JP2024514962A - 筋ジストロフィーの遺伝子治療のためのａａｖｒｈ７４ベクター - Google Patents

筋ジストロフィーの遺伝子治療のためのａａｖｒｈ７４ベクター Download PDF

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Abstract

本明細書に提供されるのは、改変されたAAVカプシドタンパク質、粒子、核酸ベクター、およびその組成物、ならびにそれらの使用の方法である。

Description

関連出願
本出願は、2021年4月23日に出願された米国仮特許出願第63/179,097号、および2022年4月5日に出願された米国仮特許出願第63/327,410号の35 U.S.C.§119(e)下の利益を主張し、その各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
EFS-WEBを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出されておりおよび参照により本明細書にその全体において組み込まれる配列表を含む。2022年4月22日に作成された該ASCIIコピーは、U120270077WO00-SEQ-COBと名付けられ、およびサイズ119,114バイトである。
背景
遺伝子治療は、遺伝性疾患を患っている、または患うリスクがある対象を処置する潜在的可能性を有する。遺伝子ペイロードを運ぶための改善されたAAVベクターは、例として筋肉の組織および/または機能に影響するある疾患のための、遺伝子治療の開発に有益になる。筋ジストロフィーなどの筋疾患は、例えば先天性または後天性の体細胞変異、傷害、および有害な化合物への曝露を包含する、無数の条件からの結果としてもたらされ得る。いくつかのケースにおいて、筋疾患は、生死を脅かす合併症を結果としてもたらすか、または重篤な症状および/または死へ繋がる。筋ジストロフィーを包含する筋疾患を調節することには無数の因子が関係しているが、有効な処置は未だ限られたままである。
概要
本開示は、少なくとも部分的には、組換えAAVrh74粒子の1以上のカプシドタンパク質におけるあるアミノ酸置換、および/またはAAVrh74カプシドによってカプシド化されたAAV核酸ベクターの改変が、野生型AAVrh74粒子またはAAVrh74カプシドによってカプシド化された改変されていないAAV核酸ベクターと比べて、改善された特性(例として、特定の細胞の型の形質導入)を結果としてもたらすという認識に基づく。カプシドタンパク質の改変(例として、アミノ酸置換)および核酸ベクターの改変(例として、D配列の置換または欠失、および転写調節因子結合エレメントの挿入)は、AAVrh74粒子に、他の特性の中でも、具体的な細胞型への結合の増強、細胞および/またはその生物学的機構との相互作用の増強、細胞の形質導入の増強、増強された細胞内での導入遺伝子の発現の増強などの様々な有益な特性を、付与することができる。複数の改変の組み合わせ（例えば、様々なカプシドタンパク質改変および/または核酸ベクター改変の組み合わせ）は、それらが組み込まれるAAVrh74粒子の様々な特性に相乗効果を有することができる。
いくつかの側面に従うと、AAV核酸ベクターの改変は、ベクターの左または右逆方向末端反復(ITR)の改変を含む。いくつかの態様において、AAV核酸ベクターの改変は、AAVベクターの左または右ITRのいずれかにおけるD配列の置換を含む。例えば、いくつかの態様においてAAV核酸ベクターの改変は、AAV核酸ベクター内の配列(例として、ITR内のD配列)の、別の配列(例として、S配列またはグルココルチコイド受容体結合エレメント(GRE))での置換を含む。AAV核酸ベクター内の配列(例として、ITR内のD配列)の、別の配列(例として、S配列またはGRE)での置換は、AAV核酸ベクターを含むAAV粒子の形質導入効率および/または導入遺伝子発現レベルを増大させることができる。
いくつかの側面に従うと、本明細書に開示の組換えAAVrh74粒子は、いくつかの態様においては改変されたAAV核酸ベクターに加えて、1以上のアミノ酸置換を有するカプシドタンパク質を含む。1以上のアミノ酸置換を含むAAVrh74カプシドにおける、改変されたAAV核酸ベクターのカプシド化は、改変されたAAV核酸ベクターおよび1以上のアミノ酸置換を含むカプシドを含むAAV粒子の、対応する改変されていないAAV核酸ベクターおよび/またはアミノ酸置換を含んでいないカプシドを含むAAV粒子との関連でいうと改善された特性を、結果としてもたらす可能性がある。いくつかの態様において、改善された特性は、形質導入効率、すなわちAAV粒子の関心のある細胞へ遺伝子ペイロードを送達する効率の改善である。
本開示のいくつかの側面に従うと、カプシドタンパク質が提供される。いくつかの態様において、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、ここでカプシドタンパク質は、AAVrh74血清型カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665R、および/またはY733Fである。
いくつかの側面に従うと、AAVrh74粒子が提供される。いくつかの態様において、AAVrh74粒子は、本明細書に開示のカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、AAVrh74粒子は、核酸ベクターをさらに含み、ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列は、S配列で置換されている。いくつかの態様において、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、AAVrh74粒子は、核酸ベクターを含み、ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、グルココルチコイド受容体結合要素(GRE)で置換されている。いくつかの態様において、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
本開示のいくつかの側面に従うと、AAVカプシドタンパク質またはAAV粒子を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、本明細書に開示の組成物は、本明細書に開示のAAVrh74カプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示の組成物は、本明細書に開示のAAVrh74粒子を含む。
いくつかの側面に従うと、細胞を接触させる方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞を、AAVrh74粒子を含む組成物と接触させることを含み、ここでAAVrh74粒子は、カプシドタンパク質および核酸ベクターを含み、
(i) ここでカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665R、および/またはY733F、であり、および/または
(ii) ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列は、S配列で置換されており、任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、方法は、細胞を、AAVrh74粒子を含む組成物と接触させることを含み、AAVrh74粒子は、カプシドタンパク質および核酸ベクターを含み、
(i) ここでカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665R、および/またはY733Fであり、および/または
(ii) ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、グルココルチコイド受容体結合要素(GRE)で置換されており、任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fである。
いくつかの態様において、核酸ベクターは、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列は、S配列で置換されており、任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、核酸ベクターは、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、GREで置換されており、任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、かつ、核酸ベクターは、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列は、S配列で置換されており、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fであり、および任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、かつ、核酸ベクターは、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、GREで置換されており、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fであり、および任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質の、以下に対応する位置でのアミノ酸置換を含む:
(a) Y447およびY733、任意にここで、置換は、Y447FおよびY733Fである；
(b) Y447、Y733、およびN665、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、およびN665Rである；
(c) Y447、Y733、およびT494、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、およびT494Vである；
(d) Y447、Y733、およびK547、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、およびK547Rである；または
(e) Y447、Y733、N665、T494、およびK547、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、N665R、T494V、およびK547Rである。
いくつかの態様において、第1のITRおよび第2のITRは、それぞれAAV2血清型ITRまたはAAV3血清型ITRである。
いくつかの態様において、第1のD配列は、S配列で置換されているか、または第1のD配列は、GREで置換されている。いくつかの態様において、第2のD配列は、S配列で置換されているか、または第2のD配列は、GREで置換されている。いくつかの態様において、S配列が、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、または、GREが、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、AAVrh74粒子の形質導入効率は、野生型AAVrh74粒子よりも少なくとも2倍高い。いくつかの態様において、AAVrh74粒子のパッケージング効率は、野生型AAVrh74粒子と比べて減少している。
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物の細胞である。いくつかの態様において、細胞は、筋細胞である。いくつかの態様において、細胞は、骨格筋細胞である。いくつかの態様において、細胞は、腓腹筋の細胞であるかまたは前脛骨筋の細胞である。
いくつかの態様において、核酸ベクターは、調節要素を含む。いくつかの態様において、調節要素は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、応答要素、開始部位、終結シグナル、またはリボソーム結合部位を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーター、または合成プロモーターである。
いくつかの態様において、核ベクターは、関心のある遺伝子のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、関心のある遺伝子は、治療用タンパク質または診断用タンパク質をコードする。
いくつかの態様において、接触させることは、in vivoでなされる。
いくつかの態様において、方法は、AAVrh74粒子を含む組成物を対象に投与することをさらに含む。
いくつかの態様において、細胞は、対象におけるものである。
いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、筋疾患を患うリスクがあるかまたは患っており、任意にここで、筋疾患は、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ミオパチー、筋炎、末梢神経障害、または脊髄性筋萎縮症である。いくつかの態様において、筋疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、任意にここで、対象が、ジストロフィン遺伝子内に突然変異を有する。いくつかの態様において、筋疾患は、肢帯筋ジストロフィーである。いくつかの態様において、筋疾患は、X連鎖性筋細管ミオパチーであり、任意にここで、対象は、MTM1遺伝子内に突然変異を有する。
いくつかの態様において、組成物は、皮下注射によって、筋肉内注射によって、静脈内注射によって、腹腔内注射によって、または経口的に対象に投与される。
いくつかの態様において、接触させることは、in vitroまたはex vivoでなされる。
図1A～1Bは、ヒトHeLa(図1A)およびマウスC2C12(図1B)細胞における野生型(WT)およびY-F突然変異体ssAAVrh74ベクターの形質導入効率を示す。細胞に、示されたベクターゲノムコピー数(vgs)/細胞で、37℃にて2時間、各ベクターを形質導入し、および、導入遺伝子発現を、形質導入72時間後に蛍光顕微鏡下で可視化させた。データは、ImageJソフトウェアを使用して定量した。左パネルは、形質導入の後の細胞におけるEGFP蛍光を示す。図1Aの右パネルにおけるデータは、WT、Y733F、およびY447+733F ssAAVrh74ベクターの各々についての1,000vgs/細胞(左、淡色バー)または3,000vgs/細胞(右、濃色バー)での形質導入の後の導入遺伝子発現の定量化(ピクセル2/視野)を示す。図1Bの右パネルにおけるデータは、WT、Y733F、およびY447+733F ssAAVrh74ベクターの各々についての3,000vgs/細胞(左、淡色バー)または9,000vgs/細胞(右、濃色バー)での形質導入の後の導入遺伝子発現の定量化(ピクセル2/視野)を示す。
図2は、初代ヒト骨格筋細胞における野生型(「WT」)およびY733+447F+T494V三重突然変異体(「TM」)ssAAVrh74ベクターの形質導入効率を示す。細胞に、示された感染の多重度(vgs/細胞)で各 ベクターを形質導入し、および、導入遺伝子発現レベルを、図1A～1Bにおいて上に記載したとおり定量化した。左パネルは、形質導入の後の骨格筋細胞におけるEGFP蛍光を示す。右パネルは、WTおよびTM AAVrh74ベクターについて、夫々、1,000vgs/細胞(左、淡色バー)または3,000vgs/細胞(右、濃色バー)での形質導入の後の導入遺伝子発現の定量化(ピクセル2/視野)を示す。
図3A～3Bは、HeLa細胞におけるssAAV-rh74突然変異体の形質導入効率を示す。図3Aは、野生型(WT)またはカプシド突然変異体ssAAVrh74ベクターの3,000vgs/細胞での形質導入72時間後のGFP蛍光を示す。 図3Bは、GFP蛍光形質導入データ(ピクセル2/視野として測定された導入遺伝子発現)の定量を示す。
図4A～4Cは、野生型(「WT」)ssAAVrh74ベクター、またはその左ITRのD配列が置換されている(「LC1」)もしくは右ITRのD配列が置換されている(「LC2」)ssAAVrh74ベクターの形質導入効率を示す。図4Aは、HeLa細胞におけるWT、LC1、またはLC2 ssAAVrh74ベクターによって媒介される導入遺伝子発現を示す。左パネルは、各ssAAVrh74ベクター夫々の1,000vgs/細胞、3,000vgs/細胞、または10,000vgs/細胞での形質導入の後のHeLa細胞におけるhrGFP蛍光を示す。右パネルは、WT、LC1、またはLC2 AAVrh74ベクターの、夫々、1,000vgs/細胞(バーの各セットのうち左のバー)、3,000vgs/細胞(中央のバー)、または10,000vgs/細胞(右のバー)での形質導入の後の導入遺伝子発現の定量化(ピクセル2/視野)を示す。 図4Bは、WT、LC1、またはLC2 ssAAVrh74ベクターで形質導入されたHeLa細胞におけるベクターゲノムコピー数(DNA 1μgあたりのコピー数×108)を示す。3本のバーの各セットは、1,000vgs/細胞(左のバー)、3,000vgs/細胞(中央のバー)、または10,000vgs/細胞(右のバー)での形質導入の後のコピー数を示す。 図4Cは、初代ヒト骨格筋細胞におけるWT、LC1、またはLC2 ssAAVrh74ベクターによって媒介される導入遺伝子発現を示す。左パネルは、各ssAAVrh74ベクター夫々の1,000vgs/細胞、3,000vgs/細胞、または10,000vgs/細胞での形質導入の後の初代ヒト骨格筋細胞におけるhrGFP蛍光を示す。右パネルは、WT、LC1、またはLC2 AAVrh74ベクターについて、夫々、1,000vgs/細胞(バーの各セットのうち左のバー)、3,000vgs/細胞(中央のバー)、または10,000vgs/細胞(右のバー)での形質導入の後の導入遺伝子発現の定量化(ピクセル2/視野)を示す。図3Aおよび図3Bの両方について、細胞に、示された感染の多重度(vgs/細胞)で、37℃にて2時間、各ベクターを形質導入し、および、導入遺伝子発現を、形質導入72時間後に蛍光顕微鏡下で可視化させた。データは、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
図5は、野生型(「WT」)ssAAVrh74 ベクター、Y447+733F+T494V三重突然変異体(「TM」)ssAAVrh74ベクター、および左ITRのD配列のさらなる置換を伴うY447+733F+T494V三重突然変異体ssAAVrh74ベクター(「OptX」)を使用したHeLa細胞の形質導入効率を示す。HeLa細胞に、1,000vgs/細胞で形質導入し、および、形質導入効率を、形質導入72時間後に決定した。 図6A～6Bは、GFP蛍光のフローサイトメトリー定量化(図6A)およびフローサイトメトリー平均GFP蛍光の定量化(図6B)によって測定されたHeLa細胞におけるWT、TM、およびOptX ssAAV-rh74ベクターの形質導入効率を示す。WT、TM、およびOptXは、上で図5に定義されたとおりである。HeLa細胞に、1,000vgs/細胞で形質導入し、および、形質導入効率を、形質導入72時間後に決定した。 図6A～6Bは、GFP蛍光のフローサイトメトリー定量化(図6A)およびフローサイトメトリー平均GFP蛍光の定量化(図6B)によって測定されたHeLa細胞におけるWT、TM、およびOptX ssAAV-rh74ベクターの形質導入効率を示す。WT、TM、およびOptXは、上で図5に定義されたとおりである。HeLa細胞に、1,000vgs/細胞で形質導入し、および、形質導入効率を、形質導入72時間後に決定した。
図7A～7Dは、C57Bl6マウスにおける1×1012vgs/マウスの静脈内投与の後のin vivoでのWTおよびOptX ssAAVrh74ベクターの有効性を示す。図7Aは、ベクターの静脈内投与後に定量化した、腓腹筋(GA)の筋肉における導入遺伝子発現を示し、および図7Bは、ベクターの静脈内投与後に定量化した、前脛骨筋(TA)の筋肉における導入遺伝子発現を示す。 図7Cは、ベクターの投与の後の8週間にて採取した様々な組織において定量化したベクターゲノムコピー数を示す。図7Dは、ベクターの投与の後の肝臓、GA、およびTAにおいて測定された相対的な導入遺伝子発現を示す。導入遺伝子発現データは、蛍光顕微鏡画像のNIH ImageJソフトウェア分析を使用して定量化した。
図8A～8Dは、in vitroでのWT、GenX、およびGenYベクターの有効性を示す。図8Aは、WT(核酸ベクターの末端から遠位のITR端にD配列がある)、GenX(1つのD配列が置換されている)、およびGenY(1つのD配列の一部分がGREで置換されている)ゲノムの概略的な構造を示す。図8Bは、チルホスチン(「Tyr.」)の不在下または存在下での、マウスC2C12細胞におけるGenXおよびGenY AAVrh74ベクターの形質導入効率を示す。 図8Cは、初代ヒト骨格筋細胞におけるWT、GenX、およびGenY AAVrh74ベクターの形質導入効率を示す。細胞に、示された細胞あたりのベクターゲノムコピー数で、37℃にて2時間、各ベクターを形質導入し、および、導入遺伝子発現を、形質導入72時間後に蛍光顕微鏡下で可視化させた。導入遺伝子発現は、蛍光顕微鏡画像のNIH ImageJソフトウェア分析を使用して定量化した。図8Dは、WT、GenX、およびGenY AAVrh74ベクターで形質導入された初代ヒト骨格筋細胞において定量化したベクターゲノムコピー数を示す。
図9A～9Bは、OptX AAVrh74ベクターの有効性を示す。図9Aは、PBS、hrGFP導入遺伝子を含有する野生型AAVrh74粒子(「WT」)またはhrGFP導入遺伝子を含有するOptX AAVrh74粒子(「OptX」)を投与されたマウスの肝臓、横隔膜、および心臓組織から抽出された全RNAの1μgあたりのhrGFP mRNAコピー数の逆転写定量PCR(RT-qPCR)測定を示す。図9Bは、hrGFP導入遺伝子を含有するWTまたはOptX AAVrh74粒子を投与されたマウスからの肝臓、横隔膜、および心臓組織試料におけるhrGFPの相対的な発現レベルを示す。 図10A～10Bは、PBS、hrGFP導入遺伝子を含有するWTまたはOptX AAVrh74粒子を投与されたマウスの肝臓、横隔膜、および心臓組織における遺伝子発現の対照測定を示す。図10Aは、RT-qPCRによって測定されたβアクチンの発現を示す。図10Bは、βアクチンのRT-qPCR測定からのサイクル閾値(CT)の値を示す。
図11A～11Bは、OptY AAVrh74ベクターの有効性を示す。図11Aは、hrGFP導入遺伝子を含有するY447+733F+T494V三重突然変異体AAVrh74粒子(「TM」)またはhrGFP導入遺伝子を含有するOptY AAVrh74粒子(「OptY」)を投与されたマウスからの肝臓、腓腹筋(「GA」)、および前脛骨筋(「TA」)組織切片の蛍光顕微鏡画像を示す。図11Bは、蛍光顕微鏡画像からのhrGFP導入遺伝子発現の定量化を示す。 図12は、hrGFP導入遺伝子を含有するY447+733F+T494V三重突然変異体AAVrh74粒子(「TM」)またはhrGFP導入遺伝子を含有するOptY AAVrh74粒子(「OptY」)を投与されたマウスの肝臓、心臓、横隔膜、腓腹筋(「GA筋肉」)および前脛骨筋(「TA筋肉」)組織におけるベクターゲノムコピー数の定量化を示す。 図13は、hrGFP導入遺伝子を含有するY447+733F+T494V三重突然変異体AAVrh74粒子(「TM」)またはhrGFP導入遺伝子を含有するOptY AAVrh74粒子(「OptY」)を投与されたマウスの肝臓、心臓、横隔膜、腓腹筋(「GA筋肉」)および前脛骨筋(「TA筋肉」)組織におけるベクターゲノムコピー数あたりのhrGFP mRNA発現の定量化を示す。
詳細な記載
本開示は、少なくとも部分的には、その細胞内での導入遺伝子発現を円滑化する特定の細胞への様々なカーゴの送達に有用なアデノ随伴ウイルス(AAV)カプシドタンパク質、粒子、ゲノム、核酸ベクター、およびプラスミドの開発に基づく。本開示は、少なくとも部分的には、AAVrh74カプシドタンパク質におけるアミノ酸置換および/またはAAV核酸ベクターにおけるヌクレオチド配列改変(例として、置換または欠失)の組み込みが、改善された形質導入効率および/または導入遺伝子発現を結果としてもたらすという知見に関する。本明細書に開示のAAVカプシドタンパク質、粒子、ゲノム、核酸ベクター、およびプラスミドは、これらに限定されないが組成物および方法(例として、治療方法)を包含する様々な用途において使用されてもよい。本明細書に開示の治療方法は、それを必要とする対象における、疾患(例として、筋ジストロフィーなどの筋障害)の処置において有用なものを包含する。
本明細書に提供されるのは、AAVカプシドタンパク質、AAV粒子、AAV粒子内に含まれる核酸であって1以上のITR内に1以上の改変を含む核酸、を包含する組成物、および、関心のある細胞を形質導入するための組成物を使用する方法(例として、対象における疾患または状態を処置するための)である。
カプシドタンパク質
本明細書に提供されるのは、アミノ酸置換によって特徴づけられる1以上の突然変異を有するAAVカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAVカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質の、Y447、T494、K547、N665、またはY733に対応する1以上の位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、Y447F、T494V、K547R、N665R、および/またはY733Fから選択される。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAVカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質の、Y447およびY733；Y447、Y733、およびN665；Y447、Y733、およびT494；Y447、Y733、およびK547；またはY447、Y733、N665、T494、およびK547、に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAVカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質の、Y447FおよびY733F；Y447F、Y733F、およびN665R；Y447F、Y733F、およびT494V；Y447F、Y733F、およびK547R；またはY447F、Y733F、N665R、T494V、およびK547R、に対応する位置でのアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAVカプシドタンパク質は、VP1タンパク質、VP2タンパク質、またはVP3タンパク質である。VP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質は、各々AAVゲノムの同じセグメントからコードされ、および、選択的mRNAスプライシングに基づいてそれらのN末端が異なる。
AAVrh74カプシドタンパク質のアミノ酸配列の例：
AAVrh74カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
種々異なるカプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3は、完全長VP1タンパク質の付番に従って定義される。いくつかの態様において、AAVrh74カプシドタンパク質については、VP1カプシドタンパク質は、配列番号1のアミノ酸1～738によって定義され；VP2カプシドタンパク質は、配列番号1のアミノ酸138～738によって定義され；およびVP3カプシドタンパク質は、配列番号1のアミノ酸204～738によって定義される。AAVカプシドタンパク質の付番は、VP1配列に従って提供される。例えば、Y447は、VP1タンパク質における配列番号1の位置447でのチロシンまたはVP2またはVP3タンパク質における対応するチロシンを指す。同様に、T494、K547、N665、およびY733は、夫々、VP1タンパク質における配列番号1の位置494でのトレオニン、位置547でのリシン、位置665でのアスパラギン、および位置733でのチロシン、またはVP2またはVP3タンパク質における対応するアミノ酸を指す。
本明細書に開示のAAVカプシドタンパク質は、あらゆる血清型のものとすることができ、またはキメラのカプシドタンパク質(すなわち、2以上の血清型のカプシドタンパク質からのセグメントを含む)とすることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、またはAAVrh74カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書に提供されるとおりのAAVカプシドタンパク質は、血清型rh74のものである。他のAAV血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列は知られており、および、これは当該技術分野において知られている技法を使用して配列番号1(AAVrh74カプシドタンパク質)とアラインメントすることができる。様々な血清型のAAVカプシドタンパク質のアミノ酸配列の例を、下に提供する：
野生型AAV1カプシドタンパク質の例
野生型AAV2カプシドタンパク質の例
野生型AAV3カプシドタンパク質の例
野生型AAV4カプシドタンパク質の例
野生型AAV5カプシドタンパク質の例
野生型AAV6カプシドタンパク質の例
野生型AAV7カプシドタンパク質の例
野生型AAV8カプシドタンパク質の例
野生型AAV9カプシドタンパク質の例
野生型AAV10カプシドタンパク質の例
野生型AAV11カプシドタンパク質の例
野生型AAV12カプシドタンパク質の例
野生型AAVrh10カプシドタンパク質の例
カプシドタンパク質をコードする核酸もまた、本明細書に提供される。核酸は、ここに開示されたカプシドタンパク質(例として、1以上のアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質)をコードする配列を含み得る。本明細書に開示のカプシドタンパク質をコードする配列は、知られている方法により当業者によって決定されることができる。カプシドタンパク質をコードする核酸は、コード配列へ作動可能に連結されているプロモーターまたは他の調節配列を含んでもよい。カプシドタンパク質をコードする核酸は、カプシドタンパク質を生産するための宿主細胞の酵素または機構によって使用されることが可能な、プラスミド、mRNA、または別の核酸の形態であってもよい。本明細書に提供されるとおりのカプシドタンパク質をコードする核酸は、細胞へ遺伝子を送達するために使用されることが可能なAAV粒子を作製ために使用されることができる。AAV粒子を作製する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Scientific Reports volume 9, Article number: Methods Mol Biol. 2012; 798: 267-284；およびwww.thermofisher.com/us/en/home/clinical/cell-gene-therapy/gene-therapy/aav-production-workflow.htmlを参照されたい。カプシドタンパク質をコードする核酸の配列の例は、以下に提供される。
AAV1カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV2カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV3カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV4カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV5カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV6カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV7カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV8カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV9カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
AAV10カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の例：
核酸ベクター
いくつかの側面に従うと、本明細書に提供されるのは、野生型AAVカプシドまたは本明細書に提供されるとおりのAAVカプシド(例として、1以上のアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質)のいずれか1つによってカプシド化されていてもよい核酸ベクターである。いくつかの態様において、本明細書に提供されるとおりの核酸ベクターは、第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のITRを含む。いくつかの態様において、第1のITRは、改変されている。いくつかの態様において、第2のITRは、改変されている。いくつかの態様において、ITRの改変は、D配列全体の置換またはD配列の一部の置換を含む。いくつかの態様において、ITRの改変は、D配列全体(例として、左ITRまたは右ITRのD配列)の欠失またはD配列の一部(例として、ITRの、核酸ベクターの末端に対して遠位の10ヌクレオチド)の欠失を含む。例えば、ITRの改変は、いくつかの態様において、D配列の1～20ヌクレオチドの欠失または置換を含んでもよい。
いくつかの態様において、D配列の、核酸ベクターの末端に対して遠位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチドが、欠失または置換されている。いくつかの態様において、D配列の、核酸ベクターの末端に対して遠位の10ヌクレオチドが、欠失または置換されている。いくつかの態様において、D配列の中央の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチドが、欠失または置換されている(例として、D配列の3’または5’端から1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドから始まって1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)。いくつかの態様において、D配列の、核酸ベクターの末端に対して近位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチドが、欠失または置換されている。いくつかの態様において、D配列の、核酸ベクターの末端に対して近位の10ヌクレオチドが、欠失または置換されている。いくつかの態様において、D配列は、配列番号16に提供される配列を含む。いくつかの態様において、D配列は、配列番号16に提供される配列によって定義されている。ITRのD配列(例として、本明細書に記載の核酸ベクターの左ITRまたは右ITRのD配列)の一部または全体が置換されている態様において、置換配列は、S配列またはGREなどの、本明細書に記載のいずれかの代替の配列であり得る。
核酸ベクターは、関心のある遺伝子(例として、関心のあるタンパク質またはポリペプチド)をコードする1以上の異種核酸配列、および、1以上の異種核酸配列に隣接する逆方向末端反復(ITR)配列(例として、野生型ITR配列または改変されたITR配列)を含む1以上の配列を含み得る。いくつかの態様において、核酸ベクターは、AAV粒子を形成するAAVカプシド内にカプシド化されている。いくつかの態様において、本明細書に開示の核酸ベクターは、野生型AAVrh74カプシド、または、1以上のアミノ酸置換を含むAAVカプシドなどの本明細書に開示の別のAAVカプシドによって、カプシド化されている。
いくつかの態様において、核酸ベクターは、ネイティブなAAV遺伝子またはネイティブなAAVヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、1以上のネイティブなAAV遺伝子またはネイティブなAAVヌクレオチド配列は、核酸ベクターから除去され得る。いくつかの態様において、1以上のネイティブなAAV遺伝子またはネイティブなAAVヌクレオチド配列が、核酸ベクターから除去されて関心のある遺伝子に置き換えられてもよい。
核酸ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、またはAAVrh74、または血清型の組み合わせなどの、あらゆるAAV血清型のものとすることができる。いくつかの態様において、AAVカプシド内にカプシド化された核酸ベクターは、核酸ベクターがそれのカプシド化されているAAVカプシドとは別個の血清型のものであるような、シュードタイプAAV粒子を形成する。例えば、血清型AAV2の核酸ベクターが血清型AAVrh74のカプシド内にカプシド化されていてもよい。
いくつかの態様において、核酸ベクターは一本鎖であり、および、第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のITRを含む。本明細書に開示のとおりであるとき、第1のITRは、核酸ベクターの5’末端でのITRを指し、および、第2のITRは、核酸ベクターの3’末端でのITRを指す。そのネイティブなまたは野生型の形態である各ITRは、長さ145ヌクレオチドであるかまたは約145ヌクレオチド(例として、約140ヌクレオチド、約145ヌクレオチド、約150ヌクレオチド、約155ヌクレオチド、約160ヌクレオチド、または約165ヌクレオチド)であり、および、D配列を含む。各ITRは、独立して、あらゆるAAV血清型のものとすることができ(例として、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10、またはAAVrh74)、または両方のITRが同じ血清型のものであってもよい。ITRは、例えば、Grimm et al. J. Virol. 80(1):426-439 (2006)において記載されている。例示的な左ITR配列は、以下に提供される。右ITRは、対応する左ITRの逆相補であるヌクレオチド配列を有する(例として、AAV2右ITRは、AAV2左ITRの逆相補であるヌクレオチド配列を有する)。
野生型AAV1左ITRの例：
TTGCCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCGGTGGGGCCTGCGGACCAAAGGTCCGCAGACGGCAGAGGTCTCCTCTGCCGGCCCCACCGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGGCAACTCCATCACTAGGGGTAA (配列番号35)
野生型AAV2左ITRの例：
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT (配列番号12)
野生型AAV3左ITRの例：
TTGGCCACTCCCTCTATGCGCACTCGCTCGCTCGGTGGGGCCTGGCGACCAAAGGTCGCCAGACGGACGTGCTTTGCACGTCCGGCCCCACCGAGCGAGCGAGTGCGCATAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGAGGTATGGC (配列番号13)
野生型AAV4左ITRの例：
TTGGCCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCACTCACTCGGCCCTGGAGACCAAAGGTCTCCAGACTGCCGGCCTCTGGCCGGCAGGGCCGAGTGAGTGAGCGAGCGCGCATAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCATCTAGGTTTGCCC (配列番号36)
野生型AAV5左ITRの例：
CTCTCCCCCCTGTCGCGTTCGCTCGCTCGCTGGCTCGTTTGGGGGGGTGGCAGCTCAAAGAGCTGCCAGACGACGGCCCTCTGGCCGTCGCCCCCCCAAACGAGCCAGCGAGCGAGCGAACGCGACAGGGGGGAGAGTGCCACACTCTCAAGCAAGGGGGTTTTGTA (配列番号14)
野生型AAV6左ITRの例：
TTGCCCACTCCCTCTATGCGCGCTCGCTCGCTCGGTGGGGCCTGCGGACCAAAGGTCCGCAGACGGCAGAGCTCTGCTCTGCCGGCCCCACCGAGCGAGCGAGCGCGCATAGAGGGAGTGGGCAACTCCATCACTAGGGGTA (配列番号15)
いくつかの態様において、核酸ベクターは、ITRのD配列の改変(例として、欠失または置換)を含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、左ITRのD配列の改変(例として、欠失または置換)を含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、右ITRのD配列の改変(例として、欠失または置換)を含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、左ITRおよび右ITRの両方のD配列の改変(例として、欠失または置換)を含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、左ITRまたは右ITRのいずれかであるが両方ではない改変(例として、欠失または置換)を含む(すなわち、核酸ベクターは、一方のITRのみの改変を含む)。
ITR配列は、回文二本鎖T字型ヘアピン構造を形成するAAVゲノムの5’または3’端での末端配列、および、一本鎖のままである(すなわち、T字型ヘアピン構造の一部ではない)さらなる配列を含み、これはD配列と称される。ITRのD配列は、典型的には、ITRの遠位(核酸ベクターの末端に対して)の端(すなわち、左ITRの3’端または右ITRの5’端)に位置するおよそ20(例として、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25)のヌクレオチドであり、および、配列番号12の野生型AAV2左ITRのCTCCATCACTAGGGGTTCCT(配列番号16)の配列に対応する。ITRのD配列は、いくつかの態様において、核酸配列CTCCATCACTAGGGGTTCCT(配列番号16)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、本明細書に開示の核酸ベクターのITR(例として、第1のITRまたは第2のITR)のD配列は、全面的にまたは部分的に除去されている。いくつかの態様において、本明細書に開示の核酸ベクターの両方のITRのD配列は、全面的にまたは部分的に全面的にまたは部分的に除去されている。いくつかの態様において、ITR(例として、第1のITRまたは第2のITR)のD配列は、全面的にまたは部分的に非AAV配列(すなわち、AAV核酸からのものではないヌクレオチド配列)に置き換えられている。いくつかの態様において、ITR(例として、第1のITRまたは第2のITR)のD配列は、全面的にまたは部分的にS配列に置き換えられている。いくつかの態様において、S配列は、核酸配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの態様において、S配列は、配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)と少なくとも70％同一性(例として、少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも91％同一性、少なくとも92％同一性、少なくとも93％同一性、少なくとも94％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも96％同一性、少なくとも97％同一性、少なくとも98％同一性、または少なくとも99％同一性)を有する。
いくつかの態様において、S配列は、配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)と95％未満の同一性(例として、90％未満の同一性、85％未満の同一性、80％未満の同一性、75％未満の同一性、または70％未満の同一性)を有する。いくつかの態様において、S配列は、配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)と約70％～約95％同一性(例として、約95％同一性、約90％同一性、約85％同一性、約80％同一性、約75％同一性、または約70％同一性)を有する。いくつかの態様において、S配列は、配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)に対して6より少数のミスマッチ(例として、5より少数、4より少数、3より少数、2より少数、1、またはゼロ個のミスマッチ)を有する。いくつかの態様において、S配列は、配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)に対して1、2、3、4、5、または6のミスマッチを有する。いくつかの態様において、S配列は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドのまたは約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの態様において、ITR(例として、第1のITRまたは第2のITR)のD配列は、全面的にまたは部分的に、グルココルチコイド受容体結合要素(GRE)で置換されている。いくつかの態様において、GREは、核酸ベクター内に挿入されている(すなわち、ITRの一部分を置換する代わりに)。例えば、GREは、ITRのD配列の内部、ITRのD配列の上流、またはITRのD配列の下流に挿入されていてもよい。
グルココルチコイド受容体結合要素は、グルココルチコイド応答性要素またはグルココルチコイド応答要素としてもまた知られている。GREは、グルココルチコイド受容体が結合するヌクレオチド配列であり、これはそれらのネイティブな遺伝子座内において、一般に遺伝子の転写開始部位から約100～2,000塩基対上流にある。本開示は、その一部では、AAV2のD配列の一部分がGREのコンセンサスハーフサイト（consensus half-site）と互いに部分的相同性を有するという発見、およびグルココルチコイド受容体シグナリング経路は、AAV2感染または形質導入に続いて活性化されるという発見に基づいている。いくつかの態様において、GREでの、AAV ITRのD配列の一部分またはすべての置換は、AAV粒子内にカプシド化されている核酸ベクターによってコードされる導入遺伝子の発現を増大させる。
いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、少なくとも70％同一性(例として、少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも91％同一性、少なくとも92％同一性、少なくとも93％同一性、少なくとも94％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも96％同一性、少なくとも97％同一性、少なくとも98％同一性、または少なくとも99％同一性)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、GREは、配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、95％未満の同一性(例として、90％未満の同一性、85％未満の同一性、80％未満の同一性、75％未満の同一性、または70％未満の同一性)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、約70％～約95％同一性(例として、約95％同一性、約90％同一性、約85％同一性、約80％同一性、約75％同一性、または約70％同一性)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、GREは、配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)またはその逆もしくは逆相補に対して、6より少数のミスマッチ(例として、5より少数、4より少数、3より少数、2より少数、1、またはゼロ個のミスマッチ)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)またはその逆もしくは逆相補に対して、1、2、3、4、5、または6のミスマッチを有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドのまたは約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、GREは、15ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。
いくつかの態様において、GREは、核酸配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、少なくとも70％同一性(例として、少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも91％同一性、少なくとも92％同一性、少なくとも93％同一性、少なくとも94％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも96％同一性、少なくとも97％同一性、少なくとも98％同一性、または少なくとも99％同一性)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。
いくつかの態様において、GREは、配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、95％未満の同一性(例として、90％未満の同一性、85％未満の同一性、80％未満の同一性、75％未満の同一性、または70％未満の同一性)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、約70％～約95％同一性(例として、約95％同一性、約90％同一性、約85％同一性、約80％同一性、約75％同一性、または約70％同一性)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。
いくつかの態様において、GREは、配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)またはその逆もしくは逆相補に対して、6より少数のミスマッチ(例として、5より少数、4より少数、3より少数、2より少数、1、またはゼロ個のミスマッチ)を有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)またはその逆もしくは逆相補に対して、1、2、3、4、5、または6のミスマッチを有し、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドのまたは約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、GREは、15ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、GREは、核酸配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。
いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの態様において、GREは、配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、少なくとも70％同一性(例として、少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも91％同一性、少なくとも92％同一性、少なくとも93％同一性、少なくとも94％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも96％同一性、少なくとも97％同一性、少なくとも98％同一性、または少なくとも99％同一性)を有する。
いくつかの態様において、GREは、配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、95％未満の同一性(例として、90％未満の同一性、85％未満の同一性、80％未満の同一性、75％未満の同一性、または70％未満の同一性)を有する。いくつかの態様において、GREは、配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)の少なくとも8の連続したヌクレオチド(例として、8、9、10、11、12、13、14、または15の連続したヌクレオチド)、またはその逆もしくは逆相補と、約70％～約95％同一性(例として、約95％同一性、約90％同一性、約85％同一性、約80％同一性、約75％同一性、または約70％同一性)を有する。
いくつかの態様において、GREは、配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)またはその逆もしくは逆相補に対して、6より少数のミスマッチ(例として、5より少数、4より少数、3より少数、2より少数、1、またはゼロ個のミスマッチ)を有する。いくつかの態様において、GREは、配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)またはその逆もしくは逆相補に対して、1、2、3、4、5、または6のミスマッチを有する。いくつかの態様において、GREは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドのまたは約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、GREは、15ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
本開示に従う有用なGRE配列の別の例は、5’-GGCACAGTGTGGTCT-3’(配列番号21)である。例えば当該技術分野において知られているGRE配列を包含する、その他のGRE配列を使用することができる。
いくつかの態様において、D配列の置換は、D配列の少なくとも5のヌクレオチド(例として、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のヌクレオチド)の、異なるヌクレオチド配列(例として、S配列またはその一部、またはGREまたはその一部)での置換を含む。いくつかの態様において、D配列の置換は、D配列の10のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの態様において、D配列の置換は、D配列の最も3’-側の10のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの態様において、D配列の置換は、D配列の最も5’-側の10のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの態様において、D配列の置換は、D配列の内部の部分の10のヌクレオチドなどの、D配列の内部の部分(すなわち、末端のヌクレオチドを含まない)の置換を含む。
いくつかの態様において、D配列の欠失は、D配列の少なくとも5のヌクレオチド(例として、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のヌクレオチド)の欠失を含む。いくつかの態様において、D配列の欠失は、D配列の10のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの態様において、D配列の欠失は、D配列の最も3’-側の10のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの態様において、D配列の欠失は、D配列の最も5’-側の10のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの態様において、D配列の欠失は、D配列の内部の部分の10のヌクレオチドなどの、D配列の内部の部分(すなわち、末端のヌクレオチドを含まない)の欠失を含む。
いくつかの態様における本明細書に開示のとおりの核酸ベクターは、1以上の調節要素を含む。調節要素は、核酸ベクターの構成要素(例として、そこに含まれる関心のある遺伝子)の発現の調節に関与する、核酸ベクターのヌクレオチド配列または構造的構成要素を指す。調節要素は、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、応答要素、開始部位、終結シグナル、およびリボソーム結合部位を包含する。
プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的なプロモーター、および合成プロモーターを包含する。例えば、本明細書に開示の核酸ベクターは、ウイルスのプロモーター、または、一般に転写を促進することにおいて活性な哺乳動物遺伝子からのプロモーターを包含し得る。構成的ウイルスプロモーターの非限定例は、単純ヘルペスウイルス(HSV)、チミジンキナーゼ(TK)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、Ad E1Aおよびサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを包含する。構成的哺乳動物プロモーターの非限定例は、βアクチンプロモーターによって例示されるような様々なハウスキーピング遺伝子プロモーターを包含する。
誘導性プロモーターまたは他の誘導性調節要素もまた、関心のある遺伝子(例として、関心のあるタンパク質またはポリペプチド)の所望の発現レベルを達成するために使用してもよい。好適な誘導性プロモーターの非限定例は、シトクロムP450遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、および、エストロゲン遺伝子プロモーターなどホルモン誘導性遺伝子などの、遺伝子からのものを包含する。別の誘導性プロモーターの例は、テトラサイクリンへ応答するtetVP16プロモーターである。
組織特異的プロモーターまたは他の組織特異的調節要素もまた、本明細書に企図される。使用され得るかかるプロモーターの非限定例は、筋特異的プロモーターを包含する。
合成プロモーターもまた、本明細書に企図される。合成プロモーターは、例えば、知られているプロモーター、調節要素、転写因子結合部位、エンハンサー要素、リプレッサー要素等の領域を含んでもよい。
いくつかの態様において、本明細書に提供される核酸は、ある産物(例として、タンパク質またはポリペプチド産物)をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、関心のある遺伝子のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、関心のある遺伝子は、治療用または診断用のタンパク質またはポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、治療用または診断用のタンパク質またはポリペプチドは、抗体、ペプチボディ、成長因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体またはイオンチャネルに対して作用する活性化または阻害性ペプチド、細胞内プロセスを標的にする細胞透過性ペプチド、血栓溶解剤、酵素、骨形成タンパク質、ヌクレアーゼ、遺伝子編集のために使用されるタンパク質、Fc融合タンパク質、抗凝固薬、または実験室での試験を使用して検出することができるタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの態様において、本明細書に提供される核酸は、任意に遺伝子編集のために使用されるタンパク質に加えて、遺伝子編集のために使用されるガイドRNAまたは他の核酸をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示の核酸によってコードされる産物は、検出可能な分子である。検出可能な分子は、可視化(例として、裸眼を使用して、顕微鏡下で、またはカメラなどの光検出デバイスを使用して)することができる分子である。いくつかの態様において、検出可能な分子は、蛍光分子、生物発光分子、または色を提供する分子(例として、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、βグルクロニダーゼ、またはスフェロイデノン)である。いくつかの態様において、検出可能な分子は、蛍光、生物発光または酵素タンパク質またはその機能的ペプチドもしくはポリペプチドである。
いくつかの態様において、蛍光タンパク質は、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、またはそれらの機能的ペプチドもしくはポリペプチドである。青色蛍光タンパク質は、アジュライト、EBFP、EBFP2、mTagBFP、またはY66Hであってもよい。シアン蛍光タンパク質は、ECFP、AmCyan1、Cerulean、CyPet、mECFP、Midori-ishi Cyan、mTFP1、またはTagCFPであってもよい。緑色蛍光タンパク質は、AcGFP、Azami Green、EGFP、Emarald、GFPまたはGFPの突然変異した型(例として、GFP-S65T、mWasabi、Stemmer、Superfolder GFP、TagGFP、TurboGFP、またはZsGreen)であってもよい。黄色蛍光タンパク質は、EYFP、mBanana、mCitrine、PhiYFp、TagYFP、Topaz、Venus、YPet、またはZsYellow1であってもよい。橙色蛍光タンパク質は、DsRed、RFP、DsRed2、DsRed-Express、Ds-Red-モノマー、Tomato、tdTomato、Kusabira Orange、mKO2、mOrange、mOrange2、mTangerine、TagRFP、またはTagRFP-Tであってもよい。赤色蛍光タンパク質は、AQ142、AsRed2、dKeima-Tandem、HcRed1、tHcRed、Jred、mApple、mCherry、mPlum、mRasberry、mRFP1、mRubyまたはmStrawberryであってもよい。
いくつかの態様において、検出可能な分子は、生物発光タンパク質、またはその機能的ペプチドもしくはポリペプチドである。生物発光タンパク質の非限定例は、ホタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、およびトゲオキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)由来のルシフェラーゼである。
いくつかの態様において、検出可能な分子は、当該技術分野において知られている方法を使用して検出することができるあらゆるポリペプチドまたはタンパク質であり得る。非限定的な検出の方法は、蛍光イメージング、発光イメージング、明視野イメージングであり、および、免疫蛍光または免疫組織化学的染色によって円滑化されるイメージングを包含する。
AAV粒子、核酸ベクター、およびカプシドタンパク質の追加の特色は、米国特許公開公報第2017/0356009号に記載されており、それらの内容は、それら全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる。
AAV粒子
いくつかの側面に従うと、AAV粒子は、本明細書に提供される。AAV粒子は、4.7-kb一本鎖DNAゲノムを保護することができる非エンベロープ型T-1正二十面体格子を形成する60個の個々のカプシドタンパク質サブユニットの超分子集合体である。成熟したAAV粒子は、直径およそ20 nmとなり、およびそのカプシドは、夫々87、73、および62kDaの分子量の3つの構造上カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3から形成され、その比率はおよそ1:1:18である。60個のカプシドタンパク質は、逆平行βストランドバレロイド（barreloid）配置に配置され、結果として明確な指向性および分解に対する高い抵抗性をもたらす。
いくつかの態様において、AAV粒子は、中空カプシド(例として、カーゴを伴わないカプシド)を含む。いくつかの態様において、AAV粒子は、核酸(例として、本明細書に開示の核酸ベクターなどの目的の遺伝子を含む核酸ベクター)をカプシド化したカプシドを含む。いくつかの態様において、AAV粒子を生成するためにAAVカプシド内にカプシド化されている核酸は、本明細書に開示の核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、1以上の突然変異、例として、1以上のアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質を含む。
本明細書に開示のいずれかのカプシドタンパク質突然変異(例として、アミノ酸置換)が本明細書に開示のいずれかの核酸ベクターの改変(例として、配列欠失または置換)と組み合わされ得ることが本明細書に企図される。例えば、本明細書に記載のAAV粒子は、AAVrh74カプシドタンパク質(例として、野生型AAVrh74カプシドタンパク質または1以上のアミノ酸置換を含むもの)および改変(例として、D配列の欠失または置換、および/またはGREなどの非AAV配列の挿入)を含むAAV核酸ベクター(例として、AAV2核酸ベクター)を有していてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665、およびY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、カプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、K547R、N665R、およびY733Fに対応する1以上のアミノ酸置換を含む、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665、およびY733に対応する1以上の位置でのアミノ酸置換を含む、カプシドタンパク質を含み、およびITRのD配列の改変(例として、欠失または置換)(例として、右ITR、左ITR、または右ITRおよび左ITRの両方のD配列の改変)を含む核酸ベクターをさらに含む。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665、およびY733に対応する1以上の位置でのアミノ酸置換を含む、カプシドタンパク質およびITRのD配列のS配列での置換を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、K547R、N665R、およびY733Fに対応する。いくつかの態様において、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ITRのD配列(例として、左ITRのD配列)の一部または全体は、S配列で置換されている。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447FおよびY733Fに対応するアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質、およびITRのD配列のS配列での置換を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ITRのD配列(例として、左ITRのD配列)の一部または全体は、S配列で置換されている。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、およびY733Fに対応するアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質、およびITRのD配列のS配列での置換を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ITRのD配列(例として、左ITRのD配列)の一部または全体は、S配列で置換されている。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665、およびY733に対応する1以上の位置でのアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質、および核酸ベクターのITRのD配列の全部または一部の欠失を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447FおよびY733Fに対応する。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、およびY733Fに対応する。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、K547R、N665R、およびY733Fに対応する。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665、およびY733に対応する1以上の位置でのアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質、およびITRのD配列のGREでの置換を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、K547R、N665R、およびY733Fに対応する。いくつかの態様において、GREは、核酸配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)、またはその逆、もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ITRのD配列(例として、左ITRのD配列)の一部または全体は、GREで置換されている。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447FおよびY733Fに対応するアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質、およびITRのD配列のGREでの置換を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、GREは、核酸配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここでYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ITRのD配列(例として、左ITRのD配列)の一部または全体は、GREで置換されている。
いくつかの態様において、AAV粒子は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447F、T494V、およびY733Fに対応するアミノ酸置換を含むカプシドタンパク質、およびITRのD配列のGREでの置換を含む核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、GREは、核酸配列GGTACANNNTGTYCT(配列番号19)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAであり、およびここYは、TまたはCである。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである。いくつかの態様において、GREは、核酸配列AGAACAGGATGTTCT(配列番号20)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ITRのD配列(例として、左ITRのD配列)の一部または全体は、GREで置換されている。
いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、複製である。複製のAAV粒子は、宿主細胞(例として、対象内の宿主細胞または培養中の宿主細胞)内で複製することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、複製しない。複製しないAAV粒子は、宿主細胞(例として、対象内の宿主細胞または培養中の宿主細胞)内で複製することはできないが、宿主に感染し、および発現のために宿主のゲノム内へ遺伝子の構成要素を組み込み得る。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、宿主細胞に感染することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、宿主細胞のゲノム内への遺伝子の構成要素の安定した統合を促進することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、宿主細胞のゲノム内への遺伝子の構成要素の統合を促進することができない。
いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、目的の遺伝子をコードする配列の末端に隣接する2つの逆方向末端反復(ITR)を含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、AAVのssDNAゲノム内に含まれる。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、1つの一本鎖DNAを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、2つの相補DNA鎖を含み、自己相補型AAV(scAAV)を形成する。
いくつかの態様において、AAV粒子(例として、WT粒子または本明細書に開示のいずれか1以上の突然変異を含むカプシドを含む粒子)に含まれ得る核酸ベクターは、ITRのD配列の一部またはすべての改変(例として、欠失または置換)を含むITRを含む。いくつかの態様において、ITRのD配列の一部またはすべては、S配列またはこの一部で置換されている。いくつかの態様において、ITRのD配列の一部またはすべては、GREまたはこの一部で置換されている。いくつかの態様において、ITRのD配列の一部またはすべては、欠失している。かかる改変(例として、欠失および置換)のさらなる記載は、本明細書の他の場所に提供される。
本明細書に開示のAAV粒子は、いずれかの誘導体(天然に存在するものではない血清型のバリアントを包含する)またはシュードタイプを包含する、いずれかのAAV血清型(例として、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13)であってもよい。誘導体およびシュードタイプの非限定例は、AAV2-AAV3ハイブリッド、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAVクローン32/83、AAVShH10、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、およびAAVr3.45を包含する。かかるAAV血清型および誘導体/シュードタイプ、およびかかる誘導体/シュードタイプを産生する方法は、当該技術分野において知られている(例として、Mol. Ther. 2012 Apr; 20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24. The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A, Schaffer DV, Samulski RJ.参照)。いくつかの態様において、AAV粒子は、ある血清型(例として、AAV2またはAAV3)からのITRを含む核酸ベクター、および別の血清型(すなわち、夫々AAV2またはAAV3以外の血清型)に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドを含む、シュードタイプのAAV粒子である。シュードタイプのrAAVベクターを産生および使用するための方法は、当該技術分野において知られている(例として、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167 (2002);およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081 (2001)参照)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子は、組換えAAV(rAAV)粒子であり、例として、組換え核酸または導入遺伝子を含む。
本明細書に記載の改変(例として、カプシドタンパク質の改変、D配列の欠失または置換、および/またはAAVゲノム内への非AAV配列の挿入)のいずれかの組み合わせは、その結果得られる組み合わせの有益な特性が夫々個々の改変の効果の和と等しいかまたはそれより大きい相加効果または相乗効果を結果としてもたらし得る。例えば、改変されたカプシドタンパク質および改変されたゲノムを含むAAV粒子は、対応する野生型AAV粒子と比べて、個々のカプシドタンパク質の改変およびゲノムの改変によって付与される改善の和に等しいかまたは個々の改変によって付与される改善の和よりも大きい、形質導入効率、導入遺伝子発現、および/またはパッケージング効率の改善を有し得る。
形質導入効率
いくつかの側面に従うと、本明細書に開示のAAV粒子の形質導入効率は、対応する野生型AAV粒子と比べて改変されている。AAV粒子の形質導入効率は、例えば、細胞をAAV粒子と接触させた後に細胞中の目的の遺伝子の発現の発現を比較することによって、または細胞の集団をAAV粒子と接触させた後に細胞あたりのウイルスのゲノムコピーの数を測定することによって、決定することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子(例として、改変されたカプシドタンパク質(例として、1以上のアミノ酸置換を含む)、改変された核酸ベクター(例として、D配列の欠失および/または置換によって改変される)、または改変されたカプシドタンパク質(例として、1以上のアミノ酸置換を含む)および改変された核酸ベクター(例として、D配列の欠失および/または置換によって改変される)の両方を含むAAV粒子)の形質導入効率は、対応する野生型AAV粒子の形質導入効率よりも高い。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子の形質導入効率は、対応する野生型AAV粒子の形質導入効率よりも、少なくとも5％高い(例として、少なくとも10％高い、少なくとも15％高い、少なくとも20％高い、少なくとも25％高い、少なくとも30％高い、少なくとも35％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも100％高い、少なくとも150％高い、少なくとも200％高い、少なくとも250％高い、またはそれ以上高い)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子の形質導入効率は、対応する野生型AAV粒子の形質導入効率よりも、少なくとも1.5倍高い(例として、少なくとも2倍高い、少なくとも2.5倍高い、少なくとも3倍高い、少なくとも3.5倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも4.5倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも5.5倍高い、少なくとも6倍高い、少なくとも6.5倍高い、少なくとも7倍高い、少なくとも7.5倍高い、少なくとも8倍高い、少なくとも8.5倍高い、少なくとも9倍高い、少なくとも9.5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも10.5倍高い、少なくとも11倍高い、少なくとも11.5倍高い、少なくとも12倍高い、少なくとも12.5倍高い、少なくとも13倍高い、少なくとも13.5倍高い、少なくとも14倍高い、少なくとも14.5倍高い、少なくとも15倍高い、少なくとも15.5倍高い、少なくとも16倍高い、少なくとも16.5倍高い、少なくとも17倍高い、少なくとも17.5倍高い、少なくとも18倍高い、少なくとも18.5倍高い、少なくとも19倍高い、少なくとも19.5倍高い、少なくとも20倍高い、またはそれ以上高い)。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子の形質導入効率は、対応する野生型AAV粒子に対して改変されていない。
導入遺伝子発現
いくつかの側面に従うと、本明細書に開示の改変(例として、D配列などの配列の欠失または置換)を含む核酸ベクターによってコードされる導入遺伝子の発現は、改変を含まない核酸ベクターによってコードされる導入遺伝子の発現に対して変化している。いくつかの態様において、導入遺伝子の発現のかかる変更は、核酸ベクターコピー数あたりに基づく(例として、細胞における核酸ベクターの総量に対して正規化されたときに、細胞における導入遺伝子発現が変化する)。例えば、いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの改変されたAAV粒子は、同じ改変を含まないが同等の数のウイルスのゲノムを細胞に送達する対応するAAV粒子と比べて、より大きな導入遺伝子の発現をもたらす。相対的な導入遺伝子発現レベルは、例えば、細胞を、導入遺伝子をコードする改変された核酸ベクターを含むAAV粒子と接触させた後に、当該技術分野において知られている方法によって細胞における導入遺伝子の発現を測定すること、および、改変を含まない核酸ベクターを含むAAV粒子と接触させられた別の細胞における同等の測定を比較することによって、決定することができる。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの改変された核酸ベクター(例として、D配列の欠失および/または置換によって改変される)からの導入遺伝子発現は、改変を含まない対応する核酸ベクターからの導入遺伝子発現よりも高い。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの改変された核酸ベクターからの導入遺伝子発現は、改変を含まない対応する核酸ベクターからの導入遺伝子発現よりも、少なくとも5％高い(例として、少なくとも10％高い、少なくとも15％高い、少なくとも20％高い、少なくとも25％高い、少なくとも30％高い、少なくとも35％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも100％高い、少なくとも150％高い、少なくとも200％高い、少なくとも250％高い、またはそれ以上高い)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの改変された核酸ベクターからの導入遺伝子発現は、改変を含まない対応する核酸ベクターからの導入遺伝子発現よりも、少なくとも1.5倍高い(例として、少なくとも2倍高い、少なくとも2.5倍高い、少なくとも3倍高い、少なくとも3.5倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも4.5倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも5.5倍高い、少なくとも6倍高い、少なくとも6.5倍高い、少なくとも7倍高い、少なくとも7.5倍高い、少なくとも8倍高い、少なくとも8.5倍高い、少なくとも9倍高い、少なくとも9.5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも10.5倍高い、少なくとも11倍高い、少なくとも11.5倍高い、少なくとも12倍高い、少なくとも12.5倍高い、少なくとも13倍高い、少なくとも13.5倍高い、少なくとも14倍高い、少なくとも14.5倍高い、少なくとも15倍高い、少なくとも15.5倍高い、少なくとも16倍高い、少なくとも16.5倍高い、少なくとも17倍高い、少なくとも17.5倍高い、少なくとも18倍高い、少なくとも18.5倍高い、少なくとも19倍高い、少なくとも19.5倍高い、少なくとも20倍高い、またはそれ以上高い)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの改変された核酸ベクターからの導入遺伝子発現は、改変を含まない対応する核酸ベクターからの導入遺伝子発現と比べて、変わらない。
パッケージング効率
いくつかの側面に従うと、本明細書に開示のAAV粒子のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子と比べて改変されている。AAV粒子のパッケージング効率は、特定のAAVカプシドの特定のウイルスのゲノムをカプシド化する能力を指す。パッケージング効率は、カプシドのウイルスのゲノムに対する比率を定量することなどによって、当業者によって測定され得る(例として、Grimm, et al. Gene Ther. 6:1322-1330 (1999)参照)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子(例として、改変されたカプシドタンパク質、改変された核酸ベクター、または、または改変されたカプシドタンパク質および改変された核酸ベクターの両方を含むAAV粒子)のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子のパッケージング効率よりも高い。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子のパッケージング効率よりも、少なくとも5％高い(例として、少なくとも10％高い、少なくとも15％高い、少なくとも20％高い、少なくとも25％高い、少なくとも30％高い、少なくとも35％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも100％高い、少なくとも150％高い、少なくとも200％高い、少なくとも250％高い、またはそれ以上高い)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子のパッケージング効率よりも、少なくとも1.5倍高い(例として、少なくとも2倍高い、少なくとも2.5倍高い、少なくとも3倍高い、少なくとも3.5倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも4.5倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも5.5倍高い、少なくとも6倍高い、少なくとも6.5倍高い、少なくとも7倍高い、少なくとも7.5倍高い、少なくとも8倍高い、少なくとも8.5倍高い、少なくとも9倍高い、少なくとも9.5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも10.5倍高い、少なくとも11倍高い、少なくとも11.5倍高い、少なくとも12倍高い、少なくとも12.5倍高い、少なくとも13倍高い、少なくとも13.5倍高い、少なくとも14倍高い、少なくとも14.5倍高い、少なくとも15倍高い、少なくとも15.5倍高い、少なくとも16倍高い、少なくとも16.5倍高い、少なくとも17倍高い、少なくとも17.5倍高い、少なくとも18倍高い、少なくとも18.5倍高い、少なくとも19倍高い、少なくとも19.5倍高い、少なくとも20倍高い、またはそれ以上高い)。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子(例として、改変されたカプシドタンパク質、改変された核酸ベクター、または改変されたカプシドタンパク質および改変された核酸ベクターの両方を含むAAV粒子)のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子のパッケージング効率よりも低い。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子のパッケージング効率と比べて、少なくとも5％(例として、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、またはそれ以上)減少している。
いくつかの態様において、本明細書に開示のAAV粒子のパッケージング効率は、対応する野生型AAV粒子と比べて改変されていない。
いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子の形質導入効率およびパッケージングの効率の両方は、対応する改変されていないAAV粒子または野生型AAV粒子(例として、同じ血清型のもの)と比べて改変されている(すなわち、増大または減少している)。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりのAAV粒子の免疫原性は、対応する改変されていないAAV粒子または野生型AAV粒子(例として、同じ血清型のもの)と比べて改変されている。
医薬組成物
本明細書に開示のAAV粒子のいずれか1つ、カプシドタンパク質、または核酸は、薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物内に含まれていても、または薬学的に許容し得る担体内に含まれていてもよい。用語「担体」は、AAV粒子、カプシドタンパク質、または核酸が、共に含まれるかまたはそれとともに対象に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる医薬の担体は、水および、石油（鉱油など）、植物油（落花生油、大豆油、およびゴマ油など）、動物油、または合成起源の油のそれらを包含する油などの滅菌された液体であり得る。生理食塩水溶液および水性のデキストロースおよびグリセリン溶液もまた、液体担体として採用され得る。
薬学的に許容し得る担体の非限定例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリル酸、平滑剤(タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油など)、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤(メチル-、エチル-、およびプロピル-ヒドロキシ-ベンゾアートなど)、およびpH調整剤(無機および有機酸ならびに塩基など)、およびそれらの溶液または組成物を包含する。
担体の他の例は、リン酸緩衝生理食塩水、HEPES緩衝生理食塩水、および注射用水を包含し、これらのいずれかは、塩化カルシウム二水和物、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、またはスクロースのうちの1以上と任意に組み合わせてもよい。使用されてもよい担体の他の例は、生理食塩水(例として、滅菌された、パイロジェンフリーの生理食塩水)、生理食塩水緩衝剤液(例として、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝剤、および重炭酸緩衝液)、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質(例えば、血清 アルブミン)、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを包含する。USPグレードの担体および賦形剤は、AAV粒子のヒト対象への送達に殊更有用である。
典型的には、かかる組成物は、少なくとも約0.1％以上の治療剤(例として、AAV粒子)を含有してもよいが、活性成分(単数または複数)のパーセンテージは、当然変化してもよく、および便宜上全製剤の重量または体積の約1または2％と約70％または80％以上との間であってもよい。当然ながら、各治療上有用な組成物における治療剤(単数または複数)(例として、AAV粒子)の量は、好適な投薬量が化合物のいずれかの所与の単位用量において得られるように調整されてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与のルート、製品の貯蔵寿命、ならびに他の薬理学的な考察などの要因は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって熟慮され、およびそのため、様々な投薬量および処置計画が設計されてもよい。
細胞を接触させる方法
いくつかの側面に従うと、細胞をAAV粒子と接触させる方法が、本明細書に提供される。細胞を接触させる方法は、例えば、培養中の細胞を、AAV粒子を含む組成物と接触させることを含んでもよい。いくつかの態様において、細胞を接触させることは、AAV粒子を含む組成物を細胞培養(例として、組織培養プレートまたはディッシュ上での細胞培養)の上清に添加すること、またはAAV粒子を含む組成物と細胞培養物(例として、懸濁細胞培養物)とを混合することを含む。いくつかの態様において、細胞を接触させることは、AAV粒子を含む組成物を細胞培養培地などの別の溶液と混合すること、および細胞を混合物とインキュベートすることを含む。
いくつかの態様において、細胞をAAV粒子と接触させることは、AAV粒子を含む組成物を、その中に細胞が位置づけられる対象またはデバイスに投与することを含む。いくつかの態様において、細胞を接触させることは、AAV粒子を含む組成物をその中に細胞が位置づけられる対象内に注射することを含む。いくつかの態様において、細胞を接触させることは、AAV粒子を含む組成物を直接細胞に、またはその中に、もしくはその中に細胞が存在する対象の組織に実質的に隣接して投与することを含む。
いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、薬理学的に有用な様式で対象に材料を提供することを意味する。いくつかの態様において、rAAV粒子は、経腸的に対象に投与される。いくつかの態様において、必須金属元素（単数または複数）の経腸投与は、経口である。いくつかの態様において、rAAV粒子は、非経口的に対象に投与される。いくつかの態様において、rAAV粒子は、皮下に、眼内に、硝子体内に、網膜下に、静脈内に(IV)、脳室内、筋肉内に、髄腔内に(IT)、大槽内に、腹腔内に、吸入を介して、局所的に、または1以上の細胞、組織、または器官への直接注射によって対象に投与される。いくつかの態様において、rAAV粒子は、肝動脈または門脈内への注射によって対象に投与される。
いくつかの態様において、AAV粒子の組成物は、疾患または状態を処置するために対象に投与される。本明細書に使用される、疾患を「処置する」という用語は、対象によって経験される疾患または障害の少なくとも1の兆候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。上記または本明細書の他の箇所に記載の組成物は、典型的には、有効量、すなわち、所望の結果を生じることができる量で対象に投与される。所望の結果は、投与される活性な薬剤に依存することになる。例えば、rAAV粒子の有効量は、発現コンストラクトを宿主の器官、組織、または細胞に移すことができる粒子の量であってもよい。治療的に許容し得る量は、疾患、例として、筋ジストロフィーを処置することができる量であってもよい。医学および獣医学の技術分野において周知であるように、いずれか1の対象についての投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される具体的な組成物、組成物中の活性成分(単数または複数)、投与の時間およびルート、一般的な健康状態、および並行して投与される他の薬物を包含する多くの要因に依存する。
いくつかの態様において、本明細書に開示の細胞は、対象から単離されたかまたは対象に由来する細胞である。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物の細胞(例として、哺乳動物から単離されたかまたは哺乳動物に由来する細胞)である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、筋組織などの対象の特定の組織から単離されたかまたは対象の特定の組織に由来する。いくつかの態様において、細胞は、筋細胞である。いくつかの態様において、細胞は、骨格筋細胞または平滑筋細胞である。いくつかの態様において、細胞は、in vitroである。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoである。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、対象内(例として、対象の組織内または器官内)にある。いくつかの態様において、細胞は、初代細胞である。いくつかの態様において、細胞は、細胞株(例として、不死化細胞株)からのものである。いくつかの態様において、細胞は、がん細胞または不死化細胞である。
いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、薬理学的に有用である様式で対象に物質を提供することを意味する。
ある状況において、皮下、眼内、硝子体内、網膜下、非経口的、静脈内(IV)、脳室内、筋肉内、髄腔内(IT)、大槽内、経口的、腹腔内、経口もしくは経鼻の吸入、または1以上の細胞、組織、または器官への直接注入法のいずれかによって、本明細書に開示のAAV粒子を本明細書に開示の好適に処方された医薬組成物に送達することが所望されるであろう。いくつかの態様において、投与は、静脈内注射などの全身性送達に好適なルートである。いくつかの態様において、投与は、筋肉内注射などの局所的送達に好適なルートである。いくつかの態様において、「投与すること」または「投与」は、薬理学的に有用である様式で材料を対象に提供することを意味する。
いくつかの態様において、対象に投与されるAAV粒子の濃度は、106粒子/mlから1014粒子/mlまで、または103粒子/mlから1015粒子/mlまでの範囲をとるオーダー、または、例えば、約106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、または1014粒子/mlなどのいずれかの範囲の間のいずれかの値であってもよい。いくつかの態様において、1013粒子/mlよりも高い濃度のAAV粒子が投与される。いくつかの態様において、対象に投与されるAAV粒子の濃度は、106ベクターゲノム(vgs)/mlから1014vgs/mlまで、または103vgs/mlから1015vgs/mlまでの範囲をとるオーダー、またはいずれかの範囲の間のいずれかの値(例として、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、または1014vgs/ml)であってもよい。いくつかの態様において、1013vgs/mlよりも高い濃度のAAV粒子が投与される。
AAV粒子は、単回用量として投与され得るか、または処置されるべき具体的な疾患または障害の治療を達成するために必要とされるであろうものとして2以上の投与に分けられ得る。いくつかの態様において、0.0001ml～10mlが、対象に送達される。いくつかの態様において、対象に投与されるAAV粒子の数は、対象の体重kgあたり106～1014vgsの範囲をとるオーダー、またはその間位のいずれかの値(例として、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、または1014vgs/kg)であってもよい。いくつかの態様において、対象に投与されるＡＡＶ粒子の用量は、1012～1014vgs/kgまでの範囲をとるオーダーであってもよい。いくつかの態様において、(例として、本明細書に記載のとおりの1以上のルートの投与を介して)対象に送達されるAAVrh74組成物の容量は、0.0001ml～10mlである。
いくつかの態様において、本明細書に開示の組成物(例として、AAV粒子を含むもの)は、対象に1回投与される。いくつかの態様において、組成物は、対象に複数回(例として、2回、3回、4回、5回、6回、またはそれ以上)投与される。対象への反復投与は、対象における疾患、障害、または状態の1以上の症状の処置する(例として、改善する、または緩和する)ために必要に応じて一定の間隔(例として、毎日、一日おき、週に2回、毎週、月に2回、毎月、6月毎、年に1回、またはそれより少ないかもしくはそれより多い頻度)で行われてもよい。
対象
本開示の側面は、ヒトまたは霊長目の非ヒト動物対象などの対象で;対象におけるin situでの宿主細胞で;または対象に由来する宿主細胞(例として、ex vivoまたはin vitro)で、使用するための方法に関する。霊長目の非ヒト動物対象の非限定例は、マカク(例として、カニクイザルまたはアカゲザル)、キヌザル、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンを包含する。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。他の例示の対象は、イヌおよびネコなどの飼育動物;ウマ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜類;およびマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。
いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療で処置され得る疾患または障害を有するか、または有すると疑われる。いくつかの態様において、対象は、筋疾患または障害を有するか、または有すると疑われる。筋疾患または障害は、典型的には、筋肉の発達、健康、維持および/または機能に関連する1以上のタンパク質の正常でない構造または機能をもたらすゲノムにおける1以上の突然変異(単数または複数)によって特徴付けられる。例示の筋疾患および障害は、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、多発性硬化症、筋ジストロフィー(例として、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、または1型肢帯筋ジストロフィー(LGMD)または2型LGMDなどのLGMD)、重症筋無力症、ミオパチー(例として、X連鎖性筋細管ミオパチー)、筋炎、末梢神経障害、または脊髄性筋萎縮症を包含する。
筋肉疾患および障害は、例として、実験室の試験および/または臨床医による評価を通じて特徴付けられ、および特定され得る。いくつかの態様において、対象は、筋細胞に関する疾患(例として、1以上の筋細胞またはそれに関連する遺伝子における遺伝子突然変異などの欠陥によって引き起こされる疾患)を有するか、または有すると疑われる。いくつかの態様において、対象から単離されるかまたは対象に由来する核酸(例として、対象からのゲノムDNA、mRNA、またはcDNA)は、配列決定(例として、Sangerまたは次世代配列決定)を介して、(例として、筋肉の発達、健康、維持、または機能に関連する遺伝子における)突然変異を含むことを特定される。
いくつかの態様において、筋肉の発達、健康、維持、または機能に関連する遺伝子は、ジストロフィン/DMD、SCN4A、DMPK、ACTA、TPM3、TPM2、TNNT1、CFL2、KBTBD13、KLHL30、KKLHL3、KLHL41、LMOD3、MYPN、MTM1、ネブリン、DNM2、TTN、RYR1、MYH7、TK2、GAA(α-グルコシダーゼ)、ClC1、LMNA、CAV3、DNAJB6、TRIM32、デスミン、LAMA2、COL6A1、COL6A2、COL6A3、またはDUX4である。いくつかの態様において、遺伝子は、ジストロフィン(DMD)またはMTM1である。いくつかの態様において、遺伝子は、MYOT、LMNA、CAV3、DNAJB6、DES、TNP03、HNRNPDL、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、FKRP、TTN、POMT1、ANO5、FKTN、POMT2、POMGnT1、DAG1、PLEC1、DES、TRAPPC11、GMPPB、ISPD、GAA、LIMS2、BVES、またはTOR1A1P1などのその突然変異が肢帯筋ジストロフィー(例として、LGMD1またはLGMD2)を引き起こすことが示されている遺伝子である。いくつかの態様において、対象は、筋肉の発達、健康、維持または機能に関連する1以上の遺伝子の突然変異を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示の方法は、筋肉の発達、健康、維持、または機能に関連する遺伝子の機能的形態を有する対象の細胞(例として、筋細胞)を提供する。
例
以下の例は、本発明の実例となる態様を実証するために包含されるものであり、これに限定されるとはみなされない。これらの例において開示された技法は、本発明の実施において十分に機能することが発見された技術を表すものであり、およびよってその実施に好ましい様式を構成することが考えられ得ることを当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の態様に多くの変更をすることができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
例1．初代ヒト骨格筋細胞において増大した形質導入効率を有するカプシド修飾された次世代AAVrh74ベクターの開発:筋ジストロフィーの遺伝子治療における関わり
AAVへの宿主免疫応答が投与されるAAVベクターの用量と直接的に相関することは益々明確になってきている。例えば、X連鎖性筋細管ミオパチーの遺伝子治療の治験において、1x1014vgs/kgまでのAAV8ベクターの用量は安全であることが示されているが、3x1014vgs/kgの用量は3人の患者において重度の合併症に関連しており、合併症は患者のうちの2人については致死的であると判明した(Hum. Gene Ther., 31: 787, 2020)。2x1014vgs/kgの用量のAAVrh74ベクターはデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する患者において十分な忍容性を有することが示されている(JAMA Neurol., 77: 1122-1131, 2020)が、著しく低いベクター用量で臨床的有効性を達成することが所望されるであろう。表面に露出した特定のチロシン(Y)残基のフェニルアラニン(F)への部位特異的変異誘発が、著しく効率的に用量を低減させ((Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105: 7827-7832, 2008; Mol. Ther., 18: 2048-2056, 2010)、かつより低い免疫原生である(Blood, 8: 121: 2224-2233, 2013)、次世代(「NextGen」)AAV2ベクターをもたらすことはこれまでに報告されていた。
全てではないがほとんどの表面に露出したY残基はAAVrh74において保存されていることから、対応するY733F単一突然変異体(「SM」)およびY733+447F二重突然変異体(DM)AAVrh74ベクターを生成した。EGFPレポーター遺伝子を発現するこれらのベクターの形質導入効率は、従来のHeLa細胞における野生型(「WT」)AAVrh74ベクターにおけるそれよりも、夫々約12倍までおよび約16倍まで、より高かった(図1A)。Y-F突然変異体ベクターは、不死化したマウス筋芽細胞のC2C12細胞株を形質導入することにおいてもまた著しく効率的であった(図1B)。表面に露出したトレオニン(T)のバリン(V)残基への部位特異的変異誘発の包含は、AAV2ベクターの形質導入効率をさらに増加させることがこれまでに報告されており(PLoS One, 8: e59142, 2013)、そのためY733+Y447F+T494V三重突然変異体(「TM」)ssAAVrh74ベクターをさらに生成し、それは初代ヒト骨格筋細胞における第1世代ssAAVrh74ベクターよりも約5倍まで、より効率的であった(図2)。
さらにまた、単一突然変異体T494V、K547R、およびN665R、三重突然変異体Y447+733F+N665RおよびY447+733F+K547R、および五重突然変異体Y447+733F+N665R+T494V+K547R ssAAVrh74ベクターを生成し、およびそれらの形質導入効率について試験した。三重突然変異体の各々は、五重突然変異体と同様に、野生型ssAAVrh74ベクターと比べて、HeLa細胞の増大した形質導入効率を示し、およびこれらの多重突然変異体の各々の形質導入効率は、Y733+447F+T494V三重突然変異体と同様であった(図3Aおよび3B)。マウスモデルの骨格筋においてin vivoで突然変異体ssAAVrh74ベクターの有効性を評価する研究が、目下進行中である。まとめると、これらの研究は、Next Gen AAVrh74ベクターの使用は、免疫抑制の必要性なしに、低用量で、潜在的に安全かつ有効なヒト筋ジストロフィーの遺伝子治療につながるであろうということを示唆する。
例2．初代ヒト骨格筋細胞における改善された導入遺伝子発現を伴うゲノム改変されたX世代一本鎖AAVrh74ベクターの開発
天然に存在するAAVは、一本鎖DNAゲノムを含有し、およびssDNAが転写不活性であり、かつssDNAを転写し得るRNAポリメラーゼがないため、ウイルス遺伝子の発現が乏しい。同様に、組換えssAAVベクターからの導入遺伝子発現レベルもまた、悪影響を受ける。ベクターゲノムの3’末端でのAAV逆方向末端反復(ITR)におけるD配列は、ssAAVベクターからの導入遺伝子発現を制限するのに重要な役割を担うことがこれまでに報告された(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10879-10884, 1997)。転写を抑制することが知られている、NF-κBネガティブ調節因子(NRF)について、AAV-ITR中のD配列において結合部位が同定された。左ITR(LC1)、または右ITR(LC2)におけるD配列のS配列での置換は、8倍までも改善された導入遺伝子発現を媒介する、X世代(「GenX」)ssAAVベクターをもたらした(J. Virol., 89: 952-961, 2015)。
本研究において、AAVrh74カプシドにおけるこれらの改変されたssAAVゲノムのカプシド化が導入遺伝子発現の増大にもまたつながるかどうかを評価した。HeLa細胞を、hrGFPレポーター遺伝子を発現するWT、LC1、およびLC2ベクターで、1,000、3,000、および10,000vgs/細胞の感染の多重度にて形質導入し、およびhrGFP蛍光を形質導入後72時間で定量した。図4Aに示されるこれらの結果は、D配列置換のないゲノムを包んだssAAVrh74ベクターと比べて、LC1およびLC2ベクターによって媒介される導入遺伝子発現の増大が夫々約5倍および約2.5倍である(p＜0.01)ことが記録された。これらのベクター各々で形質導入された細胞から単離された低分子量DNA試料のqPCR分析によって定量されたおよそ同様の数のベクターゲノムによって記録されたとおり、観察された導入遺伝子発現の増大は、LC1およびLC2ベクターの侵入の増大に起因するものではなかった(図4B)。これらのベクターからの導入遺伝子発現の程度もまた、これらのベクターの各々を1,000、3,000、および10,000vgs/細胞の感染の多重度で形質導入した初代ヒト骨格筋細胞において評価した。蛍光画像の定量は、従来のssAAVrh74ベクターからのものと比較して、ssLC1-AAVrh74ベクターは平均して約13倍の導入遺伝子発現の増大、およびssLC2-AAVrh74ベクターは平均して約5倍の導入遺伝子発現の増大を示した(図4C)。
NextGen AAV2およびAAV3血清型ベクターを用いたこれまでに公開された研究(Hum. Gene Ther. Meth., 27: 143-149, 2016)に基づき、NextGen AAVrh74カプシド内へのLC1およびLC2 GenX AAVゲノムのカプシド化がマウスモデルにおけるin vivoでの有意に高い遺伝子導入発現を達成することが実現可能であるであろうということが予期された。かかるベクターの有効性を試験するために、左ITRのD配列のS配列での置換を含むY733+Y447F+T494V三重突然変異体(「TM」)ssAAVrh74ベクターを生成し、およびゲノム改変のないTM ssAAVrh74およびWT ssAAVrh74ベクターと比較した。図5および図6A～6Bの結果は、ベクターから発現したhrGFPの蛍光顕微鏡法イメージング(図5)およびフローサイトメトリー(図6A～6B)による測定のとおり、突然変異体ssAAVrh74 ベクターと組み合わせたTM/D配列(「OptX」)が、WT ssAAVrh74ベクターと比べてHeLa細胞における導入遺伝子発現が約4倍高いことを示し、およびTM ssAAVrh74(D配列の置換なし)よりも導入遺伝子発現が約2倍高いことを示した。これらの所見は、筋ジストロフィーの遺伝子治療においてさらに低減した用量でのGenX AAVrh74ベクターの潜在的な使用と重要な関わりを有する。
例3．in vitroでの初代ヒト骨格筋細胞および全身投与後のin vivoでのマウス筋肉における形質導入効率の増大を伴う最適化された(OptX) AAVrh74ベクターの開発
AAV9ベクターを使用した1つの第I/II相臨床試験において、補体活性化および腎損傷および心肺機能不全を引き起こす血小板減少症などの重篤な有害事象が報告された。別の試験において、AAV9ベクターの使用において、典型溶血性尿毒症症候群に関与する急性腎臓障害および血小板減少症などのいくつかの重篤な有害事象、およびさらに最近では、患者の死亡もまた報告されている。Sarepta Therapeutics社は、AAVrh74ベクターを使用した第I/II相試験の結果を、嘔吐のみが有害事象とあり、AAVrh74ベクターは2x1014vgs/kgという高い用量で使用しても安全であること示す報告をしている。
先行する例に記載されるように、カプシド改変された次世代(「NextGen」)AAVrh74ベクターおよびゲノム改変されたX世代(「GenX」)AAVrh74ベクターは、それらの野生型(WT)対応物よりも著しく効率的である(Mol. Ther., 29: 159-160, 2021; Mol. Ther., 29: 184-185, 2021もまた参照)。本実施例において、2つの改変を組み合わせて最適化された(「OptX」)AAVrh74ベクターを生成した。OptX AAVrh74ベクターの形質導入効率を、in vitroで初代ヒト骨格筋細胞において評価した。結果は、これらの細胞の形質導入効率が、野生型AAVrh74ベクターのそれよりも、約5倍までも高いことを実証した。
WTおよびOptX AAVrh74ベクターの有効性もまた、全身投与後のマウス筋肉においてin vivoで評価した。図7A～7Dは、OptX AAVrh74ベクターの形質導入効率が、腓腹筋(GA;図7A)および前脛骨筋(TA;図7B)の筋肉において約5倍高かったことを実証する。興味深いことに、GA、TA、横隔膜および心臓の筋肉のいずれかにおけるWTまたはOptX AAVrh74ベクターの全ゲノムコピー数は、互いに有意差がなく(図7C)、OptX AAVrh74ベクターの形質導入効率において観察された増大がこれらのベクターの改善された細胞内輸送および核の輸送から結果として生じたであろうということを示唆する。
まとめると、これらの研究は、OptX AAVrh74ベクターの使用が、用量でのヒト筋ジストロフィーの安全かつ有効な遺伝子治療につながり得るということを示唆する。
例4．マウス骨格筋細胞株および初代ヒト骨格筋細胞における改善された導入遺伝子発現を伴うゲノム改変されたY世代(GenY)AAVrh74ベクターの開発
組換えssAAVベクターからの導入遺伝子発現レベルは、ssDNAが転写不活性であることの結果として、典型的には比較的低い。「X世代」(「GenX」)AAVベクターを形成するAAVベクターの左逆方向末端反復(ITR)におけるD配列の置換は、8倍までも改善された導入遺伝子発現を媒介するAAVベクターをもたらす(J. Virol., 89: 952-961, 2015)。GenX AAVrh74ベクターからの導入遺伝子発現の程度はまた、野生型(WT)AAVrh74ベクターからのそれよりも約5倍高い(Mol. Ther., 29: 184-185, 2021)。AAV2 D配列における遠位の10ヌクレオチドは、グルココルチコイド受容体結合要素(GRE)のコンセンサスハーフサイトと互いに部分的相同性を有しており、およびグルココルチコイド受容体シグナル伝達経路は、AAV2感染またはAAV2ベクター形質導入後に活性化される(Mol. Ther., 24: S6, 2016)。
現行の実施例において、D配列における遠位(核酸ベクターの末端に関して)の10ヌクレオチドの真正GREでの置換について、図8Aにおいて図式的に示される「Y世代」(「GenY」)ベクターと称される、AAVrh74ベクターからの導入遺伝子発現を増大させるその能力を評価した。WTおよびGenY AAVrh74ベクターからの導入遺伝子発現をC2C12マウス骨格筋細胞で評価した。GenY AAVrh74ベクターは、WT AAVrh74ベクターと比較して、平均して約2～3倍の導入遺伝子発現の増大であった(図8B)。導入遺伝子発現は、細胞の上皮成長因子受容体タンパク質チロシンキナーゼの特異的インヒビターである、チロホスチンでの前処置の後さらに約4～5倍増大した(図8B)。
WT、GenX、およびGenYベクターを、初代ヒト骨格筋細胞でも評価した。GenXおよびGenY AAVrh74ベクターからの導入遺伝子発現は、WT AAVrh74ベクターと比較して、夫々約4倍および約6倍高かった(図8C)。WT、GenX、またはGenY AAVrh74ベクターで形質導入された初代ヒト骨格筋細胞から単離された低分子量DNA試料のqPCRによる分析は、各ベクターで形質導入された細胞において同様のベクターゲノムコピー数を示しており(図8D)、観察された導入遺伝子発現の増大がGenXまたはGenYベクターのエントリーの増大に起因するものではないことが示される。
これらの研究は、カプシド改変されたNextGen + GenY (OptY) AAVrh74ベクターの併用が高いベクター用量の使用の必要性をさらに低減させることができ、これはヒトにおける筋ジストロフィーの安全かつ有効な遺伝子治療におけるOptY AAVrh74ベクターの潜在的な使用と重要な関わりを有することを示唆する。
例5．OptXおよびOptY AAVrh74ベクターのin vivoでの有効性
この実施例において、Y733+Y447F+T494V三重突然変異体(TM)カプシドおよびGenX(左ITRにおけるD配列のS配列での置換を有する)またはGenY(左ITRにおいてD配列の一部をGRE配列で置き換えた置換を有する)のいずれかの改変されたゲノムを含むAAVrh74ベクターの有効性を試験した。TM + GenXベクターは「OptX」と称され、およびTM + GenYベクターは「OptY」と称される。
OptXベクターを試験するために、C57BL/6マウスに、PBS、野生型AAVrh74粒子(「WT」)の用量またはOptX AAVrh74粒子(「OptX」)の用量のいずれかを静脈内に投与した。WTおよびOptX粒子の用量は、1x1012ウイルスゲノムと当量であった。粒子の投与8週後に、様々な組織を収集し、およびRNAを抽出した。逆転写定量PCR(RT-qPCR)を、ベクターから発現されたhrGFP mRNAについて行った。図9Aは、肝臓(斜線の縞模様のバー)、横隔膜(一色塗りのバー)、および心臓(白抜きのバー)における、μg全RNAあたりのhrGFPの量を示す。結果は、試験された組織にわたって値を集計したとき、OptX AAVrh74ベクターが、WT AAVrh74と比べて、マウス組織においておよそ2倍高いhrGFP発現を達成したことを実証する。図9Bは、内在性のβアクチン遺伝子発現と比べて算出したとき、横隔膜および心臓におけるOptX AAVrh74ベクターからの導入遺伝子発現は、WT AAVrh74ベクターからの導入遺伝子発現よりも、有意に高かったが肝臓ではそうではなかったことを示す。
図10Aおよび10Bは、PBS、WT AAVrh74粒子、またはOptX AAVrh74粒子を投与されたマウスからの試料におけるβアクチンmRNAの発現を示す。結果は、様々な試料間でのβアクチン発現に差異がないことを実証し、OptX粒子で処置されたマウスからの試料において測定された増大したhrGFP発現は、粒子の改善された特性に起因することを示している。
OptYベクターを試験するために、C57BL/6マウスに、PBS、TMカプシドタンパク質(「TM」)を伴うAAVrh74粒子の用量またはOptY AAVrh74粒子(「OptY」)の用量のいずれかを、静脈内に投与した。AAVrh74粒子の用量は1x1012ウイルスゲノムと当量であった。粒子の投与8週後に、様々な組織を収集した。組織切片を調製し、およびRNAを抽出した。組織切片の蛍光顕微鏡法は、TMのみの粒子と比べて、OptY粒子の投与後に、肝臓、腓腹筋(「GA」)および前脛骨筋(「TA」)においてhrGFP蛍光が増大することを実証した(図11A;蛍光を図11Bにおいて定量化した)。
図12に示される結果は、肝臓(斜線の縞模様のバー)、心臓(白抜きのバー)、横隔膜(塗りつぶされたバー)、腓腹筋(「GAの筋肉」;碁盤目状のバー)、および前脛骨筋(「TAの筋肉」;横線の縞模様のバー)におけるベクターゲノムのコピー数がTMのみのAAVrh74粒子で処置されたマウス(「TM」)対OptY粒子で処置されたマウス(「OptY」)において有意差がなかったことを実証する。これとは対照的に、AAVrh74ベクターからのhrGFP mRNA発現は、ある組織では異なった。図13に示されるとおり、hrGFP発現は、OptY粒子で処置されたマウスにおいて、TMのみの粒子で処置されたマウスと比べて、肝臓で減少し、横隔膜で増大し、腓腹筋で増大し、および前脛骨筋でわずかに増大した。
この例に提示された結果は、OptXおよびOptY AAVrh74ベクターが、マウスへの静脈内投与後にin vivoで改善された導入遺伝子発現プロファイルを達成することができることを実証する。
等価物および範囲
数個の本発明の態様が、本明細書に記載され、および、説明されているが、当業者は、本明細書に記載の、機能を実施するための、および/または、結果および/または１以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に心に描くであろう。および、かかるバリエーションおよび/または改変の各々は、本明細書に記載の本発明の態様の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および配置は、例示的であることを意味すること、および、実際のパラメータ、寸法、材料および/または配置は、本発明の教示が使用される特定の出願(単数または複数)に依存するであろうということを、容易に理解するであろう。
当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の態様に対する多くの等価物を認識するか、または、ルーチンな実験法を使用するだけでこれを確かめることができるであろう。したがって、上記の態様は、一例としてのみ提示されること、および添付の請求項およびそれに対する等価物の範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載されおよび特許請求される以外に実施され得ること、が理解されるべきである。本開示の本発明の態様は、本明細書に記載の、各々の個々の特色、系、物品、材料、キット、および/または方法に関する。加えて、かかる特色、系、物品、材料、キット、および/または方法の2以上の組み合わせは、かかる特色、系、物品、材料、キット、および/または方法が相互に不一致でない場合、本開示の範囲内に包含される。
すべての定義は、本明細書に定義されおよび使用される場合、辞書の定義、参照によって組み込まれる文献における定義、および／または定義される用語の通常の意味に優先することが理解されるべきである。
本明細書に開示の、すべての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して、参考により援用され、いくつかのケースにおいて、文献全体を包含し得る。
不定冠詞「a」および「an」は、本明細書および請求項に使用されるとき、それとは反対であることが明確に表されない限り、「少なくとも1の」を意味すると理解されるべきである。
句「および/または」は、本明細書および請求項に使用されるとき、等位接続される要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである(すなわち、いくつかのケースにおいて等位接続的に存在し、他のケースにおいて、選言的に存在する)。「および/または」とともに列挙される複数の要素は、同じ様式で解釈されるべきである（すなわち、そのように等位接続される要素の1以上）。具体的に同定されるこれらの要素に関連するか関連しないかにかかわらず、「および/または」節によって具体的に同定される要素以外の、他の要素は任意に存在してもよい。よって、非限定例として、「Aおよび/またはB」への参照は、「含む(comprising)」などのオープンエンドの言語との接続において使用される場合、一態様において、Aのみを指し得る(任意にB以外の要素を包含する)；別の態様において、Bのみを指し得る(任意にA以外の要素を包含する)；もう1つの態様において、AおよびBの両方を指し得る(任意に他の要素を包含する)；等々。
本明細書および請求項に使用されるとき、「または」は、上に定義されるとおりの「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分離する場合、「または」または「および/または」は、包括的であると解釈されるべきである(すなわち、要素の数またはリストのうち、少なくとも1つを包含するが、1を超えて包含し、および、任意に、追加の列挙されていない項目を包含する)。「のうち1つのみ」または「のうち厳密に1つ」、または、請求項において使用される場合「のみからなる」などの、それとは反対であることが明確に表される用語のみが、要素の数またはリストのうちの正確に1つの要素の包含を指す。一般に、用語「または」は、本明細書に使用されるとき、「のいずれか」、「のうちの1つ」、「のうちの1つのみ」または「のうち厳密に1つ」などの、排他的な用語が先行する場合、代替（すなわち、「両方ではなく、一方または他方」）を排除することを表すものとしてのみ解釈されるべきである。「のみから本質的になる」は、請求項において使用される場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するべきである。
本明細書および請求項に使用されるとき、句「少なくとも1の」は、1以上の要素のリストを参照して、要素のリスト中の要素のいずれか1以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素および全ての要素の少なくとも1つを必ずしも包含しなくてもよく、要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に同定されている要素に関連するかしないかにかかわらず、成句「少なくとも1つ」が参照する要素のリスト内に具体的に同定される要素以外の要素が任意に存在してもよいことを可能にする。
よって、非限定例として、「AおよびBの少なくとも1の」(または等価には、「AまたはBの少なくとも1の」または等価には、「Aおよび/またはBの少なくとも１の」）は、一態様において、任意に1より多くのAを包含し、Bが存在しない、少なくとも1つ(および任意にB以外の要素を包含する);別の態様において、任意に1より多くのBを包含し、Aが存在しない、少なくとも1つ(および任意にA以外の要素を包含する);もう１つの態様において、任意に1より多くのAを包含する少なくとも1つ、および、任意に1より多くのBを包含する少なくとも1つ(および任意に他の要素を包含する);等々を指し得る。
それとは反対であることが明確に表されない限り、1を超えるステップまたは行為を包含する、本明細書で特許請求されるいずれかの方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が記載される順序に必ずしも限定されない。
請求項において、ならびに、上記明細書において、「含む(comprising)」、「包含する(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」等などのすべての移行句は、オープンエンドであることが理解されるべきである（すなわち、包含するが、これに限定されないことを意味する）。移行句「のみからなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、合衆国特許庁特許審査便覧セクション2111.03に表されるように、夫々、クローズまたは半クローズの移行句であるべきである。オープンエンドの移行句（例として、「含む」）を使用するこの文献において記載される態様はまた、代替の態様において、オープンエンドの移行句によって記載される特徴「のみからなる」および「から本質的になる」として企図されることが理解されるべきである。例えば、本開示が、「AおよびBを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、「AおよびBのみからなる組成物」および「AおよびBから本質的になる組成物」の代替の態様を企図する。

Claims (42)

  1. 配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、カプシドタンパク質であって、ここでカプシドタンパク質は、AAVrh74血清型カプシドタンパク質であり、
    任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fである、
    前記カプシドタンパク質。
  2. 請求項1に記載のカプシドタンパク質を含む、AAVrh74粒子。
  3. 核酸ベクターをさらに含む、請求項2に記載のAAVrh74粒子であって、ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列は、S配列で置換されており、
    任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、
    前記AAVrh74粒子。
  4. 核酸ベクターをさらに含む請求項2に記載のAAVrh74粒子であって、ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、グルココルチコイド受容体結合要素(GRE)で置換されており、
    任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである、
    前記AAVrh74粒子。
  5. 請求項1に記載のカプシドタンパク質を含む、組成物。
  6. 請求項2～4のいずれか一項に記載のAAVrh74粒子を含む、組成物。
  7. 細胞を、AAVrh74粒子を含む組成物と接触させることを含む方法であって、ここでAAVrh74粒子は、カプシドタンパク質および核酸ベクターを含み、
    (i)ここでカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fであり、および/または
    (ii)ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む第1の逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、S配列で置換されており、任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、
    前記方法。
  8. 細胞を、AAVrh74粒子を含む組成物と接触させることを含む方法であって、ここでAAVrh74粒子は、カプシドタンパク質および核酸ベクターを含み、
    (i)ここでカプシドタンパク質は、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fであり、および/または
    (ii)ここで核酸ベクターは、第1のD配列を含む逆方向末端反復(ITR)および第2のD配列を含む第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列は、グルココルチコイド受容体結合要素(GRE)で置換されており、任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである、
    前記方法。
  9. カプシドタンパク質が、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fである、請求項7または8に記載の方法。
  10. 核酸ベクターが、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列が、S配列で置換されており、任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項7に記載の方法。
  11. 核酸ベクターが、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列が、GREで置換されており、任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである、請求項8に記載の方法。
  12. カプシドタンパク質が、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、かつ核酸ベクターが、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列または第2のD配列が、S配列で置換されている請求項7に記載の方法であって、
    任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fであり、および
    任意にここで、S配列は、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、
    前記方法。
  13. カプシドタンパク質が、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質のY447、T494、K547、N665および/またはY733に対応する位置でのアミノ酸置換を含み、かつ
    核酸ベクターが、第1のITRおよび第2のITRを含み、ここで第1のD配列および/または第2のD配列が、GREで置換されている、
    請求項8に記載の方法であって、
    任意にここで、置換は、Y447F、T494V、K547R、N665Rおよび/またはY733Fであり、および
    任意にここで、GREは、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである、
    前記方法。
  14. カプシドタンパク質が、配列番号1の野生型AAVrh74カプシドタンパク質の、以下に対応する位置でのアミノ酸置換:
    (a)Y447およびY733、任意にここで、置換は、Y447FおよびY733Fである;
    (b)Y447、Y733、およびN665、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、およびN665Rである;
    (c)Y447、Y733、およびT494、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、およびT494Vである;
    (d)Y447、Y733、およびK547、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、およびK547Rである;または
    (e)Y447、Y733、N665、T494、およびK547、任意にここで、置換は、Y447F、Y733F、N665R、T494V、およびK547Rである、
    を含む、請求項7～13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 第1のITRおよび第2のITRが、それぞれAAV2血清型ITRまたはAAV3血清型ITRである、請求項7～13のいずれか一項に記載の方法。
  16. 第1のD配列が、S配列で置換されているか、または第1のD配列が、GREで置換されている、請求項7～15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 第2のD配列が、S配列で置換されているか、または第2のD配列が、GREで置換されている、請求項7～15のいずれか一項に記載の方法。
  18. S配列が、ヌクレオチド配列TATTAGATCTGATGGCCGCT(配列番号17)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、または
    GREが、ヌクレオチド配列AGAACANNNTGTTCT(配列番号18)、またはその逆もしくは逆相補を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなり、ここで各Nは、独立して、T、C、G、またはAである、
    請求項7～17のいずれか一項に記載の方法。
  19. AAVrh74粒子の形質導入効率が、野生型AAVrh74粒子よりも少なくとも2倍高い、請求項7～18のいずれか一項に記載の方法。
  20. AAVrh74粒子のパッケージング効率が、野生型AAVrh74粒子と比べて減少している、請求項7～19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 組成物が、薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項7～20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 細胞が、哺乳動物の細胞である、請求項7～21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 細胞が、筋細胞である、請求項7～22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 細胞が、骨格筋細胞である、請求項7～23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 細胞が、腓腹筋の細胞であるかまたは前脛骨筋の細胞である、請求項7～23のいずれか一項に記載の方法。
  26. 核酸ベクターが、調節要素を含む、請求項7～25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 調節要素が、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、応答要素、開始部位、終結シグナル、またはリボソーム結合部位を含む、請求項26に記載の方法。
  28. プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項27に記載の方法。
  29. プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項27に記載の方法。
  30. プロモーターが、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーター、または合成プロモーターである、請求項27～29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 核ベクターが、関心のある遺伝子のヌクレオチド配列を含む、請求項7～30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 関心のある遺伝子が、治療用タンパク質または診断用タンパク質をコードする、請求項31に記載の方法。
  33. 接触させることが、in vivoでなされる、請求項7～32のいずれか一項に記載の方法。
  34. AAVrh74粒子を含む組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
  35. 細胞が、対象におけるものである、請求項34に記載の方法。
  36. 対象が、ヒトである、請求項34または35に記載の方法。
  37. 対象が、筋疾患を患うリスクがあるかまたは患っており、任意にここで、筋疾患は、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ミオパチー、筋炎、末梢神経障害、または脊髄性筋萎縮症である、請求項34～36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 筋疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーであり、任意にここで、対象が、ジストロフィン遺伝子内に突然変異を有する、請求項37に記載の方法。
  39. 筋疾患が、肢帯筋ジストロフィーである、請求項37に記載の方法。
  40. 筋疾患が、X連鎖性筋細管ミオパチーであり、任意にここで、対象が、MTM1遺伝子内に突然変異を有する、請求項37に記載の方法。
  41. 組成物が、皮下注射によって、筋肉内注射によって、静脈内注射によって、腹腔内注射によって、または経口的に対象に投与される、請求項34～37のいずれか一項に記載の方法。
  42. 接触させることが、in vitroまたはex vivoでなされる、請求項7～32のいずれか一項に記載の方法。
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