JP2024517872A - ＨＥＲ２を標的にするＦｃ抗原結合性フラグメント－薬物抱合体 - Google Patents

ＨＥＲ２を標的にするＦｃ抗原結合性フラグメント－薬物抱合体 Download PDF

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Abstract

本発明は、HER2を標的にするFc抗原結合性フラグメント-薬物抱合体(HER2 Fcab-薬物抱合体)、および、哺乳動物（特にヒト）における過剰増殖性の疾患および障害の処置および/または予防のための本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の使用、および、かかるHER2 Fcab-薬物抱合体を含有する医薬組成物に関する。さらに、本発明は、HER2 Fcab-標識抱合体、および、かかるHER2 Fcab-標識抱合体を含有する診断用組成物に関する。

Description

本発明は、HER2を標的にするFc抗原結合性フラグメント-薬物抱合体(HER2 Fcab-薬物抱合体)、および、哺乳動物（特にヒト）における過剰増殖性の疾患および障害の処置および/または予防のための本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の使用、および、かかるHER2 Fcab-薬物抱合体を含有する医薬組成物に関する。さらに、本発明は、HER2 Fcab-標識抱合体、および、かかるHER2 Fcab-標識抱合体を含有する診断用組成物に関する。
本発明の背景
ヒト上皮成長因子受容体2(HER2、HER2/neuまたはErbB-2ともまた称される)は、85kDaの細胞膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である。それは、17番染色体qの長腕に位置するc-erbB-2遺伝子によってコードされ、およびHERファミリーのメンバーである(Ross et al., 2003)。HERファミリーは、通常、細胞成長および生存、ならびに癒着、遊走、分化、および他の細胞応答を調節する(Hudis, C., 2007)。HER2の過剰発現および増幅は、乳がん(Yarden Y., 2001)、胃部のがん(Gravalos et al., 2008)、胃がん(Ruschoff et al., 2010)、大腸がん(Ochs et al., 2004)、卵巣がん(Lanitis et al., 2012)、膵臓がん(Lei et al., 1995)、子宮内膜がん(Berchuk et al., 1991)および非小細胞肺がん(Brabender et al., 2001)を包含する様々な固形がんの発症で観察される。乳がん、大腸がん、および胃部のがんは、2008年に診断されたすべてのがん症例の30%およびすべてのがん死亡の24%を占めている(CRUKおよびWHOの世界がん報告書)。
とりわけ乳がんは、女性のがん死亡の主因である。HER2は、乳がんの15～30％において過剰発現または増幅しており、予後不良、無病期間および全生存期間の短縮、ならびにより悪性のがん表現型と関連している(Vinatzer et al., 2005)。乳がんでは、患者の約20％が、HER2がん原遺伝子を含有する17番染色体上のアンプリコンの増幅が関与するゲノム変化を持つ腫瘍を発症する(Ross J. 2009；およびHicks et al., 2005)。かかる腫瘍は、疾患の死亡率に過剰に寄与する乳がんの最も悪性のサブタイプを表す(Hudis C., 2007)。数多のHER2標的療法が、HER2陽性腫瘍の処置のために承認されてきている。
ハーセプチン(商標)(トラスツズマブ)は、タキソール(商標)(パクリタキセル)との組み合わせで転移性乳がんの処置のために、および単独では、転移性疾患のための1以上の化学療法過程を受けてきた患者のHER2陽性乳がんの処置のために、承認されている。トラスツズマブはまた、手術可能なまたは局所的に進行したHER2陽性腫瘍におけるアジュバント化学療法(パクリタキセル、ドセタキセルおよびビノレルビン)の有効性も増強させることから、それは、早期または進行したステージのHER2過剰発現乳がんを持つ患者のための標準治療(standard of care)と考えられている。トラスツズマブはまた、化学療法(シスプラチンおよびカペシタビンまたは5-フルオロウラシルのいずれか)との組み合わせで、胃のHER2陽性転移性がんまたは胃食道接合部がんの、それらの転移性疾患のための先立つ処置を受けていない患者における処置のためにも承認されている。
Perjeta(商標)(ペルツズマブ)もまた、トラスツズマブおよびドセタキセルとの組み合わせで、HER2陽性転移性乳がんの処置のために承認されている。ペルツズマブは、トラスツズマブとは異なるHER2のドメインを標的にし、および異なる作用の機構を有する。具体的に言うと、ペルツズマブは、HER2が他のHER受容体(EGFR/HER1、HER3およびHER4)と対形成することを防ぐ、HER2二量体化インヒビターである。
Kadcyla(商標)(アドトラスツズマブエムタンシン、T-DM1)は、細胞死を結果としてもたらす分裂細胞内の微小管の集合を分断させる細胞傷害性薬剤メルタンシン(DM1)へ連結されたトラスツズマブを含む抗体-薬物抱合体であり、および、トラスツズマブおよびタキサン化学療法での先立つ処置を受けている患者における転移性乳がんの処置のために承認されている。
Tykerb(商標)(ラパチニブ)は、HER2およびEGFR両方の触媒作用をブロックする小分子キナーゼインヒビターである。それは、Femara(商標)(レトロゾール)との組み合わせで、閉経後の女性におけるHER2陽性、ホルモン受容体陽性の転移性乳がんの処置のために、および、Xeloda(商標)(カペシタビン)との組み合わせでは、アントラサイクリン、タキサン、およびハーセプチン(商標)を包含する先立つ治療を受けている患者における進行または転移性HER2陽性乳がんの処置のために、承認されている。さらなる薬物も、臨床開発中である。
承認されたHER2特異的治療が、HER2陽性の乳がんおよび胃部のがんの標準治療を改善してきたものの、これらの薬物に対する固有のまたは獲得耐性に起因して、多大な満たされない医療ニーズが存在する。HER2陽性乳がんに対するトラスツズマブの標準治療ステータスにもかかわらず、アジュバント療法セッティングの患者の20～50%、および単剤療法セッティングの患者のほぼ70%が、トラスツズマブに対する耐性を発達させるようになる(Wolff et al., 2007；およびHarris et al., 2007)。
がん治療においては、バイオマーカーとして、がんの根本的な遺伝子または分子の機構のアセスメントに基づいて処置すべき患者を選択するという最新動向がある。特定のがんに関係があることが見出されたバイオマーカーに基づく診断試験は、特定のがん治療での処置に感受性である患者を同定するためにFDAによって承認されている。2013年5月には、コンパニオン診断としてもまた知られている15のかかる診断試験がFDAによって承認されており、および様々なその他のものが開発中である。例えば、therascreen(商標)KRAS試験は、Erbitux(商標)(セツキシマブ)で処置される野生型KRAS遺伝子を伴うEGFR陽性の転移性大腸がんを有する患者を同定するEGFR免疫組織化学試験である。DAKO C-kit PharmDx 免疫組織化学試験は、Gleevec(イマニチブ)での処置に感受性であるc-kit陽性の消化管間質腫瘍を持つ患者を同定する。
一般的に一緒に使用される免疫組織化学試験Herceptest(商標)およびHer2 FISH PharmDx Kit(商標)など、数多の診断試験がまた、ハーセプチン(商標)(トラスツズマブ)で処置すべきHER2陽性腫瘍の同定のために承認されている(HamburgおよびCollins、2010)。HER2陽性腫瘍の免疫組織化学のためのさらなる市販のキットは、Oracle(Leica Biosystems)およびPathway(Ventana)を包含する。処置に対する臨床反応を予測するバイオマーカーを同定する前臨床および臨床調査の取り組みは、HER2表的療法の恩恵を受けそうである大腸がん、卵巣がんおよびその他のものを包含する「非既存の」HER2陽性がんを持つ追加の患者を特定できる潜在的可能性もまた有する(Gun et al., 2013)。
抗体-薬物抱合体(ADC)は、近年にわたって急速に進歩し、および、様々ながんを患う患者に治療的な利益を提供する腫瘍学の分野における恒久的なプレーヤーとして確立された。その結果として、5の新しいADCが、2019年～2020年8月の間にFDAによって承認されており、この治療薬クラスの臨床的成功を実証している。1-3 ADCは、モノクローナル抗体の大きな選択性を高度に細胞傷害性の薬物の細胞死滅能力と結び付け、および、これらの毒素を腫瘍細胞へガイドすることによって治療濃度域を拡大させる。今日まで、承認されているADC、および、臨床および前臨床ステージのADCの圧倒的多数は、モノクローナルIgGスキャフォールドを保有する。4 従来の完全サイズのADCの大きな成功の結果として、代替のより小さい抗体フラグメントをベースとした薬物抱合体が進化している。5,6 かかる抱合体は、Fabフラグメント7,8、単一鎖可変フラグメント(scFv)9,10、二重特異性抗体11、または、アブジュリン12、nano-13-15もしくはhumabodies16のような単一ドメイン抗体をベースとした構造体からなる。それらの小さなサイズは、血管から間質組織空間への血管外漏出および組織を通じた間質拡散の上昇に起因して、より良好な固形腫瘍浸透を可能にする。17,18
しかしながら、抗体フラグメントは、しばしば、より良好な有効性を示さず8,16、これは、Fcドメインおよびその半減期延長機能が不在であることと関連し得る。Fcドメインとその天然のリガンドである新生児Fc受容体(FcRn)との相互作用は、血流中の完全長IgG抗体の長期化された循環を媒介する(例としてマウスでの消失t1/2 トラスツズマブ対FcRn非結合トラスツズマブ、212h対6.9h17)。したがって、Fc部分を欠いたフラグメントは、しばしば速い全身クリアランス速度および限定された曝露によって阻まれる(例としてトラスツズマブFab、マウスでの消失t1/2 4.4h17)。これらの知見は、それらのin vivo半減期を改善するための、小さいバインダーフラグメントがPAS化19されたか、PEG11、アルブミン結合ドメイン11,13,14,16またはFc部分20へ縮合された、様々な新規な抱合体フォーマットに導いたが、しかしながら、流体力学半径を増大させるという対価のもとであり、これは腫瘍浸透を限定する。
したがって、ADCは、それらのサイズの上昇(150kDa)に起因して、固形腫瘍浸透の低減を示す。これは、ペイロードの細胞傷害性の用量へのがん細胞の不均一な曝露、および低減されたADCの治療的有効性を、結果としてもたらす。
対照的に、既知のより小さい抗体フラグメントをベースとした薬物抱合体(≦50kDa)は、理論上はがん細胞の治療薬へのより均一な曝露を結果としてもたらす、増大した固形腫瘍浸透を示す。しかしながら、それらのより小さいサイズ、および、FcRn結合部位の欠如は、持続性のある腫瘍浸透に対し反対に作用するこれらのフラグメント薬物抱合体のより短い半減期の原因となる。
よって、増大した腫瘍浸透を示すが同時に長い半減期も示してその両方が治療的有効性の増大を媒介する、ADCまたは抗体-フラグメントをベースとした抱合体による、がんの処置のための新規な治療的選択肢を開発するニーズが残っている。
本発明の概要
驚くべきことに、別の抗体フラグメントベースのフォーマットの薬物抱合体であるFc抗原結合性フラグメント(Fcab)は、より小さいサイズ、およびFcに媒介される半減期延長に起因して、既知のADCおよび既知のより小さい抗体フラグメントをベースとした薬物抱合体とは対照的に、増大した腫瘍浸透および長い半減期を両方同時に示し、その両方がかかるFcab-薬物抱合体の治療的有効性の増大を媒介するということが見出された。従って、効率的なリソソームの送達が、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体について観察されており、腫瘍細胞における強力な細胞傷害効果を結果としてもたらした。よって、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体は、がんなどの過剰増殖性の疾患および障害の処置のために使用することができる。
Fcabは、抗がん薬物抱合体として説明されまたは探索されたことがない。Fcabは、Fcエフェクター機能を、CH3ドメイン内のC末端の構造的ループに位置する改変された抗原結合部位と組み合わせる、IgG1をベースとしたホモダイマーFc領域である21-23。本明細書では、FcRn結合は、50kDaの分子サイズを保有しながら、類いまれな長い半減期(マウスにおける消失t1/2:Fcabでは60～85h、ヒトFcでは40h22,24)を媒介する。いくつかの十分に特徴づけられたFcabは、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)の細胞外ドメインに対して向けられている。例えば、Fcab H10-03-6は、ランダム化されたC末端の構造的ループ配列を含有するIgG1 Fc領域の酵母表面ディスプレー(YSD)ライブラリから単離された。22,25 H10-03-6の低減された熱安定性が、さらなるYSDをベースとした指向進化プロトコルによって改善され、安定化されたバリアントSTAB5およびSTAB19を結果としてもたらした。26 最も進歩したHER2結合Fcabは、YSDライブラリから単離されており、および、臨床的に評価された分子FS102へ導いた。24
本明細書に示されているとおり、Fcabの好ましい薬物動態プロファイルは、それらの小さなサイズの組み合わせで、驚くべきことに、Fcabをベースとした薬物抱合体によって、固形腫瘍の、より良好なかつ持続性のある浸透へ繋がる。これは、他のフラグメントをベースとした同様のサイズの薬物抱合体、または従来のIgGをベースとしたADCとの比較において本発明の抱合体の、全体的な腫瘍曝露の上昇およびより良好な有効性を、結果としてもたらす(図1に示されている概念)。
本明細書では、我々は初めて、Fcab-薬物抱合体の生成および機能を提示する。概念証明のために、我々は、固形腫瘍抗原HER2を標的にするFcabの多様なセットを選択した。弾頭の細胞内放出がADCの前提条件であることから、選択されたFcab分子についてのHER2依存的な取り込み率をがん細胞に対して決定した。続いて、Fcabを、十分に確立されたチューブリンインヒビターモノメチルアウリスタチンE(MMAE)とカップリングするために、様々な部位特異的抱合の技法を採用した。その上、すべてのFcab-薬物抱合体ならびにFcRnについて標的依存的な細胞傷害性および血清中の安定性を、および、親のFcab分子と比較した標的結合特性を、評価した。加えて、標的親和性およびサイズの、細胞内蓄積およびスフェロイド浸透への影響を査定するために、スフェロイドアッセイを適用した。概して、開示された実験および結果は、Fcab-薬物抱合体の生成のためのFcabの応用を強調する。
広範なin vitro特徴付けに基づき、我々の実験および結果は、Fcabフォーマットが、安定なかつ細胞傷害性の薬物抱合体の生成に好適であるという概念実証を提供する。その上、我々は、50kDaのFcabフォーマットが、150kDaの参照構築物と比較して秀でたスフェロイド浸透を示すということを実証できた。Fcab-薬物抱合体の有益なスフェロイド浸透は、より良好な腫瘍浸透および全体的な腫瘍曝露の増大、および究極的にはADCと比較して改善された有効性を実証している。
よって、本発明は、式Fcab-(L)m-(D)nを含み、式中：
a) Fcabは、HER2 Fcabを含み、
b) Lは、リンカーを含み、
c) Dは、薬物を含み、
d) mは、1～5の整数であり、および、nは、1～10の整数である、HER2 Fcab-薬物抱合体またはその薬学的に許容し得る塩に関する。
本発明の好ましい態様において、mは、1～3であり、および、nは、1～5である。
本発明は、HER2 Fcabが、以下からなる群：配列番号1～16に掲げるとおりのアミノ酸配列を有する、S5(ネイティブなQ295)、S5-C265、S5-NLLQGA、S5-NG4S-LLQGA、S5-CG4S-LLQGA、S5-C(G4S)2-LLQGA、S19(ネイティブなQ295)、S19(ネイティブなQ295)、FS(ネイティブなQ295)、αH-H10(Q295)、αH-H10C265(D265C)、H242-9、STAB1、STAB11、STAB14およびSTAB15、から選択される、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体に関する。
本発明の好ましい態様は、HER2 Fcabが、以下からなる群：配列番号1～11に掲げるとおりのアミノ酸配列を有する、S5(ネイティブなQ295)、S5-C265、S5-NLLQGA、S5-NG4S-LLQGA、S5-CG4S-LLQGA、S5-C(G4S)2-LLQGA、S19(ネイティブなQ295)、S19(ネイティブなQ295)、FS(ネイティブなQ295)、αH-H10(Q295)およびαH-H10C265(D265C)、から選択される、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体である。
本発明の別の好ましい態様は、HER2 Fcabが、以下からなる群：配列番号1～9に掲げるとおりのアミノ酸配列を有する、S5(ネイティブなQ295)、S5-C265、S5-NLLQGA、S5-NG4S-LLQGA、S5-CG4S-LLQGA、S5-C(G4S)2-LLQGA、S19(ネイティブなQ295)、S19(ネイティブなQ295)およびFS(ネイティブなQ295)、から選択される、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体である。
本発明に網羅されるのはまた、Fcabのアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換によって修正または修飾された、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体である。本明細書に使用されるとき、用語「保存的置換」は、当業者によって知られており、および、一般にその結果得られる分子の生物活性を変化させることなくなされる、アミノ酸の置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、実質的に生物活性を変化させないということを理解する(例として、Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/ Cummings Pub. Co., p. 224 (第4版 1987)を参照)。
一般に、本発明の方法に従って得られるHER2 Fcab-薬物抱合体は、好ましくはそれが所望の標的細胞に到達する前に早期放出されるのを防ぐのに充分に安定であり、それによって非標的細胞への損傷を防ぎおよび標的部位での利用可能性を増大させられる限り、あらゆる薬物が抱合されたものとすることができる。薬物が、最も一般的にはリンカー分子の切断に続いてリソソーム内で放出されることから、薬物が低pH環境中でも安定なままでありそれが効果を発揮する細胞の細胞質ゾルまたは核の区画内へと移動する能力があることを確実にすることが重要である。同様に、薬物の分子構造は、リンカーへのその抱合を許容しつつ、免疫原性を回避し、HER2 Fcab-薬物抱合体の内在化速度を維持し、およびその生物学的効果(すなわち、ADCC、CDCCおよびCDC)を、もしあれば、促進するか、または少なくとも損なわないようにすることが望まれる。薬物の安定性に関係なく、典型的には、投与されたHER2 Fcab-薬物抱合体のごく一部のみが、標的細胞に到達することになる。よって、抱合された薬物は、好ましくは、低濃度で強力である。
よって、本発明の一態様は、HER2 Fcab-薬物抱合体であり、ここで、HER2 Fcabは、化学療法剤などの細胞傷害性薬剤、成長阻害剤、毒素(例として、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント)、または放射性同位体(すなわち、放射性抱合体)から選択される薬物へ抱合されている。ADCとしての抗体-薬物抱合体の、および本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の、細胞傷害性または細胞増殖抑制性の薬剤すなわちがんの処置において腫瘍細胞を殺すかまたは阻害するための薬物の局所送達のための使用(SyrigosおよびEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-DuvazおよびSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)は、これらの抱合されていない薬剤の全身投与の場合は消滅させようとした腫瘍細胞だけでなく正常細胞にも許容し得ないレベルの毒性を結果としてもたらし得るところ、薬物部分の腫瘍への標的送達およびその中への細胞内蓄積を可能にする(Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05；Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506におけるThorpe, (1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」)。最小限の毒性を伴う最大限の有効性が、それによって追求される。
これらの方法において使用される薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシンを包含する(Rowland et al., (1986)上記参照)。抗体-毒素抱合体において使用される毒素は、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler et al. (2000) Bioorganic＆Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、およびカリケアマイシン(Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman et a et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素を包含する。毒素は、チューブリン結合、DNA結合、またはトポイソメラーゼ阻害を包含する機構により、それらの細胞傷害性および細胞増殖抑制性の効果を発揮し得る。いくつかの細胞傷害性の薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドに抱合されたとき、不活性または活性が少なくなる傾向がある。
本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体を調製するための企図される好適な薬物は、今日まで一般的にADCにおいて利用されている全ての細胞毒素を包含する。細胞毒素のほとんどのクラスは、細胞分裂を阻害するように作用し、およびそれらの作用機序に基づき分類されている。本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の一部として考えられる例示の細胞毒素は、限定せずに、アントラサイクリン、ドキソルビシン、メトトレキサート、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)およびモノメチルアウリスタチンF(MMAF)を包含するアウリスタチン、メイタンシンおよびそれらのメイタンシノイド誘導体(DM)、カリケアマイシン、デュオカリマイシン、およびピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマーを包含する。
一態様において、薬物部分は、V-ATPaseインヒビター、アポトーシス促進剤、Bcl2インヒビター、MCL1インヒビター、HSP90インヒビター、IAPインヒビター、mTorインヒビター、微小管安定剤、微小管脱安定剤、アウリスタチン、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、RNAポリメラーゼインヒビター、ドラスタチン、メイタンシノイド、MetAP(メチオニンアミノペプチダーゼ)、タンパク質CRM1の核外輸送のインヒビター、DPPIVインヒビター、プロテアソームインヒビター、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応のインヒビター、タンパク質 合成 インヒビター、キナーゼインヒビター、CDK2インヒビター、CDK9インヒビター、キネシンインヒビター、HDACインヒビター、DNA損傷剤、DNAアルキル化剤、DNAインターカレーター、DNA副溝結合剤およびDHFRインヒビターからなる群から選択される。いくつかの態様において、細胞傷害性薬剤は、メイタンシノイドであり、ここで、メイタンシノイドは、N(2')-デアセチル-N(2')-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン(DM1)、N(2')-デアセチル-N(2')-(4-メルカプト-1-オキソペンチル)-メイタンシン(DM3)またはN(2')-デアセチル-N2-(4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチル)-メイタンシン(DM4)である。
よって、本発明の好ましい態様は、薬物が、以下からなる群：アントラサイクリン、ドキソルビシン、メトトレキサート、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)およびモノメチルアウリスタチンF(MMAF)を包含するアウリスタチン、メイタンシンおよびそれらのメイタンシノイド誘導体(DM)、カリケアマイシン、デュオカリマイシンおよびピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマー、V-ATPaseインヒビター、アポトーシス促進剤、Bcl2インヒビター、MCL1インヒビター、HSP90インヒビター、IAPインヒビター、mTorインヒビター、微小管安定剤、微小管脱安定剤、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、RNAポリメラーゼインヒビター、ドラスタチン、メイタンシノイド、MetAP(メチオニンアミノペプチダーゼ)、タンパク質CRM1の核外輸送のインヒビター、DPPIVインヒビター、プロテアソームインヒビター、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応のインヒビター、タンパク質合成インヒビター、キナーゼインヒビター、CDK2インヒビター、CDK9インヒビター、キネシンインヒビター、HDACインヒビター、DNA損傷剤、DNAアルキル化剤、DNAインターカレーター、DNA副溝結合剤およびDHFRインヒビター、から選択される、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体である。
具体的な好ましい態様において、薬物は、チューブリンインヒビターモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である。
リンカーは、好ましくは、血流中で安定であり（抗体の循環時間の増大に適合するように）、および薬物の迅速な放出を可能にするために標的部位で不安定になるように設計される。好適なリンカーを設計するときに考慮されるパラメーターは、典型的には、リンカーの切断可能性、および、連結の位置および機構(すなわち共役化学)を包含する。現存のリンカーは、伝統的に、切断可能なまたは切断不能なリンカーとして分類される。
切断可能なリンカーは、HER2 Fcab-抗原複合体が標的細胞内へと内在化した際の環境の変化を活用し、リンカーの切断および標的細胞内への薬物の放出を結果としてもたらす。本明細書に提供されるHER2 Fcab-薬物抱合体とともに使用することが企図される例示的な切断可能なリンカーは、ヒドラゾン、ジスルフィドおよびペプチドリンカーを包含する。薬物を放出するために特有の細胞内条件に頼る切断可能なリンカーとは対照的に、チオエーテルリンカーなどの切断不能なリンカーは、もっぱらHER2 Fcab-抗原内在化に続くタンパク分解性の分解のプロセス、およびリソソームの経路におけるプロセシングにもっぱら依存する。抗体-薬物設計のためのリンカーは、当該技術分野において周知であり、および、とりわけPetersおよびBrown, Biosci. Rep. 2015年8月; 35(4): e00225によって、総括されている。1またはいくつかの薬物を、適正な治療的有効性を達成するために、各HER2 Fcabへ連結することができる。
ADCを調製するための手段および方法は、当該技術分野において説明されており、および、とりわけPetersおよびBrownによって、総括されている(上記参照)。伝統的に、薬物は、それによってネイティブなアミノ酸の反応性の部分がリンカー分子の特定の部分と相互作用しおよび結合させられる従来の技法を使用して、抗体へ化学的に抱合される。反応基の例は、リシン残基のイプシロン-アミノ末端、および部分還元型のシステイン残基中に存在するチオール側鎖を包含する。従来の抱合の技法の代替手段は、(i)部位特異的突然変異誘発を使用して、抗体に沿った特定の制御された部位に導入される新規の不対システイン残基、(ii)プラスミドを介して抗体中へと組み込まれることができるグルタミン「タグ」配列を認識し、グルタミン側鎖へアミンを含有する薬物を付加する、微生物トランスグルタミナーゼ、または(iii)転写中に抗体中へと導入されるセレノシステインまたはアセチルフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸であって好適な細胞毒素（実例として求核性のセレノシステインの場合には正に帯電した薬物分子）との抱合のために利用可能であるもの、を介しての抱合を包含する。
薬物部分Dは、リンカーLを通じてHER2 Fcabへ連結されることができる。Lは、共有結合を通じて薬物部分を抗体へ連結することを可能とするあらゆる化学的部分である。架橋試薬は、薬物部分とFcabとを連結させることでHER2 Fcab-薬物抱合体を形成するために使用することができる二官能性のまたは多官能性の試薬である。HER2 Fcab-薬物抱合体は、薬物部分とHER2 Fcabとの両方へ結合することを可能とする反応性官能基を有する架橋試薬を使用して調製することができる。例えば、システイン、チオールまたはアミン、例としてN末端、またはHER2 Fcabのリシンなどのアミノ酸側鎖は、架橋試薬の官能基を結合を形成することができる。
一態様において、Lは、切断可能なリンカーである。別の態様において、Lは、切断不能なリンカーである。いくつかの態様において、Lは、酸に不安定なリンカー、光に不安定なリンカー、ペプチダーゼ切断可能なリンカー、エステラーゼ切断可能なリンカー、ジスルフィド結合切断可能なリンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカー、またはジカルボン酸をベースとしたリンカーである。
薬物部分例えばメイタンシノイドと抗体との間に切断不能なリンカーを形成する好適な架橋試薬は、当該技術分野において周知であり、および、硫黄原子を含む切断不能なリンカー(SMCCなど)または硫黄原子なしのそれらのものを形成することができる。薬物部分例えばメイタンシノイドとHER2 Fcabとの間に切断不能なリンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドまたはハロアセチルをベースとした部分を含む。本発明に従うと、かかる切断不能なリンカーは、マレイミドまたはハロアセチルをベースとした部分に由来すると言われる。
マレイミドをベースとした部分を含む架橋試薬は、これらに限定されないが、N-スクシンイミジル-4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシラート(SMCC)、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(スルホ-SMCC)、SMCCの「長鎖」類似体(LC-SMCC)であるN-スクシンイミジル-4-(マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロアート)、K-マレイミドウンデカノン酸N-スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル(GMBS)、e-マレイミドカプロン酸N-スクシンイミジルエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-O-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMSA)、スクシンイミジル-6-(B-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノアート(SMPH)、N-スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチラート(SMPB)、N-(-p-マレイミドフェニル)-イソシアナート(PMIP)およびMAL-PEG-NHSなどのポリエチレングリコールスペーサーを含有するマレイミドをベースとした架橋試薬、を包含する。これらの架橋試薬は、マレイミドをベースとした部分に由来する切断不能なリンカーを形成する。
よって、本発明の好ましい態様は、リンカーが、本明細書に記載のリンカーから選択される、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体である。
本発明の別の好ましい態様は、リンカーが、酸に不安定なリンカー、光に不安定なリンカー、ペプチダーゼ切断可能なリンカー、エステラーゼ切断可能なリンカー、ジスルフィド結合切断可能なリンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸をベースとしたリンカーからなる群から選択される、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体である。
本発明のさらに好ましい態様は、リンカーが、ジスルフィド結合切断可能なリンカーである、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体である。
本明細書に記載の態様の各々は、それと組み合わせられる態様と矛盾しない本明細書に記載のいずれの他の態様とも、組み合わせることができる。さらにまた、所与の文脈において不適合でなければ、化合物がイオン化(例としてプロトン化または脱プロトン化)することが可能なものとして規定されていればどこでも、該化合物の定義はそのあらゆる薬学的に許容し得る塩を包含する。従って、句「またはその薬学的に許容し得る塩」は、本明細書に記載のすべての化合物の記載に黙示されている。下に記載のとおりの側面の範囲内の態様は、同じかまたは異なる側面の範囲内の矛盾しないいずれの他の態様とも組み合わせることができる。実例として、本発明の処置方法のいずれかの態様は、本発明の組み合わせ製品または本発明の医薬組成物のいずれの態様とも組み合わせることができ、逆の場合も同じである。同じく、本発明の処置方法のために与えられたいずれかの詳細または特徴は、矛盾するものでなければ、本発明の組み合わせ製品および本発明の医薬組成物のそれらにも当てはまり、逆の場合も同じである。
図1は、他の抗体フラグメントをベースとした薬物抱合体(VHH13-15、scFv9,10、Fab7,8)および従来のIgGをベースとしたADC4に対する、Fcab-薬物抱合体の利点の概念的な表現を示す。
図2は、Fcab-pHAb色素抱合体(FS-pHAb、S5-pHAb、S19-pHAb)、T-IgG-pHAbおよびT-Fab-pHAb参照構築物およびhuFc-pHAb陰性対照の、種々異なるHER2陽性(SKBR-3、HCC-1954、BT-474)およびHER2陰性(MDA-MB-468)細胞株への細胞取り込みデータを示す。 (A)直線的に増大する(S5-pHAb、T-IgG-pHAb)および減速する(FS-pHAb)細胞取り込みが示される。細胞内蓄積は、トリプリケートにて100nMで24hの間モニタリングし、および蛍光強度を、細胞数、および各構築物のpHAb色素DOL値に対して正規化した。細胞内蓄積率を、線形フィッティングによって導出した。 (B)相対的細胞内蓄積(±SD)は、最も高い正規化された細胞内蓄積率：S5-pHAbのSKBR-3細胞に対するものを指す。細胞株をHER2発現レベルに基づいて選択し、SKBR-3において最も高発現であり、HCC-1954およびBT-474がこれに続いた。38
図3は、Fcab抱合部位およびリンカー-薬物構造を示す。 (A)Fcab結晶構造(PDB: 5JIH、STAB1923)は、漫画的な表現で透き通った表面を伴って示されている。mTGのための抱合部位Q295、および突然変異したD265は、棒として描かれ、および青色および橙色でハイライトされている。N末端ヒンジ領域ならびにLLQGAタグのアミノ酸は、結晶構造中に示されていない。HER2パラトープを形成するCH3 ABおよびEFループ内の改変されたアミノ酸は、赤色でマークされている。突然変異は、EU付番を使用して記載されている。 (B)mTG抱合のためのGly3ハンドル(1)またはシステイン抱合のためのmcハンドル(2)のいずれかを保有する、Val-Cit-MMAE切断可能なリンカー-薬物。
図4は、in vitro細胞生存率データを示す。 (A)Fcab-MMAE抱合体(赤色)ならびにトラスツズマブをベースとした参照MMAE抱合体(黒色)およびhuFcをベースとした陰性対照(灰色)を、HER2を発現するSKBR-3およびHCC-1954細胞株に対して試験した。グラフ中の各データポイントは、個々の実験からのIC50値を表す。バーは、個々のIC50から算出された幾何平均(±SD)を表す。構築物を細胞上で37℃にて4日間インキュベートしてから、細胞生存率を測定した。抱合されていない親分子は、アッセイ条件下で細胞傷害性を示さなかった。期待どおり、すべての抱合体構築物は、より高い濃度でMDA-MB-468 HER2陰性細胞に対してほとんど細胞傷害効果を示さなかった(図S17)。 (B)DAR 2.0～2.2のFcab-薬物抱合体についてのSKBR-3細胞に対するIC50値とHER2解離定数(KD)との間の相関関係。 (C)MMAE抱合体で処置されたSKBR-3細胞の例示的な生存率プロット。
図5は、3D腫瘍スフェロイド浸透モデルを示す。 (A)HER2陽性BT-474およびHER2陰性HCC-1937腫瘍細胞スフェロイドにおける、50kDaのpHAb色素標識付き抗体フラグメントの高親和性対低親和性分布を比較した代表的な共焦点顕微鏡画像。 (B)BT-474およびHCC-1937腫瘍細胞スフェロイドにおける50kDaのpHAb色素標識付き抗体フラグメントと対応する150kDaのIgGバリアントの分布を比較する代表的な共焦点顕微鏡画像。 (C)浸透深度を半定量的に描いた共焦点顕微鏡画像から導出されたラジアルプロファイルプロット。実線は、平均(n＝8スフェロイド/群)を、点線として描かれたSDとともに表す。 (D)ラジアルプロファイルプロットから算出されたBT-474スフェロイドにおける50kDaの抗体フラグメントおよび対応する150kDaのIgGバリアントの平均浸透距離(±SD)(n＝8スフェロイド/群)。統計分析は対応のない両側t検定を使用して行い、***はP＜0.001を示した。スフェロイドは、2,000細胞から、96hの間成長させ、50nMのpHAb色素標識付き構築物で24hの間インキュベートし、および細胞内の蓄積されたpHAb色素をレーザー走査共焦点顕微鏡(20x)でイメージングした。画像は、スフェロイド直径341±3μmおよびスフェロイド深度62±3μmで撮った。
図6は、プロテインAによるFcab FS抗体フラグメントの精製プロセスを示す。 (A)プロテインAカラム(50mM酢酸(HOAc)、pH3.2)からの溶離後のタンパク質ピークおよびこれに続く緩衝剤の変化のステップの後の第2のタンパク質ピークを示す、AEKTA Xpress(HiTrap(商標) MabSelect SuRe(商標) 5mLおよびHiPrep(商標) 26/10脱塩カラム)クロマトグラム。 (B)還元されたおよび還元されていないExpi293F上清、プロテインAフロースルーおよび精製されたFSのSDS-PAGE分析。4-12％ Bis-Tris Gel(Invitrogen(商標))、MES SDSランニングバッファー(1x)、200Vで40min、InstantBlue(商標)(Coomassieをベースとする)で2hの間染色、マーカー：Precision Plus Protein(商標)Unstained Standards(BioRad)。
図7は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によるHis6タグ付きT-Fab抗体フラグメントの精製プロセスを示す。 A)イミダゾールの濃度を増大させたことによる溶離したタンパク質画分を示すAEKTA Pure(1mL HisTrap(商標) HPカラム、GE Healthcare)クロマトグラム。 (B)還元されていないおよび還元されたプールされたピークおよび混合された画分のSDS-PAGE分析。4-12％ Bis-Tris Gel(Invitrogen(商標))、MES SDSランニングバッファー(1x)、200Vで40min、InstantBlue(商標)(Coomassieをベースとする)で2hの間染色、マーカー：Precision Plus Protein(商標)Unstained Standards(BioRad)。
図8は、精製されたタンパク質の収率をまとめている。Expi-293F発現培養物の体積あたりのFcabおよび対照構築物。Fcabは、赤色でマークされており、および対照構築物は、灰色でマークされている。D265C突然変異を含有するバリアントは、橙色の線でマークされている。D265C突然変異体は、この突然変異を欠く同等の構築物よりも発現が悪かった。
図9は、還元されていないおよび還元された精製されたhuFcおよびFcabバリアントを示す。還元されていない構築物のバンドは、期待どおりの50kDa周辺で現れる。還元されたときには、モノマーの重鎖が、およそ30kDaで現れる。STAB5バリアント(＃5～10)の、huFcまたはSTAB19バリアント(1～4、11～12)と比較してより高い見掛けの分子量は、Traxlmayr et al.52によってもまた報告されたものであるSTAB5の改変されたCH3 ABループ内の追加の人工NVSグリコシル化部位が原因で起こる。4-12％ Bis-Tris Gel(Invitrogen(商標))、MES SDSランニングバッファー(1x)、200Vで40min、InstantBlue(商標)(Coomassieをベースとする)で2hの間染色、マーカー：Precision Plus Protein(商標)Unstained Standards(BioRad)。
図10は、凍結解凍サイクル後の、精製されたFcabおよび対照の分析的なSE-HPLCクロマトグラム(Abs. 214nm)を示す。単一のピークは、モノマー含量が高いこと、および、有意な分量の凝集が不在であることを示す。
図11は、FcabおよびhuFc対照分子の熱安定性を示す。熱アンフォールディング曲線の一次導関数(A)ならびにアンフォールディング遷移中間点(Tm)(B)が示される。熱アンフォールディングを決定するために、FcabおよびhuFc(PBS pH6.3)をナノDSFグレードの標準キャピラリー内へとロードし、これを次いでPrometheus NT.PLEXナノDSF(NanoTemper Technologies)機器内へと移した。試料を、350および330nmでの蛍光を同時に記録しながら、1℃/minの勾配で20℃～95℃の直線的な温度上昇に供した。アンフォールディング遷移中間点(Tm)を、蛍光比率350nm/330nmの一次導関数から決定した。すべての試料は、デュプリケートで測定した。
図12は、FcabおよびhuFc対照の同一性を確認するLC-MS分析を示す。計算質量と実測質量との間の質量変動は、グリコシル化パターンおよび標準測定偏差の主要因になる。最も強烈なグリコシル化パターンのみをリストしている。S5-NLLQGAおよびhuFc-NLLQGAは、遺伝的に導入されたN末端LLQGAタグによって生成された潜在的なO-グリコシル化部位 に起因して部分的にO-グリコシル化されている。すべてのSTAB5バリアントは、改変されたCH3 ABループ内の人工NVSグリコシル化部位に位置する可能性が高い追加のMan5グリコシル化を抱えている。この人工のグリコシル化部位は、Traxlmayr et al.52にもまた報告されている。
図13は、HER2陽性(SKBR-3、HCC-1954)およびHER2陰性(MDA-MB-468)細胞に対するFcabおよび対照分子の細胞結合分析を示す。Fcabおよびトラスツズマブ参照構築物は、HER2を発現する細胞を選択的に結合し、一方でhuFcはHCC-1954細胞へわずかにのみ結合する。HER2陽性細胞上の、区別のつくバリアントの蛍光強度の相対的な序列は、それらのHER2結合親和性に対応する。細胞を、100nMのFcab/抗体とともに4℃にて60minの間インキュベートし、PBS-1％ BSAで2回洗浄し、500nMのAF488標識付き検出抗体(Jackson ImmunoResearch)とともに暗所で4℃にて30minの間インキュベートし、PBS-1％ BSAで2回洗浄し、および最終的に蛍光強度を、Attune NxTフローサイトメーター(Invitrogen(商標))を適用して測定した。
図14は、実験において使用したpHAb色素構築物を示す。 (A)システインのフリーのチオール基と反応するマレイミド基3を抱えているpHAbチオール反応性色素(Promega)の構造。 (B)SE-HPLCランニングバッファー(50mM リン酸ナトリウム、400mM 過塩素酸ナトリウム、pH6.3)中のpHAb色素の吸収および蛍光スペクトル。スペクトルは、マイクロプレートリーダー(Synergy/neo2、BioTek)上で記録した。 (C)この研究のための生成されたpHAb色素抱合体。同様の標識化度(DOL 1.8～2.5)を、事前に還元されたタンパク質へ加えた3の当量を慎重に調整することによって達成した。
図15は、pHAb色素標識付き構築物の細胞取り込み動態を示す。 (A)SKBR-3細胞に対するS5-pHAbについて例示的に示した細胞内蓄積の時系列。細胞を、37℃、湿度80%および5％ CO2にて100nM S5-pHAbとともにインキュベートし、およびRFPチャネル画像(ex.: 531nm、em.: 593nm)を、DAPIおよびRFPフィルターキューブおよびBioSpa 8自動化インキュベーター(BioTek)を備えたCytation 5細胞イメージングリーダー(BioTek)を使用して24hの間2h毎に記録した。 (B)画像の蛍光強度を、細胞数、および各構築物のpHAb色素DOLに対して正規化し、および、直線的にフィットされたデータの勾配から正規化された細胞内蓄積率を導出するために経時的にプロットした。続いて、相対的細胞内蓄積を、これらの率から算出することができる。
図16は、Fcab-MMAE抱合体のための抱合および精製ストラテジーを示す。 (A)改変されたシステインまたは酵素的なトランスグルタミナーゼ抱合のいずれかによって、MMAE抱合体を生成した。抱合の後、過剰なデヒドロアスコルビン酸(DHA)、N-アセチルシステイン(NAC)、mc-Val-Cit-MMAE(2)または微生物トランスグルタミナーゼ(mTG)およびGly3-Val-Cit-MMAE(1)を、分取SECによって除去した。 (B)例示的にS19-Q295-MMAEおよびhuFc-Q295-MMAEトランスグルタミナーゼについて示された、抱合されたMMAE構築物の分取SECによる精製。抱合されたタンパク質(および非抱合種)を含有する画分をプールし、濃縮し、滅菌濾過し、および分析に供した。ピーク強度は、280nmでの吸収を表す。
図17は、FS-Q295-MMAE、huFc-Q295-MMAEおよびT-Fab-C183,C205-MMAEについての、生成されたMMAE抱合体のクロマトグラフの特徴付けを示す。 (A)分析的なサイズ排除SE-HPLCは、凝集のないモノマー薬物抱合体の形成を実証する区別のつく単一ピークを示す。シグナル強度は、214nmでの吸収を表す。 (B)逆相RP-HPLCは、Gly3-Val-Cit-MMAE 1またはmc-Val-Cit-MMAE 2の抱合を明らかにする。RP-DARを、個々のDAR種のピーク面積から算出した。例えば、DAR 1種T-Fab-C183,C205-MMAEの25％の相対的ピーク面積、およびDAR 2種T-Fab-C183,C205-MMAEの75％の相対的ピーク面積は、1.75の最終RP-DARを明らかにする。シグナル強度は、214nmでの吸収を表す。 (C)疎水性相互作用HI-HPLCは、区別のつくDAR種をそれらの疎水性に従って分離する。HIC-DARは、RP-DARと同じようにピーク面積から算出することができる。その上、相対保持時間(RRT)は、ADCの固有の疎水性を特徴付けるためにHICデータから算出することができる。DAR 2.0の薬物抱合体および親の抗体(Ab)の溶離時間からRRTが算出されており、各構築物へリンカー-薬物によって追加された疎水性が強調されている。シグナル強度は、280nmでの吸収を表す。
図18は、LC-MSによるS19-Q295-MMAEのDARの決定を示す。 (A)還元された薬物抱合体の逆相クロマトグラムおよびDAR計算。 (B)Gly3-Val-Cit-MMAE(1)と抱合された個々の重鎖種へRPピークを割り当てるために使用されたデコンボリューションされたMSスペクトル。 図19は、LC-MSによるhuFc-Q295-MMAEのDARの決定を示す。 (A)還元された薬物抱合体の逆相クロマトグラムおよびDAR計算。 (B) Gly3-Val-Cit-MMAE(1)と抱合された個々の重鎖種へRPピークを割り当てるために使用されたデコンボリューションされたMSスペクトル。
図20は、MMAE抱合体および抱合されていない親分子についての速度論的なHER2結合パラメーターを示す。解離定数(KD)、オン速度(kon)およびオフ速度(koff)を、組換え生産されたHER2を使用したBLIによってpH7.4で測定した。誤差は、Forte´Bioデータ分析ソフトウェア9.1を使用したフィッティングからの標準誤差である。フィッティングの質は、R2によって特徴付けられる。データは、図22および図23に表されるBLIセンサーグラムから導出される。 図21は、MMAE抱合体および抱合されていない親分子についての速度論的なFcRn結合パラメーターを示す。解離定数(KD)、オン速度(kon)およびオフ速度(koff)を、組換え生産されたFcRnを使用したBLIによって測定した。FcRnへの結合親和性は、pH6.0で決定した。誤差は、Forte´Bio データ分析ソフトウェア9.1を使用したフィッティングからの標準誤差である。データは、図22および図23に表されるBLIセンサーグラムから導出される。
図22は、抱合されていないFcab、トラスツズマブバリアントおよび夫々のMMAE抱合体の、BLIを介したHER2結合分析を示す。会合および解離を、1:1包括的フルフィット結合モデルまたは1:1包括的部分解離モデル(STAB19バリアントのみ)のいずれかによってフィットさせた。フィッティングは、赤色で示されている。各センサーグラムに対して、結合の間の分析物の最も高い濃度およびその希釈倍率が与えられている。 図23は、抱合されていないFcab、トラスツズマブバリアントおよび夫々のMMAE抱合体の、BLIを介したFcRn結合分析を示す。分析物(1μM；1:2で段階希釈された)の会合および解離をpH6.0で記録し、および1:1包括的部分解離モデルによってフィットさせた。フィッティングは、赤色で示されている。
図24は、マウスおよびヒト血清中でのS5-MMAEについてのin vitro安定性評価を示す。 (A)マウス血清インキュベーションは、N末端で抱合されたSTAB5バリアントからのMMAE放出を明らかにする。これに反して、Q295またはC265で抱合されたSTAB5バリアントは、MMAEの極めて低い放出、およびゆえに優れた抱合体安定性を示す。 (B)ヒト血清中で構築物をインキュベートしたときには、遊離MMAEは検出されなかった。遊離MMAEは、96hの間マウスおよびヒト血清中で37℃にてインキュベーションした後にLC MS/MSを介して測定した(n＝3)。
図25は、in vitro細胞傷害性データを示す。 (A)Fcab-薬物抱合体の段階的希釈物および対照で処置されたHER2陽性(SKBR-3、HCC-1954)およびHER2陰性細胞(MDA-MB-468)の例示的な生存率プロット。 (B)生存率曲線から導出されたFcab-薬物抱合体および対照のIC50値。抱合された薬物の数および抗体の標的親和性は細胞傷害活性に影響を及ぼすことから、DAR値およびHER2解離定数(KD)も、同様にリストしている。
図26は、腫瘍細胞スフェロイドの形成を示す。 (A)37℃、湿度80%および5％ CO2にて24hにわたっての8000 HCC-1937細胞の例示的な腫瘍細胞スフェロイド形成を示す広視野画像。広視野画像は、IncuCyte生細胞分析システム(Sartorius)で撮った。 (B)再現性のあるサイズを持つ4の異なるBT-474細胞スフェロイド(2,000細胞を、37℃、湿度80%および5％ CO2にて96hの間成長させた)の共焦点顕微鏡画像。共焦点顕微鏡画像は20倍の倍率にて、共焦点のレーザー走査顕微鏡TCS SP8(Leica)で撮った。
図27は、50nMのpHAb色素標識付き構築物とともに24hの間インキュベートされたBT-474腫瘍細胞スフェロイド(2,000細胞が37℃、湿度80%および5％ CO2にて96hの間成長させられた)の共焦点顕微鏡画像を示す。画像は、スフェロイド直径341±3μmおよびスフェロイド深度62±3μmにて共焦点レーザー走査顕微鏡TCS SP8(Leica、20倍の倍率)で撮った。視覚的な比較可能性のために、画像の輝度を、区別のつくpHAb色素の標識度からの結果としてもたらされる差異を補償するように調整した。より良好な可視化のために、すべての画像のコントラストを40％増大させた。ラジアルプロファイルプロットおよびMPDは、未処理の画像から導出した。
図28は、腫瘍細胞スフェロイド浸透についての定量化ストラテジーを示す。 (A)50nMのpHAb色素標識付きT-IgGとともに24hの間インキュベートされたBT-474スフェロイドの共焦点顕微鏡画像。写真は、スフェロイドの下部の50μm上で撮った(z-位置)。細胞内の蓄積されたT-IgG-pHAbの蛍光は、赤色で示されている。黄色の円は、スフェロイドの境界をマークし、および、ImageJにおけるラジアルプロファイルプロットプラグインを使用して手動でセットされている。56 ラジアルプロファイルプロットプラグインは、黄色の円(スフェロイド)の中心からの距離の関数として同心円の周りの正規化された積分強度のプロファイルプロットを生じる。 (B)同じスフェロイドの明視野画像。 (C)ImageJによってBT-474スフェロイドから生成されたラジアルプロファイルプロット。T-IgG-pHAbの蛍光強度プロファイル(A)は、より大きな半径(スフェロイドの境界)で、より高い強度に反映される。スフェロイドの中心へと向かうその限定される分布は、より小さい半径(スフェロイドの中心)へ向かって、蛍光強度の急激な減少を生じる。このラジアル蛍光プロファイルから、平均浸透距離(MPD)を算出することができる。MPDは、区別のつく分子のスフェロイド浸透特性を比較することを可能にする。 (D)ラジアルプロファイルプロット(C)からの平均浸透距離の算出のための方程式。
本発明は、本発明の具体的なかつ好ましい態様の上記および下記の詳細な記載ならびに本明細書に包含される例を参照することによって、より容易に理解され得る。本明細書に使用される専門用語は、特定の態様を記載する目的のためのものにすぎず、限定を意図しないということを理解されたい。本明細書に具体的に定義されない限り、本明細書に使用される専門用語は、関係のある技術において知られているとおりのその既存の意味を与えられるものであるということを、さらに理解されたい。本発明がより容易に理解され得るように、ある技術用語および科学用語は、具体的に下記に定義されている。この文書中の別の場所に具体的に定義されない限り、本明細書に使用される他のすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術における当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「A」、「an」、および「the」は、文脈が明確に別様に指示しない限り、複数形の指示対象も包含する。よって、例えば、抗体と言うときは、1以上の抗体または少なくとも1の抗体を指す。そのため、用語「a」(または「an」)、「1以上の」、および「少なくとも1の」は、本明細書中で互換的に使用される。
用語「約」は、数字で表して定義されたパラメーターを修飾するように使用されるとき、全体としての効果、例として、疾患または障害の処置における薬剤の有効性を、変化させないような、かかるパラメーターにおける最小限の変更を指す。いくつかの態様において、用語「約」は、パラメーターが、そのパラメーターについて規定された数値よりも最大10%上下に変動してもよいことを意味する。
患者へ薬物「を投与すること」または「の投与」(およびこの句の文法的に等価なもの)は、患者への医療従事者による投与であってもよくまたは自己投与であってもよい直接投与、および/または、薬物を処方するという行為、例として、患者へ薬物を自己投与するように指示するかまたは患者に薬物の処方箋を提供する医師が、患者へ薬物を投与することであってもよい、間接投与を指す。
「アミノ酸の違い」は、アミノ酸の置換、欠失または挿入を指す。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも1の抗原認識部位を通じて炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等々、などの標的への特異的な結合を可能とする免疫グロブリン(Ig)分子である。本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず、別様に特定されない限り、特異的結合について無傷の抗体と競合するそれらのあらゆる抗原結合性フラグメントまたは抗体フラグメント、ならびにかかるそれらの抗原結合性フラグメントまたは抗体フラグメントを含むあらゆるタンパク質をも網羅し、これは融合タンパク質(例として、抗体-薬物抱合体、サイトカインへ融合された抗体またはサイトカイン受容体へ融合された抗体)、ポリエピトープ特異性を持つ抗体組成物、および多重特異性抗体(例として、二重特異性抗体)を包含する。
基本4鎖抗体単位は、2の同一の軽(L)鎖および2の同一の重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgM抗体は、J鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に5の基本ヘテロ四量体単位からなり、かつ、10の抗原結合部位を含有し、一方で、IgA抗体は、J鎖と組み合わせられて多価集合体を形成するように重合化することができる2～5の基本4鎖単位を含む。IgGのケースでは、4鎖単位は、一般に約150,000ダルトンである。各L鎖は、1の共有ジスルフィド結合によってH鎖へ連結されており、一方で2のH鎖は、H鎖アイソタイプに依存して1以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。
各HおよびL鎖はまた、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各H鎖は、N末端に、可変ドメイン(VH)を、これに続きαおよびγ鎖の各々については3の定常領域(CH)を、およびμおよびεアイソタイプについては4のCHドメインを有する。各L鎖は、N末端に、可変ドメイン(VL)を、これに続き他方の端には定常領域を有する。VLは、VHとアラインされており、および、CLは、重鎖の第1の定常領域(CH1)とアラインされている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。VHおよびVLの対形成は、一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。
抗体の種々異なるクラスの構造および特性については、例として、Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Sties et al.(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, 頁71およびChapter 6を参照されたい。あらゆる脊椎動物種からのL鎖は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる2のはっきり区別されるタイプのうちの一方へ割り当てられることができる。それらの重鎖(CH)の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプへ割り当てられることができる。免疫グロブリンには5のクラス：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、があり、夫々α、δ、ε、γおよびμと名付けられた重鎖を有する。γおよびαクラスは、CH配列および機能の比較的少ない違いに基づいてさらにサブクラスへと分割され、例として、ヒトは以下のサブクラス：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgK1を発現する。
抗体または「抗体フラグメント」の「抗原結合性フラグメント」は、無傷の抗体の一部分であって、依然として抗原結合を可能とするものを含む。抗原結合性フラグメントは、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、FcabおよびFvフラグメント、ドメイン抗体(dAb、例として、サメおよびラクダ科動物の抗体)、CDRを包含するフラグメント、単鎖可変フラグメント抗体(scFv)、単鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体、マキシボディー、ナノボディー、ミニボディー、イントラボディー、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、v-NARおよびビス-scFv、直鎖状抗体(例として、米国特許第5,641,870号、例2；Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8HO: 1057を参照されたい)、および、ポリペプチドへ特異的な抗原結合を付与するのに充分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチド、を包含する。
抗体のパパイン消化は、「Fab」と呼ばれる2の同一の抗原結合性フラグメント、および、その残りの、容易に結晶化する能力を反映した呼び名の「Fc」フラグメントを生じる。Fabフラグメントは、H鎖(VH)の可変領域ドメインと共に全L鎖および1のの第1の定常領域(CH1)、からなる。各 Fab フラグメントは、抗原結合に関しては一価である、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一の大きなF(ab')2フラグメントを産出し、これは大まかには、異なる抗原結合活性を有する2のジスルフィド連結されたFabフラグメントに対応し、および依然として架橋抗原を架橋することを可能とする。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1以上のシステインを包含するCH1ドメインのカルボキシ末端に数個の追加の残基を有することでFabフラグメントとは異なる。Fab'-SHは、定常領域のシステイン残基(単数または複数)がフリーのチオール基を有するFab'の本明細書における呼び名である。F(ab')2抗体フラグメントは、元々、ヒンジシステインをそれらの間に有するFab'フラグメントの対として作られたものである。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングもまた知られている。
「バイオマーカー」は、一般には、疾患状態を示す生体分子ならびにその定量的および定性的な測定を指す。「予後バイオマーカー」は、治療とは無関係に、疾患の転帰と相関する。例えば、腫瘍低酸素症は、陰性の予後マーカーである － 腫瘍低酸素症が高いほど、疾患の転帰がマイナスになる可能性が高くなる。「予測バイオマーカー」は、患者が特定の治療に対してプラスに応答しそうであるかどうかを示し、例として、HER2プロファイリングは、乳がん患者においてそれらの患者がハーセプチン(トラスツズマブ、Genentech)に対して応答しそうであるかどうかを決定するために一般的に使用される。「応答バイオマーカー」は、治療への応答の尺度を提供し、そのため治療がうまくいっているかどうかの指標を提供する。例えば、前立腺に特異的な抗原のレベルの減少は、一般に、前立腺がん患者のための抗がん治療がうまくいっているということを示す。
本明細書に記載の処置のための患者を同定することまたは選択することの根拠としてマーカーが使用されるとき、マーカーは、処置前および/または処置中に測定されることができ、および、得られた値は、臨床医によって以下のいずれかのものを査定することにおいて使用される：(a)個人が最初に処置(単数または複数)を受けるのに適している可能性が高いかまたはおそらくその可能性があること；(b)個人が最初に処置(単数または複数)を受けるのに適していない可能性が高いかまたはおそらくその可能性があること；(c)処置への応答性；(d)個人が継続して処置(単数または複数)を受けるのに適している可能性が高いかまたはおそらくその可能性があること；(e)個人が継続して処置(単数または複数)を受けるのに適していない可能性が高いかまたはおそらくその可能性があること；(f)投薬量を調整すること；(g)臨床上の利益になる可能性を予測すること；または(h)毒性。当業者には十分に理解されるであろうとおり、臨床の場におけるバイオマーカーの測定は、このパラメーターが本明細書に記載の処置の投与を開始すること、続けること、調整することおよび/または止めることの根拠として使用されたことの明確な指標である。
「がん」では、異常な様式で増殖していく一群の細胞を意味する。本明細書に使用されるとき、用語「がん」は、白血病、癌、および肉腫を包含する、哺乳動物において見出されるすべてのタイプのがん、新生物、悪性または良性の腫瘍を指す。例示的ながんは、急性および慢性のリンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、副腎皮質がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮頸部過形成、絨毛膜がん、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ性白血病、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、胆道がん、肝細胞癌、肝臓がん、食道がん、本態性血小板増加症、泌尿生殖器癌、神経膠腫、膠芽腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、ホジキン病、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド癌、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、悪性膵臓インスリノーマ、甲状腺髄様癌、黒色腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、菌状息肉種、骨髄性およびリンパ性白血病、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、原発性マクログロブリン血症、前立腺がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、皮膚がん、小細胞肺がん、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がんおよびウィルムス腫瘍を包含する。
「CDR」は、抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合性フラグメントの相補性決定領域アミノ酸配列である。これらは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には3の重鎖および3の軽鎖のCDR(またはCDR領域)がある。
「臨床転帰」、「臨床パラメーター」、「臨床応答」、または「臨床エンドポイント」は、治療への患者の反応に関連するあらゆる臨床の所見または測定を指す。臨床転帰の非限定例は、腫瘍応答(TR)、全生存期間(OS)、無増悪生存期間(PFS)、無病生存期間、腫瘍再発までの時間(TTR)、腫瘍進行までの時間(TTP)、相対的なリスク(RR)、毒性、または副作用を包含する。
「組み合わせ」は、本明細書に使用されるときは、1以上のさらなる活性なモダリティ(ここで1以上の活性なモダリティは融合されていてもよい)に加えての第1の活性なモダリティの提供を指す。本明細書に記載の組み合わせの範囲内には、単一のまたは複数の化合物および組成物に網羅される組み合わせモダリティまたはパートナー(すなわち、活性化合物、構成要素または薬剤)のあらゆるレジメンが企図される。単一の組成物、処方物または単位剤形(すなわち、固定用量の組み合わせ)内でのあらゆるモダリティは、同一の用法および送達のルートを有していなければならないということが理解される。モダリティが一緒に送達されるために(例として、同じ組成物、処方物または単位剤形中で)製剤化されなければならないことを暗示することを意図するものではない。組み合わせられるモダリティは、同じまたは異なる製造業者によって製造および/または製剤化されることができる。組み合わせパートナーは、例として、全面的に別々の医薬の剤形または医薬組成物であり、互いに独立して販売もされるものであってもよい。
「併用療法」、「との組み合わせで」または「と併せて」は、本明細書に使用されるときは、区別のつく少なくとも2の処置モダリティ(すなわち、化合物、構成要素、標的にされた薬剤または治療剤)でのあらゆる形態の併用の、並行の、同時の、逐次的なまたは断続的な処置を示す。そのため、用語は、対象への他の処置モダリティの投与前、投与中または投与後の1の処置モダリティの投与を指す。組み合わせでのモダリティは、いずれの順番で投与されることもできる。
治療的に活性なモダリティは、医療管理者によって処方されたまたは規制当局に従った様式および投薬レジメンで、一緒に(例として、同じかまたは別々の組成物、処方物または単位剤形で同時に)または個別に(例として、同じ日にまたは異なる日におよび別々の組成物、処方物または単位剤形についての適切な投薬プロトコルに従うとおりのあらゆる順番で)投与される。一般に、各処置モダリティは、その処置モダリティのために決定された用量および/または時間スケジュールで投与されることになる。任意に、4以上のモダリティが併用療法において使用されてもよい。加えて、本明細書に提供される併用療法は、他のタイプの処置と併せて使用されてもよい。例えば、他の抗がん処置は、対象のための現在の標準治療に関連する他の処置の中でも、化学療法、外科手術、放射線治療(放射線)および/またはホルモン療法からなる群から選択されてもよい。
「完全奏功」または「完全寛解」は、処置に応答してがんのすべての兆候が消失することを指す。これは、常にがんが治ったことを意味するわけではない。
「含む」は、本明細書に使用されるとき、組成物および方法が、述べられている要素を包含するが、しかし他を排除するものでもないという意味であることを意図する。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義することに使用されるとき、組成物または方法にとって何らかの本質的な重要性がある他の要素を排除することを意味するものとする。
「からなる」は、クレームされている組成物および実質的な方法ステップに対する他の成分の微量以上の要素を排除することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義された態様は、本発明の範囲内である。従って、方法および組成物は、追加のステップおよび構成要素を包含することができ(含む)、あるいは代替的に重要性のないステップおよび組成物を包含することができ(から本質的になる)、あるいは代替的に、規定された方法ステップまたは組成物のみを意図することができる(からなる)、ということが意図される。
「用量」および「投薬量」は、投与のための活性薬剤または治療剤の特定の量を指す。かかる量は、ヒト対象およびその他の哺乳動物のための統一された投薬量として好適な物理的に不連続な単位を指す「剤形」に包含され、各単位は、担体などの1以上の好適な医薬賦形剤と関連付けて、所望されるオンセット、忍容性、および治療的効果を生じるように算出された予め決められた分量の活性薬剤を含有する。
本発明に従う「薬物抱合体」または「薬物」は、本発明に従うHER2 Fcabと、これらに限定されないがアントラサイクリン、ドキソルビシン、メトトレキサート、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)およびモノメチルアウリスタチンF(MMAF)を包含するアウリスタチン、メイタンシンおよびそれらのメイタンシノイド誘導体(DM)、カリケアマイシン、デュオカリマイシンおよびピロロベンゾジアゼピン(PBD)ダイマー、V-ATPaseインヒビター、アポトーシス促進剤、Bcl2インヒビター、MCL1インヒビター、HSP90インヒビター、IAPインヒビター、mTorインヒビター、微小管安定剤、微小管脱安定剤、アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、RNAポリメラーゼインヒビター、ドラスタチン、メイタンシノイド、MetAP(メチオニンアミノペプチダーゼ)、タンパク質CRM1の核外輸送のインヒビター、DPPIVインヒビター、プロテアソームインヒビター、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応のインヒビター、タンパク質合成インヒビター、キナーゼインヒビター、CDK2インヒビター、CDK9インヒビター、キネシンインヒビター、HDACインヒビター、DNA損傷剤、DNAアルキル化剤、DNAインターカレーター、DNA副溝結合剤またはDHFRインヒビター、を包含する群から選択される薬物との、抱合体である。
本発明に従う「Fcab」は、Fcエフェクター機能を、CH3ドメイン内のC末端の構造的ループに位置する改変された抗原結合部位と組み合わせる、IgG1をベースとしたホモダイマーFc領域である。21-23例として高親和性でHER2へ結合する修飾されたlgG1 Fcドメインを含む、抗原結合Fcフラグメント(Fcab(商標) [抗原の結合を伴うFcフラグメント]ともまた称される)は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2009/132876A1およびWO2009/000006A1に記載されている。本明細書に記載の特異的結合メンバーは、本明細書に記載の抗原結合Fcフラグメントを包含し、これは各々が少なくとも1の構造上のループ領域内に1以上のアミノ酸修飾を有し、ここで、修飾された構造上のループ領域は、修飾されていないFcフラグメントが有意に結合しない抗原のエピトープ、例としてHER2へ、特異的に結合する。
「Fc」は、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のH鎖のカルボキシ末端部分を含むフラグメントである。抗体のエフェクター機能は、ある種の細胞上で見出されるFc受容体(FcR)によってもまた認識される領域であるFc領域における配列によって決定される。抗原結合Fcフラグメントは、Fcフラグメントの定常領域、例としてCH2またはCH3ドメインの1以上の構造上のループ領域内に改変された抗原結合部位を含み得る。抗原結合Fcフラグメントの調製は、WO2006/072620およびWO2009/132876に記載されている。
本発明における使用のための特異的結合メンバーは、好ましくは、Fcab(商標)ともまた称される抗原結合Fcフラグメントであるかまたはこれを含む。より好ましくは、本発明における使用のための特異的結合メンバーは、抗原結合Fcフラグメントである。特異的結合メンバーは、lgA1、lgA2、IgD、IgE、lgG、lgG2、lgG3、lgG4またはIgM抗原結合Fcフラグメントであってもよい。最も好ましくは、本明細書で言及される特異的結合メンバーは、lgG1(例として、ヒトlgG1)抗原結合Fcフラグメントである。ある態様において、特異的結合メンバーは、ヒンジまたはその一部、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む、lgG1抗原結合Fcフラグメントである。
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する、最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、緊密な非共有結合的に会合した、1の重鎖および1の軽鎖可変領域ドメインのダイマーからなる。これらの2のドメインのフォールディングは、アミノ酸残基を抗原結合に寄与させる6の高可変性のループ(HおよびL鎖の各々から各3のループ)を発生させ、および抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(または、抗原に特異的なHVRを3のみ含む、Fvの半分)でもなお、結合部位全体よりも低い親和性でとはいえ、抗原を認識および結合する能力を有する。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産された抗体のそれに対応するアミノ酸配列を保有するおよび/または本明細書に開示のとおりのヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は特別に除外する。ヒト抗体は、当該技術分野において知られている、ファージディスプレーライブラリを包含する様々な技法を使用して、生産することができる(例として、HoogenboomおよびWinter (1991)、JMB 227: 381；Marks et al. (1991) JMB 222: 581を参照されたい)。Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 頁77；Boerner et al. (1991), J. Immunol. 147(l): 86；van Dijkおよびvan de Winkel (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368において記載された方法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してかかる抗体を生産するように修飾されているがしかしその内在性の遺伝子座は無効化されているようなトランスジェニック動物、例として、免疫化された異種マウス(XENOMOUSE技術に関して、例として、米国特許第6,075,181；および6,150,584を参照されたい)へ抗原を投与することによって、調製することができる。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関して、例えば、Li et al. (2006) PNAS USA, 103: 3557もまた参照されたい。
非ヒト(例として、マウス)抗体の「ヒト化された」形態は、最小限の非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有するキメラ抗体である。一態様において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)において、レシピエントのHVRからの残基が、所望される特異性、親和性および/または容量を有するマウス、ラット、ウサギ、または霊長目の非ヒト動物などの非ヒト種のHVR(ドナー抗体)からの残基によって置き換えられたものである。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク(「FR」)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてまたはドナー抗体においては見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改良するためになされてもよい。
一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1の、および典型的には2の、可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、その中で、高可変性のループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリン配列のそれらに対応し、およびFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のそれらであり、ただし、FR領域は、結合親和性、異性化、免疫原性等々、などの抗体性能を改善する1以上の個々のFR残基置換を包含してもよい。FR内におけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的にはH鎖内においては6を超えず、およびL鎖内においては3を超えない。ヒト化抗体は、任意には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの、少なくとも一部分もまた含み得る。さらなる詳細については、例として、Jones et al. (1986) Nature 321: 522；Riechmann et al. (1988)、Nature 332: 323；Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593；VaswaniおよびHamilton (1998), Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1: 105；Harris (1995) Biochem. Soc. Transactions 23: 1035；HurleおよびGross (1994) Curr. Op. Biotech. 5: 428；および米国特許第6,982,321および7,087,409を参照されたい。
「注入」または「注入する」は、治療目的での、静脈を通じた体内への、薬物を含有する溶液の導入を指す。一般に、これは、静脈内(IV)バッグを介して達成される。
「転移性」がんは、体の1の部分(例として、肺)から体の別の部分へと広がったがんを指す。
「モノクローナル抗体」は、本明細書に使用されるときは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在してもよいような考えられる天然に存在する突然変異および/または翻訳後修飾(例として、異性化およびアミド化)を除いて同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に対して向けられる。典型的に異なる決定基(エピトープ)に対して向けられた異なる抗体を包含するものであるポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、および他の免疫グロブリンによってコンタミネーションされないという点で有利である。
修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特質を示し、および、いずれかの特定の方法による抗体の生産を要求するものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法(例として、KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256: 495；Hongo et al. (1995) Hybridoma 14 (3): 253；Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press第2版；Hammerling et al. (1981) In: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563 (Elsevier, N.Y.)、組換えDNA法(例として、米国特許第4,816,567を参照されたい)、ファージディスプレー技術(例として、Clackson et al. (1991) Nature 352: 624；Marks et al. (1992) JMB 222: 581；Sidhu et al. (2004) JMB 338(2): 299；Lee et al. (2004) JMB 340(5): 1073；Fellouse (2004) PNAS USA 101(34): 12467；およびLee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119を参照されたい)、および、ヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生産するための技術(例として、WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits et al. (1993) PNAS USA 90: 2551；Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 255；Bruggemann et al. (1993) Year in Immunol. 7: 33；米国特許第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；および5,661,016；Marks et al. (1992) Bio/Technology 10: 779；Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856；Morrison (1994) Nature 368: 812；Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnol. 14: 845；Neuberger (1996), Nature Biotechnol. 14: 826；ならびにLonbergおよびHuszar (1995), Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93を参照されたい)を包含する様々な技法によって作製され得る。
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、一方で鎖(単数または複数)の残りは別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体(免疫グロブリン)、ならびにかかる抗体のフラグメントを、それらが所望の生物活性を呈する限り、包含する(例として、米国特許第4,816,567；Morrison et al. (1984) PNAS USA, 81: 6851を参照されたい)。
「客観的奏効」は、完全奏効(CR)または部分奏効(PR)を包含する測定可能な応答を指す。
「部分奏効」は、処置に応答した、1以上の腫瘍または病変のサイズのまたは体内のがんの程度の減少を指す。
「患者」および「対象」は、がんの処置を必要とする哺乳動物を指すのに本明細書中で互換的に使用される。一般に、患者は、がんの1以上の症状を患うと診断されたかまたはそのリスクを持っている、ヒトである。ある態様において、「患者」または「対象」は、霊長目の非ヒト動物、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、マウス、またはラットなどの非ヒト哺乳動物、あるいは、例として薬物および治療をスクリーニングすること、特徴付けすること、および評価することにおいて使用される動物、を指してもよい。
ペプチドまたはポリペプチド配列に関する「パーセント(％)配列同一性」は、配列をアラインメントしおよび必要ならば最大限のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、および配列同一性の一部として保存的置換は何ら考慮しないものとする、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のでのアラインメントは、当技術分野における技能の範囲内の様々な手法で、実例として、BLAST、BLAST-2またはALIGNソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大限のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
「薬学的に許容し得る」とは、物質または組成物が、処方物を含む他の成分と、および/またはそれで処置される哺乳動物と、化学的におよび/または毒物学的に適合性でなければならないということを示す。「薬学的に許容し得る担体」は、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤等を包含する。薬学的に許容し得る担体の例は、を水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組み合わせのうちの、1以上を包含する。
HER2 Fcab-薬物抱合体の「薬学的に許容し得る塩」の形態は、ほとんどが、従来の方法によって調製することができる。本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体がカルボキシル基を含有する場合、その好適な塩の1つは、対応する塩基付加塩を与える好適な塩基と本発明の化合物を反応させることによって形成することができる。かかる塩基は、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化リチウムを包含するアルカリ金属水酸化物；水酸化バリウムおよび水酸化カルシウムなどのアルカリ土類金属水酸化物；アルカリ金属アルコキシド、例えばカリウムエトキシドおよびナトリウムプロポキシド；およびピペリジン、ジエタノールアミンおよびN-メチルグルタミンなどの様々な有機塩基である。
さらにまた、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の塩基性塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、鉄(III)、鉄(II)、リチウム、マグネシウム、マンガン(III)、マンガン(II)、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛塩を包含するが、しかしこれは、制限を表すことを意図するものではない。
上述の塩のうち、アンモニウム；アルカリ金属塩ナトリウムおよびカリウム、およびアルカリ土類金属塩カルシウムおよびマグネシウムが、好ましいものとされる。薬学的に許容し得る有機の非毒性の塩基に由来する本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の塩は、一級、二級および三級アミン、天然に存在する置換アミンも包含するものである置換アミン、環状アミン、および塩基性のイオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、クロロプロカイン、コリン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン(ベンザチン)、ジシクロヘキシルアミン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リドカイン、リシン、メグルミン、N-メチル-D-グルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミンおよびトリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン(トロメタミン)、の塩を包含するが、しかしこれは、制限を表すことを意図するものではない。
言及したとおり、HER2 Fcab-薬物抱合体の薬学的に許容し得る塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンとともに形成される。好ましい金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムである。好ましい有機アミンは、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、N-メチル-D-グルカミンおよびプロカインである。
本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の塩基付加塩は、遊離酸形態を充分な量の所望される塩基と接触させ、従来の様式で塩の形成を引き起こすことによって調製される。遊離酸は、塩形態を酸と接触させ、および従来の様式で遊離酸を単離することによって、再生成することができる。遊離酸形態は、極性溶媒への可溶性など、ある物理的特性に関しては、対応する塩形態とはある点で異なるが；本発明の目的では、しかしながら、塩はそれ以外の点ではその夫々の遊離酸形態に対応する。
「プロドラッグ」は、有効な分子を形成するように生体内へと迅速に切断されまたは遊離される、例えば、アルキルまたはアシル基(下のアミノ保護基およびヒドロキシル保護基もまた参照されたい)、糖またはオリゴペプチドを用いる手段によって修飾されている、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の誘導体を指す。これらはまた、例えばInt. J. Pharm. 115 (1995), 61-67において記載されているとおり、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の生分解性ポリマー誘導体を包含する。
「再発性の」がんは、外科手術などの初期治療に対する応答の後、初期部位または遠位部位のいずれかにて再成長したものである。局所的に「再発性の」がんは、これまでに処置されたがんと同じ場所に、処置後に再度戻るがんである。
症状(単数または複数)の「低減」(およびこの句の文法的に等価なもの)は、症状(単数または複数)の重症度または頻度を減少させること、または症状(単数または複数)の解消を指す。
「sFv」または「scFv」ともまた略される、「単鎖Fv」は、単一のポリペプチド鎖へと接続されたVHおよびVL抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。いくつかの態様において、sFvポリペプチドは、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするVHおよびVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。sFvの総括については、例として、Pluckthun(1994)、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore(編), Springer-Verlag, New York, pp. 269におけるものを参照されたい。
「溶媒和物」は、相互の引力によって形成される本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体への不活性な溶媒分子の付加を指す。溶媒和物は、例えば、一水和物または二水和物などの水和物、またはアルコール和物、すなわち、例えば、メタノールまたはエタノールとなどのアルコールとの付加化合物である。
「実質的に同一の」では、(1)対象アミノ酸配列に対して少なくとも75％、85％、90％、95％、99％または100％アミノ酸配列同一性を呈するクエリアミノ酸配列、または(2)対象アミノ酸配列のアミノ酸配列からのそのアミノ酸位置が20％以下、30％、20％、10％、5％、1％または0％異なり、ここでアミノ酸位置の違いがアミノ酸の置換、欠失または挿入のいずれかであるクエリアミノ酸配列、を意味する。
「全身性の」処置は、薬剤物質が血流を通じて移動し、体中のすべての細胞に到達しおよび影響する処置である。
HER2 Fcab-薬物抱合体の「治療的に有効な量」は、がんを持つ患者へ投与されたとき、意図した治療的効果、例として、患者におけるがんの1以上の兆候の緩和、回復、軽減または解消、または、がん患者を処置する過程におけるあらゆる他の臨床上の結果を有することになる、必要な投薬量および期間で有効な量を指す。治療的効果は、必ずしも1の用量によって起こるものではなく、および、一連の用量の後でのみ起こるものであってもよい。よって、治療的に有効な量は、1以上の投与にて施され得る。かかる治療的に有効な量は、個々の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個々において所望される応答を奏するHER2 Fcab-薬物抱合体の能力などの要因に従って変動し得る。
HER2 Fcab-薬物抱合体のあらゆる毒性または有害作用に治療的に有益な効果が勝るというものもまた、治療的に有効な量である。用語「有効量」は、組織、系、動物またはヒトにおいて、例えば、調査者または医者によって追求されまたは所望される、生物学的なまたは医学的な応答を引き起こすような医薬のまたは医薬活性化合物の量を示す。
加えて、用語「治療的に有効な量」は、その量を受けていない対応する対象と比較して以下の因果関係を有する量を示す：疾患、症候群、病状、愁訴、障害への改善された処置、治癒、予防または消滅、または副作用の予防、またはさらには疾患、愁訴または障害の進行の低減。用語「治療的に有効な量」はまた、正常な生理学的機能を増大させるのに有効である量も網羅する。
「処置すること」、あるいは疾病または患者「の処置」は、臨床上の結果を包含する有益なまたは所望の結果を得るための措置を取ることを指す。本発明の目的では、有益なまたは所望される臨床上の結果は、これらに限定されないが、がんの1以上の症状の緩和、回復；疾患の程度の小康化；疾患進行の遅延または減速；病状の回復、軽減、または安定化；または他の有益な結果を包含する。当然のことながら、「処置すること」または「処置」と言うときは、疾病の、確立された症状の予防法ならびに緩和を包含する。
状態、障害または疾病を「処置すること」またはその「処置」は、したがって、以下のことを包含する：(1)状態、障害または疾病に罹患しているかまたはその素因がある可能性があるがしかし未だ状態、障害または疾病の臨床症状または不顕性症状を経験していないまたは顕示させていない対象において発症する状態、障害または疾病の臨床症状の出現を予防するまたは遅延させること、(2)状態、障害または疾病を阻害すること、すなわち、疾患またはその再燃(維持療法のケースにおける)またはその少なくとも1の臨床症状または不顕性症状の発症を阻止する、低減させるまたは遅延させること、あるいは(3)疾患、すなわち、状態、障害または疾病を緩めるもしくは減弱させることまたはその少なくとも1の臨床症状または不顕性症状の後退を引き起こすこと。
「単位剤形」は、本明細書に使用されるときは、処置される対象のために適切な治療的処方物の物理的に不連続な単位を指す。しかしながら、本発明の組成物の一日毎の総使用量は、主治医によって穏健な医学的判断の範囲内で判断されるであろうということが理解される。あらゆる特定の対象または生物に対する具体的な有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；採用される具体的な活性薬剤の活性；採用される具体的な組成物；対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食生活；採用される具体的な活性薬剤の投与の時間、および排出速度；処置の持続時間； 採用される具体的な化合物(単数または複数)と組み合わせでまたは偶然同時に使用される薬物および/または追加の治療、および医学技術分野において周知である同様の要因を包含する様々な要因に依存することになる。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、夫々「VH」および「VL」と称されることもある。これらのドメインは、一般に抗体の最も可変性の部分(同じクラスの他の抗体に対して)であり、および抗原結合部位を含有する。
本明細書に使用されるとき、複数の項目、構造的な要素、構成的な要素、および/または材料が、利便性のために共通のリストで提示され得る。しかしながら、これらのリストは、リストの各メンバーが、別々のかつ一意のメンバーとして個別に識別されるかのように解釈されるべきである。
濃度、量、およびその他の数字で表したデータは、範囲のフォーマットで本明細書中に表現されまたは提示され得る。かかる範囲のフォーマットは、ただ単に利便性および簡潔さのために使用されているのであって、およびよって範囲の限度として明示的に述べられている数値を包含するのみならず、その範囲内に網羅されるすべての個々の数値または部分範囲をもまた各数値および部分範囲が明示的に述べられているかのように包含するものとして、柔軟に解されるべきであるということを理解されたい。例解として、「約1～約5」の数字で表した範囲は、約1～約5の明示的に述べられた値を包含するのみならず、示された範囲内の個々の値および部分範囲をもまた包含するものとして解されるべきである。よって、2、3、および4などの個々の値および1～3、2～4、および3～5等々、などの部分範囲、ならびに個々に1、2、3、4、および5が、この数字で表した範囲に包含される。この同じ原理は、最小または最大としての1の数値のみを述べている範囲にも適用される。さらにまた、かかる解釈は、範囲の広さまたは記載されている特徴を問わず適用されるべきである。
治療剤を発見および開発するとき、当業者は、所望のin-vitro特性を保ちながら薬物動態のパラメーターを最適化しようと試みる。薬物動態のプロファイルが劣っている多くの化合物は、酸化的代謝を受けやすいと仮定することが合理的である。目下のところ利用可能なin-vitro肝臓ミクロソームアッセイは、このタイプの酸化的代謝の過程についての貴重な情報を提供し、これは次にかかる酸化的代謝への耐性を通じて改善された安定性を持つ重水素化された本発明の化合物の合理的設計を可能にする。本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の薬物動態のプロファイルにおける有意な改善が、それによって得られ、ならびに、in-vivo半減期(T/2)、最大の治療的効果での濃度(Cmax)、用量応答曲線の下の面積(AUC)、およびFにおける増大という観点で；およびクリアランス、用量および材料のコストの低減という観点で、定量的に表現できる。
本発明はまた、生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法における使用のための本発明に従う少なくとも1のHER2 Fcab-薬物抱合体を含む医薬にも関する。
生理学的および/または病態生理学的状態は、例えば、疾患または病気および医学的な障害、愁訴、症状または合併症等、とりわけ疾患などの、医学的に関係のある生理学的および/または病態生理学的状態を意味するものと取られる。
本発明の好ましい態様は、過剰増殖性の疾患および障害からなる群から選択される生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法における使用のための、少なくとも1の本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体を含む、医薬である。
本発明のなおより好ましい態様は、過剰増殖性の疾患および障害からなる群から選択される、ここで、過剰増殖性の疾患または障害は、がんである、生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法における使用のための、本発明に従う医薬である。
本発明の別の好ましい態様は、がんが、急性および慢性のリンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、副腎皮質がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮頸部過形成、絨毛膜がん、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ性白血病、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、胆道がん、肝細胞癌、肝臓がん、食道がん、本態性血小板増加症、泌尿生殖器癌、神経膠腫、膠芽腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、ホジキン病、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド癌、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、悪性膵臓インスリノーマ、甲状腺髄様癌、黒色腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、菌状息肉種、骨髄性およびリンパ性白血病、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、原発性マクログロブリン血症、前立腺がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、皮膚がん、小細胞肺がん、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がんおよびウィルムス腫瘍、からなる群から選択される、がんの処置における使用のための、本発明に従う医薬である。
とりわけ、HER2と繋がりのある生理学的および/または病態生理学的状態が具体的に好ましいものとされる。よって、本発明は、HER2陽性がんの処置における使用のための、本発明に従う医薬に関する。
本明細書で言及されるがんは、胃部のがん、乳がん、大腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)、胃がん、または子宮内膜がんであってもよい。これらのがんはすべて、HER2を過剰発現することが示されている。好ましくは、がんは、胃部のがん、乳がん、または大腸がんである。より好ましくは、がんは、胃部のがんまたは乳がんである。好ましい一態様において、がんは、胃部のがんである。本明細書で言及される胃部のがんは、食道がんを包含する。別の好ましい態様において、がんは、乳がんである。がんのHER2遺伝子コピー数は、上に掲げられたとおりである。かかるがんは、HER2陽性(HER2+)またはHER2過剰発現と称され得る。よって、本明細書で言及されるがんは、HER2陽性であり得る。加えて、または代替的に、本明細書で言及されるがんは、HER2を過剰発現し得る。がんがHER2陽性であるかまたはHER2を過剰発現するかどうかは、例えば、まず免疫組織化学(IHC)を使用し、任意にこれに続き上で概説されたとおりのqPCRなどの方法を使用することにより、決定され得る。
さらなる好ましい態様は、乳がん、胃部のがん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮内膜がんまたは非小細胞肺がんを包含する固形がんの処置における使用のための本発明に従う医薬である。
上に開示された医薬は、上の生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法のための医薬の調製のための本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の対応する使用を包含するということが意図される。
加えて、上に開示された医薬は、上の生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法のための、本発明に従う少なくとも1のHER2 Fcab-薬物抱合体がかかる処置を必要とする患者へ投与される、対応する方法を包含するということが意図される。
従って、がんの処置のための本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の使用もまた、本発明の態様である。
従って、がんの処置のための医薬の製造のための本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の使用もまた、本発明の態様である。
従って、対象におけるがんを処置するための方法であって、対象へ本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体または医薬製剤を投与することを含む方法もまた、本発明の態様である。
従って、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体または医薬製剤をこれを必要とする対象へ投与することを含むがんの処置のための方法の使用もまた、本発明の態様である。
一態様において、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体は、ヒト対象の処置において使用される。HER2 Fcabと薬物との治療的組み合わせでの処置における主な期待される利益は、これらのヒト患者にとってのリスク/利益比の向上である。本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体の投与は、HER2 Fcabと薬物との組み合わせが、単一の治療剤単独での個々の投与と比較すると以下の改善された特性の1以上を提供し得るという点で、個々の治療剤よりも有利であり得る：i)最も活性な単一の薬剤よりも大きな抗がん効果、ii)相乗的なまたは高度に相乗的な抗がん活性、iii)低減された副作用プロファイルとともに増強された抗がん活性を提供する投薬プロトコル、iv)毒性効果プロファイルにおける低減、v)治療濃度域の増大、および/またはvi)治療剤の一方または両方のバイオアベイラビリティーの増大。
ある態様において、本発明は、過度のまたは異常な細胞増殖によって特徴付けられる疾患、障害、および疾病の処置を提供する。かかる疾患は、増殖性または過剰増殖性の疾患を包含する。増殖性および過剰増殖性の疾患の例は、がんおよび骨髄増殖性障害を包含する。
別の態様において、がんは、癌腫、リンパ腫、白血病、芽腫、および肉腫から選択される。かかるがんのより具体的な例は、扁平上皮細胞癌、骨髄腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、胃腸(管)がん、腎がん、卵巣がん、肝臓がん、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、前立腺がん、甲状腺がん、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、膠芽腫、子宮頸がん、脳がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸癌、胆道がん、および頭頸部がんを包含する。問題となる疾患または医学的な障害は、WO2015118175、WO2018029367、WO2018208720、PCT/US18/12604、PCT/US19/47734、PCT/US19/40129、PCT/US19/36725、PCT/US19/732271、PCT/US19/38600、PCT/EP2019/061558に開示されたもののいずれかから選択されてもよい。
一態様において、がんは、以下のものから選択される：虫垂がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、大腸がん、子宮内膜がん、食道がん(とりわけ食道扁平上皮細胞癌)、卵管がん、胃部のがん、神経膠腫(びまん性内因性橋神経膠腫など)、頭頸部がん(とりわけ頭頸部扁平上皮細胞癌および中咽頭がん)、白血病(とりわけ急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病)、肺がん(とりわけ非小細胞肺がん)、リンパ腫(とりわけホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫)、黒色腫、中皮腫(とりわけ胸膜悪性中皮腫)、メルケル細胞癌、神経芽細胞腫、口腔がん、骨肉腫、卵巣がん、前立腺がん、腎がん、唾液腺 腫瘍、肉腫(とりわけユーイング肉腫または横紋筋肉腫)、扁平上皮細胞癌、軟組織肉腫、胸腺腫、甲状腺がん、尿路上皮がん、子宮がん、膣がん、外陰がんまたはウィルムス腫瘍。
さらなる態様において、がんは、以下のものから選択される：虫垂がん、膀胱がん、子宮頸がん、大腸がん、食道がん、頭頸部がん、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺がん、前立腺がんおよび尿路上皮がん。さらなる態様において、がんは、子宮頸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん(とりわけ頭頸部扁平上皮細胞癌および中咽頭がん)、肺がん(とりわけ非小細胞肺がん)、リンパ腫(とりわけ非ホジキンリンパ腫)、黒色腫、口腔がん、甲状腺がん、尿路上皮がんまたは子宮がんから選択される。別の態様において、がんは、頭頸部がん(とりわけ頭頸部扁平上皮細胞癌および中咽頭がん)、肺がん(とりわけ非小細胞肺がん)、尿路上皮がん、黒色腫または子宮頸がんから選択される。
一態様において、ヒトは、固形腫瘍を有する。一態様において、固形腫瘍は、進行した固形腫瘍である。一態様において、がんは、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮細胞癌(SCCHNまたはHNSCC)、胃部のがん、黒色腫、腎細胞癌(RCC)、食道がん、非小細胞肺癌、前立腺がん、大腸がん、卵巣がんおよび膵臓がんから選択される。一態様において、がんは、以下のものからなる群から選択される：大腸がん、子宮頸がん、膀胱 がん、尿路上皮がん、頭頸部がん、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌、前立腺がん、食道がん、および食道扁平上皮細胞癌。
一側面において、ヒトは、以下のものの1以上を有する：SCCHN、大腸がん、食道がん、子宮頸がん、膀胱 がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、黒色腫、腎細胞癌(RCC)、食道扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、中皮腫(例として胸膜悪性中皮腫)、および前立腺がん。
別の側面においてヒトは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、多発性骨髄腫、慢性リンパ芽球性白血病、濾胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの液性腫瘍を有する。
いくつかの態様において、がんは、進行がんである。いくつかの態様において、がんは、転移性がんである。いくつかの態様において、がんは、再発性のがん(例として、再発性上皮性卵巣がん、再発性卵管がん、再発原発性腹膜がん、または再発性子宮内膜がんなどの再発性婦人科がん)である。一態様において、がんは、再発性であるかまたは進行している。
様々な態様において、本発明の方法は、第1、第2、第3、またはそれ以降の処置のライン(line of treatment)として採用される。処置のラインは、患者が受けた異なる薬またはその他の治療での処置の順序を指す。第1ラインの治療レジメンは、最初に与えられる処置であり、他方で第2または第3ラインの治療は、夫々第1ラインの治療の後または第2ラインの治療の後で与えられる。したがって、第1ラインの治療は、疾患または疾病のための第1の処置である。
がんの患者において、一次治療または一次処置と称されることも時々ある第1ラインの治療は、外科手術、化学療法、放射線治療、またはこれらの治療の組み合わせとすることができる。典型的には、患者がプラスの臨床転帰を示さなかったため、または第1または第2ラインの治療に対して不顕性の応答しか示さなかったため、またはプラスの臨床応答を示したもののしかし後に、時には初期のプラスの応答を奏した初期の治療に今度は耐性を持つようになった疾患を伴う、再燃を経験したため、のいずれかを理由として、患者はこれに続く化学療法レジメン(第2または第3ラインの治療)を受ける。
いくつかの態様において、がんの処置は、がんの第1ラインの処置である。一態様において、がんの処置は、がんの第2ラインの処置である。いくつかの態様において、処置は、がんの第3ラインの処置である。いくつかの態様において、処置は、がんの第4ラインの処置である。いくつかの態様において、処置は、がんの第5ラインの処置である。いくつかの態様において、がんの該第2ライン、第3ライン、第4ラインまたは第5ラインの処置に対する先立つ処置は、放射線治療、化学療法、外科手術または放射線化学療法の1つ以上を含む。
一態様において、先立つ処置は、パクリタキセル、nab-パクリタキセルまたはドセタキセルなどのジテルペノイド；ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンなどのビンカアルカロイド；シスプラチンまたはカルボプラチンなどの白金配位錯体；シクロホスファミド、メルファラン、またはクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルムスチンなどのニトロソ尿素；ダカルバジンなどのトリアゼン；ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン；ダウノルビシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン；ブレオマイシン；エトポシドまたはテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；フルオロウラシル、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、またはゲムシタビンなどの代謝体拮抗性抗新生物剤；メトトレキサート；イリノテカンまたはトポテカンなどのカンプトテシン；リツキシマブ；オファツムマブ；トラスツズマブ；セツキシマブ；ベキサロテン；ソラフェニブ；ラパチニブなどのErbBインヒビター、エルロチニブまたはゲフィチニブ；ペルツズマブ；イピリムマブ；ニボルマブ；FOLFOX；カペシタビン；FOLFIRI；ベバシズマブ；アテゾリズマブ；セリクレルマブ；オビヌツズマブまたはあらゆるそれらの組み合わせでの処置を含む。
一態様において、がんの該第2ライン、第3ライン、第4ラインまたは第5ラインの処置に対する先立つ処置は、イピリムマブおよびニボルマブを含む。一態様において、がんの該第2ライン、第3ライン、第4ラインまたは第5ラインの処置に対する先立つ処置は、FOLFOX、カペシタビン、FOLFIRI/ベバシズマブおよびアテゾリズマブ/セリクレルマブを含む。一態様において、がんの該第2ライン、第3ライン、第4ラインまたは第5ラインの処置に対する先立つ処置は、カルボプラチン/Nab-パクリタキセルを含む。一態様において、がんの該第2ライン、第3ライン、第4ラインまたは第5ラインの処置に対する先立つ処置は、ニボルマブおよび電気化学療法を含む。一態様において、がんの該第2ライン、第3ライン、第4ラインまたは第5ラインの処置に対する先立つ処置は、放射線治療、シスプラチンおよびカルボプラチン/パクリタキセルを含む。
一態様において、本発明の方法は、該ヒトへ少なくとも1の抗新生物薬剤またはがんアジュバントを投与することをさらに含む。本発明の方法はまた、がん処置のその他の治療的な方法とともに採用されてもよい。
典型的には、処置される感受性腫瘍などの腫瘍に対する活性を有するあらゆる抗新生物薬剤またはがんアジュバントが、本発明におけるがんの処置において共投与されてもよい。かかる薬剤の例は、V.T. Devita、T.S. Lawrence、およびS.A. Rosenberg(編集)によるCancer Principles and Practice of Oncology、第10版(12月 5日、2014)、Lippincott Williams ＆ Wilkins Publishersにおいて見出すことができる。
一態様において、ヒトは、これまでに1以上の異なるがん処置モダリティで処置されている。いくつかの態様において、がん患者集団における患者の少なくとも一部が、これまでに外科手術、放射線治療、化学療法または免疫療法などの1以上の治療で処置されている。いくつかの態様において、がん患者集団における患者の少なくとも一部が、これまでに化学療法(例として白金をベースとした化学療法)で処置されている。例えば、2のがん処置のラインを受けている患者は、2Lがん患者(例として2L NSCLC患者)として同定することができる。
いくつかの態様において、患者は、2のがん処置のラインまたはより多くのがん処置のラインを受けている(例として2L+子宮内膜がん患者などの2L+がん患者)。いくつかの態様において、患者は、これまでに抗PD-1治療などの抗体療法では処置されていない。いくつかの態様において、患者は、これまでに少なくとも1のがん処置のラインを受けている(例として、これまでに少なくとも1のがん処置のラインまたは少なくとも2のがん処置のラインを受けた患者)。いくつかの態様において、患者は、これまでに転移性がんのための少なくとも1の処置のラインを受けている(例として、転移性がんのための少なくとも1または2の処置のラインを受けた患者)。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、好ましくは、例に示されるとおり、酵素アッセイおよび動物実験において容易に実証することができる有利な生物活性を呈する。かかる酵素をベースとしたアッセイにおいて、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、好ましくは、大抵は好適な範囲、好ましくはマイクロモル範囲、およびより好ましくはナノモル範囲におけるIC50値によって記される阻害効果を呈しおよび引き起こす。
本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体は、とりわけ非化学的方法による、医薬製剤の調製のために使用することができる。このケースにおいて、それらは、固体、液体または半液体の賦形剤またはアジュバントと一緒に、および任意に1以上のさらなる活性化合物(単数または複数)と組み合わせて、好適な剤形にされる。
よって、本発明はさらに、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体を含む医薬製剤に関する。
本発明の別の態様において、この医薬製剤は、さらなる賦形剤および/またはアジュバントを含む。加えて、本発明に従う別の態様は、少なくとも1の本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体および少なくとも1のさらなる医薬活性化合物を含む、医薬製剤である。
本発明はさらに、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体が、固体、液体または半液体の賦形剤またはアジュバントと一緒に好適な剤形にされることを特徴とする、医薬製剤の調製のためのプロセスに関する。
本発明に従う医薬製剤は、ヒト医学または獣医学における医薬として使用することができ、およびヒトまたは動物の体の治療的な処置においておよび上述の疾患と戦うことにおいて使用することができる。患者または宿主は、いずれかの哺乳動物種、例えば霊長目の動物種、具体的にはヒト；マウス、ラットおよびハムスターを包含する齧歯類の動物；ウサギ；ウマ、畜牛、イヌ、ネコ等々に属し得る。動物モデルは、実験調査のための関心対象であり、それらはヒト疾患の処置のためのモデルを提供する。それらはさらにまた、診断用薬としてまたは試薬としても使用することができる。
好適な担体物質は、腸内(例えば経口)、非経口または局所投与のために好適であり、および新規化合物と反応しない、有機または無機物質、例えば、水、植物油(ヒマワリ油またはタラ肝油など)、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトースまたはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラノリンまたはワセリンである。当業者は、その専門知識により、所望される医薬処方物のためにいずれのアジュバントが好適であるかを熟知している。
溶媒、例えば水、生理食塩水溶液、または例えばエタノール、プロパノールまたはグリセロールなどのアルコール、グルコースまたはマンニトール溶液などの糖溶液、または、該溶媒、ゲル形成剤、錠剤補助剤および他の活性成分担体の混合物の他にも、例えば、潤滑剤、安定剤および/または湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、酸化防止剤、分散剤、消泡剤、緩衝物質、フレーバーおよび/またはアロマ、またはフレーバー補正剤、防腐剤、可溶化剤または色素もまた、使用することが可能である。所望であれば、本発明に従う製剤または医薬は、1以上のさらなる活性化合物、例えば1以上のビタミンを含んでもよい。
所望であれば、本発明に従う製剤または医薬は、1以上のさらなる活性化合物および/または1以上の作用エンハンサー(アジュバント)を含んでもよい。
用語「医薬製剤」および「医薬調製物」は、本発明の目的では、同義語として使用される。
ここで使用されるとき、「薬学的に忍容性である」は、医薬、沈殿試薬、賦形剤、アジュバント、安定剤、溶媒およびその他の薬剤であって、これから得られる医薬製剤の哺乳動物への投与を、例えば、吐き気、眩暈、消化問題または同種のものなどの望ましくない生理学的副作用なしに円滑化するものに関する。
非経口投与のための医薬製剤には、等張性、体水分正常性および忍容性、ならびに、処方物の(低い毒性)、採用されるアジュバントのおよび一次包装の安全性の要件がある。驚くべきことに、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、好ましくは、直接の使用が可能であるという利点を有し、および、例えば、高濃度の有機溶媒またはその他の毒物学的に許容し得ないアジュバントなどの、毒物学的に許容し得ない薬剤の除去のためのさらなる精製ステップは、よって、医薬処方物中における本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の使用の前には不必要である。
本発明は、殊更好ましくはまた、沈殿した非結晶の、沈殿した結晶の、または溶解または懸濁された形態にある少なくとも1の本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体、および、任意に、賦形剤および/またはアジュバントおよび/またはさらなる医薬活性化合物を含む、医薬製剤にも関する。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、好ましくは、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の不都合な望ましくない凝集が起こることなしに、高濃度に濃縮された処方物の調製を可能にする。よって、水性溶媒とともにまたは水性媒体中において、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の助けを借りて、高い活性成分含量を有するすぐに使用できる溶液を調製することができる。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体はまた、凍結乾燥することができ、および結果として生じる凍結乾燥物は、例えば、注射製剤の調製のために使用することができる。
水性の製剤は、水性溶液中に本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体を溶解させまたは懸濁させ、および任意にアジュバントを加えることによって、調製され得る。このために、定義された濃度で該さらなるアジュバントを含む定義された体積の原液は、有利なことに、定義された濃度の本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体を有する溶液または懸濁液へ加えられ、および混合物は、任意に、予め算出された濃度へ水で希釈される。代替的に、アジュバントは、固体形態で加えることもできる。各ケースにおいて必要な量の原液および/または水を、続いて、得られた水性溶液または懸濁液へ加えることができる。本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、本発明に従ってまた有利なことにすべてのさらなるアジュバントを含む溶液中に直接溶解させまたは懸濁させることもできる。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体を含み、および4～10のpHを有する、好ましくは5～9のpH、および250～350mOsmol/kgの重量オスモル濃度を有する溶液または懸濁液を、有利なことに、調製することができる。医薬製剤は、よって、実質的に疼痛なく、静脈内に、動脈内に、関節内に、皮下にまたは経皮的に、直接的に投与することができる。加えて、製剤はまた、例えば、グルコース溶液、等張の生理食塩水溶液またはRingerの溶液などの、注入溶液へ加えられてもよく、これはまたさらなる活性化合物を含有してもよく、よって相対的に多量の活性化合物が投与されることもまた可能にする。
本発明に従う医薬製剤はまた、本発明に従う複数のHER2 Fcab-薬物抱合体の混合物もまた含んでもよい。
本発明に従う製剤は、生理学的に十分に忍容性であり、調製が簡単であり、正確に分配でき、および好ましくは、保管および輸送および複数の凍結および解凍プロセスの間中全体を通して、アッセイ、分解産物および凝集物に関して安定である。それらは、好ましくは、安定した様式で少なくとも3月～2年の期間にわたって、冷蔵温度にて(2～8℃)および室温にて(23～27℃)および60％の相対大気湿度(R.H.)にて保管することができる。
例えば、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、乾燥することによって安定した様式で保管することができ、および必要とあれば溶解または懸濁によって即時使用できる医薬製剤へと変換することができる。考えられる乾燥方法は、例えば、これらの例に制限されることなしに、窒素ガス乾燥、真空オーブン乾燥、凍結乾燥、有機溶媒で洗浄することおよびこれに続く空気乾燥、液床乾燥、流体床乾燥、噴霧乾燥、ローラー乾燥、層乾燥、室温での空気乾燥およびさらなる方法である。
本発明に従う製剤または医薬の使用の際、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、一般に知られている市販製剤または製剤と類似して、好ましくは、使用単位当たり0.1～500mg、とりわけ5～300mgの間の投薬量で、使用される。毎日の用量は、好ましくは体重の、0.001～250mg/kg、とりわけ0.01～100mg/kgの間である。製剤は、1日当たり1回以上、例えば1日当たり2、3または4回、投与されることができる。しかしながら、患者のための個々の用量は、例えば、使用される特定の化合物の有効性に、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、栄養に、投与の時間および方法に、排出速度に、他の医薬との組み合わせに、および特定の疾患の重症度および持続時間になど、多数の個々の要因に依存する。
生体における医薬活性化合物の取り込みの尺度は、そのバイオアベイラビリティである。医薬活性化合物が、注射溶液の形態にて静脈内で生体へ送達される場合、その絶対的なバイオアベイラビリティ、すなわち、全身血液、すなわち大循環に、変化しない形態で到達する医薬の割合は、100％である。治療薬活性化合物の経口投与のケースでは、活性化合物は、一般に、処方物中では固体の形態であり、およびしたがって、それが侵入障壁、例えば胃腸管、口腔粘膜、鼻粘膜、または皮膚、とりわけ角質層、を乗り越えられるようにするために、または体に吸収されることができるようにするために、最初に溶解させられなければならない。薬物動態学についての、すなわちバイオアベイラビリティについてのデータは、J. Shaffer et al., J.Pharm. Sciences, 88 (1999), 313-318の方法と同様にして得ることができる。
さらにまた、このタイプの医薬は、薬学技術分野において一般に知られているプロセスの1つを用いる手段によって調製することができる。
医薬は、あらゆる所望される好適なルートを介しての、例えば経口の(口腔内または舌下を包含する)、直腸の、肺の、経鼻の、局所の(口腔内、舌下または経皮を包含する)、膣内または非経口の(皮下、筋肉内、静脈内、皮内およびとりわけ関節内を包含する)ルートによっての、投与のために適応されることができる。このタイプの医薬は、薬学技術分野において知られているすべてのプロセスを用いる手段によって、例えば、活性なHER2 Fcab-薬物抱合体を賦形剤(単数または複数)またはアジュバント(単数または複数)と組み合わせることによって調製することができる。
非経口投与は、好ましくは本発明に従う医薬の投与のために好適である。非経口投与のケースでは、関節内投与が、殊更好ましい。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体はまた、活性な化合物を徐放、持続的および/または制御放出させるように非経口的に投与される医薬の調製のためにもまた好適である。それらは、よって、投与が相対的に長い時間間隔でのみ必要になることから患者にとって有利であるような遅延放出の処方物の調製のためにもまた好適である。
非経口投与に適応された医薬は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および溶質であってこれを用いる手段によって処方物が処置されるレシピエントの血液または滑液と等張になるものを含む滅菌された注射溶液；ならびに、懸濁媒体および増粘剤を含むことができる水性のおよび非水性の滅菌された懸濁液を包含する。処方物は、単回用量または複数回用量の容器、例えばシールされたアンプルおよびバイアルにおいて送達されることができ、および、注射の目的で水などの滅菌されたキャリア液を使用の直前に加えることだけ必要であるように、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保管されることができる。処方に従った注射溶液および懸濁液は、滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体はまた、例えば、小さな単層ベシクル、大きな単層ベシクルおよび多重層ベシクルなどの、リポソーム送達系の形態で投与されてもよい。リポソームは、例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの、様々なリン脂質から形成されることができる。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体はまた、標的にされた医薬の賦形剤として可溶性ポリマーにカップリングされたものとすることもできる。かかるポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノールまたはポリエチレンオキシドポリリシンがパルミトイルラジカルによって置換されたものを、網羅することができる。本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、さらにまた、医薬の徐放を達成するために好適である生分解性ポリマーのクラス、例えばポリ乳酸、ポリ-イプシロン-カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロキシピラン、ポリシアノアクリル酸塩、ポリ乳酸-コ-グリコール酸、デキストランとメタクリラートとの間の抱合体などのポリマー、ポリホスホエステル、様々な多糖類およびポリアミンおよびポリ--カプロラクトン、アルブミン、キトサン、コラーゲンまたは修飾ゼラチン、および架橋されたかまたは両親媒性のヒドロゲルのブロックコポリマー、にカップリングされたものとすることができる。
腸内投与(経口のまたは直腸の)のために好適なものは、とりわけ、錠剤、糖衣錠、カプセル、シロップ、ジュース、点薬または坐薬であり、および局所使用のために好適なものは、軟膏、クリーム、ペースト、ローション、ゲル、スプレー、泡、エアロゾル、溶液(例えば、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール、アセトニトリル、DMF、ジメチルアセトアミド、1,2-プロパンジオールまたはそれらの互いとおよび/または水との混合物中の溶液)または粉末である。局所の使用のためにもまた殊更好適なものは、リポソーム製剤である。
軟膏を与えるための処方物のケースでは、活性化合物は、パラフィン性または水混和性のクリームベースのいずれかとともに採用することができる。代替的に、活性なHER2 Fcab-薬物抱合体は、水中油クリームベースまたは油中水ベースでの、クリームへと製剤化されることができる。
経皮的投与に適合された医薬は、レシピエントの表皮との長時間の密着のための独立した硬膏剤として送達されることができる。よって、例えば、活性なHER2 Fcab-薬物抱合体は、Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1986)に記載されているとおり、イオントフォレーシスを用いる手段によって、硬膏剤から供給されることができる。
言うまでもないことであるが、上で殊更言及された構成物質の他にも、本発明に従う医薬はまた、医薬処方物の特定のタイプに関して当該技術分野において通例である他の薬剤も含んでもよい。
本明細書に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体はまた、医薬処方物、医薬製剤、セットまたはキットの形態であってもよい。
本発明はさらに、
a) 有効量の少なくとも1の本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体、および
b) 有効量のさらなる医薬活性化合物
の別々のパックからなる、セット(キット)に関する。
セットは、箱またはカートン、個々の瓶、バッグまたはアンプルなどの好適な容器を含む。セットは、例えば、有効量の本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体および有効量のさらなる医薬活性化合物を溶解または凍結された形態で各々含有する、別々のアンプルを含んでもよい。
一態様において、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体は、2～6週間毎(例として2、3または4週、とりわけ3週)に1回投与される。一態様において、HER2 Fcab-薬物抱合体は、2週間毎に1回投与される(「Q2W」)。一態様において、HER2 Fcab-薬物抱合体は、3週間毎に1回投与される(「Q3W」)。一態様において、HER2 Fcab-薬物抱合体は、6週間毎に1回投与される(「Q6W」)。一態様において、HER2 Fcab-薬物抱合体は、2～6投薬サイクル(例として最初の3、4、または5投薬サイクル、とりわけ、最初の4投薬サイクル)の間Q3Wで投与される。
ある態様において、処置されるがんは、HER2陽性である。例えば、ある態様において、処置されるがんは、HER2+発現(例として、高いHER2発現)を呈する。例えばHER2などの、がんまたは腫瘍上のバイオマーカーを検出する方法は、当該技術分野において日常的であり、および本明細書において企図される。非限定例は、免疫組織化学、免疫蛍光および蛍光活性化セルソーティング(FACS)を包含する。
いくつかの態様において、HER2の高いがんを持つ対象または患者は、静脈内に抗HER2 Fcab-薬物抱合体を約1200mg Q2Wの用量で投与することによって処置される。いくつかの態様において、HER2の高いがんを持つ対象または患者は、静脈内にHER2 Fcab-薬物抱合体を約1800mg Q3Wの用量で投与することによって処置される。いくつかの態様において、HER2の高いがんを持つ対象または患者は、静脈内にHER2 Fcab-薬物抱合体を約2100mg Q3Wの用量で投与することによって処置される。いくつかの態様において、HER2の高いがんを持つ対象または患者は、静脈内に HER2 Fcab-薬物抱合体を約2400mg Q3Wの用量で投与することによって処置される。いくつかの態様において、HER2の高いがんを持つ対象または患者は、静脈内にHER2 Fcab-薬物抱合体nを約15mg/kg Q3Wの用量で投与することによって処置される。
ある態様において、処置されるがんは、腫瘍微小環境におけるアデノシンの上昇したレベルを有する。
ある態様において、投薬レジメンは、約0.01～3000mgの用量(例として、用量約0.01mg；用量約0.08mg；用量約0.1mg；用量約0.24mg；用量約0.8mg；用量約1mg；用量約2.4mg；用量約8mg；用量約10mg；用量約20mg；用量約24mg；用量約30mg；用量約40mg；用量約48mg；用量約50mg；用量約60mg；用量約70mg；用量約80mg；用量約90mg；用量約100mg；用量約160mg；用量約200mg；用量約240mg；用量約300mg；用量約400mg；用量約500mg；用量約600mg；用量約700mg；用量約800mg；用量約900mg；用量約1000mg；用量約1100mg；用量約1200mg；用量約1300mg；用量約1400mg；用量約1500mg；用量約1600mg；用量約1700mg；用量約1800mg；用量約1900mg；用量約2000mg；用量約2100mg；用量約2200mg；用量約2300mg；用量約2400mg；用量約2500mg；用量約2600mg；用量約2700mg；用量約2800mg；用量約2900mg；または用量約3000mg)で抗HER2 Fcab-薬物抱合体を投与することを含む。
いくつかの態様において、用量は、約500mgの用量である。いくつかの態様において、用量は、約1200mgである。いくつかの態様において、用量は、約2400mgである。いくつかの態様において、HER2 Fcab-薬物抱合体の用量は、約0.001～100mg/kg(例として、用量約0.001mg/kg；用量約0.003mg/kg；用量約0.01mg/kg；用量約0.03mg/kg；用量約0.1mg/kg；用量約0.3mg/kg；用量約1mg/kg；用量約2mg/kg；用量約3mg/kg；用量約10mg/kg；用量約15mg/kg；または用量約30mg/kg)である。
本明細書に開示のすべての固定された用量は、80kgの参照体重に基づく体重用量に匹敵するとみなされる。従って、2400mgの固定用量に言及するとき、30mg/kgの体重用量も、同じくそれとともに開示される。
本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体での処置に加えて、かつ患者の健全さのために必要とみなされる併用療法が、処置医の裁量で与えられてもよい。いくつかの態様において、本発明は、化学療法、放射線治療または化学放射線療法などの追加の治療とともにHER2 Fcab-薬物抱合体をこれを必要とする患者へ投与することを含む、本明細書に記載の1以上の疾患または障害の重症度または進行を処置、安定化または減少させる方法を提供する。
一態様において、パクリタキセル、nab-パクリタキセルまたはドセタキセルなどのジテルペノイド；ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビノレルビンなどのビンカアルカロイド；シスプラチンまたはカルボプラチンなどの白金配位錯体；シクロホスファミド、メルファラン、またはクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルムスチンなどのニトロソ尿素；ダカルバジンなどのトリアゼン；ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン；ダウノルビシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン；ブレオマイシン；エトポシドまたはテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；フルオロウラシル、ペメトレキセド、メトトレキサート、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、またはゲムシタビンなどの代謝体拮抗性抗新生物剤；メトトレキサート；イリノテカンまたはトポテカンなどのカンプトテシン；リツキシマブ；オファツムマブ；トラスツズマブ；セツキシマブ；ベキサロテン；ソラフェニブ；ラパチニブ、エルロチニブまたはゲフィチニブなどのerbBインヒビター；ペルツズマブ；イピリムマブ；トレメリムマブ；ニボルマブ；ペンブロリズマブ；FOLFOX；カペシタビン；FOLFIRI；ベバシズマブ；アテゾリズマブ；セリクレルマブ；オビヌツズマブまたはあらゆるそれらの組み合わせ(単数/複数)がさらに投与される。
一態様において、放射線治療が、HER2 Fcab-薬物抱合体と並行または連続してさらに施される。いくつかの態様において、放射線治療は、全身性放射線治療、外部ビーム放射線治療、画像誘導放射線治療、トモセラピー、定位放射線外科手術、体幹部定位放射線治療、および陽子線療法からなる群から選択される。いくつかの態様において、放射線治療は、外部ビーム放射線治療、内部放射線治療(小線源療法)、または全身性放射線治療を含む。例として、Amini et al., Radiat Oncol.「Stereotactic body radiation therapy (SBRT) for lung cancer patients previously treated with conventional radiotherapy: a review」9:210 (2014)；Baker et al., Radiat Oncol.「A critical review of recent developments in radiotherapy for non-small cell lung cancer」11(1):115 (2016)；Ko et al., Clin Cancer Res「The Integration of Radiotherapy with Immunotherapy for the Treatment of Non?Small Cell Lung Cancer」(24)(23) 5792-5806；および、Yamoah et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys「Radiotherapy Intensification for Solid Tumors: A Systematic Review of Randomized Trials」93(4): 737-745 (2015)を参照されたい。
いくつかの態様において、放射線治療は、外部ビーム放射線治療を含み、および、外部ビーム放射線治療は、強度変調放射線治療(IMRT)、画像誘導放射線治療(IGRT)、トモセラピー、定位放射線外科手術、体幹部定位放射線治療、陽子線療法、または他の荷電粒子ビームを含む。
いくつかの態様において、放射線治療は、体幹部定位放射線治療を含む。
本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の他に、本発明に従う医薬製剤はまた、さらなる医薬活性化合物、例えばがんの処置における使用のための他の抗腫瘍医薬をもまた含んでもよい。言及された他の疾患の処置のために、本発明に従う医薬製剤はまた、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体の他に、その処置の技術分野における当業者に知られているさらなる医薬活性化合物も含んでもよい。
一態様において、方法は、抗体と組み合わせてまたはこれと交代で宿主へ本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体を投与することを含む。特定の下位態様において、抗体は、治療用抗体である。具体的な一態様において、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体と組み合わせてまたはこれと交代で1以上の受動抗体を投与することを含む、受動的抗体治療の有効性を増強させる方法が提供される。この方法は、がんなどの異常細胞増殖性の障害の処置のための抗体療法の有効性を増強させることができ、または、感染性疾患の処置または予防において治療の有効性を増強させることができる。本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体は、例えばリツキシマブ、ハーセプチンまたはアービタックスなどの抗体と組み合わせてまたはこれと交代で投与されることができる。
主たる別の態様では、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体を、実質的に別の抗がん剤の不在下において、これを必要とする宿主へ投与することを含む、異常な細胞増殖を処置または予防する方法が提供される。
主たる別の態様では、実質的に第1の抗がん剤と組み合わせて宿主へ第1の本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体を投与することおよび続いて第2のHER2 Fcab-薬物抱合体を投与することを含む、これを必要とする宿主における異常な細胞増殖を処置または予防する方法が提供される。1の下位態様では、第2のHER2 Fcab-薬物抱合体は、実質的に別の抗がん剤の不在下で投与される。主たる別の態様において、実質的に第1の抗がん剤と組み合わせて宿主へ本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体を投与することおよび続いてHER2 Fcab-薬物抱合体の不在下で第2の抗がん剤を投与することを含む、これを必要とする宿主における異常な細胞増殖を処置または予防する方法が提供される。
よって、ここに開示されたがん処置は、本発明の HER2 Fcab-薬物抱合体での治療として、または手術、照射または化学療法と組み合わせて実施することができる。このタイプの化学療法は、抗腫瘍活性化合物の以下のカテゴリーの1以上の活性化合物の使用を包含することができる：
(i)アルキル化活性化合物(例えばシスプラチン、パルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファンおよびニトロソ尿素)；代謝拮抗薬(例えば、5-フルオロウラシルおよびテガフールなどの葉酸拮抗薬、フッ化ピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素およびゲムシタビン)；抗腫瘍抗生物質(例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン-C、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンなどのアントラサイクリン)；抗有糸分裂活性化合物(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、および、タキソールおよびタキソテールなどのタキソイド)；トポイソメラーゼインヒビター(例えば、エトポシドおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカンおよびカンプトテシンなどのエピポドフィロトキシン)および細胞分化活性化合物(例えば全トランス型レチノイン酸、13-cis-レチノイン酸およびフェンレチニド)などの、医学的腫瘍学において使用されるとおりの抗増殖性/抗新生物/DNA損傷活性化合物およびそれらの組み合わせ；
(ii)抗エストロゲン薬(例えばタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン)、エストロゲン受容体調節因子(例えば フルベストラント)、抗アンドロゲン薬(例えば ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン)、LHRHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト(例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン)、プロゲステロン(例えば酢酸メゲストロール)、アロマターゼインヒビター(例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボロゾールおよびエキセメスタン)、およびフィナステリドなどの5-レダクターゼのインヒビターなどの、細胞増殖抑制性の活性化合物；
(iii)例えばマリマスタットのようなメタロプロテイナーゼインヒビター、およびウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能のインヒビターを包含する、がん浸潤を阻害する活性化合物；
(iv)成長因子機能のインヒビター、例えば成長因子抗体、成長因子受容体抗体、例えば抗erbb2抗体トラスツズマブ[ハーセプチン(商標)]および抗erbbl抗体セツキシマブ[C225]、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビターおよびセリン/?トレオニンキナーゼインヒビター、例えば上皮成長因子ファミリーのインヒビター(例えば、N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6- (3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(ゲフィチニブ、AZD1839)、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン(エルロチニブ、OSI-774)および6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(CI 1033)などのEGFRファミリーチロシンキナーゼインヒビター)、例えば血小板由来成長因子ファミリーのインヒビター、および、例えば、肝細胞成長因子ファミリーのインヒビター；
(v)ベバシズマブ、アンギオスタチン、エンドスタチン、リノミド、バチマスタット、カプトプリル、軟骨由来のインヒビター、ゲニステイン、インターロイキン12、ラベンダスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、組換えヒト血小板因子4、テコガラン、トロンボスポンジン、TNP-470、抗VEGFモノクローナル抗体、可溶性VEGF-受容体キメラタンパク質、抗VEGF受容体抗体、抗PDGF受容体、インテグリンのインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、セリン/トレオニンキナーゼインヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、siRNA、抗VEGFアプタマー、色素上皮由来因子および国際特許出願WO97/22596、WO97/30035、WO97/32856およびWO98/13354)に公開されている化合物などの血管新生阻害活性化合物；
(vi)国際特許出願WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434およびWO02/08213に公開されているコンブレタスタチンA4および化合物などの血管破壊剤；
(vii)アンチセンス療法、例えば抗RasアンチセンスであるISIS 2503など、上に言及された標的へ向けられたもの；
(viii)例えば、異常なp53または異常なBRCA1またはBRCA2などの異常な修飾された遺伝子の置き換えのためのアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌のニトロレダクターゼ酵素を使用するものなどのGDEPTアプローチ(遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法)、および、多剤耐性治療などの化学療法または放射線治療に対する患者の耐性を増大させるアプローチなどを包含する、遺伝子治療アプローチ；および
(ix)例えば、インターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクションなどの患者の腫瘍細胞の免疫原性を増大させるためのex-vivoおよびin-vivoアプローチ、T細胞アネルギーを減少させるためのアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞などのトランスフェクトされた免疫細胞を使用したアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞の使用のためのアプローチ、および抗イディオタイプの抗体の使用のためのアプローチ、を包含する免疫療法アプローチ
(x)例えばアバレリックス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、BCG生、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラントおよびゲムシタビンを包含する化学療法剤。
表1からの医薬は、好ましくは、排他的にではないが、本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体と組み合わせることができる。
本開示は、本明細書に記載のHER2 Fcab-色素抱合体を使用した診断的、予測的、予後的および/または治療的な方法をさらに提供する。かかる方法は、少なくとも部分的には、関心のあるバイオマーカーの発現レベルの同一性の決定に基づく。とりわけ、がん患者試料におけるHER2のいずれか1つの量は、患者が本発明の治療的な組み合わせを利用したがん治療に好ましく応答しそうであるかどうかを予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。
よって、本発明の別の態様は、式Fcab-(L)m-(La)nを含むHER2 Fcab-標識抱合体であり、式中：
a) Fcabは、HER2 Fcabを含み、
b) Lは、リンカーを含み、
c) Laは、標識を含み、
d) mは、1～5の整数であり、および、nは、1～10の整数である。
本発明の好ましい態様において、mは、1～3であり、および、nは、1～5である。
本発明はまた、本発明に従うHER2 Fcabが、標識を加えることによって修飾されて標識付きHER2 Fcab抱合体を生じた、HER2 Fcab-標識抱合体にも関する。標識は、潜在的な立体障害を低減させるために様々な長さのスペーサー/リンカーを介してHER2 Fcabへカップリングされることができる。リンカーは、本発明に従うHER2 Fcab-薬物抱合体について上に記載されたとおりのものと同じであることができる。
用語「標識」または「標識基」は、あらゆる検出可能な標識を指す。例示的な標識は、これらに限定されないが、放射性同位体または放射性核種(例として、3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)などの、放射性同位体もしくは重同位体であり得る同位体標識；磁性標識(例として、磁性粒子)；酸化還元活性部分；蛍光基(例として、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、化学ルミネセンス基、および「小分子」フルオロフォアまたはタンパク性のフルオロフォアのいずれとすることもできるフルオロフォアなどの光学色素(これらに限定されないが、発色団、蛍光体およびフルオロフォアを包含する)；酵素基(例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、～-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)；ビオチン化された基；または、二次レポーター (例として、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ、等々)によって認識される予め決められたポリペプチドエピトープ、を包含する。
本発明の好ましい態様は、標識が、同位体標識、磁性標識、酸化還元活性部分、光学色素および酵素基からなる群から選択される、本発明のHER2 Fcab-標識抱合体である。
本発明のさらに好ましい態様は、標識がpHAb色素である、本発明のHER2 Fcab-標識抱合体である。
本発明に従うと、標識はまた、抗体の精製および単離の助けになるアフィニティータグなどのタグとすることもできる。かかる追加のドメインの非限定例は、Mycタグ、HATタグ、HAタグ、TAPタグ、GSTタグ、キチン結合ドメイン(CBDタグ)、マルトース結合タンパク質(MBPタグ)、Flagタグ、Strepタグおよびそのバリアント(例としてStrepIIタグ)およびHisタグとして知られるペプチドモチーフを含む。
よって、本発明のさらに好ましい態様は、標識がタグである、本発明のHER2 Fcab-標識抱合体である。
本発明の別の態様は、本発明に従うHER2 Fcab-標識抱合体を含有する診断用組成物である。
あらゆる好適な試料を、方法のために使用することができる。かかるものの非限定例は、針生検、コア生検および針吸引から単離されたものとすることができる、血清試料、血漿試料、全血、膵液試料、組織試料、腫瘍ライセートまたは腫瘍試料の1以上を包含する。例えば、組織、血漿または血清試料は、処置の前に、および任意に本発明の治療的な組み合わせで処置した際に、患者から取られる。処置した際に得られる発現レベルは、患者の処置を開始する前に得られた値と比較される。得られる情報は、がん治療に対して患者の応答が好ましかったか好ましくなかったかを示すことができるという点で、予後的であり得る。
本明細書に記載の診断アッセイを使用して得られる情報は、単独で、あるいは、これらに限定されないが、他の遺伝子の発現レベル、臨床化学的パラメーター、組織病理学的パラメーター、または対象の年齢、性差および重量などのその他の情報と組み合わせて、使用されてもよいということが理解される。単独で使用されるとき、本明細書に記載の診断アッセイを使用して得られる情報は、処置の臨床転帰を決定または同定すること、処置する患者を選択すること、または患者を処置すること、等々において有用である。他方で、他の情報と組み合わせて使用されるとき、本明細書に記載の診断アッセイを使用して得られる情報は、処置の臨床転帰の決定または同定の助けになること、処置する患者の選択の助けになること、または患者の処置の助けになること等において有用である。具体的な側面において、発現レベルは、最終的な診断、予後、または患者のために選択される処置に各々寄与する診断パネルにおいて使用することができる。
バイオマーカータンパク質または他の好適なバイオマーカーレベルについてのリードアウトを測定するためには、あらゆる好適な方法を夫々使用することができ、その例は、本明細書に記載されており、および/または当業者に周知である。
いくつかの態様において、バイオマーカーレベルを決定することは、バイオマーカー発現を決定することを含む。いくつかの態様において、バイオマーカーレベルは、患者試料中のバイオマーカータンパク質濃度によって、例として、抗体または特異的結合パートナーなどのバイオマーカー特異的リガンドを用いて、決定される。結合事象は、例として、競合的または非競合的方法によって検出することができ、これは、結合事象について標識付きタンパク質と競合する、標識付きリガンドまたはバイオマーカー特異的部分、例として、抗体、または、標識付きバイオマーカー標準を包含する標識付きの競合部分の使用を包含する。バイオマーカー特異的リガンドが、バイオマーカーを複合体を形成することを可能とする場合、複合体形成は、試料中のバイオマーカー発現を示すことができる。
様々な態様において、バイオマーカータンパク質レベルは、定量的ウエスタンブロット、複合型イムノアッセイフォーマット、ELISA、免疫組織化学法、組織化学法を含む方法、または、腫瘍ライセートのFACS分析、蛍光免疫染色、ビーズに基づく懸濁イムノアッセイ、ルミネックス技術、もしくは近接ライゲーションアッセイの使用によって決定される。一態様において、バイオマーカー発現は、バイオマーカーを特異的に結合させる1以上の一次抗体を使用した免疫組織化学法によって決定される。
しかしながら、本発明の好ましい態様においては、本発明に従うHER2 Fcab-標識抱合体が、細胞、オルガノイド、血清試料、血漿試料、全血、膵液試料、組織試料、腫瘍ライセートまたは腫瘍試料中におけるHER2タンパク質の発現を決定するために使用される。
一態様において、本発明の治療的な組み合わせの有効性は、腫瘍試料中におけるHER2発現を用いる手段によって予測される。
本開示はまた、患者から単離された試料中におけるHER2のタンパク質レベルを決定するための手段、および取扱説明を含む、本発明の組み合わせが、がん患者の治療的な処置のために好適であるかどうかを決定するためのキットも提供する。本発明の一側面において、高いHER2レベルの決定は、患者が本発明のHER2 Fcab-薬物抱合体で処置されたときの増大したPFSまたはOSを示す。キットの一態様において、バイオマーカータンパク質レベルを決定するための手段は、バイオマーカーへの特異的結合を伴う抗体である。
さらなる態様がなくても、当業者は最も広い範囲において上の記載を使用することができるであろうということが仮定される。好ましい態様は、したがって、ただ単に、絶対的にいかなるやり方によっても限定するものでもない記述的開示とみなされるべきである。
本明細書に引用された全ての参考文献は、本発明の開示において参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料が本発明の実践または試験において使用することができるが、好適な例を、下に記載している。例の中において、(実際的な場合には常に)汚染活性のない標準的な試薬および緩衝剤が使用される。例は、殊更、それらは明示的に実証された特色の組み合わせに限定されないが、例示された特色を本発明の技術的課題が解決されることを前提として制限なく再び組み合わせてもよいというように解釈されたい。同様に、いずれかの請求項の特色を、1以上の他の請求項の特色と組み合わせることができる。要約にておよび詳細に説明してきた本発明を、以下の例によって例解するが、これらによって限定されるものではない。
別様に明記されない限り、パーセントデータは重量による百分率を示す。すべての温度は、セ氏の度で表示される。「従来のワークアップ」：最終産物の構成に依存して、水を、必要ならば加え、pHを、必要ならば、2～10の間の値へ調整し、混合物を、酢酸エチルまたはジクロロメタンで抽出物し、相を分離し、有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過しおよび蒸留し、および、産物を、シリカゲル上のクロマトグラフィーによっておよび/または結晶化によって精製する。
シリカゲル上のRf値；質量分析: EI(電子衝撃イオン化): M+、FAB(高速原子衝撃法): (M+H)+、THF(テトラヒドロフラン)、NMP(N-メチルピロリドン)、DMSO(ジメチルスルホキシド)、EA(酢酸エチル)、MeOH(メタノール)、TLC(薄層クロマトグラフィー)
略語の一覧
AUC 血漿薬物濃度-時間曲線の下の面積
Cmax 最大血漿濃度
CL クリアランス
CV 変動係数
CYP シトクロムP450
DMSO ジメチルスルホキシド
F バイオアベイラビリティー
fa 吸収率
iv 静脈内
LC-MS/MS 液体クロマトグラフィータンデム質量分析
LLOQ 定量下限
NC 算出されていない
ND 決定されていない
PEG ポリエチレングリコール
Pgp 透過性糖タンパク質
PK 薬物動態(単数または複数)
po Per os(経口)
t1/2 半減期
tmax 薬物の最大血漿濃度に到達する時間
UPLC 超高速液体クロマトグラフィー
Vss 分布の体積(定常状態で)
v/v 体積対体積
例
例1: Fcabおよび対照の調製
HER2に対するナノモル以下～2桁のナノモルの結合親和性を持つ3の異なるFcabを文献から選択した：STAB5、STAB1927、および臨床候補のFS10224。ADCの生成のためのFcabを調製するために、種々異なる構築物を設計した(表1)。部位特異的バイオコンジュゲーションのために、STAB5およびSTAB19スキャフォールドを、位置D265Cでのシステイン残基の組み込みによって改変した28(S5-C265、S19-C265)。トランスグルタミナーゼ媒介性バイオコンジュゲーション(S5-NLLQGA、S5-NG4S-LLQGA、S5-CG4S-LLQGA、S5-C(G4S)2-LLQGA)を可能にするNおよびC末端のトランスグルタミナーゼ認識タグ(LLQGA29)の遺伝子融合には、STAB5スキャフォールドを選んだ。その上、FcγRI、II、III受容体結合によって媒介される効果を回避するために、すべてのFcabバリアント(S5-C265、S19-C265を除く)内にエフェクターサイレンシング突然変異(D265A30,31)を組み込んだ。32
これに続くスフェロイド浸透アッセイのための対照として、全長150kDa STAB5バリアント(α-HEL-S5)を、Fcabスキャフォールド上へと遺伝的に融合された無関係の抗鶏卵リゾチーム(HEL)Fabフラグメントを用いて設計した。その上、ネイティブなヒトFc(huFc)をベースとした陰性対照(huFc、huFc-C265、huFc-NLLQGA、huFc-NG4S-LLQGA)およびトラスツズマブ-IgG(T-IgG)およびFab(T-Fab)参照構築物を設計した。すべてのタンパク質は、Expi293F細胞において発現させ、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製した(図6および図7)。Fcabの発現収量は、huFc対照と比較して低減した(平均収量: 54mg/L対330mg/L)(図8)。C末端がタグ付けされたバリアントS5-CG4S-LLQGAおよびS5-C(G4S)2-LLQGAは、タンパク質濃縮ステップの間に凝集したので、さらなる実験からは除外された。すべての他のバリアントは、ゲル電気泳動(SDS-PAGE)(図9)および分析的なサイズ排除クロマトグラフィー(SE-HPLC)(図10)を介して確認された高い純度を示した。すべてのバリアントの同一性は、質量分析(LC-MS)によって確認した(図12)。バリアントは、以下のセクションに記載のとおりpHAb色素またはMMAEを介してさらに官能化させられた。
例2: Fcabおよび対照抗体のpHAb色素との抱合
選択したFcabバリアントおよび対照を、それらの細胞取り込みおよびスフェロイド浸透プロファイルを研究するために、鎖間システイン(S5-pHAb、S19-pHAb、FS-pHAb、huFc-pHAb、T-IgG-pHAb、α-HEL-S5-pHAb)または改変されたシステイン(T-Fab-pHAb)への部位特異的カップリングを介してpHセンサー蛍光色素(pHAb色素35)で標識した。pHAb色素は、中性のpHでは蛍光ではないが、しかし内在化後のエンドソームのおよびリソソームのベシクル内に存在する酸性のpHでは高度に蛍光になる。35 生成されたpHAb色素抱合体は、UV-VIS分光法により判定して1.8～2.5の間の範囲にある定義された標識度(DOL)を有していた。pHAb色素標識付き構築物の詳細な概観は、図14に与えられている。
例3: pHAb色素抱合体の腫瘍細胞内への細胞取り込み
これまでに、STAB19、STAB5およびFS102が、トラスツズマブとは異なるHER2エピトープへ結合することは説明されていた。23,24 これは、選択されたFcabの内在化、リソソーム輸送およびADCの細胞傷害性に影響を及ぼし得ることから、我々は、HER2陽性BT-474、SKBR-3、HCC-1954に対しておよびHER2陰性MDA-MB-468腫瘍細胞に対して、pH感受性のpHAb色素抱合体の細胞取り込みプロファイルを調べた。T-IgG-pHAbおよびT-Fab-pHAbを、陰性対照としてのhuFc-pHAbとともに、これらの実験に包含させた。pHAb色素標識付き構築物を接着細胞上で24hの間インキュベートし、および、2h毎に記録した細胞画像のpHAb色素蛍光の増大から細胞取り込み動態を導出した(図15A)。続いて、蛍光強度を、細胞数、および各構築物のpHAb色素DOL値に対して正規化し(図2A)、および線形フィットさせた(図15B)。
その結果得られる正規化された細胞内蓄積率を、次いで、最も高い率(SKBR-3に対するS5-pHAb)に対して相対的に表現した(図2B)。すべてのFcab-pHAb色素抱合体は、内在化およびエンドソームのトラフィッキングを示す選択的な細胞内蓄積を示しており、それによってADCアプローチの前提条件に見合っている。認められる細胞内蓄積は、S5-pHAb(KD＝2.25nM)について最も顕著であり、T-Fab-pHAb(KD＝0.12nM)、S19-pHAb(KD＝46.6nM)、T-IgG-pHAb(KD＝0.18nM)およびFS-pHAb(KD＝0.34nM)がこれに続いた。S19-pHAbのS5-pHAbと比較して低減した細胞内蓄積は、このアッセイで使用した未飽和抗体濃度(100nM)での標的エンゲージメントの低減を反映し、これは高いHER2結合親和性と上昇した細胞取り込みとの間の相関関係を示す。
直観に反して、バリアントFS-pHAbは、受容体結合における高い親和性が記載されていながらも低減した細胞内蓄積を示した。これは、次いで連続する内在化サイクルでは不在になる、表面表出HER2の密度を低下させると報告されていた24、FS102によって引き起こされる著しいHER2分解に起因するものであり得る。HER2欠乏はまた、細胞内蓄積率の時間依存的な低減によっても支持される(図2A)。T-Fab-pHAbと比較したS5-pHAbのより高い細胞内蓄積は、エピトープに駆り立てられる、あるいは、増強されたエンドソームHER2解離(koff、pH7.4 2.61・10-3 s-1 対 0.13・10-3 s-1)からの結果としてもたらされるものであり得、リソソーム内へのS5-pHAbの侵入を可能にする一方で、受容体に結合したT-Fab-pHAbが再利用される。36,37 HER2高発現細胞におけるトラスツズマブの高い再利用率もまた、文献に記載されている。38
2の受容体が、2の標識付きT-Fab、Fcabs、または1の二価のT-IgG-pHAbの、いずれによっても結合されることができることを考慮すると、T-IgG-pHAbとT-Fab-pHAbまたはS5-pHAbとの間の違いは、フルオロフォア標識での受容体占有率が低減したことに起因した可能性がある。これを踏まえると、T-IgG-pHAbの相対的細胞内蓄積は、T-Fab-pHAbまたはS5-pHAbと比較しておよそ50%低減された。リソソームのトラフィッキングもまた、発現した表面受容体の相対的な数に依存するものであり得、それについては以下の序列SKBR-3＞HCC-1954＞BT-474が報告されている。38 要約すれば、これらの結果は、この研究において使用されたHER2-Fcabが、ADCの応用のために要求される効率的な細胞内蓄積を可能にするということを実証する。
例4: Fcab-薬物抱合体の生成
数件の報告は、抱合部位がADCの安定性および治療的活性へ及ぼす影響を実証している。39-41 したがって、Fcabのリンカー-薬物の抱合のための種々異なる部位および抱合技法を評価した(表2、図3Aおよび図16)。これのために、グリシン(Gly3)ハンドル(1、図3B)を持つ十分に確立された切断可能なバリン-シトルリンリンカー(Val-Cit)微小管インヒビターMMAE構築物を、N末端での遺伝的に融合されたLLQGAタグへまたはCH2ドメイン中のネイティブなQ29542へのいずれかへ、微生物トランスグルタミナーゼ(mTG)を介して抱合させた(表2)。加えて、位置D265Cへのシステイン抱合28を、マレイミドカプロイル(mc)ハンドル(2、図3B)を抱えているVal-Cit-MMAEを用いて行った(表2)。
凝集が存在しないことを、分析SE-HPLCによって確認し(表2および図17A)、および、薬物抗体比(DAR)を、逆相(RP-HPLC、図17B)および疎水性相互作用クロマトグラフィー(HI-HPLC、図17C)ならびにLC-MSデータ(図18および図19)から決定した(表2)。1の、N末端に連結されたLLQGAタグへの抱合は、N297がグリコシル化されているときにIgGスキャフォールドにおいてネイティブなQ295を認識しないことが報告されたS. mobaraensisからの野生型mTGを適用することによって達成された。43 驚くべきことに、Fcabスキャフォールドは、DAR 2.0を超える上昇したDARを示しており(S5-NLLQGA-MMAE DAR 2.4、S5-NG4S-LLQGA-MMAE DAR 3.0)(表2)、これは追加のグルタミン残基がS. mobaraensisのmTGを介してカップリングされたということを示す。
この位置を同定するための努力はなされなかった。1の、グリコシル化されたN297の存在下でのネイティブなQ295への抱合については、我々は、近年記載されたとおりの遺伝的に改変されたmTG42を使用して、DAR 2.0～2.2を持つ均一な産物を得た(S5-Q295-MMAE、S19-Q295-MMAE、FS-Q295-MMAEおよびhuFc-Q295-MMAE)(表2)。位置D265Cでのシステイン抱合は、修飾されていないhuFc対照(DAR 1.8)と比較してFcab(S5-C265-MMAE DAR 1.5、S19-C265-MMAE DAR 1.1)に対して効率が低かった。MMAEなどの疎水性のペイロードの抱合は、典型的には分子の全体的な疎水性を増大させる。これは、タンパク質凝集によって構築物の安定性に影響を及ぼす可能性があり、および正常な細胞による望ましくない非特異的な取り込みを加速させる。32 DAR 2.0薬物抱合体ピークおよび抱合されていない親分子の保持時間(tR)から全体的な疎水性を見積もるために、HI-HPLCを行った(表2)。親Fcab分子は、親huFc(tR 10.35～10.63min)と比較してより高い疎水性(tR 13.22～16.49min)を示した。従って、Fcab-薬物抱合体の全体的な疎水性も同様に上昇した(tR 14.39～19.55min対huFc抱合体tR 12.33～18.05min)。
その上、HI-HPLC相対保持時間(RRT)を、疎水性のペイロードの遮蔽を特徴付けるために算出することができる。42,44 同様のRRTを、Q295およびC265にカップリングされたFcab-薬物抱合体(RTT 1.04～1.12)について測定し、MMAEがこれらの構築物において充分に遮蔽されたということを示した(表2)。huFcおよびS5の抱合体tRおよびRRT増大は、位置Q295＜D265C＜N末端LLQGA＜N末端G4S-LLQGAで増大し、位置Q295は最も効率的な遮蔽および全体的に最も低減された疎水性を提供するということが示唆される。秀でた抱合の収率および産物の均一性(DAR 2.0～2.2)とともに、位置Q295は、Fcab-薬物抱合体の生成のために好ましいものと見受けられる。
例5: 薬物抱合体の受容体結合特性
MMAEなどの疎水性のペイロードの抱合が、Fcab-薬物抱合体のそれらの標的HER2またはFcRn受容体に対する結合挙動を変化させるかどうかを評価するために、組換えHER2またはFcRnに対するFcabのおよび対照の抱合体の解離定数(KD)を、バイオレイヤー干渉法(BLI)を介して決定し、およびそれらの抱合されていない親バリアントと比較した(表3、図20～23)。45 HER2ならびにFcRn両方について、解離定数は抱合の影響を受けなかった。
例6: 薬物抱合体の血清安定性
薬物抱合体の薬物動態は、FcRn結合に依存するのみならず、抱合安定性によってもまた影響され、それについて顕著な抱合部位依存性が記されている。39-41 血清中の薬物抱合安定性を評価するために、我々は、Fcab-薬物抱合体を、トラスツズマブをベースとした薬物抱合体とともに、マウスおよびヒト血清中でインキュベートし、および、LC-MS/MSを介した遊離MMAEの検出によってペイロード放出をモニタリングした(表4、図24)。ヒト血清中においては、すべての抱合体について遊離MMAEは測定されなかった。位置Q295またはD265C上にVal-Cit-MMAEを抱えたバリアントについて、マウス血清中において同様の高い安定性が測定され、これは、Q295抱合部位が全長ADCへの高い安定性を付与するというこれまでの報告41,42,46と合致する。
興味深いことに、S5-NLLQGA-MMAE(9.6％)およびS5-NG4S-LLQGA-MMAE(34.8％)は、おそらく血清プロテアーゼのアクセスを促進するN末端での溶媒に曝露された位置に起因して、MMAE放出の上昇を示した。本明細書において、Val-Citリンカーが、マウス血清中においてマウスの細胞外カルボキシルエステラーゼ1c(mCes1c) 47によって媒介される切断を受けることができるということ、および、抱合部位41またはリンカー設計47,48のいずれかが切断を防止することができたということは、十分に記載されている。MMAE放出の上昇およびより高い溶媒への曝露はまた、N末端が連結されたMMAE構築物のより高いHI-HPLC RRTにも反映され得る(表2)。44
例7: In vitro細胞傷害性
生成されたFcab-薬物抱合体が細胞内にMMAEを選択的に送達しおよび効率的に放出するかどうかを検査するために、MMAE抱合体を、HER2過剰発現(SKBR-3、HCC-1954)およびHER2陰性(MDA-MB-468)細胞株上でインキュベートした(図4および図25)。Fcab-薬物抱合体(DAR 1.1～3.0)を、T-IgG-Q295-MMAE(DAR 2.0)およびT-Fab-C183,C205-MMAE(DAR 1.8)参照抱合体およびhuFc-MMAE(DAR 1.4～2.2)ならびに抱合されていないFcab陰性対照とともに評価した。すべてのFcab-薬物抱合体およびトラスツズマブをベースとした対照抱合体は、ナノモル以下～2桁のナノモル濃度の範囲にわたるIC50値を伴ってHER2陽性細胞に対しての選択的な細胞傷害性を実証し(図4A)、他方でHER2陰性細胞に対しては大きく低減した細胞傷害性(IC50＞100nM)が測定された(図25)。これに反して、huFc-MMAE陰性対照は、より高い濃度でわずかのみの細胞傷害効果を示し(IC50＞100nM)、および抱合されていないFcabは、SKBR-3、HCC-1954またはMDA-MB-468細胞に対する何らの細胞傷害効果も媒介しなかった(図25)。
S5およびS19をベースとしたMMAE抱合体は、より低いHER2親和性と相関するT-IgGおよびT-Fab MMAE抱合体と比較して10～100倍低減した効能を示した(表3および図4B)。FS-Q295-MMAEは、高い効能(IC50 0.18nM)を示すが、しかし、SKBR-3細胞に対しての細胞生存率の低減がより低く(78％対他の構築物については87～95％)、これは、細胞傷害性の用量のペイロードに細胞が曝露されることを防ぐような、その報告されているHER2受容体分解が原因で起こるものであり得る(図4C)。概して、これらの結果は、Fcab-薬物抱合体が、選択的細胞死滅に起因して安全かつ効果的である見込みがあるということ、および、親和性を調整することがin vitro 細胞傷害性に重大な影響を及ぼすということを実証する。
例8: pHAb色素抱合体を使用した3D腫瘍スフェロイド浸透研究
動物モデルにおける有効性を見積もるには、in vitro細胞傷害性データは、追加的な効果を考慮する必要があることから誤解がある可能性がある。例えば、Nessler et al.は、様々な単一ドメイン抗体-薬物抱合体について、固形腫瘍異種移植モデルでのin vitro効能、生体内分布およびin vivo有効性への標的受容体親和性の影響を評価した。16 ナノモル以下の受容体親和性およびより低いin vitro効能を持つ構築物は、直観に反して、より高いin vivo有効性を示した。生体内分布プロファイルは、バリアントのより低い親和性が、腫瘍浸透およびin vivo活性を増大させるということを示した。16 したがって、Fcab-薬物抱合体は、より高い親和性の完全サイズのADCバリアントと比較して上昇した固形腫瘍浸透を示し得ると推測したくなるものである。
in vitroで腫瘍浸透を予見するために、我々は細胞の腫瘍スフェロイド浸透モデルを確立した。これのために、再現性のあるサイズで丸いスフェロイドを形成するHER2陽性BT-474およびHER2陰性HCC-1937細胞株を同定するための細胞スクリーニングを行った(図26)。浸透実験のために、共焦点顕微鏡法を、それらの好ましいシグナル対バックグラウンド比に起因してpHAb色素抱合体(FS-pHAb、S5-pHAb、S19-pHAb、huFc-pHAb、T-IgG-pHAb、T-Fab-pHAb、α-HEL-S5-pHAb)と一緒に適用した。35 スフェロイド浸透を定量化するために、共焦点顕微鏡画像のラジアルプロファイルプロットからの平均浸透距離(MPD)の算出を可能にした新規な分析ストラテジーを適用した(詳細は材料および方法のセクション、図27および図28において見出すことができる)。
標的親和性の分布および細胞取り込みへの影響を研究するために、HER2を過剰発現するBT-474スフェロイド上でT-Fab-pHAb、FS-pHAb、S5-pHAb、S19-pHAbおよびhuFc-pHAbをインキュベートし、および、細胞内蓄積された構築物の分布を、共焦点顕微鏡法を介した蛍光測定によって分析した(図5A)。高親和性のT-Fab-pHAb(KD 0.12nM)は、腫瘍スフェロイドの周辺に蓄積された(MPD 54±2μm)。この制限された蓄積は、スフェロイドの中心へ向かう輸送に対抗してさらなる浸透を防ぐ広範な結合および内在化 － 文献において「結合部位障壁(binding site-barrier)」として記載されている所見18,49によって引き起こされた可能性が高い。これを踏まえると、より低い親和性のバリアントS5-pHAb(KD 2.25nM)およびS19-pHAb(KD 46.60nM)は、T-Fab-pHAbと比較してより均一な分布および上昇したMPD(69±2μmおよび63±4μm)を示した。
対照的に、FS-pHAbは、その高親和性(KD＝0.34nM)にもかかわらず、最も均一な分布および最も高いMPD(78±3μm)を示した。FS-pHAbによって媒介される受容体分解は、エンドサイトーシスクリアランスの低減(より低い細胞内蓄積シグナル、図5C)へ繋がり得、それによってスフェロイド浸透を改善し得る。FS-pHAb以外では、S5-pHAbは最も高いMPD(69±2μm)を示しており、これらのアッセイにおいて1桁のナノモルの結合親和性が顕著な細胞内蓄積およびスフェロイド浸透のために有益であるものと見受けられることが示される。重要なことには、pHAb色素抱合体はいずれもHER2陰性HCC-1937スフェロイド上に何らのシグナルも示さなかった。huFc-pHAbは、BT-474スフェロイド上にもまたシグナルを示さなかった。
標的結合親和性の他にも、流体力学半径が、腫瘍スフェロイド浸透に影響を及ぼす。したがって、50kDaのFcab分子S5-pHAbの浸透プロファイルを、T-Fab-pHAbおよびT-IgG-pHAb対照とともに、その150kDaの誘導体α-HEL-S5-pHAbと比較した(図5Bおよび5C)。期待どおり、α-HEL-S5-pHAb(MPD 63±2μm)と比較して、より小さいサイズのS5-pHAbは、BT-474スフェロイド中へとより深く浸透した(MPD 69±2μm)(図5D)。二価の150kDaのT-IgG-pHAb参照抱合体(MPD 48±2μm)は、一価の50kDaのT-Fab-pHAb(MPD 54±2μm)と比較してより顕著な結合部位障壁効果を示しており、これはアビディティー効果に起因して細胞のHER2に対する親和性が上昇したことを示唆する。
まとめると、微調整されたより低い親和性、より小さいサイズおよび固有の受容体分解機構からの結果としてもたらされた、T-Fab-pHAbおよびT-IgG-pHAbと比較して改善されたS5-pHAb、S19-pHAbおよびFS-pHAbの改善された浸透能力が実証された。この効果がin vivoでより良好な有効性に転換されるかどうかは、血漿クリアランスおよび腫瘍組織溢出などの追加の効果を考慮して慎重に設計した動物モデルにおいて調べる必要がある。
例9: 材料および方法
プラスミド生成
抗体フラグメントのアミノ酸配列は、文献から抜粋され(STAB527、STAB1927、FS10224、huFc23、トラスツズマブ-Fab50)、および表1に規定されているとおりに修飾されている。明確さのために、アミノ酸配列を、SIでも与えている。修飾された配列を含有するpTT5プラスミドを、哺乳動物での発現のためのコドン最適化されたバージョンとしてGeneArt(Thermo Fisher Scientific)からオーダーした。
抗体フラグメントの調製
FcabおよびhuFc対照は、Life Technologiesからの対応するトランスフェクションキットおよび培地を使用して製造業者の取扱説明に従いExpi293F(商標)細胞における重鎖(加えてT-Fabのケースでは軽鎖)の一過的なトランスフェクションによって発現させた。上清を、トランスフェクションの5日後に収集した。T-Fabは、精製のためのHis6タグを含有しており、および、AEKTA Pureデバイス(GE Healthcare)を使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(1mL HisTrap(商標) HP、GE Healthcare)の前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS) pH7.4に対して終夜透析した。FcabおよびhuFc対照は、HiTrap(商標) Mab Select SuRe 5mLカラム(GE Healthcare)を使用してプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、および続いてHiPrep(商標) 26/10脱塩カラムを使用してPBS pH6.8中で製剤化した。
抗体純度を、TSKgel(登録商標) SuperSW3000カラム(Tosoh Bioscience)を使用した分析SE-HPLCによっておよびSDSゲル電気泳動によって分析した。タンパク質の同一性は、TripleTOF(登録商標) 6600+質量分析計(AB Sciex)を使用したLC-MSによるインタクト質量分析を介して確認した。抗体フラグメントを、Ultra遠心式フィルターユニット(3K MWCO、Amicon(登録商標))を使用して濃縮し、滅菌濾過し、およびタンパク質濃度をUV-VIS分光法によって280nmで決定した。抗体フラグメントは、液体窒素中で瞬間冷凍し、および-80℃で保管した。
pHAb色素抱合体の調製
チオールカップリングのために、抗体および抗体フラグメントを、DPBS中の2.5mM DTT、1mM EDTA、pH7.0を用いて25℃、450rpmにて1.5hの間還元した。DPBS、1mM EDTA、pH7.0で平衡化されたZeba(商標) Spin脱塩カラムによってDTTを除去した。2.0モル当量(pHAb：抗体)のpHAbチオール反応性色素(10mg/mL 1:1 (v/v) DMSO/H2O、Promega)を、還元された抗体および抗体フラグメントに加え、および光の不在下で25℃、450rpmにて3hの間インキュベートした。未反応のpHAb色素は残っておらず、および、DOL値は製造業者の取扱説明書に従ってUV-VIS分光法によって決定することができた。
MMAE抱合体の調製
トランスグルタミナーゼ抱合：mTGに媒介される抗体抱合を、10％までのDMSOを伴うPBS pH6.8中の、5mg/mLの抗体または抗体フラグメント、20当量の薬物-リンカー、および、Q295に対する抱合については60U/mLの遺伝的に改変されたmTG(自社製42)、またはLLQGAタグに対する抱合については6U/mLのS. mobaraensis由来mTG(Zedira)、との反応において査定した。mTGの活性(U/mL)を、ZediXclusive微生物トランスグルタミナーゼ(Zedira)測光アッセイを使用して決定した。抗体フラグメントは調製したものをそのまま使用し、トラスツズマブは薬局から購入し(ハーセプチン)、および薬物-リンカーGly3-Val-Cit-PAB-MMAE(1)はLevenaから購入した。反応混合物を18hの間37℃にて緩やかな振盪とともにインキュベートし、10℃まで冷却し、および分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した(図S10)。
システイン抱合：抗体フラグメントを、PBS pH7.4、1mM EDTA中の5mg/mLの最終濃度へ希釈し、および、37℃にて2hの間、過剰な40当量のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)で部分的に還元した。2の連続した5mL HiTrap(商標)脱塩カラム(GE Healthcare)を介してTCEPを除去し、および還元された抗体フラグメントを25℃にて2hの間、20当量のデヒドロアスコルビン酸で再酸化した。この混合物へ、8当量のmc-Val-Cit-PAB-MMAE(2)(Levena)を加え、および25℃にて1hの間インキュベートしてから、25当量のN-アセチルシステイン(25℃にて15min)を加えることによって反応を停止させ、および分取SECによって精製した。
ランニングバッファーとしてPBS pH6.8を用いて1260液体クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies)またはAEKTA Avantデバイス(GE Healthcare)においてSuperdex(商標) 200 Increase 10/300 GL、Superdex(商標) 75 10/30 GLまたはSuperdex(商標) 200 prep grade 16/60カラムのいずれかを使用して分取SECを行った。精製された抱合体を、Ultra遠心式フィルターユニット(10K MWCO、Amicon(登録商標))を使用して濃縮し、滅菌濾過し、およびタンパク質濃度をUV-VIS分光法によって280nmで決定した。精製された 抱合体を、別の場所に記載されているとおり42、SE-HPLCおよびDAR決定(HIC、RP、LC-MS)による分析に供し、液体窒素中で瞬間冷凍し、および-80℃で保管した。
細胞培養
ヒトがん細胞株をAmerican Type Culture Collectionから取得し(HER2陽性: BT-474、HCC-1954、SKBR-3；HER2陰性: HCC-1937、MDA-MB-468)、および標準的な培養条件(37℃、5％ CO2、95％ 湿度)に従って維持した。10％ウシ胎仔血清(FBS)、2mM L-グルタミンおよび1mMピルビン酸ナトリウムが添加されたDMEM高グルコース培地中で、SKBR-3細胞を培養した。10％ FBS、2mM L-グルタミンおよび1mMピルビン酸ナトリウムが添加されたRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培地中で、HCC-1954、HCC-1937およびMDA-MBA-468を培養した。10％ウシ胎仔血清(FBS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび10μg/mLインスリンが添加されたHam F12培地中で、BT-474細胞を培養した。継代培養のために、接着した成長済みの細胞を、0.05％トリプシン-EDTAを加えることによって剥離させ、新鮮な培地で希釈し、および新しい培養フラスコ内へと移した。
細胞取り込みアッセイ
適切な数の細胞を、5minの間500×gにて遠心分離した。上清を捨て、および細胞を、フェノールレッドなしで夫々の培地中に、200,000vc/mLで再懸濁させた。細胞懸濁液(40μL/ウェル)を、黒色384透明底プレート内へと播種し、これに続き湿ったチャンバー内で終夜インキュベーションを行った(37℃、5％ CO2)。pHAb色素構築物に0.3％ Tween-20(最終)を添加し、3μMへ希釈し、およびD300eデジタルディスペンサー(Tecan)を使用してトリプリケートで細胞へ加えた(最終100nM)。細胞を、即時に、DAPIおよびRFPフィルターキューブおよびBioSpa 8自動化インキュベーター(BioTek)を備えたCytation 5細胞イメージングリーダー(BioTek)へ移した。明視野(対物: 10x、LED強度: 10、積分時間: 13ミリ秒、カメラゲイン: 24)およびRFPチャネル画像(ex.: 531nm、em.: 593nm、LED強度: 10、積分時間: 60ミリ秒、カメラゲイン: 24)は、24hの期間にわたって2h毎に撮った。
24h測定の約30min前、プレートをBioSpa 8デバイスから取り外し、および1μg/mL Hoechst 33342色素を、Tecan D300eデジタルディスペンサーを介して追加の24hエンドポイントDAPI核染色画像のために加えた。画像を、BioTek gen5データ分析ソフトウェアによって処理した。各画像の、合計pHAb色素蛍光強度(RFPチャネル)を、DAPIチャネルにおいて決定された細胞の数に対して正規化し、および0hでのRFPチャネルシグナル(バックグラウンドシグナル)によって減算した。細胞数およびバックグラウンドで正規化された強度を、各構築物のpHAb色素DOL値によって除算し、および時間に対してプロットした。データをGraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)における線形回帰によってフィットさせ、および細胞内蓄積率(勾配)を導出した。最終的に、最も高い細胞内蓄積率に基づき相対的細胞内蓄積(％)を各構築物について算出した。
FcRnおよびHER2結合
速度論的結合パラメーターを、30℃および1,000rpmの攪拌スピードにてOctet(登録商標) RED96システム(Forte´Bio、Pall)を使用したBLIによって決定した。
FcabバリアントのHER2結合分析のために、T-Fabおよびそれらの抱合体(分析物)、抗マウスIgG Fc捕捉バイオセンサー(AMC)に、マウスFc-HER2ダイマー(20μg/mLでDPBS中に希釈された、自社製)を360sの間ロードした。バイオセンサーを、次いでキネティクスバッファー(PBS pH7.4、0.02％ Tween-20および0.1％ウシ血清アルブミン)中へと移しおよび45sの間インキュベートし、分析物への会合ステップがこれに続いた。分析物は、200nM～3.13nMで変化させた濃度範囲においてキネティクスバッファー中に希釈した。会合を180sまたは240sの間モニタリングし、konおよびkoff値を決定するためのキネティクスバッファー中での480sの間の解離ステップがこれに続いた。分析物を、陰性対照および参照測定としての役割があるキネティクスバッファーによって置き換えた。夫々の非結合ヒトFcフラグメントを、各実験における陰性対照として使用した。
データをフィッティングするために抗体測定値から緩衝剤の参照測定値(対照曲線)を差し引き、および、動態パラメーターを、Savitzky-Golay濾過の後で1:1包括的フルフィット結合モデルを適用してForte´Bioデータ分析ソフトウェア12.0を使用して決定した。T-IgGおよびそのMMAE抱合体のHER2結合分析には、アビディティー効果を回避するために、分析物としてモノマーHER2-His6(Novoprotein)を使用したリバースアッセイセットアップを選択した。60sのDPBSにおけるベースラインステップの後で、抗体(DPBS中の10μg/mL)を、抗ヒトIgG Fc捕捉バイオセンサー(AHC)上に60sの間ロードし、45sのキネティクスバッファーステップがこれに続いた。420sの間のキネティクスバッファー中における最終的な解離ステップの前に、HER2-His6(50 - 0.78nM)(キネティクスバッファー中に希釈された)の会合を180sの間モニタリングした。緩衝剤の参照測定を包含させ、およびデータは前述のとおりに処理した。
FcRn結合アッセイは、公開されたForte´Bioアプリケーションノートから適合させた。45 ベースライン、会合および解離ステップを、リン酸ナトリウム緩衝剤(100mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.05％ Tween-20、pH6.0)中で行った。同じ緩衝剤を、分析物およびリガンドの希釈のために使用した。ストレプトアビジンバイオセンサーを使用し、および、60s ベースラインステップから開始してセンサーグラムを10Hzで記録してから、ビオチン化FcRn-His6(自社製)(2μg/mL)を120sの間捕捉した。続いて、Fcab、T-IgGおよびそれらの夫々のMMAE抱合体の会合を、60sの間、変化させた濃度(1μM～15.63nM)で測定し、これに続き60sの間解離させた。
リガンド解離の主要因となるため、分析物の会合を省略したロードされたバイオセンサーでの参照測定を各ランに包含させた。センサーチップへの非特異的結合を差し引くために、ロードされていない参照バイオセンサーで再度アッセイをランした。参照測定および参照センサーのラン(二重の参照)を差し引いた後、Savitzky-Golay濾過を行い、およびデータを、1:1包括的部分解離モデルを使用してフィットさせた。典型的な二相解離に起因して、解離ステップは、当初の速い解離速度をカバーするために4sについてのみフィットさせた。45
血清安定性
血清安定性アッセイを、少しの改変を適用してこれまでに記載されたとおりに実施した42：MMAE抱合体を、ヒトおよびマウス血清中における5μMの最終濃度の抱合されたMMAE(各構築物のDARを考慮)でインキュベートした。その上、血清試料に、内部標準として5μMの重水素化されたD8-MMAEを添加した。
細胞傷害性アッセイ
Fcab-MMAE抱合体および関連する化合物の評価のために、40μLの生存細胞懸濁液を不透明384ウェルプレート(SKBR-3: 6000vc/ウェル、HCC-1954: 3500vc/ウェル、MDA-MB-468: 2500vc/ウェル)内へと播種し、これに続き湿ったチャンバー内で終夜インキュベーションを行った(37℃、5％ CO2)。D300eデジタルディスペンサー(Tecan)を使用して、試験化合物を加えた。遊離MMAEおよびタンパク質/タンパク質抱合体溶液に0.3％ Tween-20(最終)を添加し、および6μM(MMAE)または10μM(タンパク質)へ希釈した。すべてのウェルを、加えたTween-20の最大量に対して正規化させた。製造業者の取扱説明に従ってCell Titer Glo試薬(Promega)を使用して4d後に細胞生存率を決定した。発光値を、処置されていない細胞の発光に対して正規化し、および用量-応答を、GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)の非対称(5パラメーター)フィッティング機能を使用してフィットさせた。
スフェロイド浸透アッセイ
スフェロイド形成のために、BT-474またはHCC-1937細胞をそれらの適切な媒体中に希釈し、および黒色透明/丸底384ウェルプレート(Corning)内へと播種した(2,000vc/ウェル；40μL)。プレートを、4minの間660×gで遠心分離させ、180°回転させ、およびウェルの中央にある細胞を中心に集めるためにさらに4minの間660×gで遠心分離させた。スフェロイドを形成させるために、湿ったチャンバー内で細胞を37℃、5％ CO2にて96hの間インキュベートした。pHAb色素構築物に0.3％ Tween-20(最終)を添加し、3μMへ希釈し、およびD300eデジタルディスペンサー(Tecan)を使用してレプリケート(n＝8)にて細胞へ加えた(最終50nM)。光の排除の下、湿ったチャンバー内でBT-474およびHCC-1937スフェロイドを37℃、5％ CO2にて24hの間インキュベートした。画像は、Leica TCS SP8 共焦点レーザー走査顕微鏡(20x対物、励起: 535nm、放射: 560～610nm、レーザーパワー: 20、ゲイン: 500)で撮った。
ラジアルプロファイルプロットを、未処理の画像から、ImageJにおけるラジアルプロファイルプロットプラグインを使用して作り出し51(図S20)、および、各構築物のpHAb色素DOL値に対して正規化させた。平均浸透距離を、ImageJ データから以下の方程式によって算出し、ここでのradnは、μmでのスフェロイドの半径であり、radiは、μmでのスフェロイドの範囲内の同心円の半径であり、およびintiは、半径radiの円上の正規化された積分強度である。
例10: 注射バイアル
3lの再蒸留水中の100gの本発明の抱合体および5gのリン酸水素二ナトリウムの溶液を、2N塩酸を使用してpH6.5へ調整し、滅菌条件下で濾過し、注射バイアル内へと移し、滅菌条件下で凍結乾燥し、および滅菌条件下でシールした。各注射バイアルは、5mgの本発明の抱合体を含有する。
例11: 溶液
溶液は、940mlの再蒸留水中の1gの本発明の抱合体、9.38gのNaH2PO4 2H2O、28.48gのNa2HPO4 12H2Oおよび0.1gの塩化ベンザルコニウムから調製される。pHは6.8へ調整され、および溶液は、1lになるように作製され、および照射によって滅菌される。
例12: アンプル
60lの再蒸留水中の1kgの本発明の抱合体の溶液を、滅菌条件下で濾過し、アンプル内へと移し、滅菌条件下で凍結乾燥し、および滅菌条件下でシールした。各アンプルは、10mgの本発明の抱合体を含有する。
例13: 発現したタンパク質のアミノ酸配列
1. Fcab
配列番号1: S5(ネイティブなQ295)
配列番号2: S5-C265
配列番号3: S5-NLLQGA
配列番号4: S5-NG4S-LLQGA
配列番号5: S5-CG4S-LLQGA
配列番号6: S5-C(G4S)2-LLQGA
配列番号7: S19(ネイティブなQ295)
配列番号8: S19-C265
配列番号9: FS(ネイティブなQ295)
追加の試験されたHER2 Fcab配列
追加の公的に利用可能なHER2 Fcab配列
CH3 ABループ(薄い灰色)およびCH3 EFループ(濃い灰色)を伴うhuFcフラグメント
配列番号12: H242-9(10.1093/protein/gzq005から抜粋)
配列番号13: STAB1(10.1093/protein/gzs102から抜粋)
配列番号14: STAB11(10.1093/protein/gzs102から抜粋)
配列番号15: STAB14(10.1093/protein/gzs102から抜粋)
配列番号16: STAB15(10.1093/protein/gzs102から抜粋)
2. 参照および対照分子
配列番号17: T-Fab(K183C、V205C)
配列番号18: huFc(ネイティブなQ295)
配列番号19: huFc-C265
配列番号20: huFc-NLLQGA
配列番号21: huFc-NG4S-LLQGA
α-HEL-S5
配列番号22: 軽鎖:
配列番号23: 重鎖:
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(56) Baggethun, P. Radial Profile Plot for ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/plugins/radial-profile.html (accessed Apr 28, 2020).

Claims (15)

  1. 式Fcab-(L)m-(D)nを含み、式中：
    e) Fcabは、HER2 Fcabを含み、
    f) Lは、リンカーを含み、
    g) Dは、薬物を含み、
    h) mは、1～5の整数であり、および、nは、1～10の整数である、HER2 Fcab-薬物抱合体またはその薬学的に許容し得る塩。
  2. HER2 Fcabが、配列番号1～16に掲げるとおりのアミノ酸配列を有する、S5(ネイティブなQ295)、S5-C265、S5-NLLQGA、S5-NG4S-LLQGA、S5-CG4S-LLQGA、S5-C(G4S)2-LLQGA、S19(ネイティブなQ295)、S19(ネイティブなQ295)、FS(ネイティブなQ295)、αH-H10(Q295)、αH-H10C265(D265C)、H242-9、STAB1、STAB11、STAB14およびSTAB15からなる群から選択される、請求項1に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体。
  3. 式Fcab-(L)m-(La)nを含み、式中：
    e) Fcabは、HER2 Fcabを含み、
    f) Lは、リンカーを含み、
    g) Laは、標識を含み、
    h) mは、1～5の整数であり、および、nは、1～10の整数である、HER2 Fcab-標識抱合体。
  4. 少なくとも1の請求項1または2に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体を含む、医薬製剤。
  5. 賦形剤および/またはアジュバントをさらに含む、請求項4に記載の医薬製剤。
  6. 少なくとも1の請求項1または2に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体、および、少なくとも1のさらなる医薬活性化合物を含む、医薬製剤。
  7. 請求項1または2に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体が、固体、液体または半液体の賦形剤またはアジュバントと一緒に好適な剤形にされることを特徴とする、医薬製剤の調製のためのプロセス。
  8. 少なくとも1の請求項3に記載のHER2 Fcab-標識抱合体を含む、診断用組成物。
  9. 生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法における使用のための、少なくとも1の請求項1または2に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体を含む、医薬。
  10. 過剰増殖性の疾患および障害からなる群から選択される生理学的および/または病態生理学的状態の処置および/または予防法における使用のための、請求項1または2に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体を含む、医薬。
  11. 過剰増殖性の疾患または障害が、がんである、請求項10に記載の使用のための医薬。
  12. がんが、HER2陽性がんである、請求項11に記載の使用のための医薬。
  13. がんが、急性および慢性のリンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、副腎皮質がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮頸部過形成、絨毛膜がん、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ性白血病、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、胆道がん、肝細胞癌、肝臓がん、食道がん、本態性血小板増加症、泌尿生殖器癌、神経膠腫、膠芽腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、ホジキン病、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド癌、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、悪性膵臓インスリノーマ、甲状腺髄様癌、黒色腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、菌状息肉種、骨髄性およびリンパ性白血病、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、原発性マクログロブリン血症、前立腺がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、皮膚がん、小細胞肺がん、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がんおよびウィルムス腫瘍、からなる群から選択される、請求項11に記載の使用のための医薬。
  14. がんが、乳がん、胃部のがん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮内膜がんまたは非小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項11に記載の使用のための医薬。
  15. a) 有効量の少なくとも1の請求項1または2に記載のHER2 Fcab-薬物抱合体を含むもの、および
    b) 有効量のさらなる医薬活性化合物
    の別々のパックからなる、セット(キット)。
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