JP2024517238A - 外因性ＲＮＡｉ農業用途及び製剤のためのＲＮＡの安定化 - Google Patents

Abstract

ＲＮＡに安定性を提供するための組成物は、一次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤を含み得る。一次界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり得る。組成物は、可溶性液体濃縮物形態にあり得、ＲＮＡに室温で１年間の常温安定性を提供するのに十分であり得る。組成物の植物への外因的な葉面適用を介してＲＮＡを害虫に送達するための組成物は、ＲＮＡ、一次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤を含み得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月５日に出願された米国仮出願第６３／１８４，５０８号の利益及び優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、全般的には、ＲＮＡの安定化、より具体的には、外因性ＲＮＡｉ農業用途及び製剤のためのＲＮＡの安定化に関する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡによって制御された選択的な生物学的プロセスがサイレンシングされるか、又はプロセスが意図されたように完了されないように、通常、死亡、成長の抑制若しくは発育阻害、毒性の低下、増殖／再生能力の低下、又は選択された表現型の排除の効果に変更される、生物学的プロセスである。生物学的システムでは、ＲＮＡｉ経路は、例えば、ｄｓＲＮＡを配列特異的干渉ＲＮＡとして機能するより短い２０～２５塩基対のヌクレオチドに切断するＤＩＣＥＲなどの酵素によって開始される。この干渉ＲＮＡは、宿主遺伝子材料の翻訳に影響を及ぼすいくつかの方法を通じて、遺伝子サイレンシングを促進する。これらの遺伝子改変は高度に選択的、及び種依存性であるため、標的生物は、従来の化学農薬の標的外及び生態学的負荷を伴わずに、ＲＮＡｉ技術を通して効果的に管理することができる。ＲＮＡｉベースの技術における活性成分、又は干渉ＲＮＡは、様々な形態での二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡであることができる。干渉ＲＮＡの様々な構造が従来技術で既知であり、例えば、Ｇｈｉｌｄｉｙａｌ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，Ｓｍａｌｌ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ＲＮＡｓ：Ａｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．９４－１６８（２００９）で考察されている。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ配列の骨格を形成するリン酸結合に起因する正味の負電荷を有する天然由来の水溶性バイオポリマーである。ＲＮＡを作製するための様々な方法が当該技術分野で既知であり、本発明のＲＮＡは当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって産生され得る。ＲＮＡを産生する方法の例としては、２０１９年５月１６日に公開された米国特許第１０，８５８，３８５号（公開第ＵＳ２０１９／０１４４４８９号）及び２０１７年１０月１２日に公開された米国特許第１０，９５４，５４１号（公開第ＵＳ２０１７／０２９２１３８号）（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどのインビトロ転写（ＩＶＴ）、化学合成、微生物発酵、又は無細胞方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用する内因性送達のためのＲＮＡｉ分子の例として、２０２０年５月１４日に公開された米国特許第１１，１４２，７６８号（公開第ＵＳ２０２０／０１４９０４４号）、２０２０年３月２６日に公開された米国特許第１１，１８５，０７９号（公開第ＵＳ２０２０／００９３１３８号）、２０２１年１１月１８日に公開されたＰＣＴ／ＵＳ／２０２１／０３２３３４（国際公開第２０２１／２３１７９１号）（それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

ＲＮＡｉ技術は、内部の生物学的プロセス干渉を通じて、多種多様な害虫及び病気に対する選択的な生物学的処置であることが示されている。ＲＮＡ安定性を維持及び改善するのに役立つ製剤における外因的な送達を介したＲＮＡｉ技術の送達が必要とされている。

本発明の前に本分野に存在する欠点及び必要性の考察は、かかる欠点及び必要性が本開示の前に当業者によって認識されたことを何ら認めるものではない。

可溶性液体濃縮物（ＳＬ）製剤は、製品用途における使用のために安定でなければならない。濃縮形態における安定性は、製剤の物理的、化学的、微生物的、及び酵素的な不安定性への応答に対して確実でなければならない。物理的安定性のために、製剤は、視覚的又は濁度観察によって相分離について評価される。化学的安定性のために、高温又は制御された温度での保存における活性成分濃度が、液体クロマトグラフィー又はゲル電気泳動によって評価される。微生物又は酵素的な安定性のために、活性成分濃度が、既知の負荷混合物への曝露後に評価される。

様々な実施形態は、植物への製剤の外因的な葉面適用を介して害虫にＲＮＡを送達するための組成物に関する。組成物は、ＲＮＡ、一次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤を含み得る。様々な実施形態によれば、一次界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり得る。

他の実施形態は、ＲＮＡに安定性を提供するための組成物に関する。組成物は、一次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤を含み得る。一次界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり得る。組成物は、可溶性液体濃縮物形態にあり得、ＲＮＡに室温で１年間の常温安定性を提供するのに十分であり得る。

様々な実施形態のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、図、及び特許請求の範囲を参照してよりよく理解される。

本開示の多くの態様は、以下の図面を参照してよりよく理解することができる。

様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後の相溶性製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後の相溶性製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後の相溶性製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後の相溶性製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ１０重量％及び５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ１０重量％及び５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ５重量％、４．５重量％、４．０重量％、及び３．５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ５重量％、４．５重量％、４．０重量％、及び３．５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ５重量％、４．５重量％、４．０重量％、及び３．５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ５重量％、４．５重量％、４．０重量％、及び３．５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、リン酸緩衝液を有しない製剤の写真を示し、ｄｓＲＮＡの著しい沈殿を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、２４２ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液を有する製剤の写真を示し、図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅに目視可能な沈殿を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、２４２ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液を有する製剤の写真を示し、図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅに目視可能な沈殿を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、２４２ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液を有する製剤の写真を示し、図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅに目視可能な沈殿を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、２４２ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液を有する製剤の写真を示し、図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅに目視可能な沈殿を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、２４２ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液を有する製剤の写真を示し、図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅに目視可能な沈殿を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈直後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈直後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈直後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈直後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１５０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１５０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１５０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１５０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。 様々な実施形態による例であり、－１０℃、４℃、４０℃、及び５４℃で保存した後の様々な製剤における化学的安定性について高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）結果を示す。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む相溶性製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を実証する。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む相溶性製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を実証する。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む相溶性製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を実証する。 様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む相溶性製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を実証する。 様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。 様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。 様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。 様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。 様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果の写真を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。 様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果の写真を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。 様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、３４２ｐｐｍ水に４００×及び１００×で希釈した、０．０２５％ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びｄｓＲＮＡを含む製剤について滴定アッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、３４２ｐｐｍ水に４００×及び１００×で希釈した、０．０２５％ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びｄｓＲＮＡを含む製剤について滴定アッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、３４２ｐｐｍ水に４００×及び１００×で希釈した、０．０５％ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びｄｓＲＮＡを含む製剤について滴定アッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、３４２ｐｐｍ水に４００×及び１００×で希釈した、０．０５％ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びｄｓＲＮＡを含む製剤について滴定アッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、濃縮製剤におけるＳＡＧ１５９９（商標）の物理的相溶性及び物理的安定性を示す写真を示す。 様々な実施形態による例であり、０．２％ＡＮＴＩＦＯＡＭ ＧＮ１１Ｐ（商標）を含む製剤の静置１分後の写真を示す。 様々な実施形態による例であり、１０７ＣＦＵの細菌カクテルによる汚染後の非製剤化ＴＧＡＩ及びｄｓＲＮＡバイオバーデンレベルを含有する製剤化ＴＧＡＩの結果を示し、図中、ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮという表示は、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。 様々な実施形態による例であり、１０７ＣＦＵの細菌カクテルによる汚染後の非製剤化ｄｓＲＮＡ及び製剤化ｄｓＲＮＡについてｄｓＲＮＡ分解プロファイルを示し、図中、ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮは、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。 様々な実施形態による例であり、１０４ＣＦＵの真菌カクテルによる汚染後の非製剤化ｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡバイオバーデンレベルを含有する製剤化ｄｓＲＮＡの結果を示し、図中、ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮは、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。 様々な実施形態による例であり、１０４ＣＦＵの真菌カクテルによる汚染後の非製剤化ｄｓＲＮＡ及び製剤化ｄｓＲＮＡのｄｓＲＮＡ分解プロファイルを示し、図中、ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮは、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷した塩化セトリモニウムについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷した塩化セトリモニウムについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷したラウリルベタインについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷したラウリルベタインについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷したＣ１２アミノオキシドについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷したＣ１２アミノオキシドについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。 様々な実施形態による例であり、１０ｍＭの平均含有量を有する９～１３ｍＭのＭｇ^２＋を含有した７ｇ／ＬのｄｓＲＮＡで産生されたＴＧＡＩ、及び２２．５ｍＭの平均含有量を有する１５．５～２８ｍＭのＭｇ^２＋を含有する１４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡで産生されたＴＧＡＩを含む、ＴＧＡＩの複数の産生ロットのＭｇ^２＋分析を示す。 ヌクレアーゼ活性によるｄｓＲＮＡ分解を例示する例である。 様々な実施形態による例であり、増加する濃度のＥＤＴＡを含有するｄｓＲＮＡ製剤のゲル電気泳動結果を示す。 様々な実施形態による例であり、増加する濃度のＥＤＴＡを含有するｄｓＲＮＡ製剤のゲル電気泳動結果を示す。 様々な実施形態による例であり、ＵＶ－Ｂ曝露レベル、及び２週間後のｄｓＲＮＡ安定性を示す。 様々な実施形態による例であり、様々なＵＶ－Ｂ曝露後のｄｓＲＮＡのＨＰＬＣクロマトグラムオーバーレイを示す。 様々な実施形態による例であり、ＵＶ照射に対する２週間曝露後のｄｓＲＮＡ試料中のｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び遊離ヌクレオチドの質量バランスを示す。 様々な実施形態による例であり、１．５％リグノスルホネート（レーン２～６）を含有する製剤が、ゲルでｄｓＲＮＡバンドの保持、及びＵＶ照射からのｄｓＲＮＡ分解のある程度の保護を示す。 様々な実施形態による例であり、１００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ－Ｂ照射に対する曝露後の製剤のＨＰＬＣ定量からの結果を示す。 様々な実施形態による例であり、ＵＶ照射に対するｄｓＲＮＡ安定性について葉表面対パラフィルムでの比較を示す。 様々な実施形態による例であり、ＵＶ－Ｂ曝露後のゲル電気泳動の結果を示し、オレフィン系及びフェニルベースの化学物質がｄｓＲＮＡのいかなる顕著な保護を提供しないことを示す。 様々な実施形態による例であり、コロラドハムシ（ＣＰＢ）バイオアッセイからの死亡率を示す。 様々な実施形態による例であり、リグノスルホネートの添加又は無添加における製剤のコロラドハムシ（ＣＰＢ）バイオアッセイからの死亡率を示す。 塩酸セトリモニウム及びＥＤＴＡの相対濃度における安定性の実験評価の統計的設計を示す。

様々な実施形態は、図に示される例に限定されないことが理解されるべきである。

序文及び定義
本開示は、当業者に本発明を説明するために記述され、本開示が記載される特定の実施例又は実施形態に限定されないことを理解するであろう。実施例及び実施形態は本発明の一例であり、当業者にはるかに広い範囲を明らかにする。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される専門用語は、実施例及び実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではなく、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。

本明細書に開示される全ての特徴（添付の特許請求の範囲、要約、及び図面を含む）は、特に明記されていない限り、同じ、同等、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられ得る。したがって、特に明記されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等又は同様の特徴の一例にすぎない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のためだけのものであり、その観点で様々な修正又は変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲内に含まれるべきである。多くの変形及び変更が、本開示の趣旨及び原理から実質的に逸脱することなく、本開示の実施形態に行われ得る。かかる変更及び変形は、本開示の範囲内に含まれることが意図される。例えば、別段の指示がない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応物質、製造プロセスなどに限定されず、したがって変化することができる。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことを理解されたい。本開示では、ステップが、これが論理的に可能である異なる順序で行われ得ることも可能である。

本明細書において、明示的に示されているか否かにかかわらず、全ての数値は「約」という用語によって修飾されると想定される。「約」という用語は、一般に、当業者が言及された値と等価（例えば、同一の機能又は結果を有する）であると考えるであろう数値の範囲を指す。多くの場合、「約」という用語は、最も近い有効数字に四捨五入される数値を含み得る。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数の参照物を含むことに留意する必要がある。そのため、例えば、「支持体」への言及は、複数の支持体を含む。本明細書及び以下の特許請求の範囲において、いくつかの用語を参照し、これらは逆の意図が明らかでない限り以下の意味を有するように定義されるものとする。

本明細書で使用される場合、「標準温度及び圧力」又は「室温及び／又は圧力」という用語は、一般に、２５℃及び１気圧を指す。標準温度及び圧力はまた、「周囲条件」と称され得る。別段の指示がない限り、割合は、重量であり、温度は、℃であり、圧力は、大気圧又はその付近である。「上昇した温度」又は「高温」という用語は、一般に、少なくとも１００℃の温度を指す。

特に明記しない限り、組成物中の成分の量を示す全てのパーセンテージは、組成物の総重量に基づいて、成分の重量パーセントを表す。用語「ｍｏｌパーセント」又は「モルパーセント」は、一般に、混合物中にある総モルに対する特定の成分のモルであるパーセントを指す。溶液中の各成分のモル分数の合計は、１に等しい。

値の範囲が提供される場合、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の各介在値と、その記述された範囲内の任意の他の記述された値又は介在値が、本開示内に包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、より小さな範囲に含まれてもよく、また、記述された範囲内の任意の明確に除外された限定を前提として、本開示内に包含される。記述された範囲が、上限及び下限の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた上限及び下限の一方又は両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。

本明細書で引用された全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により本明細書に組み込まれることを明確にかつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれ、引用された刊行物に関連して方法及び／又は物質を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日以前のその開示のためのものであり、本開示が、先行開示によってそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。更に、提供した公開日は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。

異性体を有するか、又は１つ以上のキラル中心を示す分子では、簡潔さのために、可能性のある変形のうちの１つのみが示され得る。当業者は、かかる変形全ての開示が意図されていることを理解するであろう。特定の変形が好ましい場合、本開示はそのように言明するであろう。

本明細書で使用される場合、「可溶性液体濃縮物」（ＳＬ）という用語は、溶解した活性成分を含有する水性製剤を指す。いくつかの実施形態によれば、活性成分は、塩であり得る。

本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡを指し、２つの相補的な鎖を有するＲＮＡである。

本明細書で使用される場合、ＲＮＡに関して使用されるとき、「安定性」又は「不安定性」という用語は、ＲＮＡの化学的構成又は物理的状態が任意の原因から時間経過で変化に供される度合を指す。ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ又はｄｓＲＮＡであり得る。物理的安定性の欠如の例としては、製剤からの沈殿が挙げられ得るが、これに限定されない。化学的安定性の欠如の例としては、紫外線（ＵＶ）照射への曝露、生物学的汚染、又は化学的汚染などの様々な要因のうちのいずれか又は全てによる干渉ＲＮＡの分子構造の分解が挙げられ得るが、これらに限定されない。生物学的汚染の例としては、細菌、酵素、又は真菌への曝露が挙げられ得るが、これらに限定されない。生物学的汚染を引き起こし、それによって化学的安定性に影響を及ぼし得る酵素の例としては、ＲＮＡを分解するヌクレアーゼが挙げられる。化学的汚染の例としては、不適切なｐＨ範囲又は化学薬品への曝露が挙げられ得るが、これらに限定されない。ＲＮＡの物理的及び／又は化学的安定性はまた、熱変動によって影響を受け得る。

本明細書で使用される場合、「一本鎖ＲＮＡの半減期」又は「ｄｓＲＮＡの半減期」という用語は、一本鎖ＲＮＡ又はｄｓＲＮＡの安定性が半分に低下するのに要する期間を指す。

本明細書で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、２つの液体間、気体と液体との間、又は液体と固体との間の表面張力（又は界面張力）を低下させる化合物を指す。界面活性剤分子は、疎水的部分（疎水性）及び親水的部分（親水性）を有し得る。

本明細書で使用される場合、「一次界面活性剤」及び「二次界面活性剤」という用語は、「第１の界面活性剤」及び「第２の界面活性剤」という用語と互換的に使用され得る。用語は、製剤又は製剤を調製する方法における様々な界面活性剤を指し、それらを区別する便宜上使用される。

本明細書で使用される場合、「バイオ農薬」という用語は、害虫を制御又は殺傷する組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ分子が標的化ｍＲＮＡ分子を中和することによって遺伝子発現又は翻訳を阻害する生物学的プロセスであるＲＮＡ干渉を指す。

本明細書で使用される場合、「植物への外因的適用」という用語は、植物の外部へのＲＮＡｉバイオ農薬の適用を指す。外因的適用は、植物を遺伝子改変することを回避し得る。

ｄｓＲＮＡ
様々な実施形態は、ｄｓＲＮＡを含み得る製剤に関するものであり、様々な実施形態は、ｄｓＲＮＡを含むこれらの製剤のうちの１つ以上を適用することを含み得る、害虫又は病原体から植物を保護する方法に関する。様々な実施形態は、ｄｓＲＮＡに安定性を提供するための組成物に関するものであり、様々な実施形態は、ｄｓＲＮＡをこれらの組成物のうちの１つ以上と組み合わせることを含み得る、ｄｓＲＮＡを安定化する方法に関する。

多種多様のｄｓＲＮＡが、様々な実施形態に従って用いられ得る。本開示で使用のｄｓＲＮＡには、例えば、米国特許第１１，１８５，０７９号及び同第１１，１４２，７６８号、並びにＷＩＰＯ公開第２０２０／１２３４１９号及び同第２０２１／２３１７９１号に記載されるものが含まれ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ｄｓＲＮＡのタイプは、サイズ及び構造を含むがこれらに限定されない、任意の数の要因に基づいて変化し得る。

ｄｓＲＮＡのサイズは、典型的には、塩基対に関して測定される。様々な実施形態によれば、様々な実施形態に従って用いられるか又は安定化され得るｄｓＲＮＡは、１０～１７００の範囲内の塩基対数を有する。本明細書に記載される各範囲は、その範囲によって包含される全ての数値を含むことが意図される。更に、追加の範囲が、本明細書に記載の任意の下限及び／又は上限から形成され得る。例えば、様々な実施形態に従って用いられるか又は安定化され得るｄｓＲＮＡは、塩基対数を下限及び／又は上限を有する範囲内の範囲に有する。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外し得る。例として、限定ではないが、下限及び／又は上限は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、及び１７００塩基対から選択され得る。下限単独から形成される範囲は、値が本開示に明示的に引用されているかかかわらず、少なくとも下限及び下限を超える全ての数値を含む。上限単独から形成される範囲は、値が本開示に明示的に列挙されているかかかわらず、少なくとも上限及び上限未満の全ての数値を含む。下限及び上限の組み合わせから形成される範囲は、値が本開示で明示的に列挙されているかにかかわらず、少なくとも下限、上限、並びに、それらの間の全ての数値を含む。例えば、上記に明示的に列挙された例示的な上限及び下限のセットに基づいて、様々な実施形態に従って用いられるか又は安定化され得るｄｓＲＮＡは、約１０～約１０００塩基対、約１０塩基対未満、約１０塩基対超、約１０００塩基対未満、又は約１０００塩基対超などの範囲内の塩基対数を有する。かかる範囲は、全て企図されており、明示的に開示及び列挙されることが意図されている。列挙される各値は、「約」という用語によって修飾されることが意図される。

当業者は、ｄｓＲＮＡが多種多様な構造的配置で存在することを理解するであろう。これらの構造には、二本鎖構造、ペーパークリップ構造、ヘアピン構造、ステムループ構造、プレマイクロＲＮＡ構造、及び人工マイクロＲＮＡ構造が含まれ得るが、これらに限定されない。様々な実施形態に従って用いられ得るか又は安定化され得るｄｓＲＮＡは、これらの構造のいずれかを有し得る。

一本鎖ＲＮＡ
様々な実施形態は、小干渉ＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡなどの様々な一本鎖ＲＮＡを含み得る製剤に関するものであり、様々な実施形態は、一本鎖ＲＮＡを含むこれらの製剤のうちの１つ以上を適用することを含み得る、害虫から植物を保護する方法に関する。様々な実施形態は、一本鎖ＲＮＡに安定性を提供するための組成物に関するものであり、様々な実施形態は、一本鎖ＲＮＡをこれらの組成物のうちの１つ以上と組み合わせることを含み得る一本鎖ＲＮＡを安定化する方法に関する。

一本鎖ＲＮＡのサイズは、典型的には、ヌクレオチド塩基に関して測定される。様々な実施形態によれば、様々な実施形態に従って用いられるか又は安定化され得る一本鎖ＲＮＡは、１０～１０００塩基の範囲内の塩基である。本明細書に記載される各範囲は、その範囲によって包含される全ての数値を含むことが意図される。更に、追加の範囲が、本明細書に記載の任意の下限及び／又は上限から形成され得る。例えば、様々な実施形態に従って用いられるか又は安定化され得る一本鎖ＲＮＡは、下限及び／又は上限を有する範囲内の範囲に塩基数を有する。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外し得る。例として、限定ではないが、下限及び／又は上限は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、及び１０００塩基であり得る。下限単独から形成される範囲は、値が本開示に明示的に引用されているかかかわらず、少なくとも下限及び下限を超える全ての数値を含む。上限単独から形成される範囲は、値が本開示に明示的に列挙されているかかかわらず、少なくとも上限及び上限未満の全ての数値を含む。下限及び上限の組み合わせから形成される範囲は、値が本開示で明示的に列挙されているかにかかわらず、少なくとも下限、上限、並びにそれらの間の全ての数値を含む。例えば、上記に明示的に列挙された例示的な上限及び下限のセットに基づいて、様々な実施形態に従って用いられるか又は安定化され得る一本鎖ＲＮＡは、約１０～約１０００塩基、約１０塩基未満、約１０塩基超、約１０００塩基未満、又は約１０００塩基超などの範囲内の塩基数を有する。かかる範囲は、全て企図されており、明示的に開示及び列挙されることが意図されている。列挙される各値は、「約」という用語によって修飾されることが意図される。

一次界面活性剤：定義及び例
様々な実施形態によれば、一次界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり得る。本明細書で使用される場合、「非イオン性界面活性剤」という用語は、中性に荷電した親水性剤及び疎水性剤を含む界面活性剤のクラスを指す。様々な実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、濃縮製剤とのその相溶性、様々な水条件で希釈時にｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを安定化させるのに役立つ能力、及び葉表面に噴霧されたときの適用特性に基づいて、製剤における使用のために選択され得る。

非イオン性界面活性剤のいくつかの例には、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化フェノール、アルコキシル化脂肪酸、アルコキシル化モノアルカオルアミド（ｍｏｎｏａｌｋａｏｌａｍｉｄｅ）、アルコキシル化ソルビタンエステル、アルコキシル化脂肪アミンなどのアルコキシレートが含まれ得るが、これらに限定されない。アルコキシレートのより具体的な例としては、アルコールエトキシレート、アルキルフェノールエトキシレート、脂肪酸エトキシレート、モノアルカオルアミドエトキシレート、ソルビタンエステルエトキシレート、脂肪アミンエトキシレートが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤はまた、エチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマーを含むが、これらに限定されないポリマー界面活性剤を含み得る。非イオン性界面活性剤の更なる例としては、直鎖アルコールエトキシレート、分岐鎖アルコールエトキシレート、脂肪アルコールエトキシレート、アルコールアルコキシレート、ポリエチレン修飾脂肪酸ソルビタンエステル、ポリアルキルグルコシド、エトキシル化アルキルポリエチレングリコールエーテル、アルコキシル化アルキルポリエチレングリコールエーテル、及び脂肪酸アミドが挙げられるが、これらに限定されない。

様々な実施形態の目的のために非イオン性界面活性剤として分類され得る市販の界面活性剤の例としては、ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ、ＢＩＯ－ＳＯＦＴ（登録商標）Ｎ２３－６．５、ＴＷＥＥＮ２０（商標）、ＳＹＮＥＲＧＥＮ（登録商標）ＧＡ、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（登録商標）ＴＤＡ８、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（登録商標）ＴＤＡ９、Ｔ ＭＡＺ ２０Ｋ（商標）、Ｔ ＭＡＺ ８０Ｋ（商標）、及びＡＧＮＩＱＵＥ（登録商標）ＣＳＯ－３６が挙げられ得るが、これらに限定されない。

非イオン性界面活性剤のなお更なる例として、マルチヒドロキシ生成物が挙げられるが、これに限定されない。マルチヒドロキシ生成物の例には、グリコールエステル、グリセロールエステル、ポリグリセロールエステル、グルコシド、ポリグルコシド、及びスクロースエステルが含まれ得るが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の追加の例として、限定されないが、アルキルポリグリコシド、ＣＥＴＯＭＡＣＲＯＧＯＬ １０００（商標）、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドｄｅａ、コカミドｍｅａ、デシルグルコシド、デシルポリグルコース、グリセロールモノステアレート、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、ＩＳＯＣＥＴＥＴＨ－２０（商標）、ラウリルグルコシド、マルトシド、モノラウリン、マイコスブチリン、狭域エトキシレート、ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（商標）（ＮＰ－４０）、ＮＯＮＯＸＹＮＯＬ－９（商標）（ＮＰ－９）、ノノキシノール、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ｎ－オクチルベータ－ｄ－チオグルコピラノシド、オクチルグルコシド、オレイルアルコール、ＰＥＧ－１０ヒマフラワーグリセリド、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリドカノール、ポロキサマー、ポロキサマー４０７、ポリエトキシル化獣脂アミン、ポリリシノール酸ポリグリセロール、ポリソルベート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタン、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ステアリルアルコール、サーファクチン、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００（商標）、及びＴＷＥＥＮ８０（商標）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

ノナエチレングリコール又はポリエチレングリコールノニルフェニルエーテルとしても知られるノノキシノールは、洗剤、乳化剤、湿潤剤、又は消泡剤として使用される非イオン性界面活性剤の混合物である。

ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマーである。ポロキサマー４０７は、ポロキサマーとして知られるより一般的なクラスのコポリマーの親水性非イオン性界面活性剤である。ポロキサマー４０７は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の２つの親水性ブロックに隣接するポリプロピレングリコールの中央疎水性ブロックからなるトリブロックコポリマーである。

ポリソルベートは、脂肪酸でエステル化されたエトキシル化ソルビタン（ソルビトールの誘導体）に由来する油性液体である。ポリソルベート２０（一般的な市販のブランド名としては、Ｓｃａｔｔｉｃｓ、Ａｌｋｅｓｔ ＴＷ２０、及びＴｗｅｅｎ２０が挙げられる）は、ラウリン酸の付加前にソルビタンをエトキシル化することによって形成されるポリソルベート型非イオン性界面活性剤である。その正式なＩＵＰＡＣ名は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである。ポリソルベート８０は、ポリエトキシル化ソルビタン及びオレイン酸に由来する非イオン性界面活性剤及び乳化剤である。その正式なＩＵＰＡＣ名は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートである。

ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡは、市販のアルコキシル化アルコールであり、Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃから購入し得る。ＴＷＥＥＮ２０（商標）は、市販のポリオキシエチレンソルビトールエステル、具体的にはポリソルベート２０である。Ｔｗｅｅｎ８０（商標）は、市販のポリソルベート界面活性剤、具体的にはポリソルベート８０である。ＳＹＮＥＲＧＥＮ（登録商標）ＧＡは、Ｎ－メチル－Ｎ－オクタノイル／デカノイルグルカミンを含む、市販の糖ベースの界面活性剤である。ＬＵＴＥＮＳＯＬ（登録商標）ＴＤＡ８及びＬＵＴＥＮＳＯＬ（登録商標）ＴＤＡ９は、市販のエトキシル化トリデシルアルコールである。Ｔ ＭＡＺ ２０Ｋ（商標）及びＴ ＭＡＺ ８０Ｋ（商標）は、水溶性の油水乳化剤を得るためにおよそ２０モルのエチレンオキシドでエトキシル化されている市販のソルビタンモノオレエートである。ＡＧＮＩＱＵＥ（登録商標）ＣＳＯ－３６は、市販のエトキシル化ヒマシ油である。ＣＥＴＯＭＡＣＲＯＧＯＬ１０００（商標）は、市販のポリエチレングリコールヘキサデシルエーテルであり、セチルアルコールのエトキシル化によって生成された非イオン性界面活性剤である。ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０は、市販の非イオン性、非変性化洗剤である。その正式なＩＵＰＡＣ名は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ＩＳＯＣＥＴＥＴＨ－２０（商標）は、イソセチルアルコールのエトキシル化によって生成された市販のポリエチレングリコールエーテルである。ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ－４０（商標）（ＮＰ－４０）は、市販の非イオン性、非変性化洗剤である。その正式なＩＵＰＡＣ名は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ＮＯＮＯＸＹＮＯＬ－９（商標）（ＮＰ－９）は、ノノキシノールファミリーからの市販の界面活性剤である。その正式なＩＵＰＡＣ名は、２－｛２－［２－（２－｛２－［２－（２－｛２－［２－（４－ノニルフェノキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エタノールである。ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００（商標）は、親水性ポリエチレンオキシド鎖及び芳香族炭化水素親油性又は疎水性基を有する市販の非イオン性界面活性剤である。その正式なＩＵＰＡＣ名は、２－［４－（２，４，４－トリメチルペンタン－２－イル）フェノキシ］エタノールである。

二次界面活性剤：定義及び例
様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及び／又は両性界面活性剤であり得る。本明細書で使用される場合、「カチオン性界面活性剤」という用語は、正に荷電した親水性剤を含む界面活性剤のクラスを指す。本明細書で使用される場合、「双性イオン性界面活性剤」又は「両性界面活性剤」という用語は、正に荷電した（カチオン性）中心及び負に荷電した（アニオン性）中心の両方を有する親水性剤を含む界面活性剤のクラスを指す。カチオン性部分は、しばしば、１級、２級、若しくは３級アミン、又は４級アンモニウムカチオンに基づいている。アニオン性部分は、より可変であることができ、硫酸、スルホン酸、リン酸、炭酸、及び他のプロトン提供部分を含む。

様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、アルキルアンモニウムクロリドなどのアルキルアンモニウムハロゲン化物であり得、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡに対して抗微生物保護を提供する。カチオン性界面活性剤の例としては、塩化ベヘントリモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化ベンゾドデシニウム、ブロニドックス、臭化カルベトペンデシニウム、塩化セタルコニウム、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン、臭化ドミフェン、ラウリルメチルグルセチ－１０ヒドロキシプロピルジモニウムクロリド、オクテニジン二塩酸塩、オラフルル、ｎ－オレイル－１，３－プロパンジアミン、パフトキシン、塩化ステアラルコニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、及び臭化トンゾニウムが挙げられ得るが、これらに限定されない。

双性イオン性界面活性剤の例として、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）デタージェント、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、卵レシチン、ヒドロキシスルタイン、レシチン、ミルテフォシン、ペプチタージェント（ｐｅｐｔｉｔｅｒｇｅｎｔ）、及びラウロアンホ酢酸ナトリウムが挙げられ得るが、これらに限定されない。

ラウリルベタインは、タンパク質変性能力を有するＮ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジアルカノールアミンに由来する両性界面活性剤である。本明細書で使用される場合、「ベタイン」は、四級アンモニウム又は水素原子を有しないホスホニウムカチオン（一般に、オニウムイオン）などの正に荷電したカチオン性官能基を有し、カチオン性部位に隣接し得ないカルボキシレート基などの負に荷電した官能基を有する、任意の中性化学化合物を指す。ベタインは、特定のタイプの双性イオンである。

アミンオキシドの例としては、融点６２～６７℃を有する水溶性結晶性固体であるピリジン－Ｎ－オキシド、及び酸化剤であるＮ－メチルモルホリンＮ－オキシドが挙げられる。様々な実施形態は、Ｃ６～Ｃ３０アミンオキシド、例えば、Ｃ１２アミンオキシドを用い得る。

様々な実施形態によれば、ＡＭＭＯＮＹＸ（登録商標）ＣＥＴＡＣ－３０及び／又はＭＡＱＵＡＴ（登録商標）ＬＢは、それらのカチオンの性質、及び各分子中のアンモニウム基が抗微生物活性に対して有する役割によって、二次界面活性剤として使用され得る。ＡＭＭＯＮＹＸ（登録商標）ＣＥＴＡＣ－３０は、既知の抗微生物効果を有するカチオン性界面活性剤である塩化セトリモニウムの商品名である。ＭＡＱＵＡＴ（登録商標）ＬＢは、ラウリルベタインであり、ベタインの物理的構造に起因して、全てのｐＨで正電荷を有し、抗微生物効果を有する内部アンモニウム塩を含む。

二次界面活性剤の他の例には、アミン－Ｎ－オキシド及びＮ－オキシドとしても知られる、アミンオキシドが含まれ得る。例えば、ドデシルジメチルアミンオキシド（ＤＤＡＯ）としても知られるラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）は、アミンオキシドベースの双性イオン性界面活性剤である。

金属イオン封鎖剤：定義及び例
本明細書で使用される場合、「金属イオン封鎖剤」、「錯化剤」、「キレーター」、「キレート剤」、又は「封鎖剤」という用語は、単一の中心原子に２つ以上の別個の配位結合を形成することができる多座配位子を指す。様々な実施形態によれば、金属イオンキレーターは、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡに対する酵素ヌクレアーゼ活性を阻害し得る。金属イオン封鎖剤の例として、シトレート、硫酸アンモニウム、アクリルコポリマー（例えば、ＮＯＶＥＲＩＴＥ（登録商標）Ｋ－７７５）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、リグノスルホネート、リグノスルホン酸ナトリウム、グルタミン酸ジ酢酸（ＧＬＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酸酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ－カルボキシメチルイミノビス（エチレンニトリロ）テトラ（酢酸）、エチレンジアミン－Ｎ、Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシフェニル酢酸）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’－チアセチン酸（ｔｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシ－６－メチルフェニル酢酸、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ビス（４－カルボキシ－２－ヒドロキシフェニル酢酸、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’ビス（２－ヒドロキシ－５－スルホフェニル酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。

様々な実施形態によれば、金属イオン封鎖剤は、多くの一般的なヌクレアーゼの酵素活性に必要な二価金属カチオンをキレート化する能力に基づいて、製剤における使用のために選択され得る。例えば、ＥＤＴＡは、多くの一般的なヌクレアーゼの酵素活性に必要な二価の金属カチオンをキレート化する能力を有する金属イオン封鎖剤である。これらの金属イオンをキレート化することによって、任意の利用可能なヌクレアーゼは、それらの機能を行うことができず、したがって、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡが、濃縮製剤中の酵素媒介性分解から保護される。

ＵＶ保護剤：定義及び例
本明細書で使用される場合、「ＵＶ保護剤」又は「分散剤界面活性剤」又は「分散性界面活性剤」という用語は、紫外線照射に曝露されたときにｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの安定性を増加させる組成物を指す。ＵＶ保護剤の例として、コンジュゲート化芳香族型界面活性剤が挙げられ得るが、これに限定されない。例えば、ＵＶ保護剤として、リグニンによって例示されるコンジュゲート化芳香族官能性を含むポリマー界面活性剤、リグノスルホネートなどのナフタレンベースの界面活性剤、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びナフタレンスルホネート縮合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。クラフトリグニンは、クラフトパルプから得られる工業用リグニンの一種であり、世界中の総リグニン生産量の約８５％を占める。ＵＶ保護剤の更なる例として、リグノスルホネート及びナフタレンスルホネートなどのコンジュゲート化芳香族界面活性剤、最も具体的には、ＲＥＡＸ（登録商標）１０５Ｍ、ＲＥＡＸ（登録商標）９１０、ＫＲＡＦＴＳＰＥＲＳＥ（登録商標）８８２８、ＲＥＡＸ（登録商標）１４２５Ｅ、ＲＥＡＸ（登録商標）２６０、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）Ｄ－４２５、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＥＦＷ、及びＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＩＰが挙げられ得るが、これらに限定されない。

ＲＥＡＸ（登録商標）１０５Ｍは、市販されている、低遊離電解質含有量を有する高度にスフォン化（ｓｕｆｏｎａｔｅｄ）された低分子量のクラフトリグノスルホネート分散剤である。ＲＥＡＸ（登録商標）９１０は、市販されている、低い遊離電解質含有量、低い伝導性、及びほぼ中性のｐＨを特徴とする中度のスルホン化クラフトリグニン分散剤である。ＲＥＡＸ（登録商標）１４２５Ｅは、優れた水溶性を有する市販のエトキシル化クラフトリグノスルホネートである。ＲＥＡＸ（登録商標）２６０は、水分散性顆粒又は湿潤性粉末などの乾燥製剤に分散剤として使用される、市販の亜硫酸ナトリウムリグノスルホネート製品である。ＫＲＡＦＴＳＰＥＲＳＥ（登録商標）８８２８は、市販の疎水性、高分子量リグニンベースの分散剤である。ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）Ｄ－４２５は、ナフタレンスルホネート縮合物の市販のナトリウム塩である。ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＥＦＷは、市販のアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウムブレンドであり、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＩＰは、市販のイソプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウムである。

不凍剤：定義及び例
本明細書で使用される場合、「不凍剤」という用語は、水ベースの液体の凍結点を低下させる添加剤を指す。不凍剤の例として、プロピレングリコール、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アルキレングリコールエーテル、アルキレングリコールアルキルエーテル、及びグリセロールが挙げられ得るが、これらに限定されない。様々な実施形態によれば、不凍剤は、凍結以下の温度で製剤及び個々の成分に安定性を提供するように、低温でその性能に基づいて製剤に使用するために選択され得る。例えば、プロピレングリコールは、低温でのその優れた性能のために使用される一般的なアルコールベースの溶媒であり、そのため、凍結以下の温度で製剤及び個々の成分に安定性を提供する。

緩衝液：定義及び例
本明細書で使用される場合、「緩衝液」という用語は、酸性又は塩基性の成分及び機能の添加に際してｐＨ変化に抵抗することができ、少量の添加された酸又は塩基を中和するように機能して、相対的安定性のために溶液のｐＨを維持する溶液を指す。様々な実施形態によれば、緩衝液は、中性ｐＨを模倣し、製剤中の酸／塩基加水分解及びその後のｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの分解の可能性を防ぐのに役立つように選択され得る。

様々な実施形態によれば、リン酸ベースの緩衝液を使用し得る。例えば、様々な実施形態によれば、ｐＨ７のリン酸カリウム緩衝液を使用して、中性ｐＨを模倣し、製剤中の酸／塩基加水分解及びその後のｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの分解の可能性を防止するのに役立ち得る。緩衝液組成物の別の例は、様々な実施形態により、ｐＨ７でのリン酸－クエン酸緩衝液の組み合わせである。この組成物を使用して、中性ｐＨを模倣し、製剤内のｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの酸／塩基加水分解の可能性を防止するのに役立ち得、シトレートを含めることによって追加の潜在的なキレート化効果を提供し得る。緩衝液組成物の別の例は、様々な実施形態により、ｐＨ６でのクエン酸緩衝液である。かかる組成物を使用して、クエン酸緩衝液の使用を通してキレート化を増加させ得、ｐＨ６の使用を通して微生物汚染に対する保護を改善し得る。

緩衝液の例としては、リン酸カリウム、ビス－トリス（ビス－トリスメタン）、ＡＤＡ（２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸）、ＡＣＥＳ（２－（カルバモイルメチルアミノ）エタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３－モルホリン－４－イルプロパン－１－スルホン酸）、ＢＥＳ（２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸）、ＴＥＳ（２－［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４－（４－モルホリニル）－１－ブタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３－｛［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）－２－プロパニル］アミノ｝－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（３－｛１，１，１，５，５，５－ヘキサメチル－３－［（トリメチルシリル）オキシ］－３－トリシロキサニル｝プロピルメタクリレート）、及びクエン酸（２－オキシド－１，２，３－プロパントリカルボキシレート）が挙げられるが、これらに限定されない。

消泡剤：定義及び例
本明細書で使用される場合、「消泡剤」又は「泡制止剤」という用語は、工業プロセス液体中の泡の形成を低減及び阻害する化合物を指す。消泡剤の例として、不溶性油、ポリジメチルシロキサン及び他のシリコーン、特定のアルコール、ステアレート、並びにグリコールが挙げられ得るが、これらに限定されない。特定の市販の消泡剤の例として、ＳＡＧ １５７２（商標）、ＤＲＥＷＰＬＵＳ（登録商標）Ｌ－７６８、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ８８３０（商標）、ＡＧＮＩＱＵＥ（登録商標）ＤＦＭ１１１Ｓ、ＳＩＬＦＯＡＭ（登録商標）ＳＥ１１、ＳＩＬＦＯＡＭ（登録商標）ＳＥ２１、ＡＮＴＩＦＯＡＭ １００（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ＨＬ５５０（商標）、ＳＡＧ １５９９（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ８８１０（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ８８２０（商標）、及びＡＮＴＩＦＯＡＭ ＧＮ１１Ｐ（商標）が挙げられ得るが、これらに限定されない。様々な実施形態によれば、ＳＡＧ １５７２（商標）及びＤＲＥＷＰＬＵＳ（登録商標）Ｌ－７６８が、スプレータンク内で希釈時に持続的な泡を減少させるために選択された。

ＳＡＧ １５７２（商標）及びＳＡＧ １５９９（商標）は、ポリジメチルシロキサンを含む市販の消泡エマルションである。ＤＲＥＷＰＬＵＳ（登録商標）Ｌ－７６８は、ポリジメチルシロキサンを含む市販の消泡エマルションである。ＡＮＴＩＦＯＡＭ ８８３０（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ １００（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ＨＬ５５０（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ８８１０（商標）、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ８８２０（商標）、及びＡＮＴＩＦＯＡＭ ＧＮ１１Ｐ（商標）は、ポリジメチルシロキサンを含む市販の消泡エマルションである。ＡＧＮＩＱＵＥ（登録商標）ＤＦＭ１１１Ｓは、ポリジメチルシロキサン及びプロピレングリコールを含む市販の消泡エマルションである。ＳＩＬＦＯＡＭ（登録商標）ＳＥ１１及びＳＩＬＦＯＡＭ（登録商標）ＳＥ２１は、市販の低粘度シリコーンベースの消泡エマルションである。

生物学的保存剤：定義及び例
本明細書で使用される場合、「生物学的保存剤」という用語は、作物、ヒト若しくは動物の健康に有害であるか、又は天然若しくは製造された製品に損傷を引き起こす生物を制御するために使用される物質を指す。生物学的保存剤の例として、ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ、ＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ、及びＰＲＯＸＥＬ（登録商標）ＧＸＬが挙げられ得るが、これらに限定されない。

ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰは、活性物質５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＣＭＩＴ）及び２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）を含む広域スペクトル殺真菌剤及び殺生物剤である。ＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ及びＰＲＯＸＥＬ（登録商標）ＧＸＬは、活性物質として、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オン（ＢＩＴ）を含む広域スペクトル殺生物剤である。

全般的な考察
様々な実施形態は、農業市場においてバイオ農薬として使用するための有効成分としてｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを利用する製剤を提供する。様々な実施形態によれば、製剤は、可溶性液体濃縮物であり得る。製剤は、必要な物理的及び化学的安定性をｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡに提供し得、その結果、製剤の葉面又は他の適用は、外因性ＲＮＡｉを介して害虫又は病原体管理プログラムにおける害虫又は病原体制御を支援することができる。製剤の様々な実施形態は、葉面適用のためのＳＬタイプ製剤に関するＣＩＰＡＣ／試験方法において十分な性能を示す。製剤の様々な実施形態は、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの化学的及び物理的安定性を改善して、常温で安定なｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡベースの農業製剤を可能にし得、細菌性及び真菌性汚染、酵素ヌクレアーゼ活性、並びにＵＶ照射によるＲＮＡ分解を防止又は制限し得る。

選択されたゲノム標的においてＲＮＡｉを達成するために外因的に送達されたＲＮＡの高い特異性及び有効性を利用することによって、選択された害虫集団を標的とし、有害な生物学的効果を用いて著しい減少で排除し得る。Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａは、現在のジャガイモ害虫管理プログラムに対して増加した耐性を示している。Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａへのｄｓＲＮＡの外因的送達のためのＳＬ型製剤の開発は、腐敗性又は非滅菌環境、微生物汚染、及びＵＶ照射などの一般的な環境及び保存条件に曝露されたときの高い分解度を実証した。本発明は、外因的送達のためにＲＮＡが常温安定であることを可能にし、汚染又は環境条件に起因するＲＮＡ分解を排除又は低減する製剤を提供することを目的とする。

様々な実施形態は、バイオポリマーの固有の負電荷及び水溶性の両方による、ｄｓＲＮＡの送達のための可溶性液体濃縮型製剤に関する。製剤タイプは、活性成分が製剤媒体中で完全に可溶化される、水性ベースの濃縮物を特徴とする。可溶性液体濃縮製剤の不活性成分又は補助成分は、必要に応じて活性成分を安定化又は分解から保護するのに役立つ製剤特異的なものに加えて、いくつかのクラスの補助成分を含み得る。製剤設計は、様々な実施形態により、低温での凍結を防止するための不凍剤、微生物及び真菌防護のための１つ以上の広域スペクトル保存剤成分、安定性及び植物への葉面適用を促進する一次界面活性剤、スプレータンク内での希釈時に持続的な泡を防ぐ消泡剤、ｄｓＲＮＡの酸／塩基加水分解を防ぐｐＨ緩衝液として指定される補助成分を含み得る。しかしながら、ｄｓＲＮＡはバイオポリマーであり、他のポリマー又は小分子とは共通ではない特異的な分解問題に直面しているため、追加の補助成分が、様々な実施形態によれば、二価金属カチオンを封鎖することによってヌクレアーゼ活性を阻害するのに役立つ金属イオンキレーター、及びＵＶ照射による葉面適用後のｄｓＲＮＡの分解を防止するコンジュゲート化芳香族官能基（好ましくは、ポリマー）からなるアニオン分散剤型界面活性剤を含むように添加され得る。いくつかの実施形態は、抗微生物効果を有する追加の界面活性剤としてカチオン性又は双性イオン薬剤（本明細書において「二次界面活性剤」とも称される）を更に含む。

様々な実施形態は、葉面適用のためのｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを含有する常温安定な可溶性液体濃縮製剤を提供し得る。製剤組成物は、様々な実施形態により、別のものではＲＮＡの急速な分解をもたらす一般的な汚染物質及び環境条件の存在下で、ＲＮＡの安定性を促進し得る。

様々な実施形態は、外因的な葉面適用のための低毒性及び高選択性ＲＮＡｉ処置を提供し得る、費用対効果の高いｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡ製剤の製造を可能にする。様々な標的種が、現在の商業的な害虫管理プログラムに対して増強した耐性を示しているため、農工業における葉面適用としてのＲＮＡｉ技術の使用可能性は特に有益である。

製剤開発プロセス中、各個々の成分は、製剤設計の必要性に応じて、性能、安定性、及び相溶性のために選択された。表１は、例示的な製剤の成分のリスト、並びに全体的な製剤における各成分機能の簡潔な一般化した説明を提供する。

様々な実施形態は、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを、製剤の植物への外因的な葉面適用を介して害虫に送達するための製剤に関する。様々な実施形態によれば、製剤は、可溶性液体濃縮物であり得る。様々な実施形態によれば、製剤は、ＲＮＡ、一次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤、任意選択的に二次界面活性剤、任意選択的にＵＶ保護剤、任意選択的に緩衝液、任意選択的に生物学的保存剤、任意選択的に消泡剤、並びに任意選択的に不凍剤を含み得る。いくつかの実施形態において、製剤は、ＲＮＡ、一次界面活性剤、金属イオン封鎖剤、及び二次界面活性剤、任意選択的にＵＶ保護剤、任意選択的に緩衝液、任意選択的に生物学的保存剤、任意選択的に消泡剤、並びに任意選択的に不凍剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ＲＮＡ、一次界面活性剤、金属イオン封鎖剤、及びＵＶ保護剤、任意選択的に二次界面活性剤、任意選択的に緩衝液、任意選択的に生物学的保存剤、任意選択的に消泡剤、並びに任意選択的に不凍剤を含む。

様々な実施形態は、組成物及びＲＮＡの植物への外因的な葉面適用を介した、害虫へのＲＮＡの送達を促進するのに十分な安定性をＲＮＡに提供するための組成物に関する。組成物は、一次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤、任意選択的に二次界面活性剤、ＵＶ保護剤、任意選択的に緩衝液、任意選択的に生物学的保存剤、任意選択的に消泡剤、任意選択的に不凍剤を含み得る。組成物は、一次界面活性剤、金属イオン封鎖剤、及び二次界面活性剤、任意選択的にＵＶ保護剤、任意選択的に緩衝液、任意選択的に生物学的保存剤、任意選択的に消泡剤、並びに任意選択的に不凍剤を含み得る。組成物は、一次界面活性剤、金属イオン封鎖剤、及びＵＶ保護剤、任意選択的に二次界面活性剤、任意選択的に緩衝液、任意選択的に生物学的保存剤、任意選択的に消泡剤、並びに任意選択的に不凍剤を含み得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、ＲＮＡは、本明細書に記載の任意の好適なｄｓＲＮＡ又はＲＮＡであり得る。上記の製剤の様々な実施形態によれば、ＲＮＡは、製剤の総重量に基づいて約０．０５～約１０重量パーセント、又は製剤の総重量に基づいて０．２５～約２重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤の様々な実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡは、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、２、２．０５、２．１、２．１５、２．２、２．２５、２．３、２．３５、２．４、２．４５、２．５、２．５５、２．６、２．６５、２．７、２．７５、２．８、２．８５、２．９、２．９５、３、３．０５、３．１、３．１５、３．２、３．２５、３．３、３．３５、３．４、３．４５、３．５、３．５５、３．６、３．６５、３．７、３．７５、３．８、３．８５、３．９、３．９５、４、４．０５、４．１、４．１５、４．２、４．２５、４．３、４．３５、４．４、４．４５、４．５、４．５５、４．６、４．６５、４．７、４．７５、４．８、４．８５、４．９、４．９５、５、５．０５、５．１、５．１５、５．２、５．２５、５．３、５．３５、５．４、５．４５、５．５、５．５５、５．６、５．６５、５．７、５．７５、５．８、５．８５、５．９、５．９５、６、６．０５、６．１、６．１５、６．２、６．２５、６．３、６．３５、６．４、６．４５、６．５、６．５５、６．６、６．６５、６．７、６．７５、６．８、６．８５、６．９、６．９５、７、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、７．５、７．５５、７．６、７．６５、７．７、７．７５、７．８、７．８５、７．９、７．９５、８、８．０５、８．１、８．１５、８．２、８．２５、８．３、８．３５、８．４、８．４５、８．５、８．５５、８．６、８．６５、８．７、８．７５、８．８、８．８５、８．９、８．９５、９、９．０５、９．１、９．１５、９．２、９．２５、９．３、９．３５、９．４、９．４５、９．５、９．５５、９．６、９．６５、９．７、９．７５、９．８、９．８５、９．９、９．９５、及び１０重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤の様々な実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡは、製剤の総重量に基づいて約０．２５～約２重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、一次界面活性剤は、本明細書に記載の任意の好適な一次界面活性剤又は一次界面活性剤の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、一次界面活性剤は、製剤若しくは組成物の総重量に基づいて約１～約１０重量パーセントの量、又は製剤若しくは組成物の総重量に基づいて約４～約６重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、一次界面活性剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、及び１５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、一次界面活性剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約１～約１０重量パーセント若しくは約４～約６重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、二次界面活性剤は、本明細書に記載の任意の好適な二次界面活性剤又は二次界面活性剤の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．０１～約３重量パーセントの量で存在し得る。上記のそれ又は組成物の様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．０１～約１重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、及び５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．０１～約３重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。追加の例では、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、二次界面活性剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．０１～約１重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、金属イオン封鎖剤は、本明細書に記載の任意の好適な金属イオン封鎖剤又は金属イオン封鎖剤の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、金属イオン封鎖剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約０．１～約５重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、金属イオン封鎖剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約０．１～約２重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、金属イオン封鎖剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、及び５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、金属イオン封鎖剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．１～約５重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、金属イオン封鎖剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．１～約２重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、ＵＶ保護剤（別名分散剤界面活性剤）は、本明細書に記載される任意の好適なＵＶ保護剤、分散剤界面活性剤、又はそれらの組み合わせ、又は本明細書に記載されるそれらの組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、ＵＶ保護剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約１～約４重量パーセント又は約１～約２重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、ＵＶ保護剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、及び５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、ＵＶ保護剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約１～約４重量パーセント又は約１～約２重量パーセントの量で存在し得、又は記載される下限値と上限値との任意の組み合わせで存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、緩衝液は、本明細書に記載の任意の好適な緩衝液又は緩衝液の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、緩衝液は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約１～約３重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、緩衝液は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、及び５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、緩衝液は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約１～約３重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、少なくとも約２００ｍＭ又は少なくとも約２４２ｍＭの濃度で存在する。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、生物学的保存剤は、本明細書に記載の任意の好適な生物学的保存剤又は生物学的保存剤の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、生物学的保存剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約０．０５～約１重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、生物学的保存剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、及び５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、生物学的保存剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．０５～約１重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、消泡剤は、本明細書に記載の任意の好適な消泡剤又は消泡剤の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、消泡剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約０．０２５～約０．２重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、消泡剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約０．０２５～約０．１重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、消泡剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、及び５重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、消泡剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約０．０２５～約０．１重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。追加の実施形態、上記の製剤又は組成物において、消泡剤は、製剤又は組成物に基づいて、約０．０２５～約０．２重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

上記の製剤又は組成物のいずれかにおいて、不凍剤は、本明細書に記載の任意の好適な不凍剤又は不凍剤の組み合わせであり得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、不凍剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて約５～約１５重量パーセントの量で存在し得る。上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、不凍剤は、下限及び／又は上限を有する範囲内の量で存在し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０重量パーセントから選択することができる。例えば、上記の製剤又は組成物の様々な実施形態によれば、不凍剤は、製剤又は組成物の総重量に基づいて、約５～約１５重量パーセント、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせの量で存在し得る。

様々な実施形態は、植物を害虫から保護する方法に関するものであり、方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによる、製剤を植物に外因的に適用することを含む。製剤は、様々な実施形態により、水を更に含み得る。水は、外因性ＲＮＡｉバイオ農薬を約１５～約３００倍で希釈し得る。水は、下限及び／又は上限を有する範囲内の係数によって外因性ＲＮＡｉバイオ農薬を希釈し得る。範囲は、下限及び／又は上限を含むか、あるいは除外することができる。下限及び／又は上限は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、及び４００から選択することができる。例えば、ある特定の実施形態によれば、水は、外因性ＲＮＡｉバイオ農薬を約１５～約３００、又は記載される下限及び上限の任意の組み合わせ倍で希釈し得る。製剤は、例えば、噴霧することによって、植物の葉群に適用され得る。

様々な実施形態は、組成物及びｄｓＲＮＡの植物への外因的な葉面適用を介して、ｄｓＲＮＡの害虫への送達を促進するのに十分な安定性をｄｓＲＮＡに提供するために、ｄｓＲＮＡを組成物と組み合わせることを含む、ｄｓＲＮＡを安定化させる方法に関する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは溶液中に残存して、５４℃で２週間後に沈殿しない。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、最初のｄｓＲＮＡ濃度を比較してＨＰＬＣによって測定したとき、及びそれを５４℃で２週間後にｄｓＲＮＡ濃度と比較して、検出可能な分解（すなわち、ＨＰＬＣにおける既知の変動の範囲内）又は最小分解（５％未満）の証拠を示さない。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは、５４℃で２週間後に＋／－２単位以下で変化する。いくつかの実施形態では、これらの安定性評価のための期間及び温度条件は、室温で１年間、室温で２年間、５４℃４週間、５４℃８週間、－１０℃で２週間、４℃で２週間、４０℃で２週間、４℃で４週間、４０℃で４週間、４℃で８週間、又は４０℃で８週間である。

表２は、様々な実施形態により、製剤の詳細を提供する。表２に詳述される特定の製剤（又は本明細書に詳述される任意の特定の製剤）は、様々な実施形態に従って可能な製剤の範囲を制限しないことが理解されるべきであり、特定の製剤は単なる例である。

表２に列挙される製剤組成物に加えて、同じ利益を更に提供し、各特定の補助成分の意図された機能を行う代替成分を含有する追加の製剤組成物がある。様々な実施形態による、非限定的な代替組成物が表３及び４に示される。

表３は、様々な実施形態による、例示的な製剤の詳細を提供する。

表４は、様々な実施形態による、例示的な製剤の詳細を提供する。

表５は、様々な実施形態による、例示的な製剤の詳細を提供する。

様々な実施形態によれば、ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの優れた化学的及び物理的安定性を示す製剤は、ＢＩＴ、ＭＩＴ、及びＣＭＩＴの組み合わせなどの広域スペクトル生物学的保存剤の組み合わせを含み得、異なる環境条件下、並びに一般的な細菌性及び真菌性汚染物質への曝露後に、時間経過にわたって溶液中のＲＮＡの安定性を確実にし得る。ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの優れた化学的及び物理的安定性を示す製剤は、カチオン性／双性イオン性二次界面活性剤を更に含み得、これは、本明細書に実施例で提供される細菌負荷試験において、カチオン性界面活性剤が製剤中に有するポジティブな影響及び抗微生物活性、並びにｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡ分解の防止を有するとして特定されている。ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの優れた化学的及び物理的安定性を示す製剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害するＥＤＴＡなど、金属イオンキレーターを更に含み得る。ヌクレアーゼ活性は、様々な環境条件下、及び細菌性又は真菌性汚染後における時間経過にわたるＲＮＡ安定性に対する重要な課題である。金属イオンキレーターを含むことは、ＥＤＴＡによって例示され、酵素ヌクレアーゼ活性に必要な二価カチオンを封鎖することによってヌクレアーゼ活性を阻害するのに役立つ。本ＴＧＡＩ濃度に関連して、ＥＤＴＡの最小濃度が、本明細書に提供される実施例に詳述されるように、実用的な適用のためにｄｓＲＮＡの安定性について決定された。ｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの優れた化学的及び物理的安定性を示す製剤は、リグノスルホネート、又はポリマーコンジュゲート化芳香族界面活性剤を更に含んで、ＵＶ照射によるＲＮＡ分解を防止し得る。ＵＶ照射によるＲＮＡ分解からのこの防止は、適用後及び曝露後に、増加した生物学的有効性に変換される。ｄｓＲＮＡの優れた化学的及び物理的安定性を示す製剤は、一次界面活性剤を更に含んで、ｄｓＲＮＡ及びカチオン性界面活性剤を含有する製剤を安定化し得る。一次界面活性剤は、ｄｓＲＮＡとカチオン性界面活性剤との錯体形成を防止し、製剤化製品に安定性を提供するのに役立ち得る。ＲＮＡの優れた化学的及び物理的安定性を示す製剤は、緩衝液を更に含んで、様々な保存条件にわたってｄｓＲＮＡの酸／塩基加水分解を防止し得る。また、本明細書に提供される実施例において、緩衝液の最適化された濃度が、濃縮製品中、及び希釈時のｄｓＲＮＡの安定性を、特に高いイオン強度条件下で維持するのに役立ち得ることが示されている。

様々な実施形態に従って詳述される製剤組成物は、本明細書に提供される実施例で詳述及び試験されるように、常温安定製剤としてｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを安定化する優れた化学的及び物理的安定性属性を示している。製剤マトリクスは、全ての個々の成分の完全な可溶化を伴う反復可能なＳＬ型製剤を製造する、ｄｓＲＮＡとの非常に良好な相溶性を示している。製剤組成物は、濃縮製品中、及び意図された用途のための希釈時の両方において、ｄｓＲＮＡに優れた物理的及び化学的安定性を付与するために一緒に作用する、いくつかの補助成分及び賦形剤を含有する。１００×希釈で、これらの製剤は、様々な水タイプ及びＤＩ水から１０００ｐｐｍのカルシウム／マグネシウム水までの硬度にわたって安定であることが示されている。様々な水のほとんどで、これらの製剤は、透明な溶液であることが示され、ミセル可溶化として記載されるものを示し、一方、１０００ｐｐｍ水での試料は、３００～６００ｎｍの範囲内にある安定したナノ粒子沈殿物を示す。これらの製剤はまた、－１０℃、４℃、室温、４０℃、５４℃を含む様々な温度条件で保存されており、様々な環境条件にわたってそれらの物理的及び化学的安定性を保持する。様々な条件での保存後、それらはｄｓＲＮＡの安定性についてＨＰＬＣを介して分析されており、可能であれば分解プロファイルを決定する。このＨＰＬＣ分析は、約＋／－１０％の変動性を示すことが知られており、初期濃度と比較してこの既知の変動性内の保存後の試料は、これらの製剤中のｄｓＲＮＡ安定性を示す。保存の前及び後の各製剤のｐＨも測定し、考慮すべき変化は実証されず、様々な保存条件後の化学的及び物理的安定性を示す。例示的な製剤は、非イオン性界面活性剤としてＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡを含有し、濃縮溶液中及び水での希釈時の両方において、既存の製剤マトリクス中のｄｓＲＮＡ及び補助成分の安定性及び可溶化を補助する。例示される製剤はまた、細菌性及び真菌性生物学的汚染からのｄｓＲＮＡの保護を実証する包括的な保存剤パッケージを含有する。この試験の結果は、選択された製剤マトリクスが、この汚染に一度曝露されたいくつかの一般的な細菌及び真菌を分解及び破壊し、細菌性及び真菌性汚染後に拡張された安定性を提供することを示す。多くの細菌及び真菌は、ｄｓＲＮＡのようなバイオポリマーを摂取することができ、細菌及び真菌の増殖及びｄｓＲＮＡ分解を促進する。この二重分解を防止するために、製剤の保存剤成分は、生物学的汚染に耐えて、ｄｓＲＮＡを分解から保護することができなければならず、本試験は、これが選択された製剤で達成されることを実証する。様々な実施形態による製剤は、許容できるレベルの物理的及び化学的安定性を実証し、農業用途を有する可溶性液体濃縮物型製剤のために指定された特定の規制試験に合格し、常温保存で２年にわたって活性成分ｄｓＲＮＡを保護することができる堅牢な設計を有する。実際の適用として物理的及び化学的安定性を実証するｄｓＲＮＡ製剤を提供する能力がない場合、害虫又は病原体管理プログラムの一部としてｄｓＲＮＡを外因的に送達する製剤は存在しない。本開示に記載の製剤組成物は、実用的な適用として溶液中のｄｓＲＮＡ安定性に対する複数の課題に対処し、農業害虫プログラムにおける商業用途のためのｄｓＲＮＡの使用を可能にする。

様々な実施形態は、農業害虫管理プログラムにおけるｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの実用的な適用を可能にするために、ＲＮＡに化学的及び物理的安定性を提供し得る組成物及び製剤を提供する。個々の製剤成分は、濃縮製品中及び適用中の希釈時の両方において、化学的安定性、及び物理的安定性を含むように、ｄｓＲＮＡ製剤の安定性に利点を提供するように選択された。これらの成分の多くは互いに相互作用し、安定性のために最適化された比率を有する。他の指定された成分は、同様の性能を提供する代替成分を有し、一方、他の成分は濃度範囲を有するか、又は代替成分は探究されていない。

溶液中及び適用のための希釈時に安定であり、時間、保存条件、又は汚染による化学分解に耐性である、葉面適用した農業製品として実用的な適用のためのｄｓＲＮＡ又は一本鎖ＲＮＡを含有する可溶性液体濃縮物型製剤の開発。

序文
以下の実施例は、当業者に、本明細書に開示及び特許請求の範囲の、方法をいかに行うか、組成物及び化合物をいかに作製するか、並びにいかに使用するかの完全な開示及び説明を提供するために示される。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差及び偏差が考慮されるべきである。以下の実施例の目的は、様々な実施形態の範囲を限定するのではなく、単に特定の実施形態を例証する例を提供することである。

製剤化方法
各プローブ製剤は、以下の実施例に例示されるプロトコルに従って低剪断及び単純混合を介して製造される。実施例は、成分及び手順の量及びタイプに関する具体的な詳細を提供するが、当業者は、示された具体的な製剤方法によって示唆される幅広い変形を容易に理解するであろう。

実施例１
様々な実施形態による製剤は、以下のプロトコルに従って、低剪断及び単純混合を介して調製された：

反応容器を事前に風袋引きし、それによって適切な重量／容積が追加され、製造中に確認することができる。

容器に、適切な重量のｄｓＲＮＡ材料を添加して、８ｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、又は０．８％のｄｓＲＮＡの最終濃度に到達させる。

オーバーヘッドミキサーユニットに装備された下部３プロペラブレードを、ｄｓＲＮＡを含む容器に入れ、溶液中に穏やかな渦を生じるのに必要な最小速度、およそ４５０ＲＰＭを使用して、低剪断で撹拌する。容器への残りの添加を通して穏やかな撹拌を維持し、必要に応じてＲＰＭを、ｄｓＲＮＡの剪断を避けるため最小限で増加させる。

容器に生物学的保存剤、例えば、０．１％のＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ、及び０．０５％のＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰを添加する。完全に混合されるまで４５０ＲＰＭでおよそ１分間撹拌する。

容器に、不凍剤、例えば、１０％のプロピレングリコールを添加する。この混合物を５００ＲＰＭで、得られた溶液が透明な黄色の溶液になるまでおよそ２分間撹拌する。

容器に金属イオン封鎖剤、例えば、１．５８３％ＥＤＴＡを５００ＲＰＭで撹拌しながら添加する。

容器に緩衝液、例えば、１２．１０％の２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７溶液を添加する。緩衝液及びＥＤＴＡ溶液の添加で、製剤はわずかに濁るが、数分間の撹拌後に透明な溶液に戻る。６００ＲＰＭおよそ５分間。

容器に０．０５％の消泡剤を添加する。後の実施例で詳述されるように、様々な消泡剤を試験した。６００ＲＰＭで完全に混合されるまで撹拌し、わずかに濁った黄色がかった溶液がおよそ２分間で生じる。

容器に５％の一次界面活性剤を添加し、ＲＰＭをゆっくりと９００ＲＰＭに上昇させる。後の実施例で詳述されるように、様々な一次界面活性剤を試験した。

容器に二次界面活性剤、例えば、最大０．２５％の塩化セトリモニウム、又は最大１％のラウリルベタインを添加する。塩化セトリモニウム又はラウリルベタインの直接添加で、わずかな局所的な濃度の沈殿物が観察されるが、溶液中にすばやく溶解されるであろう。全ての材料が完全に可溶化され、得られた溶液がわずかに混濁し、わずかに黄色になるまで、溶液を９００ＲＰＭでおよそ２分間撹拌し続ける。四級アンモニウム化合物（例えば、ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ）が、二次界面活性剤の存在なしに一次界面活性剤として添加される場合、四級アンモニウム化合物はＲＮＡと相互作用して、製剤中のｄｓＲＮＡの即時の不安定性をもたらし得る。

容器に最大１．５％のＵＶ保護剤（分散剤界面活性剤としても知られる）を加え、９００ＲＰＭで２分間撹拌させる。

容器に適切な重量パーセントの水を加えて、目標製剤重量に到達させる。溶液が完全に混合されるまで、５００ＲＰＭでおよそ１分間撹拌する。

次に、各成分が完全に組み込まれるまで、この試料を低剪断を介して混合し、得られた液体は、低粘度を有する半透明でわずかに濁った、わずかに黄色がかった液体でなければならない。ナフタレンスルホネート縮合物又はリグノスルホネートが、任意選択的なＵＶ保護剤（分散剤界面活性剤としても知られる）として使用される場合、得られる液体は、低粘度を有する暗褐色の液体となる。

本明細書に記載の方法又は当該技術分野で既知の任意の他の方法は、様々な成分を様々な濃度で使用して本開示の組成物を製造するために使用することができる。

実施例２～６：製剤相溶性
これらの実施例は、一次界面活性剤、及び様々な実施形態により、同様に緩衝液の重要性を実証する。製剤相溶性は、物理的観察によって特性評価される。可溶性液体濃縮物型製剤として、全ての成分は水に容易に可溶化されるべきであり、任意の沈殿、凝集、相分離、又は混和性の問題は、製剤成分が相溶性ではないことの指標である。一般に、様々な実施形態による製剤は、相溶性の問題を有さず、低粘度を有する微細な可溶化製剤を生成することが特定されている。製剤は、主に半透明であるが、場合によってはわずかに懸濁しており、透明から黄色がかった溶液までである。

これらの実施例の目的のために、ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡを一次界面活性剤として使用し、４～６重量％の濃度範囲の間で安定であることが決定された。これらの特定された範囲を上回るか、又は下回る一次界面活性剤の濃度を調整することは、これらの実施例では、成分を列挙された濃度で有する組成物において、濃縮製品に著しい量の沈殿をもたらすことが実証された。

様々な実施形態による製剤組成物は、ｐＨ７若しくは約ｐＨ７のリン酸緩衝液、又は別の実施形態ではｐＨ６若しくは約ｐＨ６のクエン酸緩衝液などの緩衝液を含み得る。これらの実施例の目的及び本明細書における他の箇所では、「リン酸緩衝液」という用語は、一塩基性リン酸カリウム及び二塩基性リン酸カリウムの特定の比率を含む緩衝液を指す。より具体的には、二塩基性リン酸カリウムに対する一塩基性リン酸カリウムの０．１～１．１質量比は、６．５～７．５のｐＨ範囲に及ぶ。様々な実施形態によれば、冷蔵温度を超えて保存する場合、又は保存温度が著しく変動する場合、緩衝液の添加は、時間経過にわたって、並びに異なる温度条件下での保存期間中に、酸／塩基加水分解を防止におけるｐＨ安定系を維持するために製剤にとって重要である。酸／塩基加水分解の防止のためのこの安定性の利点に加えて、緩衝液系は、電解質ベースの系の溶解性を維持することにおいて特定の安定性の利点を提供する。リン酸緩衝液の不存在又はモル量の減少は、濃縮製剤の沈殿をもたらし得る。

実施例２
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄは、様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後の適合製剤の写真を示す。

図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに示す製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表６による組成を有した。

上記のように、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに示される製剤試料中の一次界面活性剤は、製剤中に５重量％の使用率で、ＥＯ：ＰＯ修飾アルコールエトキシレート型界面活性剤であるＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡだった。ｄｓＲＮＡを含有する製剤の安定性及び相溶性は、界面活性剤化学における変化、及び製剤内の濃度範囲に影響を受ける。様々な濃度のＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡを使用して試験を行い、これらの特定の製剤は、５重量％で安定であることが見出された。

実施例３
この実施例は、変動させた濃度の一次界面活性剤、特にＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡとの相溶性及び安定性が不十分な製剤を示す。

図２Ａ及び２Ｂは、様々な実施形態による例であり、５４℃で保存後、それぞれ１０重量％及び５重量％のＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。１０％のＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡの濃度で、はっきりと目視可能な沈殿物が、ｄｓＲＮＡを含有する製剤で形成される。５％のＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡを含有する製剤は、著しい沈殿の徴候なしに、安定であることが見出されている。同様の結果が、－１０℃～５４℃の範囲の保存条件で実証された。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表７による組成を有した。

実施例４
この実施例は、変動させた濃度の一次界面活性剤、特にＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡとの相溶性及び安定性が不十分な製剤を更に示す。

図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄは、様々な実施形態による例であり、それぞれ５重量％、４．５重量％、４．０重量％、及び３．５重量％でＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ濃度を有する製剤の写真を示す。５％濃度のＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡで沈殿物は観察されず、これらの試験した組成物中の５％未満のＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡの濃度を有する製剤において、許容限度内で少量の目視可能な沈殿物が観察された。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表８による組成を有した。

実施例５
この実施例は、表９の製剤組成物中の金属イオン封鎖剤の欠如及び緩衝液の欠如によってもたらされた不十分な安定性を実証する。図４は、金属イオン封鎖剤を有しないこの製剤の写真を示し、ｄｓＲＮＡの著しい沈殿を示す。示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表９による組成を有した。

実施例６
この実施例は、製剤組成物中の緩衝液の濃度及びＥＤＴＡの濃度に起因するより低い安定性を実証する。

図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅは、様々な実施形態による例であり、それぞれ２４２ｍＭ、２００ｍＭ、１５０ｍＭ、１００ｍＭ、及び５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝液を有する製剤の写真を示し、図５Ｃ、図５Ｄ、及び図５Ｅでは、リン酸緩衝液濃度及びＥＤＴＡ濃度が著しく低減されており、許容できる限界内であるが、限られた量の目視可能な沈殿を示す。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表１０による組成を有した。

実施例７～９：粒子サイズ及び水硬度安定性
粒子サイズ測定は、重要な物理的パラメータであり、ｄｓＲＮＡを含有する製剤が希釈時に安定であるかを決定するために使用される。製剤が安定しているかを決定するために、試料は、３５ｐｐｍ水、３４２ｐｐｍ水、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍ水としてＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって特定されたＣＩＰＡＣ標準水中に噴霧適用率で希釈され、４：１のＭｇ^２＋：Ｃａ^２＋イオン溶液からおおまかに構成される。希釈時に、試料を２４時間放置して任意の物理的不安定性を観察し、次いで粒子サイズを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＤＳ、又は他の好適なＤＬＳ装置を使用してＤＬＳ測定を介して収集する。物理的安定性試験は、技術グレード活性成分（ＴＧＡＩ）として供給されるｄｓＲＮＡと緩衝液系との間の最適な比率を、特に、高イオン含有量を有する水で希釈した場合に決定している。

実施例７
選択した製剤プローブを、エーカー当たり２０ガロンの適用体積を使用して、最大フィールド使用率に相当する濃度で水に希釈した。試験した各水条件は、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８標準方法に従って調製した。粒子サイズ測定及び物理的観察を、希釈直後及び２４時間後に試料について行った。成功した製剤の結果がこの実施例に示され、視覚的外観及びＤＬＳを介した粒子サイズの中央値を示す。

表１１は、様々な水条件下で選択された製剤希釈について動的光散乱によって測定された粒子サイズ、多分散性、及び係数速度を示す。低い計数速度及び３１０～３３０ｎｍのＺ平均粒子サイズは、希釈後の製剤が非常に低い濃度の粒子を有し、室温での溶液中で安定であることを示す。

図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈直後に撮影された。図６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、及び６Ｈは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表１２による組成を有した。

実施例８
希釈時の製剤安定性への追加の態様は、ＴＧＡＩ濃度に対するリン酸緩衝液の比率である。証拠は、緩衝液濃度とＴＧＡＩ入力源との間の比率を最大化することが、高イオン強度（硬）水での希釈時に製剤により高い安定性をもたらすことを示している。高イオン強度水での希釈時の安定性におけるこの影響は、濃縮製剤の安定性に反しており、これは、ＴＧＡＩに対する緩衝液の比率が最小化されるときに、より高い安定性を示す。緩衝液とＴＧＡＩとの間の最適化された比率（緩衝液組成物に対するＴＧＡＩの０．２超の質量比）は、濃縮製剤における安定性を提供している例示された組成物及び様々なイオン強度水での希釈で選択されている。

図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、及び７Ｄは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。図７Ｅ、７Ｆ、７Ｇ、及び７Ｈは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１５０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。図７Ｉ、７Ｊ、７Ｋ、及び７Ｌは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、１００ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。図７Ｍ、７Ｎ、７Ｏ、及び７Ｐは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、２０ｍＭのリン酸緩衝液及び２１ｍＭのＥＤＴＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。

示されているように、リン酸緩衝液の濃度を低下させ、ＴＧＡＩと緩衝液との間の比率を増加させることは、高イオン強度水中でより良好な溶液安定性をもたらす。これは、試料を左から右に見て、２４時間後に、１０００ｐｐｍ水での沈殿の消失によって示される。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表１３による組成を有した。

実施例９
この実施例は、４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡ濃度で、緩衝液に対するＴＧＡＩの比率に関して、高イオン強度水での希釈で製剤の安定性に対する影響について観察を提供する。ｄｓＲＮＡ濃度が現在の組成物中で８ｇ／Ｌに倍増されると、ＴＧＡＩ入力濃度もおおよそ倍増される。入力ＴＧＡＩのこの増加の結果として、緩衝液とＴＧＡＩとの間の比率も、結果として増加され、それ以外は同等な製剤組成物間で改善を有する。同じ濃度のリン酸緩衝液を用いた４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡ及び８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡでの対応するＴＧＡＩ入力間のこの例が、以下の図に示される。

図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、及び８Ｄは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。図８Ｅ、８Ｆ、８Ｇ、及び８Ｈは、様々な実施形態による例であり、それぞれ３５ｐｐｍ、３４２ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、及び１０００ｐｐｍでの水に希釈された、４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤の写真を示し、写真は、水への希釈の２４時間後に撮影された。これらの図は、リン酸緩衝液に対するＴＧＡＩの比率の結果として、高イオン強度水における溶液安定性の差を示す。リン酸緩衝液に対するＴＧＡＩの比率がおおまかに２倍増加した試料は、１０００ｐｐｍ水での希釈後、２４時間後に同じ沈殿物を示さない。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表１４に示される組成を有した。

希釈時の溶液安定性における緩衝液濃度の重要性は、以下のように要約することができる。一般的な傾向は、リン酸濃度に対するＴＧＡＩの比を増加させると、高イオン強度の水を使用する場合、希釈時の製品の安定性に改善をもたらすことを示すことが観察された。リン酸緩衝液濃度の低下は、ＴＧＡＩと緩衝液との間の最大化した比率である条件をもたらし、高イオン強度水での希釈時の溶液安定性に役立つ。希釈時の溶液中の安定性に対するリン酸緩衝液濃度のこの影響は、濃縮製品における安定性に対するリン酸緩衝液濃度の効果に反することに留意することが重要である。これらの効果を念頭において、２４２ｍＭの濃度は、濃縮溶液における安定性で「最大化」されるが、高イオン強度水での希釈時の溶液中の安定性で「最小化」される。リン酸緩衝液濃度の低下は、高イオン強度水での希釈時に溶液中の安定性に正の影響を与えるが、濃縮溶液中の安定性に負の影響を与える。リン酸緩衝液濃度の増加は、高イオン強度水での希釈時に溶液中の安定性に負の影響を及ぼすが、濃縮溶液中の安定性に正の影響を及ぼし、したがって、２４２ｍＭのリン酸緩衝液での高イオン強度水の最適化されたバランスを、両方の条件での安定性のために選択した。この影響、及びこの一般的な傾向の観察が表１５に示される。

表１５は、濃縮製品中、及び高イオン強度水中での希釈時の製剤安定性におけるリン酸緩衝液濃度の明らかな効果を実証する。

実施例１０～１２：保存期間安定性：保存後の物理的及び化学的安定性
保存期間安定性及び加速保存試験を、可能性のある各製剤の小分け（最小５０ｍＬ）を以下の環境条件に配置することによって行う：－１０℃、４℃、室温、４０℃、５４℃、及び２４時間ごとに－１０℃から４０℃の間で凍結／解凍温度サイクル。試料はこれらの条件で、分析前に最低２週間、４０℃で８週間保存し、分析は、最初の試料、又は４℃で保存した試料からの小分けと比較した物理的及び化学的安定性によって決定される。化学的安定性は、固相抽出ベースのＨＰＬＣ方法を利用するＨＰＬＣによる定量によって決定される。化学的安定性はまた、リボグリーン試薬、核酸結合試薬、及び蛍光分光法を、製造業者のプロトコルに従って使用して検証される。物理的安定性は、いずれかの色調変化、沈殿、凝集、相分離、細菌又は真菌増殖、ｐＨの変化、濁度の変化、離水又は上部澄明化、及び希釈時の粒子サイズの変化に注目することによって決定される。

製剤化されたｄｓＲＮＡは、加速保存条件の後、及び－１０℃～５４℃の温度範囲にわたって非常に安定であることが示される。非製剤化ｄｓＲＮＡは、高温に対してこの同じ安定性を示さず、５４℃で２週間以内の保存で急速に分解する。かかる加速保存条件は、長期間にわたるそれほど極端でない温度での安定性を試験するために頻繁に使用される。例えば、５４℃で２週間は、室温で１年間の保存を表すために一般的に使用される。（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １６，２０１２ Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ ｒｅｇａｒｄｉｎｇ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを参照されたい）。

実施例１０（比較）
この比較例は、非製剤化ｄｓＲＮＡが高温に対してこの同じ安定性を示さず、５４℃で２週間以内に急速に分解することを実証する。表１６は、高温で保存した場合の非製剤化ｄｓＲＮＡの化学的分解を示す。注目すべきは、５４℃で２週間保存された未製剤化ｄｓＲＮＡについて示される顕著な分解プロファイルである。

実施例１１
プローブ製剤の化学的安定性は、列挙された環境条件下での保存の前及び後のＨＰＬＣ分析によって実証される。このＬＣ分析の結果を図９及び表１７に示す。

図９は、様々な実施形態による例であり、－１０℃、４℃、４０℃、及び５４℃で保存した後の様々な製剤における化学的安定性について高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）結果を示す。試料は、８ｇ／Ｌ及び４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含有する製剤について収集された。製剤は、加速保存条件において、４０℃で８週間、５４℃で２週間、－１０℃で２週間、並びに４℃で２及び８週間の試験した時間経過にわたってｄｓＲＮＡの分解を示さない。したがって、結果は、試験した全ての製剤が室温で少なくとも１年間安定であり続けることを示す。

示された製剤は、実施例１に記載されている方法に従って調製され、表２２による組成を有した。

表１７は、上記の保存条件後のＨＰＬＣを介したｄｓＲＮＡの化学的安定性を実証するデータを示す。この表に記載されるように、ｄｓＲＮＡのＨＰＬＣ測定は、かなり高い分解率を示した表１６の未製剤化ｄｓＲＮＡと比較して、製剤試料中で１０％未満のｄｓＲＮＡ分解を示した。製剤化組成物におけるこれらの測定は、ＨＰＬＣ測定で予想される１０％の変動内にあり、ｄｓＲＮＡの分解が最小限であることを示す。

実施例１２
製剤化した試料はまた、保存後のｐＨにおけるいずれの変化についても評価し、これらの結果を表１８に示す。ｐＨにおける変化は、物理的又は化学的不安定性を示し、例示的な製剤組成物によって示されない。

表１８は、加速保存条件後の製剤化ｄｓＲＮＡのｐＨ安定性に関するデータを示す。様々な保存条件後のｐＨにおける顕著な変化は、初期サンプリング状態から観察されない。物理的及び化学的安定性の指標、並びに製剤における保存期間中のｄｓＲＮＡの潜在的な酸／塩基加水分解の防止。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表１９による組成を有した。

実施例１３～１８：持続的な発泡試験
希釈した系として最大の表示した倍率で各製剤の持続的な泡を、ＣＩＰＡＣ ＭＴ ４７に従って測定する。この実験で使用した目盛り付きシリンダーは、試験方法で指定された要件に適合する２５０ｍＬシリンダーである。これは、静置１分後の最大体積として報告される。

実施例１３
葉面適用のためのｄｓＲＮＡを含有する製剤は、保存安定性のためにｄｓＲＮＡを安定化し、希釈したスプレー溶液として使用するために開発されている。ｄｓＲＮＡ分解を防止するため、並びにｄｓＲＮＡを含有する常温安定製剤を可能にするための製剤中での界面活性剤及び他の安定剤の使用は、葉面適用のためにスプレー溶液に希釈されたとき、かなり持続的な泡をもたらす。製剤組成物における消泡タイプの化合物の添加は、実際の適用のために希釈時にこの持続的な泡を低減又は除去することが要求される。典型的な消泡剤は、ｄｓＲＮＡ及び他の補助成分とともに製剤化されるときに顕著な安定性課題を示すことが見出されており、高い電解質含有量を有する水性ベースの製剤として分類することができる。例示的な製剤組成物は、様々な保存条件にわたってｄｓＲＮＡ製剤で優れた安定性を示し、一方でまた、スプレー溶液での希釈時に優れた泡低減を提供する消泡タイプの成分を含有する。製剤におけるこの相溶性、及び持続的発泡試験の結果を本実施例に示す。

図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、及び１１Ｂは、様々な実施形態による例であり、－１０℃で２週間、４℃で２及び８週間、４０℃で８週間、５４℃で２週間保存した後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む相溶性製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を実証する。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２０による組成を有した。

実施例１４
この実施例は、様々な製剤における相溶性及び持続的な発泡試験の更なる結果を実証する。図１２Ａ及び１２Ｂは様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。図１２Ｃ及び１２Ｄは、様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＨａｌｉｆａｘ－ＣＡＮ ＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。図１２Ｅ及び１２Ｆは、様々な実施形態による例であり、ＣＩＰＡＣ ＭＴ １８によって指定されるように、それぞれ３４２ｐｐｍ水で３００×及び１５×の倍率で希釈した、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びＴＧＡＩ源から得られた８ｇ／ＬのｄｓＲＮＡを含む製剤について持続的な発泡試験結果の写真を示し、１分間静置すると、持続的な泡の不存在、及び各段の泡低下を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２１による組成を有した。

実施例１５
この実施例は、ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含有する製剤について得られた結果もまた、５４℃で２週間、４０℃で８週間保存され、加速保存条件を完了したことを実証する。これらの製剤は、ｄｓＲＮＡの優れた安定性を示し、試験した時間経過にわたって物理的に安定したままである。消泡剤として使用するための乳化シリコーンベースの油から主になる、いずれのわずかな沈殿事象も、製剤中で劇的に最小化されており、存在する場合、１５０ｕｍ篩を通過することができる。

図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅ、１３Ｆは、様々な実施形態による例であり、４０℃での８週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。図１３Ｇ、１３Ｈ、１３Ｉ、１３Ｊ、１３Ｋ、１３Ｌは、様々な実施形態による例であり、５４℃での２週間保存後のＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤を含む製剤の写真を示し、優れたｄｓＲＮＡ安定性を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２２による組成を有した。

実施例１６
この実施例は、製剤中の０．０５％の指定された使用率でＳＡＧ １５７２（商標）を含む製剤組成物について結果を示す。この濃度は、製剤中の消泡剤の総濃度を低減することを目的とした滴定試験後に特定された。この最小使用率は、希釈時の溶液中の泡低減の有効性を評価することによって特定され、結果は以下の図にみることができる。

図１４Ａ及び１４Ｂは、様々な実施形態による例であり、それぞれ、３４２ｐｐｍ水で４００×及び１００×で希釈した、０．０２５％ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びｄｓＲＮＡを含む製剤について滴定アッセイの写真を示す。図１４Ｃ及び１４Ｄは、様々な実施形態による例であり、それぞれ、３４２ｐｐｍ水で４００×及び１００×で希釈した、０．０５％ＳＡＧ １５７２（商標）消泡剤及びｄｓＲＮＡを含む製剤について滴定アッセイの写真を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２３による組成を有した。

実施例１７
実施例１４～１６に例示されるように、ＳＡＧ １５７２（商標）は、様々な実施形態による製剤中の消泡剤として最も優れた安定性及び有効性の結果を示したが、いくつかの他の消泡成分を相溶性及び泡低減について試験した。この実施例は、ＳＡＧ １５９９（商標）が、ＳＡＧ １５７２（商標）よりも、試験した組成物により高い安定性を提供することを実証する。

図１５は、様々な実施形態による例であり、濃縮製剤におけるＳＡＧ １５９９（商標）の不相溶性及び物理的安定性を示す写真を示す。保存期間中の製剤におけるシリコーン及び油粒子の凝集は、油ベースの消泡成分を高塩水性製剤に製剤化することの安定性の課題を強調する。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２４による組成を有した。

実施例１８
この実施例は、ＡＮＴＩＦＯＡＭ ＧＮ１１Ｐ（商標）が、ＳＡＧ １５７２（商標）と比較して泡低減の有効性の低下をもたらすことを実証する。

図１６は、様々な実施形態による例であり、０．２％ＡＮＴＩＦＯＡＭ ＧＮ１１Ｐ（商標）を含む製剤の静置１分後の写真を示す。調製されたこの製剤について顕著な泡低減特性は観察されず、消泡成分は溶液中で他の選択肢ほど有効ではないと決定された。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２５による組成を有した。

実施例１９～２２：細菌性及び真菌性生物学的汚染負荷試験
細菌性及び真菌性生物学的汚染試験は、これらの製剤を使用して行い、容器が非密封であり使用前に汚染した場合に発生する可能性のある細菌性及び真菌性汚染に耐えるためのそれらの固有の能力を評価した。これらのアッセイは、米国薬局方チャプター５１：抗微生物効果試験（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｃｈａｐｔｅｒ ５１：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の改定版を使用して行った。この試験方法では、各製剤は、選択した殺生物性及び殺真菌性保存剤ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ及びＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓの添加及び無添加で、細菌又は真菌カクテル負荷に供され、選択された生物が材料に導入されて、生物数における増殖又は減少を評価する。真菌カクテルには、以下の真菌培養が選択されており、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（糸状モルフ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（酵母モルフ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ（一般的な汚染菌、糸状）、及びＡｕｒｅｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ（一般的な汚染菌、二形性）が含まれる。細菌カクテルには、以下の細菌培養物が選択されており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（一般的な汚染菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（プロテアーゼ及びＲＮＡｓｅを排出する芽胞形成性耐熱細菌）、及びＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓが含まれる。この試験を行うために、各製剤の４０ｍＬを、保存剤の添加及び無添加で、滅菌コニカルに小分けし、試料を細菌又は真菌カクテルのいずれかを添加する。細菌カクテル及び真菌カクテルの両方を、それぞれ１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ及び１×１０^５ＣＦＵ／ｍＬを超える目標濃度を用いて、製剤に１％（ｖ／ｖ）で添加する。各試料は、細菌及び真菌の増殖を促進するために、３０℃で４週間保存する。試料中の細菌及び真菌の濃度を評価するために、０、１、７、１４、２１、及び２８日目に連続して試験のために小分けを採取する。細菌数は、試験する小分けをトリプシンダイズプレートに広げること、３０℃で１～３日間インキュベートすること、細菌増殖について毎日確認してから全細胞数を得ることによって行わる。真菌数は、試験する小分けをサブローデキストロース寒天プレートに広げること、２５℃で３～５日間インキュベートすること、及び細菌増殖について毎日確認してから全細胞数を得ることによって行われる。生物学的汚染は、希釈係数を乗じた測定されたコロニーの全数によって決定されるＣＦＵ／ｍＬで記録され、必要に応じて、ミリリットルでの試料の総体積によって除される。

ｄｓＲＮＡを含有する製剤は、保存中の長期にわたる細菌性及び真菌性汚染からのｄｓＲＮＡの分解に特に影響を受け易い。開発された製剤は、常温保存中のｄｓＲＮＡの細菌及び真菌の分解を阻害する保存剤及び界面活性剤パッケージを含有する。非製剤化ｄｓＲＮＡは、１０^４ＣＦＵレベルの真菌性汚染に曝露された場合、保存の２１日以内にｄｓＲＮＡの著しい分解を示す。非製剤化ｄｓＲＮＡは、１０^７ＣＦＵレベルの細菌性汚染に曝露された場合、保存の２１日以内にｄｓＲＮＡの完全な分解を示す。この製剤のために開発されている追加のカチオン性界面活性剤パッケージではない保存剤パッケージで処理されているｄｓＲＮＡは、１０^４ＣＦＵレベルの真菌性汚染に曝露された場合、保存の４２日後にｄｓＲＮＡの著しい分解を示さない。この製剤のために開発された追加のカチオン性界面活性剤パッケージではない、保存剤パッケージで処理されている未製剤化ｄｓＲＮＡ又はＴＧＡＩは、１０^７ＣＦＵレベルの細菌性汚染に曝露された場合、保存の１４日後にｄｓＲＮＡの著しい分解を示す。例示される製剤組成物に特異的な保存剤及び界面活性剤パッケージで処理されている全ての製剤化ｄｓＲＮＡは、１０^４ＣＦＵの真菌性汚染及び１０^７ＣＦＵの細菌性汚染で汚染された場合、ｄｓＲＮＡの優れた安定性を実証する。追加のカチオン性界面活性剤パッケージではない、保存剤パッケージで処理された非製剤化ｄｓＲＮＡ、又はＴＧＡＩの分解プロファイルは、細菌性汚染による分解からのｄｓＲＮＡの完全な保護を確実にするために必要な成分として、カチオン性界面活性剤パッケージの必要性及び有用性を実証する。このデータセットは、特に、ＢＩＴ、ＣＭＩＴ、及びＭＩＴからなる従来の広域スペクトル保存剤パッケージを使用したときでさえ、追加の保存剤成分の利点を強調する。ＨＰＬＣ定量、及びバイオバーデン胞子数測定は、ｄｓＲＮＡを含有する製剤が、１～７日以内にバイオバーデンレベルを排除し、３７℃で４２日間の保存にわたっていずれのｄｓＲＮＡ分解も防止することの両方において、かなりの細菌性及び真菌性汚染に耐えることができることを実証している。これは、１～７日の間に細菌及び真菌胞子が分解するが、１４日後に細菌性汚染によるｄｓＲＮＡ分解を示す、保存剤単独で処理される非製剤化ｄｓＲＮＡとは異なる。これは、製剤が生物学的汚染のための胞子数のノックダウン、及び同じ期間にわたる生物学的汚染による分解からのｄｓＲＮＡの保護の両方において提供するｄｓＲＮＡへの特定の安定性の利点を実証する。以下の実施例は、非製剤化及び製剤化ｄｓＲＮＡについて、細菌及び真菌負荷後のバイオバーデンレベル、並びに細菌及び真菌負荷後のｄｓＲＮＡ分解プロファイルを示す。

実施例１９
図１７は様々な実施形態による例であり、未製剤化ｄｓＲＮＡ（第１カラム）、ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ及びＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓを用いて製剤化したｄｓＲＮＡ（カラム２～４）、並びに表２６に示すように製剤化したｄｓＲＮＡ（カラム５～７）の結果を示す。図は、様々なパッケージの使用が、細菌カクテルの１０^７ＣＦＵを用いた汚染後のバイオバーデンレベルの低減に役立つことを実証する。

実施例２０
図１８は、様々な実施形態による例であり、１０^７ＣＦＵの細菌カクテルを用いた汚染後、非製剤化ｄｓＲＮＡ（「ＴＧＡＩ ＨＡＬ ＣＡＮ ｎｏ ｂｉｏ＋ＢＣ」と表示）、ＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ及びＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰで製剤化されたｄｓＲＮＡ（「ＴＧＡＩ．．．ＢＣ」と表示）、並びに表２６に示される製剤化ｄｓＲＮＡ（「ＦＯＲＭ．．．」と表示）のｄｓＲＮＡ分解プロファイルを示す。ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮは、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。これらの結果は、ＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ及びＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ単独は、期間にわたって細菌感染を排除するのにいくらかの有効性を有したが、細菌が排除された後でさえ存続した残存細菌ヌクレアーゼ活性のために、ｄｓＲＮＡに安定性を提供することにそれら自体では効果的ではなかったことを示す。表は更に、金属イオン封鎖剤とともに製剤化した試料が、ヌクレアーゼ活性を阻害し、二次界面活性剤と組み合わせて、汚染後３７℃で保存の４２日間後、細菌負荷後に強い安定性を提供したことを実証する。

実施例２１
図１９は様々な実施形態による例であり、未製剤化ｄｓＲＮＡ（第１カラム）、ＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ及びＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓを用いて製剤化したｄｓＲＮＡ（カラム２～４）、並びに表２６に示すように製剤化したｄｓＲＮＡ（カラム５～７）の結果を示す。図は、様々なパッケージの使用が、１０^４ＣＦＵの真菌カクテルを用いた汚染後にバイオバーデンレベルの低減に役立つことを実証し、ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮは、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。

実施例２２
図２０は、様々な実施形態による例であり、１０＾４ＣＦＵの真菌カクテルを用いた汚染後、非製剤化ｄｓＲＮＡ（「ＴＧＡＩ ＨＡＬ ＣＡＮ ｎｏ ｂｉｏ＋ ＢＣ」と表示）、ＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ及びＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰで製剤化されたｄｓＲＮＡ（「ＴＧＡＩ．．．ＢＣ」と表示）、並びに表２６に示される製剤化ｄｓＲＮＡ（「ＦＯＲＭ．．．」と表示）についてｄｓＲＮＡ分解プロファイルを示す。ＨＡＬ ＣＡＮ、ＡＬ ＳＡＣ、ＡＬ ＣＡＮは、ＴＧＡＩの産生のための３つの異なる酵母源を表す。これらの結果は、ＲＯＣＩＭＡ（登録商標）ＢＴ２Ｓ及びＫＡＴＨＯＮ（登録商標）ＣＧ／ＩＣＰ単独は、真菌性汚染を除去する際に有効性を有し、それらは、金属イオン封鎖剤及び二次界面活性剤を含む表２６のより多くの製剤ほど効果的ではないが、ヌクレアーゼ活性からの許容可能な保護を提供したことを実証する。

実施例２３～２５：細菌負荷プレートアッセイ及び水分活性の決定
カチオン型界面活性剤の添加は、水溶液中の塩化アルキルアンモニウムの所望の抗微生物効果によって、全体的な保存剤パッケージの重要な成分として利用される。ｄｓＲＮＡの細菌性及び真菌性分解は、実際の適用におけるｄｓＲＮＡ含有溶液の送達に対する重要な障壁であり、これらのタイプの補助成分を含むことは、ｄｓＲＮＡ安定性にとって重要である。カチオン性界面活性剤成分の包含について製剤を効果的にスクリーニングするため、及び製剤中のそれらの成分の最小阻害濃度を決定するために、プレートベースのアッセイが開発された。プレートベースのアッセイは、細菌生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉを１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ、及びＢａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを１×１０^６ＣＦＵ／ｍＬカウント値で使用して、トリプシンダイズブロスを用いたマイクロタイタープレートで行った。アンモニウム含有製剤成分を、段階的低下を使用して異なる濃度でスクリーニングして、両方の生物について各成分の最小阻害濃度を決定した。各製剤をマイクロタイタープレートに連続的に希釈し、各培養物の１０ｕＬスパイクを添加してから、プレートレプリケーターツールを使用して１５０ｍｍトリプシンダイズ寒天プレートに試料をスポットした。各製剤成分について濃度スポッティングを完了した後、トリプシンダイズプレートを３０Ｃで一晩インキュベートし、１８時間のインキュベーション後に画像化した。スポットが細菌増殖の完全なマイクロ菌叢とは対照的に個々のコロニーをもたらしたときに、各成分について生物的防除特性及び最小阻害濃度が決定された。

固有の生物的防除特性について製剤を更に特性評価するために、水分活性レベルを測定した。水分活性レベルは、Ｎｏｖａｓｉｎｅ Ｌａｂ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏを使用して測定した。水分活性は重要な尺度であり、製剤中の自由水の量を決定するために使用され、汚染生物の増殖のための既知の最小水分活性レベルと比較する。

細菌性汚染負荷試験の結果は、カチオン性界面活性剤の添加として含まれている、追加の保存剤成分の利点を実証している。生物的防除効果を実証し、製剤における最小使用率を特定するために、プレートベースのアッセイを開発して、成分及び濃度をスクリーニングした。３つの異なる成分を試験のために選択し、３つの異なる化学クラスを網羅した。塩化セトリモニウムは、食品使用のために承認された従来のカチオン性界面活性剤である塩化アルキルアンモニウムを代表するように選択された。ラウリルベタインは、構造内の内部塩の位置に起因して、全てのｐＨにわたってアンモニウム官能性を示すタイプの双性イオン化合物である、ベタインを代表するように選択された。ＭＡＣＡＴ（登録商標）ＡＯ－１２は、アミン官能性を含むが、カチオン性又は双性イオン成分のような荷電種として存在しないタイプの界面活性剤であるアミンオキシドとして選択された。プレートベースのアッセイからの結果は、カチオン性界面活性剤が、試験した生物に対して最大の利益を提供し、製剤中で０．０５％の最小使用率を有することを示す。ラウリルベタインは、塩化セトリモニウムよりも低い程度で生物に対する保護を提供することが示され、製剤中で０．７５％の最小推奨使用率を有した。アミンオキシド界面活性剤は、Ｅ．ｃｏｌｉに対するいかなる生物的防除も実証することが示されず、汚染に対する改善された生物的防除特性のために双性イオン性、又はより好ましくはカチオン性界面活性剤の具体的な必要性を実証する。これらのアッセイの結果は、以下の実施例に示される。

実施例２３
図２１Ａ及びＢは、様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷した塩化セトリモニウムについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。塩化セトリモニウムの最小阻害濃度は、製剤中で０．０５％であることが決定された。スポットしたプレート内に増殖のマイクロ菌叢がないことは、生物の阻害制御を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２７による組成を有した。

実施例２４
図２２Ａ及び２２Ｂは、様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷したラウリルベタインについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。ラウリルベタインの最小阻害濃度は、製剤中で０．７５％であることが決定された。スポットしたプレート内に増殖のマイクロ菌叢がないことは、生物の阻害制御を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２８による組成を有した。

実施例２５
図２３Ａ及び２３Ｂは、様々な実施形態による例であり、それぞれ、Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ及びＥ．Ｃｏｌｉを負荷したＣ１２アミノオキシドについて、プレートベースのアッセイの写真を示す。Ｃ１２アミンオキシドの最小阻害濃度は、製剤中で０．５％であることが決定された。スポットしたプレート内に増殖のマイクロ菌叢がないことは、生物の阻害制御を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表２９による組成を有した。

実施例２６
カチオン性界面活性剤の特定の性質及び広域スペクトル保存剤パッケージによる生物的防除特性に加えて、製剤を水分活性レベルについて分析した。個々の生物は、細菌性又は真菌性増殖を促進及び助長するために、特定濃度の自由水を必要とする。製剤中の高レベルの塩及び他の界面活性剤のために、製剤の水分レベルを測定して、製剤の固有な生物的防除特性をそのまま決定し、容器が非密封及び使用前に汚染された場合に発生する可能性がある、微生物汚染に起因するｄｓＲＮＡ分解を防止するための保存剤パッケージにおける利点を実証する。様々な生物を増殖させるために必要な水分活性レベルの列挙、及びいくつかの製剤の水分活性が表３０に示される。

表３０は、いくつかの試験した製剤の水分活性レベルを示す。界面活性剤濃度は、５％及び１０％で試験し、ｄｓＲＮＡ濃度は、４ｇ／Ｌ及び８ｇ／Ｌで試験した。このアッセイの結果は、製剤が０．９４４～０．９５１の非常に低い水分活性レベルを有し、いくつかの生物に対するいくつかの固有の生物的防除特性を含むことを実証する。しかしながら、いくつかの追加の一般的な生物は、より低い水分活性レベルを有するため、追加の保存剤成分について必要性が強調される。加えて、ｄｓＲＮＡ濃度の増加する界面活性剤間に著しい差は示されない。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表３１による組成を有した。

参照のために、表３２は、いくつかの一般的な生物の水分活性レベルを提供する。増殖に必要な最低限の水分活性レベルが列挙される。

実施例２７～２９：ＥＤＴＡ濃度及び酵素ヌクレアーゼ分解試験
様々な濃度のＥＤＴＡを含有する製剤におけるｄｓＲＮＡの安定性を決定するために、ベンゾナーゼを使用する２つの別個のヌクレアーゼ負荷試験アッセイを開発した。ＥＤＴＡは、ｄｓＲＮＡを含有する製剤に使用され、ｄｓＲＮＡをヌクレアーゼ活性に対して安定化させ、様々な保存条件、並びに汚染にわたって分解を防止する。標準的なヌクレアーゼ活性試験は、０．３Ｕ／ｕＬのベンゾアーゼ、及びｄｓＲＮＡを含有する製剤とともに３７Ｃで３時間のインキュベーション期間を利用した。ＥＤＴＡを使用して、３時間後にヌクレアーゼ活性をクエンチし、次いで、試料を、電気泳動を使用して、１．２％アガロースゲルで未処理及び処理した試料としてランさせた。０．３Ｕ／ｕＬのベンゾナーゼで処理した試料中のｄｓＲＮＡの定量的決定も、ＨＰＬＣによって行われた。ｄｓＲＮＡの分解は、ゲルにおける対応する分子量バンドの消失によって定性的に、及びＨＰＬＣ分析によって定量的に評価した。ウルトラヌクレアーゼチャレンジアッセイが、著しく過剰のベンゾナーゼに対して１時間でｄｓＲＮＡ製剤を迅速に試験するために開発された。この試験プロトコルを使用して、ＥＤＴＡ濃度をスクリーニングし、製剤化試料中のヌクレアーゼ活性を阻害するのに必要なＥＤＴＡの最小濃度を決定した。ウルトラヌクレアーゼ活性試験は、３０Ｕ／ｕＬのベンゾアーゼ、及びｄｓＲＮＡを含有する製剤とともに３７Ｃで１時間のインキュベーション期間を利用した。ＥＤＴＡを使用して、１時間後にヌクレアーゼ活性をクエンチし、次いで、試料を、電気泳動を使用して、１．２％アガロースゲルで未処理及び処理した試料としてランさせた。３０Ｕ／ｕＬのベンゾナーゼで処理した試料中のｄｓＲＮＡの定量的決定も、ＨＰＬＣによって行われた。ｄｓＲＮＡの分解は、ゲルにおける対応する分子量バンドの消失によって定性的に、及びＨＰＬＣ分析によって定量的に評価した。

酵素ヌクレアーゼ活性は、様々な保存条件にわたるｄｓＲＮＡの分解及びｄｓＲＮＡを含有する溶液の不安定性の重要な原因であることが決定されている。多くのヌクレアーゼは、それらの酵素プロセスを触媒するために二価金属イオンを必要とし、したがって、ｄｓＲＮＡを含有する常温安定製剤は、二価金属イオンを系から封鎖し、ヌクレアーゼ活性を阻害するように存在する金属イオンキレーターを必要とする。ｄｓＲＮＡはポリアニオンであり、リン酸骨格を有する二本鎖核酸らせんとして存在するため、ｄｓＲＮＡ自体では、水溶液中のリン酸骨格と会合する対イオン種として、Ｍｇ^２＋などの遊離二価金属イオンを含有する著しい潜在性がある。加えて、ｄｓＲＮＡを産生するために利用される無細胞反応は、ｄｓＲＮＡ分子を構築するために、Ｍｇ^２＋などの二価金属イオンの特定の濃度を必要とする。ｄｓＲＮＡの産生中の二価金属イオンの存在は、ＴＧＡＩにおけるヌクレアーゼ活性に対する固有の感受性を生み出す。この無細胞反応を利用するｄｓＲＮＡの実際的な産生は、実質的な透析に対して禁止であり、対イオン置換法がラボスケールで二価イオンを除去するために一般的に使用される。したがって、ＥＤＴＡなどのキレーターの適切な濃度を含有することは、製剤内のｄｓＲＮＡの安定性にとって重要である。

実施例２７
ＴＧＡＩの複数の産生ロットを、特定の標的ｄｓＲＮＡ濃度でのＴＧＡＩにおけるこれらの二価イオンの濃度範囲を理解するためにＭｇ^２＋含有量について分析し、図２４にみることができる。より具体的には、図２４は、様々な実施形態による例であり、１０ｍＭの平均含有量を有する９～１３ｍＭのＭｇ^２＋を含有した７ｇ／ＬのｄｓＲＮＡで産生されたＴＧＡＩ、及び２２．５ｍＭの平均含有量を有する１５．５～２８ｍＭのＭｇ^２＋を含有した１４ｇ／ＬのｄｓＲＮＡで産生されたＴＧＡＩを含む、ＴＧＡＩの複数の産生ロットのＭｇ^２＋分析を示す。

実施例２８
１３．８ｍＭでのＥＤＴＡの初期濃度は、４ｇ／Ｌの最終使用製品中のｄｓＲＮＡの十分な保護を実証しており、製剤化されたときに、ｄｓＲＮＡをより高い濃度で保護するには不十分であることが決定された。製剤化されたｄｓＲＮＡ製品中のＥＤＴＡ濃度の更なる低下は、ヌクレアーゼ活性を介したｄｓＲＮＡのより完全な分解さえ唯一もたらした。この傾向、及び非抑制化ヌクレアーゼ活性によるｄｓＲＮＡ分解の結果を図２５に示す。より具体的に、図２５は、様々な実施形態による例であり、ヌクレアーゼ活性によるｄｓＲＮＡ分解を示す。金属イオンキレーターの低下した濃度を有する製剤は、非特異的ヌクレアーゼであるベンゾナーゼの不十分な阻害を提供することが示された。試験した組成物について８ｍＭ未満のＥＤＴＡの更なる低下は、完全な分解をもたらし、一方、より高い濃度のＥＤＴＡは、この実施例で試験した組成物について完全な保護を提供するには十分ではなかったが、反応速度を変化させ、時間経過にわたって部分的な分解のみをもたらした。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表３３による組成を有した。

このデータから、様々な実施形態によれば、製剤中のＥＤＴＡ濃度を１３．８ｍＭ（＞０．４重量％）超に増加させることが有益であり得ることが決定され、また、本開示の組成物に金属イオンキレーターを含むことの一般的な利点が実証された。

実施例２９
極めて過剰なベンゾナーゼを使用する別個のヌクレアーゼ負荷アッセイを開発し、２２．６ｍＭのＭｇ^２＋を含有する代表的なＴＧＡＩロットについて、ヌクレアーゼ媒介性分解からｄｓＲＮＡ安定性を提供するのに必要な最小レベルのＥＤＴＡを決定した。このアッセイからの結果は、Ｍｇ^２＋イオンに対するＥＤＴＡの１：１モル当量からおおよそ２ｍＭの増加が、ｄｓＲＮＡのヌクレアーゼ媒介性分解を決定的に阻害するために必要であることを示した。このウルトラヌクレアーゼ負荷アッセイの結果が、図２６及び２７に示される。

図２６は、様々な実施形態による例であり、増加する濃度のＥＤＴＡを含有するｄｓＲＮＡ製剤のゲル電気泳動結果を示す。これらの製剤を製造するために使用されるＴＧＡＩロットは、２２．６ｍＭのＭｇ^２＋を含有し、ヌクレアーゼ感受性に対する安定性の大幅な改善が、ＥＤＴＡ濃度が２０ｍＭを超えて増加するときに観察される。３５ｍＭでのモル過剰のＥＤＴＡは、完全な定性的安定性を明らかに実証し、ヌクレアーゼ活性に対するｄｓＲＮＡの完全性を維持する。

図２７は、様々な実施形態による例であり、増加する濃度のＥＤＴＡを含有するｄｓＲＮＡ製剤のゲル電気泳動結果を示す。増加する濃度のＥＤＴＡを含有するｄｓＲＮＡ製剤のゲル電気泳動。これらの製剤を製造するために使用されるＴＧＡＩロットは、２２．６ｍＭのＭｇ^２＋を含有し、ＥＤＴＡ濃度がモル当量を約２ｍＭ増加するか、又は２２．６ｍＭのとき、ヌクレアーゼ活性に対する安定性が観察される。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表３４による組成を有した。

最初のヌクレアーゼ負荷アッセイ、ウルトラヌクレアーゼ負荷アッセイ、及びＴＧＡＩのいくつかの産生ロットについて収集されたＭｇ^２＋濃度データからのデータを組み合わせて、様々な実施形態によれば、約３５ｍＭのＥＤＴＡが、ｄｓＲＮＡを含有する製剤に含まれて、ヌクレアーゼ活性から安定性を提供し、実際の保存条件下でｄｓＲＮＡの分解を防止するのに役立つ適切な濃度であることが決定された。

実施例３０～３６：ＵＶ照射安定性試験
ＵＶ－Ｂ照射レベルを、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡで２週間の経過にわたって外部から監視した。収集したエネルギーレベルを使用して、１日、７日、及び１４日の経過にわたるＵＶ－Ｂ曝露レベルを決定した。ネイキッドｄｓＲＮＡを、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡで２週間の経過にわたってＵＶ照射に供した。この時間経過にわたるｄｓＲＮＡの完全性及び分解プロファイルを、ＨＰＬＣ定量によって評価した。環境条件下で１週間曝露されたネイキッドｄｓＲＮＡは、完全に分解されていることが決定され、この期間にわたるｄｓＲＮＡへの総ＵＶ－Ｂ曝露は、７９Ｊ／ｃｍ^２であると決定された。

ｄｓＲＮＡを含有する試料を、ＵＶ照射チャンバ内に配置し、１００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ－Ｂ照射で条件化した。このレベルの照射は、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡの通常の環境で１週間の経過にわたって測定された平均照射曝露の平均レベルと少なくとも同等であるか、又はそれを超えると決定された。これらの試料は、試料の固有の光安定性を決定するためにパラフィルムライニングしたプレートで、並びに葉表面での光安定性の任意の影響を決定するために植物中の両方で調製された。各試料は、５ｕｇのｄｓＲＮＡの９回の反復試料として条件化した。ＵＶ照射による条件化後、試料を２００ｕＬの水で再構成し、分析のためにプールした。

ＵＶ条件化した材料のプールした試料をゲル電気泳動によって分析して、試料のｄｓＲＮＡ回収及び完全性の両方を定性的に決定した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｅ－Ｇｅｌ Ｆｌａｓｈ電気泳動システムを使用して結果を生じた。

ＵＶ条件化した材料のプールした試料をＨＰＬＣによって分析して、ｄｓＲＮＡの回収及びｄｓＲＮＡの曝露後の定量を定量的に決定した。

試料のバイオアッセイは、葉を広げた適用を用いて実験室で行った。２０匹のコロラドハムシ幼虫を処理ごとに使用した。試料は、陽性対照として０Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ照射、通常の環境条件下で１週間曝露経過に相当する決定したレベルとして１００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ照射、及びこれらの条件下での完全なｄｓＲＮＡ分解による陰性対照として２００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ照射への曝露後に提供された。異なるレベルの曝露での製剤と、追加のＵＶ保護剤分散剤タイプの界面活性剤を含有する組成物との間の死亡率における差を、処置の９日間後に決定した。

試験した化学物質の概要、及び曝露後にｄｓＲＮＡに提供されたＵＶ保護のレベルを表３５に示す。

実施例３０
ＵＶ照射レベルをＢｏｓｔｏｎ，ＭＡの屋上で２週間の経過にわたって測定した。これらの環境条件に曝露した試料中のｄｓＲＮＡの定量をＨＰＬＣによって監視して、曝露限界及び分解効果を決定した。ｄｓＲＮＡは、ＨＰＬＣ決定を介して、１週間後に完全に分解されることが見出され、これは、７６Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ－Ｂ照射に相当することが決定された。１３１Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ－Ｂ曝露に相当する２週間の曝露後、ｄｓＲＮＡ定量は０ｎｇ／μＬに減少した。

図２８は、様々な実施形態による例であり、ＵＶ－Ｂ曝露レベル、及び２週間後のｄｓＲＮＡ安定性を示す。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表３６による組成を有した。

実施例３１
ＵＶ曝露後に試験した試料について収集した個々のクロマトグラムの検査は、ＨＰＬＣを介したｄｓＲＮＡの定量が０ｎｇ／ｕＬに減少していたが、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び遊離ヌクレオチドのピークが有意な歪み及びシフトを示したことを実証した。ＲＮＡ型ピークのこのシフト及び歪みは、いくらかのレベルのｄｓＲＮＡが７～１４日後に残存することを実証するが、化学的シフトは、試料中のサイズ及び塩基対のランダムな損失を示す。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのピークを混合すると、ｄｓＲＮＡに対する著しい分解及び立体構造変化が７～１４日のＵＶ曝露後に生じることを示すが、この分解が有効性の喪失をもたらすかは不明である。

図２９は、様々な実施形態による例であり、様々なＵＶ－Ｂ曝露後のｄｓＲＮＡのＨＰＬＣクロマトグラムオーバーレイを示す。ｄｓＲＮＡのピーク強度は、１日曝露後に有意に低下する。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのピークは、ＵＶ照射への曝露の７～１４日間後に広がり及び混合し始める。記載された製剤は、実施例１に記載された方法に従って調製し、実施例３０に指定された組成を有した。

実施例３２
図３０は、様々な実施形態による例であり、紫外線への２週間曝露後のｄｓＲＮＡ試料中のｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び遊離ヌクレオチドの質量バランスを示す。ｄｓＲＮＡにおける著しい減少、ｓｓＲＮＡにおけるわずかな増加、及び遊離ヌクレオチドにおける著しい増加は、ｄｓＲＮＡの分解を示す。記載された製剤は、実施例１に記載された方法に従って調製し、実施例３０に指定された組成を有した。

実施例３３
リグノスルホネート分散剤型界面活性剤を含有する代替製剤を開発した。リグノスルホネートは、スルホン化コンジュゲート化芳香族官能性を含むポリマーネットワークからなる。コンジュゲート化芳香族官能性のこのポリマーネットワークは、ＵＶ照射の光吸収によってＵＶ保護に著しい有益な影響を与えると仮定された。全てが異なる分子量、スルホン化度、及びスルホン化部位を含む様々なリグノスルホネートを用いて、５つの製剤を製造し、このタイプの界面活性剤を含有しない例示的な製剤に対するＵＶ照射からの保護について試験した。これらの製剤をパラフィルムプレート上で乾燥させ、次いで、ＵＶチャンバ内で１００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ－Ｂ照射に曝露した。試料を水で再水和させ、次いでゲル電気泳動によって分析してｄｓＲＮＡ分解を定性的に決定し、ＨＰＬＣを介してｄｓＲＮＡ分解を定量的に決定した。ゲル及びＨＰＬＣの結果は、図３１及び３２にみることができる。

図３１は、様々な実施形態による例であり、１．５％リグノスルホネート（レーン２～６）を含有する製剤が、ゲルでｄｓＲＮＡバンドの保持、及びＵＶ照射からのｄｓＲＮＡ分解のある程度の保護を示す。リグノスルホネートを含有しない製剤は、ゲルでｄｓＲＮＡバンドの完全な消失及びｄｓＲＮＡ分解を示す。

図３２は、様々な実施形態による例であり、１００Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ－Ｂ照射に対する曝露後の製剤のＨＰＬＣ定量からの結果を示す。リグノスルホネート型界面活性剤を含有する製剤は、６０％を超えるｄｓＲＮＡ安定性の改善を実証する。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表３７による組成を有した。

実施例３４
リグノスルホネートを含有する製剤化試料もまた、葉表面とのいずれかの相互作用が、ＵＶ照射に曝露された場合にｄｓＲＮＡの安定性を更に改善したかを理解するために、葉上で乾燥させた。パラフィルムプレート上と葉表面上に曝露された製剤の間の比較が、図３３に示される。より具体的に、図３３は、様々な実施形態による例であり、ＵＶ照射に対するｄｓＲＮＡ安定性について葉表面対パラフィルムでの比較を示す。葉表面は、ＵＶ照射からのｄｓＲＮＡの更なる保護を提供し、ｄｓＲＮＡを含有する製剤の安定性を改善するように思われる。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、実施例３４による組成を有した。

実施例３５
リグノスルホネートと同様の他のいくつかの化学クラスが、芳香族ベースの化学物質、コンジュゲート化界面活性剤、及びオレフィン系界面活性剤を含む、潜在的なＵＶ吸収性界面活性剤として探索された。これらのタイプの化学物質の例は、ナフタレンスルホネート、アルキルフェニルエトキシレート、及びメチルオレイルタウレートに見出され、これらのタイプの添加剤のゲル電気泳動結果を図３４に示す。より具体的に、図３４は、様々な実施形態による例であり、ＵＶ－Ｂ曝露後のゲル電気泳動の結果を示し、オレフィン系及びフェニルベースの化学物質がｄｓＲＮＡのいかなる顕著な保護も提供しないことを示す。ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）シリーズによって例示される他のコンジュゲート化化学物質は、ＵＶ－Ｂ曝露後のｄｓＲＮＡ安定性にわずかな改善を示すが、リグノスルホネート化学クラスほど著しい利益はない。

上記の製剤は、実施例１に記載される方法に従って調製され、前の実施形態の組成を有したが、１．５％分散性界面活性剤がこれらの追加の成分に置き換えられている。

実施例３６
ＵＶ－Ｂ照射に曝露されたｄｓＲＮＡ製剤の定性的及び定量的分析は、いくらかのレベルのｄｓＲＮＡ分解を示し、分解の量は、製剤に使用される界面活性剤のクラスに依存する。製剤をＵＶ－Ｂ照射後、バイオアッセイに使用して、試料にわたって観察された分解レベルが有効性の損失をもたらしたかを決定した。製剤をリグノスルホネートの添加及び無添加で供給して、陽性対照として曝露なし、陰性対照として完全な分解のために２００Ｊ／ｃｍ^２に過剰曝露し、陽性対照として乾燥及び再水和ステップなしで、ＵＶ保護剤の結果として有効性における改善を決定した。コロラドハムシのバイオアッセイの結果を図３５及び３６に示す。

図３５は、様々な実施形態による例であり、コロラドハムシ（ＣＰＢ）バイオアッセイからの死亡率を示す。ＵＶ－Ｂ照射に曝露しなかった製剤は、８０％を超える死亡率での制御を実証したが、１００Ｊ／ｃｍ２への曝露は死亡率を４７％に低下させ、２００Ｊ／ｃｍ２への曝露は死亡率を未処置対照と同等である２５％に低下させた。ＵＶ－Ｂ照射に曝露された製剤の評価は、ゲル及びＨＰＬＣで観察されたｄｓＲＮＡの分解が、バイオアッセイにおける有効性の著しい損失に置き換えられることを実証する。

上記の製剤を実施例１に記載の方法に従って調製し、実施例３０で指定された組成を有した。

図３６は、様々な実施形態による例であり、リグノスルホネートの添加又は無添加における製剤のコロラドハムシ（ＣＰＢ）バイオアッセイからの死亡率を示す。リグノスルホネートが添加及び無添加の製剤をＵＶ－Ｂ照射に曝露し、ＣＰＢ幼虫に与えた。リグノスルホネートを含有し、１００Ｊ／ｃｍ２のＵＶ－Ｂ照射に曝露したいくつかの製剤は、ＵＶ－Ｂ曝露のない標準的なｄｓＲＮＡ製剤と比較して、同様、又はより良好な性能を提供した。リグノスルホネートを含有し、１００Ｊ／ｃｍ２で曝露した全ての製剤は、リグノスルホネートが無添加の同じ製剤と比較して有効性に改善を示した。バイオアッセイデータは、定性的及び定量的ゲル及びＨＰＬＣアッセイにおいて同じ試料で観察されたｄｓＲＮＡ分解に対する保護が、ＵＶ－Ｂ照射からのｄｓＲＮＡ分解の保護を示さなかった試料と比較して有効性に改善をもたらすことを確証する。

上記の製剤は、実施例１に記載の方法に従って調製し、表３８による組成を有した。

実施例３７
表３９による組成物を調製した。様々な異なるｄｓＲＮＡ配列を組み込んでいる試料を、表４０Ａ、４０Ｂ、及び４０Ｃに示すように、様々な期間及び温度で安定性について試験した。１つの試料は、真菌Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒの遺伝子を標的とする４９７ｂｐのｄｓＲＮＡを含み（表４０Ａ）、１つの試料は、真菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａの遺伝子を標的とする４７８ｂｐのｄｓＲＮＡを含み、１つの試料は、真菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａの遺伝子を標的とする４５０ｂｐのｄｓＲＮＡを含む。

物理的安定性を決定するために、試料を肉眼で任意の視覚的分離について観察し、試料をゆっくりと反転させて沈殿物を調べた。全ての試料は、試験した全ての条件下で全ての試料の物理的安定性を実証する均質であることが観察された。

化学的安定性を評価するために、初期ｐＨをクエン酸緩衝液で約６に設定し、各試料のｐＨを、ＣＩＰＡＣ ＭＴ ７５．３に記載されているように、電子的に較正されたｐＨメーターを使用して様々な時点で測定した。全ての試料は、全ての時点で強い化学的安定性を示し、ｐＨは、図４０Ａ、４０Ｂ、及び４０Ｃにそれぞれ示される３つの試料について最大０．１６、０．３１、０．２９で変化し、化学的に安定な組成物における閾値を十分に下回っていた。

水への希釈後の物理的安定性を評価するために、濃縮製品を、図４０Ａ、４０Ｂ、及び４０Ｃに列挙される水硬度における目標割合に希釈した。水は、ＡＳＴＭ Ｅ１９４５－０２の方法に類似した、ＡＳＴＭ方法に従って調製した。試料を簡単に混合し、次いで、方法ＣＩＰＡＣ ＭＴ ４１の方法と同様に、任意の濁り又は沈殿について観察した。任意の期間又は温度でいずれの試料についても濁り又は沈殿が観察されず、希釈した製品の安定性を実証する。

組成物の化学的安定性を評価するために、全ｄｓＲＮＡ含有量を、０．８％ｗ／ｗ又は８．２４ｇ／Ｌの標的濃度でＨＰＬＣによって測定した。分析方法の変動性は、プラス又はマイナス１５％と推定することができる。ＨＰＬＣ結果をゲル電気泳動によって確証した。任意の時点で７．０ｇ／Ｌ未満のｄｓＲＮＡ分解は観察されず、試験した全ての試料の安定性を実証する。

実施例３８
この実施例は、ｄｓＲＮＡ濃度、一次界面活性剤、二次界面活性剤、及び金属イオン封鎖剤の物理的安定性につながる要因のマルチパラメータ調査を扱う。ＪＭＰ（バージョン１５．２．０，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ ＮＣ，１８）を使用して、以下のパラメータ内の実験の統計的設計を構築した。

試験したパラメータのこの範囲内では、ｄｓＲＮＡ濃度は、保存後の組成物の物理的安定性に顕著な影響を有しなかった。塩化セトリモニウムは、安定性に顕著な効果を有し、ＥＤＴＡと塩化セトリモニウムとの関係を示す図３７の濃い灰色領域に示すように、低ＥＤＴＡと高塩化セトリモニウムとの組み合わせが不安定性をもたらした。図３９は、製剤の安定性におけるＥＤＴＡと塩化セトリモニウムとの間の顕著な関係を説明する。ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡの試験した最高レベル（１０重量％）では、最小の沈殿物がいくつかの条件下で観察されたが、それは許容限度内で、ＤＯＥにおいて重要な要因ではなかった。ＤＯＥは、試験した組成物の範囲内で、ｄｓＲＮＡを有する物理的に安定な混合物が、低ＥＤＴＡ及び高塩化セトリモニウム濃度のものを除く全ての組成物で作製することができることを確証する。

実施例３９
表１９による組成物を調製し、様々な期間及び温度条件で試験して、安定性について様々なマトリクスを評価した。試料は、ｐＨ、ｄｓＲＮＡの密度、希釈安定性、及び発泡について最初に評価した。残存する試料を容器中でアルミニウムを用いて密封し、室温で１年及び２年後、並びに５４℃で４週間後（室温で少なくとも２年間の保存をシミュレートした）を含む様々な条件及び期間で保存した。その後、試料は、安定性を確証するために評価した。表４２に示されるように、これらの試料は、ＨＰＬＣ方法の１０％検出範囲内又は最小限の範囲外にとどまり、ヌクレアーゼ、真菌性汚染、又は細菌性汚染によるｄｓＲＮＡの検出可能な分解が最小限であるか、又はないことを実証した。ｐＨレベルは、安定性のために１単位の閾値内でさえも十分に維持され、ｐＨは、７の初期ｐＨから最大０．１９単位変動した。物理的安定性は、濃縮試料の色調を検査すること、並びに保存した濃縮試料及び濃縮試料を希釈してから１８時間後の両方で沈殿を評価することによって評価した。試料は、外観がクリア又はほとんどクリアだった。希釈前又は後に、試料中に沈殿は観察されなかった。発泡は、ＣＰＡＣ ＭＴ４７に従って試験し、全ての試料は、１分後に標準の１５％泡／溶液ｖ／ｖ未満だった。

本明細書に開示される寸法及び値は、列挙される正確な数値に厳密に限定されるものとして理解されるべきではない。代わりに、別段の指定がない限り、かかる各寸法は、列挙された値と、その値の周囲の機能的に等価な範囲との両方を意味することが意図される。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することが意図される。

本明細書に引用される全ての文書は、相互参照されるか、又は関連する特許若しくは出願、並びに本出願がその優先権又は利益を主張する任意の特許出願又は特許を含むが、明示的に除外されるか、又は他に限定されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。任意の文書の引用は、それが本明細書に開示又は特許請求される範囲の任意の発明に関して先行技術であること、又はそれが単独で、又は任意の他の参考文献若しくは複数の参照文献との任意の組み合わせで、任意のかかる発明を教示、示唆、又は開示することを認めるものではない。更に、本文書における用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれる文書における同じ用語の意味又は定義と矛盾する範囲に対して、本文書におけるその用語に割り当てられた意味又は定義が適用されるものとする。

本開示の特定の実施形態が例示及び説明されているが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な他の変更及び修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。したがって、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内にある全てのかかる変更及び修正を網羅することが意図される。

Claims (94)

1. 組成物の植物への外因的な葉面適用を介して、ＲＮＡを害虫に送達するための前記組成物であって、
   ＲＮＡと、
   一次界面活性剤であって、前記一次界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、一次界面活性剤と、
   金属イオン封鎖剤と、を含む、組成物。
2. 前記組成物が、可溶性液体濃縮物である、請求項１に記載の組成物。
3. 二次界面活性剤を更に含み、前記二次界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
4. ＵＶ保護剤を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. １つ以上の緩衝液を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. １つ以上の生物学的保存剤を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 消泡剤を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 不凍剤を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 以下、
   二次界面活性剤、
   ＵＶ保護剤、
   １つ以上の緩衝液、
   １つ以上の生物学的保存剤、
   消泡剤、及び／又は
   不凍剤のうちの１つ以上を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
10. 前記ＲＮＡが、前記組成物の総重量に基づいて、約０．１０～約１０重量パーセントの量で存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記ＲＮＡが、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．２５～約２重量パーセントの量で存在する、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記ＲＮＡが、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．４～約１．２重量パーセントの量で存在する、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記一次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約３～約１０重量パーセントの量で存在する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記一次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約４～約７重量パーセントの量で存在する、請求項１２に記載の組成物。
15. 前記一次界面活性剤が、ポリソルベート、アルコキシレート、ノノキシノール、ポロキサマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記一次界面活性剤が、ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ、ポリソルベート２０、アルコキシル化アルコール、及びＣ_１２－Ｃ_１３アルコールのアルコキシレート混合物からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記金属イオン封鎖剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約５重量パーセントの量で存在する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記金属イオン封鎖剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約３重量パーセントの量で存在する、請求項１６に記載の組成物。
19. 前記金属イオン封鎖剤が、ＥＤＴＡ及びアクリレートコポリマーからなる群から選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記二次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０１～約３重量パーセントの量で存在する、請求項３～１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 前記二次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０１～約１重量パーセントの量で存在する、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記二次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約３重量パーセントの量で存在する、請求項２０に記載の組成物。
23. 前記二次界面活性剤が、アルキルアンモニウムハロゲン化物、ラウリルベタイン、アミンオキシド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３～２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記二次界面活性剤が、塩化セトリモニウムを含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記ＵＶ保護剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約１～約１５重量パーセントの量で存在する、請求項４～２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記ＵＶ保護剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約１～約２重量パーセントの量で存在する、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記ＵＶ保護剤が、コンジュゲート化芳香族界面活性剤又はコンジュゲート化芳香族官能性を含むポリマー界面活性剤からなる群から選択されるｕｖ保護剤を含む、請求項４～２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記ＵＶ保護剤が、リグノスルホン酸ナトリウム分散剤を含み、任意選択的に、前記ＵＶ保護剤が、ＲＥＡＸ（登録商標）１０５Ｍ、ＫＲＡＦＴＳＰＥＲＳＥ（登録商標）８８２８、ＲＥＡＸ（登録商標）９１０、ＲＥＡＸ（登録商標）９６０、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）Ｄ－４２５、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＩＰ、及びＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＥＦＷからなる群から選択される、請求項４～２７のいずれか一項に記載の組成物。
29. 前記１つ以上の緩衝液が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約１～約７重量パーセントの量で個別に存在する、請求項５～２８のいずれか一項に記載の組成物。
30. 前記緩衝液が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約２～約５重量パーセントの量で存在する、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記緩衝液が、一塩基性リン酸カリウム及び二塩基性リン酸カリウムを含む、請求項５～３０のいずれか一項に記載の組成物。
32. 前記緩衝液が、１つ以上のクエン酸緩衝液を含み、任意選択的に、前記クエン酸緩衝液が、クエン酸ナトリウム及びクエン酸を含む、請求項５～３０のいずれか一項に記載の組成物。
33. 前記１つ以上の生物学的保存剤が、細菌制御、真菌制御、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものを提供する、請求項６～３２のいずれか一項に記載の組成物。
34. 前記１つ以上の生物学的保存剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約１重量パーセントの量で各々個別に存在する、請求項６～３３のいずれか一項に記載の組成物。
35. 前記１つ以上の生物学的保存剤が、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＣＭＩＴ）、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オン（ＢＩＴ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される活性成分を含む、請求項６～３４のいずれか一項に記載の組成物。
36. 前記消泡剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０２５～約０．２重量パーセントの量で存在する、請求項７～３５のいずれか一項に記載の組成物。
37. 前記消泡剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０２５～約０．１重量パーセントの量で存在する、請求項３６に記載の組成物。
38. 前記不凍剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約５～約１５重量パーセントの量で存在する、請求項７～３７のいずれか一項に記載の組成物。
39. 前記ＲＮＡが、ｄｓＲＮＡである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
40. 前記ＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物。
41. 害虫又は病原体から植物を保護する方法であって、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物を前記植物に外因的に適用することを含む、方法。
42. 前記組成物が、水を更に含む、請求項３３に記載の方法。
43. 前記水が、前記組成物を約１５～約３００倍で希釈する、請求項３４に記載の方法。
44. 前記組成物が、前記植物の葉群に適用される、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記組成物が、噴霧によって適用される、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記害虫が、昆虫である、請求項３３～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記昆虫が、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａである、請求項４６に記載の方法。
48. 前記害虫又は病原体が、真菌病原体である、請求項４６に記載の方法。
49. 前記真菌病原体が、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ及びｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
50. ＲＮＡに安定性を提供するための組成物であって、前記組成物が、
    一次界面活性剤であって、前記一次界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、一次界面活性剤、及び
    金属イオン封鎖剤を含み、
    前記組成物が、室温で１年間、ＲＮＡに常温安定性を提供するのに十分である、組成物。
51. 二次界面活性剤を更に含み、前記二次界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
52. ＵＶ保護剤を更に含む、請求項５０又は５１に記載の組成物。
53. １つ以上の緩衝液を更に含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の組成物。
54. １つ以上の生物学的保存剤を更に含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の組成物。
55. 消泡剤を更に含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の組成物。
56. 不凍剤を更に含む、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の組成物。
57. 以下、
    二次界面活性剤、
    ＵＶ保護剤、
    １つ以上の緩衝液、
    １つ以上の生物学的保存剤、
    消泡剤、及び／又は
    不凍剤のうちの１つ以上を更に含む、請求項５０に記載の組成物。
58. 前記一次界面活性剤が、前記組成物の総重量に基づいて、約３～約１０重量パーセントの量で存在する、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の組成物。
59. 前記一次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約４～約７重量パーセントの量で存在する、請求項４６に記載の組成物。
60. 前記一次界面活性剤が、ポリソルベート、アルコキシレート、ノノキシノール、ポロキサマー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の組成物。
61. 前記一次界面活性剤が、ＡＴＰＬＵＳ（登録商標）ＰＦＡ、ポリソルベート２０、アルコキシル化アルコール、及びＣ_１２－Ｃ_１３アルコールのアルコキシレート混合物からなる群を含み、それから選択される、請求項６０に記載の組成物。
62. 前記金属イオン封鎖剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約５重量パーセントの量で存在する、請求項５０～６１のいずれか一項に記載の組成物。
63. 前記金属イオン封鎖剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約２重量パーセントの量で存在する、請求項６２に記載の組成物。
64. 前記金属イオン封鎖剤が、ＥＤＴＡ及びアクリルコポリマーからなる群から選択される、請求項５０～６３のいずれか一項に記載の組成物。
65. 前記二次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０１～約３重量パーセントの量で存在する、請求項５１～６４のいずれか一項に記載の組成物。
66. 前記二次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０１～約３重量パーセントの量で存在する、請求項６５に記載の組成物。
67. 前記二次界面活性剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約１重量パーセントの量で存在する、請求項６６に記載の組成物。
68. 前記二次界面活性剤が、アルキルアンモニウムハロゲン化物、ラウリルベタイン、アミンオキシド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１～６７のいずれか一項に記載の組成物。
69. 前記二次界面活性剤が、塩化セトリモニウムを含む、請求項６８に記載の組成物。
70. 前記ＵＶ保護剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約１～約１５重量パーセントの量で存在する、請求項５２～６９のいずれか一項に記載の組成物。
71. 前記ＵＶ保護剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約１～約２重量パーセントの量で存在する、請求項７０に記載の組成物。
72. 前記ＵＶ保護剤が、コンジュゲート化芳香族界面活性剤又はコンジュゲート化芳香族官能性を含むポリマー界面活性剤からなる群から選択されるＵＶ保護剤を含む、請求項５２～７１のいずれか一項に記載の組成物。
73. 前記ＵＶ保護剤が、リグノスルホン酸ナトリウム分散剤を含み、任意選択的に、前記ＵＶ保護剤が、ＲＥＡＸ（登録商標）１０５Ｍ、ＫＲＡＦＴＳＰＥＲＳＥ（登録商標）８８２８、ＲＥＡＸ（登録商標）９１０、ＲＥＡＸ（登録商標）９６０、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）Ｄ－４２５、ＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＩＰ、及びＭＯＲＷＥＴ（登録商標）ＥＦＷからなる群から選択される、請求項５２～７２のいずれか一項に記載の組成物。
74. 前記１つ以上の緩衝液が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約１～約３重量パーセントの量で各々個別に存在する、請求項５３～７３のいずれか一項に記載の組成物。
75. 前記１つ以上の緩衝液が、リン酸ベースの緩衝液を含む、請求項５３～７４のいずれか一項に記載の組成物。
76. 前記１つ以上の緩衝液が、一塩基性リン酸カリウム及び二塩基性リン酸カリウムを含む、請求項５３～７４のいずれか一項に記載の組成物。
77. 前記緩衝液が、１つ以上のクエン酸緩衝液を含み、任意選択的に、前記クエン酸緩衝液が、クエン酸ナトリウム及びクエン酸を含む、請求項５３～７４のいずれか一項に記載の組成物。
78. 前記１つ以上の生物学的保存剤が、細菌制御、真菌制御、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものを提供する、請求項５４～７７のいずれか一項に記載の組成物。
79. 前記１つ以上の生物学的保存剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０５～約０．１重量パーセントの量で各々個別に存在する、請求項５４～７９のいずれか一項に記載の組成物。
80. 前記１つ以上の生物学的保存剤が、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＣＭＩＴ）、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（ＭＩＴ）、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オン（ＢＩＴ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される活性成分を含む、請求項５５～８０のいずれか一項に記載の組成物。
81. 前記消泡剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０２５～約０．２重量パーセントの量で存在する、請求項５６～８０のいずれか一項に記載の組成物。
82. 前記消泡剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約０．０２５～約０．１重量パーセントの量で存在する、請求項８１に記載の組成物。
83. 前記不凍剤が、前記組成物の前記総重量に基づいて、約５～約１５重量パーセントの量で存在する、請求項５７～８２のいずれか一項に記載の組成物。
84. 前記ＲＮＡが、ｄｓＲＮＡである、請求項５０～８３のいずれか一項に記載の組成物。
85. 前記ＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡである、請求項５０～８３のいずれか一項に記載の組成物。
86. ＲＮＡを安定化させる方法であって、ＲＮＡを請求項５０～８５のいずれか一項に記載の組成物と組み合わせることを含む、方法。
87. 前記組成物のｐＨが、前記組成物が－２０℃で２週間、－１０～４０サイクルで２週間、５４℃で２週間、４０℃で８週間、５４℃で４週間、及び５４℃で８週間、室温で１年間、及び室温で２年間からなる群から選択される温度である期間保存された後、初期ｐＨの２単位以内のままである、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組成物。
88. 前記組成物の前記ｐＨが、前記組成物が前記期間及び前記温度で保存された後、前記初期ｐＨの１単位以内のままである、請求項８７に記載の組成物。
89. 前記組成物の前記ｐＨが、前記組成物が前記期間及び前記温度で保存された後、前記初期ｐＨの０．５単位以内のままである、請求項８７又は８８に記載の組成物。
90. 前記組成物中に存在する前記ＲＮＡが、前記組成物が、－２０℃で２週間、－１０～４０サイクルで２週間、５４℃で２週間、４０℃で８週間、５４℃で４週間、及び５４℃で８週間、室温で１年間、及び室温で２年間からなる群から選択される期間及び温度で保存された後、ＨＰＬＣによって測定されたとき、前記組成物中に存在するＲＮＡの初期濃度の１５％以内のままである、請求項１～４０又は８７～８９のいずれか一項に記載の組成物。
91. 前記組成物中に存在する前記ＲＮＡが、前記組成物が前記期間及び前記温度で保存された後、ＨＰＬＣによって測定されたとき、前記組成物中に存在するＲＮＡの前記初期濃度の１０％以内のままである、請求項９０に記載の組成物。
92. 前記組成物中に存在する前記ＲＮＡが、前記組成物が前記期間及び前記温度で保存された後、ＨＰＬＣによって測定されたとき、前記組成物中に存在するＲＮＡの前記初期濃度の５％以内のままである、請求項９０に記載の組成物。
93. 前記組成物が、－２０℃で２週間、－１０～４０サイクルで２週間、５４℃で２週間、４０℃で８週間、５４℃で４週間、及び５４℃で８週間、室温で１年間、及び室温で２年間からなる群から選択される期間及び温度で保存された後、沈殿が生じない、請求項１～４０又は８７～９２のいずれか一項に記載の組成物。
94. 前記期間及び温度が、５４℃で２週間である、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の組成物。

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