JP2799500B2 - Ｄｎａ塩基配列分析用ベクター - Google Patents
Ｄｎａ塩基配列分析用ベクターInfo
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- JP2799500B2 JP2799500B2 JP1896789A JP1896789A JP2799500B2 JP 2799500 B2 JP2799500 B2 JP 2799500B2 JP 1896789 A JP1896789 A JP 1896789A JP 1896789 A JP1896789 A JP 1896789A JP 2799500 B2 JP2799500 B2 JP 2799500B2
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- JP
- Japan
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- dna
- site
- vector
- restriction enzyme
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- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、DNA塩基配列分析用ベクターに関し、特
に、キロシークエンス法によりDNA塩基配列を決定する
際に有用なDNA塩基配列分析用ベクターに関する。
に、キロシークエンス法によりDNA塩基配列を決定する
際に有用なDNA塩基配列分析用ベクターに関する。
近年の遺伝子組換え研究の発展により、DNA塩基配列
分析は非常に重要な技術となってきており、ヒトの全DN
A塩基配列を決定しようとする計画も進められている。
分析は非常に重要な技術となってきており、ヒトの全DN
A塩基配列を決定しようとする計画も進められている。
通常用いられている塩基配列分析法は、英国のサンガ
ーらが開発したジヌクレオチド法を基本とするものであ
るが、様々な改良が加えられている。
ーらが開発したジヌクレオチド法を基本とするものであ
るが、様々な改良が加えられている。
一般に、ジヌクレオチド法によって一度に配列を決定
できる塩基の数は〔35S〕dCTP、修飾T7DNAポリメラーゼ
を用いることによって従来の〔32P〕dCTP、E.coliDNAポ
リメラーゼIklenow断片を用いた場合と比べかなり多く
なったが、それでも300〜500塩基程度である。
できる塩基の数は〔35S〕dCTP、修飾T7DNAポリメラーゼ
を用いることによって従来の〔32P〕dCTP、E.coliDNAポ
リメラーゼIklenow断片を用いた場合と比べかなり多く
なったが、それでも300〜500塩基程度である。
これにより長いDNAの塩基配列を決定するためには、
ショット・ガン法、制限酵素断片法、キロシークエンス
法等の方法が用いられている。中でも、キロシークエン
ス法は確実に短時間で行なうことができることから、最
近では多用されている。
ショット・ガン法、制限酵素断片法、キロシークエンス
法等の方法が用いられている。中でも、キロシークエン
ス法は確実に短時間で行なうことができることから、最
近では多用されている。
ジヌクレオチド法は、ベクターの一部に相補する合成
DNAが結合するプライマー結合部位より、DNAをDNAポリ
メラーゼで伸長させることにより塩基配列を決定する方
法であるが、キルシークエンス法は、このプライマー結
合部位が近い側の目的DNA末端からエキソヌクレアーゼI
IIのような二本鎖特異DNA分解酵素及びナタマメ（Mung
bean）ヌクレアーゼのような一本鎖DNA分解酵素を用い
て、ジヌクレオチド法により決定可能な300〜500塩基を
欠失させたDNAをつくり、この操作を繰り返すことによ
り長鎖DNAの全塩基配列を決定する方法である。
DNAが結合するプライマー結合部位より、DNAをDNAポリ
メラーゼで伸長させることにより塩基配列を決定する方
法であるが、キルシークエンス法は、このプライマー結
合部位が近い側の目的DNA末端からエキソヌクレアーゼI
IIのような二本鎖特異DNA分解酵素及びナタマメ（Mung
bean）ヌクレアーゼのような一本鎖DNA分解酵素を用い
て、ジヌクレオチド法により決定可能な300〜500塩基を
欠失させたDNAをつくり、この操作を繰り返すことによ
り長鎖DNAの全塩基配列を決定する方法である。
ここで使用するエキソヌクレアーゼIIIは３′→５′
方向に作用する二本鎖特異DNA分解酵素で３′−末端が
二本鎖になっている部分にのみ作用してこれを切断す
る。ナタマメ（Mung bean）ヌクレアーゼは一本鎖DNAを
選択的に切断する。
方向に作用する二本鎖特異DNA分解酵素で３′−末端が
二本鎖になっている部分にのみ作用してこれを切断す
る。ナタマメ（Mung bean）ヌクレアーゼは一本鎖DNAを
選択的に切断する。
これらの性質を利用してベクターのプライマー結合部
位（ジヌクレオチド法で必須の部位）を欠失させずに目
的とするDNAのみをプライマー結合部位側から順次欠失
させることができる。
位（ジヌクレオチド法で必須の部位）を欠失させずに目
的とするDNAのみをプライマー結合部位側から順次欠失
させることができる。
制限酵素には、その切断部位が５′−末端突出になる
もの、平滑になるもの、及び３′−末端突出になるもの
の３種類がある。プライマー結合部位と目的DNAの間に
マルチクローニング部位を設け、このマルチクローニン
グ部位に３′−末端突出型制限酵素切断部位と、５′−
末端突出型制限酵素切断部位をこの順に存在させておけ
ば、これら２種類の酵素を用いてプライマー結合部位側
には３′−末端突出を、目的DNA側には５′−末端突出
を形成することができる。これをまず上記エキソヌクレ
アーゼIIIにより処理して目的DNAの５′−末端突出側か
ら３′−５′方向にDNAを欠失させ、次いでナタマメヌ
クレアーゼのような一本鎖DNA切断酵素を作用させて欠
失した目的DNAの５′−末端突出部とプライマー結合部
位の３′−末端突出部を平滑末端とし、DNAリガーゼで
再結合して欠失した目的DNAを含むベクターを構築し、
適当な宿主に導入して増殖させた後、採取し、これをジ
ヌクレオチド法によりプライマー結合部位側から300〜5
00のDNA塩基配列を決定する。この操作を繰り返すこと
により長鎖DNAの全塩基配列を決定することができる。
もの、平滑になるもの、及び３′−末端突出になるもの
の３種類がある。プライマー結合部位と目的DNAの間に
マルチクローニング部位を設け、このマルチクローニン
グ部位に３′−末端突出型制限酵素切断部位と、５′−
末端突出型制限酵素切断部位をこの順に存在させておけ
ば、これら２種類の酵素を用いてプライマー結合部位側
には３′−末端突出を、目的DNA側には５′−末端突出
を形成することができる。これをまず上記エキソヌクレ
アーゼIIIにより処理して目的DNAの５′−末端突出側か
ら３′−５′方向にDNAを欠失させ、次いでナタマメヌ
クレアーゼのような一本鎖DNA切断酵素を作用させて欠
失した目的DNAの５′−末端突出部とプライマー結合部
位の３′−末端突出部を平滑末端とし、DNAリガーゼで
再結合して欠失した目的DNAを含むベクターを構築し、
適当な宿主に導入して増殖させた後、採取し、これをジ
ヌクレオチド法によりプライマー結合部位側から300〜5
00のDNA塩基配列を決定する。この操作を繰り返すこと
により長鎖DNAの全塩基配列を決定することができる。
通常、キロシークエンス法によりその塩基配列を決定
しようとするDNAは、pUC/M13mp系等のベクターのマルチ
クローニング部位（４種の３′−突出、６種の５′−突
出、３種の平滑制限酵素切断点を含む部位）にサブクロ
ーニングし、切断点地図を作成する。目的のDNA内部に
切断点がある制限酵素は使用できない。
しようとするDNAは、pUC/M13mp系等のベクターのマルチ
クローニング部位（４種の３′−突出、６種の５′−突
出、３種の平滑制限酵素切断点を含む部位）にサブクロ
ーニングし、切断点地図を作成する。目的のDNA内部に
切断点がある制限酵素は使用できない。
従来使用されている制限酵素はすべて６塩基認識のも
ので、単純計算すると確率的には46＝4096塩基につき１
ケ所切断されることになる。
ので、単純計算すると確率的には46＝4096塩基につき１
ケ所切断されることになる。
従来、キロシークエンス法に使用されているベクター
pUC118、pUC119のマルチクローニング部位を第２図に示
した。
pUC118、pUC119のマルチクローニング部位を第２図に示
した。
このベクターは塩基配列決定用に開発されたものであ
るが、キロシークエンス用ではないため汎用性が低く、
種々の問題点がある。
るが、キロシークエンス用ではないため汎用性が低く、
種々の問題点がある。
たとえば、pUC118のEcoR I切断部位に挿入した目的DN
Aが、Pst I及びSph Iで切断されてしまう場合は、５′
−突出、３′−突出の順に切断できないのでキロシーク
エンス法を用いることができない。一般にEcoR I部位に
DNAを挿入し実験を行なう機会は非常に多いので、この
ようなことがしばしば起こる。
Aが、Pst I及びSph Iで切断されてしまう場合は、５′
−突出、３′−突出の順に切断できないのでキロシーク
エンス法を用いることができない。一般にEcoR I部位に
DNAを挿入し実験を行なう機会は非常に多いので、この
ようなことがしばしば起こる。
したがって本発明の目的は、キロシークエンス法によ
りDNA塩基配列を決定する際に有用かつ汎用性の高いベ
クターを提供することである。
りDNA塩基配列を決定する際に有用かつ汎用性の高いベ
クターを提供することである。
本発明の上記目的は、プライマー結合部位とマルチク
ローニング部位とを含むDNA塩基配列分析用ベクターに
おいて、マルチクローニング部位が、少なくとも１個の
目的DNAクローニング部位と、少なくとも１個の５′−
末端突出型８塩基に認識制限酵素切断部位と、少なくと
も１個の３′−末端突出型８塩基認識制限酵素切断部位
とを含み、前記の順にプライマー結合部位から遠い順に
位置することを特徴とするDNA塩基配列分析用ベクター
により達成される。
ローニング部位とを含むDNA塩基配列分析用ベクターに
おいて、マルチクローニング部位が、少なくとも１個の
目的DNAクローニング部位と、少なくとも１個の５′−
末端突出型８塩基に認識制限酵素切断部位と、少なくと
も１個の３′−末端突出型８塩基認識制限酵素切断部位
とを含み、前記の順にプライマー結合部位から遠い順に
位置することを特徴とするDNA塩基配列分析用ベクター
により達成される。
３′−末端突出型８塩基認識制限酵素の具体例として
はSfi Iが、５′−末端突出型８塩基認識制限酵素の具
体例としてはNot Iが挙げられる。
はSfi Iが、５′−末端突出型８塩基認識制限酵素の具
体例としてはNot Iが挙げられる。
本発明のベクターのマルチクローニング部位は、上記
以外の任意の制限酵素、好ましくは６塩基認識制限酵素
の切断部位を含むことができる。このような制限酵素の
例としては、Sac I、Kpn I、Pst I、Hind III、Sal I、
Acc I、Hinc I、Sma I、BamH I、EcoR Iなどを挙げるこ
とができる。
以外の任意の制限酵素、好ましくは６塩基認識制限酵素
の切断部位を含むことができる。このような制限酵素の
例としては、Sac I、Kpn I、Pst I、Hind III、Sal I、
Acc I、Hinc I、Sma I、BamH I、EcoR Iなどを挙げるこ
とができる。
本発明のベクターを構築するには、適当なプラスミド
ベクター、ファージベクターを適当な制限酵素で消化
し、このDNA断片に、別に合成したマルチクローニング
部位をDNAリガーゼで挿入連結すればよい。本発明のベ
クターの構築に使用されるプラスミドベクターの例とし
ては、プライマー結合部位近傍にHind III、EcoR Iのよ
うな汎用酵素切断部位を有するpUC118、pUC119等のpUC
プラスミドが挙げられる。また本発明のベクターの構築
に使用されるファージベクターの例としては、M13、f
1、fd等の一本鎖DNAファージのゲノムを改変してクロー
ニング部位を導入したもの、たとえばM13mp18やM13mp19
等が挙げられる。
ベクター、ファージベクターを適当な制限酵素で消化
し、このDNA断片に、別に合成したマルチクローニング
部位をDNAリガーゼで挿入連結すればよい。本発明のベ
クターの構築に使用されるプラスミドベクターの例とし
ては、プライマー結合部位近傍にHind III、EcoR Iのよ
うな汎用酵素切断部位を有するpUC118、pUC119等のpUC
プラスミドが挙げられる。また本発明のベクターの構築
に使用されるファージベクターの例としては、M13、f
1、fd等の一本鎖DNAファージのゲノムを改変してクロー
ニング部位を導入したもの、たとえばM13mp18やM13mp19
等が挙げられる。
本発明のベクターのマルチクローニング部位を構成す
るDNA鎖は、少なくとも１個の目的DNAクローニング部位
と、少なくとも１個の３′−末端突出型８塩基認識制限
酵素切断部位と、少なくとも１個の５′−末端突出型８
塩基制限酵素切断部位とを含むものであればよいが、汎
用性を高くするためにはさらに上述の汎用の６塩基認識
制限酵素切断部位を含むことが望ましい。これらのDNA
鎖の長さは合成の容易さ、操作性、経済性等の点から、
一般に20〜100塩基程度が適当であり、この程度の長さ
のDNA鎖は、市販のDNA合成機（たとえばアプライド・バ
イオシステムズ・ジャパン（株）製の全自動DNA合成機3
81A型）により容易に合成することができる。
るDNA鎖は、少なくとも１個の目的DNAクローニング部位
と、少なくとも１個の３′−末端突出型８塩基認識制限
酵素切断部位と、少なくとも１個の５′−末端突出型８
塩基制限酵素切断部位とを含むものであればよいが、汎
用性を高くするためにはさらに上述の汎用の６塩基認識
制限酵素切断部位を含むことが望ましい。これらのDNA
鎖の長さは合成の容易さ、操作性、経済性等の点から、
一般に20〜100塩基程度が適当であり、この程度の長さ
のDNA鎖は、市販のDNA合成機（たとえばアプライド・バ
イオシステムズ・ジャパン（株）製の全自動DNA合成機3
81A型）により容易に合成することができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、pUC118をHind I
II及びRcoR Iで消化してそのアルチクローニング部位を
欠失させ、このDNA断片と、別途合成したDNA（マルチク
ローニング部位）を混合し、T4DNAリガーゼ連結するこ
とにより新規ベクターpYUM1118が構築される。
II及びRcoR Iで消化してそのアルチクローニング部位を
欠失させ、このDNA断片と、別途合成したDNA（マルチク
ローニング部位）を混合し、T4DNAリガーゼ連結するこ
とにより新規ベクターpYUM1118が構築される。
pYUM1118は適当な宿主、たてえばE.coliJM107、JM10
9、MV1184等に導入して形質転換し、得られた形質転換
体をＸ−gal、IPTG及びApを含むLB培地で培養し、青色
コロニーの菌体より採取することができる。
9、MV1184等に導入して形質転換し、得られた形質転換
体をＸ−gal、IPTG及びApを含むLB培地で培養し、青色
コロニーの菌体より採取することができる。
pUC118のマルチクローニング部位はlacZ（β−ガラク
トシダーゼ遺伝子）の中に挿入されており、発色基質
（Ｘ−gal、IPTG）を含む培地によって外来DNAの挿入の
有無を容易に判別できるようになっている。本発明の新
規ベクターpYUM1118のマルチクローニング部位もlacZと
読みわく（reading frame）を合わせてあるので、同様
に使用することができる。また、欠失の長さをチェック
するための切断点（Sma I）も導入されている。このpYU
M1118のマルチクローニング部位の塩基配列を第１図に
示した。
トシダーゼ遺伝子）の中に挿入されており、発色基質
（Ｘ−gal、IPTG）を含む培地によって外来DNAの挿入の
有無を容易に判別できるようになっている。本発明の新
規ベクターpYUM1118のマルチクローニング部位もlacZと
読みわく（reading frame）を合わせてあるので、同様
に使用することができる。また、欠失の長さをチェック
するための切断点（Sma I）も導入されている。このpYU
M1118のマルチクローニング部位の塩基配列を第１図に
示した。
こうして得られた本発明のベクターを用いて目的DNA
の塩基配列をキロシークエンス法により決定することが
できる。たとえば上述のpYUM1118を用いる場合には、ま
ずこれをEcoR Iで消化し、ベクターの自己再結合を防ぐ
ためホスファターゼ処理した後、目的DNA断片をEcoR I
切断部位に挿入連結し、得られたプラスミドを宿主E.co
liJM109に導入して形質転換し、得られた形質転換体を
培養して、多量のプラスミドを調整する。これを３′−
末端制限酵素Sfi Iと５′−末端制限酵素Not Iで完全に
消化する。さらにエキソヌクレアーゼIIIで消化後、ナ
タマメヌクレアーゼで消化し、DNAポリメラーゼKlenow
断片で修復し、T4DNAリガーゼで再連結したのち、Hind
IIIで処理し、欠失が起っていないものを消化する。こ
うして得られる欠失した目的DNAを含むプラスミドを宿
主E.coliMV1184に導入して形質転換し、形質転換体を培
養して、各コロニーの菌体よりプラスミドを採取する。
このプラスミドをEcoR I、Sma I消化後、アガロース電
気泳動及びポリアクリルアミド電気泳動により欠失の長
さをチェックする。各欠失DNAについて、一本鎖DNAを調
整し、ジヌクレオチド法によりそのDNA塩基配列を決定
し、これらのデータから目的DNAの全塩基配列を決定す
る。
の塩基配列をキロシークエンス法により決定することが
できる。たとえば上述のpYUM1118を用いる場合には、ま
ずこれをEcoR Iで消化し、ベクターの自己再結合を防ぐ
ためホスファターゼ処理した後、目的DNA断片をEcoR I
切断部位に挿入連結し、得られたプラスミドを宿主E.co
liJM109に導入して形質転換し、得られた形質転換体を
培養して、多量のプラスミドを調整する。これを３′−
末端制限酵素Sfi Iと５′−末端制限酵素Not Iで完全に
消化する。さらにエキソヌクレアーゼIIIで消化後、ナ
タマメヌクレアーゼで消化し、DNAポリメラーゼKlenow
断片で修復し、T4DNAリガーゼで再連結したのち、Hind
IIIで処理し、欠失が起っていないものを消化する。こ
うして得られる欠失した目的DNAを含むプラスミドを宿
主E.coliMV1184に導入して形質転換し、形質転換体を培
養して、各コロニーの菌体よりプラスミドを採取する。
このプラスミドをEcoR I、Sma I消化後、アガロース電
気泳動及びポリアクリルアミド電気泳動により欠失の長
さをチェックする。各欠失DNAについて、一本鎖DNAを調
整し、ジヌクレオチド法によりそのDNA塩基配列を決定
し、これらのデータから目的DNAの全塩基配列を決定す
る。
本発明のベクターは、マルチクローニング部位に８塩
基認識制限酵素切断部位を含んでおり、この酵素により
目的DNAが切断される可能性は48＝65536塩基に１ケ所で
あり、極めて汎用性が高い。したがって、従来キロシー
クエンス法を適用できなかったDNA鎖の塩基配列決定
に、これを適用することができる。また、本発明のベク
ターがマルチクローニング部位に６塩基認識制限酵素切
断部位を含む場合には、さらに汎用性が高く、特にEcoR
I、BamH I切断部位がマルチクローニング部位に導入さ
れている場合には操作性が著しく向上する。
基認識制限酵素切断部位を含んでおり、この酵素により
目的DNAが切断される可能性は48＝65536塩基に１ケ所で
あり、極めて汎用性が高い。したがって、従来キロシー
クエンス法を適用できなかったDNA鎖の塩基配列決定
に、これを適用することができる。また、本発明のベク
ターがマルチクローニング部位に６塩基認識制限酵素切
断部位を含む場合には、さらに汎用性が高く、特にEcoR
I、BamH I切断部位がマルチクローニング部位に導入さ
れている場合には操作性が著しく向上する。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
（１）マルチクローニング部位DNAの合成 第１図の点線枠内に示す塩基配列を有するDNA鎖
（ａ）及び（ｂ）を、アプライド・バイオシステムズ・
ジャパン（株）製全自動DNA合成機381A型を用い、β−
シアノエチル−ホシホアミダイト法により合成した。
（ａ）及び（ｂ）を、アプライド・バイオシステムズ・
ジャパン（株）製全自動DNA合成機381A型を用い、β−
シアノエチル−ホシホアミダイト法により合成した。
（２）プラスミドpYUM1118の構築 ５μｇのpUC118をHind III100単位で１時間消化し、
次いでEcoR I100単位で１時間消化した。これを0.8％ア
ガロースゲル電気泳動に供し、3.1kbの断片を電気溶出
法により回収した。
次いでEcoR I100単位で１時間消化した。これを0.8％ア
ガロースゲル電気泳動に供し、3.1kbの断片を電気溶出
法により回収した。
（１）で合成したDNA鎖（ａ）及び（ｂ）を50μｇず
つ100μTE buffer中で混合し、これを95℃、２分間加
熱し、次に68℃で３時間保温した。さらに37℃、30分間
保温後、室温に15分放置した。この合成DNA1μｇを前述
のベクター断片と混合し、T4DNAリガーゼで連結した。
つ100μTE buffer中で混合し、これを95℃、２分間加
熱し、次に68℃で３時間保温した。さらに37℃、30分間
保温後、室温に15分放置した。この合成DNA1μｇを前述
のベクター断片と混合し、T4DNAリガーゼで連結した。
反応物をXba I100単位で１時間消化して未反応のpUC1
18を除去後、E.coliJM109に導入して形質転換した。こ
の形質転換体をＸ−gal、IPTG、Apを含むLB培地にま
き、青色コロニーを選択した。この青色コロニーの菌体
はエシェリヒア・コリpYUM1118 （Esherichia coli pYUM1118）と命名され、工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第10516号（FERM P
−10516）として寄託された。
18を除去後、E.coliJM109に導入して形質転換した。こ
の形質転換体をＸ−gal、IPTG、Apを含むLB培地にま
き、青色コロニーを選択した。この青色コロニーの菌体
はエシェリヒア・コリpYUM1118 （Esherichia coli pYUM1118）と命名され、工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第10516号（FERM P
−10516）として寄託された。
このコロニーの菌体から調製したプラスミドpYUM1118
を、BamH I、EcoR IHind III、Kpn I、Not I、Sac I、S
al I、Sfi I、Sma I、Xba Iで処理したところ、Xba Iで
は切断されないが、他の制限酵素によってそれぞれ１ケ
所切断されることが確認された。
を、BamH I、EcoR IHind III、Kpn I、Not I、Sac I、S
al I、Sfi I、Sma I、Xba Iで処理したところ、Xba Iで
は切断されないが、他の制限酵素によってそれぞれ１ケ
所切断されることが確認された。
（３）pYUM1118を用いた小麦グルテニンcDNA（約0.8k
b）の塩基配列の決定 λgt11のEcoR I部位にクローニングされた小麦グルテ
ニンcDNA（約0.8kb）は、内部に４ケ所のPst I切断点を
もっているため、このままではキロシークエンス法を適
用できない。そこでEcoR I消化後、仔牛小腸由来アルカ
リホスファターゼで処理したpYUM1118のEcoR I部位に、
この小麦グルテニンcDNAを挿入した。
b）の塩基配列の決定 λgt11のEcoR I部位にクローニングされた小麦グルテ
ニンcDNA（約0.8kb）は、内部に４ケ所のPst I切断点を
もっているため、このままではキロシークエンス法を適
用できない。そこでEcoR I消化後、仔牛小腸由来アルカ
リホスファターゼで処理したpYUM1118のEcoR I部位に、
この小麦グルテニンcDNAを挿入した。
このプラスミド（５μｇ）をSfi I、Not I（各80単
位）で完全消化し、エキスヌクレアーゼIII（200単位）
で消化後、ナタマメヌクレアーゼ（20単位）で消化し、
DNAポリメラーゼKlenow断片（１単位）で修復した。T4D
NAリガーゼで再連結後、Hind III（100単位）で処理し
て、欠失が起っていないものを消化して除去した後、E.
coliMV1184の導入して形質転換した。形質転換体を培養
し、各コロニーよりプラスミドを調製した。このプラス
ミドをEcoR I、Sma I消化後、アガロース電気泳動及び
ポリアクリルアミド電気泳動により欠失の長さをチェッ
クし、シークエンス反応（一本鎖DNA調製、ジヌクレオ
チド反応、電気泳動等）により、目的の小麦グルテニン
cDNAの全塩基配列を決定した。
位）で完全消化し、エキスヌクレアーゼIII（200単位）
で消化後、ナタマメヌクレアーゼ（20単位）で消化し、
DNAポリメラーゼKlenow断片（１単位）で修復した。T4D
NAリガーゼで再連結後、Hind III（100単位）で処理し
て、欠失が起っていないものを消化して除去した後、E.
coliMV1184の導入して形質転換した。形質転換体を培養
し、各コロニーよりプラスミドを調製した。このプラス
ミドをEcoR I、Sma I消化後、アガロース電気泳動及び
ポリアクリルアミド電気泳動により欠失の長さをチェッ
クし、シークエンス反応（一本鎖DNA調製、ジヌクレオ
チド反応、電気泳動等）により、目的の小麦グルテニン
cDNAの全塩基配列を決定した。
第１図は、本発明のプラスミドpYUM1118とそのマルチク
ローニング部位の塩基配列を示す図面であり、 第２図は、公知プラスミドpUC118及びpUC119とそのマル
チクローニング部位の塩基配列を示す図面である。
ローニング部位の塩基配列を示す図面であり、 第２図は、公知プラスミドpUC118及びpUC119とそのマル
チクローニング部位の塩基配列を示す図面である。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】プライマー結合部位とマルチクローニング
部位とを含むDNA塩基配列分析用ベクターにおいて、マ
ルチクローニング部位が、少なくとも１個の目的DNAク
ローニング部位と、少なくとも１個の５′−末端突出型
８塩基認識制限酵素切断部位と、少なくとも１個の３′
−末端突出型８塩基認識制限酵素切断部位とを含み、前
記の順にプライマー結合部位から遠い順に位置すること
を特徴とするDNA塩基配列分析用ベクター。 - 【請求項２】３′−末端突出型８塩基認識制限酵素がSf
i Iである請求項１記載のベクター。 - 【請求項３】５′−末端突出型８塩基認識制限酵素がNo
t Iである請求項１記載のベクター。 - 【請求項４】請求項１記載のDNA塩基配列分析用ベクタ
ーであって、そのマルチクローニング部位が下記の塩基
配列を有することを特徴とするプラスミドpYUM1118。 - 【請求項５】マルチクローニング部位が、さらに、Sac
I、Kpn I、Pst I、Hind III、Sal I、Acc I、Sma I、Hi
nc II、BamH I及びEcoR Iからなる群から選ばれる少な
くとも１種の制限酵素切断部位を有する請求項１〜３の
いずれか１項記載のベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1896789A JP2799500B2 (ja) | 1989-01-27 | 1989-01-27 | Ｄｎａ塩基配列分析用ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1896789A JP2799500B2 (ja) | 1989-01-27 | 1989-01-27 | Ｄｎａ塩基配列分析用ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02200190A JPH02200190A (ja) | 1990-08-08 |
| JP2799500B2 true JP2799500B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=11986426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1896789A Expired - Lifetime JP2799500B2 (ja) | 1989-01-27 | 1989-01-27 | Ｄｎａ塩基配列分析用ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2799500B2 (ja) |
-
1989
- 1989-01-27 JP JP1896789A patent/JP2799500B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02200190A (ja) | 1990-08-08 |
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