JP2024515384A - 骨分化能機能強化の間葉系幹細胞、及びその用途 - Google Patents
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Abstract
一態様によって提供される骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、骨分化能、脂肪細胞分化能、軟骨細胞分化能、神経細胞分化能にすぐれており、特に、骨分化能の場合、他の由来の間葉系幹細胞より顕著にすぐれる。また、該骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、免疫拒否反応が少なく、骨疾患及びエストロゲン欠乏症侯群の予防または治療の効果を示しうる。さらには、該骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、連続した継代培養にもかかわらず、増殖能が維持され、核型安定性が維持されるが、商用化に安全であり、量産が可能であるという長所がある。【選択図】図１
Description
本出願は、２０２１年５月７日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００５９５１６号を優先権として主張し、前述の明細書全体は、本出願の参考文献である。
本発明は、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞、及びその用途に関する。
胎児由来の間葉系幹細胞は、それ自体の細胞特性を基に、商用化開発の長所が多いが、急変する胎児発生段階、及び解剖組織学的な位置により、分離される数多くの細胞が多様性があり、また胎児から幹細胞を得ることは、倫理的な問題が若干あり、子宮外妊娠または死産胎児を利用した研究も、子宮外妊娠または死産胎児の確保及び組織供与を受け難く、胎児自体の研究開発は、微々たるものである状態である。
胎児由来の間葉系幹細胞は、成体幹細胞に比べ、(1) 全分化能幹細胞マーカーであるＳＳＥＡ４を発現し、(2) 分化能にすぐれ、(3) ２０ｋｂ以上のテロメアを維持するために、核型安定性及び増殖率を維持することができる。
また、胎児由来幹細胞は、ＴＧＦ－βのような免疫調節サイトカインを分泌し、ＨＬＡタイプＩ及び共刺激分子（co-stimulatory molecule）の発現が低く、(4) 他ソースの間葉系幹細胞に比べ、免疫原性が低いと知られている。
それにより、子宮外妊娠または死産胎児組織を寄贈され、胎児由来の間葉系幹細胞を利用し、骨分化機能強化幹細胞、及び前記幹細胞を利用した骨疾患、及び／または閉経期以後に主に現れるエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物の開発に至った。
一態様は、Ｏｓｘ（ＳＰ７）、ｃ－kit、ＣＤ２４、ＣＤ７０及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が発現される骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を提供するものである。
他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む骨疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含むエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品を提供するものである。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含むエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品を提供するものである。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を連続して継代培養する段階を含む骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の大量製造方法を提供するものである。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、それを必要とする個体に投与する段階を含む骨疾患の予防方法または治療方法を提供するものである。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、それを必要とする個体に投与する段階を含むエストロゲン欠乏症侯群の予防方法または治療方法を提供するものである。
一態様は、Ｏｓｘ（ＳＰ７）、ｃ－kit、ＣＤ２４、ＣＤ７０及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が発現される骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を提供する。
本明細書において、用語「間葉系幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cell）」とは、自己再生能（self-renewal）と幹細胞能（stemness maintenance）とを維持し、多様な間葉系組織に分化しうる細胞を意味し、哺乳類、例えば、ヒトを含む動物の間葉系幹細胞を含むものでもある。
また、用語「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」とは、骨細胞に分化しうる機能が強化された間葉系幹細胞を意味し、骨細胞前駆細胞（bone progenitor cell）または間葉系前駆細胞（mesenchymal progenitor cell）と同一の意味で使用されうる。
一態様において、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、子宮外妊娠、または死産された胎児の組織に由来するものでもあり、望ましくは、前記胎児の組織は、胎児の頭部（skull）または頭部上端部である頭蓋冠（calvaria）組織でもあり、さらに望ましくは、前記胎児の組織は、胎児の神経管（neural tube）を除いた頭部組織、または頭蓋冠組織でもあり、さらに一層望ましくは、頭蓋冠組織であり得る。
前記子宮外妊娠された胎児は、子宮外妊娠によって死亡したか、あるいは子宮外妊娠と診断され、手術的に分離されることによって死亡したものであり得る。
前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、Ｏｓｘ（ＳＰ７）、ｃ－kit、ＣＤ２４、ＣＤ７０及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を発現し、具体的には、Ｏｓｘ（ＳＰ７）、ｃ－kit、ＣＤ２４、ＣＤ７０及びＳＦＲＰ２をいずれも発現しうる。
さらに具体的には、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、骨形成間葉系幹細胞においてのみ特異的に発現されるマーカーとして、Ｏｓｘ（ＳＰ７）、胎児間葉系幹細胞マーカーとして、ｃ－kit、細胞表面マーカーとして、ＣＤ２４及びＣＤ７０、骨分化マーカーとして、ＳＦＲＰ２を、少なくとも、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％発現するものであり得る。
本明細書において、用語「陽性」とは、幹細胞標識と係わり、その標識が基準になる他の幹細胞（例えば、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞（CordＳＴＥＭ）、及び成人骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ））と比較したとき、さらに多くの量、またはさらに高濃度で存在するものを意味しうる。すなわち、細胞は、ある標識が、細胞の内部または表面に存在するために、その標識を利用し、その細胞を、１以上の他の細胞類型と区別することができれば、その標識について陽性になる。また、細胞が背景値よりさらに大きい値でもって、信号、例えば、細胞測定装置の信号を出すことができるほどの量でもってその標識を有しているということを意味しうる。例えば、細胞を、ＣＤ９０に特異的な抗体でもって検出可能に標識し、該抗体からの信号が、対照群（例えば、背景値）より検出可能にさらに大きければ、その細胞は、「ＣＤ９０＋」である。
本明細書において、用語「陰性」とは、特定細胞表面標識に特異的な抗体を使用しても、背景値に比較し、その標識を検出することができないものを意味する。例えば、ＣＤ３４に特異的な抗体でもって細胞を検出可能に標識することができなければ、その細胞は、「ＣＤ３４－」である。
また、一態様において、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べ、ＫＩＴＬＧ、ＣＸＣＬ１２、ＨＥＳ４、ＴＷＩＳＴ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＮＯＧ及びＡＬＰＬからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が過発現されるものでもあり、具体的には、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べ、ＫＩＴＬＧ、ＣＸＣＬ１２、ＨＥＳ４、ＴＷＩＳＴ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＮＯＧ及びＡＬＰＬが、いずれも過発現されるものであり得る。
さらに具体的には、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、胎児間葉系幹細胞マーカーとして、ＫＩＴＬＧ及びＣＸＣＬ１２、骨分化マーカーとして、ＨＥＳ４、ＴＷＩＳＴ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＮＯＧ及びＡＬＰＬを、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べて過発現するものであり得る。
前記間葉系幹細胞は、代案として、その培養物、溶解物またはその抽出物が利用されうる。前記培養物、前記溶解物または前記抽出物は、細胞とそのままを利用し難い場合、有用な代案にもなり、タンパク質などを含む細胞の構成成分を含んでいるので、本来の細胞と類似しているか、あるいはそれと同等な生物学的活性を示すことができる。前記溶解物または前記抽出物は、商業的に利用可能な細胞溶解キットまたは細胞抽出キットなどを利用して得ることができる。
前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、他の間葉系幹細胞（例えば、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞（CordＳＴＥＭ）、成人骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）、及び胚芽幹細胞由来の間葉系幹細胞（ＥＳ－ＭＳＣ））に比べ、連続された継代培養にも増殖能が維持され、核型安定性が維持され、商用化に安全であり、量産が容易である。具体的には、前記間葉系幹細胞は、少なくとも２０継代まで培養されても、増殖能が維持され、少なくとも２４継代まで培養されても、核型安定性が維持されうる。
また、一様相による前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、軟骨細胞分化能、脂肪細胞分化能及び神経細胞分化能にもすぐれ、特に、骨分化能の場合、他の間葉系幹細胞に比べて顕著にすぐれており、具体的には、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞（CordＳＴＥＭ）、成人骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）、胚芽幹細胞由来の間葉系幹細胞（ＥＳ－ＭＳＣ）に比べて著しく骨分化能にすぐれている。
一態様において、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現しないものであり得る。
具体的には、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞がｂＦＧＦ添加培地で培養される場合、ＨＬＡクラスＩが発現される細胞が５％以下に低減されうる。従って、一様相による間葉系幹細胞は、免疫拒否反応によって死滅される細胞が少なく、同種細胞治療時、細胞生存率が高い。
また、一態様において、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べ、ＡＢＬ１、ＩＧＦＢＰ－７、ＭＭＰ－１、ＧＬＯ－１、プログラニュリン（progranulin）、アミリン（amylin）、ＢＭＸ、ＡＬＰＰ、ＦＡＰ、ＡＤＡＭＴＳ－Ｌ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＬＲ１、ガレクチン－３、beta ＩＧ－Ｈ３、ＨＢ－ＥＧＦ、１１ｂ－ＨＳＤ１、ＰＴＨＬＰ、ＡＣＴＨ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１及びＧＤＦ３からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドが過分泌（over－secretion）されるものでもあり、具体的には、ＡＢＬ１、ＩＧＦＢＰ－７、ＭＭＰ－１、ＧＬＯ－１、プログラニュリン（progranulin）、アミリン（amylin）、ＢＭＸ、ＡＬＰＰ、ＦＡＰ、ＡＤＡＭＴＳ－Ｌ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＬＲ１、ガレクチン－３、beta ＩＧ－Ｈ３、ＨＢ－ＥＧＦ、１１ｂ－ＨＳＤ１、ＰＴＨＬＰ、ＡＣＴＨ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１及びＧＤＦ３が、いずれも臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べて過分泌されるものであり得る。
また、前述の過分泌は、具体的には、細胞外培養液に過分泌されるものであり得る。
前記用語「ポリペプチド（polypeptide）」とは、アミド結合（または、ペプチド結合）によって連結された２個以上のアミノ酸によってなるポリマーを意味する。前記ポリペプチドのアミノ酸配列と、それぞれ約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列相同性を有するポリペプチドを含むものであり得る。
前記用語「相同性（homology）」とは、野生型アミノ酸配列との類似程度を示すためのものであり、そのような相同性の比較は、当業界で周知されている比較プログラムを利用して行い、２個以上の配列間相同性を百分率（％）で計算しうる。
また、一態様において、前記幹細胞は、ＣＤ９０を異形性（heterogeneous）に発現しうる。
また、一態様において、前記幹細胞は、ＣＤ９０を異形性（heterogeneous）に発現しうる。
具体的には、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、胎児の骨組織由来でもあり、前記胎児の組織は、頭部（skull）または頭蓋冠（calvaria）であり得る。また、ＣＤ９０の発現が高い細胞群と、ＣＤ９０の発現が低い細胞群とを含むものでもあり、それは、培地内ｂＦＧＦ添加いかんにより、さらに明らかに示されうる。
他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む骨疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
前記「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」とは、前述の範囲内であり得る。
前記骨疾患は、例えば、骨粗鬆症、骨折、骨不癒合、骨形成不全、骨減少症、骨融解性転移、老人性脊椎後彎症、パジェット病、骨萎縮、骨軟化症、骨関節炎、歯周疾患、くる病、無形成骨疾患、癌細胞の骨転移によって引き起こされる骨損傷、繊維異形成症、マッキューン・オルブライト症侯群、骨奇形、及び骨異形成症からなる群より選択される少なくとも１つの骨疾患でもあり、望ましくは、骨粗鬆症、骨折、繊維異形成症、マッキューン・オルブライト症侯群、骨不癒合及び骨形成不全からなる群より選択される少なくとも１つの骨疾患でもあり、さらに望ましくは、骨粗鬆症であり得る。
用語「予防」とは、一様相による薬学的組成物の投与により、個体の骨疾患を抑制させるか、あるいは発病を遅延させる全ての行為を意味しうる。
用語「治療」とは、一様相による薬学的組成物の投与により、個体の骨疾患に対する症状が好転するか、あるいは良好に変更される全ての行為を意味しうる。
一様相によれば、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、他の間葉系幹細胞対比で、増殖能にすぐれ、増殖することにより、核型安定性にもすぐれ、骨分化能に非常にすぐれ、骨形成能が顕著である。前述の顕著な骨形成能を基に、骨密度、骨細胞数、骨体積をいずれも増大させ、顕著な骨疾患治療効果を示すことができる。
また、一態様において、前記薬学的組成物は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞以外に、他の骨疾患の予防用または治療用の薬学的組成物をさらに含むものであり得る。
すなわち、前記薬学的組成物は、従来に知られている他の骨疾患の予防用または治療用の組成物、または新たに開発される他の骨疾患の予防用または治療用の組成物と混合して提供されうる。
前記薬学的組成物が、他の骨疾患の予防用または治療用の組成物を含む場合、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量が混合されることが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記薬学的組成物が、他の骨疾患の予防用または治療用の組成物をさらに含む場合、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のみを有効成分として含む場合より、骨疾患の予防または治療の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
また、一態様において、前記薬学的組成物は、単独投与、または他の骨疾患の予防用または治療用の組成物と併用投与されるものであり得る。
前述の他の骨疾患の予防用または治療用の組成物は、従来に知られている他の骨疾患の予防用または治療用の組成物、または新たに開発される他の骨疾患の予防用または治療用の組成物であり得る。
前記薬学的組成物は、他の骨疾患の予防用または治療用の組成物と併行して投与され、同時、別途または順次に投与され、単一投与されたり、多重投与されたりしうる。前述の要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記薬学的組成物が、他の骨疾患の予防用または治療用の組成物と併用投与される場合、前記薬学的組成物が単独投与される場合より、骨疾患の予防または治療の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
用語「投与」とは、適切な方法でもって、個体に所定物質を導入させることを意味し、「個体」とは、骨疾患を保有しうるヒトを含む鼠、マウス、家畜のような全ての生物を意味する。具体的な例として、ヒトを含む哺乳動物であり得る。
一態様において、薬学的組成物の投与経路は、以下のところに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨膜内または骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。
前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与される。用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の年齢・性別・状態・体重、体内への活性成分の吸収度、不活性率、排泄速度、患者疾患の種類・重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間・投与経路及び排出比率、治療期間、肥満の重症度、同時使用される薬物を含む要素、並びにその他医学分野に周知されている要素によっても決定され、例えば、前記薬学的組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日ないし１，０００ｍｇ／ｋｇ／日で投与され、薬学的組成物に含まれた骨分化能機能強化の間葉系幹細胞、及び投与対象個体を基準とするとき、１０２細胞／ｋｇないし１０９細胞／ｋｇ、１０３細胞／ｋｇないし１０９細胞／ｋｇ、１０３細胞／ｋｇないし１０８細胞／ｋｇ、１０４細胞／ｋｇないし１０８細胞／ｋｇ、または１０４細胞／ｋｇないし１０７細胞／ｋｇのレベルで投与されるものであり得る。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含むエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
前記「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」とは、前述の範囲内であり得る。
前記エストロゲン欠乏症侯群は、例えば、エストロゲン欠乏による、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、鬱病、眩暈症、集中障害、短期記憶障害、不安、記憶力減退、心悸亢進、筋肉痛、関節痛、皮膚の乾燥及び萎縮、膣乾燥症、膣萎縮、下部尿道萎縮、膣炎、子宮萎縮、膀胱炎、排尿痛、急尿、肥満、第２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、脂肪肝、急な心臓拍動変化、睡眠障害、自信感と性的欲求との喪失、骨粗鬆症、アテローム性心臓疾患、静脈血栓症、不規則な生理周期、不規則な生理量、不規則な生理期間、多汗症、耳鳴、高血圧、消火器障害、頭痛、認知機能障害、疲労感、感情起伏、アルツハイマー病、性交痛、短期記憶障害、性欲減退、血流障害、並びに皮膚老化からなる群より選択される少なくとも１つの症状を示すものでもあり、望ましくは、エストロゲン欠乏による、肥満及び第２型糖尿病からなる群より選択される少なくとも１つの症状を示すことでもあり、さらに望ましくは、エストロゲン欠乏による、骨粗鬆症及び肥満症状を示すことであり得る。
用語「予防」とは、一様相による薬学的組成物の投与により、個体のエストロゲン欠乏症侯群を抑制させるか、あるいは発病を遅延させる全ての行為を意味しうる。
用語「治療」とは、一様相による薬学的組成物の投与により、個体のエストロゲン欠乏症侯群に対する症状が好転するか、あるいは良好に変更される全ての行為を意味しうる。
一態様によれば、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、他の間葉系幹細胞対比で、増殖能にすぐれ、増殖することにより、核型安定性にもすぐれ、骨分化能に非常にすぐれ、脂肪細胞の増加を抑制する。それを介し、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、エストロゲン欠乏症侯群の予防または治療の効果を示すことができる。
また、一態様において、前記薬学的組成物は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞以外に、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の薬学的組成物をさらに含むものであり得る。
すなわち、前記薬学的組成物は、従来に知られている他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物、または新たに開発される他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物と混合して提供されうる。
前記薬学的組成物が、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物を含む場合、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量が混合されることが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記薬学的組成物が、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物をさらに含む場合、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のみを有効成分として含む場合より、エストロゲン欠乏症侯群の予防または治療の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
また、一態様において、前記薬学的組成物は、単独投与、または他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物と併用投与されるものであり得る。
前述の他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物は、従来に知られている他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物、または新たに開発される他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物であり得る。
前記薬学的組成物は、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物と併行して投与され、同時、別途または順次に投与され、単一投与されたり、多重投与されたりしうる。前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記薬学的組成物が、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の組成物と併用投与される場合、前記薬学的組成物が単独投与される場合より、エストロゲン欠乏症侯群の予防または治療の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
用語「投与」とは、適切な方法でもって、個体に所定物質を導入させることを意味し、「個体」とは、エストロゲン欠乏症侯群を保有しうるヒトを含む鼠、マウス、家畜のような全ての生物を意味する。具体的な例として、ヒトを含む哺乳動物であり得る。
前記薬学的組成物は、有効成分を単独で含むか、あるいは１以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物として提供されうる。
具体的には、前記担体は、例えば、コロイド懸濁液、粉末、食塩水、脂質、リポソーム、微小球体（microspheres）またはナノ球形粒子であり得る。それらは、運搬手段と複合体を形成するか、あるいは関連することができ、脂質、リポソーム、微細粒子、金、ナノ粒子、ポリマー、縮合反応剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増進物質または脂肪酸のような当業界に公知された運搬システムを使用して生体内運搬されうる。
前記薬学的組成物が製剤化される場合には、一般的に使用される潤滑剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤のような希釈剤または賦形剤を使用して調製されうる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、前記組成物に少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調製されうる。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用されうる。経口のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれるものであり得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれるものであり得る。非水性溶剤、懸濁液剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（Witepsol（登録商標））、マクロゴール、トゥイーン（Tween（登録商標））６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され、点眼剤形態に製造されるとき、公知の希釈剤または賦形剤などが使用されうる。
一態様において、薬学的組成物の投与経路は、以下のところに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。
前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与される。用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の年齢・性別・状態・体重、体内への活性成分の吸収度、不活性率、排泄速度、患者疾患の種類・重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間・投与経路及び排出比率、治療期間、肥満の重症度、同時使用される薬物を含む要素、並びにその他医学分野に周知されている要素によっても決定され、例えば、前記薬学的組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日ないし１，０００ｍｇ／ｋｇ／日で投与され、薬学的組成物に含まれた骨分化能機能強化の間葉系幹細胞、及び投与対象個体を基準とするとき、１０２細胞／ｋｇないし１０９細胞／ｋｇ、１０３細胞／ｋｇないし１０９細胞／ｋｇ、１０３細胞／ｋｇないし１０８細胞／ｋｇ、１０４細胞／ｋｇないし１０８細胞／ｋｇ、または１０４細胞／ｋｇないし１０７細胞／ｋｇのレベルで投与されるものであり得る。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品を提供する。
前記「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「骨疾患」、「予防」などは、前述の範囲内であり得る。
用語「改善」とは、治療される状態と係わるパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも低減させる全ての行為を意味しうる。このとき、前記健康機能食品は、骨疾患の予防または改善のために、当該疾病の発病段階以前またはその発病後、治療のための薬剤と同時、または別個に使用されうる。
一態様において、前記健康機能食品は、他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品をさらに含むものであり得る。
前記健康機能食品は、従来に知られている他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品、または新たに開発される他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品と混合して提供されうる。
前記健康機能食品が、他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品を含む場合、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量が混合されることが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記健康機能食品が、他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品をさらに含む場合、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のみを有効成分として含む場合より、骨疾患の予防または改善の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
前記健康機能食品は、従来に知られた他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品、または新たに開発される他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品と併行して摂取され、同時、別途または順次に摂取され、単一摂取または多重摂取されうる。前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量を摂取することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記健康機能食品が、他の骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品と併用摂取される場合、前記健康機能食品を単独摂取する場合より、骨疾患の予防または改善の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含むエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品を提供する。
前記「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「エストロゲン欠乏症侯群」、「予防」などは、前述の範囲内であり得る。
用語「改善」とは、治療される状態と係わるパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも低減させる全ての行為を意味しうる。このとき、前記健康機能食品は、エストロゲン欠乏症侯群の予防または改善のために、当該疾病の発病段階以前、またはその発病後、治療のための薬剤と同時または別個に使用されうる。
一態様において、前記健康機能食品は、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品をさらに含むものであり得る。
前記健康機能食品は、従来に知られている他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品、または新たに開発される他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品と混合して提供されうる。
前記健康機能食品が、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品を含む場合、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量が混合されることが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記健康機能食品が、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品をさらに含む場合、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のみを有効成分として含む場合より、エストロゲン欠乏症侯群の予防または改善の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
前記健康機能食品は、従来に知られた他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品、または新たに開発される他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品と併行して摂取され、同時、別途または順次に摂取され、単一摂取または多重摂取されうる。前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最小限の量でもって、最大効果を得ることができる量を摂取することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されうる。
前記健康機能食品が、他のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品と併用摂取される場合、前記健康機能食品を単独摂取する場合より、エストロゲン欠乏症侯群の予防または改善の効果がさらに顕著になる相乗効果が示されうる。
前記健康機能食品において、有効成分は、食品にそのまま添加されるか、あるいは他の食品または食品成分と共に使用され、一般的な方法により、適切に使用されうる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防用または改善用）により、適切に決定されうる。一般的に、食品または飲料の製造時、前記健康機能食品は、原料に対し、具体的には、約１５重量％以下、さらに具体的には、約１０重量％以下の量で添加されうる。しかしながら、健康及び衛生を目的とするか、あるいは健康調節を目的とする長期間の摂取である場合には、前述の量は、前記範囲以下であり得る。
前記健康機能食品は、担体、希釈剤、賦形剤及び添加剤のうち１以上をさらに含み、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤及び液剤の剤形によってなる群のうちから選択された一つに剤形されうる。一様相による間葉系幹細胞を添加しうる食品としては、各種食品類、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ剤、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
前述の担体、賦形剤、希釈剤及び添加剤の具体的な例としては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、エリトリトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート 、ケイ酸カルシウム、微晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、水、砂糖シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアト酸マグネシウム及びミネラルオイルによってなる群から選択される少なくとも一つであり得る。
前記健康機能食品は、前記有効成分を含む以外に、特別な制限なしに、他の成分を必須成分として含むものであり得る。例えば、通常の飲料と共に、さまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むものであり得る。前述の天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、ショ糖など；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンのような一般的な糖：及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールのような糖アルコールであり得る。前述のところ以外の香味剤として、天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を、利をもって使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適切に決定されうる。
前述のところ以外にも、一様相による健康機能食品は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤のような風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むものであり得る。そのような成分は、独立して、または組み合わせて使用され、そのような添加剤の比率も、当業者によって適切に選択されうる。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を連続して継代培養する段階を含む、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の大量製造方法を提供する。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を連続して継代培養する段階を含む、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の大量製造方法を提供する。
前記「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」などは、前述の範囲内であり得る。
前記「継代培養」とは、本来、培養物における一部細胞を、新たな培養培地に移して作られた新たな細胞または微生物を培養することを意味し、該継代培養を介し、細胞または微生物細胞の数を増加させるか、あるいは細胞株の寿命を延長させることができる。
前述の「連続しての継代培養」とは、本来の細胞または微生物の形質が変わっていない状態で継代培養されることを意味する。
前述の「連続しての継代培養」とは、本来の細胞または微生物の形質が変わっていない状態で継代培養されることを意味する。
前述の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、一般的な間葉系幹細胞と異なり、連続して継代培養されるにもかかわらず、本来の形質、すなわち、骨分化能、脂肪細胞分化能、軟骨細胞分化能、神経細胞分化能、少ない免疫拒否反応、骨疾患及び／またはエストロゲン欠乏症侯群の予防または治療の効果は、低下されず、核型安定性を維持しうる。
一様相による大量製造方法によれば、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を大量に増殖させることができ、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を商用化させるところに貢献可能である。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、それを必要とする個体に投与する段階を含むエストロゲン欠乏症侯群の予防方法または治療方法を提供する。
前述の「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「個体」、「投与」、「エストロゲン欠乏症侯群」、「予防」、「治療」などは、前述の範囲内であり得る。
前述の「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「個体」、「投与」、「エストロゲン欠乏症侯群」、「予防」、「治療」などは、前述の範囲内であり得る。
さらに他の態様は、前記骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の骨疾患の予防用途または治療用途を提供する。
前述の「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「骨疾患」、「予防」、「治療」などは前述の範囲内であり得る。
さらに他の態様は、前述の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のエストロゲン欠乏症侯群の予防用途または治療用途を提供する。
前述の「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「エストロゲン欠乏症侯群」、「予防」、「治療」などは、前述の範囲内であり得る。
前述の「骨分化能機能強化の間葉系幹細胞」、「エストロゲン欠乏症侯群」、「予防」、「治療」などは、前述の範囲内であり得る。
一様相による骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、骨分化能、脂肪細胞分化能、軟骨細胞分化能、神経細胞分化能にすぐれており、特に、骨分化能の場合、他由来の間葉系幹細胞よりも顕著にすぐれている。また、前述の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、免疫拒否反応が少なく、骨疾患及びエストロゲン欠乏症侯群に、予防または治療の効果を示すことができる。さらには、前述の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、連続した継代培養にもかかわらず、増殖能が維持され、核型安定性が維持されるが、商用化に安全であり、量産が可能であるという長所がある。
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
実施例
実施例
実施例１．ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）添加剤の存在下及び不在下における胎児間葉系幹細胞（Fetal ＭＳＣ）由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の増殖
ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）添加剤の存在下及び不在下において、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の増殖を確認し、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦ添加剤存在（図１下段）下及び不在（図１上段）以下において培養培地に拡張された。Fetal ＭＳＣは、継代培養され、示されているように、３日ないし４日にごとに細胞数を計数した。その結果、図１のように、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の形態を確認することができた。
また、２個の他のFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞株（ｆＭＳＣ＿００１、ｆＭＳＣ＿００２）を確認し、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の成長曲線（図２の上段）及び予想細胞数（図２下段）は、図２に示されている。
図１及び図２について述べれば、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦの添加有無に係わりなく、間葉系幹細胞の形態学的特性である紡錘形のモルフォロジーを有することを確認することができた。
ただし、成人由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ、ＡＤ－ＭＳＣ）、新生児（neonatal）由来のＭＳＣ（umbilical cord ＭＳＣ、placental ＭＳＣ、ＵＣ blood ＭＳＣ）に比べ、増殖能にすぐれ、２０継代まで増殖能が維持されることを確認することができた。
それは、量産工程の側面において、１８継代後、１０６細胞基準で、６０億バイアル以上生産可能であることを示す。
それは、量産工程の側面において、１８継代後、１０６細胞基準で、６０億バイアル以上生産可能であることを示す。
実施例２．Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の分化能
ｂＦＧＦ添加剤の存在下及び不在下のFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の分化能を確認するために、骨分化能（図３Ａ）、脂肪細胞分化能（図３Ｂ）、軟骨細胞分化能（図３Ｃ）及び神経細胞分化能（図３Ｄ）を確認した。
ｂＦＧＦ添加剤の存在下及び不在下のFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の分化能を確認するために、骨分化能（図３Ａ）、脂肪細胞分化能（図３Ｂ）、軟骨細胞分化能（図３Ｃ）及び神経細胞分化能（図３Ｄ）を確認した。
具体的には、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、ｂＦＧＦ存在（下段）下及びｂＦＧＦ不在（上段）以下において、培養培地に拡張させた。
骨分化能を確認するために、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、骨分化培地（StemPro(登録商標) Osteogenesis Differentiation Kit）において１４日間培養した。分化後、細胞外カルシウム沈着物をアリザリンレッド（Alizarin Red）で染色した（図３のＡ）。
また、脂肪細胞分化能を確認するために、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、脂肪細胞分化培地（StemPro(登録商標) Adipogenesis Differentiation Kit）において１０日間培養した。分化後、脂肪滴をオイルレッド（Oil Red）で染色した（図３のＢ）。
また、軟骨細胞分化能を確認するために、細胞ペレット（２．５×１０５細胞／ペレット）を、軟骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ／high－glucose supplemented with １％ ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１、１０μＭデキサメタゾン（dexamethasone）、１μＭ ascorbate－２－phosphate、１％ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、１Ｘ ＮＥＡＡ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）において２１日間培養した。分化後、パラフィン切片をＨ＆Ｅで染色した（図３のＣ）。
また、神経細胞分化能を確認するために、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、Ｂ－２７無血清補充剤及びGlutaMAX－Ｉが添加された神経細胞分化培地において１４日間培養した。分化後、分化されたニューロンを、ネスチン（nestin）またはＧＦＡＰ特異抗体を利用し、免疫細胞化学で染色した。
その結果、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦの添加有無に係わりなく、間葉系幹細胞の分化特性である骨分化能、脂肪細胞分化能、軟骨細胞分化能、及び多少の神経細胞分化能を維持することを確認することができた。
実施例３．子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の頭部（skull）組織由来または頭蓋冠（calvaria）組織由来の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞と、手足（limb）組織由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞との分化能比較
子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の頭部（skull）組織由来または頭蓋冠（calvaria）組織由来の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞と、子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の手足（limb）組織由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞との分化能を比較するものである。
子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の頭部（skull）組織由来または頭蓋冠（calvaria）組織由来の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞と、子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の手足（limb）組織由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞との分化能を比較するものである。
具体的には、骨分化能を確認するために、Fetal ＭＳＣ（手足（limb）組織）由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、骨分化培地（StemPro(登録商標) Osteogenesis Differentiation Kit）において１４日間培養した。分化後、細胞外カルシウム沈着物をアリザリンレッド（Alizarin Red）で染色した。
また、脂肪細胞分化能を確認するために、Fetal ＭＳＣ（手足（limb）組織）由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、脂肪細胞分化培地（StemPro(登録商標) Adipogenesis Differentiation Kit）において１０日間培養した。分化後、脂肪滴をオイルレッド（Oil Red）で染色した。
また、軟骨細胞分化能を確認するために、細胞ペレット（２．５×１０５細胞／ペレット）を、軟骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ／high－glucose supplemented with １％ ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１、１０μＭデキサメタゾン（dexamethasone）、１μＭ ascorbate－２－phosphate、１％ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、１Ｘ ＮＥＡＡ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン）において２１日間培養した。分化後、パラフィン切片をＨ＆Ｅで染色した。
その結果、胎児の手足（limb）から分離されたFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の脂肪細胞分化能は、胎児頭部（skull）組織または頭蓋冠（calvaria）組織から分離されたFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞と類似しており、軟骨細胞分化能は、若干増大するが、骨分化能は、若干低減されることを確認することができた（図４）。
本実施例３を除いた残り実施例においては、胎児の頭部組織または頭蓋冠（calvaria）組織から分離されたFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を利用した。
実施例４．骨分化能の比較
多様な由来のＭＳＣの骨分化能を比較するものである。
多様な由来のＭＳＣの骨分化能を比較するものである。
具体的には、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞（CordＳＴＥＭ）、成人骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）、及び胚芽幹細胞由来の間葉系幹細胞（ＥＳ－ＭＳＣ）を含む間葉系幹細胞を培養培地に拡張させた。該間葉系幹細胞は、骨分化培地（StemPro(登録商標) Osteogenesis Differentiation Kit）において１４日間培養された。分化後、細胞外カルシウム沈着物及び塩基性ホスファターゼ酵素活性を、それぞれアリザリンレッド（Alizarin Red）及びＡＰ染色で染色した（図５）。
また、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞と、ＢＭ－ＭＳＣとの骨分化能を比較するために、該間葉系幹細胞を、表示された期間（７日、１４日及び２１日）の間、骨分化培地（StemPro(登録商標) Osteogenesis Differentiation Kit）において培養した。分化後、細胞外カルシウム沈着物は、アリザリンレッド（Alizarin Red）で染色した（図６）。
また、骨形成マーカー遺伝子の発現を確認するために、表示されているように、骨分化の間、総ＲＮＡは、準備され、骨形成マーカー遺伝子に係わるプライマーを利用し、ＲＴ－ＰＣＲを遂行した（図７）（ＡＬＰ：Alkaline phosphatase；Ｓ１００Ａ４：S100 Calcium Binding Protein A4；ＣＯＬ１Ａ１：Collagen Type I Alpha 1 Chain；ＣＯＬ１Ａ２：Collagen Type I Alpha 2 Chain）。
その結果、骨分化能比較分析を介し、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、成人由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）、新生児（neonatal）由来のＭＳＣ（umbilical cord ＭＳＣ）、胚芽幹細胞由来ＭＳＣに比べ、特に、ｂＦＧＦ無添加培地で培養されたFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の骨分化能がすぐれていることを確認することができた（図５）。
現在まで、骨分化能にもっともすぐれていると知られているＢＭ－ＭＳＣと比較したとき、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、骨分化誘導７日後から骨分化が始まれば、１４日後、すでに飽和（saturation）されている一方、ＢＭ－ＭＳＣは、２１日後にも、飽和（saturation）されていない。また、それは、さまざまな骨分化マーカー遺伝子発現においても確認することができた。
実施例５．染色体分析（核型分析（karyotyping））
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の染色体分析を行うために、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、ｂＦＧＦ添加剤の存在下または不在下において、培養培地に拡張させた。Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、表示されているように、ｂＦＧＦが添加されていない場合、８継代まで培養され（図８のＡ）、ｂＦＧＦが添加されている場合、２４継代まで培養された（図８のＢ）。少なくとも１０個の細胞が分析され、代表的なＧ（Giemsa）バンド中期顕微鏡イメージで示されている。
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の染色体分析を行うために、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、ｂＦＧＦ添加剤の存在下または不在下において、培養培地に拡張させた。Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、表示されているように、ｂＦＧＦが添加されていない場合、８継代まで培養され（図８のＡ）、ｂＦＧＦが添加されている場合、２４継代まで培養された（図８のＢ）。少なくとも１０個の細胞が分析され、代表的なＧ（Giemsa）バンド中期顕微鏡イメージで示されている。
核型分析（karyotyping）を介し、核型安定性を確認した結果、８継代及び２４継代においても、核型安定性が維持されることが確認されたが、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、商用化に安全な細胞であることを知ることができた。
実施例６．表面マーカー発現
ＦＡＣＳ分析を介し、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の表面マーカー発現を確認するものである。Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、ｂＦＧＦ添加剤の存在下または不在下において、培養培地に拡張させた。表示された継代において、細胞は培養され、間葉系幹細胞マーカー（図９）、万能幹細胞マーカー（図１０）、造血母細胞マーカー（図１１）、ヒト白血球抗原（図１２）を使用し、ＦＡＣＳ分析を行った。
ＦＡＣＳ分析を介し、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の表面マーカー発現を確認するものである。Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を、ｂＦＧＦ添加剤の存在下または不在下において、培養培地に拡張させた。表示された継代において、細胞は培養され、間葉系幹細胞マーカー（図９）、万能幹細胞マーカー（図１０）、造血母細胞マーカー（図１１）、ヒト白血球抗原（図１２）を使用し、ＦＡＣＳ分析を行った。
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間葉系幹細胞特性を確認するために、間葉系幹細胞表面マーカー発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦの添加有無に係わりなく、間葉系幹細胞の代表的な表面マーカーであるＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６を、初期培養継代（Ｐ９）、中期培養継代（Ｐ１３）、後期培養継代（Ｐ１７）において、均一（uniform）に発現することを確認した（図９）。
また、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間葉系幹細胞特性を確認するために、全分化能細胞表面マーカー発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦの添加有無に係わりなく、全分化能細胞の代表的な表面マーカーであるＳＳＥＡ－３、ＴＲＡ１－８１を、初期培養継代（Ｐ９）、中期培養継代（Ｐ１３）、後期培養継代（Ｐ１７）において、全く発現しないが、特別に、ｂＦＧＦ無添加培養条件の初期細胞において、胎児由来細胞表面マーカーであるｃ－kitを発現する細胞が存在することが確認された。従って、ｃ－kit発現がFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の特性中の一つであることを確認することができた（図１０）。
また、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間葉系幹細胞特性を確認するために、造血母細胞（hematopoietic stem cell）の表面マーカー（surface marker）発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦの添加有無に係わりなく、造血母細胞の代表的な表面マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ２４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７０を、初期培養継代（Ｐ９）、中期培養継代（Ｐ１３）、後期培養継代（Ｐ１７）において、全く発現していないことが確認された（図１１）。
また、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間葉系幹細胞特性において、ＨＬＡ発現による免疫原性を確認した結果、他のＭＳＣと同様に、ＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）発現は、全くないことが確認され、特異なことに、ＨＬＡクラスＩの発現が、ｂＦＧＦ添加培養された細胞において、ほとんど発現されないことが確認された。従ってｂＦＧＦ添加培地において、ＨＬＡクラスＩの発現低減は、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の特性のうち一つであることを知ることができ、それは、同種細胞治療剤開発において、免疫拒否反応による細胞生存率を高めるのに非常に有用であるということを知ることができた（図１２）。
実施例７．遺伝子発現の分析
多様な由来の間葉系幹細胞のＲＮＡシークエンシング分析を行い、クラスタリングヒートマップ（clustering heat map）及び主要成分分析（ＰＣＡ：principal component analysis）が得られた（図１３）。
多様な由来の間葉系幹細胞のＲＮＡシークエンシング分析を行い、クラスタリングヒートマップ（clustering heat map）及び主要成分分析（ＰＣＡ：principal component analysis）が得られた（図１３）。
クラスタリングヒートマップとＰＣＡは、培養培地内において、ｂＦＧＦ存在下または不在下において、ＢＭ－ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ（CordＳＴＥＭ）及びFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間の差別的に発現された遺伝子の相対的発現（ｚ－score）を示す。
また、差別的に発現された遺伝子分析を行い、多様な由来のＭＳＣ間の差別的に発現された遺伝子間の重畳されたベンダイアグラムが得られた（図１４）。図１４内のTable １は、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞内の排他的（赤色）または高度（黒色）に発現されたFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞特異マーカー遺伝子を要約したところを示す。
また、総ＲＮＡは、多様な由来のＭＳＣから準備され、図１４のTable １の（１）骨形成ＭＳＣマーカー遺伝子、（２）Fetal ＭＳＣマーカー遺伝子、（３）細胞表面マーカー及び（４）骨形成ＭＳＣマーカーに係わる特異的なプライマーを利用し、ＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ｍＲＮＡ発現が確認された（図１５及び図１６）。
ＲＮＡシークエンシング分析方法でもって、成人由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）、新生児（neonatal）由来ＭＳＣ（umbilical cord ＭＳＣ）につき、遺伝子発現を分析した結果、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の特異発現遺伝子（マーカー）が確認された。他起源（origin）のＭＳＣにおいては、発現されていないが、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞においてのみ発現されるFetal ＭＳＣ特異遺伝子は、Ｏｓｘ（ＳＰ７）、ｃ－kit、ＣＤ２４、ＣＤ７０、ＳＦＲＰ２であった。従って、それらマーカー発現を介し、Fetal ＭＳＣが、他のＭＳＣと差別化されることを知ることができた。
そのうち、骨分化機能と関連し、Ｏｓｘ（ＳＰ７）は、骨形成性（osteogenic）ＭＳＣ特異マーカーとして知られており、ＳＦＲＰ２は、骨分化に重要な役割を行う細胞シグナリング（cell signaling）に関与すると知られている。
また、Ｃ－kitは、胎児（fetus）由来細胞の特異マーカーであり、それ以外に、胎児（fetus）由来遺伝子であるＫＩＴＬＧ、ＣＸＣＬ１２が他のソース（source）ＭＳＣ対比で、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞で過発現されることを確認することができた。
また、ＣＤ２４、ＣＤ７０は、細胞表面マーカーであり、これらマーカーを介し、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の特異性を区別することができた。
その他骨分化に係わる転写因子（transcription factor）、リガンド及び細胞シグナリング構成要素（cell signaling components）、酵素などが、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞において過発現されることが確認された（例えば、ＨＥＳ４、ＴＷＩＳＴ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＮＯＧ、ＡＬＰＬなど）。
実施例８．分泌体分析（secretome analysis）
分泌体分析を行うために、クラスタリングヒートマップ及び主要成分分析をまず行った（図１７）。RayBiotech human cytokine array（RayBiotech ＃Ｌ－５０７，＃Ｌ－４９３）は、多様な由来のＭＳＣから得られた無血清培地サンプルを利用して分析された。該クラスタリングヒートマップ及び該ＰＣＡは、培養培地内において、ｂＦＧＦの存在下または不在下において、ＢＭ－ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ（CordＳＴＥＭ）及びFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間の差別的に分泌されたサイトカイン及び成長因子の相対的分泌を示す。
分泌体分析を行うために、クラスタリングヒートマップ及び主要成分分析をまず行った（図１７）。RayBiotech human cytokine array（RayBiotech ＃Ｌ－５０７，＃Ｌ－４９３）は、多様な由来のＭＳＣから得られた無血清培地サンプルを利用して分析された。該クラスタリングヒートマップ及び該ＰＣＡは、培養培地内において、ｂＦＧＦの存在下または不在下において、ＢＭ－ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ（CordＳＴＥＭ）及びFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の間の差別的に分泌されたサイトカイン及び成長因子の相対的分泌を示す。
また、散布図（scatter plot）が確認された（図１８）。該散布図は、差別的に分泌されたタンパク質を示し、タンパク質分泌は、Fetal ＭＳＣ（＋）に比べ、増大されたものは、赤色で示され、低減されたものは、緑色で示されている。図１８の表は、該散布図において、高度に分泌された遺伝子のリスト、及びそれらの骨代謝関連機能を示す。
分泌体（secretome）分析方法でもって、成人由来ＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）、新生児（neonatal）由来ＭＳＣ（umbilical cord ＭＳＣ）につき、培養液内にタンパク質分泌を分析した結果、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞特異タンパク質の分泌を確認することができた。他由来のＭＳＣと比べ、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞から過分泌されるタンパク質が多数確認された（図１８）。
特に、ＭＳＣ増殖、骨分化または骨代謝機能と関連し、図１８の表に要約されているように、多数のサイトカイン、成長因子のような機能性タンパク質が、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞において、多く分泌されることが確認された。従って、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、骨分化機能にすぐれるということが知ることができた。
実施例９．ＣＤ９０異形成能（heterogeneity）及び骨形成可能性（osteogenic potential）
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ＣＤ９０異形成能を有するが、それを確認するためにＦＡＣＳ分析を行った（図１９）。具体的には、間葉系幹細胞（ＥＳ－ＭＳＣ、CordＳＴＥＭ）及びFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦ添加剤の存在下または不在下において、培養培地内に拡張された。表示された継代（Ｐ４、Ｐ６、Ｐ１１及びＰ１２）において細胞が培養され、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４に対する特異抗体を利用し、ＦＡＣＳ分析を行った。
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ＣＤ９０異形成能を有するが、それを確認するためにＦＡＣＳ分析を行った（図１９）。具体的には、間葉系幹細胞（ＥＳ－ＭＳＣ、CordＳＴＥＭ）及びFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、ｂＦＧＦ添加剤の存在下または不在下において、培養培地内に拡張された。表示された継代（Ｐ４、Ｐ６、Ｐ１１及びＰ１２）において細胞が培養され、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＳＥＡ－３及びＳＳＥＡ－４に対する特異抗体を利用し、ＦＡＣＳ分析を行った。
具体的には、８．５週齢胎児の頭部の頭蓋冠（calvaria）部位由来の間葉系幹細胞（図２０Ａ）、７週齢胎児の頭蓋冠，手足（limb），皮膚組織由来の間葉系幹細胞（図２０Ｂ）につき、ＦＡＣＳ分析を行った。骨分化能機能強化間葉系幹細胞のＣＤ９０異形成の場合、手足，皮膚由来の間葉系幹細胞の場合、確認されない一方、骨組織由来の間葉系幹細胞においては、ＣＤ９０異形成を確認することができた。
なお、骨分化能は、頭蓋冠由来間葉系幹細胞が最も顕著であることが確認された（図２０Ｃ）。
前述のような結果を介し、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、継代培養過程において、表面マーカーのうち、ＣＤ９０発現が高い細胞と、ＣＤ９０発現が低い細胞とに分けられることが確認され、そのようなＣＤ９０発現異形成能は、骨組織（頭部部位）に由来する間葉系幹細胞において、強く示されることが確認された。前述のような現象は、ｂＦＧＦ添加時、さらに明らかに示されることが確認された。
実施例１０．骨粗鬆症動物モデルでにおけるFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の骨保護及びその再生
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の骨保護効果及び骨再生効果を確認するために実験を進め、図２１は、実験計画を示す。
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の骨保護効果及び骨再生効果を確認するために実験を進め、図２１は、実験計画を示す。
具体的には、８週齢めすＣ５７ＢＬ／６鼠の卵巣を切除した。２週後、１ｘ１０６のFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞、またはそれと同一体積のＰＢＳ（１００μｌ）を尾静脈に注入した。Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の移植後６週に鼠を犠牲にした。免疫抑制群の場合、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン（cyclospholine）Ａ（ＣｓＡ）を毎日皮下投与した。
その結果として、マイクロコンピュータ断層撮影（micro-computerized tomography）及び骨密度を図２２に示した。犠牲にした後、大腿骨と硬骨とを切除し、１０％ ＰＦＡ溶液で固定させた。骨構造変数は、micro－ＣＴシステム及びＨ＆Ｅ染色を利用して分析された。骨密度及び骨構成の分析において、大腿骨と硬骨は、マイクロコンピュータ断層撮影システム（SkyScan１１７３（Bruker－ＣＴ（ベルギー）））を利用し、１ｍｍ間隔でスキャンされた。骨体積（ｃｍ３）、海綿骨数及び骨密度（ｍｇ／ｃｍ３）は、ＣＴ分析器ソフトウェア（ＣＴＡｎＭｉｃｒｏ－ＣＴ software）を利用して計算された（ＢＶ／ＴＶ：bone volume per tissue volume；Ｔｂ．Ｎ：trabecular bone number；ＢＭＤ：bone mineral density）。
すなわち、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞の骨疾患動物モデルにおける有効性を確認するために、卵巣切除術を介する骨粗鬆症モデルを作製し、骨粗鬆症モデルにおいて、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を静脈に投与した結果、骨密度増大、骨細胞数の増加、骨体積増大が確認された。従って、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、骨粗鬆症、骨折、骨不癒合、骨形成不全、繊維異形成症のような骨疾患適応症細胞治療剤として活用がなされうるということが確認された。
また、作用メカニズム中の一つとして、卵巣切除による骨粗鬆症モデルにおいて、骨髄内間葉系幹細胞の脂肪細胞分化が、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞投与によって低減されることが確認された。
実施例１１．エストロゲン欠乏症侯群の保護
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のエストロゲン欠乏症侯群の保護効果を確認するために実験を進め、実験計画は、図２３に示されている。
Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のエストロゲン欠乏症侯群の保護効果を確認するために実験を進め、実験計画は、図２３に示されている。
具体的には、８週齢めすＣ５７ＢＬ／６鼠の卵巣を切除した。２週後、１ｘ１０６のFetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞、またはそれと同一体積のＰＢＳ（１００μｌ）を尾静脈に注入した。Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞移植後６週に鼠を犠牲にした。免疫抑制群の場合、１０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン（cyclospholine）Ａ（ＣｓＡ）を、浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ（米国））を利用して投与した。
その結果として、脂肪組織分析結果を図２４に示した。犠牲にした後、脂肪パッド（生殖腺脂肪（gonadal fat）、腹膜後脂肪（retroperitoneal fat））の形態と重量とを分析した（one-way ＡＮＯＶＡ test；Ｐ値＊＊＊＊；＜０．０００１，Ｐ値＊＊；０．００１８、Ｐ値＊；０．０１３９）。血糖と総グリセリドとのレベルは、血清を利用して分析した（one-way ＡＮＯＶＡ test；Ｐ値＊＊；０．００２５）。
すなわち、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞のエストロゲン欠乏症侯群（estrogen deficiency syndrome）動物モデルにおいて有効性を確認するために、卵巣切除術を介する動物モデルを作製し、該卵巣切除術によるエストロゲン欠乏症侯群の一つにおいて、代謝障害の一種である脂肪細胞増加による肥満が生じることが確認された。
卵巣切除モデルにおいて、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を静脈に投与した結果、脂肪細胞増加による肥満が大きく低減されることが確認され、従って、Fetal ＭＳＣ由来骨分化能機能強化の間葉系幹細胞は、閉経期以後に生じるエストロゲン欠乏症侯群の一つである代謝疾患（肥満、第２型糖尿病など）適応症に、細胞治療剤として活用が可能であることが確認された。
参照例
参照例１．ヒト胎児間葉系幹細胞（Fetal ＭＳＣ：human fetalmesenchymalstemcell）の分離培養
子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の頭部（skull）組織または手足（limb）組織から神経管（neural tube）を除去した後、頭部（skull）組織を５０ｍｌチューブに入れ、ＨＢＳＳを添加して十分に混ぜながら血液を除去する。かみそり刃を利用し、胎児組織を細く切った後、ＨＢＳＳ １０ｍｌと共に５０ｍｌチューブに移す。頭部（skull）切片を１０ｍｌピペットに柔らかに放ち入れた後、室温で１，２００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。上澄み液を除去し、コラゲナーゼ溶液１０ｍｌを入れ、３７℃恒温振盪器（shaking incubator）に入れ、１５分間インキュベーションする。室温において、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、組織塊だけ沈ませ、上澄み液を９ｍｌを、新たな５０ｍｌチューブにピペットで移した後、同量の１０％ ＦＢＳを含むＤＰＢＳ溶液を添加し、ピペットで十分い混ぜてコラゲナーゼ酵素をブロッキング（blocking）させる。１００μｍ濾過器（strainer）で濾し、１，５００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離する。ペレットを培養培地（ＤＭＥＭ high glucose with １０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン＆ストレプトマイシン）１ｍｌに十分に混ぜる。Ｔ－２５フラスコ当たり５ｘ１０５細胞を培養する。
参照例１．ヒト胎児間葉系幹細胞（Fetal ＭＳＣ：human fetalmesenchymalstemcell）の分離培養
子宮外妊娠、または死産されたヒト胎児の頭部（skull）組織または手足（limb）組織から神経管（neural tube）を除去した後、頭部（skull）組織を５０ｍｌチューブに入れ、ＨＢＳＳを添加して十分に混ぜながら血液を除去する。かみそり刃を利用し、胎児組織を細く切った後、ＨＢＳＳ １０ｍｌと共に５０ｍｌチューブに移す。頭部（skull）切片を１０ｍｌピペットに柔らかに放ち入れた後、室温で１，２００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。上澄み液を除去し、コラゲナーゼ溶液１０ｍｌを入れ、３７℃恒温振盪器（shaking incubator）に入れ、１５分間インキュベーションする。室温において、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、組織塊だけ沈ませ、上澄み液を９ｍｌを、新たな５０ｍｌチューブにピペットで移した後、同量の１０％ ＦＢＳを含むＤＰＢＳ溶液を添加し、ピペットで十分い混ぜてコラゲナーゼ酵素をブロッキング（blocking）させる。１００μｍ濾過器（strainer）で濾し、１，５００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離する。ペレットを培養培地（ＤＭＥＭ high glucose with １０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン＆ストレプトマイシン）１ｍｌに十分に混ぜる。Ｔ－２５フラスコ当たり５ｘ１０５細胞を培養する。
参照例２．ヒト胎児間葉系幹細胞の分化方法
（１）骨分化（osteogenic differentiation）
細胞を２４ウェルプレートで培養した後、StemPro osteogenesis differentiation kit（Ａ１００７２－０１（Gibco））のbasal mediumとsupplementとを９：１で混ぜ、ペニシリン／ストレプトマイシンを１％で添加した培地で交換する。３～４日間隔で培地を交換して培養する。４％ ＰＦＡで固定させた後、２％アリザリンレッド（Alizarin Red）溶液で３０分間染色し、赤く染色されたカルシウムを確認する。
（１）骨分化（osteogenic differentiation）
細胞を２４ウェルプレートで培養した後、StemPro osteogenesis differentiation kit（Ａ１００７２－０１（Gibco））のbasal mediumとsupplementとを９：１で混ぜ、ペニシリン／ストレプトマイシンを１％で添加した培地で交換する。３～４日間隔で培地を交換して培養する。４％ ＰＦＡで固定させた後、２％アリザリンレッド（Alizarin Red）溶液で３０分間染色し、赤く染色されたカルシウムを確認する。
（２）脂肪細胞分化（adipogenic differentiation）
細胞を１２ウェルプレートで培養した後、StemPro adipogenesis differentiation kit（Ａ１００７０－０１）のbasal mediumとsupplementとを９：１で混ぜ、ペニシリン／ストレプトマイシンを１％で添加した培地で交換する。３～４日間隔で培地を交換して培養する。４％ＰＦＡで固定させた後、オイルレッド（Oil Red）溶液で１５分間染色し、オイルドロップ（oil drop）を確認する。
細胞を１２ウェルプレートで培養した後、StemPro adipogenesis differentiation kit（Ａ１００７０－０１）のbasal mediumとsupplementとを９：１で混ぜ、ペニシリン／ストレプトマイシンを１％で添加した培地で交換する。３～４日間隔で培地を交換して培養する。４％ＰＦＡで固定させた後、オイルレッド（Oil Red）溶液で１５分間染色し、オイルドロップ（oil drop）を確認する。
（３）軟骨細胞分化（chondrogenic differentiation）
細胞ペレットを、２１日間、軟骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ－high glucose＋１％ ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１、１０μＭデキサメタゾン（dexamethasone）、１μＭ ascorbate－２－phosphate、１％ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、１Ｘ ＮＥＡＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で培養した後、パラフィン切片に作製し、Ｈ＆Ｅ染色またはＰＡＳ染色で軟骨細胞分化いかんを確認する。
細胞ペレットを、２１日間、軟骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ－high glucose＋１％ ＦＢＳ、１Ｘ ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ－β１、１０μＭデキサメタゾン（dexamethasone）、１μＭ ascorbate－２－phosphate、１％ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）、１Ｘ ＮＥＡＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で培養した後、パラフィン切片に作製し、Ｈ＆Ｅ染色またはＰＡＳ染色で軟骨細胞分化いかんを確認する。
参照例３．ヒト胎児間葉系幹細胞の分化能確認実験
（１）ＲＮＡ製造及びｃＤＮＡ合成
収穫された細胞をTRIzol１ｍｌに入れ、十分に放ち入れた後、クロロホルム２００μｌを入れて十分に混ぜる。室温に２～３分放置した後、１２，０００Ｇで１５分間室温で遠心分離し、上端の無色部分を新たなチューブに移し入れる。同量の１００％エタノールを添加した後、５～６回混ぜる。内容物をＧｅｎｅＡｌｌ kit（＃３０４－１５０（GeneAll Biotech））のMiniSpin Columnに移し、１０，０００Ｇで室温で３０秒間遠心分離する。抜け出てきた内容物を捨て、ＧＷ１バッファを５００μｌ入れた後、同条件で遠心分離する。７００μｌのＲＮＷバッファを入れて遠心分離し、新たなチューブに移し入れ、５０μｌの水を利用し、ＲＮＡを抽出する。１０，、０００Ｇで１分間遠心分離し、ＲＮＡを抽出し、それを分光器（NanoDrop）を利用して濃度を確認した後、総５００ｎｇの量を基準に、ＬａｂｏＰａｓｓ ｃＤＮＡ synthesis kit（＃ＣＭＲＴＫ００２（Cosmogenetic））を利用し、ｏｌｉｇｏ ｄＴ／random primer、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ、Nuclease free waterを入れた後、４２℃で１時間反応させ、ｃＤＮＡを合成する。
（１）ＲＮＡ製造及びｃＤＮＡ合成
収穫された細胞をTRIzol１ｍｌに入れ、十分に放ち入れた後、クロロホルム２００μｌを入れて十分に混ぜる。室温に２～３分放置した後、１２，０００Ｇで１５分間室温で遠心分離し、上端の無色部分を新たなチューブに移し入れる。同量の１００％エタノールを添加した後、５～６回混ぜる。内容物をＧｅｎｅＡｌｌ kit（＃３０４－１５０（GeneAll Biotech））のMiniSpin Columnに移し、１０，０００Ｇで室温で３０秒間遠心分離する。抜け出てきた内容物を捨て、ＧＷ１バッファを５００μｌ入れた後、同条件で遠心分離する。７００μｌのＲＮＷバッファを入れて遠心分離し、新たなチューブに移し入れ、５０μｌの水を利用し、ＲＮＡを抽出する。１０，、０００Ｇで１分間遠心分離し、ＲＮＡを抽出し、それを分光器（NanoDrop）を利用して濃度を確認した後、総５００ｎｇの量を基準に、ＬａｂｏＰａｓｓ ｃＤＮＡ synthesis kit（＃ＣＭＲＴＫ００２（Cosmogenetic））を利用し、ｏｌｉｇｏ ｄＴ／random primer、ｄＮＴＰ、ＲＮＡ、Nuclease free waterを入れた後、４２℃で１時間反応させ、ｃＤＮＡを合成する。
（２）リアルタイム（realーtime） ＰＣＲ
９６ウェル反応（reaction）プレート（＃Ｎ８０１０５６０（Applied Biosystems））の各ウェルに、ＳＹＢＲ green mix（＃ＲＴ５００Ｓ（Enzynomics））、ｃＤＮＡ、プライマー（フォワード／リバース）、ＲＮａｓｅ free waterを入れ、ＲＴ－ＰＣＲ機械（ｖｉｉＡ７（Applied Biosystems））を介し、ＰＣＲサイクル（cycle）を進める。その後、comparative delta－delta－Ｃｔ法あるいは検量線（standard curve）法でもって、各遺伝子の発現量を確認して比較する。
９６ウェル反応（reaction）プレート（＃Ｎ８０１０５６０（Applied Biosystems））の各ウェルに、ＳＹＢＲ green mix（＃ＲＴ５００Ｓ（Enzynomics））、ｃＤＮＡ、プライマー（フォワード／リバース）、ＲＮａｓｅ free waterを入れ、ＲＴ－ＰＣＲ機械（ｖｉｉＡ７（Applied Biosystems））を介し、ＰＣＲサイクル（cycle）を進める。その後、comparative delta－delta－Ｃｔ法あるいは検量線（standard curve）法でもって、各遺伝子の発現量を確認して比較する。
（３）ＦＡＣＳ分析
細胞を、トリプシンを利用して引き離した後、遠心分離して集める。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、１ｘ１０５細胞／２００μｌの濃度でＦＡＣＳバッファに放つ。抗体を１００ｘ濃度で入れ、光がない４℃条件に３０分間置く。細胞をＦＡＣＳバッファによって洗浄した後、ＦＡＣＳバッファ４００μｌに放ち、ＦＡＣＳ機器を利用して分析する。
細胞を、トリプシンを利用して引き離した後、遠心分離して集める。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、１ｘ１０５細胞／２００μｌの濃度でＦＡＣＳバッファに放つ。抗体を１００ｘ濃度で入れ、光がない４℃条件に３０分間置く。細胞をＦＡＣＳバッファによって洗浄した後、ＦＡＣＳバッファ４００μｌに放ち、ＦＡＣＳ機器を利用して分析する。
（４）分泌体（Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）分析
１００％合流皿（confluence dish）を準備し、ＤＰＢＳで２回洗浄する。１％ペニシリン／ストレプトマイシンだけ添加したＤＭＥＭ培地を８ｍｌずつ入れ、２４時間間培養する。培養皿の培養液をいずれも１５ｍｌチューブに移し、２，０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離した後、上澄み液をantibody array（Raybiotech Human Ｌ１０００ Antibody Array）を利用し、ターゲット物質の濃度を確認して比較する。
１００％合流皿（confluence dish）を準備し、ＤＰＢＳで２回洗浄する。１％ペニシリン／ストレプトマイシンだけ添加したＤＭＥＭ培地を８ｍｌずつ入れ、２４時間間培養する。培養皿の培養液をいずれも１５ｍｌチューブに移し、２，０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離した後、上澄み液をantibody array（Raybiotech Human Ｌ１０００ Antibody Array）を利用し、ターゲット物質の濃度を確認して比較する。
（５）卵巣切除モデル（ＯＶＸ model：ovariectomized model）
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスめすを、呼吸麻酔を介して麻酔させた後、背部分を切開した後、脂肪が溜まっている卵巣を摘出し、切開部位を縫合する。その後、毎週、重量及び状態を確認し、手術２週後、さまざまな条件の幹細胞を、尾静脈を介し、１００μｌ容量で注入する。静脈投与６週後、動物を犠牲にした後、組織と血液サンプルとを確保して分析する。
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスめすを、呼吸麻酔を介して麻酔させた後、背部分を切開した後、脂肪が溜まっている卵巣を摘出し、切開部位を縫合する。その後、毎週、重量及び状態を確認し、手術２週後、さまざまな条件の幹細胞を、尾静脈を介し、１００μｌ容量で注入する。静脈投与６週後、動物を犠牲にした後、組織と血液サンプルとを確保して分析する。
（６）核型分析
Fetal ＭＳＣを、ｂＦＧＦの添加または無添加の培養培地で、それぞれ８継代（図８のＡ）または２４継代（図８のＢ）まで培養した後、トリプシンを利用して分離する。Giemsa染色を介し、少なくとも１０個の中期（metaphase）細胞のＧバンドを顕微鏡で観察する。
Fetal ＭＳＣを、ｂＦＧＦの添加または無添加の培養培地で、それぞれ８継代（図８のＡ）または２４継代（図８のＢ）まで培養した後、トリプシンを利用して分離する。Giemsa染色を介し、少なくとも１０個の中期（metaphase）細胞のＧバンドを顕微鏡で観察する。
Claims (15)
- Ｏｓｘ（ＳＰ７）、ｃ－kit、ＣＤ２４、ＣＤ７０及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が発現される、骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 前記幹細胞は、ＣＤ９０を異形成(heterogeneous)に発現する、請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 前記幹細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現しないものである、請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 前記幹細胞は、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べ、ＫＩＴＬＧ、ＣＸＣＬ１２、ＨＥＳ４、ＴＷＩＳＴ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＮＯＧ及びＡＬＰＬからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が過発現される、請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 前記幹細胞は、臍帯ワルトンジェリー由来の間葉系幹細胞、または成人骨髄由来の間葉系幹細胞に比べ、ＡＢＬ１、ＩＧＦＢＰ－７、ＭＭＰ－１、ＧＬＯ－１、プログラニュリン、アミリン、ＢＭＸ、ＡＬＰＰ、ＦＡＰ、ＡＤＡＭＴＳ－Ｌ２、ＳＰＡＲＣ、ＴＬＲ１、ガレクチン－３、beta ＩＧ－Ｈ３、ＨＢ－ＥＧＦ、１１ｂ－ＨＳＤ１、ＰＴＨＬＰ、ＡＣＴＨ、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１及びＧＤＦ３からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドが過分泌される、請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 前記幹細胞は、子宮外妊娠、または死産された胎児の組織に由来する、請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 前記胎児の組織は、胎児の頭部組織または頭蓋冠組織である、請求項６に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞。
- 請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む、骨疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 前記骨疾患は、骨粗鬆症、骨折、骨不癒合、骨形成不全、骨減少症、骨融解性転移、老人性脊椎後彎症、パジェット病、骨萎縮、骨軟化症、骨関節炎、歯周疾患、くる病、無形成骨疾患、癌細胞の骨転移によって引き起こされる骨損傷、繊維異形成症、マッキューン・オルブライト症侯群、骨奇形、及び骨異形成症からなる群より選択される少なくとも１つの骨疾患である、請求項８に記載の骨疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 前記骨疾患は、骨粗鬆症、骨折、繊維異形成症、マッキューン・オルブライト症侯群、骨不癒合及び骨形成不全からなる群より選択される少なくとも１つの骨疾患である、請求項８に記載の骨疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む、エストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 前記エストロゲン欠乏症侯群は、エストロゲン欠乏による、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、鬱病、眩暈症、集中障害、短期記憶障害、不安、記憶力減退、心悸亢進、筋肉痛、関節痛、皮膚の乾燥及び萎縮、膣乾燥症、膣萎縮、下部尿道萎縮、膣炎、子宮萎縮、膀胱炎、排尿痛、急尿、肥満、第２型糖尿病、高脂血症、動脈硬化、脂肪肝、急な心臓拍動変化、睡眠障害、自信感と性的欲求との喪失、骨粗鬆症、アテローム性心臓疾患、静脈血栓症、不規則な生理周期、不規則な生理量、不規則な生理期間、多汗症、耳鳴、高血圧、消火器障害、頭痛、認知機能障害、疲労感、感情起伏、アルツハイマー病、性交痛、短期記憶障害、性欲減退、血流障害、並びに皮膚老化からなる群より選択される少なくとも１つの症状を示すものである、請求項１１に記載のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 前記エストロゲン欠乏症侯群は、エストロゲン欠乏による、肥満及び第２型糖尿病からなる群より選択される少なくとも１つの症状を示すものである、請求項１１に記載のエストロゲン欠乏症侯群の予防用または治療用の薬学的組成物。
- 請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む、骨疾患の予防用または改善用の健康機能食品。
- 請求項１に記載の骨分化能機能強化の間葉系幹細胞を含む、エストロゲン欠乏症侯群の予防用または改善用の健康機能食品。
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