JP2539209B2 - 細胞の破砕加工方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵母、放線菌、糸状菌、細菌、原生植物、
藻類、植物及び動物の細胞を含有する懸濁液を、機械式
冷凍機を用いて冷却された低温ガスによる冷気相領内で
微凍結粒とした後、該微凍結粒を噴射し衝突による衝撃
力を与えて、例えば該凍結粒中の細胞内の有用物質を回
収し易くするようにその細胞を加工する方法に関する。

従来の技術 従来から、酵母、細菌等の微生物細胞を凍結加工した
後その凍結物を粉砕することで、その細胞内成分が効率
よく回収できることは知られている。

特開昭53-29983号公報は、酵母等の菌体を１〜5mm径
に成形した後液化ガスと接触させて凍結し、ついで、該
凍結菌体を冷媒ガス雰囲気中で極低温下にスクリユーフ
イーダー等の粉砕機を用いて粉砕する方法を開示してい
る。しかし、この方法は、菌体内の水分を凍結し、１〜
5mm径の菌体成形物を破壊するものであり、菌体の破壊
率が低い。

これに対し、特公昭58-869号公報は、微生物菌体を含
む一定濃度の懸濁液を粒径約５〜10mm又は１cm³の凍結
粒にした後、これを凍結状態で微粉砕する微生物菌体破
壊物の製造方法を開示している。

しかし、特公昭58-869号公報の場合、凍結粒の大きさ
は上述のごとく粒径約５〜10mm又は１cm³であるため細
胞の加工率が悪く、また、この種の大きさの凍結粒を粉
砕するためにはハンマーミルやボールミルを使用するこ
ととなり、粉砕中に熱を発生して有用物質が変性した
り、あるいは、ボールの破砕物が混入したり、過度の破
砕により細胞壁及び細胞内構造物が超微細片に破砕され
て回収すべき有用物質中に混入したりするなどを避けた
粉砕の良好な条件設定が困難であり、細胞内有用物質を
純粋な状態で回収し難いという欠点があつた。

かかる従来の欠点を解決するために、本出願人は、昭
和61年12月29日付特許出願（発明の名称「細胞の破砕加
工法」）において、細胞含有懸濁液を微凍結粒として噴
射衝突による衝撃力を与えて細胞壁に損傷を与えること
により、細胞内有用物質を効率よく回収する方法を提案
した。この方法は、細胞含有懸濁液を、好ましくは表面
に漣が形成された液化ガス冷媒中に投下し、又は、該液
化ガス冷媒の蒸発により生成した冷媒蒸発ガスから成る
冷気相領域に落下して細胞含有微凍結粒に形成せしめた
後、該細胞含有微凍結粒に噴射衝突による衝撃力を与え
て細胞壁に損傷を与えるものである。

発明が解決しようとする問題点 しかし、上記昭和61年12月29日付特許出願の方法で
は、細胞懸濁液の凍結に多量の冷媒を必要とし、必要と
するエネルギ原単位は未だ高く、省エネルギ化を有効に
実現したものとは言い難く、細胞の破砕加工にかかるコ
ストの低減も不十分である。

本発明は、かかる観点から、液化ガス冷媒を実質的に
使用することなく細胞含有懸濁液の凍結を実現できる方
法を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明の第１発明によれば、上記目的は、細胞を含有
する懸濁液を500ミクロン以下の液滴として、該液滴を
機械式冷凍機を用いて冷却された空気、窒素ガス、アル
ゴンガス等の低温ガスにより形成される冷気相領域にお
いて落下せしめて実質的に粒径500ミクロン以下の細胞
含有微凍結粒とした後、該細胞含有微凍結粒を噴射衝突
せしめて細胞壁に損傷を与えることを特徴とする細胞の
破砕加工方法によつて達成される。

又、本発明の第２発明によれば、上記目的は、細胞を
含有する懸濁液を500ミクロン以下の液滴として、該液
滴を機械式冷凍機を用いて冷却された空気、窒素ガス、
アルゴンガス等の低温ガスと冷媒蒸発ガスとから形成さ
れる冷気相領域において落下せしめて実質的に粒径500
ミクロン以下の細胞含有微凍結粒とした後、該細胞含有
微凍結粒を噴射衝突せしめて細胞壁に損傷を与えること
を特徴とする細胞の破砕加工方法によつて達成される。

本発明において、細胞を含有する凍結粒（以下 氷
粒、凍結粒、細胞含有凍結粒または細胞含有微凍結粒な
どと記すこともある）の大きさ及び形状は、公知のノズ
ルから噴出可能なものであれば特に限定されるものでは
ないが、粒径が500ミクロン以上であると噴出に多大の
噴射エネルギーを要するため、実質上粒径が500ミクロ
ン以下の凍結粒であることが好ましく、特に、品温−15
℃以下、好ましくは−50℃以下の温度を有する粒径500
ミクロン以下のさらさらした氷粒であることが好まし
い。

また、本発明において、細胞含有凍結粒の噴射位置と
衝突により衝撃力を与える位置即ち衝突面との間隔は、
噴射速度および量の関係において自由に調節しうるもの
であるが、その間隔を大きくするほど衝突面への細胞含
有凍結粒の噴射面積が大きくなり破砕エネルギーのロス
を生じ易くなることから、通常10〜100mm程度であるこ
とが好ましい。

また、本発明において、細菌含有凍結粒の細胞含有量
が多すぎると細胞を懸濁する溶媒の凍結以外に細胞内水
分も凍結する結果、噴出による過度の細胞破砕が生じて
細胞内超微細構造物片及び細胞壁片の混入が多くなるた
めか、細胞内有用物質の回収率が低下し、又、細胞含有
量が低すぎると細胞壁に十分な損傷を与えることができ
なくなるので、0.005g/ml〜0.5g/mlであることが好まし
い。

本発明において、該細胞を懸濁する媒体は、細胞ある
いはその有用内容物に影響をおよぼすものでないかぎ
り、特に限定されることはないが、一般に、水、生理食
塩水、緩衝液、等浸透圧溶液、塩類溶液、等の水性媒体
が簡便かつ良好であり、その他メタノール、エタノー
ル、プロパノール等の低級アルキルアルコール類、アセ
トン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン等の低級ア
ルキルケトン類等の親水性有機溶媒を含有せしめた水溶
液の有機溶媒含有水性媒体やエチレンクロライド（mp−
35.3℃、bp83.7℃）、tert−ブチルクロライド（mp−2
8.5℃、bp51.0℃）、メチレンクロライド（mp−96℃、b
p41.6℃）、クロラール（mp−57.5℃、bp98℃）、クロ
ロホルム（mp−63.5℃、bp61.2℃）、四塩化炭素（mp−
22.6℃、bp76.7℃）等の有機溶媒の一種またはそれらの
混合溶媒、さらにこれらに他の有機溶媒、例えば酢酸メ
チル、プロピオン酸メチル等の低級脂肪酸エステル、シ
クロヘキサン、シクロペンタン、ペンタン、ヘプタン、
ベンゼン等の炭化水素系溶媒を混和して用いてもよい。

本発明において、冷気相領域を形成する低温ガス用の
被冷却ガスとしては、空気のほか窒素ガス、アルゴンガ
ス等の細胞を変性させることのない不活性なガスが使用
される。

本発明において、被凍結原料の噴霧粒子を凍結させる
に必要な冷気相温度つまり低温ガスの温度は、細胞含有
懸濁液の種類によつて異なるが、実用上からすると、凍
結時間したがつて容器の容量等との関係から−60℃〜−
130℃にしておくことが望ましい。

また第２発明の方法は、冷凍機により冷却された低温
ガスを供給するのみでは必要とする冷気相温度が確保で
きない場合に好適し、低温ガスの供給に加えて冷媒蒸発
ガスを容器内に噴出させ、低温ガスと冷媒蒸発ガスとの
混合ガスによつて、冷気相温度を第１発明の方法による
場合に比して短時間により低温に維持しておくことがで
きる。この場合、噴出器を使用して、冷媒を低温ガスと
混合した上で該低温ガスの噴出力により容器内に噴出さ
せるようにするのがよい。

また、第２発明の方法で使用する冷媒蒸発ガスは、液
体窒素、液体ヘリウム、液体アルゴン、液体空気、液体
炭酸ガス、メタン、エタン、プロパン等の液化ガスの液
状冷媒の気化によるガスを適宜選択して用いることがで
きる。

本発明において用いる機械式冷凍機としては、特に三
元冷凍機が好適であるが、冷凍機は、適宜、２段以上連
結して使用することができる。第２発明の方法では冷媒
を使用するため、第１発明の方法に比して、一般に冷凍
機の能力を低くできる。

また本発明の方法において、被冷却ガスとして空気を
用いる場合には、冷凍機による低温化処理前に、圧縮機
で昇圧しておくと共に空気中の水分及び炭酸ガスを除去
しておくことが望ましい。空気の低温化に伴ない水分は
氷となり、炭酸ガスはドライアイスとなつて、低温ガス
の供給管を閉塞する等の不都合を生じる虞れがあるから
である。水分の除去装置としては、例えば合成ゼオライ
ト等の吸着剤を使用した除湿装置又はリバーシング熱交
換器を用いればよく、また炭酸ガスの除去装置として
は、例えば合成ゼオライト等の吸着剤を使用した除去装
置を用いればよい。ただし、炭酸ガスは、水と異なつ
て、炭酸ガスの分圧より−140℃〜−150℃で凍結してド
ライアイスとなるため、低温ガス温度が当該ドライアイ
ス生成温度以上である場合には、敢えて除去しておく必
要はない。また低温ガスと冷媒とを噴出器から混合噴出
させる場合には、低温ガス温度が上記ドライアイス生成
温度以上であるときにも、低温ガス中の炭酸ガスが冷媒
によつて凍結されることになるが、低温ガスと冷媒との
混合が噴出器から噴出される直前に行われるように、つ
まりこの混合を噴出器の噴出口近傍部位で行うようにし
ておけば、仮令ドライアイスが生成したとしても、極く
小径のものであり、上記不都合を生じる虞れはない。

また、低温ガスが清浄であることが特に要求される場
合には、メンブレンフイルタ等の高性能フイルタにより
清浄化した上で、低温ガスとして容器内に供給するよう
にすることが望ましい。この場合、被凍結原料噴霧用の
噴霧ガスも同様に清浄化しておくことが望ましい。

本発明において、細胞としては、特に限定されるもの
ではないが、例えば酵母、放線菌、糸状菌、細菌、原生
動物、原生植物、藻類、植物及び動物の細胞をいい、本
発明によれば、これらの細胞の細胞壁や細胞膜の細胞表
面に損傷を与えることにより、その細胞内有用物質、例
えば、ペプタイド、アルカロイド、ステロイド、サポニ
ン、酵素などの有用蛋白質、抗生物質、制ガン性物質、
不飽和高級脂肪酸、ビタミン類、天然甘味成分やその他
の生薬成分等の回収を効率的に行うことができ、また、
クロレラ、スピルリナ等の藻類の細胞表面に損傷を与え
その消化率を上昇せしめることができる。

ところで、第１発明の方法によれば−50℃〜−100℃
の細胞含有微凍結粒を製造することが可能であるが、
今、例えば−80℃の氷粒を1Kg製造するに必要な冷気相
エネルギが約125Kcalであるとして、この条件下で、第
１発明の方法を実施するに必要なエネルギ原単位を試算
してみると、被冷却ガスとして空気（20℃）を用いる場
合において、低温ガスの温度を−85℃としたときは1.13
KW/Kg.iceとなる。

すなわち、細胞含有微凍結粒1Kgを得るに必要な低温
ガス量は7.57Nm³であるから、この低温ガスを得るに要
する圧縮機の昇圧エネルギは、7.58×1.15（収率）×0.
1＝0.87KWである。また20℃の空気（7.58Nm³）を冷凍機
（２段冷凍機）で−85℃に冷却するに要する電力エネル
ギは、Ｑ＝7.58×1.25×0.24×100＝227.4Kcalであるか
ら、227.4÷860＝0.26KWである。したがつて、必要な全
エネルギ原単位は0.87＋0.26＝1.13KW/Kg.iceとなる。

また、低温ガス温度を−130℃としたときは0.69KW/K
g.iceとなる。

すなわち、細胞含有微凍結粒1Kgを得るに必要な低温
ガス量は4.17Nm³であるから、この低温ガスを得るに要
する圧縮機の昇圧エネルギは、4.17×1.15（収率）×0.
1＝0.48KWである。また20℃の空気（4.17Nm³）を冷凍機
（三元冷凍機）で−130℃に冷却するに要する電力エネ
ルギは、Ｑ＝187.5Kcalであるから、187.5÷860＝0.21K
Wである。したがつて、必要な全エネルギ原単位は0.48
＋0.21＝0.69KW/Kg.iceとなる。

一方、同一条件下で、従来方法を実施する場合に必要
なエネルギ原単位は5.25KW/Kg.iceとなる。すなわち、
冷媒蒸発ガスの温度を−150℃としたとき、冷媒たる液
体窒素（及びこれに注入する窒素ガス）は約3.5Nm³/Kg
・ice必要となり、また液体窒素生産時の原単位は約1.5
KW/Nm³であるから、必要な電力エネルギつまりエネルギ
原単位は3.5×1.5＝5.25KW/Kg.iceとなる。

このように、第１発明の方法においては、液化窒素等
の冷媒を全く必要としないから、必要とするエネルギ原
単位は従来方法の略1/7で済み、エネルギ原単位を大幅
に低減することができる。

また、第２発明の方法によれば上記したように−50℃
〜−100℃の細胞含有微凍結粒を製造することが可能で
あるが、今、例えば−130℃の細胞含有微凍結粒を1Kg製
造するに必要な冷気相エネルギが約140Kcalであるとし
て、この条件下で、第２発明の方法を実施するに必要な
エネルギ原単位を試算してみると、被冷却ガスとして空
気（20℃）及び冷媒として液体窒素を用いる場合におい
て、−80℃に冷却した低温ガス（2.95Nm³）と液体窒素
（0.95Nm³）とを混合させることによつてその混合ガス
の温度を−150℃としたとき、1.9KW/Kg.iceとなる。

すなわち、2.95Nm³の空気を得るに要する圧縮機の昇
圧エネルギは、2.95×1.15×0.1＝0.339KWである。20℃
の空気（2.95Nm³）を冷凍機で−80℃に冷却するに要す
る電力エネルギは、Ｑ＝2.95×1.25×0.24×100＝88.5K
calであるから、88.5÷860＝0.103KWである。また0.95N
m³の液体窒素については、上記した如く生産時の原単位
が1.5KW/Nm³であるから、0.95×1.5＝1.43KW必要であ
る。したがつて、必要な全エネルギ原単位は0.339＋0.1
03＋1.43＝1.872KW/Kg.iceとなる。

一方、従来方法を同一条件下で実施する場合に必要な
エネルギ原単位は、冷媒蒸発ガスの温度を−150℃とし
たとき、冷媒たる液体窒素（及びこれに注入する窒素ガ
ス）は3.9Nm³/Kg.ice必要となることから、3.9×1.5＝
5.85KW/Kg.iceとなる。

したがつて、第２発明の方法においては、低温ガスに
加えて冷媒を使用するため、第１発明に比べれば必要エ
ネルギ原単位が若干増加するものの、従来方法に対して
はその略1/3にエネルギ原単位を低減することができ
る。

次に、第１図乃至第９図に基いて、本発明を実施する
に好適な装置例について説明する。

第１図は、細胞含有液滴を冷気相領域中に落下または
投下することにより凍結させ、これを噴射衝突させて行
なう本発明を実施するに好適な装置の概略図であり、第
１図中、全体的に50で示すのは、後で詳述する微凍結粒
製造装置であり、ここで細胞含有懸濁液は、好ましくは
500ミクロン以下の微凍結粒に製造される。該微凍結粒
は噴射や装置91の持つエゼクタ機能によつて、凍結粒回
収口６より取出管82を介して回収ボツクス90の上部に設
けられた噴射装置91の側部入口に導かれる。該噴射装置
91の中央入口には微凍結粒を加速して衝突面、例えば抵
抗体としての硬質板92に噴射せしめるための低温の窒素
ガス又は空気（加速用ガス）が管93を介して供給されて
いる。噴射装置91のノズル端からの噴射位置と衝突面と
の距離Ｄは微凍結粒の形状及び大きさによつて適宜選択
可能であるが、通常、10mm〜100mmの間に設定され、噴
射時の微凍結粒は前記の冷媒により融点以下の品温に保
持して噴射せしめればよい。このようにして噴射装置91
から噴射された微凍結粒は、例えば硬質板92に衝突し粉
砕される。尚、抵抗体としての硬質板92は例示であつて
板状、曲面状の種々の形状のものでもよく、さらにその
材質は、微凍結粒の硬さ及び噴射速度に応じて適宜選択
可能であるが、セラミツク製や金属製のものが好ましく
用いられる。また硬質板の代りに、第８図に示す如く、
微凍結粒を少なくとも２以上の噴射装置91から噴出して
微凍結粒同士を噴射衝突せしめてもよい。その際噴射角
度αは特に限定されるものではないが衝突面との距離Ｄ
として２以上の噴射装置91からの噴射交叉点とする場
合、60〜120度程度の角度にて衝突せしめればよい。

さらにこのようにして衝突せしめた後、その後部に抵
抗体を設置して二段衝突せしめてもよいものである。

さらに上述の如くして噴射衝突せしめた細胞含有微凍
結粒は、衝突により破砕されると同時に噴射装置内にて
舞つているため、例えば第９図に示す如くの試料回収装
置を用いて、この装置内にて噴射せしめることが好まし
い。この試料回収装置（直径500mm、高さ110mm）の中心
部に上記の噴射装置を１または２以上設置し、次いで噴
射せしめることにより、噴出された微凍結粒は衝突した
後水平方向に拡散し、かつその仕切板94により減圧、減
速されて、破砕された微凍結粒が回収される。さらにこ
のようにして回収された破砕微凍結粒は、必要に応じて
一旦解凍後、再度微凍結粒となして、２回以上噴射衝突
せしめて破砕させてもよい。

次に、第１図の微凍結粒製造装置50について第２図を
参照しながら詳細に説明する。

第２図において、１は内径400mm、高さ約1500mmとし
た横断面形状円形の断熱密閉容器たる微凍結粒製造容器
で、上部に冷気排出口1aを有すると共に噴霧装置２を設
けてある。この噴霧装置２は、細胞含有懸濁液供給管３
及び噴霧ガス導入管４を接続して、供給管３から供給し
た細胞含有懸濁液を導入管４から導入した窒素ガス、空
気等の噴霧ガスによつて容器１内に下方向に霧状に噴出
させるように構成してある。なお、導入管４には噴霧ガ
ス清浄用のフイルタ4aを介設してある。また容器１の下
部には、凍結粒回収口６を連設した網状体５が傾斜状に
張設されていて、容器１内を上下二室1b,1cに区画して
いる。なお、網状体５として150メツシユのSUS304製金
網を使用してある。

また８は被冷却ガス源９から容器１の下室1cに導いた
低温ガス供給管である。この供給管８には、被冷却ガス
源９側から順次直列配置して、圧縮機10、水分除去装置
11、熱交換器12、フイルタ13を介設してある。圧縮機10
としては、被冷却ガスを5Kg/cm²に昇圧しうる能力92Nm³
/hのものを使用してある。水分除去装置11としては、吸
着材として合成ゼオライトを用いる圧力変動式の除湿器
を使用してある。熱交換器12は、これと冷凍機14との間
を循環する冷媒（Ｒ−12）によつて、被冷却ガスを熱交
換冷却するもので、フイン式（冷媒蒸発温度−80℃、熱
交換能力2500Kcal/h）のものを使用してある。また冷凍
機14としては、冷凍能力2500Kcal/h、軸動力5.0KWhの三
菱電機株式会社製冷凍機を使用してある。フイルタ13と
しては、メンブレンフイルタ（除塵能力0.1μｍ）を使
用した。なお、前記フイルタ4aもこれと同様のものを使
用してある。

第２図の装置の作用を説明すると、まず被冷却ガスた
る空気（20℃）を圧縮機10、水分除去装置11、熱交換器
12、フイルタ13を経過させて供給管８から容器１の下室
1cに供給する。すなわち、空気を圧縮機10で5Kg/cm²ら
昇圧した上、熱交換器12内において冷凍機14からの冷媒
と熱交換させて−80℃に冷却し、その低温空気をフイル
タ13により清浄化した上で、容器１の下室1cに供給す
る。なお、被冷却ガスとして空気以外の窒素ガス、アル
ゴンガス等を用いる場合には、圧縮機10及び水分除去装
置11は必要としない。また、当該細胞含有微凍結粒製造
装置の設置工場に乾燥空気ラインがある場合には、この
ラインの乾燥空気を被冷却ガスとして或はその一部とし
て利用することができる。例えば、第１図に鎖線で示す
如く、乾燥ライン16を低温ガスを供給管８に接続する。

そして、容器１の下室1cに供給した低温空気が網状体
５を通過して上室1b内に充満して、該上室1b内を冷気相
雰囲気に維持するようになつた時点で、被凍結原料たる
細胞含有懸濁液を噴霧器２から噴霧する。すなわち、噴
霧器２に細胞含有懸濁液を供給すると共に噴霧ガスたる
窒素ガスを導入して、水を前記冷気相雰囲気中に下向き
に噴霧する。

なお、噴霧ガスとして被冷却ガスと同一のガスを用い
る場合（例えば被冷却ガス及び噴霧ガスとして空気を用
いる場合）には、第１図に鎖線で示す如く導入管４を供
給管８に分岐接続して、被冷却ガスの一部（例えば除湿
処理した乾燥空気）を噴霧ガスとして利用するようにし
てもよい。

このようにすると、低温空気は、被凍結原料の噴霧粒
子たる細胞含有懸濁液滴と逐次熱交換することによつて
密度差を生じ、これによつて冷気排出口1a方向に徐々に
上昇する。一方、被凍結原料の噴霧粒子たる液滴は、上
室1b内の冷気相雰囲気中を自然落下し、この間において
上昇してくる低温空気と熱交換して凍結し、その凍結粒
たる細胞含有凍結粒は網状体５上に落下到達して、凍結
粒回収口６に回収される。

次に、第２発明の実施に好適な装置例を第３図に示す
微凍結粒製造装置を用いて説明する。この凍結粒製造装
置は、第２図の微凍結粒製造装置と代替可能であり、圧
縮機10、熱交換器12、冷凍機14として第２図の装置のも
のより低能力のものを使用した点、及び低温ガスと冷媒
たる液体窒素とを混合噴出する噴出器17を設けた点以
外、前記した凍結粒製造装置と同一構造のものであるか
ら、同一構成部分については、第３図に第２図における
符号と同一の符号を付すことによつて、その説明は省略
する。噴出器17は噴出口を容器１の下室1c内に臨ませて
設けたもので、低温ガス供給管８及び冷媒供給管18を接
続して、低温ガスと冷媒とを噴出口近傍部位で混合した
上で、冷媒を低温ガスと共に該ガスの噴出力でもつて、
下室1c内に霧状に噴出させるように構成してある。また
圧縮機10としては、圧力5Kg/cm²、能力35Nm³/hの株式会
社日立製作所製圧縮機を使用し、熱交換器12としては、
冷媒蒸発温度−85℃、能力800Kcal/hのフイン式のもの
を使用し、冷凍機14としては、能力800Kcal/h、軸動力
1.6KWhの三菱電機株式会社製冷凍機を使用している。

第３図の装置の作用を説明すると、まず被冷却ガスた
る空気（20℃）を圧縮機10で5Kg/cm²に昇圧した上、熱
交換器12、冷凍機14により−80℃に冷却し、その低温空
気をフイルタ13により清浄化した上で、噴霧器17に供給
すると共に、冷媒供給管18から液体窒素（−196℃）を
噴霧器17に供給し、液体窒素を低温空気と共に容器１の
下室1c内に霧状に噴出させる。なお、被冷却ガスとして
空気以外の窒素ガス、アルゴンガス等を用いる場合に
は、圧縮器10及び水分除去装置11は必要とせず、当該微
凍結粒製造装置の設置工場に乾燥空気ラインがある場合
には、このラインの乾燥空気を被冷却ガス（及び噴霧ガ
ス）として或はその一部として利用することができるこ
とは勿論である。

そして、この低温ガスと冷媒との混合ガス（−160
℃）が網状体５を通過して上室1b内に充満して、該上室
1b内を冷気相雰囲気に維持するようになつた時点で、被
凍結原料たる細胞含有懸濁液を噴霧器２から噴霧する。
すなわち、噴霧装置２に細胞含有懸濁液を供給すると共
に噴霧ガスを導入して、細胞含有懸濁液を前記冷気相雰
囲気中に下向きに噴霧するのである。なお、噴霧ガスと
しては、第３図に示す如く導入管４を供給管８に分岐接
続することによつて、被冷却ガスの一部つまり除湿処理
した乾燥空気を用いるようにしている。

本発明において、噴霧した細胞含有懸濁液滴を微凍結
粒にする条件としては、細胞含有懸濁液噴霧量、微凍結
粒を形成するための冷却用気相温度、気相温度を一定に
保つに必要な冷媒ガス発生量、粒径、微凍結粒落下速
度、微凍結粒の冷気との接触時間を考慮する必要がある
が、これ等は当業者であれば実験によつて適宜定め得る
ところである。

尚、第１図に示した装置は、各種の修正・変更が可能
であることは言うまでもない。

すなわち、第４図に示す装置にあつては、凍結粒製造
容器１の上部に冷気排出口1aを介して連通する排熱回収
室26を設け、この排熱回収室26の下壁部に凍結粒噴射装
置91を取付け、この凍結粒噴射装置91に凍結粒取出管82
及び加速用ガス導入管93を接続して、適宜圧に加圧した
空気、窒素ガス等の加速用ガスを導入管93から噴射装置
91に導入すると、この加速用ガスの作用によるエゼクタ
効果によつて、微凍結粒Ｉが取出管82を経て噴射装置91
に吸引されて、硬質板92に噴射衝突されるように構成し
てある。そして、前記導入管93の排熱回収室26における
部分29は、加速用ガスを冷気排出口1aから排熱回収室26
にもたらされた冷気22と熱交換して冷却させる一種の熱
交換器に構成してある。すなわち、この熱交換器たる導
入管部分29は、低温ガス22との接触面積を大きくすべく
蛇行状に配管すると共に、外周部に多数のフインを突設
した厚肉管に構成して、伝熱面積の増大と蓄熱効果の向
上を図つている。導入管部分29の構成材としては熱伝導
率の高い銅合金等が適当である。

このようにしておくと、加速用ガス専用の冷却手段を
設けずとも、加速用ガスを充分冷却し得て、噴射される
微凍結粒の硬度低下又は凍結粒同志の融着等を防止し、
硬質板92への衝突による細胞壁の破壊を良好に行いう
る。しかも、導入管部分29をフイン付の厚肉管に構成し
たことによつて、微凍結粒製造装置を間欠運転する場合
において低温ガス22の発生が行われていないときにも、
蓄熱効果により加速用ガスの冷却を確保することができ
る。なお、上記構成としておくことで、加速用ガスを冷
気排出口1aから排出される低温ガス22の温度近くまで冷
却することが可能であるが、それ以下に冷却する必要が
ある場合には、例えば液体窒素等の冷媒を排熱回収室26
の上部に設けた冷媒噴霧ノズル30から導入管部分29に噴
霧させるようにすればよい。

また、網状体５を、第１図、第２図、第３図、第４図
に示す如く傾斜状に張設せず、第５図に示す如く水平に
張設して、網状体５′上に溜積した微凍結粒Ｉを、シリ
ンダー31等により網状体５′上を進退せしめられるスク
レーパ32によつて、容器１に連設した凍結粒回収室33の
ホツパー部33aに回収するようにしてもよい。ホツパー
部33aに回収した微凍結粒Ｉは、導入管93による加速用
ガスの導入によつて、凍結粒供給管82を介して噴射器91
に吸込まれて硬質板92に噴射衝突されるようになつてい
る。

さらに第１図に示した装置は、網状体の容器内部分を
容器１外に移動できるように構成したものでもよい。例
えば、第６図に示す如く、矢印方向に回行駆動する網状
体たる無端メツシユベルト５″を備えてなるコンベア35
でもつて容器１内を上下二領域1b,1cに区画すると共
に、コンベア35の搬送終端部を凍結粒回収室33に導い
て、メツシユベルト５″の容器内部分上に溜積した凍結
粒Ｉをコンベア35の搬送終端部から凍結粒回収室33のホ
ツパー部33aに回収するようにする。また第７図に示す
如く、網状体たる回転搬５を適宜の駆動機構36により
水平回転させることによつて、回転盤５の容器内部分
上に溜積した微凍結粒を凍結粒回収室33内にもたらした
上、適宜のスクレーパ装置37でホツパー部33aに回収す
るようにする。

第４図乃至第７図に示した変形例は、本発明の第２発
明を実施する装置として示した第３図の装置を第１図の
装置で使用した場合も、同様に適用し得ることは言うま
でもない。

実施例 次に、本発明による細胞の破砕加工法の実施例につい
て説明するが、本発明はこれによつて何んら限定される
ものではない。

実施例１ 市販の製パン用生イースト（東洋醸造（株）製）を水
に懸濁し、約0.1g/mlのイースト懸濁液を調整した。

そして、前述の第１図の装置（微凍結粒製造装置50は
前述の第２図のもの）を用いて実験を行なつた。該装置
中、低温ガス供給管８から低温空気を流量80Nm³/hr.で
供給し冷気相領域（−80℃）を形成した。

凍結原液を上記イースト懸濁液、混合用気体を高圧容
器内に貯溜した窒素ガス（25℃）として、イースト懸濁
液を10l/hr.の流量、および窒素ガスを1Nl/hr.の流量に
て両者を混合し、噴霧装置２から混合後のスプレー圧2.
6Kg/cm²にて混合流体を冷気相領域中に下向きに噴霧し
た。

この条件下において、−70℃のさらさらしたイースト
菌体含有氷粒を10Kg/hr製造することができ、その平均
粒径は100〜200μｍであつた。

この氷粒は、8.3mm径のノズルを有する噴射装置91か
ら噴射された。このとき、噴射装置91の中央入口から供
給される加速用の窒素ガスは、加速圧力4.7〜5Kg/cm²、
温度−70℃であり、氷粒のノズルからの噴射時の温度は
−70℃であつた。以上の条件下で、噴射距離Ｄを20mm、
50mmに設定して氷粒の噴射を行つた後、それぞれのイー
スト菌体含有破砕粒を回収した。

イースト懸濁液、イースト菌体含有氷粒、および、イ
ースト菌体含有破砕粒を、各々、水に懸濁した後、遠心
分離し、各々の試料イースト菌体区分とその上清液区分
を得た。

これらの上清液区分については、その各々についてア
ルコールデヒドロゲナーゼ活性およびローリーホリン法
による蛋白質の定量を行つた。その結果を、表１に示
す。

（試験方法） アルコールゲヒドロゲナーゼ活性の測定は、0.05Mバ
ルビタール緩衝液（pH8.6）を0.63ml、0.25％ニトロテ
トラゾリウムブルー（NTB）水溶液（同仁化学研究所
製）を0.10ml、10％アルブミン（牛の血清）（Armour P
harmaceutical CO.社製、Fraction V Powder）を0.02m
l、10mM NAD（β−NAD⁺オリエンタル酵母社製）を0.10m
l、100U/mlデイアホラーゼ（DI）（東洋醸造社製）を0.
05ml、1Mエタノールを0.10mlから成る反応混合液1.00ml
を用いて吸光光度法により行つた。

まず、1mlの上記反応混合液をガラスセルに入れて37
℃で５分間予備加温した後、上記の各試料10μｌを加え
て37℃で10分間放置し、其の後、0.1Nの塩酸を2mlを加
えて反応を停止させ波長550mμにおける試料の吸光度As
を求めた。

次に1mlの上記反応混合液をガラスセルに入れて37℃
で15分間放置した後、0.1NのHCIを2ml、試料を10μｌ加
え、波長550mμにおけるブランクの吸光度Abを求めた。

試料の吸光度As及びブランクの吸光度Abから次式によ
り試料のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を求めた。

上式中、16.4：還元型NTBの分子吸光係数 （cm²／μmol） 10：反応時間（分） 3.01：最終溶量（ml） 0.01：酵素溶液量（ml） である。

ローリーホリン法によるタンパク質の定量について
は、次のように行われた。

試料0.5mlを後述の方法で調整された試薬a5mlととも
にガラスセル内でよく混合し、室温下で10分間放置した
後、市販品（和光製薬社製）を水で２倍希釈して調整し
たローリーホリン試薬0.5mlを素早く加え、30分間放置
した。その後、吸光光度法により、750μｍにて吸光度
を測定し、牛血清アルブミンの検量線に基き定量した。

なお、試薬ａは、1NのNaOHにNaCO₃を溶解して濃度２
％とした試薬（１）と１％クエン酸ナトリウムにCuSO₄・
5H₂Oを溶解して濃度0.5％とした試薬（２）とを使用直
前に混合して得られたアルカリ性試薬である。

実施例２ 市販の製パン用生イースト（東洋醸造（株）製）を水
に懸濁し、約0.05g/mlのイースト懸濁液を調整した。

そして、前述の第１図の装置（微凍結粒製造装置50は
前述の第３図のもの）を用いて実験を行なつた。該装置
中、噴霧器17に液体窒素（−196℃）を流量10Nm³/hr.、
低温空気を流量30Nm³/hr.で供給し冷気相領域（−160
℃）を形成した。

凍結原液を上記イースト懸濁液、混合用気体を高圧容
器内に貯溜した窒素ガス（25℃）として、イースト懸濁
液を10l/hr.の流量、および窒素ガスを1Nl/hr.の流量に
て両者を混合し、噴霧装置２から混合後のスプレー圧2.
5Kg/cm²にて混合流体を冷気相領域中に下向きに噴霧し
た。

この条件下において、−130℃のさらさらしたイース
ト菌体含有氷球を10Kg/hr製造することができ、その平
均粒径は100〜200μｍであつた。

実施例１と同様に、この氷球を噴射してイースト菌体
含有破砕粒を回収した後、実施例１と同様の分析を実施
した。

その結果を第２表に示す。

発明の効果 本発明によれば、推定であるが細胞内の有用物質を低
温条件における物質の変性を伴なうことなく回収するこ
とが可能となり、又、従前のボールミル等による粉砕に
見られたような過度の破砕による超細片化された菌体内
構造物及び細胞壁の混入もなく、また、熱による変性も
受けることのない純粋な細胞内有用物質を得ることがで
きる。

また、本発明は細胞含有液を一定粒径の微凍結粒とし
て一定の条件設定のもとに噴霧するため、細胞の加工も
連続的に効率よく行なうことができる。

しかも、細胞含有懸濁液を凍結させるための冷気相源
として機械式冷凍機で冷却した空気等の低温ガス若しく
はこれと冷媒蒸発ガスとの混合ガスを用いるようにした
ため、多量の冷媒を使用する必要がなく、凍結粒を得る
に必要なエネルギ原単位を大幅に低減することができ、
省エネルギ化を有効に実現することができ、細胞破砕加
工に要するコストも大幅に低減できるのである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施に好適な装置の概略図である。 第２図は第１図中の微凍結粒製造装置の系統図である。 第３図は第２図の装置と代替可能な装置であつて本発明
の第２発明の実施に好適な微凍結粒製造装置の系統図で
ある。 第４図乃至第７図は第１図の装置の変形例を示す概略の
縦断側面図である。 第８図は２以上の噴射装置による本発明の実施に好適な
装置の概略図である。 第９図（Ａ）は噴射後の試料回収装置の全体概略図であ
り、第９図（Ｂ）は第９図（Ａ）の装置の側断面図であ
る。 尚、図面中、 １……凍結粒製造容器、1a……冷気排出口、1b……容器
の上室、1c……容器の下室、２……細胞含有懸濁液の噴
霧器、5,5′,5″,5……網状体、６……凍結粒回収
口、８……低温ガス供給管、９……被冷却ガス源、10…
…圧縮機、11……水分除去装置、12……熱交換機、13…
…フイルタ、14……冷凍機、17……噴出器、18……冷媒
供給管、22……低温ガス、26……排熱回収室、29……導
入管部分（熱交換機）、30……冷媒噴射ノズル、31……
シリンダー、32……スクレーパ、33……凍結粒回収室、
33a……ホツパー部、35……コンベア、36……駆動機
構、37……スクレーパ、50……微凍結粒製造装置、91…
…噴射装置、92……硬質板 である。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞を含有する懸濁液を500ミクロン以下
   の液滴として、該液滴を機械式冷凍機を用いて冷却され
   た低温の空気、窒素ガスまたはアルゴンガスにより形成
   される冷気相領域中を落下せしめて粒径500ミクロン以
   下の細胞含有微凍結粒とした後、該細胞含有微凍結粒を
   噴射衝突せしめて細胞壁に損傷を与えることを特徴とす
   る細胞の破砕加工方法。
2. 【請求項２】低温の空気、窒素ガスまたはアルゴンガス
   は複数段の機械式冷凍機によって冷却されることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の細胞の破砕加工方
   法。
3. 【請求項３】細胞を含有する懸濁液を500ミクロン以下
   の液滴として、該液滴を機械式冷凍機を用いて冷却され
   た低温の空気、窒素ガスまたはアルゴンガスと冷媒蒸気
   ガスとから形成される冷気相領域中を落下せしめて粒径
   500ミクロン以下の細胞含有微凍結粒とした後、該細胞
   含有微凍結粒を噴射衝突せしめて細胞壁に損傷を与える
   ことを特徴とする細胞の破砕加工方法。
4. 【請求項４】低温の空気、窒素ガスまたはアルゴンガス
   は複数段の機械式冷凍機によって冷却されることを特徴
   とする特許請求の範囲第３項に記載の細胞の破砕加工方
   法。