JP2024531725A - ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本願は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法及びその使用に関し、バイオ技術分野に属する。本願は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供する。前記方法は、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で反応させて、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を製造する。他の従来のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法と比較して、本願の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有し、本願の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質をヒドロゲルにして形成した角膜は、従来の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のものよりも１０倍以上向上し、しかも、本願の方法でポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を製造する場合は、反応時間がより短く、角膜を形成するためのヒドロゲルにすることができるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質が得られるまでにわずか５～８時間しかかからない。
Description
［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年９月１３日に中国特許局に提出された、出願番号が２０２１１１０７１３３６．３、発明の名称が「ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法及びその使用」の中国特許出願の優先権を主張しており、そのすべての内容は引用により本明細書に組み込まれている。
本願は、２０２１年９月１３日に中国特許局に提出された、出願番号が２０２１１１０７１３３６．３、発明の名称が「ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法及びその使用」の中国特許出願の優先権を主張しており、そのすべての内容は引用により本明細書に組み込まれている。
［技術分野］
本願は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法及びその使用に関し、バイオ技術分野に属する。
本願は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法及びその使用に関し、バイオ技術分野に属する。
角膜（Ｃｏｒｎｅａ）は、目の最も前にある凸状の透明度の高い物質で、横長の楕円形をしており、虹彩、瞳孔、前房を覆い、目の屈折力の大部分を担っている。水晶の屈折力と組み合わせることで、光は網膜上に正確に焦点を合わせて画像を形成することができる。角膜には非常に敏感な神経終末があり、異物が角膜に接触すると、目を守るためにまぶたが無意識に閉じる。透明性を維持するために、角膜には血管がなく、涙と房水を通じて栄養と酸素を得る。
角膜は非常に壊れやすく、眼の外傷、炎症、アレルギー反応、物理的損傷、化学火傷、激しい運動、目の使い過ぎなどはすべて角膜の病変を引き起こす可能性がある。角膜が病気になると、目の痛み、羞明、流涙、視力低下などの明らかな目の症状が現れ、重度の場合は失明につながる。
角膜移植は、患者の既存の病気の角膜を正常な角膜に置き換えて、病気に罹患した目の視力を回復したり、角膜の病変を制御したり、視力を改善したり、特定の角膜疾患を治療したりする治療法である。患者に重度の視覚障害や失明を引き起こす一部の角膜疾患の場合、角膜移植は完全な治療を達成させ、これらの不幸な患者の痛みを解消することができる。角膜自体には血管がなく、「免疫寛容」状態にあるため、角膜移植の成功率は他の同種臓器移植の中でも高い。
しかしながら、角膜の資源は限られており、患者のニーズを満たすことができない。この問題を解決するために、一部の研究者は人工角膜移植術を提案した。人工角膜移植術は、透明な医療用ポリマー材料を用いて製造された特別な光学装置を角膜組織に外科的に埋め込めて、角膜瘢痕組織の一部を置換することで、視力を回復する外科的方法である。角膜組織による合成材料の拒絶反応などの問題がまだ解決されておらず、長期成績が悪く、移植部位での房水の漏出や移植片の剥離を引き起こすことが多いため、広く使用することができないのが現状である。現在、人工角膜が適しているのは、さまざまな重篤な角膜疾患を患った後の両眼失明者、特に重度の化学熱傷による角膜白板症を患った人、複数回の角膜移植に失敗し他の手術を受けることができない人だけである。
研究者は人工角膜に基づいて、生体模倣角膜を提案している。例えば、文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）」において、Ｊａｎｇａｍｒｅｄｄｙ、Ｊａｇａｎｍｏｈａｎ Ｒ．らはポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を提案しており、このポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を化学的に架橋すると、生体模倣角膜が得られる。この生体模倣角膜は、優れた生体適合性を備えており、人工合成材料に対する角膜組織の強い拒絶反応の問題を効果的に解決できる。
しかし、この生体模倣角膜の強度は０．０２２ＭＰａと非常に低く、この生体模倣角膜を角膜移植に使用した場合、移植が困難であることや円錐角膜を引き起こす可能性があるなどの問題が残されている。
従来の生体模倣角膜の強度が低いという問題を解決するために、本願は、
コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で反応させて、上記のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を含有する反応生成物を得る反応ステップを含むポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供する。
コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で反応させて、上記のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を含有する反応生成物を得る反応ステップを含むポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供する。
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は１～１６：１である。
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は８～１２：１である。
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の反応溶媒は水又は希塩酸溶液である。
本願の一実施形態では、前記希塩酸溶液の濃度は１～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸溶液のｐＨは希アルカリ溶液で６．０～８．０に調整される。
本願の一実施形態では、前記希アルカリ溶液は、ｐＨ９．０～１１．０の水酸化ナトリウム溶液又はアンモニア水である。
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は１～１５ｍｇ／ｍＬである。
本願の一実施形態では、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬである。
本願の一実施形態では、反応ステップの後、前記方法は、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を濾過により遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得る精製ステップをさらに含む。
本願の一実施形態では、前記濾過は、透析又は限外濾過である。
本願の一実施形態では、前記反応の時間は１～４８ｈである。
本願の一実施形態では、前記反応の時間は５～８ｈである。
本願の一実施形態では、前記コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１において、Ｘは４Ｈｙｐ（４－ヒドロキシプロリン）であり、すなわち、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列は以下の通りである。
Ｈ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－ＯＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のアミノ酸配列は以下の通りである。
Ｈ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｈｙｐ－Ｇｌｙ－ＯＨ
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体は、ＰＥＧ－４０ｋ、ＰＥＧ－２０ｋ、ＰＥＧ－１０ｋ又はＰＥＧ－５ｋのうちの１つ又は複数を含む。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体の活性化基数は８－ａｒｍ、４－ａｒｍ、２－ａｒｍ、又は１－ａｒｍのうちの１つ又は複数である。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体の活性化基数は４－ａｒｍ、又は８－ａｒｍである。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体の活性化基は、－ＭＡＬ、－ＮＨＳ、－ＳＧ、－ＳＰＡ、－ＳＳ、又は－ＥＤＣのうちの１つ又は複数である。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体の活性化基は、－ＭＡＬである。
本願の一実施形態では、前記コラーゲン様タンパク質の一端にｌｉｎｋｅｒが連結されており、前記ポリエチレングリコール誘導体は、活性化基を通じてｌｉｎｋｅｒに修飾されている。
本願の一実施形態では、前記ｌｉｎｋｅｒは、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に連結されている。
本願の一実施形態では、前記ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される。
本願の一実施形態では、前記ｌｉｎｋｅｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示される。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はメルカプト、アミノ、カルボキシ、又はイミダゾリルのうちの１つ又は複数である。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール誘導体のｌｉｎｋｅｒへの修飾部位はメルカプトである。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のコアコンホメーションは、ＨＧ又はＴＰのうちの１つ又は複数である。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のポリエチレングリコール誘導体のコアコンホメーションはＴＰである。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質中のコラーゲン様タンパク質のアミノ酸配置は、Ｄ型又はＬ型のうちの１つ又は複数である。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は、１５，０００～７５，０００Ｄａである。
本願の一実施形態では、前記ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の分子量は、３０，０００～７５，０００Ｄａである。
本願はまた、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を提供する。
本願はまた、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得る凍結乾燥ステップを含む、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
本願の一実施形態では、前記凍結乾燥ステップは、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質と凍結乾燥保護剤を混合して凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得ることである。
本願の一実施形態では、前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、スクロース、又はアラニンのうちの１種又は複数種である。
本願の一実施形態では、前記凍結乾燥は、以下の段階を含む。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
本願はまた、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤を提供する。
本願はまた、生体模倣材料又は再生生体材料の製造における、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質又は上記の方法によって製造された凍結乾燥製剤の使用を提供する。
本願の一実施形態では、前記生体模倣材料又は再生生体材料は角膜である。
本願はまた、
上記の方法によって製造された凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、生体模倣角膜の製造方法を提供する。
上記の方法によって製造された凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、生体模倣角膜の製造方法を提供する。
本願の一実施形態では、硬化ステップの後、前記方法は、角膜の粗品を金型とともに緩衝液に入れて第１浸漬を行い、第１浸漬終了後、金型を開いて、第２浸漬を行い、第２浸漬終了後、離型し、角膜の完成品を得る浸漬ステップをさらに含む。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液の濃度は０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌである。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は５～４０ｇ／ｍＬである。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は１２～１８ｇ／ｍＬである。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は１５ｇ／ｍＬである。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記溶解液とＭＰＣ母液との混合質量比は２：１～４：１である。
本願の一実施形態では、架橋ステップでは、前記混合液１とＤＭＴＭＭ母液との混合質量比は５：１～７：１である。
本願の一実施形態では、前記架橋ステップは、２５～６０℃で行われる。
本願の一実施形態では、前記架橋ステップは、４５～５５℃で行われる。
本願の一実施形態では、硬化ステップでは、前記静置温度は４～３５℃である。
本願の一実施形態では、硬化ステップでは、前記静置温度は４～２５℃である。
本願の一実施形態では、硬化ステップでは、前記静置時間は８～２０ｈである。
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である。
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液の濃度は０．０５～１ｍｏｌ／Ｌである。
本願の一実施形態では、浸漬ステップでは、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
本願の一実施形態では、前記第１浸漬は、温度が４～３５℃、時間が５～２４ｈである。
本願の一実施形態では、前記第２浸漬は、温度が４～３５℃、時間が３～１０ｈである。
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液の成分は、ＭＰＣ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホコリン）、ＰＥＧＤＡ（ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート）、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン）及び溶媒を含む。
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液において、ＭＰＣの濃度は１５～４０ｇ／ｍＬであり、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は０．６～１５体積％であり、ＴＥＭＥＤの濃度は０．０５～２体積％である。
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は８～１２％である。
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は１０％である。
本願の一実施形態では、前記ＭＰＣ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である。
本願の一実施形態では、ＭＰＣ母液において、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。
本願の一実施形態では、ＭＰＣ母液において、前記緩衝液の濃度は０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌである。
本願の一実施形態では、ＭＰＣ母液において、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
本願の一実施形態では、前記ＤＭＴＭＭ母液の成分は、ＤＭＴＭＭ（４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩）、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）及び溶媒を含む。
本願の一実施形態では、前記ＤＭＴＭＭ母液において、ＤＭＴＭＭの濃度は５～２０ｇ／ｍＬであり、ＡＰＳの濃度は０．５～５ｇ／ｍＬである。
本願の一実施形態では、前記ＤＭＴＭＭ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である。
本願の一実施形態では、ＤＭＴＭＭ母液において、前記緩衝液のｐＨは６．５～７．５である。
本願の一実施形態では、ＤＭＴＭＭ母液において、前記緩衝液の濃度は０．５～０．７ｍｏｌ／Ｌである。
本願の一実施形態では、ＤＭＴＭＭ母液において、前記緩衝液は、ＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ又はＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒである。
本願はまた、上記の方法によって製造された生体模倣角膜を提供する。
本願の技術的解決手段は、以下の利点を有する。
１．本願は、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で反応させて、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得るポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供する。他の従来のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法と比較して、本願の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有し、本願の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を用いてヒドロゲルにして形成した角膜は、従来の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のものよりも１０倍以上向上する（文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）におけるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を用いて製造された角膜の強度は、わずか０．０２２ＭＰａである。）。
そして、他の従来のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法と比較して、本願の方法によってポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を製造する場合は、反応時間がより短く、角膜を形成するためのヒドロゲルにすることができるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質が得られるまでにわずか５～８時間しかかからない（文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）」では、角膜を形成するためのヒドロゲルにすることができるポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の調製に４週間かかる。）。
さらに、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は８～１２：１である。この供給モル数の比で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有する。
さらに、前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬである。この供給濃度で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、より優れた架橋性を有する。
以上の通り、本願の方法及び本願の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質は、生体模倣角膜などの生体模倣材料又は再生生体材料の製造における将来性が非常に期待できる。
２．本願は、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質と凍結乾燥保護剤を混合して凍結乾燥させ、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤を得るステップを含む、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。凍結乾燥保護剤は、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の構造が凍結乾燥プロセス中に破壊されないように、上記の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を保護することができ、それによって、本願の方法によって製造された凍結乾燥製剤をヒドロゲルにして形成した角膜は、より高い強度を有する。
以上の通り、本願の方法及び本願の方法によって製造された凍結乾燥製剤は、生体模倣角膜などの生体模倣材料又は再生生体材料の製造における将来性が非常に期待できる。
３．本願は、まず、上記の方法によって製造された凍結乾燥製剤をＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、溶解液を得て、次に、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、さらに、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得て、最後に、混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る、生体模倣角膜の製造方法を提供する。他の従来の生体模倣角膜の製造方法と比較して、本願の方法によって製造された角膜は、強度が高く、他の従来の生体模倣角膜の製造方法によって製造された角膜と比較して強度が１０倍以上向上する（文献「再生促進角膜インプラントにおけるコラーゲンの代替としての短いペプチド類似体（Short peptide analogs as alternatives to collagen in pro-regenerative corneal implants）で製造された角膜の強度は、わずか０．０２２ＭＰａである。）。
さらに、前記方法は、凍結乾燥製剤をｐＨ６．５～７．５、温度４５～５５℃の条件で架橋させる。この架橋条件で製造された生体模倣角膜は、より高い強度を有する。
さらに、前記方法は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１２～１８ｇ／ｍＬに制御する。このポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度で製造された生体模倣角膜は、より高い強度を有する。
さらに、前記方法は、ＭＰＣ母液中のＰＥＧＤＡの濃度を８～１２％に制御する。このＰＥＧＤＡの濃度で製造された生体模倣角膜は、より高い強度を有する。
以下の実施例は、本願をよりよく理解するために提供されたものであり、前述の最良の実施形態に限定されるものではなく、本願の内容及び保護範囲を制限するものではなく、本願の示唆又は本願と他の従来技術の特徴を組み合わせて得られた、本願と同一又は類似する如何なる製品も、本願の保護範囲内に入る。
以下の実施例において特定の実験ステップまたは条件が明記されていない場合、当該分野の文献に記載されている従来の実験ステップの操作または条件に従って実行することができる。使用した試薬や機器の製造元が明記されていない場合、それらはすべて市販されている従来の試薬製品である。以下の実施例では、コラーゲン様タンパク質の合成、およびコラーゲン様タンパク質とｌｉｎｋｅｒとの連結は、上海昂博生物技術有限公司（ＡｍｂｉｏＰｈａｒｍ．ＩｎＣ．）によって行われる。下記の実施例におけるポリエチレングリコール誘導体は、すべて厦門賽諾邦格生物科技股▲ふん▼有限公司から購入する。
実施例１－１：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法
本実施例は、以下のステップを含むポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供する。
反応ステップ：コラーゲン様タンパク質（コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示され、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｌｉｎｋｅｒが連結されている）とポリエチレングリコール誘導体（８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ）を濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの希塩酸溶液（希塩酸溶液のｐＨは、ｐＨ１１．０の水酸化ナトリウム溶液で６．５に調整）に溶解し、希塩酸溶液中のコラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ２．４ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３ｍｍｏｌ／Ｌにし、反応系を得た。反応系をｐＨ６．５、温度５℃の条件で１２ｈ反応させ、反応生成物を得た。
精製ステップ：反応生成物を孔径３０，０００Ｄａの限外濾過膜により５℃で限外濾過し、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を得た。
本実施例は、以下のステップを含むポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供する。
反応ステップ：コラーゲン様タンパク質（コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示され、コラーゲン様タンパク質のＮ末端に、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるｌｉｎｋｅｒが連結されている）とポリエチレングリコール誘導体（８－ａｒｍ－ＰＥＧ－４０ｋ－ＭＡＬ）を濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの希塩酸溶液（希塩酸溶液のｐＨは、ｐＨ１１．０の水酸化ナトリウム溶液で６．５に調整）に溶解し、希塩酸溶液中のコラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ２．４ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３ｍｍｏｌ／Ｌにし、反応系を得た。反応系をｐＨ６．５、温度５℃の条件で１２ｈ反応させ、反応生成物を得た。
精製ステップ：反応生成物を孔径３０，０００Ｄａの限外濾過膜により５℃で限外濾過し、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を得た。
実施例２－１：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
本実施例は、以下のステップを含むポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
実施例１で得られたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１とマンニトールを質量比１：５で混合し、凍結乾燥系を得た。凍結乾燥系を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤１を得た。
凍結乾燥は、以下の段階を含む。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
本実施例は、以下のステップを含むポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
実施例１で得られたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１とマンニトールを質量比１：５で混合し、凍結乾燥系を得た。凍結乾燥系を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤１を得た。
凍結乾燥は、以下の段階を含む。
段階１：温度が－４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。
実施例１－２：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、反応温度（５℃）を２℃、８℃、２５℃、３７℃にそれぞれ変更し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質２～５を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、反応温度（５℃）を２℃、８℃、２５℃、３７℃にそれぞれ変更し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質２～５を製造した。
実施例２－２：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－２で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質２～５にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤２～５を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－２で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質２～５にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤２～５を製造した。
実施例１－３：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、反応ｐＨ（６．５）をｐＨ２．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ１０．５にそれぞれ変更し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質６～１３を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、反応ｐＨ（６．５）をｐＨ２．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ１０．５にそれぞれ変更し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質６～１３を製造した。
実施例２－３：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－３で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質６～１３にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤６～１３を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－３で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質６～１３にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤６～１３を製造した。
実施例１－４：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の希塩酸溶液中のモル濃度をそれぞれ以下の濃度に変更した。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３７５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．８ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．２２５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．２ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．１５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１４～１６を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の希塩酸溶液中のモル濃度をそれぞれ以下の濃度に変更した。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ３．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．３７５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．８ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．２２５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
希塩酸溶液において、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体のモル濃度をそれぞれ１．２ｍｍｏｌ／Ｌ及び０．１５ｍｍｏｌ／Ｌにする。
ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１４～１６を製造した。
実施例２－４：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－４で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１４～１６にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤１４～１６を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－４で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１４～１６にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤１４～１６を製造した。
実施例１－５：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、反応時間（１２ｈ）を、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、２４ｈにそれぞれ変更し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１７～２０を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法を提供し、前記方法は、実施例１－１の方法を基にして、反応時間（１２ｈ）を、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、２４ｈにそれぞれ変更し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１７～２０を製造した。
実施例２－５：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－５で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１７～２０にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤１７～２０を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１を、実施例１－５で製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質１７～２０にそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤１７～２０を製造した。
実施例２－６：ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、凍結乾燥保護剤（マンニトール）をスクロース、アラニンにそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤２１～２２を製造した。
本実施例は、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、前記方法は、実施例２－１の方法を基にして、凍結乾燥保護剤（マンニトール）をスクロース、アラニンにそれぞれ変更し、凍結乾燥製剤２１～２２を製造した。
実験例１：製造プロセスがポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質及びその凍結乾燥製剤の架橋性に与える影響についての実験
本実験例は、製造プロセスがポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質及びその凍結乾燥製剤の架橋性に与える影響についての実験を提供し、実験の過程は以下の通りである。
凍結乾燥製剤１の製造方法を参照して、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質をそのまま用いて凍結乾燥製剤を製造し、この凍結乾燥製剤をブランクとし、実施例２－１～２－６で製造された凍結乾燥製剤１～２２をそれぞれ角膜にし、角膜１～２２を得た。ユニバーサル引張機によって角膜１～２２の強度を検出し、検出結果を表１に示す。
角膜の製造プロセスは以下の通りである。
架橋ステップ：凍結乾燥製剤を濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１２．５ｇ／ｍＬとし、溶解液を得た。溶解液とＭＰＣ母液を質量比５：１で混合し、混合液１を得た。混合液１とＤＭＴＭＭ母液を質量比７：１で混合し、混合液２を得た。架橋全体は、４５℃で行われた。
硬化ステップ：混合液２を角膜金型に注入して、２５℃で１２ｈ静置し、角膜の粗品を得た。
浸漬ステップ：角膜の粗品を（金型とともに）濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに添加し、４℃で２４ｈ浸漬した後、金型を開いて、４℃でさらに４ｈ浸漬し、離型し、角膜の完成品を得た。
ＭＰＣ母液の処方：３０ｇ／ｍＬＭＰＣ、１０％ＰＥＧＤＡ（ｖ／ｖ）、１％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ
ＤＭＴＭＭ母液の処方：１０ｇ／ｍＬＤＭＴＭＭ、１５ｇ／ｍＬ ＡＰＳ、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ。
本実験例は、製造プロセスがポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質及びその凍結乾燥製剤の架橋性に与える影響についての実験を提供し、実験の過程は以下の通りである。
凍結乾燥製剤１の製造方法を参照して、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるコラーゲン様タンパク質をそのまま用いて凍結乾燥製剤を製造し、この凍結乾燥製剤をブランクとし、実施例２－１～２－６で製造された凍結乾燥製剤１～２２をそれぞれ角膜にし、角膜１～２２を得た。ユニバーサル引張機によって角膜１～２２の強度を検出し、検出結果を表１に示す。
角膜の製造プロセスは以下の通りである。
架橋ステップ：凍結乾燥製剤を濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１２．５ｇ／ｍＬとし、溶解液を得た。溶解液とＭＰＣ母液を質量比５：１で混合し、混合液１を得た。混合液１とＤＭＴＭＭ母液を質量比７：１で混合し、混合液２を得た。架橋全体は、４５℃で行われた。
硬化ステップ：混合液２を角膜金型に注入して、２５℃で１２ｈ静置し、角膜の粗品を得た。
浸漬ステップ：角膜の粗品を（金型とともに）濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに添加し、４℃で２４ｈ浸漬した後、金型を開いて、４℃でさらに４ｈ浸漬し、離型し、角膜の完成品を得た。
ＭＰＣ母液の処方：３０ｇ／ｍＬＭＰＣ、１０％ＰＥＧＤＡ（ｖ／ｖ）、１％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ
ＤＭＴＭＭ母液の処方：１０ｇ／ｍＬＤＭＴＭＭ、１５ｇ／ｍＬ ＡＰＳ、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５のＭＯＰＳ Ｂｕｆｆｅｒ。
表１からわかるように、製造プロセスはポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質及びその凍結乾燥製剤の架橋性に影響を与え、さらにヒドロゲルにして形成した角膜にも影響を与え、さらに、凍結乾燥賦形剤の組成はポリエチレングリコール化コラーゲンのために骨格サポートと保護を提供し、それによってポリマーの空間構造と生物学的活性に影響を与え、その結果、成膜後の硬度に違いがある。実施例２－１～２－６で製造された凍結乾燥製剤１～２２を用いて製造された角膜１～２２は、強度が向上するとともに、生体適合性が向上し、生体模倣角膜などの生体模倣材料又は再生生体材料の製造における将来性が非常に期待できる。
実施例３－１：生体模倣角膜の製造方法
本実施例は、以下のステップを含む生体模倣角膜の製造方法を提供する。
架橋ステップ：実施例２－１で製造された凍結乾燥製剤を濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１５ｇ／ｍＬにし、溶解液を得た。溶解液とＭＰＣ母液を質量比４：１で混合し、混合液１を得た。混合液１とＤＭＴＭＭ母液を質量比７：１で混合し、混合液２を得た。架橋全体は、４５℃で行われた。
硬化ステップ：混合液２を角膜金型に注入して、２５℃で１２ｈ静置し、角膜の粗品を得た。
浸漬ステップ：角膜の粗品を（金型とともに）濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに添加し、４℃で２４ｈ浸漬した後、金型を開いて、４℃でさらに４ｈ浸漬し、離型し、生体模倣角膜２３を得た。
ＭＰＣ母液の処方：３０％ＭＰＣ（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）、１０％ＰＥＧＤＡ（ｖ／ｖ）、１％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ；
ＤＭＴＭＭ母液の処方：１０％ＤＭＴＭＭ（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）、１５％ＡＰＳ（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ。
本実施例は、以下のステップを含む生体模倣角膜の製造方法を提供する。
架橋ステップ：実施例２－１で製造された凍結乾燥製剤を濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度を１５ｇ／ｍＬにし、溶解液を得た。溶解液とＭＰＣ母液を質量比４：１で混合し、混合液１を得た。混合液１とＤＭＴＭＭ母液を質量比７：１で混合し、混合液２を得た。架橋全体は、４５℃で行われた。
硬化ステップ：混合液２を角膜金型に注入して、２５℃で１２ｈ静置し、角膜の粗品を得た。
浸漬ステップ：角膜の粗品を（金型とともに）濃度０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒに添加し、４℃で２４ｈ浸漬した後、金型を開いて、４℃でさらに４ｈ浸漬し、離型し、生体模倣角膜２３を得た。
ＭＰＣ母液の処方：３０％ＭＰＣ（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）、１０％ＰＥＧＤＡ（ｖ／ｖ）、１％ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ）、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ；
ＤＭＴＭＭ母液の処方：１０％ＤＭＴＭＭ（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）、１５％ＡＰＳ（ｗ／ｖ、ｇ／ｍＬ）、溶媒０．５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．５のＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ。
実施例３－２：生体模倣角膜の製造方法
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、架橋温度（４５℃）を２０℃、２５℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃にそれぞれ変更し、生体模倣角膜２４～３０を製造した。
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、架橋温度（４５℃）を２０℃、２５℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃にそれぞれ変更し、生体模倣角膜２４～３０を製造した。
実施例３－３：生体模倣角膜の製造方法
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、ＢｕｆｆｅｒのｐＨ（６．５）を５、５．５、６、７、７．５、８、８．５、９にそれぞれ変更し、生体模倣角膜３１～３８を製造した。
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、ＢｕｆｆｅｒのｐＨ（６．５）を５、５．５、６、７、７．５、８、８．５、９にそれぞれ変更し、生体模倣角膜３１～３８を製造した。
実施例３－４：生体模倣角膜の製造方法
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度（１５ｇ／ｍＬ）を、１ｇ／ｍＬ、５ｇ／ｍＬ、１０ｇ／ｍＬ、２０ｇ／ｍＬ、２５ｇ／ｍＬ、３０ｇ／ｍＬ、３５ｇ／ｍＬ、４０ｇ／ｍＬ、４５ｇ／ｍＬにそれぞれ変更し、生体模倣角膜３９～４７を製造した。
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ中のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度（１５ｇ／ｍＬ）を、１ｇ／ｍＬ、５ｇ／ｍＬ、１０ｇ／ｍＬ、２０ｇ／ｍＬ、２５ｇ／ｍＬ、３０ｇ／ｍＬ、３５ｇ／ｍＬ、４０ｇ／ｍＬ、４５ｇ／ｍＬにそれぞれ変更し、生体模倣角膜３９～４７を製造した。
実施例３－５：生体模倣角膜の製造方法
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、ＭＰＣ母液中のＰＥＧＤＡの濃度（１０％、ｖ／ｖ）を０．５％、０．６％、１％、５％、８％、１２％、１５％（ｖ／ｖ）にそれぞれ変更し、生体模倣角膜４８～５４を製造した。
本実施例は、生体模倣角膜の製造方法を提供し、前記方法は、実施例３－１の方法を基にして、ＭＰＣ母液中のＰＥＧＤＡの濃度（１０％、ｖ／ｖ）を０．５％、０．６％、１％、５％、８％、１２％、１５％（ｖ／ｖ）にそれぞれ変更し、生体模倣角膜４８～５４を製造した。
実験例２：製造プロセスが角膜の強度に与える影響についての実験
本実験例は、製造プロセスが角膜の強度に与える影響につての実験を提供し、実験の過程は以下の通りである。
本実験例は、製造プロセスが角膜の強度に与える影響につての実験を提供し、実験の過程は以下の通りである。
ユニバーサル引張機によって角膜２３～５４の強度を検出し、検出結果を表２に示す。
表２からわかるように、製造プロセスは角膜の強度に影響を与え、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度が低すぎると角膜の強度が低下し、濃度が高すぎると角膜の硬化時間が非常に短くなり、その後の注入ステップを完了できなくなる。ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の等電点は中性であるため、架橋ｐＨが等電点から遠く離れると、反応に関与する基が互いに近づくことができず、角膜強度が低下したり、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質のゲル化は起こらなかったりする。ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質で製造されたヒドロゲルは、温度に敏感なヒドロゲルであり、温度が低いと溶解性が悪く、角膜の固形分濃度が低くなり、強度が低下し、温度が高いと架橋速度が非常に速くなり、金型に流し込めなくなり、早期にゲル化してしまう。ＭＰＣ母液中のＰＥＧＤＡの濃度が低すぎると、角膜の強度が低下し、濃度が高すぎると、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質が過剰に架橋され、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質で製造されたヒドロゲルの脆性は増加し、靭性は低下し、それによって角膜の強度が低下する。表１では、角膜２３、２５～２９、３２～３６、４０～４５および５０～５４は、すべて、強度と生体適合性に優れており、角膜移植の分野での応用が期待されている。
明らかに、上記の実施例は、単に明確に説明するための例であり、実施形態を限定するものではない。当業者にとっては、上記の説明に基づいて、他の異なる形の変化または変更が行われてもよい。ここでは、すべての実施形態を網羅的に挙げる必要もなく、また、不可能なことである。そして、そこから引き出された自明な変化又は変動も本願の保護範囲に含まれるものとする。
Claims (37)
- コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体をｐＨ ６．０～８．０、温度２～８℃の条件で反応させて、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を含有する反応生成物を得る反応ステップを含む、ことを特徴とするポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の製造方法。
- 前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は１～１６：１である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質とポリエチレングリコール誘導体の供給モル数の比は８～１２：１である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質及びポリエチレングリコール誘導体の反応溶媒は水又は希塩酸溶液である、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記希塩酸溶液の濃度は１～１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸溶液のｐＨは希アルカリ溶液で６．０～８．０に調整される、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 前記希アルカリ溶液は、ｐＨ９．０～１１．０の水酸化ナトリウム溶液又はアンモニア水である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
- 前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は１～１５ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記反応ステップでは、コラーゲン様タンパク質の反応溶媒中の供給濃度は８～１０ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 反応ステップの後、反応生成物中の分子量が３０，０００Ｄａ以上の物質を濾過により遮断し、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を得る精製ステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記濾過は、透析又は限外濾過である、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法によって製造される、ことを特徴とするポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質を凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得る凍結乾燥ステップを含む、ことを特徴とするポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 前記凍結乾燥ステップは、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質と凍結乾燥保護剤を混合して凍結乾燥させ、凍結乾燥製剤を得ることである、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 前記凍結乾燥保護剤は、マンニトール、スクロース、又はアラニンのうちの１種又は複数種である、ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
- 前記凍結乾燥は、以下の段階を含む、ことを特徴とする請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
段階１：温度が４５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が５００ｍ Ｔｏｒｒの条件で６ｈ凍結乾燥させる。
段階２：温度が－３０℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で１７ｈ凍結乾燥させる。
段階３：温度が２５℃、真空度（ｖａｃｕｕｍ）が１００ｍ Ｔｏｒｒの条件で７ｈ凍結乾燥させる。 - 請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法によって製造される、ことを特徴とするポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の凍結乾燥製剤。
- 生体模倣材料又は再生生体材料の製造における、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法によって製造されたポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質、又は請求項１２に記載のポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法によって製造された凍結乾燥製剤、又は請求項１７に記載の凍結乾燥製剤の使用。
- 前記生体模倣材料又は再生生体材料は角膜である、ことを特徴とする請求項１８に記載の使用。
- 請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法によって製造された凍結乾燥製剤を緩衝液に溶解し、溶解液を得て、溶解液とＭＰＣ母液を混合し、混合液１を得て、混合液１とＤＭＴＭＭ母液を混合し、混合液２を得る架橋ステップと、
混合液２を角膜の金型に注入して静置し、角膜の粗品を得る硬化ステップと、を含む、ことを特徴とする生体模倣角膜の製造方法。 - 硬化ステップの後、角膜の粗品を金型とともに緩衝液に入れて第１浸漬を行い、第１浸漬終了後、金型を開いて、第２浸漬を行い、第２浸漬終了後、離型し、角膜の完成品を得る浸漬ステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 架橋ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 架橋ステップでは、前記緩衝液において、ポリエチレングリコール化コラーゲン様タンパク質の濃度は５～４０ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 架橋ステップでは、前記溶解液とＭＰＣ母液との混合質量比は２：１～４：１である、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 架橋ステップでは、前記混合液１とＤＭＴＭＭ母液との混合質量比は５：１～７：１である、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 前記架橋ステップは、２５～６０℃で行われる、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 硬化ステップでは、前記静置温度は４～３５℃である、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 浸漬ステップでは、前記緩衝液のｐＨは５．５～８．０である、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 前記第１浸漬は、温度が４～３５℃、時間が５～２４ｈである、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
- 前記第２浸漬は、温度が４～３５℃、時間が３～１０ｈである、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
- 前記ＭＰＣ母液の成分は、ＭＰＣ、ＰＥＧＤＡ、ＴＥＭＥＤ及び溶媒を含む、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 前記ＭＰＣ母液において、ＭＰＣの濃度は１５～４０ｇ／ｍＬであり、前記ＭＰＣ母液において、ＰＥＧＤＡの濃度は０．６～１５体積％であり、ＴＥＭＥＤの濃度は０．０５～２体積％である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
- 前記ＭＰＣ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６～８である、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
- 前記ＤＭＴＭＭ母液の成分は、ＤＭＴＭＭ、ＡＰＳ及び溶媒を含む、ことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
- 前記ＤＭＴＭＭ母液において、ＤＭＴＭＭの濃度は５～２０ｇ／ｍＬであり、ＡＰＳの濃度は０．５～５ｇ／ｍＬである、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
- 前記ＤＭＴＭＭ母液の溶媒は緩衝液であり、前記緩衝液のｐＨは６．０～８．０である、ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
- 請求項２０～３６のいずれか１項に記載の方法によって製造される、ことを特徴とする生体模倣角膜。
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