KR20220152137A - 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
일 양상에 따라 제공되는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 골 분화능, 지방 세포 분화능, 연골 세포 분화능, 신경 세포 분화능이 우수하며, 특히 골 분화능의 경우, 다른 유래의 중간엽 줄기세포들 보다 현저히 우수하다. 또한, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 면역거부반응이 적으며, 골 질환 및 에스트로겐 결핍 증후군에 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 연속적인 계대배양에도 증식능이 유지되며, 핵형 안정성이 유지되는 바, 상용화에 안전하고, 대량 생산이 가능한 장점이 있다.
Description
골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
태아 유래 중간엽 줄기세포는 그 자체의 세포 특성을 바탕으로 상용화 개발 장점이 많지만, 급변하는 태아 발생 단계 및 해부 조직학적인 위치에 따라 분리되는 수 많은 세포의 다양성과 태아로부터 줄기세포를 얻는 것은 윤리적인 문제가 다소 있으며, 자궁 외 임신 또는 사산 태아를 이용한 연구 역시 자궁 외 임신 또는 사산 태아 확보 및 조직공여를 받기 어려워, 태아 자체의 연구개발은 미비한 상태이다.
태아 유래 중간엽 줄기세포는 성체 줄기세포에 비해 ① 전분화능 줄기세포 마커인 SSEA4 를 발현 하며 ② 분화능이 우수 하고 ③ 20kb 이상 telomere 를 유지하기 때문에 핵형 안전성 및 증식율을 유지 할 수 있다.
또한, 태아 유래 줄기세포는 TGF-β 등의 면역조절 사이토카인을 분비하고 HLA type I 및 co-stimulatory molecule의 발현이 낮아서 ④ 다른 소스의 중간엽 줄기세포에 비해 면역원성이 낮은 것으로 알려져 있다.
이에, 자궁 외 임신 또는 사산 태아 조직을 기증받아 태아 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 골 분화 기능 강화 줄기세포 및 상기 줄기세포를 이용한 골 질환 및/또는 폐경기 이 후에 주로 나타나는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기에 이르렀다.
일 양상은 Osx (SP7), c-kit, CD24, CD70 및 SFRP2으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 연속적으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 대량 제조 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 Osx (SP7), c-kit, CD24, CD70 및 SFRP2으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell: MSC)"는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다.
또한, 용어 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포"는 골 세포로 분화할 수 있는 기능이 강화된 중간엽 줄기세포를 의미하며, 골 세포 전구 세포 (Bone Progenitor Cell) 또는 중간엽 전구세포 (Mesenchymal Progenitor Cell)와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 자궁 외 임신 또는 사산된 태아의 조직으로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는, 상기 태아의 조직은 태아의 두부(skull) 또는 두부의 상단부인 칼바리아(Calvaria) 조직일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 태아의 조직은 태아의 신경관(neural tube)을 제외한 두부 조직 또는 칼바리아 조직일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 칼바리아 조직일 수 있다.
상기 자궁 외 임신된 태아는 자궁 외 임신으로 인하여 사망하였거나, 자궁 외 임신으로 진단되어 수술적으로 분리됨에 따라 사망하였을 수 있다.
상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 Osx (SP7), c-kit, CD24, CD70 및 SFRP2으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자를 발현할 수 있고, 구체적으로는 Osx (SP7), c-kit, CD24, CD70 및 SFRP2을 전부 발현할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 골 형성 중간엽 줄기세포에서만 특이적으로 발현되는 마커로서 Osx (SP7), 태아 중간엽 줄기세포 마커로서 c-kit, 세포 표면 마커로서 CD24 및 CD70, 골 분화 마커로서 SFRP2를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 발현하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 줄기세포(예를 들어, 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포(CordSTEM) 및 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC))와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD90에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD90+"이다.
본 명세서에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD34에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD34-"이다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 KITLG, CXCL12, HES4, TWIST1, BMP2, BMPR1B, NOG 및 ALPL로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자가 과발현되는 것일 수 있고, 구체적으로, 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 KITLG, CXCL12, HES4, TWIST1, BMP2, BMPR1B, NOG 및 ALPL 전부 과발현되는 것일 수 있다.
보다 구체적으로는 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 태아 중간엽 줄기세포 마커로서 KITLG 및 CXCL12, 골 분화 마커로서 HES4, TWIST1, BMP2, BMPR1B, NOG 및 ALPL을 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 과발현하는 것일 수 있다.
상기 중간엽 줄기세포는 대안적으로 그의 배양물, 용해물 또는 그의 추출물이 이용될 수 있다. 상기 배양물, 용해물 또는 추출물은 세포 그대로를 이용하기 어려운 경우 유용한 대안이 될 수 있으며, 단백질 등을 포함한 세포의 구성 성분을 포함하고 있으므로 본래 세포와 유사하거나 동등한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 상기 용해물 또는 추출물은 상업적으로 이용가능한 세포 용해 키트, 또는 추출 키트 등을 이용하여 얻을 수 있다.
상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 타 중간엽 줄기세포(예를 들어, 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포(CordSTEM), 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC))에 비해 연속된 계대배양에도 증식능이 유지되고, 핵형 안정성이 유지될 수 있어, 상용화에 안전하며 대량 생산에 용이하다. 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포는 최소 20계대까지 배양되어도 증식능이 유지될 수 있고, 최소 24계대까지 배양되어도 핵형 안정성이 유지될 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 연골 세포 분화능, 지방 세포 분화능 및 신경 세포 분화능도 우수하며, 특히 골 분화능의 경우, 타 중간엽 줄기세포에 비해 현저히 우수하며, 구체적으로, 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포(CordSTEM), 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 배아 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)에 비해 현저하게 골 분화능이 우수하다.
일 양상에 있어서, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 HLA class I을 발현하지 않는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포가 bFGF 첨가 배지에서 배양되는 경우, HLA class I이 발현되는 세포가 5% 이하로 감소할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포는 면역거부반응에 따라 사멸되는 세포가 적어, 동종세포치료 시 세포 생존률이 높다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 ABL1, IGFBP-7, MMP-1, GLO-1, Progranulin, Amylin, BMX, ALPP, FAP, ADAMTS-L2, SPARC, TLR1, Galectin-3, Beta IG-H3, HB-EGF, 11b-HSD1, PTHLP, ACTH, Activin A, GDF11 및 GDF3로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드가 과분비되는 것일 수 있고, 구체적으로, ABL1, IGFBP-7, MMP-1, GLO-1, Progranulin, Amylin, BMX, ALPP, FAP, ADAMTS-L2, SPARC, TLR1, Galectin-3, Beta IG-H3, HB-EGF, 11b-HSD1, PTHLP, ACTH, Activin A, GDF11 및 GDF3이 전부 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 과분비되는 것일 수 있다.
또한, 상기 과분비는 구체적으로, 세포 외 배양액으로 과분비(over-secretion)되는 것일 수 있다.
상기 용어 "폴리펩티드(Polypeptide)”는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 줄기세포는 CD90을 이형성(heterogeneous)으로 발현할 수 있다.
구체적으로, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 태아의 골조직 유래일 수 있고, 상기 태아의 조직은 두부(Skull) 또는 칼바리아(Calvaria)일 수 있다. 또한, CD90의 발현이 높은 세포군과 CD90의 발현이 낮은 세포군을 포함할 수 있고, 이는 배지 내 bFGF 첨가 여부에 따라 보다 분명하게 나타날 수 있다.
다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포"는 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 골 질환은 예를 들어, 골다공증, 골절, 골불유합, 골형성부전, 골 감소증, 골 융해성 전이, 노인성척추후만증, 파제트병, 골위축, 골연화증, 골관절염, 치주질환, 구루병, 무형성 골질환, 암세포의 골전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 섬유이형성증, 맥쿤-알브라이트 증후군, 골기형 및 골이형성증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 골 질환일 수 있고, 바람직하게는 골다공증, 골절, 섬유이형성증, 골불유합 및 골형성부전으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 골 질환일 수 있고, 보다 바람직하게는 골다공증일 수 있다.
용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 골 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 골 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 타 중간엽 줄기세포 대비 증식능이 우수하고, 증식함에 따라 핵형 안정성도 우수하며, 골 분화능이 매우 우수하여, 골 형성능이 현저하다. 상기 현저한 골 형성능을 바탕으로 골밀도, 골 세포수, 골 부피를 모두 증가시켜, 현저한 골 질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 외에 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함할 수 있다.
즉, 상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 또는 새롭게 개발되는 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 혼합되어 제공될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 더 포함하는 경우, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포만을 유효성분으로 포함하는 경우 보다 골 질환의 예방 또는 치료 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 병용 투여되는 것일 수 있다.
상기 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 또는 새롭게 개발되는 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 병용투여되는 경우, 상기 약학적 조성물이 단독 투여되는 경우보다 골 질환의 예방 또는 치료 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 골 질환을 보유할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
일 양상에 있어서, 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골막 또는 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 비만의 중증도, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 0.001 mg/kg/day 내지 1000 mg/kg/day로 투여될 수 있으며, 약학적 조성물에 포함된 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 및 투여 대상 개체를 기준으로 할 때, 102 cells/kg 내지 109 cells/kg, 103 cells/kg 내지 109 cells/kg, 103 cells/kg 내지 108 cells/kg, 104 cells/kg 내지 108 cells/kg 또는 104 cells/kg 내지 107 cells/kg 수준으로 투여되는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포"는 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 에스트로겐 결핍 증후군은 예를 들어, 에스트로겐 결핍으로 인한 안면홍조, 발한, 불면증, 신경과민, 우울증, 현기증, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 기억력 감퇴, 심계항진, 근육통, 관절통, 피부 건조와 위축, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 자궁위축, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 비만, 제2형 당뇨병, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 급작스런 심장박동 변화, 수면장애, 자신감과 성적 욕구의 상실, 골다공증, 아테롬성 심장 질환, 정맥 혈전증, 불규칙한 생리주기, 불규칙한 생리량, 불규칙한 생리기간, 다한증, 이명, 고혈압, 소화기장애, 두통, 인지기능장애, 피로감, 감정기복, 알츠하이머병, 성교통, 단기 기억장애, 성욕 감퇴, 혈류장애 및 피부 노화로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 증상을 나타내는 것일 수 있고, 바람직하게는 에스트로겐 결핍으로 인한 비만 및 제2형 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 증상을 나타내는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 에스트로겐 결핍으로 인한 골다공증 및 비만 증상을 나타내는 것일 수 있다.
용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 에스트로겐 결핍 증후군을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 에스트로겐 결핍 증후군에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 타 중간엽 줄기세포 대비 증식능이 우수하고, 증식함에 따라 핵형 안정성도 우수하며, 골 분화능이 매우 우수하고, 지방 세포의 증가를 억제한다. 이를 통해 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 외에 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함할 수 있다.
즉, 상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물 또는 새롭게 개발되는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물과 혼합되어 제공될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 더 포함하는 경우, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포만을 유효성분으로 포함하는 경우 보다 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물과 병용 투여되는 것일 수 있다.
상기 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물은 종래에 알려져 있는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물 또는 새롭게 개발되는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물과 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 조성물과 병용투여되는 경우, 상기 약학적 조성물이 단독 투여되는 경우보다 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 에스트로겐 결핍 증후군을 보유할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 약학적 조성물들은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물들이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 약학적 조성물들의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.
상기 약학적 조성물들은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 비만의 중증도, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들어, 상기 약학적 조성물들은 0.001 mg/kg/day 내지 1000 mg/kg/day로 투여될 수 있으며, 약학적 조성물에 포함된 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 및 투여 대상 개체를 기준으로 할 때, 102 cells/kg 내지 109 cells/kg, 103 cells/kg 내지 109 cells/kg, 103 cells/kg 내지 108 cells/kg, 104 cells/kg 내지 108 cells/kg 또는 104 cells/kg 내지 107 cells/kg 수준으로 투여되는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포", "골 질환", "예방" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 골 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 건강기능식품은 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려져 있는 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 혼합되어 제공될 수 있다.
상기 건강기능식품이 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품이 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포만을 유효성분으로 포함하는 경우보다 골 질환의 예방 또는 개선 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려진 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병행하여 섭취될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 섭취될 수 있으며, 단일 또는 다중 섭취될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 섭취하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품이 다른 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 경우, 상기 건강기능식품을 단독 섭취하는 경우보다 골 질환의 예방 또는 개선 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포", "에스트로겐 결핍 증후군", "예방" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 건강기능식품은 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려져 있는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 혼합되어 제공될 수 있다.
상기 건강기능식품이 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품이 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포만을 유효성분으로 포함하는 경우보다 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려진 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병행하여 섭취될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 섭취될 수 있으며, 단일 또는 다중 섭취될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 섭취하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품이 다른 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 경우, 상기 건강기능식품을 단독 섭취하는 경우보다 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.
상기 건강기능식품들에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 건강기능식품들은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 중간엽 줄기세포를 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 건강기능식품들은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품들은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 연속적으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 대량 제조 방법을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 "계대 배양"은 원래 배양물에서 일부 세포를 새로운 배양 배지로 옮겨서 만들어진 새로운 세포 또는 미생물을 배양하는 것을 의미하며, 계대 배양을 통해 세포 또는 미생물 세포의 수를 증가시키거나, 세포주들의 수명을 연장시킬 수 있다.
상기 "연속적으로 계대 배양"은 원래의 세포 또는 미생물의 형질이 변하지 않는 상태로 계대 배양되는 것을 의미한다.
상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 일반적인 중간엽 줄기세포와 달리, 연속적으로 계대 배양됨에도 원래의 형질, 즉, 골 분화능, 지방 세포 분화능, 연골 세포 분화능, 신경 세포 분화능, 적은 면역거부반응, 골 질환 및/또는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 효과는 저하되지 않고, 핵형 안정성을 유지할 수 있다.
일 양상에 따른 대량 제조 방법에 따르면, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 대량으로 증식시킬 수 있어, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 상용화함에 이바지 가능하다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포", "개체", "투여", "골 질환", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 "골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포", "개체", "투여", "에스트로겐 결핍 증후군", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 따른 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 골 분화능, 지방 세포 분화능, 연골 세포 분화능, 신경 세포 분화능이 우수하며, 특히 골 분화능의 경우, 다른 유래의 중간엽 줄기세포들 보다 현저히 우수하다. 또한, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 면역거부반응이 적으며, 골 질환 및 에스트로겐 결핍 증후군에 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 상기 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 연속적인 계대배양에도 증식능이 유지되며, 핵형 안정성이 유지되는 바, 상용화에 안전하고, 대량 생산이 가능한 장점이 있다.
도 1 및 2는 태아 중간엽 줄기세포(Fetal mesenchymal stem cell: Fetal MSC) 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 증식을 나타낸 도로서, 구체적으로 도 1은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 형태를 나타낸 도이고, 도 2는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 성장 곡선 및 예상 세포 수를 나타낸 도이다.
도 3은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화 능력을 나타낸 도로서, 구체적으로 A는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 골 분화를 나타내고, B는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 지방 세포 분화를 나타내며, C는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 연골 세포 분화를 나타내며, D는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 신경 세포 분화를 나타낸다.
도 4는 태아의 두부(Skull) 또는 칼바리아(Calvaria) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 팔다리(Limb) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화능을 비교한 도이다.
도 5 내지 7은 골 분화 능력을 비교한 도로서, 구체적으로 도 5는 MSC의 다양한 기원의 골 분화를 나타내며, 도 6은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 BM-MSC(Bone Marrow-mesenchymal stem cell) 간의 골 분화능을 비교한 것을 나타내며, 도 7은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 골분화 과정에서 골 형성 마커들의 유전자 발현을 나타낸 도이다.
도 8은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 염색체 분석을 나타낸 도이다.
도 9 내지 12는 FACS 분석에 의해 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 표면 마커 발현을 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 9는 중간엽 줄기세포 마커, 도 10은 만능줄기세포 및 태아 유래 줄기세포 마커, 도 11은 조혈모세포 마커, 도 12는 인간 백혈구 항원을 사용하여 FACS 분석이 수행되었다.
도 13 내지 16은 중간엽 줄기세포의 다양한 유래의 RNA 시퀀싱 분석을 나타낸 도로서, 구체적으로 도 13은 클러스터링 히트맵 및 주요 성분 분석을 나타내고, 도 14는 차별적으로 발현된 유전자 분석을 나타내고, 도 15 및 16은 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 17 내지 18은 분비체 분석을 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 17은 클러스터링 히트맵 및 주요 성분 분석을 나타내며, 도 18은 스캐터 플롯을 나타낸다.
도 19 내지 20은 CD90의 이형성능을 FACS 분석을 통해 확인한 도로서, 구체적으로 도 19 FACS 분석을 나타낸 도이며, 도 20a 내지 20c는 태아의 골조직, 피부 조직, 수족 조직에 대한 FACS 분석 결과 및 골 분화 수준을 나타낸 도이다.
도 21 내지 22는 골다공증 동물모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 뼈 보호 및 뼈 재생을 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 21은 실험 계획을 나타내며, 도 22는 마이크로-컴퓨터 단층 촬영, H&E 뼈 조직염색 및 골 밀도를 나타낸다.
도 23 내지 24는 폐경 후 비만증 동물모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 에스트로겐 결핍증의 보호를 나타낸 도로서, 도 23은 실험 계획을 나타내며, 도 24는 지방 조직의 분석을 나타낸 도이다.
도 3은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화 능력을 나타낸 도로서, 구체적으로 A는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 골 분화를 나타내고, B는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 지방 세포 분화를 나타내며, C는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 연골 세포 분화를 나타내며, D는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 신경 세포 분화를 나타낸다.
도 4는 태아의 두부(Skull) 또는 칼바리아(Calvaria) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 팔다리(Limb) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화능을 비교한 도이다.
도 5 내지 7은 골 분화 능력을 비교한 도로서, 구체적으로 도 5는 MSC의 다양한 기원의 골 분화를 나타내며, 도 6은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 BM-MSC(Bone Marrow-mesenchymal stem cell) 간의 골 분화능을 비교한 것을 나타내며, 도 7은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 골분화 과정에서 골 형성 마커들의 유전자 발현을 나타낸 도이다.
도 8은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 염색체 분석을 나타낸 도이다.
도 9 내지 12는 FACS 분석에 의해 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 표면 마커 발현을 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 9는 중간엽 줄기세포 마커, 도 10은 만능줄기세포 및 태아 유래 줄기세포 마커, 도 11은 조혈모세포 마커, 도 12는 인간 백혈구 항원을 사용하여 FACS 분석이 수행되었다.
도 13 내지 16은 중간엽 줄기세포의 다양한 유래의 RNA 시퀀싱 분석을 나타낸 도로서, 구체적으로 도 13은 클러스터링 히트맵 및 주요 성분 분석을 나타내고, 도 14는 차별적으로 발현된 유전자 분석을 나타내고, 도 15 및 16은 mRNA 발현을 나타낸 도이다.
도 17 내지 18은 분비체 분석을 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 17은 클러스터링 히트맵 및 주요 성분 분석을 나타내며, 도 18은 스캐터 플롯을 나타낸다.
도 19 내지 20은 CD90의 이형성능을 FACS 분석을 통해 확인한 도로서, 구체적으로 도 19 FACS 분석을 나타낸 도이며, 도 20a 내지 20c는 태아의 골조직, 피부 조직, 수족 조직에 대한 FACS 분석 결과 및 골 분화 수준을 나타낸 도이다.
도 21 내지 22는 골다공증 동물모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 뼈 보호 및 뼈 재생을 나타낸 도로서, 구체적으로, 도 21은 실험 계획을 나타내며, 도 22는 마이크로-컴퓨터 단층 촬영, H&E 뼈 조직염색 및 골 밀도를 나타낸다.
도 23 내지 24는 폐경 후 비만증 동물모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 에스트로겐 결핍증의 보호를 나타낸 도로서, 도 23은 실험 계획을 나타내며, 도 24는 지방 조직의 분석을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. bFGF(basic fibroblast growth factor) 첨가제의 존재 및 부재 하 태아 중간엽 줄기세포(Fetal MSC) 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 증식
bFGF(basic fibroblast growth factor) 첨가제의 존재 및 부재 하에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 증식을 확인하고자 하였고, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF 첨가제 존재(도 1의 하단) 및 부재(도 1의 상단) 하에서 배양 배지에 확장되었다. Fetal MSC는 계대 배양되었고, 지시된 바와 같이 매 3 내지 4일에 세포 수를 계수하였다. 그 결과, 도 1과 같이 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 형태를 확인할 수 있었다.
또한, 2개의 다른 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포주(fMSC_001, fMSC_002)를 확인하여 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 성장 곡선(도 2의 상단) 및 예상 세포 수(도 2의 하단)는 도 2에 나타내었다.
도 1 및 2를 살피면, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF의 첨가 유무에 무관하게 중간엽줄기세포의 형태학적 특성인 방추형의 morphology를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
다만 Adult 유래 MSC (BM-MSC, AD-MSC), Neonatal 유래의 MSC (Umbilical Cord MSC, Placental MSC, UC blood MSC)에 비해 증식능 우수하여 20계대까지 증식능이 유지됨을 확인할 수 있었다.
이는 대량 공정의 측면에서 18계대 후에 106 cell 기준 60억 바이알 이상 생산 가능함을 나타낸다.
실시예 2. Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화능
bFGF 첨가제 존재 및 부재 하의 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화능을 확인하고자 골 분화능(도 3A), 지방 세포 분화능(도 3B), 연골 세포 분화능(도 3C) 및 신경 세포 분화능(도 3D)을 확인하였다.
구체적으로, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 bFGF 존재(하단) 및 부재(상단) 하에서 배양 배지에 확장시켰다.
골 분화능을 확인하고자, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 골 분화 배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit)에서 14일 간 배양하였다. 분화 후, 세포 외 칼슘 침착물을 Alizarin Red로 염색하였다(도 3A).
또한, 지방 세포 분화능을 확인하고자, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 지방 세포 분화 배지(StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit)에서 10일 간 배양하였다. 분화 후, 지방 방울을 Oil Red로 염색하였다(도 3B).
또한, 연골 세포 분화능을 확인하고자, 세포 펠릿(2.5 ×105 cells/pellet)을 연골 세포 분화 배지(DMEM/high-glucose supplemented with 1% FBS, 1X ITS+Premix, 10 ng/mL TGF-β1, 10 μM dexamethasone, 1 μM ascorbate-2-phosphate, 1% sodium pyruvate, 1X NEAA 및 1% penicillin/streptomycin)에서 21일 간 배양하였다. 분화 후, 파라핀 절편을 H&E로 염색하였다(도 3C).
또한, 신경 세포 분화능을 확인하고자, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 B-27 무혈청 보충제 및 GlutaMAX-I이 첨가된 신경 세포 분화 배지에서 14일 간 배양하였다. 분화 후, 분화된 뉴런을 Nestin 또는 GFAP 특이 항체를 이용하여 면역세포화학으로 염색하였다.
그 결과, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF의 첨가 유무에 무관하게 중간엽줄기세포의 분화 특성인 골 분화능, 지방 세포 분화능, 연골 세포 분화능 및 다소의 신경 세포 분화능을 유지함을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 자궁 외 임신 또는 사산된 인간 태아의 두부(Skull) 또는 칼바리아(Calvaria) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 팔다리(Limb) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화능 비교
자궁 외 임신 또는 사산된 인간 태아의 두부(Skull) 또는 칼바리아(Calvaria) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 자궁 외 임신 또는 사산된 인간 태아의 팔다리(Limb) 조직 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 분화능을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 골 분화능을 확인하고자, Fetal MSC(팔다리(Limb) 조직) 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 골 분화 배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit)에서 14일 간 배양하였다. 분화 후, 세포 외 칼슘 침착물을 Alizarin Red로 염색하였다.
또한, 지방 세포 분화능을 확인하고자, Fetal MSC(팔다리(Limb) 조직) 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 지방 세포 분화 배지(StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit)에서 10일 간 배양하였다. 분화 후, 지방 방울을 Oil Red로 염색하였다.
또한, 연골 세포 분화능을 확인하고자, 세포 펠릿(2.5 ×105 cells/pellet)을 연골 세포 분화 배지(DMEM/high-glucose supplemented with 1% FBS, 1X ITS+Premix, 10 ng/mL TGF-β1, 10 μM dexamethasone, 1 μM ascorbate-2-phosphate, 1% sodium pyruvate, 1X NEAA 및 1% penicillin/streptomycin)에서 21일 간 배양하였다. 분화 후, 파라핀 절편을 H&E로 염색하였다.
그 결과, 태아의 팔다리(Limb)에서 분리한 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 지방 세포 분화능은 태아 두부(skull) 또는 칼바리아(Calvaria)조직에서 분리한 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 유사하고, 연골 세포 분화능은 약간 증가하지만, 골 분화능은 다소 떨어짐을 확인할 수 있었다(도 4).
본 실시예 3를 제외한 나머지 실시예에서는 태아 두부 또는 칼바리아(Calvaria)조직에서 분리한 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이용하였다.
실시예 4. 골 분화능의 비교
다양한 유래의 MSC의 골 분화능을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포(CordSTEM), 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(ES-MSC)를 포함하는 중간엽 줄기세포들을 배양 배지에 확장시켰다. 중간엽 줄기세포들은 골 분화 배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit)에서 14일 간 배양되었다. 분화 후, 세포 외 칼슘 침착물들 및 염기성 포스파타제 효소 활성을 각각 Alizarin Red 및 AP 염색으로 염색하였다(도 5).
또한, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포와 BM-MSC 간의 골 분화능을 비교하기 위해, 중간엽 줄기세포들을 표시된 기간(7, 14 및 21일)동안 골 분화 배지(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit)에서 배양하였다. 분화 후, 세포 외 칼슘 침착물은 Alizarin Red로 염색하였다(도 6).
또한, 골 형성 마커 유전자들의 발현을 확인하기 위해, 표시된 바와 같이 골 분화 동안 총 RNA는 준비되었고, 골 형성 마커 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 7)(ALP; Alkaline phosphatase, S100A4; S100 Calcium Binding Protein A4, COL1A1; Collagen Type I Alpha 1 Chain, COL1A2; Collagen Type I Alpha 2 Chain).
그 결과, 골 분화능 비교 분석을 통하여 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 Adult 유래 MSC (BM-MSC), Neo-natal 유래의 MSC (Umbilical Cord MSC), 배아줄기세포 유래 MSC에 비해 특히 bFGF 무첨가 배지에서 배양한 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 골 분화능이 월등함을 확인할 수 있었다(도 5).
현재까지 골 분화능이 가장 우수하다고 알려진 BM-MSC와 비교했을 때 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 골 분화 유도 7일 후부터 골 분화가 시작되면 14일 후에 이미 saturation이 된 반면, BM-MSC는 21일 후에도 saturation이 이루어지지 않았다. 또한, 이는 여러 골 분화 마커 유전자 발현으로도 확인할 수 있었다.
실시예 5. 염색체 분석(Karyotyping)
Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 염색체 분석을 수행하고자, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 bFGF 첨가제의 존재 또는 부재 하에 배양 배지에 확장시켰다. Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 표시된 바와 같이 bFGF가 첨가되지 않은 경우 8계대까지 배양되었고(도 8A), bFGF가 첨가된 경우 24계대까지 배양되었다(도 8B). 적어도 10개의 세포들이 분석되었고, 대표적인 G(Giemsa) 밴드 중기 현미경 이미지로 나타냈다.
Karyotyping을 통해 핵형 안정성을 확인한 결과, 8계대 및 24계대에서도 핵형 안정성이 유지됨을 확인하였는 바, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 상용화에 안전한 세포임을 알 수 있었다.
실시예 6. 표면 마커 발현
FACS 분석을 통해 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 표면 마커 발현을 확인하고자 하였다. Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 bFGF 첨가제의 존재 또는 부재 하 배양 배지에 확장시켰다. 표시된 계대에서, 세포들은 배양되었고, 중간엽 줄기세포 마커(도 9), 만능 줄기세포 마커(도 10), 조혈모세포 마커(도 11), 인간 백혈구 항원(도 12)을 사용하여 FACS 분석을 수행하였다.
Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 중간엽줄기세포 특성을 확인하기 위해 중간엽 줄기세포 표면 마커 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF의 첨가 유무에 무관하게 중간엽 줄기세포의 대표적인 표면 마커인 CD73, CD44, CD29, CD105, CD166 등을 초기배양 계대 (P9), 중기배양 계대 (P13), 후기배양 계대 (P17)에서 uniform하게 발현함을 확인하였다(도 9).
또한, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 중간엽줄기세포 특성을 확인하기 위해 전분화능세포 표면 마커 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF의 첨가 유무에 무관하게 전분화능세포의 대표적인 표면 마커인 SSEA-3, TRA 1-81 등을 초기배양 계대 (P9), 중기배양 계대 (P13), 후기배양 계대 (P17)에서 전혀 발현하지 않으나, 특별히 bFGF 무첨가 배양 조건의 초기 세포에서 태아 유래 세포 표면 마커인 c-kit을 발현하는 세포가 존재하는 것을 확인하였다. 따라서 c-kit 발현이 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 특성 중에 하나임을 확인할 수 있었다(도 10).
또한, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 중간엽줄기세포 특성을 확인하기 위해 조혈모세포(Hematopoietic stem cell)의 표면 마커(surface marker) 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF의 첨가 유무에 무관하게 조혈모세포의 대표적인 표면 마커인 CD14, CD24, CD34, CD45, CD70 등을 초기배양 계대 (P9), 중기배양 계대 (P13), 후기배양 계대 (P17)에서 전혀 발현하지 않음을 확인하였다(도 11).
또한, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 중간엽줄기세포 특성 중 HLA 발현에 따른 면역원성을 확인한 결과, 다른 MSC와 마찬가지로 HLA class II (HLA-DR) 발현은 전혀 없었음을 확인하였고, 특이하게도 HLA class I의 발현이 bFGF 첨가 배양한 세포에서 거의 발현되지 않음을 확인하였다. 따라서 bFGF 첨가 배지에서 HLA class I의 발현 감소는 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 특성 중에 하나임을 알 수 있었으며, 이는 동종세포치료제 개발에서 면역거부반응에 따른 세포 생존율을 높이는데 매우 유용함을 알 수 있었다(도 12).
실시예 7. 유전자 발현 분석
다양한 유래의 중간엽 줄기세포의 RNA 시퀀싱 분석을 수행하여, 클러스터링 히트맵(Clustering Heat Map) 및 주요 성분 분석(Principal Component Analysis: PCA)을 얻었다(도 13).
클러스터링 히트맵과 PCA는 배양 배지 내 bFGF 존재 또는 부재 하에서 BM-MSC, 탯줄 MSC(CordSTEM) 및 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 간의 차별적으로 발현된 유전자들의 상대적 발현(z-score)을 나타낸다.
또한, 차별적으로 발현된 유전자 분석을 수행하여, 다양한 유래의 MSC들 간의 차별적으로 발현된 유전자들 사이 중첩된 벤 다이어그램을 얻었다(도 14). 도 14 내 Table 1은 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 내 배타적으로(붉은색) 또는 고도로(검은색) 발현된 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 특이 마커 유전자를 요약한 것을 나타낸다.
또한, 총 RNA는 다양한 유래의 MSC로부터 준비하였고, 도 14의 table 1의 (1) 골 형성 MSC 마커 유전자, (2) Fetal MSC 마커 유전자, (3) 세포 표면 마커 및 (4) 골형성 MSC 마커에 대한 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하여, mRNA 발현을 확인하였다(도 15 및 16).
RNA 시퀀싱 분석 방법으로 Adult 유래 MSC (BM-MSC), Neo-natal 유래의 MSC (Umbilical Cord MSC)와 유전자 발현을 분석한 결과, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 특이 발현 유전자(마커)를 확인하였다. 다른 origin의 MSC에서는 발현이 안되면서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포에서만 발현이 되는 Fetal MSC 특이 유전자는 Osx (SP7), c-kit, CD24, CD70, SFRP2 등이었다. 따라서 이들 마커 발현을 통해 Fetal MSC가 다른 MSC와 차별화됨을 알 수 있었다.
이 중 골 분화 기능과 연관하여 Osx (SP7)는 osteogenic MSC 특이 마커로 알려져 있으며, SFRP2는 골 분화에 중요한 역할을 하는 cell signaling 에 관여하는 것으로 알려져 있다.
또한, C-Kit은 Fetus 유래 세포의 특이 마커로서, 이 외에 Fetus 유래 유전자인 KITLG, CXCL12 등이 다른 source MSC 대비 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포에서 과발현됨을 확인할 수 있었다.
또한, CD24, CD70은 세포 표면 마커로서, 이 마커를 통해 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 특이성을 구별할 수 있었다.
기타 골 분화에 관련한 transcription factor, 리간드 및 cell signaling components, 효소 등이 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포에서 과발현되는 것을 확인하였다(예를 들어, HES4, TWIST1, BMP2, BMPR1B, NOG, ALPL 등).
실시예 8. 분비체 분석(Secretome Analysis)
분비체 분석을 수행하고자, 클러스터링 히트맵 및 주요 성분 분석을 먼저 수행하였다(도 17). Ray Biotech human cytokine array (Raybiotech#L-507, #L-493)는 다양한 유래의 MSC로부터 얻은 무혈청 배지 샘플을 이용하여 분석되었다. 클러스터링 히트맵 및 PCA는 배양 배지 내 bFGF의 존재 또는 부재 하 BM-MSC, 탯줄 MSC(CordSTEM) 및 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 간의 차별적으로 분비된 사이토카인 및 성장 인자의 상대적 분비를 나타낸다.
또한, 스캐터 플롯(Scatter Plot)을 확인하였다(도 18). 스캐터 플롯은 차별적으로 분비된 단백질들을 나타내며, 단백질 분비는 Fetal MSC(+)에 비해 증가된 것은 붉은 색으로, 감소된 것은 녹색으로 나타내었다. 도 18의 표는 스캐터 플롯에서 고도로 분비된 유전자들의 목록 및 그들의 골 대사 관련 기능을 나타낸다.
분비체(Secretome) 분석 방법으로 Adult 유래 MSC (BM-MSC), Neonatal 유래의 MSC (Umbilical Cord MSC)와 배양액 내에 단백질 분비를 분석한 결과, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 특이 단백질의 분비를 확인할 수 있었다. 다른 유래의 MSC와 비교해서 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포에서 과분비되는 단백질이 다수 확인되었다(도 18).
특히, MSC 증식, 골 분화 또는 골 대사 기능과 연관하여 도 18의 표에 요약된 것 과 같이 다수의 사이토카인, 성장 인자 등 기능성 단백질이 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포에서 높게 분비됨을 확인하였다. 따라서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 골 분화 기능이 뛰어나다는 것을 알 수 있었다.
실시예 9. CD90 이형성능(Heterogeneity) 및 골 형성 가능성(Osteogenic Potential)
Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 CD90 이형성능을 갖는 바, 이를 확인하고자 FACS 분석을 수행하였다(도 19). 구체적으로, 중간엽 줄기세포들(ES-MSC, CordSTEM) 및 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 bFGF 첨가제 존재 또는 부재 하에 배양 배지 내 확장되었다. 표시된 계대에서(P4, P6, P11 및 P12), 세포들은 배양되었고, CD90, CD105, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 특이 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.
구체적으로 8.5 주령 태아의 두부의 칼바리아(Calvaria) 부위 유래 중간엽줄기세포(도 20a), 7주령 태아의 칼바리아, 수족(Limb), 피부 조직 유래 중간엽줄기세포(도 20b)에 대해서 FACS 분석을 수행하였다. 골 분화능 기능강화 중간엽줄기세포의 CD90 이형성의 경우, 수족, 피부 유래의 중간엽줄기세포의 경우 확인되지 않은 반면에, 골조직 유래의 중간엽줄기세포에서는 CD90 이형성을 확인할 수 있었다.
한편, 골 분화능은 칼바리아 유래 중간엽줄기세포가 가장 현저한 것으로 확인되었다(도 20c).
상기와 같은 결과를 통해, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 계대배양 과정에서 표면 마커 중 CD90 발현이 높은 세포와 CD90 발현이 낮은 세포로 나누어지는 것을 확인하였고, 이러한 CD90 발현 이형성능은 골조직(두부 부위)에서 유래한 중간엽 줄기세포에서 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 상기와 같은 현상은 bFGF 첨가 시 더 뚜렷하게 나타남을 확인하였다.
실시예 10. 골다공증 동물 모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 뼈 보호 및 재생
Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 뼈 보호 및 뼈 재생 효과를 확인하기 위해 실험을 진행하였고, 도 21은 실험 계획을 나타낸다.
구체적으로, 8주령 암컷 C57BL/6 쥐의 난소를 절제시켰다. 2주 후, 1 x 106의 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 또는 동일한 부피의 PBS(100 ㎕)를 꼬리 정맥에 주입하였다. Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 이식 후 6주에 쥐를 희생시켰다. 면역억제군의 경우, 10 mg/kg의 cyclospholine A (CsA)를 매일 피하 투여하였다.
그 결과로서, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-computerized Tomography) 및 골 밀도를 도 22에 나타냈다. 희생시킨 후, 대퇴골과 경골을 절제하였고, 10% PFA 용액으로 고정시켰다. 골 구조 변수들은 micro-CT 시스템 및 H&E 염색을 이용하여 분석되었다. 골 밀도 및 구성 분석에서, 대퇴골과 경골은 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 시스템 (SkyScan1173; Bruker-CT, Belgium)을 이용하여 1-mm 간격으로 스캔되었다. 골 부피(cm3), 해면골 수 및 골 밀도(mg/cm3)는 CT 분석기 소프트웨어(CTAnMicro-CT software)를 이용하여 계산되었다(BV/TV, bone volume per tissue volume; Tb.N, trabecular bone number; BMD, Bone Mineral Density).
즉, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 골 질환 동물모델에서 유효성을 확인하기 위해 난소절제술을 통한 골다공증 모델을 제작하였고, 골다공증 모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 정맥으로 투여한 결과, 골 밀도의 증가, 골 세포 수의 증가, 골 부피의 증가를 확인하였다. 따라서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 골다공증, 골절, 골불유합, 골형성부전, 섬유이형성증 등 골질환 적응증 세포치료제로 활용이 가능한 것을 확인하였다.
또한, 작용 기전 중의 하나로서, 난소 절제에 따른 골다공증 모델에서 골수 내 중간엽줄기세포의 지방 세포 분화가 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 투여에 의해 감소함을 확인하였다.
실시예 11. 에스트로겐 결핍 증후군의 보호
Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 에스트로겐 결핍 증후군의 보호 효과를 확인하고자 실험을 진행하였고, 실험 계획은 도 23에 나타내었다.
구체적으로, 8주령 암컷 C57BL/6 쥐의 난소를 절제시켰다. 2주 후, 1 x 106의 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 또는 동일한 부피의 PBS(100 ㎕)를 꼬리 정맥에 주입하였다. Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포 이식 후 6주에 쥐를 희생시켰다. 면역억제군의 경우, 10 mg/kg의 cyclospholine A (CsA)를 삼투압 펌프(ALZET, USA)를 이용하여 투여하였다.
그 결과로서, 지방 조직 분석 결과를 도 24에 나타내었다. 희생시킨 후, 지방 패드(생식선 지방(Gonadal Fat), 복막 뒤 지방(Retroperitoneal Fat))의 형태와 무게를 분석하였다(One-way ANOVA test; P value ****; <0.0001, **; 0.0018, *; 0.0139). 혈당과 총 글리세라이드 수준은 혈청을 이용하여 분석하였다(One-way ANOVA test; P value **; 0.0025).
즉, Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 에스트로겐 결핍 증후군(estrogen deficiency syndrome) 동물모델에서 유효성을 확인하기 위해 난소절제술을 통한 동물 모델을 제작하였고, 난소절제술에 따른 에스트로겐 결핍 증후군의 하나로 대사 장애의 일종인 지방 세포의 증가에 따른 비만이 발생하는 것을 확인하였다.
난소절제 모델에서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 정맥으로 투여한 결과, 지방 세포의 증가에 따른 비만이 크게 줄어듦을 확인하였고, 따라서 Fetal MSC 유래 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포는 폐경기 이후 발생하는 에스트로겐 결핍 증후군의 하나인 대사 질환(비만, 제2형 당뇨병 등) 적응증에 세포치료제로서 활용이 가능함을 확인하였다.
참조예
참조예 1. 인간 태아 중간엽 줄기세포(Human fetal mesenchymal stem cell: Fetal MSC)의 분리 배양
자궁 외 임신 또는 사산된 인간 태아의 두부 (Skull) 또는 팔다리(Limb) 조직에서 Neural tube을 제거한 다음 skull 조직을 50ml tube에 넣고 HBSS를 첨가해 잘 섞어 주면서 혈액을 제거한다. 면도날을 이용해 태아 조직을 잘게 자른 후 HBSS 10 ml과 함께 50 ml tube로 옮긴다. 두부 (Skull) 조각을 10 ml 파이펫으로 부드럽게 풀어준 후 실온에서 1200 rpm에서 5 분간 원심분리한다. 상등액을 제거하고 collagenase 용액 10 ml을 넣고 37℃ shaking incubator에 넣어 15분 간 incubation한다. 실온에서 1200 rpm으로 3분 간 원심분리하여 조직 덩어리만 가라 앉혀주고 상등액을 9 ml을 새 50 ml tube에 피펫으로 옮긴 후 동량의 10% FBS를 함유하는 DPBS 용액을 첨가하여 피펫으로 잘 섞어 collagenase enzyme을 blocking시킨다. 100 μm strainer로 거르고 1500 rpm에서 5분간 실온에서 원심분리 한다. pellet을 배양 배지 (DMEM high glucose with 10% FBS, 1% Penicillin & Streptomycin) 1 ml에 잘 섞어준다. T-25 flask당 5 x 105 세포를 배양한다.
참조예 2. 인간 태아 중간엽 줄기세포의 분화 방법
(1) 골 분화(Osteogenic differentiation)
세포들을 24 well plate에 배양한 뒤, StemPro osteogenesis differentiation kit (gibco, A10072-01)의 basal medium과 supplement를 9:1로 섞고, penicillin/streptomycin을 1%로 첨가한 배지로 교환한다. 3 ~ 4일 간격으로 배지를 교체하여 배양한다. 4% PFA로 고정 후 2% Alizarin Red 용액으로 30분간 염색하여 붉게 염색된 칼슘을 확인한다.
(2) 지방 세포 분화(Adipogenic differentiation)
세포들을 12 well plate에 배양한 뒤, StemPro adipogenesis differentiation kit(A10070-01)의 basal medium과 supplement를 9:1로 섞고, penicillin/streptomycin을 1%로 첨가한 배지로 교환한다. 3 ~ 4일 간격으로 배지를 교체하여 배양한다. 4% PFA로 고정 후 Oil Red 용액으로 15분 간 염색하여 Oil drop을 확인한다.
(3) 연골 세포 분화(Chondrogenic differentiation)
세포 펠렛을 21일 간 연골 세포 분화배지 (DMEM-high glucose + 1% FBS, 1X ITS+Premix, 10 ng/mL TGF-β1, 10 μM dexamethasone, 1 μM ascorbate-2-phosphate, 1% sodium pyruvate, 1X NEAA, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양한 후 파라핀 절편으로 제작하여 H&E 또는 PAS 염색으로 연골 세포 분화여부를 확인한다.
(4) 신경 세포 분화(Neurogenic differentiation)
세포들을 12 well plate에 배양한 뒤, B-27 supplement, GlutaMAX-1을 첨가한 Neurobasal medium으로 배양한다. 3 ~ 4일 간격으로 배지를 교체하여 2주 간 배양한다. Nestin, GFAT에 대한 항체를 이용하여 면역염색 방법으로 분화여부를 확인한다.
참조예 3.
인간 태아 중간엽 줄기세포의 분화능 확인 실험
(1) RNA 제조 및 cDNA 합성
수확한 세포들을 trizol 1 ml을 넣어 충분히 풀어준 뒤, chloroform 200 ㎕를 넣고 충분히 섞어준다. 실온에 2 ~ 3분 방치한 뒤, 12000 g로 15분 간 실온으로 원심분리하여 상단의 무색 부분을 새 tube에 옮겨 담는다. 동량의 100% 에탄올을 첨가 후 5 ~ 6회 섞어준다. 내용물을 GeneAll kit (GeneAll biotech, #304-150)의 Mini spin column으로 옮기고, 10,000 g로 실온에서 30초 간 원심분리한다. 빠져나온 내용물을 버리고 GW1 버퍼를 500 ㎕ 넣은 뒤 같은 조건으로 원심분리한다. 700 ㎕의 RNW buffer를 넣어 원심 분리하고, 새 튜브에 옮겨 담아 50 ㎕의 물을 이용하여 RNA를 추출한다. 10,000 g에서 1분 간 원심분리하여 RNA를 추출하고, 이를 분광기 (Nano drop)를 이용하여 농도를 확인 후, 총 500 ng의 양을 기준으로 LaboPass cDNA synthesis kit (cosmogenetic, #CMRTK002)를 이용하여, oligo dT/random primer, dNTP, RNA, Nuclease free water를 넣은 뒤 42℃로 1시간 반응시켜 cDNA를 합성한다.
(2) Real time-PCR
96 well reaction plate (applied biosystems, #N8010560)의 각 well에 SYBR green mix (Enzynomics, # RT500S), cDNA, primer(forward/reverse), RNase free water를 넣고, RT-PCR 기계 (applied biosystems, viiA7)를 통해 PCR cycle을 진행한다. 이 후 comparative delta-delta-Ct 혹은 standard curve 방법으로 각 유전자의 발현량을 확인하고 비교한다.
(3) FACS 분석
세포를 트립신을 이용하여 떼어낸 뒤, 원심분리 하여 모은다. PBS로 2회 세척 후, 세포를 1 x 105 cells / 200 ㎕의 농도로 FACS 버퍼에 푼다. 항체들을 100x 농도로 넣고 빛이 없는 4℃ 조건에서 30분 간 둔다. 세포들을 FACS 버퍼로 워싱한 후에 FACS 버퍼 400 ㎕에 풀고 FACS 기계를 이용하여 분석한다.
(4) 분비체(Secretome) 분석
100 % confluence dish를 준비하고 DPBS로 2회 워싱한다. 1% Penicillin/Streptomycin만 첨가한 DMEM 배지를 8 ml씩 넣고 24시간 동안 배양한다. 배양 접시의 배양액을 모두 15 ml tube에 옮기고, 2000 rpm, 10분 간 원심 분리 후, 상층액을 Antibody array (Raybiotech Human L1000 Antibody Array)를 이용하여 target 물질들의 농도를 확인하여 비교한다.
(5) 난소 절제 모델(ovariectomized model: OVX model)
8주령 C57BL/6 mouse 암컷을 호흡 마취를 통해 마취 후, 등 부분을 절개 한 뒤, 지방으로 쌓여있는 난소를 적출하고, 절개 부위를 봉합한다. 이후 매주 무게 및 상태를 확인하며, 수술 2주 후 여러가지 조건의 줄기세포를 꼬리의 정맥을 통해 100 ㎕ 용량으로 주입한다. 정맥 투여 6주 후 동물을 희생시킨 후 조직들과 혈액 샘플을 확보하여 분석한다.
(6) 핵형분석
Fetal MSC를 bFGF 첨가 또는 무첨가된 배양배지에서 각각 8 계대 (그림 8A) 또는 24계대 (그림 8B)까지 배양한 다음 트립신을 이용하여 분리한다. Giemsa 염색을 통하여 최소 10개 metaphase 기 세포의 G band를 현미경으로 관찰한다.
Claims (18)
- Osx (SP7), c-kit, CD24, CD70 및 SFRP2으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자가 발현되는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 CD90을 이형성(heterogeneous)으로 발현하는 것인, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 HLA class I을 발현하지 않는 것인, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 KITLG, CXCL12, HES4, TWIST1, BMP2, BMPR1B, NOG 및 ALPL로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 유전자가 과발현되는 것인, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄 와튼젤리 유래 중간엽 줄기세포 또는 성인 골수 유래 중간엽 줄기세포에 비해 ABL1, IGFBP-7, MMP-1, GLO-1, Progranulin, Amylin, BMX, ALPP, FAP, ADAMTS-L2, SPARC, TLR1, Galectin-3, Beta IG-H3, HB-EGF, 11b-HSD1, PTHLP, ACTH, Activin A, GDF11 및 GDF3로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드가 과분비되는 것인, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 자궁 외 임신 또는 사산된 태아의 조직으로부터 유래된 것인, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 6에 있어서, 상기 태아의 조직은 태아의 두부(skull) 또는 칼바리아(Calvaria) 조직인, 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골절, 골불유합, 골형성부전, 골 감소증, 골 융해성 전이, 노인성척추후만증, 파제트병, 골위축, 골연화증, 골관절염, 치주질환, 구루병, 무형성 골질환, 암 세포의 골 전이에 의해 초래되는 뼈의 손상, 섬유이형성증 & 맥쿤-알브라이트 증후군, 골기형 및 골이형성증으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 골 질환인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골절, 섬유이형성증, 맥쿤-알브라이트 증후군, 골불유합 및 골형성부전으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 골 질환인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 에스트로겐 결핍 증후군은 에스트로겐 결핍으로 인한 안면홍조, 발한, 불면증, 신경과민, 우울증, 현기증, 집중장애, 단기 기억장애, 불안, 기억력 감퇴, 심계항진, 근육통, 관절통, 피부 건조와 위축, 질건조증, 질위축, 하부 요도 위축, 질염, 자궁위축, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 비만, 제2형 당뇨병, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 급작스런 심장박동 변화, 수면장애, 자신감과 성적 욕구의 상실, 골다공증, 아테롬성 심장 질환, 정맥 혈전증, 불규칙한 생리주기, 불규칙한 생리량, 불규칙한 생리기간, 다한증, 이명, 고혈압, 소화기장애, 두통, 인지기능장애, 피로감, 감정기복, 알츠하이머병, 성교통, 단기 기억장애, 성욕 감퇴, 혈류장애 및 피부 노화로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 증상을 나타내는 것인, 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 에스트로겐 결핍 증후군은 에스트로겐 결핍으로 인한 비만 및 제2형 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 증상을 나타내는 것인, 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 연속적으로 계대 배양하는 단계를 포함하는 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포의 대량 제조 방법.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료 방법.
- 청구항 1의 골 분화능 기능강화 중간엽 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 에스트로겐 결핍 증후군의 예방 또는 치료 방법.
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| KR20210008873A (ko) | 2018-06-05 | 2021-01-25 | 메디포스트(주) | 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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| KR20210008873A (ko) | 2018-06-05 | 2021-01-25 | 메디포스트(주) | 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
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