JP2770827B2 - パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチド - Google Patents
パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドInfo
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- JP2770827B2 JP2770827B2 JP9030069A JP3006997A JP2770827B2 JP 2770827 B2 JP2770827 B2 JP 2770827B2 JP 9030069 A JP9030069 A JP 9030069A JP 3006997 A JP3006997 A JP 3006997A JP 2770827 B2 JP2770827 B2 JP 2770827B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は魚病菌の種決定遺
伝子ＤＮＡに関するものであり、さらに詳細にはパスツ
レラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドおよびそ
れを含有する該菌種の同定用試薬に関するものである
伝子ＤＮＡに関するものであり、さらに詳細にはパスツ
レラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドおよびそ
れを含有する該菌種の同定用試薬に関するものである
【０００２】
【従来の技術】および
【発明が解決しようとする課題】魚病菌による感染症が
養殖場で発生したとき、その原因菌を究明することは魚
病の予防・治療にとって重要なことである。従来、魚病
菌を問わず一般細菌の分類、同定はその形態や生化学的
性状あるいは免疫学的手法を用いた生物学的性状でおこ
なわれてきた。最近、生化学あるいは分子遺伝学の進歩
により、その菌の持つ染色体ＤＮＡやＲＮＡ、菌体物質
および菌が生産する物質を比較することによる、いわゆ
る化学的性状による分類が行なわれるようになってき
た。しかしながら、生物学的性状あるいは化学的性状に
よる分類法は、最近の分類学にとっては重要であるが、
各々の手法は複雑で時間を費やすために、病魚の原因菌
を簡便かつ迅速に同定するには適していない。
養殖場で発生したとき、その原因菌を究明することは魚
病の予防・治療にとって重要なことである。従来、魚病
菌を問わず一般細菌の分類、同定はその形態や生化学的
性状あるいは免疫学的手法を用いた生物学的性状でおこ
なわれてきた。最近、生化学あるいは分子遺伝学の進歩
により、その菌の持つ染色体ＤＮＡやＲＮＡ、菌体物質
および菌が生産する物質を比較することによる、いわゆ
る化学的性状による分類が行なわれるようになってき
た。しかしながら、生物学的性状あるいは化学的性状に
よる分類法は、最近の分類学にとっては重要であるが、
各々の手法は複雑で時間を費やすために、病魚の原因菌
を簡便かつ迅速に同定するには適していない。
【０００３】生物は種によって形態やそれを構成する成
分が異なる。これら種の特徴はその生物の持つ遺伝子に
よって規定されている。細菌においても同様で、種によ
って生化学性状が異なることはそれを規定する遺伝子も
異なっていると考えられる。このような観点から、この
発明者等は養殖場で流行が絶えず、経済的に損失が大き
いビブリオ病及び細菌性類結節症について、それらの原
因菌であるビブリオ・アンギュラルム（Ｖｉｂｒｉｏ
ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）およびパスツレラ・ピシシー
ダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）のみ
が持つ特定遺伝子ＤＮＡをそれぞれ見出し、さらにこれ
らの遺伝子ＤＮＡから一本鎖の標識したＤＮＡプローブ
を作製して、未知の魚病の病原菌のＤＮＡとハイブリダ
イゼーションさせることで、該菌がビブリオ・アンギュ
ラルムおよびパスツレラ・ピシシーダであるか否かを簡
易かつ迅速に同定できるという知見を得ていた。
分が異なる。これら種の特徴はその生物の持つ遺伝子に
よって規定されている。細菌においても同様で、種によ
って生化学性状が異なることはそれを規定する遺伝子も
異なっていると考えられる。このような観点から、この
発明者等は養殖場で流行が絶えず、経済的に損失が大き
いビブリオ病及び細菌性類結節症について、それらの原
因菌であるビブリオ・アンギュラルム（Ｖｉｂｒｉｏ
ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）およびパスツレラ・ピシシー
ダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）のみ
が持つ特定遺伝子ＤＮＡをそれぞれ見出し、さらにこれ
らの遺伝子ＤＮＡから一本鎖の標識したＤＮＡプローブ
を作製して、未知の魚病の病原菌のＤＮＡとハイブリダ
イゼーションさせることで、該菌がビブリオ・アンギュ
ラルムおよびパスツレラ・ピシシーダであるか否かを簡
易かつ迅速に同定できるという知見を得ていた。
【０００４】しかし、該ＤＮＡプローブの分子量はそれ
ぞれ約０．６Ｋｂｐおよび０．８Ｋｂｐと大きく（昭和
６２年度日本水産学会春季大会講演要旨講演番号４０４
号参照）、実用化のために工業生産するには合成法では
実質上不可能に近く、遺伝子組替え技術を駆使して醗酵
生産する以外に大量生産の道が考えられず、また生産で
きても抽出・精製等に膨大な費用がかかるなどの問題点
があり、これらを解決する課題があった。
ぞれ約０．６Ｋｂｐおよび０．８Ｋｂｐと大きく（昭和
６２年度日本水産学会春季大会講演要旨講演番号４０４
号参照）、実用化のために工業生産するには合成法では
実質上不可能に近く、遺伝子組替え技術を駆使して醗酵
生産する以外に大量生産の道が考えられず、また生産で
きても抽出・精製等に膨大な費用がかかるなどの問題点
があり、これらを解決する課題があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この発明者等は、ビブリ
オ・アンギュラルムあるいはパスツレラ・ピシシーダ菌
によって引起こされる養殖魚の疾病は被害が大きく、該
疾病の早期発見・早期治療ができた養殖家の著しい被害
軽減の事実に鑑み、低コストで大量合成が可能なオリゴ
ヌクレオチドをみつければ、ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン法による迅速同定法を提供できると考えて鋭意研究
に着手した。
オ・アンギュラルムあるいはパスツレラ・ピシシーダ菌
によって引起こされる養殖魚の疾病は被害が大きく、該
疾病の早期発見・早期治療ができた養殖家の著しい被害
軽減の事実に鑑み、低コストで大量合成が可能なオリゴ
ヌクレオチドをみつければ、ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョン法による迅速同定法を提供できると考えて鋭意研究
に着手した。
【０００６】その結果、市販のＤＮＡ合成装置でも簡単
に合成が可能な分子量が２０ｍｅｒ前後で、シトシン・
グアニン含量の高い部分を、既知のビブリオ・アンギュ
ラルムおよびパスツレラ・ピシシーダのそれぞれの菌に
対応する種決定一本鎖ＤＮＡプローブの任意の部位から
選び、低分子のオリゴヌクレオチドを合成した。さら
に、これらのオリゴヌクレオチドを標識して、未知の魚
病菌の一本鎖ＤＮＡとハイブリダイゼーションすること
により、このような驚くべき低分子量のオリゴヌクレオ
チドでも、該菌がビブリオ・アンギュラルムまたはパス
ツレラ・ピシシーダであるか否かを簡易かつ迅速に同定
できるという新知見を得、この発明を完成した。また、
一般にシトシン・グアニン含量が高いと自己ハイブリダ
イゼーションによって使用できないことが多いといわれ
ているが、該オリゴヌクレオチドではそのようなことが
なかった。以下に、ビブリオ・アンギュラルムの種決定
オリゴヌクレオチドおよびパスツレラ・ピシシーダの種
決定オリゴヌクレオチドの一般的な製造法を示す。
に合成が可能な分子量が２０ｍｅｒ前後で、シトシン・
グアニン含量の高い部分を、既知のビブリオ・アンギュ
ラルムおよびパスツレラ・ピシシーダのそれぞれの菌に
対応する種決定一本鎖ＤＮＡプローブの任意の部位から
選び、低分子のオリゴヌクレオチドを合成した。さら
に、これらのオリゴヌクレオチドを標識して、未知の魚
病菌の一本鎖ＤＮＡとハイブリダイゼーションすること
により、このような驚くべき低分子量のオリゴヌクレオ
チドでも、該菌がビブリオ・アンギュラルムまたはパス
ツレラ・ピシシーダであるか否かを簡易かつ迅速に同定
できるという新知見を得、この発明を完成した。また、
一般にシトシン・グアニン含量が高いと自己ハイブリダ
イゼーションによって使用できないことが多いといわれ
ているが、該オリゴヌクレオチドではそのようなことが
なかった。以下に、ビブリオ・アンギュラルムの種決定
オリゴヌクレオチドおよびパスツレラ・ピシシーダの種
決定オリゴヌクレオチドの一般的な製造法を示す。
【０００７】この発明者等が先に発見したビブリオ・ア
ンギュラルムおよびパスツレラ・ピシシーダのそれぞれ
の種決定遺伝子のＤＮＡプローブの塩基配列から、それ
ぞれの菌について全体の塩基数が２０個前後でシトシン
及びグアニンの塩基数の合計が全体の５０％前後になる
配列部分を無作為に選ぶ。なお、ここでいう全体の塩基
数は、必ずしも三の倍数である必要は無い。
ンギュラルムおよびパスツレラ・ピシシーダのそれぞれ
の種決定遺伝子のＤＮＡプローブの塩基配列から、それ
ぞれの菌について全体の塩基数が２０個前後でシトシン
及びグアニンの塩基数の合計が全体の５０％前後になる
配列部分を無作為に選ぶ。なお、ここでいう全体の塩基
数は、必ずしも三の倍数である必要は無い。
【０００８】選んだ一本鎖ＤＮＡプローブの塩基配列を
正確に読取り、その配列にしたがってアデニン、シトシ
ン、チミン及びグアニンそれぞれに対応する市販の合成
原料を使用して、縮合剤の存在下で配列順に縮合合成す
れば求めるオリゴヌクレオチドが得られる。縮合合成の
方法は、リン酸ジエステル法、リン酸トリエステル法、
クロロホスファイト法及びリン酸アミダイト法など一般
に知られている方法なら何れでもよく、市販のＤＮＡ合
成装置を使用してそれぞれの装置の手順書に従って製造
してもよい。また、大量に合成するためにはＤＮＡ増幅
技術（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法など）
を併用してもよい。
正確に読取り、その配列にしたがってアデニン、シトシ
ン、チミン及びグアニンそれぞれに対応する市販の合成
原料を使用して、縮合剤の存在下で配列順に縮合合成す
れば求めるオリゴヌクレオチドが得られる。縮合合成の
方法は、リン酸ジエステル法、リン酸トリエステル法、
クロロホスファイト法及びリン酸アミダイト法など一般
に知られている方法なら何れでもよく、市販のＤＮＡ合
成装置を使用してそれぞれの装置の手順書に従って製造
してもよい。また、大量に合成するためにはＤＮＡ増幅
技術（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法など）
を併用してもよい。
【０００９】この様にして得られた、二種類のビブリオ
・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドは次のよ
うな特徴を有する。 （１）該オリゴヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ次の
通りである。
・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドは次のよ
うな特徴を有する。 （１）該オリゴヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ次の
通りである。
【数１】
【００１０】（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により測定した該オリゴヌクレオチドのそれぞれの分子
量は次の通りである。
により測定した該オリゴヌクレオチドのそれぞれの分子
量は次の通りである。
【数２】
【００１１】（３）高速液体クロマトグラフにかけると
き、該オリゴヌクレオチドはそれぞれ次の保持時間に一
本のピークを認める。
き、該オリゴヌクレオチドはそれぞれ次の保持時間に一
本のピークを認める。
【数３】 条件：検出器 紫外吸光光度計（２５４ｎｍ） カラム Ｍ＆Ｓ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ ＩＮＣ製 品番Ａ１０４−１５ カラム温度 室温 移植相 トリエチルアミン・アセトニトリル混液（９５：５） 流量 １，０００ｍｌ／分 注入量 １００μｌ
【００１２】また、三種類のパスツレラ・ピシシーダの
種決定オリゴヌクレオチドは、それぞれ次の特徴を有す
る。 （１）該オリゴヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ次の
通りである。
種決定オリゴヌクレオチドは、それぞれ次の特徴を有す
る。 （１）該オリゴヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ次の
通りである。
【数４】
【００１３】（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により測定した該オリゴヌクレオチドのそれぞれの分子
量は次の通りである。
により測定した該オリゴヌクレオチドのそれぞれの分子
量は次の通りである。
【数５】
【００１４】（３）高速液体クロマトグラフにかけると
き、該オリゴヌクレオチドはそれぞれ次の保持時間に一
本のピークを認める。
き、該オリゴヌクレオチドはそれぞれ次の保持時間に一
本のピークを認める。
【数６】 条件：検出器 紫外吸光光度計（２５４ｎｍ） カラム Ｍ＆Ｓ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ ＩＮＣ製 品番Ａ１０４−１５ カラム温度 室温 移植相 トリエチルアミン・アセトニトリル混液（９５：５） 流量 １，０００ｍｌ／分 注入量 １００μｌ
【００１５】
【発明の効果】この発明のビブリオ・アンギュラルムの
種決定オリゴヌクレオチドおよびパスツレラ・ピシシー
ダの種決定オリゴヌクレオチドは、それぞれビブリオ・
アンギュラルムおよびパスツレラ・ピシシーダを同定す
るのに有用である。すなわち、適当な標識物で標識した
ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチド
（同様に、適当な標識物で標識したパスツレラ・ピシシ
ーダの種決定オリゴヌクレオチド）と種未知の魚病菌の
ＤＮＡの一本鎖とをハイブリダイゼーションすることに
よって、該種未知の魚病菌がビブリオ・アンギュラルム
であるか否か（同様にして、パスツレラ・ピシシーダで
あるか否か）を同定することができる。
種決定オリゴヌクレオチドおよびパスツレラ・ピシシー
ダの種決定オリゴヌクレオチドは、それぞれビブリオ・
アンギュラルムおよびパスツレラ・ピシシーダを同定す
るのに有用である。すなわち、適当な標識物で標識した
ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチド
（同様に、適当な標識物で標識したパスツレラ・ピシシ
ーダの種決定オリゴヌクレオチド）と種未知の魚病菌の
ＤＮＡの一本鎖とをハイブリダイゼーションすることに
よって、該種未知の魚病菌がビブリオ・アンギュラルム
であるか否か（同様にして、パスツレラ・ピシシーダで
あるか否か）を同定することができる。
【００１６】ここで用いられる標識物としては、通常こ
の分野で用いられる標識物をそのまま使用することがで
き、そのような例としては、放射性同位元素、酵素、螢
光性化合物、生物的発光性化合物、生物学的発色性化合
物等があげられる。
の分野で用いられる標識物をそのまま使用することがで
き、そのような例としては、放射性同位元素、酵素、螢
光性化合物、生物的発光性化合物、生物学的発色性化合
物等があげられる。
【００１７】この発明の、標識物で標識されたビブリオ
・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびパ
スツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドは、
それぞれのオリゴヌクレオチドと各担体や希釈剤とを含
有するビブリオ・アンギュラルムおよびパスツレラ・ピ
シシーダの同定用の試薬として、また、これらの標識さ
れた種決定オリゴヌクレオチドをそれぞれ含有するキッ
トとして用いることができる。
・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびパ
スツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチドは、
それぞれのオリゴヌクレオチドと各担体や希釈剤とを含
有するビブリオ・アンギュラルムおよびパスツレラ・ピ
シシーダの同定用の試薬として、また、これらの標識さ
れた種決定オリゴヌクレオチドをそれぞれ含有するキッ
トとして用いることができる。
【００１８】
次にこの発明を実施例により説明する。 実施例１（ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌ
クレオチドＮｏ．１および２の製法） 目的の塩基配列に従って、バイオサーチ社製ＤＮＡ合成
装置サイクロン（ＳＹＣＬＯＮＥ）を使用し、その説明
書にしたがって合成した。即ち、装置に下表１に示した
試薬を装填し、目的の塩基配列に従って希望のシーケン
スをキーボードから入力、プレパックされたＣＰＧ支持
体（０．２μｍｏｌ）からなるショートフラグメント用
ディスポーザル反応カラムを装填し、自動運転した。
クレオチドＮｏ．１および２の製法） 目的の塩基配列に従って、バイオサーチ社製ＤＮＡ合成
装置サイクロン（ＳＹＣＬＯＮＥ）を使用し、その説明
書にしたがって合成した。即ち、装置に下表１に示した
試薬を装填し、目的の塩基配列に従って希望のシーケン
スをキーボードから入力、プレパックされたＣＰＧ支持
体（０．２μｍｏｌ）からなるショートフラグメント用
ディスポーザル反応カラムを装填し、自動運転した。
【００１９】反応終了後、カラムを取外し市販の２８％
アンモニア水で洗浄して、合成されたオリゴヌクレオチ
ド混入アンモニア水を集め、５５℃で一晩放置した。放
置後、常法に従ってアンモニアを揮発蒸散させ、減圧濃
縮し、乾燥させた。これらを、１００−２００μｌの蒸
留水に溶解し、ニトロセルロースフィルターで濾過し
た。次いで、液体クロマトグラム法により精製し、求め
るオリゴヌクレオチドを得た。
アンモニア水で洗浄して、合成されたオリゴヌクレオチ
ド混入アンモニア水を集め、５５℃で一晩放置した。放
置後、常法に従ってアンモニアを揮発蒸散させ、減圧濃
縮し、乾燥させた。これらを、１００−２００μｌの蒸
留水に溶解し、ニトロセルロースフィルターで濾過し
た。次いで、液体クロマトグラム法により精製し、求め
るオリゴヌクレオチドを得た。
【００２０】なお、合成した二つのオリゴヌクレオチド
をそれぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量
を測定すると、オリゴヌクレオチドＮｏ．１は２３ｍｅ
ｒおよびオリゴヌクレオチドＮｏ．２は２０ｍｅｒの部
分にのみ一本の明瞭なバンドを形成した（図）。また、
トリエチルアミン・アセトニトリル（９５：５）に展開
して液体クロマトグラムにかけたとき、オリゴヌクレオ
チドＮｏ．１およびオリゴヌクレオチドＮｏ．２はそれ
ぞれ保持時間１０．６分および１２．７分のところに一
つのピークのみを認め、合成したいずれのオリゴヌクレ
オチドも単一の生成物であった。
をそれぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量
を測定すると、オリゴヌクレオチドＮｏ．１は２３ｍｅ
ｒおよびオリゴヌクレオチドＮｏ．２は２０ｍｅｒの部
分にのみ一本の明瞭なバンドを形成した（図）。また、
トリエチルアミン・アセトニトリル（９５：５）に展開
して液体クロマトグラムにかけたとき、オリゴヌクレオ
チドＮｏ．１およびオリゴヌクレオチドＮｏ．２はそれ
ぞれ保持時間１０．６分および１２．７分のところに一
つのピークのみを認め、合成したいずれのオリゴヌクレ
オチドも単一の生成物であった。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例２（パスツレラ・ピシシーダの種決
定オリゴヌクレオチドＮｏ．３，Ｎｏ．４およびＮｏ．
５の製法） 目的の塩基配列に従って、バイオサーチ社製ＤＮＡ合成
装置サイクロン（ＳＹＣＬＯＮＥ）を使用し、その説明
書にしたがって合成した。即ち、装置に実施例１の表１
に示した試薬を装填し、選んだ塩基配列に従って希望の
シーケンスをキーボードから入力、プレパックされたＣ
ＰＧ支持体（０．２μｍｏｌ）からなるショートフラグ
メント用ディスポーザル反応カラムを装填し、自動運転
した。
定オリゴヌクレオチドＮｏ．３，Ｎｏ．４およびＮｏ．
５の製法） 目的の塩基配列に従って、バイオサーチ社製ＤＮＡ合成
装置サイクロン（ＳＹＣＬＯＮＥ）を使用し、その説明
書にしたがって合成した。即ち、装置に実施例１の表１
に示した試薬を装填し、選んだ塩基配列に従って希望の
シーケンスをキーボードから入力、プレパックされたＣ
ＰＧ支持体（０．２μｍｏｌ）からなるショートフラグ
メント用ディスポーザル反応カラムを装填し、自動運転
した。
【００２３】反応終了後、カラムを取外し市販の２８％
アンモニア水で洗浄して、合成されたオリゴヌクレオチ
ド混入アンモニア水を集め、５５℃で一晩放置した。放
置後、常法に従ってアンモニアを揮発蒸散させ、減圧濃
縮し、乾燥させた。これらを、１００−２００μｌの蒸
留水に溶解し、ニトロセルロースフィルターで濾過し
た。次いで、液体クロマトグラム法により精製し、求め
るオリゴヌクレオチドを得た。
アンモニア水で洗浄して、合成されたオリゴヌクレオチ
ド混入アンモニア水を集め、５５℃で一晩放置した。放
置後、常法に従ってアンモニアを揮発蒸散させ、減圧濃
縮し、乾燥させた。これらを、１００−２００μｌの蒸
留水に溶解し、ニトロセルロースフィルターで濾過し
た。次いで、液体クロマトグラム法により精製し、求め
るオリゴヌクレオチドを得た。
【００２４】なお、合成した三つのオリゴヌクレオチド
をそれぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量
を測定すると、オリゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌ
クレオチドＮｏ．４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５
はそれぞれ２１ｍｅｒの部分にのみ一本の明瞭なバンド
を形成した（図）。また、トリエチルアミン・アセトニ
トリル混液（９５：５）に展開して液体クロマトグラム
にかけたとき、オリゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌ
クレオチドＮｏ．４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５
はそれぞれ保持時間１１．８分，１１．３分および１
２．１分のところに一つのピークのみを認め、合成した
いずれのオリゴヌクレオチドも単一の生成物であった。
をそれぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分子量
を測定すると、オリゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌ
クレオチドＮｏ．４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５
はそれぞれ２１ｍｅｒの部分にのみ一本の明瞭なバンド
を形成した（図）。また、トリエチルアミン・アセトニ
トリル混液（９５：５）に展開して液体クロマトグラム
にかけたとき、オリゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌ
クレオチドＮｏ．４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５
はそれぞれ保持時間１１．８分，１１．３分および１
２．１分のところに一つのピークのみを認め、合成した
いずれのオリゴヌクレオチドも単一の生成物であった。
【００２５】実施例３（ＤＮＡハイブリダイゼーション
法によるビブリオ・アンギュラルムの同定） （被験菌株のＤＮＡ液の調整）表２に示したように各種
の魚病菌の標準株および野外分離株を準備し、それぞれ
の菌種について表２に記載した培地各１０ｍｌに一夜培
養した菌液を得た。得られた培養菌液を６，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心して、上澄液を捨て、それぞれの沈殿
菌体にトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とＥＤＴＡをそれ
ぞれ５０ｍＭ含有する溶液０．５ｍｌを加えた。これら
の菌体を含む溶液を−２０℃で凍結した後、０．２５Ｍ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にリゾチーム（和光純薬
製）１０ｍｇ／ｍｌを溶解した溶液を０．２ｍｌ加え
た。これらを室温に放置して解凍した後、氷冷下で４５
分間反応させた。次にＳＴＥＰ溶液（プロテナーゼＫｌ
ｍｇ／ｍｌ，０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ），５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．４
Ｍ ＥＤＴＡ）を０．４ｍｌ加え、時々撹拌しながら５
０℃で６０分間反応させた。
法によるビブリオ・アンギュラルムの同定） （被験菌株のＤＮＡ液の調整）表２に示したように各種
の魚病菌の標準株および野外分離株を準備し、それぞれ
の菌種について表２に記載した培地各１０ｍｌに一夜培
養した菌液を得た。得られた培養菌液を６，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心して、上澄液を捨て、それぞれの沈殿
菌体にトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とＥＤＴＡをそれ
ぞれ５０ｍＭ含有する溶液０．５ｍｌを加えた。これら
の菌体を含む溶液を−２０℃で凍結した後、０．２５Ｍ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にリゾチーム（和光純薬
製）１０ｍｇ／ｍｌを溶解した溶液を０．２ｍｌ加え
た。これらを室温に放置して解凍した後、氷冷下で４５
分間反応させた。次にＳＴＥＰ溶液（プロテナーゼＫｌ
ｍｇ／ｍｌ，０．５％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ），５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．４
Ｍ ＥＤＴＡ）を０．４ｍｌ加え、時々撹拌しながら５
０℃で６０分間反応させた。
【００２６】反応後、ＴＥフェノール２．４ｍｌを加え
て、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄液を得
た。これらの上澄液に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを入れ、さらに２倍量のエタノールを加え、核酸混合
物を沈殿させた。該沈殿物を細いガラス棒に巻きつける
ようにして分取し、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０
ｍＭとＥＤＴＡ １ｍＭを含有する液２．５ｍｌに溶解
し、５０μｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）１０ｍｇ／ｍ
ｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。静置後、等量のク
ロロホルムを加えて良く混合した上で、６０００ｒｐｍ
で１５分間遠心し、上澄液を分取した。これらに、１０
分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを
加え混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した染色
体ＤＮＡは細いガラス棒に巻きつけるようにして分取し
た後、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭとＥＤＴ
Ａ １ｍＭを含有する液１ｍｌを加えて４℃で保存し
た。
て、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄液を得
た。これらの上澄液に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを入れ、さらに２倍量のエタノールを加え、核酸混合
物を沈殿させた。該沈殿物を細いガラス棒に巻きつける
ようにして分取し、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０
ｍＭとＥＤＴＡ １ｍＭを含有する液２．５ｍｌに溶解
し、５０μｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）１０ｍｇ／ｍ
ｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。静置後、等量のク
ロロホルムを加えて良く混合した上で、６０００ｒｐｍ
で１５分間遠心し、上澄液を分取した。これらに、１０
分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを
加え混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した染色
体ＤＮＡは細いガラス棒に巻きつけるようにして分取し
た後、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭとＥＤＴ
Ａ １ｍＭを含有する液１ｍｌを加えて４℃で保存し
た。
【００２７】
【表２】
【００２８】（標識プローブＤＮＡの作製）実施例１で
得られた二種類のビブリオ・アンギュラルムの種決定オ
リゴヌクレオチドＮｏ．１およびオリゴヌクレオチドＮ
ｏ．２のそれぞれの５’側末端をγ 32Ｐ（ＮＥＮ社）に
より標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記
載、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂａｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）し、標識化合物を作製した。
得られた二種類のビブリオ・アンギュラルムの種決定オ
リゴヌクレオチドＮｏ．１およびオリゴヌクレオチドＮ
ｏ．２のそれぞれの５’側末端をγ 32Ｐ（ＮＥＮ社）に
より標識（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記
載、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂａｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）し、標識化合物を作製した。
【００２９】（ＤＮＡ−ＤＮＡ ドット ハイブリダイ
ゼーション）先に作製した被験菌の染色体ＤＮＡ液を１
００℃で５分間加熱し、氷水で急冷した後、分画したニ
トロセルロースフィルター上にそれぞれプロットし、良
く乾燥させた後、８０℃で２時間熱処理を加えた。この
様にして作製したニトロセルロースフィルターをハイブ
リダイゼーション液２０ｍｌ｛５０％（ｖ／ｖ）ホルム
アミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ−０．７５
Ｍ クエン酸ナトリウムｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤ
Ｓ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ（０．１
％ Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉ
ｄｏｎｅ−０．１％ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌ
ｂｕｍｉｎ）｝および１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理した
サケ精子５００μｌと一緒にポリ袋中に入れ、ポリ袋の
口を熱シールし、４８時間６５℃で保温した。保温後、
ニトロセルロースフィルターを取り出し、ガラス容器に
移して洗浄液（３０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．
０、０．０３ＭＮａＣｌ−０．１％ＳＤＳ）に浸し、４
２℃で１時間洗浄を３回繰返した。次に、３０ｍＭ ク
エン酸ナトリウム−０．０３Ｍ ＮａＣｌ溶液で４２℃
で１時間洗浄し、風乾した。暗室中で、乾燥したニトロ
セルロースフィルターと写真印画紙とを重ね合わせ、遮
光できる袋の中に入れ、２４時間放置した後、現像して
ハイブリダイゼーションの有無を確認した。
ゼーション）先に作製した被験菌の染色体ＤＮＡ液を１
００℃で５分間加熱し、氷水で急冷した後、分画したニ
トロセルロースフィルター上にそれぞれプロットし、良
く乾燥させた後、８０℃で２時間熱処理を加えた。この
様にして作製したニトロセルロースフィルターをハイブ
リダイゼーション液２０ｍｌ｛５０％（ｖ／ｖ）ホルム
アミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ−０．７５
Ｍ クエン酸ナトリウムｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤ
Ｓ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ（０．１
％ Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉ
ｄｏｎｅ−０．１％ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌ
ｂｕｍｉｎ）｝および１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理した
サケ精子５００μｌと一緒にポリ袋中に入れ、ポリ袋の
口を熱シールし、４８時間６５℃で保温した。保温後、
ニトロセルロースフィルターを取り出し、ガラス容器に
移して洗浄液（３０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．
０、０．０３ＭＮａＣｌ−０．１％ＳＤＳ）に浸し、４
２℃で１時間洗浄を３回繰返した。次に、３０ｍＭ ク
エン酸ナトリウム−０．０３Ｍ ＮａＣｌ溶液で４２℃
で１時間洗浄し、風乾した。暗室中で、乾燥したニトロ
セルロースフィルターと写真印画紙とを重ね合わせ、遮
光できる袋の中に入れ、２４時間放置した後、現像して
ハイブリダイゼーションの有無を確認した。
【００３０】その結果、表３に示したようにオリゴヌク
レオチドＮｏ．１およびオリゴヌクレオチドＮｏ．２共
に、ビブリオ・アンギュラルムから取り出した染色体Ｄ
ＮＡとだけハイブリダイズし、他の菌の染色体ＤＮＡと
はハイブリダイズしなかった。
レオチドＮｏ．１およびオリゴヌクレオチドＮｏ．２共
に、ビブリオ・アンギュラルムから取り出した染色体Ｄ
ＮＡとだけハイブリダイズし、他の菌の染色体ＤＮＡと
はハイブリダイズしなかった。
【００３１】
【表３】
【００３２】実施例４（ＤＮＡハイブリダイゼーション
法によるパスツレラ・ピシシーダの同定） （被験菌株のＤＮＡ液の調整）表４に示したように各種
の魚病菌の標準株および野外分離株を準備し、それぞれ
の菌種について表４に記載した培地各１０ｍｌに一夜培
養した菌液を得た。得られた培養菌液を６，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心して、上澄液を捨て、それぞれの沈殿
菌体にトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とＥＤＴＡをそれ
ぞれ５０ｍＭ含有する溶液０．５ｍｌを加えた。これら
の菌体を含む溶液を−２０℃で凍結した後、０．２５Ｍ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にリゾチーム（和光純薬
製）１０ｍｇ／ｍｌを溶解した溶液を０．２ｍｌ加え
た。
法によるパスツレラ・ピシシーダの同定） （被験菌株のＤＮＡ液の調整）表４に示したように各種
の魚病菌の標準株および野外分離株を準備し、それぞれ
の菌種について表４に記載した培地各１０ｍｌに一夜培
養した菌液を得た。得られた培養菌液を６，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心して、上澄液を捨て、それぞれの沈殿
菌体にトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とＥＤＴＡをそれ
ぞれ５０ｍＭ含有する溶液０．５ｍｌを加えた。これら
の菌体を含む溶液を−２０℃で凍結した後、０．２５Ｍ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にリゾチーム（和光純薬
製）１０ｍｇ／ｍｌを溶解した溶液を０．２ｍｌ加え
た。
【００３３】これらを室温に放置して解凍した後、氷冷
下で４５分間反応させた。次にＳＴＥＰ溶液（プロテナ
ーゼＫ １ｍｇ／ｍｌ，０．５％ ＳＤＳ，５０ｍＭト
リス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．４ＭＥＤＴＡ）を
０．４ｍｌ加え、時々撹拌しながら５０℃で６０分間反
応させた。反応後、ＴＥフェノール２．４ｍｌを加え
て、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄液を得
た。これらの上澄液に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを入れ、さらに２倍量のエタノールを加え、核酸混合
物を沈殿させた。該沈殿物を細いガラス棒に巻きつける
ようにして分取し、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０
ｍＭとＥＤＴＡ １ｍＭを含有する液２．５ｍｌに溶解
し、５０μｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）１０ｍｇ／ｍ
ｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。静置後、等量のク
ロロホルムを加えて良く混合した上で、６，０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心し、上澄液を分取した。これらに、１
０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノール
を加え混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した染
色体ＤＮＡは細いガラス棒に巻きつけるようにして分取
した後、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭとＥＤ
ＴＡ １ｍＭを含有する液１ｍｌを加えて４℃で保存し
た。
下で４５分間反応させた。次にＳＴＥＰ溶液（プロテナ
ーゼＫ １ｍｇ／ｍｌ，０．５％ ＳＤＳ，５０ｍＭト
リス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．４ＭＥＤＴＡ）を
０．４ｍｌ加え、時々撹拌しながら５０℃で６０分間反
応させた。反応後、ＴＥフェノール２．４ｍｌを加え
て、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上澄液を得
た。これらの上澄液に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを入れ、さらに２倍量のエタノールを加え、核酸混合
物を沈殿させた。該沈殿物を細いガラス棒に巻きつける
ようにして分取し、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０
ｍＭとＥＤＴＡ １ｍＭを含有する液２．５ｍｌに溶解
し、５０μｌのＲＮａｓｅ（シグマ社製）１０ｍｇ／ｍ
ｌ溶液を加え、４℃で一晩静置した。静置後、等量のク
ロロホルムを加えて良く混合した上で、６，０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心し、上澄液を分取した。これらに、１
０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノール
を加え混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した染
色体ＤＮＡは細いガラス棒に巻きつけるようにして分取
した後、トリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭとＥＤ
ＴＡ １ｍＭを含有する液１ｍｌを加えて４℃で保存し
た。
【００３４】
【表４】
【００３５】（標識プローブＤＮＡの作製）実施例２で
得られた三種類のパスツレラ・ピスシシーダの種決定オ
リゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌクレオチドＮｏ．
４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５のそれぞれの５’
側末端をγ32Ｐ（ＮＥＮ社）により標識（前出）し、標
識化合物を作製した。 （ＤＮＡ−ＤＮＡ ドット ハイブリダイゼーション）
先に作製した被験菌の染色体ＤＮＡ液を１００℃で５分
間加熱し、氷水で急冷した後、分画したニトロセルロー
スフィルター上にそれぞれプロットし、良く乾燥させた
後、８０℃で２時間熱処理を加えた。
得られた三種類のパスツレラ・ピスシシーダの種決定オ
リゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌクレオチドＮｏ．
４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５のそれぞれの５’
側末端をγ32Ｐ（ＮＥＮ社）により標識（前出）し、標
識化合物を作製した。 （ＤＮＡ−ＤＮＡ ドット ハイブリダイゼーション）
先に作製した被験菌の染色体ＤＮＡ液を１００℃で５分
間加熱し、氷水で急冷した後、分画したニトロセルロー
スフィルター上にそれぞれプロットし、良く乾燥させた
後、８０℃で２時間熱処理を加えた。
【００３６】この様にして作製したニトロセルロースフ
ィルターをハイブリダイゼーション液２０ｍｌ｛５０％
（ｖ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａ
Ｃｌ−０．７５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０）、
０．１％ＳＤＳ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ（０．１％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒ
ｒｏｌｉｄｏｎｅ−０．１％Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
ａｌｂｕｍｉｎ）および１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理
したサケ精子５００μｌと一緒にポリ袋中に入れ、ポリ
袋の口を熱シールし、４８時間６５℃で保温した。保温
後、ニトロセルロースフィルターを取り出し、ガラス容
器に移して洗浄液（３０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ
７．０、０．０３ＭＮａＣｌ−０．１％ＳＤＳ）に浸
し、４２℃で１時間洗浄を３回繰返した。次に、３０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム−０．０３ＭＮａＣｌで４２℃で
１時間洗浄し、風乾した。
ィルターをハイブリダイゼーション液２０ｍｌ｛５０％
（ｖ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭＮａ
Ｃｌ−０．７５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０）、
０．１％ＳＤＳ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ（０．１％Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒ
ｒｏｌｉｄｏｎｅ−０．１％Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
ａｌｂｕｍｉｎ）および１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理
したサケ精子５００μｌと一緒にポリ袋中に入れ、ポリ
袋の口を熱シールし、４８時間６５℃で保温した。保温
後、ニトロセルロースフィルターを取り出し、ガラス容
器に移して洗浄液（３０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ
７．０、０．０３ＭＮａＣｌ−０．１％ＳＤＳ）に浸
し、４２℃で１時間洗浄を３回繰返した。次に、３０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム−０．０３ＭＮａＣｌで４２℃で
１時間洗浄し、風乾した。
【００３７】暗室中で、乾燥したニトロセルロースフィ
ルターとＸ線フィルムとを重ね合わせ、遮光できる袋の
中に入れ、２４時間放置した後、現像してハイブリダイ
ゼーションの有無を確認した。その結果、表５に示した
ようにオリゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌクレオチ
ドＮｏ．４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５共に、パ
スツレラ・ピスシシーダから取り出した染色体ＤＮＡと
だけハイブリダイズし、他の菌の染色体ＤＮＡとはハイ
ブリダイズしなかった。
ルターとＸ線フィルムとを重ね合わせ、遮光できる袋の
中に入れ、２４時間放置した後、現像してハイブリダイ
ゼーションの有無を確認した。その結果、表５に示した
ようにオリゴヌクレオチドＮｏ．３，オリゴヌクレオチ
ドＮｏ．４およびオリゴヌクレオチドＮｏ．５共に、パ
スツレラ・ピスシシーダから取り出した染色体ＤＮＡと
だけハイブリダイズし、他の菌の染色体ＤＮＡとはハイ
ブリダイズしなかった。
【００３８】
【表５】
【００３９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 オリゴヌクレオチドＮｏｓ１−５のポリアク
リアミドゲル電気泳動の結果を、ｐＢＲ３２２を制限酵
素ＨｐａＩＩで切断したものを指標にして示したもので
ある。
リアミドゲル電気泳動の結果を、ｐＢＲ３２２を制限酵
素ＨｐａＩＩで切断したものを指標にして示したもので
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/04,1/68 G01N 33/53,33/566,33/569 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 次のような塩基配列からなるパスツレラ
・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチド：GCACTACGAA
TGTGAAAACCC,GGTGACACATCGACTACTGCAまたはCTTGTGGAGTA
ATGCTGACAG
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9030069A JP2770827B2 (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9030069A JP2770827B2 (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチド |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1072773A Division JP2653164B2 (ja) | 1989-03-24 | 1989-03-24 | ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09322782A JPH09322782A (ja) | 1997-12-16 |
| JP2770827B2 true JP2770827B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=12293532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9030069A Expired - Lifetime JP2770827B2 (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | パスツレラ・ピシシーダの種決定オリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2770827B2 (ja) |
-
1997
- 1997-02-14 JP JP9030069A patent/JP2770827B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09322782A (ja) | 1997-12-16 |
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