速に計数する検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体の検出方法として、従来寒天培養に
よる方法がよく使われるが、この方法は培養操作を必要
とするため、測定に２４時間〜数日の長時間を必要とす
る。このため生体測定時間の短縮が試みられている。例
えば、ＡＴＰ法やウンベリフェロン誘導体、フルオレセ
イン誘導体を用いる方法が提案されている。
よる方法がよく使われるが、この方法は培養操作を必要
とするため、測定に２４時間〜数日の長時間を必要とす
る。このため生体測定時間の短縮が試みられている。例
えば、ＡＴＰ法やウンベリフェロン誘導体、フルオレセ
イン誘導体を用いる方法が提案されている。
【０００３】ＡＴＰ法は生体細胞に存在するＡＴＰにル
シフェリンルシフェラーゼ酵素を作用させると発光する
ことを利用して、この光量を計測することにより生体の
濃度を測定する方法である。
シフェリンルシフェラーゼ酵素を作用させると発光する
ことを利用して、この光量を計測することにより生体の
濃度を測定する方法である。
【０００４】ウンベリフェロン誘導体を用いる方法は生
菌にウンベリフェロン誘導体を作用させたときに生ずる
ウンベリフェロンの蛍光を測定する方法である。
菌にウンベリフェロン誘導体を作用させたときに生ずる
ウンベリフェロンの蛍光を測定する方法である。
【０００５】しかし、ＡＴＰ法、ウンベリフェロン誘導
体法のいずれも発光量が微弱であるため、生体細胞濃度
で１０4 個／ｍｌ以上存在しないと測定が困難である欠
点があり、低濃度では４〜５時間以上かけて予備培養し
て濃度を高めた後に測定する必要がある。
体法のいずれも発光量が微弱であるため、生体細胞濃度
で１０4 個／ｍｌ以上存在しないと測定が困難である欠
点があり、低濃度では４〜５時間以上かけて予備培養し
て濃度を高めた後に測定する必要がある。
【０００６】フルオレセイン誘導体を用いる方法は式１
に示すように生体細胞中のエステラーゼが触媒となり、
加水分解反応により細胞周辺に蛍光物質が生成され、こ
の蛍光を検出することにより生体を検出する方法であ
る。
に示すように生体細胞中のエステラーゼが触媒となり、
加水分解反応により細胞周辺に蛍光物質が生成され、こ
の蛍光を検出することにより生体を検出する方法であ
る。
【化１】
【０００７】生体細胞中に生じたフルオレセインを励起
するのに必要な波長を有する光を照射した際に得られる
蛍光スペクトルは波長５１０ｎｍ〜５５０ｎｍ付近に最
大蛍光強度を有する。従って、特定の波長の発光を検出
する必要がある。この事から、検体の溶液成分に同じ波
長の発光がある場合には生体による発光との区別ができ
なくなりＳ／Ｎ比（検出した生体からの光の信号Ｓと計
測上のノズルＮとの比）が低下する。すなわち、この方
法が適用できる検体溶液には溶液自体が該特定波長の発
光を含まないことが必要で、使用できる溶液の種類に制
約があった。またこの方法は加水分解を利用した間接的
方法であるため、溶液のｐＨにより発光量が大幅に変化
するので、検体液はｐＨ調整した後、一定のｐＨ条件下
で発光させる必要があるなど、測定前の前処理が複雑で
ある欠点がある。
するのに必要な波長を有する光を照射した際に得られる
蛍光スペクトルは波長５１０ｎｍ〜５５０ｎｍ付近に最
大蛍光強度を有する。従って、特定の波長の発光を検出
する必要がある。この事から、検体の溶液成分に同じ波
長の発光がある場合には生体による発光との区別ができ
なくなりＳ／Ｎ比（検出した生体からの光の信号Ｓと計
測上のノズルＮとの比）が低下する。すなわち、この方
法が適用できる検体溶液には溶液自体が該特定波長の発
光を含まないことが必要で、使用できる溶液の種類に制
約があった。またこの方法は加水分解を利用した間接的
方法であるため、溶液のｐＨにより発光量が大幅に変化
するので、検体液はｐＨ調整した後、一定のｐＨ条件下
で発光させる必要があるなど、測定前の前処理が複雑で
ある欠点がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記技術水準
に鑑み、生体細胞と直接的に反応して溶液のｐＨの発光
量への影響が少なく、検体溶液自体の吸発光スペクトル
に応じてその波長領域を避けるような蛍光物質をその誘
導体の中で選択でき、かつ生体の存在により十分大きな
発光が得られる生菌の検出方法を得る方法を提供しよう
とするものである。
に鑑み、生体細胞と直接的に反応して溶液のｐＨの発光
量への影響が少なく、検体溶液自体の吸発光スペクトル
に応じてその波長領域を避けるような蛍光物質をその誘
導体の中で選択でき、かつ生体の存在により十分大きな
発光が得られる生菌の検出方法を得る方法を提供しよう
とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は検体中の生体と
直接反応して発光物質に変化するマレイミド基を有する
非発光物質を検体中の生体に添加し、生成した発光物質
に励起光を照射し、これにより発光する光を検出するこ
とを特徴とする検体中の生体数の測定方法である。
直接反応して発光物質に変化するマレイミド基を有する
非発光物質を検体中の生体に添加し、生成した発光物質
に励起光を照射し、これにより発光する光を検出するこ
とを特徴とする検体中の生体数の測定方法である。
【００１０】すなわち、本発明では生体細胞と直接的に
反応して非蛍光体を蛍光物質や燐光物質に変換するマレ
イミド基の誘導体を検体に添加して、生体の発光を光電
子増倍管で検出し計数する手段を採用するものである。
反応して非蛍光体を蛍光物質や燐光物質に変換するマレ
イミド基の誘導体を検体に添加して、生体の発光を光電
子増倍管で検出し計数する手段を採用するものである。
【００１１】なお、マレイミド基の誘導体としては例え
ば、Ｎ−（３−フルオランチル）マレイミド、Ｎ−（１
−ピレニル）マレイミド、エオシン−５−マレイミドな
どを使用し、これらは検体を含む溶液の種類（溶液自体
の吸発光スペクトル）により選択される。
ば、Ｎ−（３−フルオランチル）マレイミド、Ｎ−（１
−ピレニル）マレイミド、エオシン−５−マレイミドな
どを使用し、これらは検体を含む溶液の種類（溶液自体
の吸発光スペクトル）により選択される。
【００１２】この反応機構を式２に示す。
【化２】
【００１３】
【作用】マレイミド基の誘導体は一般に非発光性であ
り、生体細胞に存在するＳＨ基と反応して蛍光物質を生
成する。ＳＨ基はほとんど全ての生体に存在して、この
反応の活性は細胞が死んでいるときは小さくなりほとん
ど発光しない。マレイミド基誘導体による方法は、先に
挙げた方法のように生体が触媒となり加水分解により蛍
光体を生成するような間接的な発光でないため検体溶液
のｐＨに影響を受けにくい。
り、生体細胞に存在するＳＨ基と反応して蛍光物質を生
成する。ＳＨ基はほとんど全ての生体に存在して、この
反応の活性は細胞が死んでいるときは小さくなりほとん
ど発光しない。マレイミド基誘導体による方法は、先に
挙げた方法のように生体が触媒となり加水分解により蛍
光体を生成するような間接的な発光でないため検体溶液
のｐＨに影響を受けにくい。
【００１４】また吸発光のスペクトルはマレイミド基自
体により決まるのではなく、マレイミド基と結合する物
質の分子構造により決まる。従ってこの分子構造を変え
ることにより３００〜６００ｎｍの波長範囲で任意の発
光波長が得られる。例えばマレイミドと結合する物質を
フルオランチル｛Ｎ−（３−フルオランチル）マレイミ
ド｝とすれば、４６０ｎｍ付近、またピレニル｛Ｎ−
（１−ピレニル）マレイミド｝とすれば３７０〜４５０
ｎｍの生体による発光が得られることを実験により確認
している。この場合、マレイミド基は生体のＳＨ結合と
反応して結合物質の電子状態を変えて蛍光物質に変える
作用を担う。
体により決まるのではなく、マレイミド基と結合する物
質の分子構造により決まる。従ってこの分子構造を変え
ることにより３００〜６００ｎｍの波長範囲で任意の発
光波長が得られる。例えばマレイミドと結合する物質を
フルオランチル｛Ｎ−（３−フルオランチル）マレイミ
ド｝とすれば、４６０ｎｍ付近、またピレニル｛Ｎ−
（１−ピレニル）マレイミド｝とすれば３７０〜４５０
ｎｍの生体による発光が得られることを実験により確認
している。この場合、マレイミド基は生体のＳＨ結合と
反応して結合物質の電子状態を変えて蛍光物質に変える
作用を担う。
【００１５】
【実施例】本発明の一実施例を図１により説明する。反
応槽３に被検査体である検体溶液を流入ライン１から流
入させ、ここでマレイミド基をもつ薬品注入ライン２を
介して蛍光薬品、すなわちマレイミド基の誘導体と混合
させる。薬品量は概略０．０１〜１ｍｇ／ｍｌとする。
混合して生体による発光体を含んだ試料液は一定の滞留
時間を経て試料液流入ライン４から連続的にフローセル
５に達する。
応槽３に被検査体である検体溶液を流入ライン１から流
入させ、ここでマレイミド基をもつ薬品注入ライン２を
介して蛍光薬品、すなわちマレイミド基の誘導体と混合
させる。薬品量は概略０．０１〜１ｍｇ／ｍｌとする。
混合して生体による発光体を含んだ試料液は一定の滞留
時間を経て試料液流入ライン４から連続的にフローセル
５に達する。
【００１６】ここで励起光を光源７から光の幅を制限す
るスリット８、一定波長の光を得るフィルタ９及び焦光
レンズ１０を介してフローセル５内の試料に照射する
と、生体はマレイミド基誘導体と反応して特定波長の発
光を発生する。この光を焦光レンズ１１、特定の発光を
検出するフィルタ１２を介して光電子増倍管１３で検出
し、この数をカウンタ１４でカウントすることにより検
体液中の生体個数が計数できる。
るスリット８、一定波長の光を得るフィルタ９及び焦光
レンズ１０を介してフローセル５内の試料に照射する
と、生体はマレイミド基誘導体と反応して特定波長の発
光を発生する。この光を焦光レンズ１１、特定の発光を
検出するフィルタ１２を介して光電子増倍管１３で検出
し、この数をカウンタ１４でカウントすることにより検
体液中の生体個数が計数できる。
【００１７】実施例で、例えばＮ−（１−ピレニル）マ
レイミドでは３９５ｎｍ付近、または３７５ｎｍ付近、
またＮ−（３−フルオランチル）マレイミドでは４６０
ｎｍ付近の発光波長を検出すれば高いＳ／Ｎ比で生体細
胞を識別できる。図２にＮ−（１−ピレニル）マレイミ
ドを用いた生体（大腸菌）の発光スペクトルの測定例を
示す。フルオレセイン誘導体と同様に、十分強い蛍光量
が得られるにも拘らずフルオレセインと異なり溶液のｐ
Ｈ依頼性が極めて小さい。なお、図２中は生きた菌の
蛍光スペクトル、は死んだ菌の蛍光スペクトルを示
す。図３の（ａ）、（ｂ）に、Ｎ−（１−ピレニル）マ
レイミドとフルオレセインジアセテートをそれぞれ大腸
菌の生きたものを含有する液（生菌）と死んだものを含
有する液（死菌）に加え反応させて、得られた蛍光スペ
クトルの強度とブランク比の例を示す。菌体を含有する
液のｐＨは４〜１０の間のものを使用した。生菌と死菌
の含有液中の菌体濃度は同一とした。図中の発光強度は
観測した蛍光波長に於けるものであり、菌体を含む液の
蛍光強度より菌体を含まない液のみの場合の蛍光強度を
差し引いた値（Ａ 1 およびＡ 2 ）である。ブランク比は
蛍光強度Ａ 1 またはＡ 2 と液のみの場合の蛍光強度（ブ
ランク値）との比（Ａ／ブランク値）である。Ｎ−（１
−ピレニル）マレイミドを使用した際の励起波長（Ｅ
Ｘ）は３４０ｎｍ、観測した蛍光波長（ＥＭ）は３９５
ｎｍであり、フルオレセインジアセテートを使用した際
の励起波長（ＥＸ）は４５６ｎｍ、観測した蛍光波長
（ＥＭ）は５４５ｎｍである。 Ｎ−（１−ピレニル）マ
レイミドを用いた場合、ｐＨ４〜９の広い範囲で生菌の
発光強度は死菌の発光強度より十分に高い事を示してお
り、生菌と死菌の両者を含有する液中で生菌を検出する
のにＮ−（１−ピレニル）マレイミドが適していること
を示している。実施例の図１に示した装置で生菌を検出
し計数するにはブランク比が高いことが望ましい。Ｎ−
（１−ピレニル）マレイミドを使用して広いｐＨ範囲で
高いブランク比が実現できている。 フルオレセインジア
セテートを使用した際には検討したｐＨ範囲内で生菌は
死菌よりも発光強度が高いが、その差はＮ−（１−ピレ
ニル）マレイミド使用の場合と比較して少ない。また、
生菌と死菌共に発光強度は液のｐＨの影響を受けて 上昇
している。蛍光顕微鏡で観察したところ、ｐＨ値が高く
なるにつれて菌体以外の液部分の発光強度が上昇してい
た。ｐＨ値が上昇すると共に死菌および液自身の発光強
度が上昇することは、生菌のみを検出する為には好まし
くない。この事はブランク比の値に現れている。つま
り、ブランク比の値のピーク部分がｐＨ５〜６．５と狭
い上に、ブランク比の値はＮ−（１−ピレニル）マレイ
ミドを使用した際より大幅に小さい。 広いｐＨ範囲の検
体液に含有される生体数を測定するのにフルオレセイン
ジアセテートに比べＮ−（１−ピレニル）マレイミドは
適しており、検体中の生体と直接反応して発光物質に変
化するマレイミド基を有する非発光物質を検体中の生体
に添加し、生成した発光物質に励起光を照射し、これに
より発光する光を検出することで検体中の生体数を測定
できることを見出した。
レイミドでは３９５ｎｍ付近、または３７５ｎｍ付近、
またＮ−（３−フルオランチル）マレイミドでは４６０
ｎｍ付近の発光波長を検出すれば高いＳ／Ｎ比で生体細
胞を識別できる。図２にＮ−（１−ピレニル）マレイミ
ドを用いた生体（大腸菌）の発光スペクトルの測定例を
示す。フルオレセイン誘導体と同様に、十分強い蛍光量
が得られるにも拘らずフルオレセインと異なり溶液のｐ
Ｈ依頼性が極めて小さい。なお、図２中は生きた菌の
蛍光スペクトル、は死んだ菌の蛍光スペクトルを示
す。図３の（ａ）、（ｂ）に、Ｎ−（１−ピレニル）マ
レイミドとフルオレセインジアセテートをそれぞれ大腸
菌の生きたものを含有する液（生菌）と死んだものを含
有する液（死菌）に加え反応させて、得られた蛍光スペ
クトルの強度とブランク比の例を示す。菌体を含有する
液のｐＨは４〜１０の間のものを使用した。生菌と死菌
の含有液中の菌体濃度は同一とした。図中の発光強度は
観測した蛍光波長に於けるものであり、菌体を含む液の
蛍光強度より菌体を含まない液のみの場合の蛍光強度を
差し引いた値（Ａ 1 およびＡ 2 ）である。ブランク比は
蛍光強度Ａ 1 またはＡ 2 と液のみの場合の蛍光強度（ブ
ランク値）との比（Ａ／ブランク値）である。Ｎ−（１
−ピレニル）マレイミドを使用した際の励起波長（Ｅ
Ｘ）は３４０ｎｍ、観測した蛍光波長（ＥＭ）は３９５
ｎｍであり、フルオレセインジアセテートを使用した際
の励起波長（ＥＸ）は４５６ｎｍ、観測した蛍光波長
（ＥＭ）は５４５ｎｍである。 Ｎ−（１−ピレニル）マ
レイミドを用いた場合、ｐＨ４〜９の広い範囲で生菌の
発光強度は死菌の発光強度より十分に高い事を示してお
り、生菌と死菌の両者を含有する液中で生菌を検出する
のにＮ−（１−ピレニル）マレイミドが適していること
を示している。実施例の図１に示した装置で生菌を検出
し計数するにはブランク比が高いことが望ましい。Ｎ−
（１−ピレニル）マレイミドを使用して広いｐＨ範囲で
高いブランク比が実現できている。 フルオレセインジア
セテートを使用した際には検討したｐＨ範囲内で生菌は
死菌よりも発光強度が高いが、その差はＮ−（１−ピレ
ニル）マレイミド使用の場合と比較して少ない。また、
生菌と死菌共に発光強度は液のｐＨの影響を受けて 上昇
している。蛍光顕微鏡で観察したところ、ｐＨ値が高く
なるにつれて菌体以外の液部分の発光強度が上昇してい
た。ｐＨ値が上昇すると共に死菌および液自身の発光強
度が上昇することは、生菌のみを検出する為には好まし
くない。この事はブランク比の値に現れている。つま
り、ブランク比の値のピーク部分がｐＨ５〜６．５と狭
い上に、ブランク比の値はＮ−（１−ピレニル）マレイ
ミドを使用した際より大幅に小さい。 広いｐＨ範囲の検
体液に含有される生体数を測定するのにフルオレセイン
ジアセテートに比べＮ−（１−ピレニル）マレイミドは
適しており、検体中の生体と直接反応して発光物質に変
化するマレイミド基を有する非発光物質を検体中の生体
に添加し、生成した発光物質に励起光を照射し、これに
より発光する光を検出することで検体中の生体数を測定
できることを見出した。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、従来２４時間〜数日の長
時間要していた生体細胞の測定が５〜２０分程度で、連
続的に実施可能となり、また低濃度の生体の検出にも適
用できる。かつマレイミド基と結合する分子の構造を適
当に選択すれば検体の溶液自体の発光波長域を避けるこ
とができるため、多くの種類の溶液中の生体検出に適用
可能となる。したがって本発明により、食品溶液や半導
体の洗浄用純水などに含まれる微生物の検出を速やか
に、かつ高精度で実施することが可能となり、検査の省
力化や品質管理の質の向上など経済的・技術的効果が得
られる。
時間要していた生体細胞の測定が５〜２０分程度で、連
続的に実施可能となり、また低濃度の生体の検出にも適
用できる。かつマレイミド基と結合する分子の構造を適
当に選択すれば検体の溶液自体の発光波長域を避けるこ
とができるため、多くの種類の溶液中の生体検出に適用
可能となる。したがって本発明により、食品溶液や半導
体の洗浄用純水などに含まれる微生物の検出を速やか
に、かつ高精度で実施することが可能となり、検査の省
力化や品質管理の質の向上など経済的・技術的効果が得
られる。
【図１】本発明の一実施例を示す説明図。
【図２】本発明の一実施例の結果を示す図。
【図３】本発明の一実施例の結果を示す図。
Claims (1)
- 【請求項１】 検体中の生体と直接反応して発光物質に
変化するマレイミド基を有する非発光物質を検体中の生
体に添加し、生成した発光物質に励起光を照射し、これ
により発光する光を検出することを特徴とする検体中の
生体数の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1648191A JP2808493B2 (ja) | 1991-02-07 | 1991-02-07 | 検体中の生体数の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1648191A JP2808493B2 (ja) | 1991-02-07 | 1991-02-07 | 検体中の生体数の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698796A JPH0698796A (ja) | 1994-04-12 |
| JP2808493B2 true JP2808493B2 (ja) | 1998-10-08 |
Family
ID=11917481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1648191A Expired - Lifetime JP2808493B2 (ja) | 1991-02-07 | 1991-02-07 | 検体中の生体数の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2808493B2 (ja) |
-
1991
- 1991-02-07 JP JP1648191A patent/JP2808493B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0698796A (ja) | 1994-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5605988B2 (ja) | 水中の化学物質を測定及び制御する全固体蛍光光度計の使用方法 | |
| US5281825A (en) | Phase fluorometry using a modulated electroluminescent lamp as a light source | |
| Estes et al. | Reagentless detection of microorganisms by intrinsic fluorescence | |
| CN1677088A (zh) | 用于检测存在的生物物质并使其成像的方法和设备 | |
| WO1996041155A1 (en) | An improved electrochemiluminescence method | |
| JPH04504663A (ja) | 蛍光水性バイオアッセイ及び方法 | |
| WO2002064818A1 (fr) | Methode et appareil de discrimination immediate de microorganismes | |
| JP2808493B2 (ja) | 検体中の生体数の測定方法 | |
| WO1984004544A1 (en) | Method for measuring the number or methane-producing activity of methane bacteria | |
| JP2948405B2 (ja) | 微生物の迅速測定方法 | |
| Hou et al. | Determination of ATP as a fluorescence probe with europium (III)-doxycycline | |
| US20050124018A1 (en) | Method of measuring ATP by radiating ultraviolet light and apparatus using the same | |
| DE10152994A1 (de) | Methode zur gleichzeitigen optischen Bestimmung von pH-Wert und Gelöstsauerstoff | |
| JP2637561B2 (ja) | 微生物細胞の生細胞の計測方法 | |
| Nagoshi et al. | SPECTRAL ANALYSES OF LOW LEVEL CHEMILUMINESCENCE OF A SHORT LIFETIME USING A HIGHLY SENSITIVE POLYCHROMATIC SPECTROMETER INCORPORATING A TWO DIMENSIONAL PHOTON‐COUNTING TYPE DETECTOR | |
| JP2006262775A (ja) | 微生物細胞検出方法 | |
| JPS60181637A (ja) | メタン菌の菌数またはメタン生成活性の測定方法 | |
| JP2734489B2 (ja) | 微生物生細胞の計数方法及び装置 | |
| JP3763674B2 (ja) | 細菌の計測方法および計測装置 | |
| Brusilova | Detection of water system biofilms using fluorescence spectroscopy for contamination monitoring | |
| JPH06319594A (ja) | 生体活性の測定方法 | |
| JPS59205998A (ja) | メタン菌の菌数またはメタン生成活性の測定方法 | |
| JP2004279276A (ja) | 生理活性検定法及び装置 | |
| CN101464410A (zh) | 用于大肠杆菌快速检测的荧光量子点标记方法 | |
| JP2005287494A (ja) | 休眠状態のクリプトバイオティックな微生物の存在を検出する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19980609 |