JP2024518750A - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｒｓａ）の検出のためのプライマーセット、試薬組成物および方法 - Google Patents

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｒｓａ）の検出のためのプライマーセット、試薬組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、プライマーのセット、試薬の組成物およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出するための方法に関する。

Description

本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)（ＭＲＳＡ）を検出するためのプライマーのセット、プライマーのセットを使用するＭＲＳＡを検出するための方法、およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーのセットに関する。本発明は、医学診断に適用可能である。
黄色ブドウ球菌は、スタフィロコッカス科(Staphylococcaceae)に属すグラム陽性、コアグラーゼ陽性菌である。黄色ブドウ球菌は、宿主に病徴を生じることなく皮膚、皮膚腺および粘膜に定着する常在菌に属する。研究では、人口の約２０％が鼻咽頭の黄色ブドウ球菌保菌者であることを示している。黄色ブドウ球菌は、ヒトにおける最も多い病因菌の１つである。さらに、黄色ブドウ球菌は、他の病原菌よりも比較的頻繁に、治療に一般的に使用される多くの抗生物質に対する耐性を獲得する。例えば、最初の黄色ブドウ球菌耐性株は、ペニシリン治療が導入されてからわずか２年後に同定された。また、合成抗生物質メチシリンに耐性のある黄色ブドウ球菌の最初の株（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌－ＭＲＳＡ）は、メチシリンが医療に導入された（１９５９年）わずか１年後の１９６０年に同定された。
黄色ブドウ球菌が多様な抗生物質に対して耐性を獲得する分子的基盤は、遺伝子交換と細菌がゲノムの可動部分を菌株間、さらには種間で移動させる能力である。
ＭＲＳＡ株の場合、メチシリンに対する耐性は、β－ラクタム系抗生物質に親和性を有するＰＢＰ（ペニシリン結合タンパク質）と呼ばれる代替タンパク質の産生によって条件付けられる。このタンパク質は、ＳＣＣｍｅｃ(Staphylococcal Cassette Chromosome mec)と呼ばれる稼働遺伝因子(mobile genetic element)（ＭＧＥ）上にあるｍｅｃＡ遺伝子によってコードされている。メチシリン耐性の獲得には、メチシリン感受性菌の染色体へのＳＣＣｍｅｃカセットの挿入に関与している。
ＭＲＳＡ株により引き起こされる感染は、死亡率が高いだけでなく、入院期間が長く、そのため治療費が高くなるという特徴がある。従って、ＭＲＳＡ株の診断は、主にその蔓延を限定するために、極めて重要な医学的関心事である。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検査室診断は、主として、多くの場合、感染している可能性のある身体部位から採取されるスワブの形の生物学的材料中の細菌を検出することに基づいている。ＭＲＳＡ菌を検出する潜在的方法としては、適切な培地での細菌培養とともに、黄色ブドウ球菌株の同定、使用可能な抗生物質に対する耐性／感受性の判定（アンチバイオグラム）を行うものである。培養検査は、その高い感度と特異度にもかかわらず、労働集約的で時間のかかる検査である。さらに、アンチバイオグラムを実施する必要があるため、ＭＲＳＡ診断の時間がさらに長くなる。
最大の特異度と感度を特徴とする方法は、生物学的材料中のＭＲＳＡ核酸の検出を含む方法（いわゆるＮＡＡＴ法－核酸増幅検査）である。ＮＡＡＴ技術で最も一般的に使用されている検査は、リアルタイムＰＣＲに基づくアッセイである。リアルタイムＰＣＲ技術を用いた多くの検査が市販されているが、激しい競争にもかかわらず、これらの方法はまだ比較的高価である。しかも、高度に専門化された人員、高価な装置を必要とし、患者のサンプルから遺伝物質を単離する必要がある。さらに、試薬の加熱と冷却を繰り返す必要があるため、この方法は時間がかかり、使用する装置はこのプロセスを実行するために比較的大きなエネルギーを消費する。
ＬＡＭＰ(Loop-mediated isothermal amplification)法を含む等温法は、診断プロセスを加速し、分析の実施に必要なエネルギーコストを削減できる方法である。さらに、文献のデータによると、これらの方法は前述のリアルタイムＰＣＲ技術よりも高い感度と特異度を特徴とし、遙かに迅速である。その等温コースは特別な装置を必要としない。
等温法は必要な装置が少ないため、プライマリーケアユニット（ＰＯＣＴ：臨床現場即時検査(Point-of-Care Testing)）のための理想的な診断解決法であり、一般開業医または専門医（婦人科医、泌尿器科医）の診療所で、患者と医師との最初の接触時に検査を実施することができる。この解決法により、迅速な診断検査（１５分以内）が可能になり、初診時に目標とする療法を選択することができる。これは、極めて短時間で死に至る可能性があり、迅速な診断と早期の治療開始が極めて重要であるＭＲＳＡ菌による全身感染（いわゆる敗血症）の場合に特に重要である。一方、凍結乾燥試薬を使用することで、診断用検査試料を凍結する必要がなく、室温で保存することができる。
ＭＲＳＡの診断のためのＬＡＭＰ法におけるプライマーの使用は、これまでに公開されている特許出願から知られている：ＷＯ２０１９１３２４４４Ａ１；ＵＳ１０３７０７０５Ｂ２；ＵＳ２０１８００９４２９２Ａ１；ＪＰ２０１８０６８３１５Ａ；ＵＳ２０１７０１１４３９３Ａ１；ＥＰ２０９９９３６Ｂ１；ＥＰ２８５０２０５Ｂ１；ＣＮ１０５６７１１４６Ａ；ＣＮ１１１０９４５９５Ａ；ＷＯ２０１４０７３８５８Ａ１；ＣＮ１１１８６８２５８Ａ；ＪＰ２００６２７１３７０Ａ；ＫＲ１０２１２６４２９Ｂ１。ＬＡＭＰ法は、例えば、特許明細書ＷＯ００２８０８２、ＷＯ０２２４９０２に開示されている。上述の特許出願は、ほとんどの場合、ＭＲＳＡ菌の感度および検出限界を記載していない。上述のいくつかの特許出願の検出法では、定量的な測定ができず、アガロースゲル電気泳動または増幅反応陽性時の反応混合物の色の変化に基づく他のマーカーを用いた終点型の検出である。上述のいくつかの特許では、マグネシウムイオンの濃度に基づく間接的測定が用いられている。特許出願の中には、定量的測定が可能なリアルタイム技術で実施されているものもあるが、検出方法は蛍光色素で標識した分子プローブに基づいているため、分析コストが大幅に増加する。検出の他の技術的解決法は、いわゆるブロックプライマーに基づいている。さらに、記載した特許出願では、分析時間と陽性結果を待つ時間は約６０分である。その上、開発された上記のキットのほとんどはＰＯＣＴ診断には適用できず、その主な用途は検査室向けである。
従って、臨床現場即時検査での使用を意図したＬＡＭＰ法によるＭＲＳＡの診断に使用されるプライマーセットを適切に精密化し、短時間（≦２０分）で非常に低い検出限界（≧１０コピー／反応）で細菌を検出できる診断法を提供する必要性が依然として存在する。予期せぬことに、上記の問題は本発明によって解決された。
本発明の第１の主題は、ＭＲＳＡ菌のｍｅｃＡ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーのセットであり、ＭＲＳＡ菌のｍｅｃＡ遺伝子の選択された断片に特異的な、以下のヌクレオチド配列ａ）およびｂ）を有する内部プライマーのセット、ならびに以下のヌクレオチド配列ｃ）およびｄ）を含む外部プライマーのセット：
ａ）３’末端から、好ましくはＴＴＴＴ架橋によって、配列５’ＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＴＣ３’（配列番号４の核酸配列またはその逆転および相補配列）に連結された、５’ＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＣＴＡＡＴＡ３’（配列番号３の核酸配列またはその逆転および相補配列）；
ｂ）３’末端から、好ましくはＴＴＴＴ架橋によって、配列５’ＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＴＡ３’（配列番号６の核酸配列またはその逆転および相補配列）に連結された、５’ＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＧＣ３’（配列番号５の核酸配列またはその逆転および相補配列）；
ｃ）配列番号１の核酸配列５’ＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴ３’またはその逆転および相補配列、ならびに
ｄ）配列番号２の核酸配列５’ＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣ３’またはその逆転および相補配列
を含むことを特徴とする。
本発明の好ましい実施形態では、プライマーセットは、ＭＲＳＡ菌のｍｅｃＡ遺伝子と相補的な核酸配列 配列番号７－５’ＣＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣ３’またはその配逆転および相補配列を含むループプライマー配列を含んでなる。
本発明の第２の主題は、ＭＲＳＡ菌を検出するための方法であり、ＭＲＳＡゲノムの核酸配列の選択された領域（ｍｅｃＡ遺伝子断片）が、本発明の第１の主題に定義されるようなプライマーを用いて増幅され、増幅方法はＬＡＭＰ法であることを特徴とする。好ましい実施形態では、増幅は、温度プロファイル：６２℃、４０分で行われる。本発明の第１のさらなる好ましい実施形態では、終点反応は、８０℃、５分の温度プロファイルで行われる。
本発明の第３の主題は、ＭＲＳＡ菌により引き起こされる感染を検出するための方法であり、本発明の第２の主題に定義される検出方法を含んでなることを特徴とする。
本発明の第４の主題は、ＭＲＳＡ菌により引き起こされる感染を検出するためのキットであり、本発明の第１の主題に定義されるようなプライマーのセットを含んでなることを特徴とする。
本発明の好ましい実施形態では、感染検出キットは、５．０μｌのＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰマスターミックスを含んでなる。本発明のさらなる好ましい実施形態では、感染検出キットは、本発明の第１の主題に定義されるような個々の増幅プライマーを含んでなり、該プライマーは以下の濃度：０．１３μＭ Ｆ３、０．１３μＭ Ｂ３、１．０６μＭ ＦＩＰ、１．０６μＭ ＢＩＰ、０．２６μＭループＦを有するものであり；Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％を含んでなり；マンニトール－１．２５％を含んでなり；二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、または≦１μｌの量の蛍光色素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、またはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または増幅反応を阻害しない濃度の、二本鎖ＤＮＡと相互作用する別の蛍光色素を含んでなる。
ＭＲＳＡを検出するための本発明のプライマーセットならびにＭＲＳＡ感染を検出するための方法および増幅産物を検出する方法の利点は、ポータブル遺伝子分析装置を用いる標的用途における臨床現場即時検査（ＰＯＣＴ）での医療診断におけるそれらの使用の可能性である。本発明の反応混合物を凍結乾燥することにより、検査の診断パラメーターを低下させることなく、診断キットを室温で保存することができる。さらに、増幅産物を検出するために蛍光色素を使用することで、検査法の感度が向上し、検出限界を引き下げることができ（１０ゲノムコピー／反応まで）、しかも検査サンプル中のＭＲＳＡ菌の定量的測定が可能になる。
本発明の例示的実施形態を図面に示す。
図１は、本方法に特徴的な感度を示し、鋳型：黄色ブドウ球菌定量ＤＮＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）７００６９９ＤＱ（商標））では、特異的シグナルが１００－１０コピー／μｌの範囲で得られたが、ＮＴＣでは産物は見られなかった（図１：レーン１：分子量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡラダー、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；レーン２：１００コピーのＭＲＳＡ；レーン３：５０コピーのＭＲＳＡ；レーン４：２０コピーのＭＲＳＡ；レーン５：１０コピーのＭＲＳＡ；レーン６：ＮＴＣ）。 図２は、黄色ブドウ球菌定量ＤＮＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）７００６９９ＤＱ（商標））標準の連続希釈液を１００－１０コピー／ＤＮＡ標準反応でアッセイすることにより測定された本発明の方法の感度を示し、増幅産物はリアルタイムで測定した。リアルタイムＭＲＳＡ検出の結果を表１に示し、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を示す。 図３および４は、天然の生理学的細菌叢として被検生物材料中に潜在的に存在する多数の病原体、同時感染に起因する可能性のある病原体、または類似のゲノム配列を共有する病原体の標準マトリックスを用いた本発明の方法の特異性を示す（図３：レーン１：分子量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡラダー、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；レーン２および３：メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）；レーン４および５：ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)；レーン６および７：髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)；レーン８および９：肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)；レーン１０および１１：百日咳菌(Bordetella pertussis)；レーン１２および１３：化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)；レーン１４および１５：エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)；レーン１６および１７：エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)；レーン１８および１９：緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)；レーン２０および２１：モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)；レーン２２および２３：肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)；レーン２４および２５：ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)；レーン２６および２７：リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)；レーン２８および２９：レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)；レーン３０および３１：軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)；レーン３２および３３：ＨＨＶ５；レーン３４および３５：ヒト(Homo sapiens)；レーン３６および３７：カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)；レーン３３および３９：大腸菌(Escherichia coli)；レーン４０および４１：Ｂ型インフルエンザウイルス；レーン４２および４３：Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルス；レーン４４および４５：Ａ型インフルエンザＨ３Ｎ１ウイルス；レーン４６および４７：ライム病ボレリア(Borrelia afzelii)；レーン４８および４９：トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondi)；レーン５０および５１：ＨＢＶ；レーン５２および５３：梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)；レーン５４および５５：ヘモフィルス・インフルエンザ(Heamophilus influenzae)；レーン５６および５７：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２；レーン５８および５９：アシネトバクター・バウマニ(Actinomyces baumannii)；図４：レーン１：分子量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡラダー、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；レーン２および３：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）；レーン４および５：ＮＴＣ）。
実施例１．プライマー配列
ＬＡＭＰ技術を用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌遺伝物質の検出に使用される特異的オリゴヌクレオチドの配列を以下に示し、特徴付ける。
１．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡＦ３オリゴヌクレオチド配列：５’ＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴ３’は、３’末端でＦ２プライマーに隣接するＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子（５’－３’鎖）と同一の配列である。
２．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡＢ３オリゴヌクレオチド配列：５’ＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣ３’は、オリゴヌクレオチド１１の３’末端から１６７ヌクレオチド離れたＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子（５’－３’鎖）の相補的断片である。
３．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡＦ２オリゴヌクレオチド配列：５’ＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＴＣ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から８ヌクレオチド離れたＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子（５’－３’鎖）と同一の配列である。
４．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡＢ２オリゴヌクレオチド配列：５’ＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＴＡ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１４２ヌクレオチド離れたＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子（５’－３’鎖）の相補的断片である。
５．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡＦ１ｃオリゴヌクレオチド配列：５’ＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＣＴＡＡＴＡ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から６４ヌクレオチド離れたＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子（５’－３’鎖）の相補的断片である。
６．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡＢ１ｃオリゴヌクレオチド配列：５’ＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＧＣ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から９２ヌクレオチド離れたＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子（５’－３’鎖）と同一の配列である。
７．ＭＲＳＡ ｍｅｃＡループＦオリゴヌクレオチド配列：５’ＣＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣ３’。
Ｆ１ｃオリゴヌクレオチドとＦ２オリゴヌクレオチドの配列は、好ましくはＴＴＴＴ架橋によって連結されており、ＦＩＰとして使用される。Ｂ１ｃオリゴヌクレオチドとＢ２オリゴヌクレオチドの配列は、好ましくはＴＴＴＴ架橋によって連結されており、ＢＩＰとして使用される。
実施例２
実施例１で特徴付けたオリゴヌクレオチドを、ＬＡＭＰ技術と以下の組成の反応混合物：
５．０μｌ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ ２Ｘマスターミックス
０．１３μＭ Ｆ３
０．１３μＭ Ｂ３
１．０６μＭ ＦＩＰ
１．０６μＭ ＢＩＰ
０．２６μＭ ループＦ
Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％
マンニトール－１．２５％
二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘまたは０．５μｌの量の蛍光色素５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）または≦１μｌの量の緑色蛍光色素（Ｌｕｃｉｇｅｎ）またはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭまたはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭまたは増幅反応を阻害しない濃度の、二本鎖ＤＮＡと相互作用する別の蛍光色素
ＤＮＡ鋳型≧１０コピー／反応
とともに使用してｍｅｃＡ ＭＲＳＡ遺伝子を増幅する方法。総反応容量は、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼフリー水で１０μｌに調整。
実施例３
実施例１および実施例２で特徴付けたオリゴヌクレオチドを、ＬＡＭＰ技術と実施例３で特徴付けた反応混合物の組成とともに、以下の温度プロファイル：
１）６２℃、４０分
２）好ましくは、終点反応については、８０℃、５分
で使用してＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子を増幅する方法。
実施例４
実施例１および実施例２で特徴付けたオリゴヌクレオチドを、ＬＡＭＰ技術と実施例２で特徴付けた反応混合物の組成とともに、実施例３で特徴付けた温度プロファイルおよび下記の検出方法で使用する、ＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子の増幅および検出方法。
二本鎖ＤＮＡと相互作用し得る蛍光色素を使用し、反応開始前、リアルタイム測定前および／または終点測定前に反応混合物に０．５μｌ ＥｖａＧｒｅｅｎ ２０Ｘ；それぞれ０．５μｌまたは≦１Ｘ濃度；≦１６μＭの緑色蛍光色素（Ｌｕｃｉｇｅｎ）；ＳＹＴＯ－１３およびＳＹＴＯ－８２を加える。ＥｖａＧｒｅｅｎ；蛍光色素５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、緑色蛍光色素（Ｌｕｃｉｇｅｎ）；ＳＹＴＯ－１３色素についてはＦＡＭ色素と同様の範囲の励起波長－４９０～５００ｎｍ（最適には４９４ｎｍ）、またＳＹＴＯ－８２色素については５３５ｎｍ（最適には５４１ｎｍ）；ＥｖａＧｒｅｅｎ；緑色蛍光色素（Ｌｕｃｉｇｅｎ）；ＳＹＴＯ－１３色素については５０９～５３０ｎｍの範囲（最適には５１８ｎｍ）の発光波長、またＳＹＴＯ－８２色素については５５６ｎｍ（最適には５６０ｎｍ）、検出方法、変化記録時間はＭＲＳＡおよび陰性対照の反応の開始から１１分から開始。
実施例５
実施例１および実施例２で特徴付けたオリゴヌクレオチドを、ＬＡＭＰ技術と実施例２で特徴付けた反応混合物の組成とともに、実施例３で特徴付けた温度プロファイルおよび実施例４で特徴付けた検出方法で使用してＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子の増幅および検出を検出するための試薬の調製および凍結乾燥の方法。
実施例６．凍結乾燥工程の説明
鋳型ＤＮＡを除き、反応成分を実施例２記載の組成に従って混合して総量１０μｌとした。この混合物を０．２ｍｌの試験管に移し、以下のパラメーターに従って凍結乾燥工程を行った。
試験管に入れた混合物を２時間－８０℃に予冷した。その後、凍結乾燥工程を５－２ｍＢａｒの気圧下、－８０℃の温度で３時間行った。
実施例７．本方法の感度
感度は、黄色ブドウ球菌定量ＤＮＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）７００６９９ＤＱ（商標））標準の連続希釈液を反応混合物当たり細菌最小量１０コピーとしてアッセイすることにより決定し、産物の増幅はリアルタイムで測定した－図２（連続希釈液のリアルタイムＬＡＭＰ）。
個々のサンプルの発光蛍光を検出するのに要した時間を表１に示す。
特徴付けられたプライマーは、ｍｅｃＡ遺伝子断片を最小数１０コピー／反応混合物で検出することによりＭＲＳＡ菌の検出を可能とする。
本明細書に記載の増幅法とオリゴヌクレオチドがリアルタイムＬＡＭＰ技術に基づく検査よりも優れているのは、図１に示されるはるかに高い感度と、図２に示される分析時間の短縮によるものである。
配列表




Claims (9)

  1. メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）ｍｅｃＡ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーのセットであって、以下のヌクレオチド配列ａ）およびｂ）を有する内部プライマーのセット、ならびに以下のヌクレオチド配列ｃ）およびｄ）を含んでなる外部プライマーのセット：
    ａ）３’末端から、好ましくはＴＴＴＴ架橋によって、配列５’ＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＴＣ３’（配列番号４の核酸配列またはその逆転および相補配列）に連結された、５’ＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＴＧＣＴＡＡＴＡ３’（配列番号３の核酸配列またはその逆転および相補配列）；
    ｂ）３’末端から、好ましくはＴＴＴＴ架橋によって、配列５’ＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＣＧＧＴＴＡ３’（配列番号６の核酸配列またはその逆転および相補配列）に連結された、５’ＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＧＣ３’（配列番号５の核酸配列またはその逆転および相補配列）；
    ｃ）配列番号１の核酸配列５’ＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＧＡＧＴ３’またはその逆転および相補配列、ならびに
    ｄ）配列番号２の核酸配列５’ＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣ３’またはその逆転および相補配列
    を含んでなることを特徴とする、プライマーのセット。
  2. ＭＲＳＡ ｍｅｃＡ遺伝子と相補的な、配列番号７－５’ＣＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣ３’またはその逆転および相補配列のループＦプライマーを含んでなる、請求項１に記載のプライマーのセット。
  3. ＭＲＳＡ菌を検出する方法であって、細菌ゲノムの核酸配列の選択領域が請求項１または２に定義されるプライマーのセットを用いて増幅され、増幅方法がＬＡＭＰ法である、方法。
  4. 増幅が６２℃、４０分の温度プロファイルで行われる、請求項３に記載の細菌を検出する方法。
  5. 終点反応が８０℃、５分の温度プロファイルで行われる、請求項４に記載の方法。
  6. 請求項３に定義される検出方法を含んでなる、ＭＲＳＡ菌により引き起こされる感染を検出するための方法。
  7. 請求項１または２に定義されるプライマーのセットを含んでなる、ＭＲＳＡ菌により引き起こされる感染を検出するためのキット。
  8. ５．０μｌのＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰマスターミックス（ＮＥＢ）を含んでなる、請求項７に記載の感染を検出するためのキット。
  9. 請求項１または２に定義される増幅プライマーを含んでなり、前記プライマーが以下の濃度：０．１３μＭ Ｆ３、０．１３μＭ Ｂ３、１．０６μＭ ＦＩＰ、１．０６μＭ ＢＩＰ、０．２６μＭ ループＦを有するものであり；Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％を含んでなり；マンニトール－１．２５％を含んでなり；二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）≦１Ｘ、または≦０．５μｌの量の蛍光色素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、または≦１μｌの量の緑色蛍光色素（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、またはＳｙｔｏ－１３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）≦１６μＭ、またはＳＹＴＯ－８２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）≦１６μＭ、または前記増幅反応を阻害しない濃度の、二本鎖ＤＮＡと相互作用する別の蛍光色素を含んでなる、請求項７または８に記載の感染を検出するためのキット。
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