JP2525289B2 - 真核細胞における遺伝子発現のための迅速、多用途で、単純な系 - Google Patents
真核細胞における遺伝子発現のための迅速、多用途で、単純な系Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は1986年９月３日に出願された系続中のシリア
ル番号第905253号（参照することによりここに含む）の
部分継続出願である。親出願（S/N905253）は、真核細
胞における外来の遺伝子の発現に関し、特に、例えばよ
り高等な組織における、ことに哺乳類の細胞のような真
核細胞における、バクテリアやウイルスの遺伝子を例と
する原核遺伝子の利用に関する。しかし、この親出願に
おいて開示された発現系により達成されるタンパク質合
成のレベルは、限定されたものである。本発明は、親出
願において記載された基本的な系を拡張し、はるかに高
いタンパク質合成のレベルを有する、真核細胞における
遺伝子発現のための改良された迅速、多用途な系を提供
する。
ル番号第905253号（参照することによりここに含む）の
部分継続出願である。親出願（S/N905253）は、真核細
胞における外来の遺伝子の発現に関し、特に、例えばよ
り高等な組織における、ことに哺乳類の細胞のような真
核細胞における、バクテリアやウイルスの遺伝子を例と
する原核遺伝子の利用に関する。しかし、この親出願に
おいて開示された発現系により達成されるタンパク質合
成のレベルは、限定されたものである。本発明は、親出
願において記載された基本的な系を拡張し、はるかに高
いタンパク質合成のレベルを有する、真核細胞における
遺伝子発現のための改良された迅速、多用途な系を提供
する。
発明の要約 本発明の目的は、特に真核細胞において原核転写系を
使用する場合に、真核細胞においてキャップに依存しな
いRNAへの翻訳を可能にする効率のよい発現系を提供す
ることにある。
使用する場合に、真核細胞においてキャップに依存しな
いRNAへの翻訳を可能にする効率のよい発現系を提供す
ることにある。
本発明のもう一つの目的は、毒性遺伝子の発現制御の
ための方法を提供することにある。
ための方法を提供することにある。
その他の目的および利点は、本発明の次の詳細な説明
から明らかになる。
から明らかになる。
図面の簡単な説明 本発明のこれらおよびその他の目的、特徴、多くの付
帯的な利点は、添付の図面に関連して、次の詳細な説明
を読むことによってよく理解することができる。この図
面において、 図１は、本発明による発現カセットの概略構造を示
す。略号：RT7，バクテリオファージT7のφ10プロモー
ター−23から＋1;5′hp,φ10プロモーターの下流の、ヘ
アピンまたはステム・ループ構造を形成することができ
るヌクレオチド＋１から＋26;TT7，バクテリオファージ
T7φ10終止配列;EMC、EMCVのUTRのヌクレオチド163から
746。
帯的な利点は、添付の図面に関連して、次の詳細な説明
を読むことによってよく理解することができる。この図
面において、 図１は、本発明による発現カセットの概略構造を示
す。略号：RT7，バクテリオファージT7のφ10プロモー
ター−23から＋1;5′hp,φ10プロモーターの下流の、ヘ
アピンまたはステム・ループ構造を形成することができ
るヌクレオチド＋１から＋26;TT7，バクテリオファージ
T7φ10終止配列;EMC、EMCVのUTRのヌクレオチド163から
746。
図２は、ワクシニアウイルス感染中のCAT合成の経時
研究の結果を示す。CV−１細胞の単層を、１細胞あたり
20PFUの正常型ワクシニアウイルスに感染させ（レーン
９）、各ウイルスについて１細胞につき10PFUの多数倍
の量でvTF7−３およびvTF7CATに共に感染させ（レーン
1,2,5,6,10,11）、またはvTF7−３およびvTF7EMCATに共
同感染させた（レーン3,4,7,8,12,13）。感染後２、７
および24時間目に、細胞はメチオニンについて20分間飢
餓状態にし、次に、［35S］メチオニンで30分間パルス
ラベル（瞬間標識）を行った。飢餓およびパルスラベル
は、等張性（レーン1,3,5,7,9,10,12）または高張性（1
90mMのNaCl）（レーン2,4,6,8,11,13）の条件において
行われた。細胞溶解物を調製し、２×105個の細胞に対
応する同一の体積を10％NaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲルの各レーンに加えた。電気泳動に続いて、ゲルにフ
ルオログラフィーの処理を行った。矢印は、CATタンパ
ク質を示す。
研究の結果を示す。CV−１細胞の単層を、１細胞あたり
20PFUの正常型ワクシニアウイルスに感染させ（レーン
９）、各ウイルスについて１細胞につき10PFUの多数倍
の量でvTF7−３およびvTF7CATに共に感染させ（レーン
1,2,5,6,10,11）、またはvTF7−３およびvTF7EMCATに共
同感染させた（レーン3,4,7,8,12,13）。感染後２、７
および24時間目に、細胞はメチオニンについて20分間飢
餓状態にし、次に、［35S］メチオニンで30分間パルス
ラベル（瞬間標識）を行った。飢餓およびパルスラベル
は、等張性（レーン1,3,5,7,9,10,12）または高張性（1
90mMのNaCl）（レーン2,4,6,8,11,13）の条件において
行われた。細胞溶解物を調製し、２×105個の細胞に対
応する同一の体積を10％NaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲルの各レーンに加えた。電気泳動に続いて、ゲルにフ
ルオログラフィーの処理を行った。矢印は、CATタンパ
ク質を示す。
図３は、感染後の24時間によるCATタンパク質の蓄積
を示す。CV−１細胞単層を、１細胞あたり20PFUの正常
型のワクシニアウイルス（A,レーン1;B,中実の棒）、ま
たは、各ウイルスについて１細胞あたり10PFUの多数倍
のvTF7−３およびvTF7CAT（A,レーン2;B,斜線の棒）、
または、vTF7−３およびvT7EMCAT（A,レーン３および4;
B,中空の棒）により共同感染させる。感染後４時間で、
等張性の培地を、維持するか（A,レーン１から3;B,パー
ト１）、または190mMのNaC1（高張性）へと変更した
（A,レーン4;＃B,パート２）。感染から24時間後に細胞
溶解物を調製し、20μｇのタンパク質を10％のNaDodSO4
−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに加え、電気泳動
に続いて、このゲルをクーマシーブリリアントブルー
（Ａ）により染色し、またはCAT活性を本文中に記載す
るようにして決定した。
を示す。CV−１細胞単層を、１細胞あたり20PFUの正常
型のワクシニアウイルス（A,レーン1;B,中実の棒）、ま
たは、各ウイルスについて１細胞あたり10PFUの多数倍
のvTF7−３およびvTF7CAT（A,レーン2;B,斜線の棒）、
または、vTF7−３およびvT7EMCAT（A,レーン３および4;
B,中空の棒）により共同感染させる。感染後４時間で、
等張性の培地を、維持するか（A,レーン１から3;B,パー
ト１）、または190mMのNaC1（高張性）へと変更した
（A,レーン4;＃B,パート２）。感染から24時間後に細胞
溶解物を調製し、20μｇのタンパク質を10％のNaDodSO4
−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに加え、電気泳動
に続いて、このゲルをクーマシーブリリアントブルー
（Ａ）により染色し、またはCAT活性を本文中に記載す
るようにして決定した。
図４は、EMCVのUTRを含有するRNAのキャップに依存し
ない翻訳を示す。BamHIにより消化されたpT7CAT（レー
ン１〜４）またはpT7EMCAT（レーン５〜８）をテンプレ
ート（鋳型）として用いて、試験管内での転写を行っ
た。メチル化されていない（GpppG）またはメチル化さ
れた（m7GpppG）によりキャップされたRNAを含有するレ
ーンを指摘してある。単球菌により処理したウサギの網
状赤血球溶解物における翻訳を、8nMのRNA濃度により、
明示したように0.1mMのメチル化されたGDP（m7GDP）の
存在下または不存在のもとで行った。
ない翻訳を示す。BamHIにより消化されたpT7CAT（レー
ン１〜４）またはpT7EMCAT（レーン５〜８）をテンプレ
ート（鋳型）として用いて、試験管内での転写を行っ
た。メチル化されていない（GpppG）またはメチル化さ
れた（m7GpppG）によりキャップされたRNAを含有するレ
ーンを指摘してある。単球菌により処理したウサギの網
状赤血球溶解物における翻訳を、8nMのRNA濃度により、
明示したように0.1mMのメチル化されたGDP（m7GDP）の
存在下または不存在のもとで行った。
図５は、感染した細胞内でなされたCATのRNAのポリリ
ボソーム会合および試験管内翻訳を示す。（Ａ）HeLa細
胞を、細胞あたり10PFUのvTF7−３、および細胞あたり1
0PFUのvT7CAT（黒点で示す）またはvT7EMCAT（中空の点
で示す）のいずれかにより共同感染させた。12時間後、
細胞質抽出物を調製し、ショ糖密度勾配上で沈降させ
た。各フラクションの260nmでの光学濃度を測定し、モ
ノソームピークの位置を示してある。各フラクションの
20μ１のサンプルを、スロット・ブロット装置を用いて
ニトロセルロース上に固定化し、そして［32Ｐ］CATプ
ローブへとハイブリッド形成した。オートラジオグラム
を作成し、バンドの強度をデンシトメトリーにより決定
した。指示したフラクション（水平ライン）をプール
し、試験管内翻訳のために処理した。（Ｂ）このプール
されたRNAのサンプル（１μｇ）を、ウサギの網状赤血
球溶解物において、12.5μ１の最終反応容積で、0.1mM
のm7GDPとともに（＋）またはそれなしで（−）、翻訳
した。RNAなし（レーン１）、ポリリボソーム会合T7−C
ATのRNA（レーン２、３）、ポリリソーム会合T7のEMCV
のUTR−CATのRNA（レーン４、５）、遊離T7−CATのRNA
（レーン６、７）、遊離T7EMCVのUTR−CATのRNA（レー
ン８、９）のそれぞれの翻訳生成物をNaDodSO4−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析し、フルオログラ
ムを作成した。
ボソーム会合および試験管内翻訳を示す。（Ａ）HeLa細
胞を、細胞あたり10PFUのvTF7−３、および細胞あたり1
0PFUのvT7CAT（黒点で示す）またはvT7EMCAT（中空の点
で示す）のいずれかにより共同感染させた。12時間後、
細胞質抽出物を調製し、ショ糖密度勾配上で沈降させ
た。各フラクションの260nmでの光学濃度を測定し、モ
ノソームピークの位置を示してある。各フラクションの
20μ１のサンプルを、スロット・ブロット装置を用いて
ニトロセルロース上に固定化し、そして［32Ｐ］CATプ
ローブへとハイブリッド形成した。オートラジオグラム
を作成し、バンドの強度をデンシトメトリーにより決定
した。指示したフラクション（水平ライン）をプール
し、試験管内翻訳のために処理した。（Ｂ）このプール
されたRNAのサンプル（１μｇ）を、ウサギの網状赤血
球溶解物において、12.5μ１の最終反応容積で、0.1mM
のm7GDPとともに（＋）またはそれなしで（−）、翻訳
した。RNAなし（レーン１）、ポリリボソーム会合T7−C
ATのRNA（レーン２、３）、ポリリソーム会合T7のEMCV
のUTR−CATのRNA（レーン４、５）、遊離T7−CATのRNA
（レーン６、７）、遊離T7EMCVのUTR−CATのRNA（レー
ン８、９）のそれぞれの翻訳生成物をNaDodSO4−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析し、フルオログラ
ムを作成した。
発明の詳細な説明 本発明の上記またはその他の種々の目的および利点
は、ベクターがDNAに基づく細胞質ウイルスであり、RNA
ポリメラーゼおよびプロモーターがDNAバクテリオファ
ージからのものであり、リボソーム結合部位がRNAウイ
ルスからである発現系により達成される。望ましい実施
例は、図１に示すように、T7プロモーター、脳心筋炎ウ
イルス（encephalomyocarditis virus;ECMV）非翻訳部
分（untranslated region;UTR）、および発現が望まれ
るタンパク質ためのT7プロモーター制御の遺伝子を含む
ように構成された組換えワクシニアウイルスからなる。
しかし、キャップ非依存翻訳を可能にする非翻訳部分
は、ポリオウイルスおよびメンゴウイルスなど関連した
ウイルスを含むEMCV以外のものから、さらにアデノウイ
ルス等の無関係のウイルスから得ることもできる。な
お、脳心筋炎ウイルス（ECMV）は、カルジオウイルス
（cardiovirus）属の種である。ここに示す例は、単に
説明のためであり、限定的なものではない。例えば、本
発明の教えるとことに従い、バクテリオファージSP6、T
3およびGH1といったその他の原核転写系を、真核細胞に
おける発現のために採用することも可能であろう。
は、ベクターがDNAに基づく細胞質ウイルスであり、RNA
ポリメラーゼおよびプロモーターがDNAバクテリオファ
ージからのものであり、リボソーム結合部位がRNAウイ
ルスからである発現系により達成される。望ましい実施
例は、図１に示すように、T7プロモーター、脳心筋炎ウ
イルス（encephalomyocarditis virus;ECMV）非翻訳部
分（untranslated region;UTR）、および発現が望まれ
るタンパク質ためのT7プロモーター制御の遺伝子を含む
ように構成された組換えワクシニアウイルスからなる。
しかし、キャップ非依存翻訳を可能にする非翻訳部分
は、ポリオウイルスおよびメンゴウイルスなど関連した
ウイルスを含むEMCV以外のものから、さらにアデノウイ
ルス等の無関係のウイルスから得ることもできる。な
お、脳心筋炎ウイルス（ECMV）は、カルジオウイルス
（cardiovirus）属の種である。ここに示す例は、単に
説明のためであり、限定的なものではない。例えば、本
発明の教えるとことに従い、バクテリオファージSP6、T
3およびGH1といったその他の原核転写系を、真核細胞に
おける発現のために採用することも可能であろう。
その旨を特に定義しない限り、ここで用いられるすべ
ての技術的、科学的用語は、本発明の属する技術分野の
いわゆる当業者により一般的に理解されているものと同
じ意味をもつものである。ここに記載されたものと類似
または等価のいかなる方法または原料を本発明の実施ま
たは試験に用いることができるが、望ましい方法および
原料を記載する。以下に言及するすべての刊行物は、こ
こで参照することによりここに含まれるものである。特
に言及しない限り、ここで採用または考慮された技術
は、いわゆる当業者によく知られた標準的な方法であ
る。原料、方法および例は、説明のためであり、限定的
ではない。
ての技術的、科学的用語は、本発明の属する技術分野の
いわゆる当業者により一般的に理解されているものと同
じ意味をもつものである。ここに記載されたものと類似
または等価のいかなる方法または原料を本発明の実施ま
たは試験に用いることができるが、望ましい方法および
原料を記載する。以下に言及するすべての刊行物は、こ
こで参照することによりここに含まれるものである。特
に言及しない限り、ここで採用または考慮された技術
は、いわゆる当業者によく知られた標準的な方法であ
る。原料、方法および例は、説明のためであり、限定的
ではない。
原料および方法 原料 制限エンドヌクレアーゼは、ニューイングランド
・バイオラブズ（New England Biolabs）、ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labora
tories）、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Man
nheim）から入手した。m7GpppG、GpppG、m7GDPは、ファ
ーマシア（Pharmacia）から、T7RNAポリメラーゼおよび
ウサギ網状赤血球溶解物は、プロメガ・バイオテック
（Promega Biotec）から入手した。
・バイオラブズ（New England Biolabs）、ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Labora
tories）、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Man
nheim）から入手した。m7GpppG、GpppG、m7GDPは、ファ
ーマシア（Pharmacia）から、T7RNAポリメラーゼおよび
ウサギ網状赤血球溶解物は、プロメガ・バイオテック
（Promega Biotec）から入手した。
ウイルスおよび細胞 ワクシニアウイルス（WR株）は、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amer
ican Type Culture Collection）から最初に入手した。
ウイルスを、すでに報告されているようにして精製した
（Fuerst etal,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83,8122−
8126）。HeLaのＳ−３細胞は、５％のウマ血清により補
われたイーグルの最低必須培地に懸濁して成長させた。
CV−１サル腎臓細胞を、10％のウシ胎児血清を含むダル
ベッコの変更イーグル培地において単層として繁殖させ
た。細胞を、すでに報告されている方法による感染させ
た（Fuerst et al,1987,Mol.Cell Biol.7,2538−2544;F
uerst et al,1989,J.Mol.Biol.206:333−348）。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amer
ican Type Culture Collection）から最初に入手した。
ウイルスを、すでに報告されているようにして精製した
（Fuerst etal,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83,8122−
8126）。HeLaのＳ−３細胞は、５％のウマ血清により補
われたイーグルの最低必須培地に懸濁して成長させた。
CV−１サル腎臓細胞を、10％のウシ胎児血清を含むダル
ベッコの変更イーグル培地において単層として繁殖させ
た。細胞を、すでに報告されている方法による感染させ
た（Fuerst et al,1987,Mol.Cell Biol.7,2538−2544;F
uerst et al,1989,J.Mol.Biol.206:333−348）。
プラスミドの構成 EMCVのUTRのヌクレオチド163から74
6を含むpE5LVPO（Parks et al,1986,J.Virol.60,376−3
84）からの0.6キロ塩基対（kbp）のEcoR1−BallのEMC断
片を、プラスミドベクターpAR2529（Rosenberg et al,1
987,Gene56,125−135）の平滑化されたBamH1部位へと挿
入し、pTF7.25EMC−１を生成した。CATコード化配列
を、pTF7CAT−１から分離し（Fuerst et al,上記）、0.
8kbpのTaq1断片として、そしてBamH1を利用して、pUC18
のBamH1部位へとリンカーを挿入し、プラスミドpUC18CA
T−１を生成した。ついで0.8kbpのBamH1のCAT断片をpUC
18CAT−１から分離し、EMCの主要な転写開始部位の下流
のプラスミドpTF7.25EMC−１のユニークなBamH1部位へ
と挿入し、プラスミドpTF7.25EMCAT−１を形成した。こ
れにより、12のアミノ酸残基により分離されたEMCの主
要開始信号とともにフレームされるようにCAT翻訳開始
部位を置くこととなった。CATのコード化フレームは、
部位指向的変異誘発によりEMC開始コドンのすぐに下流
に置かれた。開始EMCのATGにすぐに隣接する配列は、ユ
ニークなNcol部位を提供する５′−EMC・・・GATAATACC
ATGGAG・・・CAT−３′へと変更された。CAT遺伝子に含
まれるNcol部位は、コード化配列内のサイレントな変異
を置くことにより取り除くことができる。変異を起こさ
れたEMCのCATカセットは、次に、0.82kbpのBamH1−Kpn1
断片として分離され、プラスミドpTF7.25EMCAT−１内の
対応する部位に挿入され、pTF7.25EMCAT−20を生成し
た。単純化のため、pTE7.25EMCAT−20およびpTF7CAT−
１をそれぞれ、pT7EMCATおよびpT7CATと呼ぶこととす
る。
6を含むpE5LVPO（Parks et al,1986,J.Virol.60,376−3
84）からの0.6キロ塩基対（kbp）のEcoR1−BallのEMC断
片を、プラスミドベクターpAR2529（Rosenberg et al,1
987,Gene56,125−135）の平滑化されたBamH1部位へと挿
入し、pTF7.25EMC−１を生成した。CATコード化配列
を、pTF7CAT−１から分離し（Fuerst et al,上記）、0.
8kbpのTaq1断片として、そしてBamH1を利用して、pUC18
のBamH1部位へとリンカーを挿入し、プラスミドpUC18CA
T−１を生成した。ついで0.8kbpのBamH1のCAT断片をpUC
18CAT−１から分離し、EMCの主要な転写開始部位の下流
のプラスミドpTF7.25EMC−１のユニークなBamH1部位へ
と挿入し、プラスミドpTF7.25EMCAT−１を形成した。こ
れにより、12のアミノ酸残基により分離されたEMCの主
要開始信号とともにフレームされるようにCAT翻訳開始
部位を置くこととなった。CATのコード化フレームは、
部位指向的変異誘発によりEMC開始コドンのすぐに下流
に置かれた。開始EMCのATGにすぐに隣接する配列は、ユ
ニークなNcol部位を提供する５′−EMC・・・GATAATACC
ATGGAG・・・CAT−３′へと変更された。CAT遺伝子に含
まれるNcol部位は、コード化配列内のサイレントな変異
を置くことにより取り除くことができる。変異を起こさ
れたEMCのCATカセットは、次に、0.82kbpのBamH1−Kpn1
断片として分離され、プラスミドpTF7.25EMCAT−１内の
対応する部位に挿入され、pTF7.25EMCAT−20を生成し
た。単純化のため、pTE7.25EMCAT−20およびpTF7CAT−
１をそれぞれ、pT7EMCATおよびpT7CATと呼ぶこととす
る。
pT7EMCATプラスミドの寄託は、メリーランド州ロック
ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（the ATCC,Rockville,Maryland）に1989年７月７日
に、受託番号第68045号として、なされた。この寄託
は、生存したまま維持され、特許の有効期間中に生存し
なくなったならば置き換えて、寄託日から30年の期間ま
たは寄託株のサンプルの請求の最終日から５年間のいず
れか遅い方まで、特許がされれば法の規定に従って制限
なしに公衆に提供される。特許商標庁の長官は、請求が
あれば、寄託株を入手、利用する権利を有する。
ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（the ATCC,Rockville,Maryland）に1989年７月７日
に、受託番号第68045号として、なされた。この寄託
は、生存したまま維持され、特許の有効期間中に生存し
なくなったならば置き換えて、寄託日から30年の期間ま
たは寄託株のサンプルの請求の最終日から５年間のいず
れか遅い方まで、特許がされれば法の規定に従って制限
なしに公衆に提供される。特許商標庁の長官は、請求が
あれば、寄託株を入手、利用する権利を有する。
ワクシニアウイルス挿入ベクターは、BgIII断片とし
て、完全なT7プロモーター−標的遺伝子−T7ターミネー
ターカセットを除去し、端部を平滑化し、pGS50の平滑
化されたEcoR1部位に挿入することにより調製すること
ができる（Fuerst et al,上記）。これにより、相同な
組換えに用いられるワクシニアウイルスチミジンキナー
ゼ（TK）配列に標的遺伝子カセットを隣接させる結果と
なった。ワクシニアウイルスのゲノム中への組換えおよ
び組換えウイルスの分離は、マケットらの論文（Macket
t et al,1984,J.Virol.49:857−864）に記載されたよう
にして行われた。
て、完全なT7プロモーター−標的遺伝子−T7ターミネー
ターカセットを除去し、端部を平滑化し、pGS50の平滑
化されたEcoR1部位に挿入することにより調製すること
ができる（Fuerst et al,上記）。これにより、相同な
組換えに用いられるワクシニアウイルスチミジンキナー
ゼ（TK）配列に標的遺伝子カセットを隣接させる結果と
なった。ワクシニアウイルスのゲノム中への組換えおよ
び組換えウイルスの分離は、マケットらの論文（Macket
t et al,1984,J.Virol.49:857−864）に記載されたよう
にして行われた。
試験管内での転写 プラスミドは、BamH1により消化さ
れて、T7転写ユニットを線状のDNA断片として放出し
た。転写は、GTP濃度が0.05mMであって、m7GpppGまたは
GpppGが0.5mMの濃度で加えられたほかは、プロメガ・バ
イオテック（Promega Biotec）が推奨するようにして行
った。各転写反応混合物の一部は［アルファ32P］UTPを
含んでおり、生成物を0.4％のポリアクリルアミド−ユ
リアゲル上で分析し、単一の適当な大きさの主要RNA種
の存在を確認した。転写物（transcript）の収率を、セ
ファデクス（Sephadex）Ｇ−50カラムによる２回のスピ
ンろ過と２回のエタノールによる沈澱に続いて、260nm
での吸収率から計算した。
れて、T7転写ユニットを線状のDNA断片として放出し
た。転写は、GTP濃度が0.05mMであって、m7GpppGまたは
GpppGが0.5mMの濃度で加えられたほかは、プロメガ・バ
イオテック（Promega Biotec）が推奨するようにして行
った。各転写反応混合物の一部は［アルファ32P］UTPを
含んでおり、生成物を0.4％のポリアクリルアミド−ユ
リアゲル上で分析し、単一の適当な大きさの主要RNA種
の存在を確認した。転写物（transcript）の収率を、セ
ファデクス（Sephadex）Ｇ−50カラムによる２回のスピ
ンろ過と２回のエタノールによる沈澱に続いて、260nm
での吸収率から計算した。
試験管内での翻訳 最終反応体積が12.5μｌであり、指
摘した場合には0.1mMのm7GDPをキャップ依存翻訳の特異
的な阻害剤として用いたほかは、プロメガ・バイオテッ
クにより記載されたようにして、RNAをウサギ網状赤血
球溶解物において翻訳した。翻訳反応混合物中の試験管
内または生体内において生成されたRNAの濃度は、それ
ぞれ、8nMまたは80ng/μｌであった。翻訳に続いて、9M
のユリアと、75mMのEDTAと、1.5mMのフェニルメチルス
ルフォニルフロリドと、8000U/mlのRNアーゼ（RNase）T
1および40μl/mlのRNアーゼＡを含む溶液を25μｌ、30
℃でさらに30分のインキュベーションのために加え、ア
ミノアシル化されたtRNAを消化した。翻訳混合物の10μ
ｌのサンプルを、NaDodSO4およびメルカプトエタノール
により解離させ、ペレチエら（Pelletier et al,1988,M
ol.Cell.Biol.8,1101−1112）により記載されたように
して15％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分
析した。
摘した場合には0.1mMのm7GDPをキャップ依存翻訳の特異
的な阻害剤として用いたほかは、プロメガ・バイオテッ
クにより記載されたようにして、RNAをウサギ網状赤血
球溶解物において翻訳した。翻訳反応混合物中の試験管
内または生体内において生成されたRNAの濃度は、それ
ぞれ、8nMまたは80ng/μｌであった。翻訳に続いて、9M
のユリアと、75mMのEDTAと、1.5mMのフェニルメチルス
ルフォニルフロリドと、8000U/mlのRNアーゼ（RNase）T
1および40μl/mlのRNアーゼＡを含む溶液を25μｌ、30
℃でさらに30分のインキュベーションのために加え、ア
ミノアシル化されたtRNAを消化した。翻訳混合物の10μ
ｌのサンプルを、NaDodSO4およびメルカプトエタノール
により解離させ、ペレチエら（Pelletier et al,1988,M
ol.Cell.Biol.8,1101−1112）により記載されたように
して15％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分
析した。
RNAの調製と分析 HeLaのＳ−３細胞（５×108）を、組
換えワクシニアウイルスによりフースト等が記載したよ
うにして共同感染させ（Fuerst et al,上記）、12時間
後、抽出物を調製し、カッツェらが記載したようにして
（Katze et al,1986,J.Virol.60:1027−1039）、ショ糖
の勾配上で沈降させた。各フラクションの一部は、260n
mでの吸収率の測定に用い、［32P］により標識されたCA
TのDNAプローブによるスロット・ブロット・ハイブリッ
ド形成のために用いた（White et al,1982,J.Biol.Che
m,157,8569−8572）。ポリリボソームおよび遊離RNAを
含有するフラクションを別個に保存して、エタノールに
より沈降させ、4mlの0.1Mのトリス−HCl（pH7.5）−12m
MのEDTA−0.15MのNaCl−0.1％NaDodSO4において再懸濁
させた。プロテイナーゼＫを最終濃度が50μg/mlとなる
ように加え、この混合物を37℃で30分間培養した。RNA
をフェノールクロロホルムにより３回抽出し、クロロホ
ルムにより２度抽出し、エタノールで沈降させ、70％の
エタノールで洗浄し、水中に懸濁させた。各サンプルの
一部を、1.4％のアガロース−ホルムアルデヒドゲルに
おいて電気泳動によって、その大きさについて分析し
た。RNAをニトロセルロース膜に移し、［32P］で標識さ
れたCATのDNAプローブへとハイブリッド形成した。
換えワクシニアウイルスによりフースト等が記載したよ
うにして共同感染させ（Fuerst et al,上記）、12時間
後、抽出物を調製し、カッツェらが記載したようにして
（Katze et al,1986,J.Virol.60:1027−1039）、ショ糖
の勾配上で沈降させた。各フラクションの一部は、260n
mでの吸収率の測定に用い、［32P］により標識されたCA
TのDNAプローブによるスロット・ブロット・ハイブリッ
ド形成のために用いた（White et al,1982,J.Biol.Che
m,157,8569−8572）。ポリリボソームおよび遊離RNAを
含有するフラクションを別個に保存して、エタノールに
より沈降させ、4mlの0.1Mのトリス−HCl（pH7.5）−12m
MのEDTA−0.15MのNaCl−0.1％NaDodSO4において再懸濁
させた。プロテイナーゼＫを最終濃度が50μg/mlとなる
ように加え、この混合物を37℃で30分間培養した。RNA
をフェノールクロロホルムにより３回抽出し、クロロホ
ルムにより２度抽出し、エタノールで沈降させ、70％の
エタノールで洗浄し、水中に懸濁させた。各サンプルの
一部を、1.4％のアガロース−ホルムアルデヒドゲルに
おいて電気泳動によって、その大きさについて分析し
た。RNAをニトロセルロース膜に移し、［32P］で標識さ
れたCATのDNAプローブへとハイブリッド形成した。
CATアッセイ CATをショーによる記載（Ahaw,1975,Meth
ods in Enzymology43,737−748）に変更を加えて測定し
た。６つの凹部を有するプレートにおいて融合製CV−１
細胞を感染させ、フェノールレッドなしで2.5％の牛胎
児血清を補った最少必須培地（Quality Biological,In
c.）で成長させた。感染後24時間で、細胞と培地を回収
し、NaDodSO4とクロロホルムをそれぞれ0.0005％と１％
になるように加えて、溶解させた。５から20μｌのサン
プルを96の凹部を有するプレートに移し、0.2mlの100mM
のトリス−HCl（pH7.8）/0.1mMアセチルCoA（補酵素
Ａ）/0.4mg/mlの5,5′ジチオビス２ニトロ安息香酸/0.1
mMのクロラムフェニコールを加えた。15分後には、マイ
クロプレートリーダー（Molecular Devices Corp.）に
より412nmでの吸収率を測定した。
ods in Enzymology43,737−748）に変更を加えて測定し
た。６つの凹部を有するプレートにおいて融合製CV−１
細胞を感染させ、フェノールレッドなしで2.5％の牛胎
児血清を補った最少必須培地（Quality Biological,In
c.）で成長させた。感染後24時間で、細胞と培地を回収
し、NaDodSO4とクロロホルムをそれぞれ0.0005％と１％
になるように加えて、溶解させた。５から20μｌのサン
プルを96の凹部を有するプレートに移し、0.2mlの100mM
のトリス−HCl（pH7.8）/0.1mMアセチルCoA（補酵素
Ａ）/0.4mg/mlの5,5′ジチオビス２ニトロ安息香酸/0.1
mMのクロラムフェニコールを加えた。15分後には、マイ
クロプレートリーダー（Molecular Devices Corp.）に
より412nmでの吸収率を測定した。
望まれるタンパク質（この例では、CAT）の精製され
た形での分離のために、従来からの分離・精製技術が採
用された。このような技術は、この技術分野におけるい
わゆる当業者によく知られた遠心分離、ろ過、クロマト
グラフィー、電気泳動、透析等を含む。
た形での分離のために、従来からの分離・精製技術が採
用された。このような技術は、この技術分野におけるい
わゆる当業者によく知られた遠心分離、ろ過、クロマト
グラフィー、電気泳動、透析等を含む。
結果 CAT発現についてのEMCVのUTRの効果 バクテリオファー
ジT7RNAポリメラーゼにより生成され、ワクシニアウイ
ルスによりコード化された圧倒的にキャップされていな
い転写物（transcript）に、EMCVのUTRが増強されたキ
ャップ非依存性の翻訳を付与するかどうかを決定するた
めに、哺乳類細胞において、pT7CATおよびpT7EMCATのふ
たつのプラスミドを作成した。それぞれはT7φ10プロモ
ーターを含有しており、後者によるCAT遺伝子は、図１
に示すようにT7RNA開始部位からEMCVのUTRの下流のヌク
レオチド163から746に対応するEMCVのUTRのセグメント
をも有していた。CAT活性を、T7RNAポリメラーゼを発現
するヘルパーウイルスvTF7−３（Fuerst et al,上記）
に感染している細胞中に各T7プロモータープラスミドを
トランスフェクションしたのち24時間にわたって測定し
た。EMCVのUTRにより与えられる約７倍の増強は、いく
つかの独立した実験において再現された。T7ステム・ル
ープを含まないT7EMCATプラスミドにより発現されるCAT
のレベルは、T7EMCATに比べて10分の１であった。この
ことは、EMCVのUTRが相当の二次的構造を有することが
期待される事実にもかかわらず、T7ステム・ループが発
現のために必要であることを示している。pT7CATおよび
vT7EMCATの両方が発現カセットに隣接するワクシニアウ
イルス・チミジンキナーゼ配列を有しており、組換えワ
クシニアウイルスvT7CATおよびvT7EMCATを生成すること
を容易にする。細胞をT7プロモーター含有組換えウイル
スおよびvTF7−３（T7RNAポリメラーゼを提供するため
に）により同時に感染させたのちに、CAT発現を測定し
た。総合的な結果は、繰り返された実験においてEMCVの
UTRが発現を４から５倍に増強した点をのぞいては、対
応するプラスミドによるトランスフェクションにより得
られたものと同様であった。
ジT7RNAポリメラーゼにより生成され、ワクシニアウイ
ルスによりコード化された圧倒的にキャップされていな
い転写物（transcript）に、EMCVのUTRが増強されたキ
ャップ非依存性の翻訳を付与するかどうかを決定するた
めに、哺乳類細胞において、pT7CATおよびpT7EMCATのふ
たつのプラスミドを作成した。それぞれはT7φ10プロモ
ーターを含有しており、後者によるCAT遺伝子は、図１
に示すようにT7RNA開始部位からEMCVのUTRの下流のヌク
レオチド163から746に対応するEMCVのUTRのセグメント
をも有していた。CAT活性を、T7RNAポリメラーゼを発現
するヘルパーウイルスvTF7−３（Fuerst et al,上記）
に感染している細胞中に各T7プロモータープラスミドを
トランスフェクションしたのち24時間にわたって測定し
た。EMCVのUTRにより与えられる約７倍の増強は、いく
つかの独立した実験において再現された。T7ステム・ル
ープを含まないT7EMCATプラスミドにより発現されるCAT
のレベルは、T7EMCATに比べて10分の１であった。この
ことは、EMCVのUTRが相当の二次的構造を有することが
期待される事実にもかかわらず、T7ステム・ループが発
現のために必要であることを示している。pT7CATおよび
vT7EMCATの両方が発現カセットに隣接するワクシニアウ
イルス・チミジンキナーゼ配列を有しており、組換えワ
クシニアウイルスvT7CATおよびvT7EMCATを生成すること
を容易にする。細胞をT7プロモーター含有組換えウイル
スおよびvTF7−３（T7RNAポリメラーゼを提供するため
に）により同時に感染させたのちに、CAT発現を測定し
た。総合的な結果は、繰り返された実験においてEMCVの
UTRが発現を４から５倍に増強した点をのぞいては、対
応するプラスミドによるトランスフェクションにより得
られたものと同様であった。
発現についての高張培地の効果 CAT発現に対する高張
性の効果を決定するために、CV−１細胞をvTF7−３に感
染させて、T7RNAポリメラーゼおよびvT7CATまたはvT7EM
CATのいずれかを得た。タンパク質合成を、等張または
高張性（190mM）の培地において感染させたのちに異な
る時間をおいて、［35S］メチオニンで標識した細胞か
らの細胞質タンパク質のNaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲルによる電気泳動によってモニターした（図２）。感
染から２時間後、優勢な宿主タンパク質があらゆる条件
下で標識された（レーン１から４）。しかし、６時間ま
でには、宿主タンパク質合成は阻害されて、タンパク質
合成の後期パターンが確立された（レーン５から８）。
CATポリペプチドに大きさにおいて対応するあるバンド
を、vT7EMCAT（レーン７）に感染した細胞からのタンパ
ク質のオートラジオグラムにおいて明らかに見いだすこ
とができたが、vT7CATに感染した細胞からのタンパク質
（レーン６）ではほとんど検出することができず、正常
型のワクシニアウイルスに感染した対照細胞からは失わ
れていた（図示せず）。さらに、高張の条件下において
は、vT7EMCATに感染した細胞において（レーン８）、CA
Tの標識の絶対的な増加があり、ワクシニアウイルスの
後期タンパク質の標識の減少があった。さらにその後、
vT7EMCATにより発現されたCATを、主要ウイルスタンパ
ク質（レーン９）の強度と同様な強度を有する顕著なバ
ンド（レーン10）として、容易に検出することができ
た。しかしこのとき、CATタンパク質は、等張の条件下
でvT7EMCATにより発現された顕著なバンド（レーン12）
であり、高張の条件下においてはさらに顕著であった
（レーン13）。フルオログラムのデンシトメーターによ
るトレースは、24時間後に［35S］メチオニンの78％のC
ATに組み込まれたことを示した。
性の効果を決定するために、CV−１細胞をvTF7−３に感
染させて、T7RNAポリメラーゼおよびvT7CATまたはvT7EM
CATのいずれかを得た。タンパク質合成を、等張または
高張性（190mM）の培地において感染させたのちに異な
る時間をおいて、［35S］メチオニンで標識した細胞か
らの細胞質タンパク質のNaDodSO4−ポリアクリルアミド
ゲルによる電気泳動によってモニターした（図２）。感
染から２時間後、優勢な宿主タンパク質があらゆる条件
下で標識された（レーン１から４）。しかし、６時間ま
でには、宿主タンパク質合成は阻害されて、タンパク質
合成の後期パターンが確立された（レーン５から８）。
CATポリペプチドに大きさにおいて対応するあるバンド
を、vT7EMCAT（レーン７）に感染した細胞からのタンパ
ク質のオートラジオグラムにおいて明らかに見いだすこ
とができたが、vT7CATに感染した細胞からのタンパク質
（レーン６）ではほとんど検出することができず、正常
型のワクシニアウイルスに感染した対照細胞からは失わ
れていた（図示せず）。さらに、高張の条件下において
は、vT7EMCATに感染した細胞において（レーン８）、CA
Tの標識の絶対的な増加があり、ワクシニアウイルスの
後期タンパク質の標識の減少があった。さらにその後、
vT7EMCATにより発現されたCATを、主要ウイルスタンパ
ク質（レーン９）の強度と同様な強度を有する顕著なバ
ンド（レーン10）として、容易に検出することができ
た。しかしこのとき、CATタンパク質は、等張の条件下
でvT7EMCATにより発現された顕著なバンド（レーン12）
であり、高張の条件下においてはさらに顕著であった
（レーン13）。フルオログラムのデンシトメーターによ
るトレースは、24時間後に［35S］メチオニンの78％のC
ATに組み込まれたことを示した。
感染から24時間後のCATタンパク質の総蓄積量を、ク
ーマシーブリリアントブルーでNaDodSO4−ポリアクリル
アミドゲルの染色と、CAT活性のアッセイにより決定し
た（図３）。等張培地において細胞を感染させ、このよ
うな条件に保つか、または４時間後に高張培地に移し
た。合計24時間の後に、細胞を溶解し、20μｇの細胞質
タンパク質を10％ポリアクリルアミドゲルの各レーンに
加えた。電気泳動に続いて、クーマシーブリリアントブ
ルーで染色したゲルのデンシトメトリーは、等張条件で
vT7CATまたはvT7EMCATから発現したとき、CATタンパク
質が総タンパク質のそれぞれ２％または７％を構成する
こと、そして高張条件でvT7EMCATから発現させたときに
は全タンパク質の10％をなすことを示した（図3A）。EM
CV・UTRによる発現に関する高張性の選択的な効果は、
感染後24時間の細胞から調製された抽出物中のCAT活性
の測定により確認された（図3B）。高張培地中のvT7EMC
ATから発現された場合のCAT活性は、vT7CATからの発現
レベルに比べて、10倍高かった。
ーマシーブリリアントブルーでNaDodSO4−ポリアクリル
アミドゲルの染色と、CAT活性のアッセイにより決定し
た（図３）。等張培地において細胞を感染させ、このよ
うな条件に保つか、または４時間後に高張培地に移し
た。合計24時間の後に、細胞を溶解し、20μｇの細胞質
タンパク質を10％ポリアクリルアミドゲルの各レーンに
加えた。電気泳動に続いて、クーマシーブリリアントブ
ルーで染色したゲルのデンシトメトリーは、等張条件で
vT7CATまたはvT7EMCATから発現したとき、CATタンパク
質が総タンパク質のそれぞれ２％または７％を構成する
こと、そして高張条件でvT7EMCATから発現させたときに
は全タンパク質の10％をなすことを示した（図3A）。EM
CV・UTRによる発現に関する高張性の選択的な効果は、
感染後24時間の細胞から調製された抽出物中のCAT活性
の測定により確認された（図3B）。高張培地中のvT7EMC
ATから発現された場合のCAT活性は、vT7CATからの発現
レベルに比べて、10倍高かった。
T7転写物の試験管中の翻訳特性に関するEMCVのUTRの効
果 EMCVのUTRがキャップされていないと考えられるT7
転写物の発現を生体中において高める際のメカニズムを
さらに調べるため、m7Gのキャップされた５′−未端に
より、またはそれなしで、RNAを合成し、試験管中の翻
訳特性を比較した。バクテリオファージT7RNAポリメラ
ーゼを用いて、EMCVのUTRがあり、またはなしでmRNAを
調製するために、pT7CATおよびpT7EMCATプラスミド（図
１）を転写した。高濃度のm7GpppGを転写反応に加える
ことにより、５′でメチル化されたキャップを含有する
転写物を生成し、GpppGを並行反応に加えて、翻訳にお
いては機能しないことが知られているがエキソヌクレア
ーゼによる分解に対してRNAを保護しうるメチル化され
ていないキャップを生成した。これらの転写物を、試験
管中でのメチル化されキャップされたmRNA翻訳の特異的
阻害剤であることが知られているキャップ類似m7GDPの
存在下またはその不存在の下で、ウサギ網状赤血球溶解
物中において翻訳した。EMCVのUTRが存在しないとき、T
7−CAT転写物の翻訳は、GpppGで終止されたRNAがm7Gppp
Gで終止されたRNAの翻訳に比べて不十分に翻訳されるた
め、メチル化されたキャップに依存することがわかった
（図４）。さらに、m7GpppGで終止されたRNAの翻訳は、
m7GDPにより阻害された（図４）。対照的に、T7−EMCV
のUTR−CAT転写物の翻訳は、５′キャップ構造にかかわ
らず非常に効率がよく、またm7GDPに対しても敏感でな
い。このことは、EMCVのUTRを含有するmRNAがキャップ
に依存せずに翻訳されたことを示している。m7GDPの特
異性は、異なる長さのポリペプチドをコード化するキャ
ップされた転写物をEMCVのUTRがありまたはなしで同時
に翻訳することにより、さらに示された。EMCVのUTRが
ないもののみが阻害され（データは示さない）。
果 EMCVのUTRがキャップされていないと考えられるT7
転写物の発現を生体中において高める際のメカニズムを
さらに調べるため、m7Gのキャップされた５′−未端に
より、またはそれなしで、RNAを合成し、試験管中の翻
訳特性を比較した。バクテリオファージT7RNAポリメラ
ーゼを用いて、EMCVのUTRがあり、またはなしでmRNAを
調製するために、pT7CATおよびpT7EMCATプラスミド（図
１）を転写した。高濃度のm7GpppGを転写反応に加える
ことにより、５′でメチル化されたキャップを含有する
転写物を生成し、GpppGを並行反応に加えて、翻訳にお
いては機能しないことが知られているがエキソヌクレア
ーゼによる分解に対してRNAを保護しうるメチル化され
ていないキャップを生成した。これらの転写物を、試験
管中でのメチル化されキャップされたmRNA翻訳の特異的
阻害剤であることが知られているキャップ類似m7GDPの
存在下またはその不存在の下で、ウサギ網状赤血球溶解
物中において翻訳した。EMCVのUTRが存在しないとき、T
7−CAT転写物の翻訳は、GpppGで終止されたRNAがm7Gppp
Gで終止されたRNAの翻訳に比べて不十分に翻訳されるた
め、メチル化されたキャップに依存することがわかった
（図４）。さらに、m7GpppGで終止されたRNAの翻訳は、
m7GDPにより阻害された（図４）。対照的に、T7−EMCV
のUTR−CAT転写物の翻訳は、５′キャップ構造にかかわ
らず非常に効率がよく、またm7GDPに対しても敏感でな
い。このことは、EMCVのUTRを含有するmRNAがキャップ
に依存せずに翻訳されたことを示している。m7GDPの特
異性は、異なる長さのポリペプチドをコード化するキャ
ップされた転写物をEMCVのUTRがありまたはなしで同時
に翻訳することにより、さらに示された。EMCVのUTRが
ないもののみが阻害され（データは示さない）。
ポリリボソームへのT7転写物の会合 もしEMCVのUTRの
有益な効果がキャップされていないメッセージのより効
率的な翻訳によるものであるならば、試験管中における
研究が示唆したように、これらの転写物のより高パーセ
ンテージがUTRを欠いているT7転写物のそれに比べてポ
リリボソームに会合しているべきである。これを評価す
るため、HeLa細胞をvTF7−３および、vT7CATまたはVT7E
MCATにより感染させ、12時間後に細胞質抽出物を調製
し、ショ糖密度勾配遠心分離を行った。モノソームピー
クを光学密度測定により位置決めし、CATmRNAの勾配に
沿った分布を［32P］CATプローブによる各フラクション
のサンプルのハイブリッド形成により決定した。オート
ラジオグラムを「スロットブロット」ハイブリッド形成
により作成し、各スロットの強度をデンシトメトリーに
より測定した。第5Aにまとめたこれらのデータは、同様
な量のT7−EMCV・UTR−CAT・RNAおよびT7−CATRNAがあ
るが、前者のより大きな部分が二染色体（disome）とよ
り思いポリリボソームとに会合していることを示した。
有益な効果がキャップされていないメッセージのより効
率的な翻訳によるものであるならば、試験管中における
研究が示唆したように、これらの転写物のより高パーセ
ンテージがUTRを欠いているT7転写物のそれに比べてポ
リリボソームに会合しているべきである。これを評価す
るため、HeLa細胞をvTF7−３および、vT7CATまたはVT7E
MCATにより感染させ、12時間後に細胞質抽出物を調製
し、ショ糖密度勾配遠心分離を行った。モノソームピー
クを光学密度測定により位置決めし、CATmRNAの勾配に
沿った分布を［32P］CATプローブによる各フラクション
のサンプルのハイブリッド形成により決定した。オート
ラジオグラムを「スロットブロット」ハイブリッド形成
により作成し、各スロットの強度をデンシトメトリーに
より測定した。第5Aにまとめたこれらのデータは、同様
な量のT7−EMCV・UTR−CAT・RNAおよびT7−CATRNAがあ
るが、前者のより大きな部分が二染色体（disome）とよ
り思いポリリボソームとに会合していることを示した。
ポリリボソームに会合したRNAおよび遊離したCATRNA
を別々にプールし、ウサギ網状赤血球溶解物中におい
て、m7GDPの存在下または不存在のもとで翻訳させた。N
aDodSO4−ポリアクリルアミドゲルのフルオログラム
（図5B）を検討した結果、いくつかの重要な発見があっ
た。まず、T7−EMCV・UTR−CAT・RNAのポリリボソーム
に結合したものと遊離したものの双方が、いずれのT7−
CAT・RNAフラクションよりもより効果的に翻訳された。
第二に、ポリリボソームに結合したT7−CAT・RNAの翻訳
はm7GDPにより阻害された一方、対応する遊離RNAは阻害
されなかった。第三に、ポリリボソームまたは遊離した
T7−EMCV・UTR−CAT・RNAのいずれか翻訳も、m7GDPによ
り阻害されなかった。特定の論理に結び付けることなし
に、これらの観察結果は次のように解釈することができ
る。少量のキャップされたT7−CAT転写物は、m7GDPによ
る翻訳の阻害の原因となるポリリボソームフラクション
に選択的に会合する。遊離したT7−CAT・RNAは、ほとん
どキャップされていないが、その量が大きいため、たと
え効率的でないにしてもキャップ非依存的に翻訳され
る。我々の行った試験管中における研究が、キャップさ
れたかまたはキャップされていないかのいずれの場合に
おいても、m7GDPにより阻害されないことを示している
ため、T7−EMCV・UTR−CAT・RNAのキャップ状態を判断
することはできなかった。しかしながら、T7−CATおよ
びT7−EMCV・UTR−CAT転写物の５′末端が、同一の５′
末端とステムループ構造を有するため、異なったように
キャップさせていると仮定する理由は存在しない。
を別々にプールし、ウサギ網状赤血球溶解物中におい
て、m7GDPの存在下または不存在のもとで翻訳させた。N
aDodSO4−ポリアクリルアミドゲルのフルオログラム
（図5B）を検討した結果、いくつかの重要な発見があっ
た。まず、T7−EMCV・UTR−CAT・RNAのポリリボソーム
に結合したものと遊離したものの双方が、いずれのT7−
CAT・RNAフラクションよりもより効果的に翻訳された。
第二に、ポリリボソームに結合したT7−CAT・RNAの翻訳
はm7GDPにより阻害された一方、対応する遊離RNAは阻害
されなかった。第三に、ポリリボソームまたは遊離した
T7−EMCV・UTR−CAT・RNAのいずれか翻訳も、m7GDPによ
り阻害されなかった。特定の論理に結び付けることなし
に、これらの観察結果は次のように解釈することができ
る。少量のキャップされたT7−CAT転写物は、m7GDPによ
る翻訳の阻害の原因となるポリリボソームフラクション
に選択的に会合する。遊離したT7−CAT・RNAは、ほとん
どキャップされていないが、その量が大きいため、たと
え効率的でないにしてもキャップ非依存的に翻訳され
る。我々の行った試験管中における研究が、キャップさ
れたかまたはキャップされていないかのいずれの場合に
おいても、m7GDPにより阻害されないことを示している
ため、T7−EMCV・UTR−CAT・RNAのキャップ状態を判断
することはできなかった。しかしながら、T7−CATおよ
びT7−EMCV・UTR−CAT転写物の５′末端が、同一の５′
末端とステムループ構造を有するため、異なったように
キャップさせていると仮定する理由は存在しない。
研究によれば、真核細胞にある原核転写成分の効果的
な利用は、その解決が優れた発現系のみならず真核RNA
の構造と機能の間の関係の理解に貢献するかも知れない
いくつかの問題を引き起こす可能性がある。バクテリオ
ファージT7転写系または関連したバクテリオファージか
らの同様な系は、すでに説明されている利点（Fuerst e
t al,上記）を有する。細胞質内で複製するワクシニア
ウイルスベクターを選ぶことにより、核処理および輸送
に関連した余分な問題を避けた。ワクシニアウイルスは
自己のキャッピングおよびメチル化酵素を有しているが
（Wei et al,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.USA71,3014−30
18）、T7のRNAポリメラーゼによりつくられたRNAはワク
シニアウイルスポリメラーゼによりつくられたRNAほど
効率的にキャップされてはいない（Fuerst et al,上
記）。キャップがRNAの安定性および翻訳の両方に必要
であるので［Grifo et al,1982,inInteraction of Tran
slational&Transcriptional Controls in the Regulati
on of Gene Expressioneds.Drunberg−Manago,M.＆Safe
r,B.,（New York:Elsevier Biomedical）、pp.359−372
（グリフォら、1982年、「遺伝子発現の制御における翻
訳および転写コントロールの相互作用」M.グルンバーグ
−マナゴおよびB.セイファー編所収、359から372ペー
ジ）］、この欠点は困難な問題となる。しかし、RNAの
安定性の問題は、転写物の５′末端においてT7ステムル
ープ断片を保持することにより解決された。しかしなが
ら、試験管中の研究によればこの構造を含むRNAはワク
シニアRNAグアニリルトランスフェラーゼのための基質
として劣るため（Fuerst et al,上記）、このステムル
ープがキャッピングの問題を悪化させるかもしれない。
加えて、ステムループ構造は、リボソーム走査と干渉し
うる（Pelletier et al,1985,Cell40,515−526;Kozak、
M.,1980,Cell19,79−90）。しかしながら、安定なRNAが
大量に生成されることにより（細胞質RNAの総量の約30
％）、有益な量のタンパク質がワクシニアとT7のハイブ
リッド発現系によりつくられた。
な利用は、その解決が優れた発現系のみならず真核RNA
の構造と機能の間の関係の理解に貢献するかも知れない
いくつかの問題を引き起こす可能性がある。バクテリオ
ファージT7転写系または関連したバクテリオファージか
らの同様な系は、すでに説明されている利点（Fuerst e
t al,上記）を有する。細胞質内で複製するワクシニア
ウイルスベクターを選ぶことにより、核処理および輸送
に関連した余分な問題を避けた。ワクシニアウイルスは
自己のキャッピングおよびメチル化酵素を有しているが
（Wei et al,1974,Proc.Natl.Acad.Sci.USA71,3014−30
18）、T7のRNAポリメラーゼによりつくられたRNAはワク
シニアウイルスポリメラーゼによりつくられたRNAほど
効率的にキャップされてはいない（Fuerst et al,上
記）。キャップがRNAの安定性および翻訳の両方に必要
であるので［Grifo et al,1982,inInteraction of Tran
slational&Transcriptional Controls in the Regulati
on of Gene Expressioneds.Drunberg−Manago,M.＆Safe
r,B.,（New York:Elsevier Biomedical）、pp.359−372
（グリフォら、1982年、「遺伝子発現の制御における翻
訳および転写コントロールの相互作用」M.グルンバーグ
−マナゴおよびB.セイファー編所収、359から372ペー
ジ）］、この欠点は困難な問題となる。しかし、RNAの
安定性の問題は、転写物の５′末端においてT7ステムル
ープ断片を保持することにより解決された。しかしなが
ら、試験管中の研究によればこの構造を含むRNAはワク
シニアRNAグアニリルトランスフェラーゼのための基質
として劣るため（Fuerst et al,上記）、このステムル
ープがキャッピングの問題を悪化させるかもしれない。
加えて、ステムループ構造は、リボソーム走査と干渉し
うる（Pelletier et al,1985,Cell40,515−526;Kozak、
M.,1980,Cell19,79−90）。しかしながら、安定なRNAが
大量に生成されることにより（細胞質RNAの総量の約30
％）、有益な量のタンパク質がワクシニアとT7のハイブ
リッド発現系によりつくられた。
ここで指摘したいのは、原核転写系においてつくられ
たRNAに結びついたとき、EMCVのUTRが真核細胞において
機能するかどうか本研究の始めにおいて本出願人らは知
らなかったことである。さらに、ワクシニアウイルスが
宿主細胞タンパク質合成を阻害するため、細胞のタンパ
ク質合成機構におけるワクシニアウイルスによる変化が
EMCV・UTRの効率的な利用を妨げるかも知れないという
心配があった。従って、本発明のEMCV・UTR系が真核系
において機能したのみならず、タンパク質のレベルを50
0％以上高めたことが分かったとき、このことは期待さ
れておらず、遺伝子発現技術における大きな改良を意味
した。
たRNAに結びついたとき、EMCVのUTRが真核細胞において
機能するかどうか本研究の始めにおいて本出願人らは知
らなかったことである。さらに、ワクシニアウイルスが
宿主細胞タンパク質合成を阻害するため、細胞のタンパ
ク質合成機構におけるワクシニアウイルスによる変化が
EMCV・UTRの効率的な利用を妨げるかも知れないという
心配があった。従って、本発明のEMCV・UTR系が真核系
において機能したのみならず、タンパク質のレベルを50
0％以上高めたことが分かったとき、このことは期待さ
れておらず、遺伝子発現技術における大きな改良を意味
した。
本発明のほ乳類細胞発現系は、ベクターがDNAウイル
スであり、RNAポリメラーゼおよびプロモーターがDNAバ
クテリオファージに由来し、リボソーム結合部位がRNA
ウイルスからのものである点で真に折衷的である。しか
しながら、この系は、強力で、迅速、多用途かつ単純
な、ほ乳類または鳥類の細胞での遺伝子発現の方法を提
供する。それは、もっとも単純には、T7のRNAポリメラ
ーゼを発現する標準的な組換えワクシニアウイルスに感
染している細胞に、T7プロモーターにより調節された注
目している遺伝子を含有するプラスミドを移入すること
によりすることができる。この後者のアプローチにおい
ては、新たな組換えワクシニアウイルスを準備する必要
がない。別のアプローチとしては、T7プロモーターによ
り調節された遺伝子をワクシニアウイルス中に組換え、
標準的な二重感染の手順により、より多数の細胞を便利
に利用することができ、さらに高い発現を得ることがで
きる。通常モデル研究のために選ばれる小さな25,000ダ
ルトンのCATタンパク質での結果によれば、それは、ワ
クシニアウイルスに感染した細胞においてつくられる主
要なポリペプチドであり、たった24時間後にポリアクリ
ルアミドゲル上のクーマシーブリリアントブルーにより
染色されたタンパク質の約10％を占める２×106細胞に
つき16.5μｇのレベルにまで蓄積された。ワクシニア/T
7/EMCVハイブリッド系による発現のレベルは、たとえこ
れまでに記述されたもっとも強力なポックスウイルスプ
ロモーターを用いた場合でも（Falkner et al,1988,J.V
irol.62,1849−1854;Patel et al,1988,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA85,9431−9435）、従来からあるワクシニアウ
イルスベクターにより得られるよりも大きいものであ
る。細胞がヘルパーウイルスを含有するT7RNAポリメラ
ーゼに感染するまで発現が起きないので、ワクシニアハ
イブリッド系は、例えば潜在的に毒性のある遺伝子に対
する利用といったその他の利点を有している。従って、
標的細胞を殺すための毒性のある遺伝子の発現を、この
ユニークな特徴によりコントロールすることができる。
スであり、RNAポリメラーゼおよびプロモーターがDNAバ
クテリオファージに由来し、リボソーム結合部位がRNA
ウイルスからのものである点で真に折衷的である。しか
しながら、この系は、強力で、迅速、多用途かつ単純
な、ほ乳類または鳥類の細胞での遺伝子発現の方法を提
供する。それは、もっとも単純には、T7のRNAポリメラ
ーゼを発現する標準的な組換えワクシニアウイルスに感
染している細胞に、T7プロモーターにより調節された注
目している遺伝子を含有するプラスミドを移入すること
によりすることができる。この後者のアプローチにおい
ては、新たな組換えワクシニアウイルスを準備する必要
がない。別のアプローチとしては、T7プロモーターによ
り調節された遺伝子をワクシニアウイルス中に組換え、
標準的な二重感染の手順により、より多数の細胞を便利
に利用することができ、さらに高い発現を得ることがで
きる。通常モデル研究のために選ばれる小さな25,000ダ
ルトンのCATタンパク質での結果によれば、それは、ワ
クシニアウイルスに感染した細胞においてつくられる主
要なポリペプチドであり、たった24時間後にポリアクリ
ルアミドゲル上のクーマシーブリリアントブルーにより
染色されたタンパク質の約10％を占める２×106細胞に
つき16.5μｇのレベルにまで蓄積された。ワクシニア/T
7/EMCVハイブリッド系による発現のレベルは、たとえこ
れまでに記述されたもっとも強力なポックスウイルスプ
ロモーターを用いた場合でも（Falkner et al,1988,J.V
irol.62,1849−1854;Patel et al,1988,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA85,9431−9435）、従来からあるワクシニアウ
イルスベクターにより得られるよりも大きいものであ
る。細胞がヘルパーウイルスを含有するT7RNAポリメラ
ーゼに感染するまで発現が起きないので、ワクシニアハ
イブリッド系は、例えば潜在的に毒性のある遺伝子に対
する利用といったその他の利点を有している。従って、
標的細胞を殺すための毒性のある遺伝子の発現を、この
ユニークな特徴によりコントロールすることができる。
勿論、モデルとなるCAT系による本発明の実施可能性
を示したので、いわゆる当業者に示唆されるように、そ
の他のタンパク質の発現も同様に達成できることが明ら
かである。
を示したので、いわゆる当業者に示唆されるように、そ
の他のタンパク質の発現も同様に達成できることが明ら
かである。
ここに記載された実施例は例示のためのみのものであ
り、それに照らした種々の変更がいわゆる当業者に対し
て示唆され、この出願の意図および範囲さらに添付のク
レームの範囲に含まれるべきものである。
り、それに照らした種々の変更がいわゆる当業者に対し
て示唆され、この出願の意図および範囲さらに添付のク
レームの範囲に含まれるべきものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エルロイ―スタイン，オーナ アメリカ合衆国、20852 メリーランド、 ロックヴィル、シャープ 202、イース ト・ジェファーソン 1643
Claims (15)
- 【請求項１】T7,SP6,T3およびGH1プロモーターからなる
群から選ばれたプロモーターと、キャップに非依存的な
翻訳を可能にするカルジオウイルス（cardiovirus）のR
NAの非翻訳領域のcDNAと、発現が望まれるタンパク質を
コードしている遺伝子とを含み、これらが５′末端から
３′末端にかけて上記記載順に連結してなるゲノムを持
つ組換えワクシニアウイルスであって、該組換えワクシ
ニアウイルスに感染している哺乳類細胞が該プロモータ
ーに対応するRNAポリメラーゼを含む場合にのみ該哺乳
類細胞において該遺伝子が発現されるように、該プロモ
ーター、該cDNAおよび該遺伝子が配列されている組換え
ワクシニアウイルス。 - 【請求項２】上記非翻訳領域が脳心筋炎ウイルス（ence
phalomyocarditis virus）からのものである請求項１記
載の組換えワクシニアウイルス。 - 【請求項３】T7,SP6,T3およびGH1プロモーターからなる
群から選ばれたプロモーターと、キャップに非依存的な
翻訳を可能にするカルジオウイルス（cardiovirus）のR
NAの非翻訳領域のcDNAと、発現が望まれるタンパク質を
コードしている遺伝子とを含み、これらが５′末端から
３′末端にかけて上記記載順に連結してなる組換えプラ
スミドであって、該組換えプラスミドをトランスフェク
ションした哺乳類細胞がRNAポリメラーゼを含む場合に
のみ該哺乳類細胞において該遺伝子が発現されるよう
に、該プロモーター、該cDNAおよび該遺伝子が配列され
ている組換えプラスミド。 - 【請求項４】上記非翻訳領域が脳心筋炎ウイルス（ence
phalomyocarditis virus）からのものである請求項３記
載の組換えプラスミド。 - 【請求項５】ATCC受託番号第68045号を有する請求項４
記載の組換えプラスミド。 - 【請求項６】T7,SP6,T3およびGH1プロモーターからなる
群から選ばれたプロモーターと、キャップに非依存的な
翻訳を可能にするカルジオウイルス（cardiovirus）のR
NAの非翻訳領域のcDNAと、発現が望まれるタンパク質を
コードしている遺伝子とを含み、これらが５′末端から
３′末端にかけて上記記載順に連結してなるゲノムを持
つ組換えワクシニアウイルスであって、該組換えワクシ
ニアウイルスに感染している哺乳類細胞が該プロモータ
ーに対応するRNAポリメラーゼを含む場合にのみ該哺乳
類細胞において該遺伝子が発現されるように、該プロモ
ーター、該cDNAおよび該遺伝子が配列されている組換え
ワクシニアウイルスに細胞を感染させ、 該プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを発現す
る、DNAを遺伝子として持つ細胞質ウイルスに上記細胞
を感染させ、 次に、望まれるタンパク質を適切な分離および精製の方
法により回収することから実質的になるタンパク質の合
成方法。 - 【請求項７】T7,SP6,T3およびGH1プロモーターからなる
群から選ばれたプロモーターと、キャップに非依存的な
翻訳を可能にするカルジオウイルス（cardiovirus）のR
NAの非翻訳領域のcDNAと、発現が望まれるタンパク質を
コードしている遺伝子とを含み、これらが５′末端から
３′末端にかけて上記記載順に連結してなる組換えプラ
スミドであって、該組換えプラスミドをトランスフェク
ションした哺乳類細胞が該プロモーターに対応するRNA
ポリメラーゼを含む場合にのみ該哺乳類細胞において該
遺伝子が発現されるように、該プロモーター、該cDNAお
よび該遺伝子が配列されている組換えプラスミドを細胞
にトランスフェクションし、 該プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを発現す
る、DNAを遺伝子として持つ細胞質ウイルスを上記細胞
に感染させ、 次に、望まれるタンパク質を適切な分離および精製の方
法により回収することから実質的になるタンパク質の合
成方法。 - 【請求項８】さらに上記細胞を高張条件にさらす請求項
６記載の方法。 - 【請求項９】さらに上記細胞を高張条件にさらす請求項
７記載の方法。 - 【請求項１０】上記遺伝子が毒性遺伝子である請求項６
又は７記載の方法。 - 【請求項１１】該RNAポリメラーゼが発現されるのに適
切な時に、DNAを遺伝子として持つ該細胞質ウイルスに
感染させる請求項８記載の方法。 - 【請求項１２】該RNAポリメラーゼが発現されるのに適
切な時に、DNAを遺伝子として持つ該細胞質ウイルスに
感染させる請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】上記組換えワクシニアウイルスのゲノム
に存在する上記の非翻訳領域のcDNAがない時と比べて約
500％多い量の望まれるタンパク質を発現する請求項１
の組換えワクシニアウイルス。 - 【請求項１４】請求項３の組換えプラスミドを採用して
組換えベクターを構成し、次いで、適切な細胞培地にお
いて上記ベクターにより発現されるタンパク質を従来の
分離および精製技術を用いて分離することからなり、こ
のようにして得られるタンパク質の量が上記非翻訳領域
のcDNAを利用せずに得られる量より約500％多い、増強
された量の望まれるタンパク質を得る方法。 - 【請求項１５】DNAを遺伝子として持つ該細胞質ウイル
スがワクシニアである請求項６、７、11又は12記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/376,687 US5135855A (en) | 1986-09-03 | 1989-07-07 | Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells |
| US376,687 | 1989-07-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05501048A JPH05501048A (ja) | 1993-03-04 |
| JP2525289B2 true JP2525289B2 (ja) | 1996-08-14 |
Family
ID=23486043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2510227A Expired - Lifetime JP2525289B2 (ja) | 1989-07-07 | 1990-07-03 | 真核細胞における遺伝子発現のための迅速、多用途で、単純な系 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5135855A (ja) |
| EP (1) | EP0484374B1 (ja) |
| JP (1) | JP2525289B2 (ja) |
| AT (1) | ATE157701T1 (ja) |
| AU (1) | AU642657B2 (ja) |
| CA (1) | CA2063427C (ja) |
| DE (1) | DE69031389T2 (ja) |
| ES (1) | ES2109924T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991000905A1 (ja) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0561034B1 (en) * | 1991-08-26 | 1999-06-09 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome |
| GB9125896D0 (en) * | 1991-12-05 | 1992-02-05 | Almond Jeffrey W | Bicistronic viruses |
| US6221648B1 (en) | 1992-02-27 | 2001-04-24 | Microdial Technics Ltd. | Heterologous gene expression in lactococcus, and the expression products therefrom |
| IL102404A0 (en) * | 1992-07-03 | 1993-01-14 | Daniel Zurr | Method and means for the production of gene products |
| US5648235A (en) * | 1992-07-03 | 1997-07-15 | Q.B.I. Enterprises Ltd. | Method and means for the production of gene products, novel recombinant DNA vectors therefor and kits employing them |
| US5409823A (en) * | 1992-09-24 | 1995-04-25 | Ciba-Geigy Corporation | Methods for the production of hybrid seed |
| CN1120315A (zh) * | 1993-04-09 | 1996-04-10 | 维吉尼亚大学专利基金会 | 溶组织内阿米巴粘附外源凝集素的35/31千道尔顿亚基 |
| US5591601A (en) * | 1993-05-14 | 1997-01-07 | Ohio University Edison Animal Biotechnology Institute | DNA polymerase gene expression system utilizing an RNA polymerase co-delivered with the gene expression vector system |
| WO1995033835A1 (en) | 1994-06-02 | 1995-12-14 | Chiron Corporation | Nucleic acid immunization using a virus-based infection/transfection system |
| US6242187B1 (en) * | 1996-01-29 | 2001-06-05 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US5837464A (en) * | 1996-01-29 | 1998-11-17 | Virologic, Inc. | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| US5994526A (en) * | 1996-06-21 | 1999-11-30 | Plant Genetic Systems | Gene expression in plants |
| CA2255057A1 (en) * | 1996-06-21 | 1997-12-31 | Plant Genetic Systems, N.V. | Gene expression in plants |
| WO1998010088A1 (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase |
| US20020034732A1 (en) * | 1997-07-30 | 2002-03-21 | Daniel J. Capon | Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening |
| CA2305785A1 (en) * | 1997-10-07 | 1999-04-15 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method for introducing and expressing rna in animal cells |
| WO2000039302A2 (en) | 1998-12-31 | 2000-07-06 | Chiron Corporation | Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles |
| US7935805B1 (en) | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US7575860B2 (en) * | 2000-03-07 | 2009-08-18 | Evans David H | DNA joining method |
| US20020012971A1 (en) * | 2000-03-20 | 2002-01-31 | Mehta Tammy Burd | PCR compatible nucleic acid sieving medium |
| GB2362383B (en) * | 2000-05-19 | 2003-12-31 | Devgen Nv | Gene expression system |
| EP1363663B1 (en) | 2001-01-12 | 2011-03-02 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Nucleic acid mucosal immunization |
| EP2412242A3 (en) | 2001-07-05 | 2012-06-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| WO2003004657A1 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type b and/or type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US20100015211A1 (en) | 2004-11-01 | 2010-01-21 | Barnett Susan W | Combination Approaches For Generating Immune Responses |
| JP5215865B2 (ja) | 2005-11-22 | 2013-06-19 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原 |
| DE102006015321A1 (de) * | 2006-03-30 | 2007-10-04 | Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh | Verfahren zur Genexpression |
| BRPI1005670A8 (pt) * | 2009-01-05 | 2017-12-26 | Epitogenesis Inc | composições adjuvantes e processos de uso. |
| CN103717235A (zh) | 2011-06-24 | 2014-04-09 | 埃皮托吉尼西斯有限公司 | 作为抗原特异性免疫调节剂的包含选择的载体、维生素、单宁和类黄酮的组合的药物组合物 |
| EP3068783B1 (en) | 2013-11-15 | 2020-09-23 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Agonists of hypocretin receptor 2 for use for treating heart failure |
| US10550379B2 (en) | 2015-06-29 | 2020-02-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Degron fusion constructs and methods for controlling protein production |
| CN108348593B (zh) | 2015-08-31 | 2022-08-16 | 泰克诺瓦克斯股份有限公司 | 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗 |
| JP7320601B2 (ja) | 2018-09-11 | 2023-08-03 | 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 | 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用 |
| WO2023070072A1 (en) | 2021-10-21 | 2023-04-27 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Retroelement-generated transcription factor decoys |
| WO2023081756A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Precise genome editing using retrons |
| WO2023141602A2 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
| WO2023183588A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Methods of assessing engineered retron activity, and uses thereof |
| WO2023183589A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Rt-dna fidelity and retron genome editing |
| WO2023183627A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Production of reverse transcribed dna (rt-dna) using a retron reverse transcriptase from exogenous rna |
| WO2024020346A2 (en) | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Gene editing components, systems, and methods of use |
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Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8613481D0 (en) * | 1986-06-04 | 1986-07-09 | Diatech Ltd | Translation of mrna |
| US4937190A (en) * | 1987-10-15 | 1990-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Translation enhancer |
| WO1990004026A1 (en) * | 1988-10-11 | 1990-04-19 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | New plasmid constructions for high level production of eukaryotic proteins |
-
1989
- 1989-07-07 US US07/376,687 patent/US5135855A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-07-03 AT AT90910982T patent/ATE157701T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-07-03 JP JP2510227A patent/JP2525289B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1990-07-03 ES ES90910982T patent/ES2109924T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-03 AU AU60344/90A patent/AU642657B2/en not_active Expired
- 1990-07-03 CA CA002063427A patent/CA2063427C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-03 DE DE69031389T patent/DE69031389T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-03 WO PCT/US1990/003687 patent/WO1991000905A1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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