JP2023545093A - プライマーセット、試薬の組成物、及び非定型細菌を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の第一の主題は、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）細菌ｄｎａＫ遺伝子のヌクレオチド配列の増幅のためのプライマーセットである。本発明の第二の主題は、クラミジア・トラコマティス細菌を検出するための方法である。本発明の他の主題は、クラミジア・トラコマティス細菌によって起こされる感染を検出する方法である。本発明の第四の主題は、クラミジア・トラコマティス細菌によって起こされる感染の検出のためのキットである。
Description
本発明は、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ＣｈＴ）細菌の検出のためのプライマーセット、該プライマーセットを用いたクラミジア・トラコマティスを検出するための方法、及びクラミジア・トラコマティス細菌を検出するための該プライマーセットの使用に関する。本発明は、医学的診断に適用可能である。
クラミジア・トラコマティスは、細胞壁を欠くという特徴を持つ非定型細菌である。クラミジア・トラコマティスは、泌尿生殖器において非定型の細胞内感染を起こし、基本的な複製ユニットが網状体（ＲＢ）であり、その後、他の宿主細胞への感染又は他の個体への感染を可能にする基本小体（ＥＢ）へと変化する。
クラミジア・トラコマティスは、性感染症（ＳＴＤ）の中で最も頻繁に診断される感染体の一つである。クラミジア・トラコマティスは、１９～４９歳の性活動人口における性感染症の原因の６０％である（特に、血清型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）（CDC. Summary of notifiable diseases and conditions -- united states, 2015. MMWR 64, 1-143 (2017)）。クラミジア・トラコマティス（特に、血清型Ａ、Ｂ、Ｂａ、Ｃ、Ｄ、Ｄａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｉａ、Ｊ、Ｊａ）は、泌尿器系感染症を起こすことにとどまらず、トラコーマ、慢性結膜炎の病因でもあり、主に経済水準の低い国で毎年平均４千万人が罹患している（Bhosai, S. J., Bailey, R. L., Gaynor, B. D. & Lietman, T. M. Trachoma: an updateon prevention, diagnosis, and treatment.Curr. Opin. Ophthalmol.23, 288-295(2012)）。
細胞壁を欠くことに起因して、これらの細菌は、治療の第一線で最も頻繁に使用される抗生物質のグループであるβ-ラクタム系抗生物質に耐性があり、そのことが、クラミジア・トラコマティス感染症の治療における主な困難性の一つである。他の困難性は、クラミジア・トラコマティス感染症の診断プロセスである。非定型細菌は、特定の増殖条件（細胞株の培地や特殊な培地）を必要とし、このことが、古典的な微生物学的手法を用いて生物学的材料中の上記細菌を検出することを困難にする。その結果、未治療の感染症や治療の遅れにより、多くの合併症を引き起こし得る。女性における最も一般的な合併症は、骨盤内の炎症、子宮外妊娠又は卵管機能不全によって起こる不妊症であり、男性におけるクラミジア・トラコマティス感染症の未治療は、精巣上体及び直腸の炎症につながる（Rekart ML, Gilbert M, Meza R, Kim PH, Chang M, Money DM, et al. Chlamydia public health programs and the epidemiology of pelvic inflammatory disease and ectopic pregnancy. J Infect Dis 2013;207:30-8）。
クラミジア・トラコマティス細菌の検査診断は、細菌増殖が細胞内という性質、宿主のＡＴＰ依存性に起因して、複雑であり、従来の微生物学的手法が有効でない。細菌の細胞培養は、特異性が高いものの、手間やコストがかかり、高価な装置を必要とし、結果が得られるのは約３日後である。細菌抗原や宿主が産生する抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡクラス）の検出に基づく免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着法等）は、感度や特異性が低いという特徴があり、また、患者の現在の状態を指さず、過去の疾患を示すこともある。
特異性と感度が最も高いことに特徴付けられる方法は、生物学的材料中のクラミジア・トラコマティス核酸の検出を伴う方法（ＮＡＡＴ法－核酸増幅検査とも称される）であり、即ち、男性の場合は、尿又は尿道におけるスワブであり、女性の場合は、膣又は尿道におけるスワブである。ＮＡＡＴ技術で最も一般的に使用される検査は、リアルタイムＰＣＲ法に基づくアッセイである。リアルタイムＰＣＲ技術を用いた多くの様々な検査が市場で入手可能であるが、競争が激しいにもかかわらず、これらの方法は未だに比較的高価である。しかも、高度に専門化された人材や高価な装置を必要とし、患者の試料から遺伝物質を分離する必要がある。更に、試薬の周期的な加熱及び冷却が必要であるため、この方法は比較的時間がかかり、使用される装置は、このプロセスを実行するために比較的多くのエネルギーを使用する。
等温法（ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法を含む）は、診断プロセスの迅速化、分析を実行するために必要なエネルギーコストの削減を可能にし、検出される病原体のＤＮＡ／ＲＮＡを分離することを必要とせずに判定を行うことを可能にする方法である。更に、文献データによると、これらの方法は、前述のリアルタイムＰＣＲ技術よりも高い感度と特異性を特徴とし、また、より高速である。等温過程は、特別な装置を必要としない。
ハードウェアの要件が低いことに起因して、等温法は、プライマリケアユニット（ＰＯＣＴ：ポイントオブケア検査（point-of-care testing））に対して理想的な診断ソリューションであり、一般開業医や専門医（婦人科、泌尿器科）の診療所で、患者が医師と最初に接触する際に、検査が実施され得る。このソリューションにより、迅速な診断検査（１５分以内）を可能にし、目標とする治療法を初診時に選択することを可能にする。これは、クラミジア・トラコマティスのような非定型細菌について特に重要である。一方、凍結乾燥した試薬の使用は、診断物の凍結を要することなく、検査物を室温で保存することを可能にする。
クラミジア・トラコマティスを診断するためのＬＡＭＰ法におけるプライマーの使用は、これまでに公開された特許出願（特表２０１９－５０７６０６号公報、米国特許出願公開第２０１９０１１１４２３号明細書、中国特許出願公開第１１０１７７８８７号明細書、韓国登録特許第１０１９５８０４８号公報、中国特許出願公開第１０７０９９６１８号明細書、米国特許出願公開第２０１５０３２２４９３号明細書）から公知である。ＬＡＭＰ法は、例えば、国際公開第００／２８０８２号、国際公開第０２／２４９０２号に開示されている。言及された特許出願は、ほとんどの場合、クラミジア・トラコマティス細菌の感度及び検出限界について記載していない。また、上述した特許出願の幾つかの検出方法は、定量的な測定ができず、増幅反応の陽性結果時の反応混合物の色変化（ヒドロキシナフトールブルー、カルセイン）に基づくアガロースゲル又は他のマーカーを用いたエンドポイント型の検出方法である。また、幾つかの特許出願は、定量的な測定が可能なリアルタイム技術で実現されているが、該検出方法は、分析コストを高くする二重蛍光色素で標識されたか又はその材料を用いた特定のワークフローが必要なＲＩ（ラジオアイソトープ）で標識されたモレキュラービーコン（Molecular Beacon）プローブを用いた方法である。更に、上記で開発され、説明されたほとんどのキットは、ＰＯＣＴ診断には適用できず、主な用途は研究室での使用である。
したがって、短時間（≦１５分）で非常に低い検出限界（≧５コピー／反応）で細菌を検出することを可能にし、ポイントオブケア検査での使用を意図とした、ＬＡＭＰ法でのクラミジア・トラコマティスの診断用の適切に改良されたプライマーセットを使用した診断方法を提供する必要性が依然として存在する。予期せぬことに、上記課題は、本発明により解決された。
本発明の第一の主題は、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子のヌクレオチド配列の増幅のためのプライマーセットであって、
クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子の選択されたフラグメントに対して特異的な、以下のａ）およびｂ）のヌクレオチド配列を有する内部プライマーのセットならびに以下のｃ）およびｄ）のヌクレオチド配列を含んでなる外部プライマーのセット：
ａ）５’ ＧＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＴ ３’－（配列番号：３）の核酸配列またはその逆相補的な配列であって、３’末端からＴＴＴＴブリッジにより配列 ５’ ＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＴ ３’－（配列番号：４）の核酸配列もしくはその逆相補的な配列に連結されているかまたは連結されていない、核酸配列またはその逆相補的な配列；
ｂ）５’ ＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴ ３’－（配列番号：５）の核酸配列またはその逆相補的な配列であって、３’末端からＴＴＴＴブリッジにより配列 ５’ ＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴ ３’ －（配列番号：６）の核酸配列もしくはその逆相補的な配列に連結されているかまたは連結されていない、核酸配列またはその逆相補的な配列；
ｃ）５’ ＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＧ ３’（配列番号：１）の核酸配列またはその逆相補的な配列、および
ｄ）５’ ＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡ ３’（配列番号：２）の核酸配列またはその逆相補的な配列、
を含んでなることを特徴とする、プライマーセットである。
クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子の選択されたフラグメントに対して特異的な、以下のａ）およびｂ）のヌクレオチド配列を有する内部プライマーのセットならびに以下のｃ）およびｄ）のヌクレオチド配列を含んでなる外部プライマーのセット：
ａ）５’ ＧＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＴ ３’－（配列番号：３）の核酸配列またはその逆相補的な配列であって、３’末端からＴＴＴＴブリッジにより配列 ５’ ＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＴ ３’－（配列番号：４）の核酸配列もしくはその逆相補的な配列に連結されているかまたは連結されていない、核酸配列またはその逆相補的な配列；
ｂ）５’ ＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴ ３’－（配列番号：５）の核酸配列またはその逆相補的な配列であって、３’末端からＴＴＴＴブリッジにより配列 ５’ ＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴ ３’ －（配列番号：６）の核酸配列もしくはその逆相補的な配列に連結されているかまたは連結されていない、核酸配列またはその逆相補的な配列；
ｃ）５’ ＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＧ ３’（配列番号：１）の核酸配列またはその逆相補的な配列、および
ｄ）５’ ＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡ ３’（配列番号：２）の核酸配列またはその逆相補的な配列、
を含んでなることを特徴とする、プライマーセットである。
本発明の好ましい実施態様では、上記プライマーセットは、ループプライマー配列のセットであって、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子の配列番号７（５’ ＧＧＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧ ３’）および配列番号８（５’ ＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴ ３’）に包含されているかもしくは相補的な核酸配列またはこれらに逆相補的な配列を含む、ループプライマー配列のセットを含んでなる。
本発明の第二の主題は、クラミジア・トラコマティス細菌を検出するための方法であって、クラミジア・トラコマティスゲノム（ｄｎａＫ遺伝子断片）の核酸配列の選択された領域が本発明の第一の主題に定義されるとおりのプライマーセットを用いて増幅され、増幅方法がＬＡＭＰ法である、ことを特徴とする、方法である。
本発明の好ましい実施態様では、上記増幅が、－６４℃、４０分間の温度プロファイルで実施される。
本発明の更に好ましい実施態様では、エンドポイント反応が、８０℃、５分間の温度プロファイルで実施される。
本発明の第三の主題は、本発明の第二の主題に定義されるとおりの検出方法を含んでなることを特徴とする、クラミジア・トラコマティス細菌によって起こされる感染を検出するための方法である。
本発明の第四の主題は、本発明の第一の主題に定義されるとおりのプライマーセットを含んでなることを特徴とする、クラミジア・トラコマティスよって起こされる感染の検出のためのキットである。
本発明の好ましい実施態様では、上記感染検出のキットが、ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ） ５．０μｌを含んでなる。
本発明の更に好ましい実施態様では、本発明の第一の主題に定義されるとおりの個々の増幅プライマーにおいて、０．１３μＭ Ｆ３、０．１３μＭ Ｂ３、１．０６μＭ ＦＴＰ、１．０６μＭ ＢＩＰ、０．２７μＭ ＬｏｏｐＦ、０．２７μＭ ＬｏｏｐＢの濃度のプライマーであり；Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％；二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘ、もしくは≦０．５μｌの量の蛍光色素、もしくは≦１μｌの量のＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｅｎｔ Ｄｙｅ、もしくはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭ、もしくはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭ、または増幅反応を阻害しない濃度での二本鎖ＤＮＡと相互作用するその他の蛍光色素。
クラミジア・トラコマティスの検出のための本発明のプライマーセット、並びにクラミジア・トラコマティス感染を検出するための方法及び増幅産物を検出する方法の利点は、ポータブル遺伝子分析器を用いた標的適用におけるポイントオブケア（ＰＯＣＴ）での医学的診断において、これらを使用する可能性にある。本発明の反応混合物の凍結乾燥物により、診断キットを、検査の診断パラメータを低下させることなく室温で保存させることを可能にする。また、増幅産物を検出するための蛍光色素の使用は、上記方法の感度を向上させ、検出限界を下げる（５コピー／反応まで下げる）ことを可能にし、更に検査試料中の細菌の定量的測定を可能にする。
本発明の例示的な実施例が図に示される。図１及び図２は、上記方法の感度特性を示す（鋳型：クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型Ｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０１ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡを用いて、１００～５コピー／μｌの範囲にわたって、特異的なシグナルが得られたが、ＮＴＣにおいて生成物がなかった）；図１：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２：ＮＴＣ；レーン３：ＣｈＴ １０コピー；レーン４：ＣｈＴ ２０コピー；レーン５：ＣｈＴ ５０コピー；レーン６：ＣｈＴ １００コピー；図２：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２：ＮＴＣ；レーン３：ＣｈＴ ５コピー；レーン４：ＣｈＴ １０コピー；レーン５：ＣｈＴ ２０コピー；レーン６：ＣｈＴ ５０コピー。図３は、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型Ｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０１ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ標準品の連続希釈物を、該ＤＮＡ標準品の１００～１０コピー／μｌの範囲にわたってアッセイすることにより測定された、本発明の方法の感度を示す（生成物の増幅は、リアルタイムにより測定された）。リアルタイムでのクラミジア・トラコマティスの検出結果が表１に示され、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を提供する。図４は、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型Ｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０１ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ標準品の連続希釈物を、該ＤＮＡ標準品の５０～５コピー／μｌの範囲にわたってアッセイすることにより測定された、本発明の方法の感度を示す（生成物の増幅は、リアルタイムにより測定された）。リアルタイムでのクラミジア・トラコマティスの検出結果が表２に示され、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を提供する。図５及び図６は、上記方法の感度特性を示す（鋳型：クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０２ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡを用いて、１００～５コピー／μｌの範囲にわたって、特異的なシグナルが得られたが、ＮＴＣにおいて生成物がなかった）；図５：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２：ＮＴＣ；レーン３：ＣｈＴ １０コピー；レーン４：ＣｈＴ ２０コピー；レーン５：ＣｈＴ ５０コピー；レーン６：ＣｈＴ １００コピー；図６：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２：ＮＴＣ；レーン３：ＣｈＴ ５コピー；レーン４：ＣｈＴ ２５コピー。図７は、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０２ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ標準品の連続希釈物を、該ＤＮＡ標準品の１００～１０コピー／μｌの範囲にわたってアッセイすることにより測定された、本発明の方法の感度を示す（生成物の増幅は、リアルタイムにより測定された）。リアルタイムでのクラミジア・トラコマティスの検出結果が表３に示され、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を提供する。図８は、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０２ＢＤ（商標））からのＤＮＡ標準品の連続希釈物を、該ＤＮＡ標準品の２５～５コピー／μｌの範囲にわたってアッセイすることにより測定された、本発明の方法の感度を示す（生成物の増幅は、リアルタイムにより測定された）。リアルタイムでのクラミジア・トラコマティスの検出結果が表４に示され、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を提供する。図９及び図１０は、上記方法の感度特性を示す（鋳型：クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０３Ｄ（商標））からのゲノムＤＮＡを用いて、１００～５コピー／μｌの範囲にわたって、特異的なシグナルが得られたが、ＮＴＣにおいて生成物がなかった）；図１：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２：ＮＴＣ；レーン３：ＣｈＴ １０コピー；レーン４：ＣｈＴ ２０コピー；レーン５：ＣｈＴ ５０コピー；レーン６：ＣｈＴ １００コピー、図１０：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２：ＮＴＣ；レーン３：ＣｈＴ ５コピー；レーン４：ＣｈＴ １０コピー；レーン５：ＣｈＴ ２０コピー；レーン６：ＣｈＴ ５０コピー。図１１は、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０３Ｄ（商標））からのゲノムＤＮＡ標準品の連続希釈物を、該ＤＮＡ標準品の１００～１０コピー／μｌの範囲にわたってアッセイすることにより測定された、本発明の方法の感度を示す（生成物の増幅は、リアルタイムにより測定された）。リアルタイムでのクラミジア・トラコマティスの検出結果が表５に示され、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を提供する。図１２は、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０３Ｄ（商標））からのゲノムＤＮＡの連続希釈物を、該ＤＮＡ標準品の５０～５コピー／μｌの範囲にわたってアッセイすることにより測定された、本発明の方法の感度を示す（生成物の増幅は、リアルタイムにより測定された）。リアルタイムでのクラミジア・トラコマティスの検出結果が表６に示され、蛍光シグナルを検出するために必要な最小時間を提供する。図１３及び図１４は、天然の生理的細菌叢として被検生物学的材料に潜在的に存在する多数の病原体（共感染（co-infection）の結果として生じ得る病原体、又は類似のゲノム配列を共有する病原体）の標準マトリックスを用いた本発明の方法の特異性を示す。図１３：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２及び３：マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）；レーン４及び５：クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；レーン６及び７：百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；レーン８及び９：淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；レーン１０及び１１：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）；レーン１２及び１３：ラクトバシラス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）；レーン１４及び１５：エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）；レーン１６及び１７：エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）；レーン１８及び１９：表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）；レーン２０及び２１：緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；レーン２２及び２３：ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）；レーン２４及び２５：メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）；レーン２６及び２７：マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）；レーン２８及び２９：ヘモフィルス・ドゥクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）；レーン３０：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン３１及び３２：ＣＭＶ；レーン３３及び３４：ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）；レーン３５及び３６：ヒトＤＮＡ；レーン３７及び３８：クラミジア・トラコマティス 血清型Ｄ；レーン３９及び４０：クラミジア・トラコマティス 血清型Ｇ；レーン４１及び４２：クラミジア・トラコマティス 血清型Ｊ；レーン４３及び４４：クラミジア・トラコマティス 血清型Ｈ；レーン４５、４６、４７、４８：ＮＴＣ、並びに、図１４：レーン１：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２及び３：リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；レーン４及び５：バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）；レーン６及び７：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；レーン８及び９：モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）；レーン１０及び１１：トリコモナ・バジナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）；レーン１２及び１３：ガードネレラ・バジナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）；レーン１４及び１５：ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ｕｒｅｏｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）；レーン１６及び１７：カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；レーン１８及び１９：ＨＢＶ；レーン２０及び２１：ＨＨＶ－１；レーン２２及び２３：ＨＰＶ １６；レーン２４及び２５：ＨＰＶ １８；レーン２６：質量マーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ １００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）；レーン２７及び２８：ＨＳＶ ２；レーン２９及び３０：トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）；レーン３１及び３２：カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）；レーン３３及び３４：クラミドフィラ・ニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；レーン３５及び３６：クラミジア・トラコマティス 血清型Ｅ；レーン３７及び３８：クラミジア・トラコマティス 血清型Ｉ；レーン３９及び４０：クラミジア・トラコマティス 血清型ＩＩ；レーン４１及び４２：クラミジア・トラコマティス 血清型ＩＩＩ；レーン４３、４４、４５、４６：ＮＴＣ。
実施例１．プライマー配列
ＬＡＭＰ技術を用いたクラミジア・トラコマティス遺伝子材料の検出に使用される特異的なオリゴヌクレオチドの配列を、以下に示し、特徴付けする。
ＬＡＭＰ技術を用いたクラミジア・トラコマティス遺伝子材料の検出に使用される特異的なオリゴヌクレオチドの配列を、以下に示し、特徴付けする。
１．ＣｈＴ ｄｎａＫＦ３ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＧ ３’は、Ｆ２プライマーの３’に隣接するクラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子（５’－３’鎖）と同じである。
２．ＣｈＴ ｄｎａＫＢ３ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡ ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１６４ヌクレオチド離れたクラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子（５’－３’鎖）の相補的な断片である。
３．ＣｈＴ ｄｎａＫＦ２ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＴ ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端に直ちに隣接するクラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子（５’－３’鎖）の配列と同一である。
４．ＣｈＴ ｄｎａＫＢ２ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴ ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から１４５ヌクレオチド離れたクラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子（５’－３’鎖）の相補的な断片である。
５．ＣｈＴ ｄｎａＫＦ１ｃ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＧＣＧＡＧＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＴ ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から５０ヌクレオチド離れたクラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子（５’－３’鎖）の相補的な断片である。
６．ＣｈＴ ｄｎａＫＢ１ｃ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴ ３’は、オリゴヌクレオチド１の３’末端から８２ヌクレオチド離れたクラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子（５’－３’鎖）と同じである。
７．ＣｈＴ ｄｎａＫＬｏｏｐＦオリゴヌクレオチド配列：５’ ＧＧＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧ ３’。
８．ＣｈＴ ｄｎａＫＬｏｏｐＢ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴ ３’。
８．ＣｈＴ ｄｎａＫＬｏｏｐＢ オリゴヌクレオチド配列：５’ ＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴ ３’。
好ましくは、Ｆ１ｃ及びＦ２オリゴヌクレオチドの配列をＴＴＴＴブリッジによって連結し、ＦＩＰとして使用した。好ましくは、Ｂ１ｃ及びＢ２オリゴヌクレオチドの配列をＴＴＴＴブリッジによって連結し、ＢＩＰとして使用した。
実施例３
実施例１で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び以下の組成の反応混合物を用いて、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子を増幅する方法：
５．０μｌ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
０．１３μＭ Ｆ３
０．１３μＭ Ｂ３
１．０６μＭ ＦＩＰ
１．０６μＭ ＢＩＰ
０．２７μＭ ＬｏｏｐＦ
０．２７μＭ ＬｏｏｐＢ
Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％
二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘ、もしくは０．５μｌの量の蛍光色素 ５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、もしくは≦１μｌの量のＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）、もしくはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭ、もしくはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭ、または増幅反応を阻害しない濃度での二本鎖ＤＮＡと相互作用するその他の蛍光色素。
鋳型ＤＮＡ≧５コピー／反応
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの水を用いて、反応物量の合計を１０μｌに調整した。
実施例１で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び以下の組成の反応混合物を用いて、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子を増幅する方法：
５．０μｌ ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
０．１３μＭ Ｆ３
０．１３μＭ Ｂ３
１．０６μＭ ＦＩＰ
１．０６μＭ ＢＩＰ
０．２７μＭ ＬｏｏｐＦ
０．２７μＭ ＬｏｏｐＢ
Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％
二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘ、もしくは０．５μｌの量の蛍光色素 ５０Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、もしくは≦１μｌの量のＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）、もしくはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭ、もしくはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭ、または増幅反応を阻害しない濃度での二本鎖ＤＮＡと相互作用するその他の蛍光色素。
鋳型ＤＮＡ≧５コピー／反応
ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの水を用いて、反応物量の合計を１０μｌに調整した。
実施例４
実施例１及び実施例３で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び実施例３で特徴付けられた組成の反応混合物を用い、以下の温度プロファイルで実施する、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子を増幅する方法：
１）６４℃、４０分間
２）エンドポイント反応に対して、好ましくは、８０℃、５分間。
実施例１及び実施例３で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び実施例３で特徴付けられた組成の反応混合物を用い、以下の温度プロファイルで実施する、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子を増幅する方法：
１）６４℃、４０分間
２）エンドポイント反応に対して、好ましくは、８０℃、５分間。
実施例５
実施例１及び実施例３で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び実施例３で特徴付けられた組成の反応混合物を用い、実施例４で特徴付けられた温度プロファイル及び後述する検出方法を用いる、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子を増幅し、検出する方法。
実施例１及び実施例３で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び実施例３で特徴付けられた組成の反応混合物を用い、実施例４で特徴付けられた温度プロファイル及び後述する検出方法を用いる、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子を増幅し、検出する方法。
蛍光色素は、二本鎖ＤＮＡと相互作用することが可能なものを使用し、０．５μＬのＥｖａＧｒｅｅｎ ２０Ｘ；ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）；ＳＹＴＯ－１３及びＳＹＴＯ－８２についてそれぞれ、０．５μLもしくは≦１Ｘの濃度；≦１６μＭの量を、反応開始前、リアルタイム測定及び／又はエンドポイント測定前に、反応混合物に添加する。励起波長は、ＦＡＭ色素と同様の範囲－ＥｖａＧｒｅｅｎ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ５０Ｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）；ＳＹＴＯ－１３色素については４９０～５００ｎｍ（最適には、４９４ｎｍ）であり、ＳＹＴＯ－８２色素については５３５ｎｍ（最適には５４１ｎｍ）であり；蛍光波長は、ＥｖａＧｒｅｅｎ；ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）；ＳＹＴＯ－１３色素については５０９～５３０ｎｍ（最適には５１８ｎｍ）であり、ＳＹＴＯ－８２色素については５５６ｎｍ（最適には５６０ｎｍ）であり、検出方法、登録時間の変更は、クラミジア・トラコマティス及び陰性対照の反応開始から１１分から開始する。
実施例６
実施例１及び実施例３で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び実施例３で特徴付けられた組成の反応混合物を用い、実施例４で特徴付けられた温度プロファイル及び実施例５に記載の検出方法を用いた、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子の増幅及び検出を検出するための試薬を調製する方法及び凍結乾燥する方法
実施例１及び実施例３で特徴付けられたオリゴヌクレオチドを使用し、ＬＡＭＰ技術及び実施例３で特徴付けられた組成の反応混合物を用い、実施例４で特徴付けられた温度プロファイル及び実施例５に記載の検出方法を用いた、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子の増幅及び検出を検出するための試薬を調製する方法及び凍結乾燥する方法
実施例７．凍結乾燥プロセスの記載
鋳型ＤＮＡを除き、実施例３に記載の組成に従って反応成分を混合し、合計量を１０μｌとした。この混合物を０．２ｍｌのチューブに移し、以下のパラメータに従って凍結乾燥プロセスに供した。
試験管に入れた混合物を２時間、－８０℃まで予冷した。その後、５－２ｍＢａｒの圧力下、－８０℃の温度で３時間、凍結乾燥プロセスを実施した。
鋳型ＤＮＡを除き、実施例３に記載の組成に従って反応成分を混合し、合計量を１０μｌとした。この混合物を０．２ｍｌのチューブに移し、以下のパラメータに従って凍結乾燥プロセスに供した。
試験管に入れた混合物を２時間、－８０℃まで予冷した。その後、５－２ｍＢａｒの圧力下、－８０℃の温度で３時間、凍結乾燥プロセスを実施した。
実施例８．方法の感度
感度は、標準品：クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型Ｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０１ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマティス ＬＧＶ 血清型ＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０２ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０３Ｄ（商標））からのゲノムＤＮＡの連続希釈物をアッセイすることにより決定した（反応混合物あたり５コピーの細菌の最小量、生成物の増幅をリアルタイムで測定）－図３、４、７、８、１１、１２（連続希釈についてのリアルタイム－ＬＡＭＰ）。
感度は、標準品：クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型Ｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０１ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマティス ＬＧＶ 血清型ＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０２ＢＤ（商標））からのゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマティスＬＧＶ 血清型ＩＩＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－９０３Ｄ（商標））からのゲノムＤＮＡの連続希釈物をアッセイすることにより決定した（反応混合物あたり５コピーの細菌の最小量、生成物の増幅をリアルタイムで測定）－図３、４、７、８、１１、１２（連続希釈についてのリアルタイム－ＬＡＭＰ）。
個々の試料の発光蛍光を検出するために要した時間を、表１、２、３、４、５、６に示す。
特徴付けられたプライマーは、５コピー／反応混合物の最小量でのｄｎａＫ遺伝子断片を検出することにより、クラミジア・トラコマティス細菌を検出することが可能である。
リアルタイム－ＬＡＭＰ技術に基づく検査に対する、本明細書に記載された増幅方法及びオリゴヌクレオチドの優位性は、より高い感度（図１、２、５、６、９、１０に示される）、分析時間の短縮（図３、４、７、８、１１、１２及び表１、２、３、４、５、６に示される）に起因する。
Claims (9)
- クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｄｎａＫ遺伝子のヌクレオチド配列の増幅のためのプライマーセットであって、
以下のａ）およびｂ）のヌクレオチド配列を有する内部プライマーのセットならびに以下のｃ）およびｄ）のヌクレオチド配列を含んでなる外部プライマーのセット：
ａ）５’ ＧＣＧＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＧＴ ３’－（配列番号：３）の核酸配列またはその逆相補的な配列であって、３’末端からＴＴＴＴブリッジにより配列 ５’ ＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＴ ３’－（配列番号：４）の核酸配列もしくはその逆相補的な配列に連結されているかまたは連結されていない、核酸配列またはその逆相補的な配列、
ｂ）５’ ＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴ ３’－（配列番号：５）の核酸配列またはその逆相補的な配列であって、３’末端からＴＴＴＴブリッジにより配列 ５’ ＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＴ ３’ －（配列番号：６）の核酸配列もしくはその逆相補的な配列に連結されているかまたは連結されていない、核酸配列またはその逆相補的な配列、
ｃ）５’ ＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＧ ３’（配列番号：１）の核酸配列またはその逆相補的な配列、および
ｄ）５’ ＣＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡ ３’（配列番号：２）の核酸配列またはその逆相補的な配列、
を含んでなる、プライマーセット。 - ループプライマー配列のセットであって、クラミジア・トラコマティスｄｎａＫ遺伝子の配列番号７（５’ ＧＧＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧ ３’）および配列番号８（５’ ＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴ ３’）に包含されているかもしくは相補的なヌクレオチド配列またはこれらに逆相補的な配列を含む、ループプライマー配列のセットを含んでなる、請求項１に記載のプライマーセット。
- クラミジア・トラコマティス細菌を検出する方法であって、前記細菌ゲノムの核酸配列の選択された領域が請求項１または２に定義されるとおりのプライマーセットを用いて増幅され、増幅方法がＬＡＭＰ法である、方法。
- 前記増幅が、－６４℃、４０分間の温度プロファイルで実施される、請求項３に記載の細菌を検出する方法。
- エンドポイント反応が、８０℃、５分間の温度プロファイルで実施される、請求項４に記載の方法。
- 請求項３に記載の検出の方法を含んでなる、クラミジア・トラコマティス細菌感染を検出するための方法。
- 請求項１および請求項２に定義されるとおりのプライマーセットを含んでなる、クラミジア・トラコマティス感染の検出のためのキット。
- ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＬＡＭＰ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ） ５．０μｌを含んでなる、請求項７に記載の感染検出のキット。
- ０．１３μＭ Ｆ３、０．１３μＭ Ｂ３、１．０６μＭ ＦＴＰ、１．０６μＭ ＢＩＰ、０．２７μＭ ＬｏｏｐＦ、０．２７μＭ ＬｏｏｐＢの濃度の請求項１および２に定義されるとおりの増幅プライマー；Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物－６％；二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光マーカー－ＥｖａＧｒｅｅｎ≦１Ｘ、もしくは≦０．５μｌの量の蛍光色素、もしくは≦１μｌの量のＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｅｎｔ Ｄｙｅ、もしくはＳｙｔｏ－１３≦１６μＭ、もしくはＳＹＴＯ－８２≦１６μＭ、または増幅反応を阻害しない濃度での二本鎖ＤＮＡと相互作用するその他の蛍光色素、
を含んでなる、請求項７または８に記載の感染検出のキット。
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|---|---|---|---|
| PL435634A PL435634A1 (pl) | 2020-10-09 | 2020-10-09 | Zestaw starterów, skład reagentów oraz metoda wykrywania bakterii atypowych |
| PLP.435634 | 2020-10-09 | ||
| PCT/PL2021/050071 WO2022075871A1 (en) | 2020-10-09 | 2021-10-07 | Set of primers, composition of reagents and method of detecting atypical bacteria |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023545093A true JP2023545093A (ja) | 2023-10-26 |
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|---|---|---|---|
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