JP2704235B2 - リポソーム形成剤及びリポソーム組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なリポソーム形成剤及びリポソーム組成
物に関し、更に詳しくは、微細で安定なリポソームを形
成する新規リポソーム形成剤及び容易にこれを形成する
ことができる新規なリポソーム組成物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

脂質二重膜の一重あるいは多重の球殻からなるリポソ
ームは、薬効成分のキャリアーとして注目されている。
リポソームを薬物担体として用い、静脈注射等により生
体への投与を目的とするとき、リポソームの粒径は小さ
い方が望ましいことが多い。リポソーム形成剤としては
天然リン脂質がよく知られているが、通常、天然リン脂
質を水に投入しただけでは粒径の大きな（直径１〜５μ
ｍ）多重膜リポソームを形成し、均一で粒径が小さく安
定なリポソーム分散液を得ることはできない。

従来知られている粒径の小さなリポソームの製造法と
しては、超音波処理による方法、界面活性剤との混合系
から透析などにより界面活性剤を除去する方法、脂質の
エタノール溶液を水中に注入する方法、逆ミセル法など
がある。これらの方法は、例えば、エル・エス・ラオ
（L.S.Rao）『リポソーム・テクノロジー（Liposome Te
chnology）』、ジー・グレゴリアディス（G.Gregoriadi
s）編、CRC Press、Florida、（1984）、第１巻、18
章、247−257にまとめられている。しかし、超音波照射
法、界面活性剤除去法及び逆ミセル法による小さなリポ
ソームの製造法は、実験室レベルでの調製法にすぎず、
工業的大量生産には適さない。また、脂質のエタノール
溶液を水中に注入する方法では、低濃度のリポソームし
か得られないと共に、長期間保存しておくと元の大きな
多重膜リポソームに戻ってしまうなどの問題があった。

かかる問題点を解決するための種々の研究がなされ、
例えば、ニンハム（Ninham）及びエバンス（Evans）、
〔ファラデー・ディスカス・ケミカル・ソサイエティー
（Faraday Discuss Chem.Soc.）、81:1（1986）〕に
は、水酸イオンあるいは酢酸イオンを対イオンとして有
するジドデシルジメチルアンモニウムカチオンが、半径
約30nmの小さなリポソームを形成することが報告されて
いる。しかし、この方法では小さなリポソームを形成す
るために必要なリポソーム形成剤の濃度が狭い範囲に限
られている。しかも、リポソーム形成物質がカチオン性
界面活性剤であるので、生体への投与には適さないもの
であった。

従って、粒径が小さく、安定で、しかも人体に対して
安全なリポソームを工業的有利に大量生産する方法が望
まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、このような状況において鋭意検討を重
ねた結果、特定のリン酸エステルを使用することにより
水に分散させただけで粒径が小さく、しかも安定なリポ
ソームを形成するリポソーム形成剤を得ることに成功
し、本発明を完成したものである。

すなわち、本発明は （ａ）一般式（Ｉ） ［式中、Ａは下記（ｉ）及び／または（ii）の基を示
し、 〔ここでR₁及びR₂は、それぞれ、同一もしくは異なっ
て、−OCOR₃及び／または−OR₄（R₃及びR₄は同一もしく
は異なって、それぞれ炭素数６〜32のアルキル基または
アルケニル基）を示すか、（ｉ）の場合には、R₁とR₂が
一緒になって次の基 を形成してもよい〕 Ｍは水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ア
ンモニウム、アルキルアンモニウムまたはアルカノール
アンモニウムを示し、 Ｘは下記（１）〜（３）のいずれかの化合物HO−Ｘ−
OHの残基である。

（１） HOＹ−Ｏ_mH〔ここでｍは２〜50の整数、Ｙ
は炭素数２〜４のアルキレン基もしくは置換アルキレン
基を示す〕で表わされるモノ又はポリエーテル （２） 縮合度２〜50のポリグリセリン （３） 分子内に一級アルコール基２個以上を有する炭
素数４〜７の単糖類、二糖類及び糖アルコール類］ で表わされるリン酸エステルと、 （ｂ）水溶性塩及び／または界面活性剤とからなるリポ
ソーム形成剤、及びこれら形成剤を用いて形成するリポ
ソーム内に有効活性成分を包含するリポソーム組成物を
提供するものである。

本発明リポソーム形成剤に用いられる（ａ）リン酸エ
ステルは上記一般式（Ｉ）で表されるものであるが、該
式（Ｉ）中、Ａで示される基は前記（ｉ）、（ii）いず
れでもよいが、これらの混合物であってもよい。また
R₃、R₄で示されるアルキル基またはアルケニル基として
は、例えば、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、
テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシ
ル、ドコシル、テトラコシル、ヘキサコシル、オクタコ
シル、トリアコンチル、ドトリアコンチル、２−エチル
ヘキシル、オクタジエニル、デカジエニル、ドデカジエ
ニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、オク
タデカジエニル、エイコサジエニル、ドコサジエニル、
テトラコサジエニル、ヘキサコサジエニル、オクタコサ
ジエニル、トリアコンタジエニル、ドトリアコンタジエ
ニル、ヘキサデカトリエニル、オクタデカトリエニル、
エイコサトリエニル、ドオサトリエニル、テトラコサト
リエニル、ヘキサコサトリエニル、オクタコサトリエニ
ル、トリアコンタトリエニル、ドトリアコンタトリエニ
ル、エイコサテトラエニル、ドコサテトラエニル、テト
ラコサテトラエニル、ヘキサコサテトラエニル、オクタ
コサテトラエニル、トリアコンタテトラエニル、ドトリ
アコンタテトラエニル、ドコサペンタエニル、テトラコ
サペンタエニル、ヘキサコサペンタエニル、オクタコサ
ペンタエニル、トリアコンタペンタエニル、ドトリアコ
ンタペンタエニル、ドコサヘキサエニル、テトラコサヘ
キサエニル、ヘキサコサヘキサエニル、オクタコサヘキ
サエニル、トリアコンタヘキサエニル、ドトリアコンタ
ヘキサエニル等が挙げられる。

また水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ア
ンモニウム、アルキルアンモニウムまたはアルカノール
アンモニウムであるＭとしては、例えば、カリウム、リ
チウム、ナトリウム、ベリリウム、マグネシウム、カル
シウム、ストロンチウム、バリウム、アンモニウム、ト
リエタノールアンモニウム、トリメチルアンモニウム、
トリエチルアンモニウム等が挙げられる。

一方、（１）に記載の化合物に於いて、Ｙは置換基を
有してもよい炭素数２〜４のアルキレン基で、例えばエ
チレン、プロピレン、ブチレン、１−メチルプロピレン
等が挙げられ、ｍは２〜50の整数であるが、４〜50、特
に４〜20が好ましい。特に好ましいものとしては、例え
ば平均分子量400のポリエチレングリコール（以下PEG40
0と記す）、平均分子量600のポリエチレングリコール
（以下PEG600と記す）、平均分子量200のポリプロピレ
ングリコール（以下PPG200と記す）等が挙げられる。

（２）のポリグリセリンの縮合度は２〜50であるが、
４〜50、特に４〜20が好ましい。特に好ましいポリグリ
セリンとしては例えば、平均分子量500のポリグリセリ
ン（PG500と記す）、平均分子量750のポリグリセリン
（PG750と記す）等が挙げられる。また、（３）に記載
の分子内に一級アルコール基２個以上を有する炭素数４
〜７のポリアルコール化合物のうち、単糖類としては、
例えばキシルロース、リブロース、フラクトース、ソル
ボース、プシコース、タガトース、セドヘプツロース、
グルコヘプツロース、マンノヘプツロース等を例示で
き、また、二糖類としてはスクロース、マルトース、セ
ロビオース、トレハロース、ラクトース等が例示でき、
また、糖アルコールとしては、例えばエリスリトール、
リビトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトー
ル、マンニトール、ガラクチトール、セドヘプチトー
ル、ベルセイトール等が例示できる。

特に好ましいリン酸エステル（Ｉ）としては、前記式
（Ｉ）中、Ａが前記式（ｉ）で表され、しかも、R₁及び
R₂が、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイ
ル、ステアロイル、オレオイル、リノレオイル、リノレ
ノイル、アラキドノイル、ドコサヘキサノイル、エイコ
サペンタノイル等の組合せからなるか、または、前記式
（Ｉ）中、Ａの組成が、例えば、卵黄組成または大豆組
成等、天然リン脂質由来の分布を持つ、ジホスファチジ
ルPEG400、ジホスファチジルPEG600、ジホスファチジル
PPG200、ジホスファチジルPG500及びジホスファチジルP
G750等が挙げられる。

本発明に用いるリン酸エステル（Ｉ）は、例えばホス
ファチジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤ（EC.
3.1.4.4）を用いることにより製造することができる。

すなわち、下記反応式で表されるように、天然に存在
する、あるいは合成された原料リン脂質（II）と、多価
アルコールとを、ホスホリパーゼＤ存在下、好ましくは
溶媒中で接触させて、ホスファチジル基転移反応をさせ
るものである。

〔式中、Ｂは炭素数４以下の１級水酸基含有塩基より水
酸基１個を除いた有機残基を示し、Ａ、Ｍ及びＸは前記
と同じ意味を示し、HO−はホスファチジル基の転移反応
が生起し得る第１級アルコール基を示す〕 ここで、原料リン脂質（II）及び多価アルコールは、
目的物に応じて選択されるもので特に限定されるもので
はない。原料リン脂質の例としては大豆レシチン、卵黄
レ４シチン、合成レシチン等があり、多価アルコールの
例としては、PEG400、PEG600、PPG200、PG500、PG750、
フルクトース等が挙げられる。

ホスホリパーゼＤの由来は特に限定されないが、例え
ば、ノカルディオプシス属由来のホスホリパーゼDM（特
開昭58−63388号）、アクチノマデューラ属由来のホス
ホリパーゼDM（特開昭58−67183号）などを用いること
ができる。

用いられる溶媒としては、エーテル、ベンゼン、クロ
ロホルム等の有機溶媒と適当な水性溶媒との混合溶媒を
例示することができる。水性溶媒にはホスホリパーゼＤ
の作用を促進したり、酵素の安定化に役立つ適当な添加
例を加えることができる。例えば、アルブミン、カゼイ
ン等の蛋白質や、酢酸、クエン酸、リン酸等の緩衝剤、
塩化カルシウムその他の中性塩を挙げることができる。

反応モル比、ホスホリパーゼＤの使用量、溶媒の使用
量等は、適宜に選択できる。例えば、反応モル比として
は、原料リン脂質（II）１モルに対して通常、多価アル
コール約0.1〜100倍モル、特に0.1〜10倍モルを用いる
ことが好ましい。ホスホリパーゼＤの使用量は、原料リ
ン脂質（II）1g当り約10〜100000単位、好ましくは約10
0〜1000単位を例示することができる。さらに、溶媒の
使用量としては、原料リン脂質に対して約２〜100倍程
度を例示できる。

反応温度、反応時間も適宜に選択できるが、好ましく
は、約20〜60℃、約１〜72時間を例示できる。

このようにして得られたリン酸エステル（Ｉ）は、分
液法、シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマ
トグラフィー等の適当な方法を利用して分離精製するこ
とができる。

本発明の目的のための水溶性塩としては、室温におい
て10^-4M以上水に溶解する無機塩または有機塩が好まし
い。無機塩としては、例えば、対イオンとしてアルカリ
金属、アンモニウムイオン等を有する、塩酸、硝酸、硫
酸、リン酸、炭酸、臭素酸、ヨウ酸等の塩、好ましく
は、臭化カリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウ
ム、リン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、ヨウ化カリ
ウム、硝酸カリウム、臭化リチウム、塩化リチウム、ヨ
ウ化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、臭化アン
モニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸
水素アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸
水素二アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、臭化ナトリウム、炭酸ナト
リウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸
二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硝酸ナト
リウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げら
れる。有機塩としては、例えば、アルカノールアミンの
塩酸、硫酸、リン酸等の塩、または、対イオンとしてア
ルカリ金属イオン、アンモニウムイオン等を有する、安
息香酸、酢酸、サリチル酸、シュウ酸、フタル酸、グル
コン酸、１−ナフタレンスルホン酸、２−ナフタレンス
ルホン酸、酒石酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、
フマル酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、マンデル
酸、リンゴ酸、クエン酸等の塩、好ましくは、塩化トリ
エタノールアンモニウム、リン酸二水素トリエタノール
アンモニウム、硫酸トリエタノールアンモニウム、安息
香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸アンモニ
ウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウ
ム、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸カリウム、サリ
チル酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸ナト
リウム、シュウ酸アンモニウム、フタル酸ナトリウム、
フタル酸カリウム、フタル酸アンモニウム、グルコン酸
カリウム、グルコン酸アンモニウム、グルコン酸ナトリ
ウム、１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム、２−ナ
フタレンスルホン酸カリウム、２−ナフタレンスルホン
酸アンモニウム、２−ナフタレンスルホン酸ナトリウ
ム、酒石酸カリウム、マレイン酸ナトリウム、マレイン
酸カリウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウ
ム、フマル酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、プ
ロピオン酸トリエタノールアンモニウム、アスコルビン
酸ナトリウム、アスコルビン酸トリエタノールアンモニ
ウム、アスコルビン酸カリウム、マンデル酸ナトリウ
ム、リンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン
酸カリウム、クエン酸トリエタノールアンモニウム等が
挙げられる。より好ましい塩としては、塩化ナトリウ
ム、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等が挙げら
れる。

リン酸エステルによるリポソーム形成はこれらの水溶
性塩を溶解した水中に於いて形成させ得るが、この時の
水溶液塩濃度としては10^-4〜1M、なかでも10^-3〜0.1M濃
度で行なうのが特に好ましい。

本発明に界面活性剤を用いる場合、界面活性剤として
は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非
イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤のいずれでもよ
く、その種類及び配合量は、なんら限定されるべきもの
ではないが、好ましくは界面活性剤（ｂ）をリン酸エス
テル（ａ）に対し、モル比で（ａ）／（ｂ）が10^-3〜10
³、特に0.5〜100程度、さらに１〜10程度となるように
加えるのが好ましい。

アニオン性界面活性剤としては、例えば、アルキル硫
酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ステアリン酸
塩、パルミチン酸塩、ミリスチン酸塩、オレイン酸塩、
ヘキサデカジエン酸塩、ヘキサデカトリエン酸塩、ヘキ
サデカテトラエン酸塩、リノール酸塩等のオクタデカジ
エン酸塩、リノレン酸塩等のオクタデカトリエン酸塩、
アラキドン酸塩等のエイコサテトラエン酸塩、エイオサ
ペンタエン酸塩、ドコサヘキサエン酸塩、アルキルリン
酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ジアルキ
ルリン酸塩等、好ましくは、ジセチルリン酸ナトリウ
ム、ジセチルリン酸トリエタノールアンモニウム、２−
デシルテトラデシルリン酸ナトリウム等が挙げられる。

カチオン性界面活性剤としては、例えば、モノアルキ
ルトリメチルアンモニウム塩やジアルキルジメチルアン
モニウム塩等、好ましくは、セチルトリメチルアンモニ
ウムブロマイドやジステアリルジメチルアンモニウムク
ロライド等が挙げられる。

非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシ
エチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル、グリセリンアルキルエーテル、ソ
ルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂
肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセ
リン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステ
ル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシ
エチレンアルキルアミン、フラクトースまたはグルコー
ス等の脂肪酸エステル等が挙げられ、好ましくは、９−
メチルヘプタデシルグリセリルエーテル、ソルビタンモ
ノステアレート、オレイン酸グリセロースエステル、庶
糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、コレステロー
ル等非常に疎水性の高い化合物も非イオン性界面活性剤
に含めて考えることができる。

両性界面活性剤としては、例えば、アルキルベタイ
ン、ホスホベタイン、スルホベタイン、天然及び合成の
ホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミ
ン等、好ましくは、ステアリルホスホベタイン、ジパル
ミトイルホスファチジルコリン等が挙げられる。

本発明において、リン酸エステル（ａ）並びに水溶性
塩及び／または界面活性剤（ｂ）を分散させるべき水
は、リン酸エステル（ａ）に対し、好ましくは10〜10⁴
重量倍程度、より好ましくは20〜10³重量倍程度となる
よう使用するのが適している。

本発明における小さなリポソームの形成方法は、リン
酸エステル（ａ）並びに水溶性塩及び／または界面活性
剤（ｂ）を適当量の水中に投入し、緩やかに撹拌するこ
とによる。リポソーム調製時の温度は室温でよいが、一
般に、40〜80℃で行った方が効率はよい。また、リン酸
エステル（ａ）並びに水溶性塩及び／または界面活性剤
（ｂ）の水中への投入操作において、この投入方法及び
投入順序は制限されない。例えば、水溶性塩及び／また
は界面活性剤をあらかじめリン酸エステル（ａ）と混合
しておいてもよいし、まず塩水溶液及び／または界面活
性剤（ｂ）の分散液をつくり、後からリン酸エステル
（ａ）を投入してもよい。

従来の方法により形成されたリポソームの平均直径
は、普通１〜５μｍであるが、本発明のリポソーム形成
剤を用いると、平均直径500nm以下の小さなリポソーム
をつくることが可能である。

本発明において（ａ）リン酸エステル（Ｉ）と（ｂ）
水溶性塩及び／または界面活性剤とを、上記した方法で
含有せしめれば、水溶液中で安定な小粒径リポソームを
形成できるリポソーム組成物を提供することができる。

本発明においてリポソーム中に含有する活性成分は、
疎水性物質でも親水性物質でもよく、または両者の混合
物でもよい。

活性成分としては、例えば、ビタミンＡ、B₁、B₂、
B₆、B₁₂、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、パントテニー
ルアルコール、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸ベ
ンジル、ヘスペリジン、ヘスペリチン等のビタミン類と
その誘導体、グリセリン、ニトログリセリン、ジグリセ
リド、トリグリセリド等のポリオール類とその誘導体、
グリコース、フルクトース、ソルビトール、ガラクトー
ス、マンノース、イノシトール、マルチトール、マルト
ース、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビ
オース、アデニルチオメチルペントース等の糖類とその
誘導体、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の多糖類
とその誘導体、グルコース−１−リン酸、グルコース−
６−リン酸、マンノース−６−リン酸、ガラクトース−
６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グルコース−
1,6−二リン酸、フルクトース−1,6−二リン酸、フルク
トース−2,6−二リン酸等、またはそれらのナトリウ
ム、カリウム等のアルカリ金属塩等の糖リン酸エステル
とその誘導体、アラニン、ロイシン、リジン、アスパラ
ギン、アスパラギン酸、システイン、プロリン、グルタ
ミン、セリン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、
チロシン、イソロイシン、バリン等のアミノ酸とその誘
導体、コレステロース及びその誘導体、セラミド及びそ
の誘導体、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ド
コサヘキサエン酸、プロスタグランジン、プロスタサイ
クリン、ロイコトリエン等の多不飽和脂肪酸及びその誘
導体、ピロリドンカルボン酸、グリチルリチン、ビサボ
ロール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、
パラベンエステル、メントール、レゾルシン、ヒノキチ
オール、スクワレン、アントラニル酸、尿素、副腎皮質
ホルモン、卵胞ホルモン、エストロゲン、アンドロゲ
ン、チロキシン、脳下垂体ホルモン、脳下垂体後葉抽出
物、胸腺ホルモン、胎盤性ゴナドトロピン、ε−アミノ
カプロン酸、アラントイン、ハロカルバン、カンフル、
塩化ヒドロキシアンモニウム、グルタオチンとその誘導
体、メチル−2,5−ジイソプロピル桂皮酸エステル、パ
ラアミノ安息香酸エステル、ビス（２−ピリジルチオー
ル−１−オキシド）亜鉛、アミノフェノール型抗ヒスタ
ミン剤、エストラジオール、エチルエストラジオール、
サリチル酸及びその誘導体、塩酸ジフェンドラミン、イ
ソプロピルメチルフェノール、塩化クロルヘキシジン、
アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、ホモスル
ファミン、スコポラミン、クロニジン、硫酸イソソルビ
ド、５−フルオロラウシル、塩化カプロニウム、アセチ
ルコリン等が挙げられる。

本発明における活性成分の濃度はなんら限定されない
が、リポソーム形成に用いる水に対し、10^-6〜30重量％
程度が好ましい。

活性成分の投入方法としては、リン酸エステル（ａ）
並びに水溶性塩及び／または界面活性剤の混合物に活性
成分を混合してもよいし、また、水中にあらかじめ活性
成分を溶かしておいてもよい。更に、塩水溶液また界面
活性剤（ｂ）の分散液中に混合しておいてもよい。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を説明するが、これらの実施
例、参考例及び比較例はなんら本発明を限定するもので
はない。

参考例１ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化製）
12gに、PEG400（和光純薬製ポリエチレングリコール40
0）を25g、NaCl4.8g、ジエチルエーテル120ml、ホスホ
リパーゼDM1200U、及び水100mlを添加し、30℃、24時間
振とうしながら反応させた。反応終了後、有機層をと
り、冷アセトンにて沈殿する不純物を除去し、濃縮乾固
した。さらにシリカゲルクロマトグラフィーにて、薄層
クロマトグラフィーで単一スポットを与えるまで精製を
行ない、目的物であるジホスファチジルPEG400を7g得た
（収率25％）。

得られたジホスファチジルPEG400についてNMR、IR、
元素分析を行ない、構造を確認した。以下にそのデータ
を示す。¹ H−NMR（第１図） 〔270MHz、日本電子社製;CDCl₃、TMS基準、ppm〕 0.9（t,12H,a）,1.3（bs,96H,b）,1.6（m,8H,c）， 2.3（m,8H,d）,3.7（bs,32.5H,h）,4.0（m,8H,g）， 4.2（ｄ−d,2H,e）,4.4（ｄ−d,2H,e）,5.2（m,2H,
f） 元素分析： IRスペクトル（第２図） 参考例２ 参考例１のジパルミトイルホスファチジルコリンの代
りに、大豆由来のホスファチジルコリン（ルーカスマイ
ヤー社製Epikuron200）12gを、PEG400の代りに、（和光
純薬製ポリエチレングリコール600）を25g用いて、以下
参考例１と同様の操作を行ない、脂肪酸鎖が大豆由来の
組成をもつジホスファチジルPFG600を10g得た（収率32
％）。

元素分析： 参考例３ 参考例１のジパルミトイルホスファチジルコリンの代
りに、卵黄由来のレシチン（キューピー社製PL−100H）
12gを、PEG400の代りに、PG750（阪本薬品製ポリグリセ
リン＃750）を12g用いて、以下参考例１と同様の操作を
行い、脂肪酸鎖が卵黄由来の組成をもつジホスファチジ
ルPG750を6.7g得た（収率20％）。

元素分析： 実施例１ 0.01M硫酸ナトリウム水溶液にグルコース濃度が0.056
Mとなるようにグルコースを溶かし、グルコース−塩水
溶液を調製した。本水溶液6g中に、60mgのジホスファチ
ジルPEG400−塩水溶液を加え、湯浴上約50℃に加温しつ
つマグネティックスターラーで撹拌した。均一に分散し
た後、撹拌しつつ室温に戻したところ、薄青く濁っては
いるがほとんど透明なリポソーム溶液が得られた。この
溶液について、粒径測定機（サブミクロン粒子分析装
置、Coulter社製モデルN4）を用いて測定したリポソー
ムの平均直径は82nmであった。また、このリポソーム溶
液は室温で約１カ月間変化せず、安定であった。

この溶液をセファデックスG50−メヂウムを用いて室
温でゲル濾過し、リポソームとリポソームに保持されな
かったグルコースを分離した。

リポソームの溶出している分画についてグルコース濃
度とリン酸エステル濃度を定量し、得られたリポソーム
のトラップ体積をリン酸エステルに含まれるリン原子の
モル当りで表すと、0.034/molであった。

実施例２ 0.02M硫酸アンモニウム水溶液に、グルコース濃度が
0.056Mとなるようにグルコースを溶かし、グルコース−
塩水溶液を調製した。50mgのジホスファチジルPEG600を
前記グルコース−塩水溶液5gに加え、湯浴上約50℃に加
温しつつマグネティックスターラーで撹拌した。均一に
分散した後、撹拌しつつ室温に戻したところ、薄く白濁
したリポソーム溶液が得られた。この溶液について測定
されたリポソームの平均直径は83nmであった。このリポ
ソーム溶液は室温で約２週間変化せず安定であった。

この溶液を実施例１と同様にしてゲル濾過を行い、リ
ポソームの溶出している分画について、グルコース濃度
とリン濃度を定量したところ、このリポソームのトラッ
プ体積はリン原子のモル当りで0.033/molであった。

比較例１ リポソーム形成剤として、ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンを用い、これを実施例１と同様にして0.056M
グルコース−0.01M硫酸アンモニウム塩水溶液に混合
し、湯浴上約50℃に加温しつつマグネティックスターラ
ーで撹拌した。均一に分散した後、撹拌しつつ室温に戻
したところ、白濁したリポソーム溶液が得られた。

この溶液を室温で約30分間静置しておくと、白色の沈
殿を生じ、リポソームの安定性に乏しいことが判った。
また、この沈殿を光学顕微鏡で観察すると、直径１〜５
μｍの粒子が観察され、小粒径のリポソームの形成は見
られなかった。

実施例３ リポソームの形成を電子顕微鏡観察により確認した。
30mgの実施例１で得られた白色沈殿を0.01Mの硫酸アン
モニウム水溶液3mlに溶解した。この溶液について、リ
ン−タングステン酸を染色剤として染色し、透過型電子
顕微鏡観察を行ったところ、平均直径94nmの一重のリポ
ソームが見られた。このリポソームの直径は、粒径測定
機を用いて測定した値とよく一致していた。

実施例４ １重量％のジホスファチジルPPG200、水溶性塩として
0.01M相当量の硫酸ナトリウム、活性成分として0.056M
相当量のビタミンＣを用い、実施例１と同様にしてリポ
ソーム分散液を得た。

このリポソームの平均粒径は321nmであり、ゲル濾過
による精製後、得られたリポソームのトラップ体積はリ
ン原子のモル当り、0.40/molであった。

実施例５ １重量％のジホスファチジルPG500、水溶性塩として
0.02M相当の硫酸アンモニウム、活性成分として１重量
％のグリセリンを用い、実施例１と同様にしてリポソー
ム分散液を得た。

このリポソームの平均粒径は373nmであり、得られた
リポソームのトラップ体積はリン原子のモル当りで表す
と、0.36/molであった。

実施例６ １重量％の大豆リン脂質由来の脂肪酸組成を有するジ
ホスファチジルPPG200、水溶性塩として0.02M塩化トリ
エタノールアンモニウム、活性成分として0.056Mのグル
コースを用い、実施例１と同様にしてリポソーム分散液
を得た。

このリポソームの平均粒径は457nmであり、ゲル濾過
による精製後、得られたリポソームのトラップ体積は、
リン原子のモル当り0.23/molであった。

実施例７ 30mgのジホスファチジルPEG400と２−デシルテトラデ
シルリン酸ナトリウム25mgをクロロホルム−メタノール
（2:1）混合溶媒に溶かして均一溶液とした後、減圧濃
縮乾固して有機溶媒成分を完全に除去した。こうして得
た均一な固型物に、0.167M尿素水溶液3.5gを加え、湯浴
上約50℃に加温しつつマグネティックスターラーで撹拌
した。均一に分散した後、撹拌しつつ室温に戻したとこ
ろ、薄青く濁ってはいるがかなり透明なリポソーム溶液
が得られた。この溶液のリポソームの平均直径は359nm
であった。

この溶液を実施例１と同様にしてゲル濾過した。リポ
ソームの溶出している分画についてリンと尿素の定量を
行いその結果、得られたリポソームのトラップ体積はリ
ン原子のモル当り、0.21/molであった。

実施例８ ジホスファチジルPEG400を0.94重量％、界面活性剤と
して0.18重量％のジセチルリン酸トリエタノールアンモ
ニウム、活性物質として0.543Mのグリセリンを用い、実
施例７と同様にリポソーム水溶液を調製した。

得られたリポソームの平均直径は246nm、トラップ体
積はリン原子のモル当り、0.28/molであった。

実施例９ 0.61重量％卵黄由来の脂肪酸組成を有するジホスファ
チジルPG500、界面活性剤として0.39重量％のジパルミ
トイルホスファチジルコリン、活性物質として0.133Mの
グリシンを用い、実施例７と同様にリポソーム水溶液を
調製した。

得られたリポソームの平均直径は217nm、トラップ体
積はリン原子のモル当り、0.52/molであった。

〔発明の効果〕

本発明のリポソーム形成剤は、水と混合し、撹拌した
だけで自然に粒径の小さなリポソームを形成することが
できる。本発明を用いて製造した小さなリポソームは、
従来の方法によって製造したもの（例えば超音波照射に
より得られたもの）よりも安定である。また、本発明に
よる粒径の小さなリポソームの製造法は、簡便で、従来
の方法に必要な機械的操作や界面活性剤の除去等に煩わ
されることがない。すなわち、本発明は、従来の課題で
あった、リポソームの大きさ、大量生産性、保存安定性
にたいする問題点をすべて解決しているもので、その利
用価値は大きく、医薬品等に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は参考例１で得られたジホスファチジ
ルPEG400の核磁気共鳴スペクトル及び赤外線吸収スペク
トルをそれぞれ示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 黒崎 富裕 大阪府泉南郡岬町淡輪1465 (72)発明者 国生 純孝 東京都国立市谷保7026―３

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）一般式（Ｉ） 式中、Ａは下記（ｉ）及び／または（ii）の基を示し、 〔ここでR₁及びR₂は、それぞれ、同一もしくは異なっ
   て、−OCOR₃及び／または−OR₄（R₃及びR₄は同一もしく
   は異なって、それぞれ炭素数６〜32のアルキル基または
   アルケニル基）を示すか、（ｉ）の場合には、R₁とR₂が
   一緒になって次の基 を形成してもよい〕 Ｍは水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アン
   モニウム、アルキルアンモニウムまたはアルカノールア
   ンモニウムを示し、 Ｘは下記（１）〜（３）のいずれかの化合物HO−Ｘ−OH
   の残基である。 （１） HOＹ−Ｏ_mH〔ここでｍは２〜50の整数、Ｙ
   は炭素数２〜４のアルキレン基もしくは置換アルキレン
   基を示す〕で表わされるモノ又はポリエーテル （２） 縮合度２〜50のポリグリセリン （３） 分子内に一級アルコール基２個以上を有する炭
   素数４〜７の単糖類、二糖類及び糖アルコール類 で表わされるリン酸エステルと、 （ｂ）水溶性塩及び／または界面活性剤とからなるリポ
   ソーム形成剤。
2. 【請求項２】請求項１記載のリポソーム形成剤を用い、
   有効活性成分を包含せしめたリポソーム組成物。
3. 【請求項３】リポソームの平均直径が500nm以下である
   請求項２記載のリポソーム組成物。