JP2763278B2 - Ｄｎａ分子索引法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌その他の疾病の
診断、医薬品となる可能性がある生理活性物質の遺伝
子、遺伝病の原因遺伝子の探索・単離、農作物の改良に
役立つ遺伝子の単離等に適用できるＤＮＡ分子索引法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、二種類の組織の遺伝子発現の
差をみるのに、任意の短いプライマーで、発現している
遺伝子集団の一部（約50-200個）をＰＣＲ（= Polymera
se Chain Reaction)法で増幅し、ポリアクリルアミド電
気泳動で分離することが記載される [P. Liang & A. B.
Pardee, Differential display of eukaryotic messen
ger RNA by means of the polymerase chain reactio
n., Science 257 : 967-971 (1992)]。しかしながら、
このようなＰＣＲ法によるDifferential displayでは、
原理的に全遺伝子集団の中で一部分しか増幅されず、ま
た同一の遺伝子から複数のバンドが出る。その上アーチ
ファクトが多く、技術的に未完成である。そのため、か
け離れていない二つの組織または細胞の遺伝子発現の差
しかみられず、個々の遺伝子の発現を記録することはで
きないという問題がある。

【０００３】さらに、組織や細胞における特定の遺伝子
の発現量を、ｍＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイ
ゼーション法によって測定することにより、組織や細胞
中の変異を解析することできるが、本方法においても目
的とする遺伝子がクローン化されていないもの、塩基配
列が不明のものには使用できず、また大量の遺伝子の検
査には不向きであった。例えばある細胞で発現している
遺伝子は、約10,000種類と考えられているので、ノーザ
ンブロットハイブリダイゼーション法を１週間に100 個
の遺伝子に対して行うとしても、約２年かかることにな
り、実用に供するものではない。

【０００４】一方、Class IIS に属する制限酵素（以
下、Class IIS 制限酵素) は、認識部位とは離れた部位
を切断する機能を有する制限酵素であり、切断断片は一
定の配列ではない数個の塩基の付着末端を有することを
特徴としている。Class IIS 制限酵素には、これまでFo
k I, Bsm FI, Bsm AI, Bbv I, Sfa NI, Hga I 等の30種
類以上が知られている。Fok I, Bsm FI,またはBsm AIの
切断部位を持つ遺伝子は、全体の97% と推定されてい
る。Brenner らは、高等動物の染色体の制限酵素地図を
つくる際、認識部位と切断部位が一致する通常の制限酵
素に加えてClass IIS 制限酵素でできる４塩基の配列を
利用してより複雑なゲノムの地図をつくる方法を紹介し
ている〔S. Brenner & K. J. Livak, DNA fingerprinti
ng by sampled sequencing., Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A., 86 ： 8902-6 (1989)] 。また、Class IIS
制限酵素でできる４塩基付着末端に相補的なアダプター
を使ってファージまたはコスミド由来の一部分の制限酵
素断片を増幅する方法がある [D. R. Smith, Ligation-
mediated PCR of restriction fragments from large D
NA molecules., PCR Methods Appl. 2: 21-27 (1992)
、Unrau, P. and Deugau, K. V., Gene, 145, 163-169
(1994)] 。しかしながら、これらはいずれもClass IIS
の制限酵素を、その切断によりできる４塩基末端を利
用してゲノムの構造解析の手段として使用しているもの
の、本願発明のように、特定の組織または細胞の遺伝子
発現の記録を目的としているのではない。

【０００５】ヒトゲノム計画では、組織由来のｃＤＮＡ
の断片をとり、その部分配列を決定するとともにその染
色体上の位置を決定していくアプローチが現在盛んに論
議されている。従来の方法では、ｃＤＮＡの断片をｃＤ
ＮＡライブラリーより無作為に抽出しているが、これで
は同一のものを何度もサンプリングする事は避けられ
ず、発現量の多いものを選択的に拾う傾向がある。

【０００６】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、組
織や細胞における遺伝子の発現状況あるいは変異による
欠損を大量の遺伝子について短期間にしかも簡便に分析
できる方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を達成するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 Class IIS制限酵
素を利用して、ＲＮＡを短期間にかつ重複なくサブ集団
に分類（索引）できることを見出し、本発明を完成し
た。

【０００８】すなわち、本発明は、(1) 組織または細
胞由来のＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡをClass IIS 制
限酵素にて切断し、(2) 切断断片の付着末端に対応す
る配列を含むビオチニル化アダプターを上記ｃＤＮＡに
ライゲートし、(3) (1) で使用したものとは異なる他
の２種のClass IIS 制限酵素にてさらに上記ｃＤＮＡを
切断し、(4) (3) の他の２種のClass IIS 制限酵素を
それぞれ最初の切断に用いて、上記(1) 〜(3) を繰り返
し、

【０００９】(5) ストレプトアビジン被覆常磁気ビー
ズでライゲートサンプルを回収後、ライゲートサンプル
よりビオチニル化アダプターに相補なオリゴヌクレオチ
ドを除去し、(6) アダプター−プライマーとアンカー
オリゴ（ｄＴ）プライマーとを用いて上記ｃＤＮＡをＰ
ＣＲ法にて増幅し、(7) 増幅産物を変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって分離し、断片のサイズを記
録することを含むＤＮＡ分子索引法である。

【００１０】本発明の方法、ならびに作用、効果を図１
に基づき説明する。 (1) まず、細胞または組織の全ＲＮＡを逆転写酵素にて
ｃＤＮＡに転換し、該ｃＤＮＡを Class IIS制限酵素を
用いて切断する。 (2) ５’突出付着末端になる４つのヌクレオチドの最外
側の塩基が、Ａ，Ｃ，Ｇ，およびＴの混合物でその内側
３塩基はすべての可能な配列（64種類) であるオリゴヌ
クレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的でかつ４
塩基短い、５’末端がビオチニル化されたオリゴヌクレ
オチドからなるアダプター（当該アダプターは、突出付
着末端を形成する側の５’端がリン酸化されていてはな
らない）のうちの一つをE.coli DNAリガーゼを用いて上
記のｃＤＮＡにライゲートする。ここで切断断片が64個
のサブ集団に分類される。

【００１１】(3) 次に、ｃＤＮＡを(1) で用いたものと
は別の２種のClass IIS 制限酵素にてさらに切断する。 (4) (3) の他の２種のClass IIS 制限酵素をそれぞれ最
初の切断に用いて、上記(1) 〜(3) を繰り返す。以上の
３種のClass IIS 制限酵素による切断でpolyAを失った
もの [図１、(4) (i) ] 、polyA サイドから最も近い部
位に切断部位があり、polyA を有するもの[ 図１、(4)
(ii)] ができる。これらのうち、前者のpolyA を失った
もの [図１、(4) (i) ] はその後の増幅工程で増幅され
ず、後者のpolyA を有するもの[ 図１、(4) (ii)] のみ
が増幅される。従って、ここでpolyA サイドから一番近
い切断部位が３種のClass IIS 制限酵素のいずれである
かによって、さらに64×3 = 192 個のサブ集団に分類さ
れる。

【００１２】(5) 続いてライゲーションサンプルをスト
レプトアビジンでコートした常磁性ビーズで回収し、ｃ
ＤＮＡを希アルカリ溶液で処理する。本操作により、Ｐ
ＣＲ反応に対するインヒビターとなるアダプター−プラ
イマーに相補的なオリゴヌクレオチドが除去される。 (6) ＰＣＲ増幅を、アダプタープライマーとアンカーオ
リゴ（ｄＴ）プライマーである（ｄＴ）₂₅Ａ、（ｄＴ）
₂₅Ｃ、及び（ｄＴ）₂₅Ｇのいずれか一つとを用いて上記
ｃＤＮＡに対して行う。ここでpoly(A) テイルに隣接し
た塩基（T, C,G）により、上記の3 種のオリゴ（ｄＴ）
プライマーで増幅されるものが決まり、さらに192 ×3
= 576 個のサブ集団に分類される。

【００１３】(7) 増幅産物を変性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分離し、断片のサイズをシーケンサ
ーで自動的に記録する。 以上の操作は、64種のアダプター、３種のClass IIS 制
限酵素、そして３種ののアンカーオリゴ（ｄＴ）を用い
て繰り返すので、ＲＮＡ集団は、576 個のサブ集団に分
けられる。Class IIS 制限酵素のうち、Fok I ，Bsm AI
またはBsm FIの切断部位を持つ遺伝子は、全体の97% と
推定されており、これらを本方法に用いれば、全ＲＮＡ
集団のほとんどが回収され、重複なく表示されることが
原理的に可能である。

【００１４】また、上記(2) の工程で５’突出付着末端
になる４つのヌクレオチドがＡ，Ｃ，Ｇ，およびＴの可
能な配列（256 種類) であるオリゴヌクレオチドと、該
オリゴヌクレオチドと相補で、かつ４塩基短い、５’末
端がビオチニル化した相補的なオリゴヌクレオチドから
成るアダプターを用い、上記(4) の２回目のClass IIS
制限酵素による切断を行わない以外は、同様な操作を行
う別法にても行うことができる。

【００１５】この別法においては、256 種のアダプタ
ー、３種のアンカーオリゴ（ｄＴ）を用いて繰り返すの
で、ＲＮＡ集団は、768 個のサブ集団に分けられる。さ
らに、本発明は、細胞または組織の全ＲＮＡを逆転写酵
素にてｃＤＮＡに転換する際に、下記式： ５’ＯＨ−ＧＧＡＴＣＣＴ₁₆Ａ−３’ ５’ＯＨ−ＣＡＧＣＴＧＴ₁₆Ｃ−３’ ５’ＯＨ−ＣＴＣＧＡＧＴ₁₆Ｇ−３’ でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドの混合物をプラ
イマーとして用いてもよい。

【００１６】上記手法により、ｃＤＮＡのpoly(A) 側に
poly(A) の一つ内側（５’側）の塩基がＴ，Ｇ，Ｃのい
ずれかであり、poly(A) の外側（３’側）に６塩基配列
が付加されたｃＤＮＡを得ることができる（図２）。こ
の場合、ＰＣＲ増幅を、上記アンカーオリゴ（ｄＴ）プ
ライマーである（ｄＴ）₂₅Ａの代わりに５’ＯＨ−ＧＧ
ＡＴＣＣＴ₁₆Ａ−３’、（ｄＴ）₂₅Ｃの代わりに５’Ｏ
Ｈ−ＣＡＧＣＴＧＴ₁₆Ｃ−３’、（ｄＴ）₂₅Ｇの代わり
に ５’ＯＨ−ＣＴＣＧＡＧＴ₁₆Ｇ−３’のいずれか一
つを用いて行う。この方法によれば、プライマーの３’
端の１塩基のみによるｃＤＮＡに対する特異性に加え
て、プライマーの５’端の６塩基によるｃＤＮＡに対す
る特異性を決めるためより分析がより正確となる。

【００１７】本発明の分析対象となるＲＮＡは、例えば
骨髄、末梢血、リンパ球等の造血組織等の体組織または
体液中の細胞からグアニジンチオシアネート法、フェノ
ール−クロロホルム抽出法等の常套的な方法により単離
精製され、逆転写酵素およびデオキシリボヌクレオシド
トリホスフェート類と共にインキュベートすることによ
ってｃＤＮＡに逆転写される。

【００１８】本発明に用いるClass IIS 制限酵素として
は、４塩基の５’突出付着末端を形成するものあれば、
特に限定されないが、具体的には市販のFok I 〔宝酒造
製〕, Bsm AI, Bsm FI〔バイオラボ製〕が挙げられ、最
初の切断（１種）と２回目の切断（２種）において、こ
れらを組み合わせて用いればよい。また、別法において
はこれらのいずれか１種を用いればよい。

【００１９】本発明において Class IIS 制限酵素の切
断断片の付着末端に対応する配列を含むビオチニル化ア
ダプターとは、５’突出付着末端になる４つのヌクレオ
チドの最外側の塩基が、Ａ，Ｃ，Ｇ，およびＴの混合物
で、その内側３塩基がすべての可能な配列（64種類) で
ある24〜27個のオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレ
オチドと相補的でかつ４塩基短く、５’末端がビオチニ
ル化されたオリゴヌクレオチドからなるものをいう。

【００２０】また、別法におけるビオチニル化アダプタ
ーとは、５’突出付着末端になる４つのヌクレオチド塩
基がとりうるすべての配列（256 種類) である24〜27個
のオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補
的で、かつ４塩基短く、５’末端がビオチニル化された
ものをいう。上記アダプターは、結合部位に隣接したｃ
ＤＮＡの３塩基を大腸菌ＤＮＡリガーゼに識別させるた
めに、突出付着末端を形成する側の５’端のリン酸化は
行わない。

【００２１】本発明においてＰＣＲに用いる２つのプラ
イマーの一つは、上記のアダプターと同じ配列を持つか
もしくはその一部の配列を持つオリゴヌクレオチドであ
る（＝アダプタープライマー）。該アダプタープライマ
ーを標識するマーカーとしては、常法の分析において使
用するものが用いられ、例えば蛍光色素、放射性物質、
酵素等を挙げることができる。

【００２２】本発明においてＰＣＲに用いるもう一つの
プライマーは、オリゴpoly(A) テイルに隣接した塩基
が、T, C, あるいはG である3 種のオリゴ（ｄＴ）プラ
イマーである。これらは、市販の核酸合成機を用いて合
成することもできる。本発明のＤＮＡ分子索引法を用い
て診断できる可能性のある対象としては、例えば脳腫
瘍、胃癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、子宮癌、皮膚癌、前
立腺癌、悪性黒色腫等の悪性腫瘍疾患、ヘルペス群感染
症、慢性肝炎、サイトメガロウイルス感染症、後天性免
疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等のウイルス感染症、糖尿
病、高血圧症等多因子遺伝疾患等が挙げられる。

【００２３】

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説
明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本
発明の範囲を限定するものではない。 〔実施例１〕 ｃＤＮＡの調製 (1) 超遠心によるRNAの精製 ドライアイスまたは液体窒素中で凍結乾燥させたマウス
の肝臓をホモジナイザーを用いて粉砕した。室温にて粉
砕物に５倍量のGuCNS 溶液を加え、ボルテックスを用い
て攪拌し、10mlポリアロマーチューブに5.7M CsCl/0.1M
EDTA 溶液 3.5mlを加え、その上にサンプル6mlを重層
した。ベックマンL70 を用い、15℃、32000rpmにて一晩
遠心した。

【００２４】(2) 超遠心後のRNAの回収 ローターからチューブを取り出し、すべての上清を捨
て、チューブ管壁をぬぐい乾かした後、TE緩衝液300 μ
l に沈殿を溶解した。

【００２５】(3) エタノール沈殿 水層に1/10量の3M 酢酸カリウム(pH5.0) を加え、静か
に混合して氷中に置き、2.5 倍量の氷冷100%エタノール
を加え、静かに混合した。−80℃にて数時間放置し、４
℃にて５分間遠心してＲＮＡを沈殿させ、エタノールを
捨てた。ＲＮＡの沈殿を氷冷70% エタノールにて洗浄
し、再度遠心して沈殿させ、エタノールを除去後、沈殿
ＲＮＡを乾燥させた。このとき、組織細胞１ｇあたり約
100μl の滅菌蒸留水に沈殿を溶解し、ＲＮＡ溶液とし
た（ＲＮＡ濃度＝約 5μg/μl)。

【００２６】(4) cDNA templeteの調製 (4-1) 一本鎖cDNAの調製 まず、ＲＮＡとオリゴ(dT)プライマーのみで、70℃で2
〜3 分加熱、その後他の試薬を加えて37℃で１時間保温
し、cDNAを合成した。 ＊反応液の組成 5 ×逆転写酵素緩衝液 (ギブコ-BRL製) 4μl 2mM dNTP（ファルマシア製） 4μl 0.1M DTT 2μl 10 pmol/μl 5'-amino (dT)₁₈ 1μl 全 RNA (3 μg)及び蒸留水 7.5μl RNase インヒビター^*1) (40 u/μl)（東洋紡製) 0.5μl 200 u/μl M-MLV 逆転写酵素酵素 ^*2) （ギブコ-BRL製) 1μl ^*1) ヒト胎盤由来 ^*2) Molony Murine Leukemia Virus (モロニーマウス白血球ウイルス)

【００２７】(4-2) 二本鎖cDNA合成 下記の反応液を、そのまま一本鎖cDNA反応液に加え、16
℃で２時間保ち、二本鎖cDNAとした。反応終了後0.25M
EDTA (pH 7.5) 3μl 、5 M NaCl 2μl を加えた後、フ
ェノール抽出、エタノール沈殿を行い、蒸留水 240μl
に溶かした。 ＊反応液の組成 10 mM MgCl₂ 70μl 1 M Tris-Cl (pH 7.5) 10μl 1 M (NH₄)₂SO₄ 1.5μl RNase H (東洋紡製) (1 u/μl) 1.5μl E. coli DNA ポリメラーゼI (東洋紡製) (10 u/μl) 4.5μl

【００２８】〔実施例２〕 ＤＮＡ分子索引法による分
析 (1) Class IIS制限酵素による切断（１回目） ｃＤＮＡを下記の反応液（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかで所
定の条件下保温することにより、制限酵素による切断を
行った。 ＊反応液（Ａ）の組成（Fok I） 10×M buffer 10μl 0.1 % BSA （宝酒造製) 10μl cDNAサンプル 80μl Fok I (宝酒造製) (10 u/μl) 0.5μl 37℃で50分ないし１時間保温 ＊反応液（Ｂ）の組成（Bsm AI） 10× buffer for Bsm AI (NEB) 10μl 0.1 % BSA 10μl cDNAサンプル 80μl Bsm AI (バイオラボ製) (5 u/μl) 1μl 55℃で50分ないし１時間保温 ＊反応液（Ｃ）の組成（Bsm FI） 10× H buffer 10μl 蒸留水 10μl cDNAサンプル 80μl Bsm FI (バイオラボ製) (5 u/μl) 1μl 65℃で50分ないし１時間保温

【００２９】(2)アダプターの付加 (1)で処理したｃＤＮＡに下記の配列からなるアダプタ
ー： C1T アダプター: 5'-B-GTACATATTGTCGTTAGAACGCT-3' 5'-NXYZAGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' または、 C1G アダプター: 5'-B-GTACATATTGTCGTTAGAACGCG-3' 5'-NXYZCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' 〔式中、B はビオチン、N は４種の塩基のミックス、XY
Z はとり得る64通りの配列のいずれかをそれぞれ表す。
Y およびZ がA またはT の場合、C1G アダプター、その
他の場合C1T アダプターを使用。〕を、下記の反応液中
で16℃で一晩保温することにより、結合させた。

【００３０】＊ 反応液の組成 10×E. coli DNA リガーゼバッファー 1μl 100 mM (NH₄)₂SO₄ 1μl 1 pmol/μl アダプター溶液 1 μl Class IIS 切断cDNA 1μl E. coli DNA リガーゼ 3 units 蒸留水で 10μl に調製する。(XYZの配列に、GとCを含
まない場合、 5 pmol/μl アダプター溶液、30 units
E. coli DNAリガーゼを使用)

【００３１】(3) Class IIS制限酵素による切断（２回
目） ｃＤＮＡを下記の条件下保温することにより、制限酵素
による切断を行った。 Fok I で切断したDNAを使った場合 蒸留水40μl 、10× H buffer 5 μl 添加 Bsm FI 1 unit 添加、 65 ℃, 50分保温 Bsm AI 1 unit 添加、 55 ℃, 50分保温 Bsm AIで切断したDNAを使った場合 蒸留水40μl 、10×T buffer 5μl 添加 Fok I 1 unit 添加、 37 ℃, 50分保温 Bsm FI 1 unit 添加、 65 ℃, 50分保温 Bsm FIで切断したDNAを使った場合 蒸留水40μl 、10× M buffer 5 μl 添加 Fok I 1 unit 添加、37℃_, 50分保温 Bsm AI 1 unit、 4 M NaCl 1 μl 添加、 55℃, 50分
保温 それぞれ反応終了後0.25M EDTA (pH 7.5) 3μl 、5 M N
aCl 2μl を加えた後、フェノール抽出、エタノール沈
殿を行い、蒸留水70μl に溶かした。

【００３２】(4) PCR による増幅 (4-1) 常磁性ビーズによるアダプター分子の回収 使用直前にストレプトアビジン被覆常磁性ビーズを、PB
S 0.1% BSA で２回、1×B&W buffer (10 mM Tris-Cl p
H 7.5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA) で１回洗浄し、等量の 1
×B&W bufferに懸濁した。サンプルに、5 M NaCl 15 μ
l, 常磁性ビーズ5 μl を添加し、15分間静置した後、
1 ×B&W bufferで一回洗浄した。次に、0.1 M NaOH 10
μl を加え、5 分間静置した後、0.1 M NaOH 50 μl で
１回、1 ×B&W bufferで１回、さらに蒸留水で２回洗浄
した。

【００３３】(4-2) PCR反応 下記の組成からなる反応液をエッペンドルフチューブに
入れ、96℃で１分温め、反応が迅速に開始するようにし
た。次に、94℃にて30秒、 50 ℃にて１分、72℃１分の
熱サイクルを25 - 35 回繰り返し、72℃にて20分間の伸
長工程後、反応液を室温まで冷却した。

【００３４】 ＊反応液の組成（１サンプルあたり） 酵素反応液 10× PCR buffer for Stoffel fragment 1μl 2 mM dNTP 1μl 25 mM MgCl₂ 1.2μl 蒸留水 4.3μl 10 u/ μl Stoffel fragment ^*1) 0.05μl ^*1) AmpliTaq DNA ポリメラーゼfragmentの一部 （パーキンエルマー製） プライマー反応液 10 pmol/μl fluorescent-C1T 0.5μl 10 pmol/μl d(T)₂₅A [or d(T)₂₅C, d(T)₂₅G] 2 μl

【００３５】プライマーは、JOE-C1T とd(T)₂₅A, FAM-C
1Tとd(T)₂₅C, TAMRA-C1Tとd(T)₂₅Gの組み合わせで用い
る [JOE: 2',7'-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyf
luorescein, FAM: 5'-carboxyfluorescein, TAMRA: 6-c
arboxy-tetramethyl rhodamine (いずれもパーキンエル
マー製、 C1T の配列 : d(GTACATATTGTCGTTAGAACGC
T)]。

【００３６】または、アダプターとして、C1G アダプタ
ーを使用した場合は、 10 pmol/μl fluorescent-C1G 0.5μl 10 pmol/μl d(T)₂₅A [or d(T)₂₅C, d(T)₂₅G] 2 μl プライマーは、JOE-C1G とd(T)₂₅A, FAM-C1Tとd(T)₂₅C,
TAMRA-C1Gとd(T)₂₅Gの組み合わせで用いる [JOE: 2',
7'-dimethoxy-4',5'-dichloro-6-carboxyfluorescein,
FAM: 5'-carboxyfluorescein, TAMRA: 6-carboxy-tetra
methyl rhodamine (いずれもパーキンエルマー製、 C1G
の配列 : d(GTACATATTGTCGTTAGAACGCG)]。

【００３７】(4-3) 電気泳動用サンプルの調製 各反応物、FAM-C1と d(T)₂₅Cより1 μl 、JOE-C1とd(T)
₂₅A 及びTAMRA-C1とd(T)₂₅G より3 μl とり、下記の組
成から成るT4 DPase solution 5 μl を加え、37℃40分
反応させた。 ＊ T4 DPase solution の組成（１サンプルあたり） 10 ×M buffer 0.5μl 2 mM dNTP 0.5μl 蒸留水 4μl T4 DNA ポリメラーゼ (東洋紡製) 1 unit

【００３８】反応液をエタノール沈殿した後、試料（沈
殿物）に3.5 μl の緩衝液（80% ホルムアルデヒド10mM
EDTA 6mg/mlブルーデキストラン) を加え、4 分間 95
℃で加熱し、試料溝にすばやく加え、ABI 373A (パーキ
ンエルマー製) を用いて電気泳動を行った（30W 定電力
で 13 時間）。図３に得られた電気泳動パターンの一例
を示す。

【００３９】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ＤＮＡのサブ集
団数が少なくてすむので、Class IIS制限酵素の切断部
位を持つ遺伝子（全体の97% と推定される）の組織にお
ける発現状況を一人１〜２週間の実験で調べることが可
能である。また、本発明の方法によれば、一つの遺伝子
から増幅される遺伝子の断片が、原理的には一つだけで
あるため、遺伝子を重複なくサブ集団に分類（索引）す
ることができる。よって、本発明の方法を用いて、検体
の細胞や組織に発現している遺伝子の分析パターンを正
常な遺伝子の分析パターンと比較することにより、腫瘍
などの変異を容易に正確かつ迅速に診断することができ
る。また、医薬品となる可能性がある生理活性物質の遺
伝子、遺伝病の原因遺伝子の探索ならびに単離、農作物
の改良に役立つ遺伝子の単離等にも応用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法の原理説明図を示す。

【図２】３つのオリゴヌクレオチドの混合物をプライマ
ーとしてＲＮＡを逆転写することにより合成されたｃＤ
ＮＡの構造を示す。

【図３】本発明方法により得られたマウス肝臓ＲＮＡの
ポリアクリルアミド電気泳動パターンの一例を示す。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の工程： (1) 組織または細胞由来のＲＮＡから逆転写したｃＤ
   ＮＡをClass IIS 制限酵素にて切断し、(2) 切断断片
   の付着末端に対応する配列を含むビオチニル化アダプタ
   ーを上記ｃＤＮＡにライゲートし、(3) (1) で使用し
   たものとは異なる他の２種のClass IIS 制限酵素にてさ
   らに上記ｃＤＮＡを切断し、(4) (3) の他の２種のCla
   ss IIS 制限酵素をそれぞれ最初の切断に用いて、(1)
   〜(3) を繰り返し、(5) ストレプトアビジン被覆常磁
   気ビーズでライゲートサンプルを回収後、ライゲートサ
   ンプルよりビオチニル化アダプターに相補なオリゴヌク
   レオチドを除去し、(6) アダプター−プライマーとア
   ンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーとを用いて上記ｃＤＮ
   ＡをＰＣＲ法にて増幅し、(7) 増幅産物を変性ポリア
   クリルアミドゲル電気泳動によって分離し、断片のサイ
   ズを記録することを含むＤＮＡ分子索引法。
2. 【請求項２】 Class IIS 制限酵素が、Fok I, Bsm AI,
   Bsm FI の組み合わせで使用される請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 ｃＤＮＡが、組織または細胞由来のＲＮ
   Ａを、 ５’ＯＨ−ＧＧＡＴＣＣＴ₁₆Ａ−３’ ５’ＯＨ−ＣＡＧＣＴＧＴ₁₆Ｃ−３’ ５’ＯＨ−ＣＴＣＧＡＧＴ₁₆Ｇ−３’ でそれぞれ表されるオリゴヌクレオチドの混合物をプラ
   イマーとして逆転写することにより合成されたものであ
   ることを特徴とする請求項１記載の方法。