JP2714633B2

JP2714633B2 - リポソーム形成剤及びリポソーム組成物

Info

Publication number: JP2714633B2
Application number: JP26102789A
Authority: JP
Inventors: 佳子千川; 隆司伊藤; 光晴増田; 富裕黒崎; 純孝国生
Original assignee: Kao Corp; Meito Sangyo KK
Current assignee: Kao Corp; Meito Sangyo KK
Priority date: 1989-10-05
Filing date: 1989-10-05
Publication date: 1998-02-16
Anticipated expiration: 2013-02-16
Also published as: JPH03123637A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なリポソーム形成剤及びリポソーム組成
物に関し、更に詳しくは、微細で安定なリポソームを形
成する新規リポソーム形成剤及び容易にこれを形成する
ことができる新規なリポソーム組成物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

脂質二重膜の一重あるいは多重の球殻からなるリポソ
ームは、薬効成分のキャリアーとして注目されている。
リポソームを薬物担体として用い、静脈注射等により生
体への投与を目的とするとき、リポソームの粒径は小さ
い方が望ましいことが多い。リポソーム形成剤としては
天然リン脂質がよく知られているが、通常、天然リン脂
質を水に投入しただけでは粒径の大きな（直径１〜５μ
ｍ）多重膜リポソームを形成し、均一で粒径が小さく安
定なリポソーム分散液を得ることはできない。

従来知られている粒径の小さなリポソームの製造法と
しては、超音波処理による方法、界面活性剤との混合系
から透析などにより界面活性剤を除去する方法、脂質の
エタノール溶液を水中に注入する方法、逆ミセル法など
がある。これらの方法は、例えば、エル・エス・ラオ
（L.S.Rao）『リポソーム・テクノロジー（Liposome Te
chonlogy）』、ジー・グレゴリアデイス（G.Gregoriadi
s）編、CRC Press、Florida、（1984）、第１巻、18
章、247−257にまとめられている。しかし、超音波照射
法、界面活性剤除去法及び逆ミセル法による小さなリポ
ソームの製造法は、実験室レベルでの調製法にすぎず、
工業的大量生産には適さない。また、脂質のエタノール
溶液を水中に注入する方法では、低濃度のリポソームし
か得られないと共に、長期間保存しておくと元の大きな
多重膜リポソームに戻ってしまうなどの問題があった。

かかる問題点を解決するための種々の研究がなされ、
例えば、ニンハム（Ninham）及びエバンス（Evans）、
〔ファラデー・ディスカス・ケミカル・ソサイティー
（Faraday Discuss Chem.Soc.）、81:1（1986）〕に
は、水酸イオンあるいは酢酸イオンを対イオンとして有
するジドデシルジメチルアンモニウムカチオンが、半径
約30nmの小さなリポソームを形成することが報告されて
いる。しかし、この方法では小さなリポソームを形成す
るために必要なリポソーム形成剤の濃度が狭い範囲に限
られている。しかも、リポソーム形成物質がカチオン性
界面活性剤であるので、生体への投与には適さないもの
であった。

従って、粒径が小さく、安定で、しかも人体に対して
安全なリポソームを工業的有利に大量生産する方法が望
まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、このような状況において鋭意検討を重
ねた結果、特定のリン脂質と多価アルコールとの反応混
合物を使用することにより水に分散させただけで粒径が
小さく、しかも安定なリポソームを形成するリポソーム
形成剤を得ることに成功し、本発明を完成したものであ
る。

すなわち、本発明は、（ａ）ホスホリパーゼＤの存在下、次の一般式（Ｉ）
及び／又は（II）〔式（Ｉ）及び（II）中、R¹及びR²はそれぞれ、同一又
は異なって−OCOR³及び／又は−OR⁴より選ばれる基（但
し、R³及びR⁴は同一又は異なって、それぞれ炭素数６〜
32のアルキル又はアルケニル基を表す）を示すか、又は
R¹とR²が一緒になって次の基（ここで、ｎは11〜19の整数を表す）を形成してもよ
く、Ｘは水酸基含有塩基の水酸基１個を除いた後に残る
有機残基を示し、Ｍは水素原子、アルカリ金属、アルカ
リ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム又は
アルカノールアンモニウムを示す〕で表されるグリセロリン脂質と下記（１）〜（３）（１） HOＹ−Ｏ_mH〔ここでｍは２〜50の整数、Ｙ
は炭素数２〜４のアルキレン基もしくは置換アルキレン
基を示す〕で表されるモノ又はポリエーテル（２）縮合度２〜50のポリグリセリン（３）分子内に一級アルコール基２個以上を有する炭
素数４〜７の単糖類、二糖類又は糖アルコール類のいずれかの多価アルコールとを反応させて得られるリ
ン酸エステル混合物と、（ｂ）水溶性塩及び／又は界面活性剤とからなるリポ
ソーム形成剤、及びこれら形成剤を用いて形成するリポ
ソーム内に有効活性成分を包含するリポソーム組成物を
提供するものである。

本発明リポソーム形成剤に用いられるリン酸エステル
混合物（以下、リン酸エステル混合物）（ａ）は、式
（Ｉ）及び／又は（II）のグリセロリン脂質と（１）〜
（３）から選ばれる多価アルコールとを反応させて得ら
れるものであるが、式（Ｉ）、（II）中、R³、R⁴で示さ
れるアルキル基又はアルケニル基としては、例えば、ヘ
キシル、オクチル、デジシル、ドデシル、テトラデシ
ル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシル、ドコシ
ル、テトラコシル、ヘキサコシル、オクタデシル、トリ
アコンチル、ドトリアコンチル、２−エチルヘキシル、
オクタジエニル、デカジエニル、ドデカジエニル、テト
ラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、オクタデカジエ
ニル、エイコサジエニル、ドコサジエニル、テトラコサ
ジエニル、ヘキサコサジエニル、オクタコサジエニル、
トリアコンタジエニル、ドトリアコンタジエニル、ヘキ
サデカトリエニル、オクタデカトリエニル、エイコサト
リエニル、ドコサトリエニル、テトワコサトリエニル、
ヘキサコサトリエニル、オクタコサトリエニル、トリア
コンタトリエニル、ドトリアコンタトリエニル、エイコ
サテトラエニル、ドコサテトラエニル、テトラコサテト
ラエニル、ヘキサコサテトラエニル、オクタコサテトラ
エニル、トリアコンタテトラエニル、ドトリアコンタテ
トラエニル、ドコサペンタエニル、テトラコサペンタエ
ニル、ヘキサコサペンタエニル、オクタコサペンタエニ
ル、トリアコンタペンタエニル、ドトリアコンタペンタ
エニル、ドコサヘキサエニル、テトラコサベキサエニ
ル、ヘキサコサヘキサエニル、オクタコサヘキサエニ
ル、トリアコンタヘキサエニル、トドリアコンタヘキサ
エニル等が挙げられる。

また水素原子、アルカル金属、アルカル土類金属、ア
ンモニウム、アルキルアンモニウム又はアルカノールア
ンモニウムであるＭとしては、例えば、カリウム、リチ
ウム、ナトリウム、ベリリウム、マグネシウム、カルシ
ウム、ストロンチウム、バリウム、アンモニウム、トリ
エタノールアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ト
リエチルアンモニウム等が挙げられる。

一方、（１）に記載の化合物に於いてＹは置換基を有
してもよい炭素数２〜４のアルキレン基で、例えばエチ
レン、プロピレン、ブチレン、１−メチルプロピレン等
が挙げられ、ｍは２〜50の整数であるが、４〜50、特に
４〜20が好ましい。特に好ましいものとしては、例え
ば、平均分子量400のポリエチレングリコール（以下PEG
400と記す）、平均分子量600のポリエチレングリコール
（以下PE600と記す）、平均分子量200のポリプロピレン
グリコール（以下PEG200と記す）等が挙げられる。
（２）のポリグリセリンの縮合度は２〜50であるが、４
〜50特に４〜20が好ましい。特に好ましいポリグリセリ
ンとしては例えば、平均分子量500のポリグリセリン（P
EG500と記す）、平均分子量750のポリグリセリン（PG75
0と記す）等が挙げられる。また、（３）に記載の分子
内に一級アルコール基２個以上を有する、炭素数４〜７
の多価アルコール類のうち、単糖類としては、例えばキ
シルロース、リブロース、フラクトース、ソルボース、
プシコース、タガトース、セドヘプツロース、グルコヘ
プツロース、マンノヘプツロース等を例示でき、また、
二糖類としてはスクロース、マルトース、セロビオー
ス、トレハロース、ラクトース等が例示でき、また、糖
アルコールとしては、例えばエリスリトール、リビトー
ル、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マン
ニトール、ガラクチトール、セドヘプチトール、ベルセ
イトール等が例示できる。

特に好ましいリン酸エステル混合物（ａ）としては、
R¹及びR²が、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パル
ミトイル、ステアロイル、オレオイル、リノレオイル、
リノレノイル、アラキドノイル、ドコサヘキサノイル、
エイコサペンタノイル等の組み合わせからなるか、又
は、前記式（Ｉ）中、R¹、R²の組成が、例えば、卵黄組
成又は大豆組成等、天然リン脂質由来の分布を持つホス
ファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、
ホスファチジルセリン及びその塩等と、多価アルコール
として、平均分子量400のポリエチレングリコール、平
均分子量600のポリエチレングリコール、平均分子量200
のポリプロピレングリコール、平均分子量500のポリグ
リセリン、平均分子量750のポリグリセリンやフルクト
ース、サッカロース、セロビオース、ラクトース、マル
トース、リブロース、フラクトース、ソルボース、スク
ロース、エリスリトール、リビトール、アラビトール、
キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ガラクチ
トール等とをホスファチジル基転移活性を有するホスホ
リパーゼＤの存在下、反応させて得られる生成物等が挙
げられる。

ここで示されたリポソーム形成剤を得るためのホスフ
ァチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤについて
は、転移活性を有するものであれば特に限定されず、例
えば、日本生化学会編、『続生化学実験講座、（東京化
学同人）、第３巻、235（1986）』や特開昭60−41494号
等に記載されているホスホリパーゼＤが用いられる。

反応に用いられる溶媒としては、エーテル、ベンゼ
ン、クロロホルム等の有機溶媒と適当な水性溶媒との混
合溶媒を例示することができる。水性溶媒にはホスホリ
パーゼＤの作用を促進したり、酵素の安定化に役立つ適
当な添加剤を加えることができる。例えば、アルブミ
ン、カゼイン等の蛋白質や、酢酸、クエン酸、リン酸等
の緩衝剤、塩化カルシウムその他の中性塩を挙げること
ができる。

反応モル比、ホスホリパーゼＤの使用量、溶媒の使用
量等は、適宜に選択できる。例えば、反応モル比として
は、原料リン脂質１モルに対して通常、多価アルコール
約0.1〜100倍モルを用いることが好ましい。ホスホリパ
ーゼＤの使用量は、原料リン脂質1g当り約10〜100000単
位、好ましくは約100〜1000単位を例示することができ
る。さらに、溶媒の使用量としては、原料リン脂質に対
して約２〜100倍程度を例示できる。

反応温度、反応時間も適宜に選択できるが、好ましく
は、約20〜60℃、約１〜72時間を例示できる。

本反応においては、前記多価アルコールの一級アルコ
ール基部分に対して、ホスホリパーゼＤによるホスファ
チジル基の転移が生起する。従って、本反応によって得
られたリン酸エステル混合物（ａ）には、次の一般式
（III）で表わされるジリン酸エステル及び一般式（I
V）で表わされるモノリン酸エステルの両者が含有され
ている。

〔式中、Ａは下記（ｉ）及び／又は（ii）の基を示し、（ここで、R¹及びR²は前記と同じ意味を有する）Ｂは多
価アルコール（１）〜（３）より２個の水酸基を除いた
基を示し、Ｍは前記と同じ意味を有する〕また、本発明に用いられりリン酸エステル混合物
（ａ）においては、前記ジリン酸エステル（III）とモ
ノリン酸エステル（IV）との比は、重量比で1:99〜99:1
が好ましい。

本発明において用いるリン酸エステル混合物（ａ）
は、上記反応が終了後何ら精製することなく、例えば反
応液を直接、もしくは濃縮乾固して用いることができる
が、反応液の濃縮乾固物が好ましい。

本発明の目的のための水溶性塩としては、室温におい
て10^-4M以上水に溶解する無機塩又は有機塩が好まし
い。無機塩としては、例えば、対イオンとしてアルカリ
金属、アンモニウムイオン等を有する、塩酸、硝酸、硫
酸、リン酸、炭酸、臭素酸、ヨウ酸等の塩、好ましく
は、臭化カリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウ
ム、リン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、ヨウ化カリ
ウム、硝酸カリウム、臭化リチウム、塩化リチウム、ヨ
ウ化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、臭化アン
モニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸
水素アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸
水素二アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、臭化ナトリウム、炭酸ナト
リウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸
二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硝酸ナト
リウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げら
れる。有機塩としては、例えば、アルカノールアミンの
塩酸、硫酸、リン酸等の塩、又は、対イオンとしてアル
カリ金属イオン、アンモニウムイオン等を有する、安息
香酸、酢酸、サリチル酸、シュウ酸、フタル酸、グルコ
ン酸、１−ナフタレンスルホン酸、２−ナフタレンスル
ホン酸、酒石酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フ
マル酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、マンデル酸、
リンゴ酸、クエン酸等の塩、好ましくは、塩化トリエタ
ノールアンモニウム、リン酸二水素トリエタノールアン
モニウム、硫酸トリエタノールアンモニウム、安息香酸
ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸アンモニウ
ム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウ
ム、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸カリウム、サリ
チル酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸ナト
リウム、シュウ酸アンモニウム、フタル酸ナトリウム、
フタル酸カリウム、フタル酸アンモニウム、グルコン酸
カリウム、グルコン酸アンモニウム、グルコン酸ナトリ
ウム、１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム、２−ナ
フタレンスルホン酸カリウム、２−ナフタレンスルホン
酸アンモニウム、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウ
ム、酒石酸カリウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン
酸カリウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウ
ム、フマル酸ナトリウム、プロピンオン酸ナトリウム、
プロピオン酸トリエタノールアンモニウム、アスコルビ
ン酸ナトリウム、アスコルビン酸トリエタノールアンモ
ニウム、アスコルビン酸カリウム、マンデン酸ナトリウ
ム、リンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン
酸カリウム、クエン酸トリエタノールアンモニウム等が
挙げられる。より好ましい塩としては、塩化ナトリウ
ム、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等が挙げら
れる。

リン酸エステル混合物（ａ）によるリポソーム形成は
これらの水溶性塩を溶解した水中において形成され得る
が、この時の水溶性塩濃度としては10^-4〜1M、なかでも
10^-3〜0.1M濃度で行うのが特に好ましい。

本発明に界面活性剤を用いる場合、界面活性剤として
は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非
イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤のいずれでもよ
く、その種類及び配合量は、なんら限定されるべきもの
ではないが、好ましくは界面活性剤（ｂ）とリン酸エス
テル混合物（ａ）とを｛（ａ）に含まれるリン原子のモ
ル数｝／｛（ｂ）のモル数｝が10^-3〜10³、特に0.1〜10
0程度となるように加えるのが好ましい。

アニオン性界面活性剤としては、例えば、アルキル硫
酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ステアリン酸
塩、パルミチン酸塩、ミリスチン酸塩、オレイン酸塩、
ヘキサデカジエン酸塩、ヘキサデカトリエン酸塩、ヘキ
サデカテトラエン酸塩、リノール酸塩等のオクタデカジ
エン酸塩、リノレン酸塩等のオクタデカトリエン酸塩、
アラキドン酸塩等のエイコサテトラエン酸塩、エオコサ
ペンタエン酸塩、ドコサヘキサエン酸塩、アルキルリン
酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ジアルキ
ルリン酸塩等、好ましくは、ジセチルリン酸ナトリウ
ム、ジセチルリン酸トリエタノールアンモニウム、２−
デシルテトラデシルリン酸ナトリウム等が挙げられる。

カチオン性界面活性剤としては、例えば、モノアルキ
ルトリメチルアンモニウム塩やジアルキルジメチルアン
モニウム塩等、好ましくは、セチルトリメチルアンモニ
ウムブロマイドやジステアリルジメチルアンモニウムク
ロライド等が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシ
エチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル、グリセリンアルキルエーテル、ソ
ルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂
肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセ
リン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステ
ル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシ
エチレンアルキルアミン、フラクトース又はグルコース
等の脂肪酸エステル等が挙げられ、好ましくは、９−メ
チルヘプタデシルグリセリルエーテル、ソルビタンモノ
ステアレート、オレイン酸グリセロールエステル、蔗糖
脂肪酸エステル等が挙げられる。また、コレステロール
等非常に疎水性の高い化合物も非イオン性界面活性剤に
含めて考えることができる。

両性界面活性剤としては、例えば、アルキルベタイ
ン、ホスホベタイン、スルホベタイン、天然及び合成の
ホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミ
ン等、好ましくは、ステアリルホスホベタイン、ジパル
ミトイルホスファチジルコリン等が挙げられる。

本発明において、リン酸エステル混合物（ａ）並びに
水溶性の塩及び／又は界面活性剤（ｂ）を分散させるべ
く水は、リン酸エステル混合物（ａ）に対し、好ましく
は10〜10⁴重量倍程度、より好ましくは20〜10³重量倍程
度となるよう使用するのが適している。

本発明における小さなリポソームの形成方法は、リン
酸エステル混合物（ａ）並びに水溶性の塩及び／又は界
面活性剤（ｂ）を適当量の水中に投入し、緩やかに撹拌
することによる。リポソーム調製時の温度は室温でよい
が、一般に、40〜80℃で行った方が効率はよい。また、
リン酸エステル混合物（ａ）並びに水溶性の塩及び／又
は界面活性剤（ｂ）の水中への投入操作において、その
投入方法及び投入順序は制限されない。例えば、水溶性
の塩及び／又は界面活性剤をあらかじめリン酸エステル
混合物（ａ）と混合しておいてもよいし、まず塩水溶液
及び／又は界面活性剤（ｂ）の分散液をつくり、後から
リン酸エステル混合物（ａ）を投入してもよい。

従来の方法により形成されたリポソームの平均直径
は、普通１〜５μｍであるが、本発明のリポソーム形成
剤を用いると、平均直径500nm以下の小さなリポソーム
をつくることが可能である。

本発明において、リン酸エステル混合物（ａ）と水溶
性塩及び／又は界面活性剤（ｂ）とを、上記の方法で含
有せしめれば、水溶液中で安定な小粒径リポソームを形
成できるリポソーム組成物を提供することができる。

本発明においてリポソーム中に含有する活性成分は、
疎水性物質でも親水性物質でもよく、または両者の混合
物でもよい。

このような活性成分としては、例えば、ビタミンＡ、
B₁、B₂、B₆、B₁₂、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、パン
トテニールアルコール、パントテン酸カルシウム、ニコ
チン酸ベンジル、ヘスペリジン、ヘスペリチン等のビタ
ミン類とその誘導体、グリセリン、ニトログリセリン、
ジグリセリド、トリグリセリド等のポリオール類とその
誘導体、グルコース、フルクトース、ソルビトール、ガ
ラクトース、マンノース、イノシトール、マルチトー
ル、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロー
ス、セロビオース、アデニルチオメチルペントース等の
糖類とその誘導体、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸
等の多糖類とその誘導体、グルコース−１−リン酸、グ
ルコース−６−リン酸、マンノース−６−リン酸、ガラ
クトース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グ
ルコース−1,6−２リン酸、フルクトース−1,6−２リン
酸、フルクトース−2,6−２リン酸等、又はそれらのナ
トリウム、カリウム等のアルカリ金属塩等の糖リン酸エ
ステルとその誘導体、アラニン、ロイシン、リジン、ア
スパラギン、アスパラギン酸、システイン、プロリン、
グルタミン、セリン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチ
ジン、チロシン、イソロイシン、バリン等のアミノ酸と
その誘導体、コレステロール及びその誘導体、セラミド
及びその誘導体、リノール酸、リノレン酸、アラキドン
酸、ドコサヘキサエン酸、プロスタグランジン、プロス
タサイクリン、ロイコトリエン等の多不飽和脂肪酸及び
その誘導体、ピロリドンカルボン酸、グリチルリチン、
ビサボロール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニ
ウム、パラベンエステル、メントール、レゾルシン、ヒ
ノキチオール、スクワレン、アントラニル酸、尿素、副
腎皮質ホルモン、卵胞ホルモン、エストロゲン、アンド
ロゲン、チロキシン、脳下垂体ホルモン、脳下垂体後葉
抽出物、胸腺ホルモン、胎盤性ゴナドトロピン、ε−ア
ミノカプロン酸、アラントイン、ハロカルバン、カンフ
ル、塩化ヒドロキシアンモニウム、グルタオチンとその
誘導体、メチル−2,5−ジイソプロピル桂皮酸エステ
ル、パラアミノ安息香酸エステル、ビス（２−ピリジル
チオール−１−オキシド）亜鉛、アミノフェノール型抗
ヒスタミン剤、エストラジオール、エチルエストラジオ
ール、サリチル酸及びその誘導体、塩酸ジフェンドラミ
ン、イソプロピルメチルフェノール、塩化クロルヘキシ
ジン、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、ホ
モスルファミン、スコポラミン、クロニジン、硫酸イソ
ソルビド、５−フルオロウラシル、塩化カプロニウム、
アセチルコリン等が挙げられる。

本発明における活性成分の濃度はなんら限定されない
が、リポソーム形成に用いる水に対し、10^-6〜30重量％
程度が好ましい。

活性成分の投入方法としては、有機リン化合物並びに
水溶性の塩及び／又は界面活性剤の混合物に活性成分を
混合してもよいし、また、水中にあらかじめ活性成分を
溶かしておいてもよい。更に、塩水溶液又は界面活性剤
の分散液中に混合しておいてもよい。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を説明するが、これらの実施
例、参考例及び比較例はなんら本発明を限定するもので
はない。

参考例１反応器にジパルミトイルホスファチジルコリン12g、
塩化ナトリウム4.8g、平均分子量が400のポリエチレン
グリコール25g、ホスファチジル基転移活性を持つホス
ホリパーゼＤ（例えばActinomadura属由来）1200ユニッ
ト、ジエチルエーテル120ml及び水100mlを入れ、30℃で
24時間撹拌混合した。反応終了後、クロロホルムとメタ
ノールを加えて脂質を抽出した。得られた沈澱11.5gを2
00mlのアセトンに溶解し、遠心分離して沈澱を除去した
後、溶液を濃縮乾固して9.9gを白色沈澱を得た。

得られた白色沈澱は¹H−NMR、元素分析及びIRにて分
析したところ、ジリン酸エステル（III）体37重量％、
モノリン酸エステル（IV）体58重量％、ホスファチジル
コリン４重量％及びホスファチジン酸１重量％を含有す
る混合物であった。

参考例２反応器にジパルミトイルホスファチジルコリン15g、
塩化ナトリウム6.0g、平均分子量750のポリグリセリン7
5g、ホスファチジル基転移活性を持つホスホリパーゼD1
500ユニット、ジエチルエーテル150ml及び水150mlを入
れ、30℃で24時間撹拌混合した。反応終了後、参考例１
と同様に抽出、遠心し、14.1gの反応物を得た。

得られた白色沈澱は¹H−NMR、元素分析及びIRにて分
析したところ、ジリン酸エステル（III）体38重量％、
モノリン酸エステル（IV）体55重量％、ホスファチジル
コリン６重量％及びホスファチジン酸１重量％を含有す
る混合物であった。

実施例１ 0.01M硫酸ナトリウム水溶液にグルコース濃度が0.056
Mとなるようにグルコースを溶かし、グルコース−塩水
溶液を調製した。参考例１で得られた白色沈澱60mgに前
記グルコース−塩水溶液6gを加え、湯浴上約50℃に加温
しつつマグネティックスターラーで撹拌した。均一に分
散した後、撹拌しつつ室温に戻したところ、薄青く濁っ
てはいるがほとんど透明なリポソーム溶液が得られた。
その溶液について、粒径測定機（サブミクロン粒子分析
装置、Coulter社製モデルN4）を用いて測定したリポソ
ームの平均直径は88nmであった。また、このリポソーム
溶液は室温で約１ケ月間変化せず、安定であった。

この溶液をセファデックスG50−メヂウムを用いて室
温でゲル濾過し、リポソームとリポソームに保持されな
かったグルコースを分離した。

リポソームを溶出している分画についてグルコース濃
度と有機リン化合物濃度を定量し、得られたリポソーム
のトラップ体積を有機リン化合物に含まれるリン原子の
モル当りで表すと、0.023/molであった。

実施例２ 0.02M硫酸ナトリウム水溶液に、グルコース濃度が0.0
56Mとなるようにグルコースを溶かし、グルコース−塩
水溶液を調製した。参考例１で得られた白色沈澱50mg
に、前記グルコース−塩水溶液5gを加え、湯浴上約50℃
に加温しつつマグネティックスターラーで撹拌した。均
一に分散した後、撹拌しつつ室温に戻したところ、薄く
白濁したリポソーム溶液が得られた。この溶液について
測定されたリポソームの平均直径は131nmであった。こ
のリポソーム溶液は室温で約２週間変化せず安定であっ
た。

この溶液を実施例１と同様にしてゲル濾過を行い、リ
ポソームの溶出している分画について、グルコース濃度
とリン濃度を定量したところ、このリポソームのトラッ
プ体積はリンのモル当りで0.22/molであった。

比較例１リポソーム形成剤として、ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンを用い、これを実施例１と同様にして0.056M
グルコース−0.01M硫酸アンモニウム塩水溶液に混合
し、湯浴上約50℃に加温しつつマグネティックスターラ
ーで撹拌した。均一に分散した後、撹拌しつつ室温に戻
したところ、白濁したリポソーム溶液が得られた。

この溶液を室温で約30分間静置しておくと、白色の沈
澱を生じ、リポソームの安定静に乏しいことが判った。
また、この沈澱を光学顕微鏡で観察すると、粒子直径は
１〜５μｍであり、小粒径のリポソームは形成しなかっ
た。

実施例３リポソームの形成を電子顕微鏡観察により確認した。
30mgの実施例１で得られた白色沈澱を0.01Mの硫酸アン
モニウム水溶液3mlに溶解した。この溶液について、リ
ン−タングステン酸を染色剤として染色し、透過型電子
顕微鏡観察を行ったところ、平均直径101nmの一重のリ
ポソームが見られた。このリポソームの直径は、粒径測
定機を用いて測定した値とよく一致していた。

実施例４ジパルミトイルホスファチジルコリンとPEG400から得
られた白色沈澱を１重量％相当量、水溶性塩として0.01
M相当量の硫酸ナトリウム、活性成分として0.056M相当
量のビタミンＣを用い、実施例１と同様にしてリポソー
ム分散液を得た。

このリポソームの平均粒径は305nmであり、ゲル濾過
による精製後、得られたリポソームのトラップ体積はリ
ンのモル当り、0.31/molであった。

実施例５参考例２で得られた白色沈澱を１重量％、水溶性塩と
して0.02M相当の硫酸アンモニウム、活性成分として１
重量％のグリセリンを用い、実施例１と同様にしてリポ
ソーム分散液を得た。

このリポソームの平均粒径は145nmであり、得られた
リポソームのトラップ体積はリンのモル当りで表わす
と、0.22/molであった。

実施例６大豆リン脂質由来の脂肪酸組成を有するホスファチジ
ルコリンと平均分子量が200のポリプロピレングリコー
ルからホスファチジル基転移活性を持つホスホリパーゼ
Ｄの反応により得られた混合物を１重量％、水溶性塩と
して0.02M塩化トリエタノールアンモニウム、活性成分
として0.056Mのグルコースを用い、実施例１と同様にし
てリポソーム分散液を得た。

このリポソームの平均粒径は247nmであり、ゲル濾過
による精製後、得られたリポソームのトラップ体積は、
リン当り0.28/molであった。

実施例７参考例１で得られた白色沈澱30mgと２−デシルテトラ
デシルリン酸ナトリウム25mgをクロロホルム−メタノー
ル（2:1）混合溶媒に溶かして均一溶液とした後、減圧
濃縮乾固して有機溶媒成分を完全に除去した。こうして
得た均一な固型物に、0.167M尿素水溶液3.5gを加え、湯
浴上約50℃に加温しつつマグネティックスターラーで撹
拌した。均一に分散した後、撹拌しつつ室温に戻したと
ころ、薄青く濁ってはいるがかなり透明なリポソーム溶
液が得られた。この溶液のリポソームの平均直径は271n
mであった。

この溶液を実施例１と同様にしてゲル濾過した。リポ
ソームの溶出している分画についてリンと尿素の定量を
行いその結果、得られたリポソームのトラップ体積はリ
ンのモル当り、0.16/molであった。

実施例８参考例１で得られた白色沈澱を0.94重量％、界面活性
剤として0.18重量％のジセチルリン酸トリエタノールア
ンモニウム、活性物質として0.543Mのグリセリンを用
い、実施例７と同様にリポソーム水溶液を調製した。

得られたリポソームの平均直径は239nm、トラップ体
積はリンのモル当り、0.17/molであった。

実施例９卵黄由来の脂肪酸組成を有するホスファチジルコリン
と平均分子量500のポリグリセリンを、ホスファチジル
基転移活性を有するホスホリパーゼＤの存在下、反応し
て得られた生成物を0.61重量％、界面活性剤として0.39
重量％のジパルミトイルホスファチジルコリン、活性物
質として0.133Mのグリシンを用い、実施例７と同様にリ
ポソーム水溶液を調製した。

得られたリポソームの平均直径は206nm、トラップ体
積はリンのモル当り、0.37/molであった。

〔発明の効果〕

本発明のリポソーム形成剤は、水と混合し、撹拌した
だけで自然に粒径の小さなリポソームを形成することが
できる。本発明を用いて製造した小さなリポソームは、
従来の方法によって製造したもの（例えば超音波照射に
より得られたもの）よりも安定である。また、本発明に
よる粒径の小さなリポソームの製造法は、簡便で、従来
の方法に必要な機械的操作や界面活性剤の除去等に煩わ
されることがない。すなわち、本発明は、従来の課題で
あった、リポソームの大きさ、大量生産性、保存安定性
にたいする問題点をすべて解決しているもので、その利
用価値は大きく、医薬品等に用いることができる。

フロントページの続き (72)発明者黒崎富裕大阪府泉南郡岬町淡輪1465 (72)発明者国生純孝東京都国立市谷保7026―３

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）ホスホリパーゼＤの存在下、次の
一般式（Ｉ）及び／又は（II）〔式（Ｉ）及び（II）中、R¹及びR²はそれぞれ、同一又
は異なって−OCOR³及び／又は−OR⁴より選ばれる基（但
し、R³及びR⁴は同一又は異なって、それぞれ炭素数６〜
32のアルキル又はアルケニル基を表す）を示すか、又は
R¹とR²が一緒になって次の基（ここで、ｎは11〜19の整数を表す）を形成してもよ
く、Ｘは水酸基含有塩基の水酸基１個を除いた後に残る
有機残基を示し、Ｍは水素原子、アルカリ金属、アルカ
リ土類金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム又は
アルカノールアンモニウムを示す〕で表されるグリセロリン脂質と下記（１）〜（３）（１） HOＹ−Ｏ_mH〔ここでｍは２〜50の整数、Ｙ
は炭素数２〜４のアルキレン基もしくは置換アルキレン
基を示す〕で表されるモノ又はポリエーテル（２）縮合度２〜50のポリグリセリン（３）分子内に一級アルコール基２個以上を有する炭
素数４〜７の単糖類、二糖類又は糖アルコール類のいずれかの多価アルコールとを反応させて得られるリ
ン酸エステル混合物と、（ｂ）水溶性塩及び／又は界面活性剤とからなるリ
ポソーム形成剤。
【請求項２】請求項１記載のリポソーム形成剤を用い、
有効活性成分を包含せしめたリポソーム組成物。
【請求項３】リポソームの平均直径が500nm以下である
請求項２記載のリポソーム組成物。