JPH05501048A - 真核細胞における遺伝子発現のための迅速、多用途で、単純な系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 □　二　゛　ニゴと」方１」男（」乙Ｌｊ５−３リーρ９ゝ、　τ 本出願は１９８６年９月３日に出願された係続中のシリアル番号第９０５２５３ 号（参照することによりここに含む）の部分継続出願である。親出願（Ｓ／Ｎ９ ０５２５３）は、真核細胞における外来の遺伝子の発現に関し、特に、例えばよ り高等な組織における、ことに哨乳類の細胞のような真核細胞における、バクテ リアやウィルスの遺伝子を例とする原核遺伝子の利用に関する。しかし、この親 出願において開示された発現系により達成されるタンパク質合成のレベルは、限 定されたものである０本発明は、親出願において記載された基本的な系を拡張し 、はるかに高いタンパク質合成のレベルを有する。真核細胞における遺伝子発現 のための改良された迅速、多用途な系を提供する。

見二辺１１ 本発明の目的４１　特に真核細胞において原核転写系を使用する場合に、真核細 胞においてキャップに依存しないＲＮＡへの翻訳を可能にする効率のよい発現系 を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、毒性遺伝子の発現制御のための方法を提供すること にある。

その他の目的および利点は、本発明の次の詳細な説明がら明らかになる。

・　の　か　ロ 本発明のこれらおよびその他の目的、特徴、多くの付帯的な利点は、添付の図面 に関連して、次の詳細な説明を読むことによってよく理解することができる。こ の図面において、図１は、本発明による発現カセットの概略構造を示す。略号： 　Ｐ　Ｔ７１　バタテリオファージＴ７のφ１０プロモーターー２３から＋１； ５’ｈｐ、φ１０プロモーターの下流の、ヘアピンまたはステム・ループ構造を 形成することができるヌクレオチド＋１から＋２６；ＴＴ□、バクテリオファー ジＴ７φ１０終止配列；ＥＭＣ，ＥＭＣＶのＯＴＲのヌクレオチド１６３から７ ４６゜ 図２は、ワクシニアウィルス感染中のＣＡＴ合成の経時研究の結果を示す、ＣＶ −１細胞の単層を、　ｌ細胞あたり２０ＰＦＵの正常型ワクシニアウィルスに感 染させ（レーン９）、各ウィルスについて１細胞につきｌ０ＰＦＵの多数倍の量 でｖＴＦ７−３およびｖＴＦ７ＣＡＴに共に感染させ（レーン１、　２．　５． 　６．　１０．　１１）、またはｖＴＦ７−３およびｖ　Ｔ　Ｆ　７　Ｅ　Ｍ　 ＣＡ　Ｔに共同感染させた（レーン３．　４．　７゜８．１２．１３）、感染後 ２．７および２４時時間−、細胞はメチオニンについて２０分間飢餓状態にし、 次に、　［３５３］メチオニンで３０分間パルスラベル（瞬間標識）を行った。

飢餓およびパルスラベルは、等優性（レーン１．　３．　５．　７゜９、　１０ ，１２）または高張性（１９０ｍＭのＮａＣ１）（レーン２．　４．　６．　８ ．　１１．　１３）の条件において行われた。細胞溶解物を調製し、２Ｘ　１０ Ｓ個の細胞に対応する同一の体積を１０％ＮａＤｏｄＳＯ＋−ポリアクリルアミ ドゲルの各レーンに加えた。電気泳動に続いて、ゲルにフルオログラフィーの処 理を行った。矢印は、ＣＡＴタンパク質を示す。

図３は、感染後の２４時間によるＣＡＴタンパク質の蓄積を示す。ＣＶ−１細胞 単層を、　１細胞あたり２０ＰＦｔＪの正常型のワクシニアウィルス（Ａ、レー ン１；Ｂ、中実の棒）、または、各ウィルスについて１細胞あたりｌ０ＰＦＵの 多数倍のｖＴＦ７−３およびｖ　Ｔ　Ｆ　７　ＣＡＴ　（Ａ、レーン２；Ｂ。

斜線の棒）、または、ｖＴＦ７−３およびｖ　Ｔ　７　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔ（Ａ、 レーン３および４；Ｂ、中空の棒）により共同感染させる。感染後４時間で、等 優性の培地を、維持するか（Ａ。

レーン１から３．８．　バート１）、または１９０ｍＭのＮ２ＬＣ１（高張性） へと変更した（Ａ、レーン４；＃Ｂ、バート２）、感染から２４時間後に細胞溶 解物を調製し、２０μｇのタンパク質を１０％のＮａＤｏｄ、５Ｏ４−ポリアク リルアミドゲルの各レーンに加え、電気泳動に続いて、このゲルをクーマシーブ リリアントブルー（Ａ）により染色し、またはＣＡＴ活性を本文中に記載するよ うにして決定した。

図４は、ＥＭＣＶのＵＴＲを含有するＲＮＡのキャップに依存しない翻訳を示す 、ＢａｍＨＩにより消化されたｐＴ７ＣＡＴ　（レーン１〜４）またはｐＴ７Ｅ ＭＣＡＴ　（レーン５〜８）をテンプレート（鋳型）として用いて、試験管内で の転写を行った。メチル化されていない（ＧｐｐｐＧ）またはメチル化された（ ｍ７Ｇ　ｐ　ｐ　ｐ　Ｇ）によりキャップされたＲＮＡを含有するレーンを指摘 しである。単球菌により処理したウサギの網状赤血球溶解物における翻訳を、８ ｎＭのＲＮＡ濃度により、明示したように０．１ｍＭのメチル化されたＧＤＰ　 （ｍ７ＧＤＰ）の存在下または不存在のもとで行った。

図５は、感染した細胞内でなされたＣＡＴのＲＮＡのポリリポソーム会合および 試験管内翻訳を示す。　（Ａ）ＨｅＬａ細胞を、細胞あたりｌ０ＰＦＵのｖＴＦ ７−３、および細胞あたりｌ０ＰＦＬＩのｖＴ７ＣＡＴ　（黒点で示す）または ｖＴ７ＥＭＣＡＴ　（中空の点で示す）のいずれかにより共同感染させた。　１ ２時間後、細胞質抽出物を調製し、ショ糖密度勾配上で沈降させた。各フラクシ ョンの２６０ｎｍでの光学濃度を測定し、モノソームビークの位置を示しである 。各フラクションの２０μｍのサンプルを、スロット・ブａット装置を用いてニ トロセルロース上に固定化し、そして［３２ｐ］　ＣＡＴプローブへとハイブリ ッド形成した。オートラジオグラムを作成し、バンドの強度をデンシトメトリー により決定した。指示したフラクション（水平ライン）をプールし、試験管内翻 訳のために処理した。　（Ｂ）このプールされたＲＮＡのサンプル（１ハｇ）を 、ウサギの網状赤血球溶解物において、　１２．５μ＋の最終反応容積で、０． １ｍＭのｍ７Ｇ　Ｄ　Ｐとともに（＋）またはそれなしで（−）、翻訳した。Ｒ ＮＡなしくレーンｌ）、ポリリポソーム会合Ｔ７−ＣＡＴのＲＮＡ（レーン２、 ３）、ポリリポソーム会合Ｔ７のＥＭＣＶのＵＴＲ−ＣＡＴのＲＮＡ　（レーン ４．５）、遊離Ｔ７−ＣＡＴのＲＮＡ　（レーン６．７）、遊離Ｔ７ＥＭＣＶの ＵＴＲ−ＣＡＴのＲＮＡ　（レーン８．９）のそれぞれの翻訳生成物をＮａＤｏ ｄＳＯ４−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、フルオログラムを作 成した。

ｔ・ 本発明の上記またはその他の種々の目的および利点は、ベクターがＤＮＡに基づ く細胞質ウィルスであり、ＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーターがＤＮＡバク テリオファージからのものであ１ハ　リボソーム結合部位がＲＮＡウィルスから である発現系により達成される。望ましい実施例は、図１に示すように、Ｔ７プ ロモーター、脳心筋炎ウィルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏＢｏｃａｒｄｉｆｉｓ　ｖ ｉｒｕＳ；　Ｅ　ＣＭＶ）非翻訳部分（ｕ＋＋ｔｒｔｎｓｌｕｅｄ　ｒｅｇＩｏ ｎ　；　Ｕ　Ｔ　Ｒ）、および発現が望まれるタンパク質ためのＴ７プロモータ ー制御の遺伝子を含むように構成された組換えワタシニアウイルスからなる。し かし、キャップ非依存翻訳を可能にする非翻訳部分１．ｔ、ポリオウィルスおよ びメンゴウイルスなど関連したウィルスを含むＥＭＣＶ以外のものから、さらに アデノウィルス等の無関係のウィルスから得ることもできる。ここに示す例は、 単に説明のためであり、限定的なものではない３例えば、本発明の教えるとこと に従い、バクテリオファージＳＰ６、Ｔ３およびＧＨＩといったその他の原核転 写系を、真核細胞における発現のために採用することも可能であろう。

その旨を特に定義しない限り、ここで用いられるすべての技術的、科学的用語は 、本発明の属する技術分野のいわゆる当業者により一般的に理解されているもの と同じ意味をもつものである。ここに記載されたものと類似または等価のいかな る方法または原料を本発明の実施または試験に用いることができるが、望ましい 方法および原料を記載する。以下に言及するすべての刊行物は、ここで参照する ことによりここに含まれるものである。特に言及しない限り、ここで採用または 考慮された技術は、いわゆる当業者によく知られた標準的な方法である。原料、 方法および例は、説明のためであり、限定的ではない。

Ｌｕ丘圭塁１１ １１　制限エンドヌクレアーゼは、ニューイングランド・バイオチック（Ｎｅｗ 　Ｅ＋＋ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ （Ｂｅｊｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ＋ｉｔｏ＋ｉｅ＋）、べ一リ ンガー・マンハイム（Ｂｏｅｂ＋ｉＢｅ＋　Ｍｔｎｎｂｅｉｍ）から入手した１ ｍ７ＧｐｐｐＧ、　ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧＤＰは、　ファーマシア（ＰｈａｒＩｃ 日）から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびウサギ網状赤血球溶解物は、プロメガ ・バイオチック（Ｐ＋ｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）から入手した。

レ　・　ワタシニアウィルス（ＷＲ株）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（ＡｌｌＩｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ）から最初に入手した。ウィルスを、すでに報告されているようにして 精製した（Ｆｕｅｔｓ（ｅｌｔｌ、１９８６．　Ｆｌｏｅ　Ｎａｔｌ　Ａｃｘｄ 、　Ｓｅｉ　ＵＳＡ　８３．８１２２−１１１２６）。

ＨｅＬａのＳ−３細胞は、５％のウマ血清により補われたイーグルの最低必須培 地に懸濁して成長させた。ＣＶ−１サル腎臓細胞を、　１０％のウシ胎児血清を 含むダルベツコの変更イーグル培地において単層として繁殖させた。細胞を、す でに報告されている方法による感染させた（Ｆｕｅｒｓｌ　ｅｔ　ｈｌ、１９８ ７、　Ｍｏｉ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉａｌ、７．　２５３８−２５４４；　Ｆｕｅｒ ｓｌ　ａｔ　ａｌ、１９８９゜Ｊ、　！Ｊｏ１．　Ｂｉｏｌ、２０６：３３３− ３４８）。

−ス”（７）　ＥＭＣＶ（ＤＵＴＲ（Ｄヌクｌ、、ｔ（ド１６３から７４６を含 むｐ　Ｅ　５　ＬＶＰＯ（ＰａｒｋＳｅＩａｌ、１９８６．　Ｊ。

Ｖｉ＋ｏ１．６０．３７６−３８４）からの０．６キロ塩基対（ｋｂｐ）のＥｃ ｏＲｌ−Ｂａｌ　ｌのＥＭＣ断片を、プラスミドベクターｐＡＲ２５２９（Ｒｏ ｓｅｎｂｅ＋ｇ　ｅｌ　！ｌ、１９！１７．　Ｇｅｎｅ　５６．　１２５−１３ ５）の平滑化されたＢａｍ８１部位へと挿入し、ｐＴＦ７．２５　ＥＭＣ−１を 生成した。ＣＡＴコード化配列配列　ｐＴＦ　７ＣＡＴ−１から分離しくＦｕｅ ｒｓｌ　ｅｋ　ｔｌ、　上記）、０．８ｋｂｐのＴａｑ’断片として、モしてＢ ａｍＨｌを利用して、　ｐｕＣ１８のＢ　ａｍＨ１部位へとリンカ−を挿入し、 プラスミドｐＵｃ１８ｃＡＴ−１を生成した。ついで０．８ｋｂｐのＢａｍＨ１ のＣＡＴ断片をｐＵｃ１８ｃＡＴ−１から分離し、ＥＭＣの主要な転写開始部位 の下流のプラスミドｐ　Ｔ　Ｆ　７゜２５　ＥＭＣ−１のユニークなりａｍ８１ 部位へと挿入し、プラスミドｐＴＦ７．　２５ＥＭＣＡＴ−１を形成した。これ により、　１２のアミノ酸残基により分離されたＥＭＣの主要開始信号とともに フレームされるようにＣＡＴ翻訳開始部位を置くこととなった。ＣＡＴのコード 化フレームは、部位指向的変異誘発によりＥＭＣ開始コドンのすぐに下流に置か れた。

開始ＥＭＣのＡＴＧにすぐに隣接する配列は、ユニークなＮｃｏ１部位を提供す る５’　−ＥＭＣ−・−ＧＡＴＡＡＴＡＣＣよＮ」二旦ＧＡＧ・・・ＣＡＴ−３ ’へと変更された。ＣＡＴ遺伝子に含まれるＮｃｏ１部位は、コード化配列内の サイレントな変異を置くことにより取り除くことができる。変異を起こされたＥ ＭＣのＣＡＴカセットは、次に、　０．８２ｋｂｐのＢａｍＨｌ−Ｋｐｎｌ断片 として分離され、プラスミドｐＴＦ７．　２５ＥＭＣＡＴ−１内の対応する部位 に挿入され、ｐＴＦ７．　２５ＥＭＣＡＴ−２０を生成した。単純化のため、ｐ ＴＦ７．２５ＥＭＣＡＴ−２０およびｐＴＦ７ＣＡＴ−１をそれぞれ、　ｐＴ７ ＥＭＣＡＴおよびｐ　’Ｔ　’７　ＣＡ　Ｔと呼ぶこととする。

ｐＴ７ＥＭＣＡＴプラスミドの寄託は、メリーランド州ロックビルのアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｂｅ　ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　Ｍａ「ｙｌａｎｄ）に１９８９年７月７日に、受託番号第６８０４５号とし て、なされた、この寄託は、生存したまま維持され、特許の有効期間中に生存し なくなったならば置き換えて、寄託日から３０年の期間または寄託株のサンプル の請求の最終日から′５年間のいずれか遅い方まで、特許がされれば法の規定に 従って制限なしに公衆に提供される。特許商標症の長官は、請求があれば、寄託 株を入手、利用する権利を有する。′ ワクシニアウィルス挿入ベクターは、Ｂｇｒｌｒ断片として、完全なＴ７ブロモ ーターー標的遺伝子−Ｔ７ターミネーターカセツトを除去し、端部を平滑化し、 　ｐＧＳ５０の平滑化されたＥｃｏＲ１部位に挿入することにより調製すること ができる（Ｆｕｅｒｓｔ　ｅｔ　ａｌ’、上記）、これにより５　相同な組換え に用いられるワクシニアウィルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）配列に標的遺伝子カ セットを隣接させる結果となった。ワクシニアウィルスのゲノム中への組換えお よび組換えウィルスの分離は、マケットらの論文（Ｍａｃｋｅｔｌ　ｅｌ　ａｌ 、１９８４．　Ｊ、　Ｖｉ■ｒ、　４９：８５７−８６４）に記載されたように して行われた。

での　プラスミドは、　ＢａｍＨｌにより消化されて、Ｔ７転写ユニットを線状 のＤＮＡ断片として放出した。転写は、ＧＴＰ濃度が０．０５ｍＭであって、ｍ ７Ｇ　ｐｐｐＧまたはＧｐｐ’ｐＱが０．５ｍＭの濃度で加えられたほかは、プ ロメガ・バイオチック（Ｐｒ’ａｍ＋４ａ　［１ｉｏＬｅｃ）が推奨するように して行った。各転写反応混合物の一部は［アルファ”Ｐ］ＵＴＰを含んでおり、 生成物を０．　４％のポリアクリルアミドーユリアゲル上で分析し、単一の適当 な大きさの主要ＲＮＡ種の存在を確認した。転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の 収率を、セフ７デクス（Ｓａｐｂｌｄｅｘ）　Ｇ　−５０カラムによる２回のス ピンろ過と２回のエタノールによる沈澱に続いて、　２６０ｎｍでの吸収率から 計算した。

曾　最終反応体積が１２．５μｍであり、指摘した場合には０．１ｍＭのｍ’Ｇ 　Ｄ　Ｐをキャップ依存翻訳の特異的な阻害剤として用いたほかは、プロメガ・ バイオチックにより記載されたようにして、ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物に おいて翻訳した。Ｈ訳反応混合物中の試験管内または生体内において生成された ＲＮＡの濃度は、それぞれ、８ｎＭまたは８０ｎｇ／μｍであった。翻訳に続い て、　９Ｍのユリアと、７５ｍＭのＥＤＴＡと、　１．５ｍＭのフェニルメチル スルフォニルフロリドと、８０００Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔｌお よび４０μｍ／ｍｌのＲＮ７−ゼＡを含む溶液を２５μｌ、３０℃でさらに３０ 分のインキュベーションのために加え、アミノアシル化されたｔ　ＲＮＡを消化 した。翻訳混合物の１０μｌのサンプルを、ＮａＤｏｄＳ○４およびメルカプト エタノールにより解離させ、ベレチェら（Ｐｅｌｌａｔｉｅ＋　ｅｔ　ａｌ、　 １９８ｇ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　［１ｉｏ１．８．１１０１−Ｉｔ１２）に より記載されたようにして１５％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分 析した。

ＲＮＡ　ＨｅＬａのＳ−３細胞（５Ｘ１ｏｓ）を５　組換えワクシニアウィルス によりツースト等が記載したようにして共同感染させ（Ｆｕｅｒｓｔ　ｅｔ　ａ ｔ、上記）、　１２時間後、抽出物を調製し、カッツェらが記載したようにして （ＫａＨｅ　ｅＬ　ａｌ、１９８６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０：Ｈ２７−１ ０３９）、ショ糖の勾配上で沈降させた。各フラクションの一部は、２６０ｎｍ での吸収率の測定に用い、　［！２ｐ］により標識されたＣ　Ａ、　ＴのＤＮＡ プローブによるスロット・プロット・ハイブリッド形成のために用いた（Ｗｈｉ ｔｅ　ａｔ　＊Ｉ、　１９８２．Ｌ−」目ユ土−−Ｕ日、ＪＬＩ５７゜８５６９ −８５７２＞　、ボＩＪ　ＩＪボソームオヨヒ遊１１１ＲＮＡを含有スルフラク ションを別個に保存して、エタノールにより沈降させ、４ｍｌのＯ，１Ｍのトリ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）−１２ｍＭのＥＤＴＡ−０，１５ＭのＮａＣ１−０ ，１％ＮａＤｏｄＳＯ４において再懸濁させた。プロテイナーゼＫを最終濃度が ５０Ｍｇ　／　ｍ　ｌとなるように加え、この混合物を３７℃で３０分間培養し た。ＲＮＡをフェノールクロロホルムにより３回抽出し、クロロホルムにより２ 度抽出し、エタノールで沈降させ、７０％のエタノールで洗浄し、水中に懸濁さ せた。

各サンプルの一部を、　１．４％のアガロース−ホルムアルデヒドゲルにおいて 電気泳動によって、その大きさについて分析した。ＲＮＡをニトロセルロース膜 に移し、　［３２ｐ　］で標識されたＣＡＴのＤＮＡプローブへとハイブリッド 形成した。

立人二ヱユ土ヱ　ＣＡＴをショーによる記載（ｓｈλｗ、１９７５゜Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　４３．７３７−７４８）に変更を加えて測 定した。６つの凹部を有するプレートにおいて融合性ＣＶ−１細胞を感染させ、 フェノールレッドなしで２．５％の牛胎児血清を補った最少必須培地（Ｑｕａｌ ｉｔｙ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ、ｌｎｃ、）で成長させた。感染後２４時間で、 細胞と培地を回収し、ＮａＤ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４とクロロホルムをそれぞれ０． ０００５％と１％になるように加えて、溶解させた。５から２０μｍのサンプル を９６の凹部を有するプレートに移し、０．２ｍｌの１００　ｍ、　Ｍのトリス −）（ＣＩ　（ｐＨ７，８）１０．　１ｍＭアセチルＣｏＡ　（補酵素Ａ）　／ 　０．　４ｍ　ｇ／ｍ　］の５，５゛　ジチオビス２ニトロ安息香酸１０，１ｍ Ｍのクロラムフェニコールを加えた。　１５分後には、マイクロプレートリーダ ー（ｌｏｌｅｃｕｌｉｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃａｒｐ、）により４１２ｎｍでの 吸収率を測定した。

望まれるタンパク質（この例で！ＬＣＡＴ）の精製された形での分離のために、 従来からの分離・精製技術が採用された。このような技術は、この技術分野にお けるいわゆる当業者によく知られた遠心分級　ろ過、クロマトグラフィー　電気 泳動、透析等を含む。

オファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより生成され、ワクシニアウィルスにより コード化された圧倒的にキャップされていない転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ） に、ＥＭＣＶのＵＴＲが増強されたキャップ非依存性の翻訳を付与するかどうが を決定するために、唾乳類細胞において、ｐＴ７ＣＡＴおよびｐＴ７　ＥＭＣＡ Ｔのふたつのプラスミドを作成した。それぞれはＴ７φ１０プロモーターを含有 しており、後者によるＣＡＴ遺伝子は１図工に示すようにＴ７ＲＮＡ開始部位が らＥＭＣＶのＵＴＲの下流のヌクレオチド１６３から７４６に対応するＥＭＣＶ のＵＴＲのセグメントをも有していた。ＣＡＴ活性を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ を発現するヘルパーウィルスｖＴＦ７−３　（Ｆｕｅ＋ｓｔ　ｅｔ　ｔｌ、上記 ）に感染している細胞中に各Ｔ７プロモーターブラスミドをトランスフェクショ ンしたのち２４時間にわたって測定した。ＥＭＣＶのＵＴＲにより与えられる約 ７倍の増強は、いくつかの独立した実験において再現された。Ｔ７ステム・ルー プを含まないＴ７　ＥＭＣＡＴプラスミドにより発現されるＣＡＴのレベルは、 Ｔ７ＥＭＣＡＴに比べて１０分の１であった。このことは、ＥＭＣＶのＵＴＲが 相当の二次的構造を有することが期待される事実にもかかわらず、Ｔ７ステム・ ループが発現のために必要であることを示している。ｐＴ７ＣＡＴおよびｖＴ７ ＥＭＣＡＴの両方が発現カセットに隣接するワクシニアウィルス・チミジンキナ ーゼ配列を有しており、組換えワクシニアウィルスＶＴ７ＣＡＴおよびｖ　Ｔ　 ７　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔを生成することを容易にする。細胞をＴ７プロモーター含 有組換えウィルスおよびＶＴＦ７−３　（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを提供するた めに）により同時に感染させたのちに、ＣＡＴ発現を測定した。総合的な結果は 、繰り返された実験においてＥＭＣＶのＵＴＲが発現を４から５倍に増強した点 をのぞいては、対応するプラスミドによるトランスフェクションにより得られた ものと同様であった。

につい　、　“　ＣＡＴ発現に対する高張性の効果を決定するために、ＣＶ−１ 細胞をｖＴＦ７−３に感染させて、Ｔ　７ＲＮＡポリメラーゼおよびｖ　Ｔ　７ 　ＣＡＴまたはｖ　Ｔ　７　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔのいずれかを得た。タンパク質合 成を。

等張または高張性（１９０ｍＭ）の培地において感染させたのちに異なる時間を おいて、　［３５Ｓ］メチオニンで標識した細胞からの細胞質タンパク質のＮａ ＤｏｄＳ○４−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によってモニターした（ 図２）。

感染から２時間後、優勢な宿主タンパク質があらゆる条件下で標識された（レー ン１から４）、しかし、６時間までには、宿主タンパク質合或は阻害されて、タ ンパク質合成の後期パターンが確立された（レーン５から８）、ＣＡＴポリペプ チドに大きさにおいて対応するあるバンドを、ｖＴＴＥＭＣＡＴ（レーン７）に 感染した細胞からのタンパク質のオートラジオグラムにおいて明らかに見いだす ことができたが、ｖＴ７ＣＡＴに感染した細胞からのタンパク質（レーン６）で はほとんど検出することができず、正常型のワクシニアウィルスに感染した対照 細胞からは失われていた（図示せず）。さらに、高張の条件下においては、ｖ　 Ｔ　７　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔに感染した細胞において（レーン８）、ＣＡＴの標識 の絶対的な増加があり、ワクシニアウィルスの後期タンパク質の標識の減少があ った。さらにその後、ｖＴ７ＥＭＣＡＴにより発現されたＣＡＴを、主要ウィル スタンパク質（レーン９）の強度と同様な強度を有する顕著なバンド（レーン１ ０）として、容易に検出することができた。しかしこのとき、ＣＡＴタンパク質 は、等張の条件下でｖ　Ｔ　７　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔにより発現された顕著なバン ド（レーン１２）であり、高張の条件下においてはさらに顕著であった（レーン １３）、フルオログラムのデンシトメーターによるトレースは、２４時間後に［ ３６Ｓ］　メチオニンの７８％がＣＡＴに組み込まれたことを示した。

感染から２４時間後のＣＡＴタンパク質の総蓄積量を、クーマシーブリリアント ブルーでＮａＤｏｄＳ○４−ポリアクリルアミドゲルの染色と、ＣＡＴ活性のア ッセイにより決定した（図３）１等張培地において細胞を感染させ、このような 条件に保つか、または４時間後に高張培地に移した１合計２４時間の後に、細胞 を溶解し、２０μｇの細胞質タンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲルの各レ ーンに加えた。電気泳動に続いて、クーマシーブリリアントブルーで染色したゲ ルのデンシトメトリーは、等張条件でｖＴ７ＣＡＴまたはｖＴＴＥＭＣＡＴから 発現したとき、ＣＡＴタンパク寅が総タンパク質のそれぞれ２％または７％を構 成すること、そして高張条件でｖ　Ｔ　７　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔから発現させたと きには全タンパク質の１０％をなすことを示した（図３Ａ）、ＥＭＣＶ・ＬＩＴ Ｒによる発現に関する高張性の選択的な効果は、感染後２４時間の細胞から調製 された抽出物中のＣＡＴ活性の測定により確認された（図３Ｂ）、高張培地中の ｖＴ７ＥＭＣＡＴから発現された場合のＣＡＴ活性は、ｖＴ７ＣＡＴからの発現 レベルに比べて、　１０倍高かった。

Ｔ　７　の　の　に　るＥＭＣＶの［ＪＴ、Ｌ！ＩＬＩ　ＥＭＣＶのＵＴＲがキ ャップされていないと考えられるＴ７転写物の発現を生体中において高める際の メカニズムをさらに調べるため、ｍ７Ｇのキャップされた５″−末端により、ま たはそれなしで、ＲＮＡを合成し、試験管中の翻訳特性を比較した。バクテリオ ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＥＭＣＶのＵＴＲがあり、またはな しでｍＲＮＡを調製するために、ｐＴ７ＣＡＴおよびｐＴ７ＥＭＣＡＴプラスミ ド（図１）を転写した。高濃度のｍ７ａｐｐｐａを転写反応に加えることにより 、５′でメチル化されたキャップを含有する転写物を生成し、ＧｐｐｐＧを並行 反応に加えて、翻訳においては機能しないことが知られているがエキソヌクレア ーゼによる分解に対してＲＮＡを保護しつるメチル化されていないキャップを生 成した。これらの転写物を、試験管中でのメチル化されキャップされたｍ　ＲＮ 　Ａ翻訳の特異的阻害剤であることが知られているキャップ類ｆｉｍ７ＧＤＰの 存在下またはその不存在の下で、ウサギ網状赤血球溶解物中において翻訳した。

ＥＭＣＶのＵＴＲが存在しないとき、Ｔ７−ＣＡＴ転写物の翻訳は、Ｇｐ　ｐ　 ｐＧで終止されたＲＮＡがｍ７ＧｐｐｐＧで終止されたＲＮＡの翻訳（二比べて 不十分（二翻訳されるため、メチル化されたキヤ・ツブ【こ依存する二と力くわ かった（図４）、さらに、ｍ７ＧｐｐｐＧで終止されたＲＮＡの翻訳は、ｍ’Ｑ ＤＰにより阻害された（図４）、対照的（二、Ｔ７−ＥＭＣＶのｔＪＴＲ−ＣＡ Ｔ転写物の翻訳（よ、　５°　キャップ構造にかかわらず非常に効率力（よく、 またｍ７Ｇ　Ｄ　Ｐ　（二対しても敏感でない、このことは、ＥＭＣＶのＵＴＲ を含有するｍＲＮＡがキャップに依存せずに翻訳されたことを示している１ｍ７ ＧＤＰの特異性は、異なる長さのボ１ノペプチドをコード化するキャップされた 転写物をＥＭＣＶのＵＴＲ力（あ＋Ｊまたはなしで同時に翻訳すること（二よ１ ノ、さら（二示された。

ＥＭＣＶのＵＴＲがないもののみが阻害された（データ（よ示ＴＲの有益な効果 がキャップされてし＼な（、ｓメツセージのよｊＪ効率的な翻訳によるものであ るならば、試験管中Ｇ二お（する研究が示唆したように、これらの転写物のよ一 ノ高１＼７＜−センデータがＵＴＲを欠いているＴ７転写物のそれＣ二比べてボ ＩＪ　ＩＪボソームに会合しているべきである。これを評価するため。

ＨｅＬａ細胞をｖＴＦ７−３および、ｖ　Ｔ　７　ＣＡＴまたｉ、ｔ　ＶＴ　７ 　Ｅ　Ｍ　ＣＡ　Ｔ　＋：より感染させ、　１２時間後（二細胞質抽出物を調製 し、ショ糖密度勾配遠心分離を行った。モノソームビークを光学密度測定により 位置決めし、ＣＡＴｍＲＮＡの勾配に沿った分布を［”２Ｐ］　ＣＡＴプローブ （こよる各フラクションのサンプルのハイブリッド形成により決定した。オート ラジオグラムを「スロットプロット」ハイブリッド形成により作成し、各スロッ トの強度をデンシトメトリーにより測定した０図５Ａにまとめたこれらのデータ は、同様な量のＴ７−ＥＭＣＶ　−ＵＴＲ−ＣＡＴ・ＲＮＡおよびＴ７−ＣＡＴ ＲＮＡがあるが、前者のより大きな部分が二染色体（ｄｉｓｏｍｅ）とより重い ポリリポソームとに会合していることを示した。

ポリリポソームに会合したＲＮＡおよび遊離したＣＡＴＲＮＡを別々にプールし 、ウサギ網状赤血球溶解物中において、ｍ７ＧＤＰの存在下または不存在のもと で翻訳させた。ＮａＤｏｄｓ○４−ポリアクリルアミドゲルのフルオログラム（ 図５Ｂ）を検討した結棗　いくつかの重要な発見があった。

まず、　Ｔ　７−ＥＭＣＶ・ＬＩＴＲ−ＣＡＴ　−ＲＮＡのポリリポソームに結 合したものと遊離したものの双方が、いずれのＴ７−ＣＡＴ　−ＲＮＡフラクシ ョンよりもより効果的に翻訳された。第二に、ポリリポソームに結合したＴ７− ＣＡＴ−ＲＮＡの翻訳はｍ’ＧＤＰにより阻害された一方、対応する退部ＲＮＡ は阻害されなかった。第三に、ポリリポソームまたは遊離したＴ７−ＥＭＣＶ− ＵＴＲ，−ＣＡ、Ｔ−ＲＮＡのいずれの翻訳も、ｍ７ＧＤＰにより阻害されなか った。特定の理論に結び付けることなしに、これらの観察結果は次のように解釈 することができる。少量のキャップされたＴ７−ＣＡＴ転写物は、ｍ７ＧＤＰに よる翻訳の阻害の原因となるポリリポソームフラクションに選択的に会合する。

遊離したＴ　７−ＣＡＴ・ＲＮＡは、はとんどキャップされていないが、その量 が犬きいため、たとえ効率的でないにしてもキャップ非依存的に翻訳される。我 々の行った試験管中における研究が、キャップされたかまたはキャップされてい ないかのいずれの場合においても、ｍ７ＧＤＰにより阻害されないことを示して いるため、Ｔ７−ＥＭＣＶ−ＵＴＲ−ＣＡＴ−ＲＮＡのキャップ状態を判断する ことはできなかった。しかしながら、Ｔ７−ＣＡＴおよびＴ７−ＥＭＣＶ−ＵＴ Ｒ−ＣＡＴ転写物の５′末端が、同一の５′末端とステムループ構造を有するた め、異なったようにキャップさせていると仮定する理由は存在しない。

研究によれば、真核細胞にある原核転写成分の効果的な利用は、その解決が優れ た発現系のみならず真核ＲＮＡの構造と機能の間の関係の理解に貢献するかも知 れないいくつかの問題を引き起こす可能性がある。バクテリオファージエフ転写 系または関連したバクテリオファージからの同様な系は、すでに説明されている 利点（Ｆｕｅｒｓｔ　１５１１１．上記）を有する。

細胞質内で複製するワクシニアウィルスベクターを選ぶことにより、核処理およ び輸送に関連した余分な問題を避けた。

ワクシニアウィルスは自己のキャッピングおよびメチル化酵素を有しているが（ Ｗｅｉ　ａｔ　ｍｌ、　１９７４．　Ｐ＋ｏｃ、　Ｎａ　１．　Ａｅａｄ、　Ｓ ｃｉ、ｌｌ５Ａ　７１．　３０１４−３０１８）、Ｔ７のＲ，Ｎ　Ａポリメラー ゼによりつくられたＲ　Ｎ　Ａはワクシニアウィルスポリメラーゼによりつくら れたＲＮＡはど効率的にキャップされてはいない（Ｆｕｅｒｓｔ　ｅｔ　ａｌ、 上記）、キャップがＲＮＡの安定性および翻訳の両方に必要であるので［Ｇ＋ｉ ｌｏ　ｅｔ　！ｌ、１９ｇ２．　ｉｎ　ＩｎｔｅＩａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ「ａ ｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　＆　ＴｒａｎＳｃｒｉ　ｔｉｏｎａｌ　ｏｎｌ＋ｏｌ＋ 　ｉｎ　ｔｈｅＲｅ　ｕ！ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　ＥＸ　＋ｅ＋＋ｉｏｎ 　ｅｄｓ、Ｇｒｕｎｂｅｒ（−ＭａｎａＨ，’Ａ＆　５ａｆｅｒ、Ｂ、、（Ｎｅ ｗ　Ｙｏｌｋ：　Ｅｌｓｅｖｉｅ＋　Ｂｉｏｌａｄｉｃａｌ）、　Ｉ’Ｌ　３５ ９−３７２　（グリフオら、　１９８２年、　［遺伝子発現の制御における翻訳 および転写コントロールの相互作用」Ｍ、グルンバーグーマナゴおよびＢ、セイ ファー編所収、　３５９から３７２ページ）］、この欠点は困難な問題となる。

しかし、　ＲＮＡの安定性の問題は、転写物の５′末端においてＴ７ステムルー プ断片を保持することにより解決された。しかしながら、試験管中の研究によれ ばこの構造を含むＲＮＡはワタシニアＲＮＡグアニリルトランスフエラーゼのた めの基質として劣るため（Ｆｕｅｒｘｌ　ｅＬ　ａｔ、　上記）、このステムル ープがキャッピングの問題を悪化させたかもしれない、加えて、ステムループ構 造は、リポソーム走査と干渉しつる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ　ｅｌ＆１、　１９８ ５．ムＩＩ　４０．５１５−５２６；　Ｋｏｘｚｋ、　Ｍ、、１９８Ｇ、江旦１ ９，７９−９０）、ｌ、かじながら、安定なＲＮＡが大量に生成されることによ り（細胞質ＲＮＡの総量の約３０％）、有益な量のタンパク質がワタシニアとＴ ７のハイブリッド発現系によりつくられた。

ここで指摘したいのは、原核転写系においてつくられたＲＮＡに結びついたとき 、ＥＭＣＶのＵＴＲが真核細胞において機能するかどうか本研究の始めにおいて 本出願人らは知らなかったことである。さらに、ワクシニアウィルスが宿主細胞 タンパク質合成を阻害するため、細胞のタンパク質合成機構におけるワクシニア ウィルスによる変化がＥＭＣＶ　−ＵＴＲの効率的な利用を妨げるかも知れない という心配があった。

従って、本発明のＥＭＣＶ　−ＵＴＲ系が真核系において機能したのみならず、 タンパク質のレベルを５００％以上高めたことが分かったとき、このことは期待 されておらず、遺伝子発現技術における大きな改良を意味した。

本発明のは乳類細胞発現系は、ベクターがＤＮＡウィルスであり、ＲＮＡポリメ ラーゼおよびプロモーターがＤＮＡバクテリオファージに由来し、リポソーム結 合部位がＲＮＡウィルスからのものである点で真に折衷的である。しかしながら 、この系は、強力で、迅速、多用途かつ単純な、は乳類または鳥類の細胞での遺 伝子発現の方法を提供する。それは、もっとも単純には、Ｔ７のＲＮＡポリメラ ーゼを発現する標準的な組換えワクシニアウィルスに感染している細胞に、Ｔ７ プロモーターにより調節された注目している遺伝子を含有するプラスミドを移入 することによりすることができる。この後者のアプローチにおいては、新たな組 換えワクシニアウィルスを準備する必要がない、別のアプローチとしては、Ｔ７ プロモーターにより調節された遺伝子をワクシニアウィルス中に組換え、標準的 な二重感染の手順により、より多数の細胞を便利に利用することができ、さらに 高い発現を得ることができる０通常モデル研究のために選ばれる小さな２５゜０ ００ダルトンのＣＡＴタンパク質での結果によれば、それは、ワクシニアウィル スに感染した細胞においてつくられる主要なポリペプチドであり、たった２４時 間後にポリアクリルアミドゲル上のクーマシーブリリアントブルーにより染色さ れたタンパク質の約］０％を占める２Ｘ１０’細胞につき１６．５μｇのレベル にまで蓄積された。ワクシニア／Ｔ７／ＥＭＣＶハイブリッド系による発現のレ ベルは、たとえこれまでに記述されたもつとも強力なポックスウィルスプロモー ターを用いた場合でも（Ｆａｌｋｎｅ＋　ｅｌ　！＋、＋９８８．　Ｊ、Ｖｉ＋ ｏ１．　６２、　１８４９−１８５４：　Ｐａ１ｅｌ　ｅｔ　ａｔ、１９８ｇ、 Ｐ＋ｏｃ、　ＮａｌニーＡｃａｄ、Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　８５．９４：１ｌ−９４３５）、従来からあるワクシニアウィルスベ クターにより得られるよりも大きいものである。細胞がヘルパーウィルスを含有 するＴ７ＲＮＡポリメラーゼに感染するまで発現が起きないので、ワタシニアハ イブリッド系は、例えば潜在的に毒性のある遺伝子に対する利用といったその他 の利点を有している。従って、標的細胞を殺すための毒性のある遺伝子の発現を 、このユニークな特徴によりコントロールすることができる。

勿論、モデルとなるＣＡＴ系による本発明の実施可能性を示したので、いわゆる 当業者に示唆されるように、その他のタンパク質の発現も同様に達成できること が明らかである。

ここに記載された実施例は例示のためのみのものであり、それに照らした種々の 変更がいわゆる当業者に対して示唆され、　この出願の意図および範囲さらに添 付のクレームの範囲に含まれるべきものである。

ＦＩＧ、３Ａ　１　２　３　４ ＦＩＧ、　５Ｂ ｍ７ＧＤＰ　−＋　−＋　−＋　−＋ 国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．キャップに非依存の翻訳を可能にするＲＮＡの非翻訳領域のｃＤＮＡコピー が続き、発現が望まれるタンパク質をコード化する遺伝子が続くＴ７プロモータ ーを含むゲノムをもつ組換えワクシニアウイルス。
2. ２．上記非翻訳領域がＥＭＣＶからのものである請求項１の組換えウイルス。
3. ３．キャップに非依存の翻訳を可能にするＲＮＡの非翻訳領域のｃＤＮＡコピー が続き、発現が望まれるタンパク質をコード化する遺伝子が続くＴ７プロモータ ーを含有するプラスミド。
4. ４．上記非翻訳領域がＥＭＣＶからのものである請求項３のプラスミド。
5. ５．ＡＴＣＣ受託番号第６８０４５号を有する請求項４のプラスミド。
6. ６．請求項１のワクシニアウイルスに細胞を感染させ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ を発現する第二のワクシニアウイルスに上記細胞を感染させ、次に、望まれるタ ンパク質を適切な分離および精製の方法により回収することを含むタンパク質の 合成方法。
7. ７．請求項３のプラスミドを細胞に移入し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する ＤＮＡを基礎とする細胞質ウイルスを上記細胞に移入し、次に、望まれるタンパ ク質を適切な分離および精製の方法により回収することを含むタンパク質の合成 方法。
8. ８．さらに上記細胞を高張条件にさらす請求項６の方法。
9. ９．さらに上記細胞を高張条件にさらす請求項７の方法。
10. １０．上記遺伝子が毒性遺伝子である請求項６の方法。
11. １１．上記遺伝子が毒性遺伝子である請求項７の方法。
12. １２．選ばれた時間に上記のＤＮＡを基礎とする細胞質ウイルスに感染させる請 求項８による方法。
13. １３．選ばれた時間に上記のＤＮＡを基礎とする細胞質ウイルスに感染させる請 求項９による方法。
14. １４．上記組換えワクシニアウイルスのゲノムに存在する非翻訳領域なしに発現 される量より約５００％多い量で望まれるタンパク質を発現する請求項１の組換 えウイルス。
15. １５．請求項３のプラスミドを採用して組換えベクターを構成し、次いで、適切 な細胞培地において上記ベクターにより発現されるタンパク質を従来の分離およ び精製技術を用いて分離することからなり、このようにして得られるタンパク質 の量が非翻訳領域を和用せずに得られる量より約５００％多い、増強された量の 望まれるタンパク質を得る方法。