JP2024512824A - コロナウイルスの治療 - Google Patents

Abstract

コロナウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防のための、シレンジタイドまたはその機能的変異体のようなαＶβ３インテグリンアンタゴニストの使用が記載されており、特に、シレンジタイドが静脈内または経口的に対象者に投与される。

Description

本発明は、コロナウイルスの治療および予防のための治療戦略に関する。具体的には、本発明は、コロナウイルス、より具体的にはコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）によって引き起こされる疾患の治療または予防方法において使用するための、αＶβ３インテグリンアンタゴニストに関する。

前例のない現在進行中のコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）パンデミックは、全世界の人々に深刻な衝撃を与えている。世界的な死者数が増え続ける中、ワクチン候補、標的を絞った効果的な抗ウイルス・免疫療法が切実に求められている。

他のコロナウイルスによる疾患と比較して、ＣＯＶＩＤ－１９は心血管系により多くの悪影響を及ぼす。重症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症において、深部静脈血栓症やおよび肺塞栓症が高率で発生している（Klok FA, et al., Incidence of thrombotic complications in critically ill ICU patients with COVID-19, Thromb Res. 2020; 191: 145-7）。一方、脳卒中、心筋梗塞、播種性血管内凝固障害を伴うＣＯＶＩＤ－１９の報告もある（Oxley TJ, et al., Large-Vessel Stroke as a Presenting Feature of Covid-19 in the Young, N Engl J Med. 2020; 382(20): e60）．さらに、肺内の微小血管閉塞がＣＯＶＩＤ－１９の発症に重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が蓄積されている。検死研究において、致死的ＣＯＶＩＤ－１９患者では肺血管系全体に微小血栓が広がっていることが証明されている（Wichmann D, et al. Autopsy Findings and Venous Thromboembolism in Patients With COVID-19: A Prospective Cohort Study, Ann Intern Med. 2020; 173(4): 268-77）、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の右心室機能障害は一般的である（Giustino G, et al. Characterization of Myocardial Injury in Patients With COVID-19, J Am Coll Cardiol. 2020; 76(18): 2043-55）．ＣＯＶＩＤ－１９の剖検研究から得られたデータから、肺微小血管系におけるタイトジャンクションの完全性の喪失とともに、顕著な内皮細胞のアポトーシスが見出された。一方、電子顕微鏡による研究では、肺内皮細胞内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子が確認されており、肺内皮細胞の直接感染がＣＯＶＩＤ－１９に関連する血管症の引き金として重要であることが示唆されている（Varga Z, et al., Endothelial cell infection and endotheliitis in COVID-19, Lancet. 2020; 395(10234): 1417-8）．

血管内皮細胞はウイルスの増殖に不可欠であるが、この経路の背後にある機序の解明はいまだ手つかずのままである。ＣＯＶＩＤ－１９の病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、以前のコロナウイルスよりもはるかに感染力が強い。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がこれまでのコロナウイルスにはない新しい特徴を持っていることは明らかであり、それが広範囲なパンデミックをもたらした。研究の結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質が宿主の認識およびウイルスの付着に大きく関与しており、その受容体結合ドメインを介して宿主の受容体であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と相互作用することが明らかになった。

しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質における新規のＫ４０３Ｒ変異は、ＡＣＥ２認識部位の外側にユニークなＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを形成している。

内皮バリアにはインテグリンが多く存在し、主要な内皮細胞インテグリンであるαＶβ３は、多数のＲＧＤ含有リガンドを認識することができる。このインテグリンは、細胞外マトリックス全体の種々のタンパク質（フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなど）と相互作用する結合ポケットを有し、接着、細胞遊走、増殖、血管新生を調節する機能を有する。

米国特許出願公開第２０２０／０２８９５３４号明細書は、１種または複数種の抗ウイルス薬を含む生体適合性薬剤を投与することを含む、病状を治療、軽減、緩和する方法を記載している。この薬剤とともに投与されるものは、無毒性の半フッ素化アルカンに溶解した１種または複数種の細胞経路阻害剤である。記載されている病状の例には、１種または複数種の気道炎症性疾患が含まれる。阻害剤は炎症を起こした組織の炎症反応をブロックし、アルカンは投与時に蒸発するため、生体適合性のある薬剤を所望の治療部位に残すことができると記載されている。オセルタミビル、バリシチニブ、およびＧＳＫ阻害剤、ならびにＣＯＶＩＤ－１９ Ｓタイマーを経鼻投与し、引き続いて１日３～４回の半フッ素化アルカン中での深呼吸を３日間にわたって行うことにより、対象者を予防的に処理するコロナウイルスおよび予防を議論する１つの例が存在する。対象者はコロナウイルスの徴候なしに旅行から帰還した。この例に関するデータおよび詳しい結果は発表されていない。この文献では、多くの細胞経路阻害剤の１種としてシレンジタイドを挙げているが、呼吸器系症状に対してαＶβ３インテグリンを使用したデータはなく、コロナウイルス様の症状に対してシレンジタイド（cilengitide）を使用したデータもない。

本発明は、αＶβ３インテグリンアンタゴニストを含む、コロナウイルスに起因する疾患の治療および予防のための治療戦略を提供する。

驚くべきことに、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が、その受容体結合ドメインなかの新規のＫ４０３Ｒ変異を通じて、宿主への接着を媒介するためにヒト内皮αＶβ３インテグリンを利用することを示した。これは、これまでに当技術分野では示されていなかった。

この進化的変異（すなわちＫ４０３Ｒ）を開発することにより、追加の結合部位（ＲＧＤ）を有するスパイクタンパク質を提供する。本発明者らは、宿主へのウイルス付着を強化し、より高い伝播率をもたらすことにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の病原性が増大する可能性があることを示唆する。さらに、ＡＣＥ２およびαＶβ３インテグリンレセプターの両方がヒトの血管系全体に豊富に存在し、ウイルスの侵入経路の可能性を提供すると同時に、二重のレセプター機構によって宿主全体に広がることを促進する。

本発明者らは、αＶβ３を介してヒト血管系に結合すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が重大な内皮調節障害を引き起こし、その結果、バリア機能／完全性の喪失をもたらし、ショックと主要臓器への二次感染の播種を促進することを証明した。ウイルスによってもたらされるこの有害な影響は、主要な内皮細胞インテグリンαＶβ３との相互作用を阻止することによって、著しく軽減される可能性がある。このことは、従来技術では開示も予測もされていなかった。

さらに、これらのデータは、シレンジタイドが、ヒト血管内皮細胞へのウイルス付着の防止に関して予期せぬ有益な挙動を示し、当該挙動は、他のインテグリンアンタゴニストの挙動とは異なることを示唆する（図８）。

第１の態様において、本発明は、対象者におけるコロナウイルス感染の治療または予防の方法において使用するためのαＶβ３インテグリンアンタゴニスト（「本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニスト」）を提供する。

１つの実施形態では、コロナウイルスは、スパイクタンパク質の受容体結合ドメインにＫ４０３Ｒ変異を含み、ＲＧＤドメインを提供するものである。

好ましくは、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）である。

好ましくは、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象者はＣＯＶＩＤ－１９の疾患または病態を有する。

１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは、αＶβ３受容体の強力な阻害剤である。
１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは、αＶドメインに特異的である。
１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは、αＶインテグリンに特異的なものである。
１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは、αＶβ、好ましくはαＶβ３に特異的なものである。

好ましくは、αＶβ３アンタゴニストはＲＧＤ配列またはモチーフを含むものである。

１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストはペプチドである。１つの実施形態において、ペプチドは環状ペプチドである。

実施形態において、環状ペプチドは、シレンジタイド（cilengitide）およびシレンジタイドの変異体または誘導体から選択される。

１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは抗体またはそのフラグメントである。１つの実施形態において、抗体またはフラグメントは、αＶドメインに特異的である。１つの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。１つの実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。１つの実施形態では、抗体はナノボディである。

１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは低分子量アンタゴニストである。低分子量αＶβ３アンタゴニストの例は、シレンジタイドのようなペプチド、およびＩＳ２０１のようなペプチド模倣物（peptidomimetics）である。

１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは、アンタゴニストを含む組成物として製剤化される。組成物を、経口投与または静脈内投与のために製剤化してもよい。組成物を、肺投与用に製剤化してもよい。

組成物は医薬組成物であってもよい。このような組成物は、１種または複数種の薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでもよい。

コロナウイルス感染の治療または予防方法を提供し、前記方法は、αＶβ３アンタゴニストを対象者に投与することを含む。αＶβ３インテグリンアンタゴニストは、本明細書に記載のものである。コロナウイルスは、本明細書中に記載されるとおりである。

本発明は、添付の図面を参照して例示のためにのみ与えられる、その実施形態の以下の説明からより明確に理解されるであろう：

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒト上皮細胞に結合し、透過性を引き起こす。（Ａ） ＭＯＩ＝０．４において固定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に接着させたヒト大腸上皮細胞株Ｃａｃｏ－２。細胞を固定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に接着させ、細胞内に発現するアルカリホスファターゼに対する蛍光基質ｐＮＰＰで溶解させた。ｐＮＰＰが発する蛍光シグナルは、接着した細胞数に相関し、４０５ｎｍにおいて読み取りを行った。上皮細胞はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と有意に相互作用した（Ｐ＜０．００１；対応ｔ検定、Ｎ＝３）。（Ｂ） Ｃａｃｏ－２をトランスウェルインサートに播種し、ＭＯＩ＝０．４においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。フロオレセインイソチオシアネート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン、４０ｋＤａ）を用いて、０時間、２４時間、４８時間にわたって、透過性を測定した。ＦＩＴＣ－デキストランは上皮細胞を通過して下部チャンバーに入り、その透過性に比例する。透過性の程度は、４９０／５２０ｎｍにおけるＦＩＴＣ－デキストランの蛍光レベルを定量することにより測定した。細胞透過性は時間経過を通して有意に増加した（Ｐ＜０．０１；Ｐ＜０．０００１；分散分析（ANOVA）、Ｎ＝３）。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の塩基配列の比較により、新規のＫ４０３Ｒ変異が強調された。（Ａ） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の全体的な概略図は、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、ＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）、サブドメイン１（ＳＤ１）、サブドメイン２（ＳＤ２）を示す。ＲＧＤモチーフは受容体結合ドメイン内に存在するが、ＡＣＥ２結合領域（ＲＢＭ）のために隣接している。（Ｂ） ＥＭＢＬ－ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いたペア配列アラインメントにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を対比している。同一アミノ酸を（＊）、非同一アミノ酸を（－）、ＲＧＤモチーフを（黄色）、ＲＢＭ領域を（青色）で示す。 αＶβ３との複合体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のイン・シリコ予測構造。ドッキングを行って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＧＤモチーフがインテグリンαＶβ３のＲＧＤポケットに結合するかどうかを決定した。（Ａ） ＲＧＤリガンド（青）を強調したサイドパネルを用いて、インテグリンαＶβ３（ＰＤＢ：ＩＬ５Ｇ）を可視化した（黄色）。（Ｂ） 新規ＲＧＤモチーフ（桃色）が配置されるサイドパネルを用いて、スパイクタンパク質（ＰＤＢ：６ＶＸＸ）を可視化した（紫色）。（Ｃ） スパイクタンパク質－αＶβ３の複合体から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＧＤモチーフが、αＶβ３が任意のＲＧＤリガンドと結合するために形成するのと同一の結合ポケットに収まることが明らかになった。タンパク質構造はＰｙＭｏｌを用いて構築した。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＧＤモチーフはヒト内皮細胞との相互作用を媒介する。（Ａ） 精製ウイルススパイクタンパク質と内皮インテグリンタンパク質との相互作用を免疫蛍光結合アッセイにて評価した。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を固定化し、抗αＶβ３蛍光抗体（ＬＭ６０９－ＡＦ４８８、１：１００）を用いてαＶβ３タンパク質との結合を測定した。結合は４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより分析した。αＶβ３に結合したスパイクタンパク質は有意な相互作用を示した（Ｐ＜０．０００１；対応ｔ検定、Ｎ＝３）。（Ｂ） イン・ビトロ感染モデルを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の内皮細胞への接着能を調べた。剪断したヒト大動脈内皮細胞をサイトカインＴＮＦαで活性化し、ＣＯＶＩＤ－１９敗血症煮て経験する状態と同様の炎症状態を誘起した。１０倍毎増量（０．０５μＭ～０．０００５μＭ）にて、シレンジタイドを投与した。ｐＮＰＰ結合アッセイは、４０５ｎｍで測定した蛍光シグナルによる結合率を示した。無薬物対照と各シレンジタイド投与群との間に統計的有意性が認められた。０．０００５μＭで宿主－ウイルス相互作用が消失したため、以後の実験に最適な濃度として選択した（Ｐ＝０．００１、分散分析（ANOVA）、Ｎ＝３）。 血管調節異常はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時に起こり、αＶβ３アンタゴニストであるシレンジタイドを用いて防ぐことができる。処理した内皮細胞および未処理の内皮細胞をトランスウェルインサートに播種、剪断、活性化し、イン・ビボで血管系が経験する血流およびストレスの生理的条件をシミュレートした。シレンジタイド処理（０．０００５μＭ）の後、細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を２４時間にわたって接種した。フロオレセインイソチオシアネート－デキストラン（ＦＩＴＣ－デキストラン、４０ｋＤａ）を添加し、ＦＩＴＣ－デキストランはバリアーの透過性に比例して内皮細胞単層を通過し、下部のチャンバーに入った。透過性の程度は、４９０／５２０ｎｍにおけるＦＩＴＣ－デキストランの蛍光レベルを定量することによって測定した。透過性レベルの有意な上昇は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のバリア完全性の深刻な喪失を示したが、シレンジタイドで細胞を処理すると回復した（Ｐ＝０．００５；分散分析（ANOVA）、Ｎ＝３）。 血管調節異常はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時に起こり、αＶβ３アンタゴニストであるシレンジタイドを用いて防ぐことができる。免疫蛍光顕微鏡を用いて、剪断および活性化された内皮細胞における血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン）の発現を評価した。処理細胞には０．０００５μＭのシレンジタイドを投与した。感染細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を２４時間にわたって接種した。細胞接合を、核染色のための抗ＶＥカドヘリン抗体（緑）および４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（青）で染色した。スケールバーは５０μｍである。非感染細胞は、最初に倍率２０倍の逆位相差顕微法（inverted phase-contrast microscopy）で可視化してせん断結合を観察し（左上）、倍率４３倍の蛍光顕微法を用いて非感染細胞と比較した。感染した内皮細胞は、ＶＥ－カドヘリンの発現低下により、単層結合を失った（左下）。ウイルスのＲＧＤから宿主のαＶβ３への経路をシレンジタイドで遮断すると、バリアの完全性が再確立した（右下）。 血管調節異常はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染時に起こり、αＶβ３アンタゴニストであるシレンジタイドを用いて防ぐことができる。未感染細胞、感染細胞、処理した細胞におけるＶＥ－カドヘリン濃度をバリア完全性のマーカーとして評価し、平均蛍光に基づいて定量した。ウイルス感染後の血管系は、ＶＥ－カドヘリンの発現が有意に低下したため、深刻な血管漏れを起こした。シレンジタイドで処理すると、バリア透過性は非感染のレベルにまで回復した（Ｐ＝０．０２；分散分析（ANOVA）、Ｎ＝３）。 イン・ビトロ感染モデルにおいて、シレンジタイドはヒト大腸上皮細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を効果的に減少させた。Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 精製インテグリンαＶβ３へのスパイクタンパク質の結合。αＶβ３抗体およびβ３抗体の両方が、スパイクタンパク質のαＶβ３への結合を阻害することができ、レセプター間の有意な相互作用が明らかになった。シレンジタイドは０．０００５μＭで組換えスパイクタンパク質とαＶβ３との結合を阻害した。 非ＲＧＤ結合性インテグリンアンタゴニスト化合物ＧＬＰＧ０１８７との比較が、シレンジタイドはインテグリンαＶβ３への組換えスパイクタンパク質の結合を減少させるのに著しく効果的であることが明らかにした。非ＲＧＤ結合性インテグリンアンタゴニストであるＳＢ－２７３００５を用いたイン・ビトロ感染アッセイでは、ヒト内皮細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を減少させることはできなかった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、血管内皮は、細胞外から細胞内へのＶＥ－カドヘリンの移動によって確認される重度の単層機能不全に陥る。イン・ビトロ感染モデルにおいて、ＶＥ－カドヘリンの内在化は、シレンジタイドの存在下で阻止された（０．０００５μＭ）。ＶＥ－カドヘリン総量は、健常細胞、感染細胞、処理細胞のいずれにおいても一貫しており、ＶＥ－カドヘリンの転位パターンが明らかになった。Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ＮＳ＝有意ではない。 図１０： α－、β－、γ－、δ－およびο（オミクロン）－スパイクタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体をアラインメントし、４０３－４０５のＲＧＤ部位の保存を示す。ο－スパイクタンパク質とδ－スパイクタンパク質のイン・シリコモデリングにより、ο－スパイクタンパク質のＲＧＤモチーフは、δ－スパイクタンパク質よりも溶媒の外側に伸びていることが明らかになった。カラーキー：ο－スパイクタンパク質（黄色）、δ－スパイクタンパク質（桃色）。

本明細書に記載されたすべての刊行物、特許、特許出願およびその他の文献は、その全体が参照により本明細書の一部となすものとし、それぞれの刊行物、特許または特許出願が参照による組み込みが具体的かつ個別に示され、その内容がすべて記載されているものとする。

その最も広い意味において、本発明は、対象者におけるコロナウイルスの治療または予防方法に使用するためのαＶβ３インテグリンアンタゴニストを提供する。それは、コロナウイルスによって引き起こされる対象者の疾患または状態の治療または予防のためであってもよい。

典型的には、コロナウイルスは、バリア機能の喪失に関連するウイルスである。特筆すべきことには、コロナウイルスが心血管系に影響を及ぼすウイルスであることである。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、凝固亢進、血小板活性化、内皮機能不全を伴う急性炎症効果を誘発する。その他の心血管系への影響または症状は、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、播種性血管内凝固障害、肺血管系における微小血栓や右心室機能障害などの肺における微小血管閉塞などの１つまたは複数を含むが、これらに限定されるものではない。

注目すべきことには、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患がＣＯＶＩＤ－１９であることである。コロナウイルスはスパイクタンパク質にＲＧＤドメインを有するものである。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の変異体であってもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいくつかの懸念される変種（ヒトに重篤な疾患を引き起こす変種）が現在知られており、任意の変種が本明細書に包含される。変種はまた、スパイクタンパク質中にＲＧＤドメインを有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の人獣共通感染症変異体またはバージョンであってもよい。たとえば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２クラスター５すなわち「ミンクバリアント」、ＶＯＣ ２０２０／２１すなわち「ＵＫバリアント」、５０１Ｙ．Ｖ２すなわち「南アフリカ（ＳＡ）バリアント」およびＢ．１．１．２８（Ｅ４８４Ｋ）すなわち「ブラジルバリアント」を含むが、これらに限定されない。α－変種、β－変種、γ－変種、δ－変種またはο（オミクロン）－変種であってもよい。このような変種は、当技術分野で識別可能である。

本発明者らは、懸念されるα－、β－、γ－、δ－またはο－スパイクタンパク質のすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体が、４０３－４０５のＲＧＤ部位の保存を示すように整列することを示した（図１０）。

αＶβ３インテグリンアンタゴニストは、治療上有効な量のアンタゴニストである。

特に、コロナウイルスは、スパイクタンパク質のアミノ酸配列にＲＧＤ部位またはモチーフが存在するウイルスである。スパイクタンパク質の配列は以下の通りである：＞ＱＨＤ４３４１６．１表面糖タンパク質［重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２；配列番号３］。

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT

上記配列において、ＲＧＤ部位は、太字および黄色で強調表示され、下線が引かれている。ＲＧＤ部位は、対象者内の内皮細胞上のαＶβ３インテグリンにウイルスが結合することを可能にする。内皮細胞は典型的には任意の血管内皮細胞である。

１つの態様において、本発明のアンタゴニストは、対象者におけるコロナウイルス感染、たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防する、または重症度を軽減するための予防薬として使用される。この文脈において、対象者に対するαＶβ３インテグリンアンタゴニストの投与により、ウイルスが内皮細胞に付着して内皮機能障害を引き起こすのを防止する。

感染を予防するために、任意の時点で、対象者にアンタゴニストを投与できる。対象者がコロナウイルスの既知の症例、またはその疑いのある症例に暴露されたことを認識したとき、または対象者がその疾患を発症する危険性があるときに、対象者にアンタゴニストを投与できる。投与は、直ちに、たとえば暴露時または暴露が疑われる時点で開始すべきである。投与は、暴露または暴露の疑いから１時間以内、１２時間以内、２４～４８時間以内、または７日以内に行うことができる。

１つの態様において、本発明のアンタゴニストは、対象者におけるコロナウイルス感染、たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療するために使用される。対象者に対するαＶβ３インテグリンアンタゴニストの投与により、対象者の内皮細胞（たとえば血管内皮細胞）へのウイルスの付着および侵入を防止し、したがって血管損傷またはさらなる血管損傷が防止される。ウイルスは反管腔側でαＶβ３と結合し、内皮細胞を開放して漏出を引き起こし、すべての病原体が血流に播種されることを可能にする。

この治療法は、バリア機能の喪失をもたらすウイルスの結合に関連した内皮細胞の損傷および調節障害を阻止する。これはウイルスおよび日和見菌の体内への播種に関わる重要な問題であり、コロナウイルス感染でみられる心血管系への影響の主要な症状発現である。これは敗血症を引き起こす恐れがある。

ＶＥ－カドヘリンは、無傷の内皮層を維持する上で重要な役割を果たす重要なタイトジャンクションタンパク質である。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染すると、内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリンの表面発現が著しく減少することを発見した。ウイルスはαＶβ３インテグリンを活性化し、ＶＥ－カドヘリンのリン酸化および内在化をもたらす。本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストは、感染時のＶＥ－カドヘリンの減少を防ぐことにより作用する。

対象者は、本発明の治療、または本発明のアンタゴニストを任意の時点で受けることができる。対象者が、コロナウイルスの既知の症例またはその疑いのある症例に暴露されたことを認識するようになったとき、または対象者がその疾患を発症する危険性があるとき、または対象者が一旦陽性と判定されたとき、および／またはその疾患の症状を呈しているときに、対象者はアンタゴニストを受容することができる。治療は、対象者が病院に到着した時、病院に到着してから１時間以内、１２時間以内、２４～４８時間以内とすることができる。

「対象者」は任意の人であってもよい。１つの実施形態において、対象者は、コロナウイルスによって引き起こされる疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）を発症する危険性のある人、たとえば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への暴露が知られている濃厚接触者であってもよい。対象者は、ＣＯＶＩＤ－１９のようなコロナウイルスによって引き起こされる疾患と診断された、またはその症状を示す対象者と接触した、典型的には密接な接触があったために危険な状態にある可能性がある。対象者は、コロナウイルス、たとえばＣＯＶＩＤ－１９の疾患または感染が疑われる者、または前記疾患の症状を呈している者、および／または前記疾患に対して陽性反応を示した者であってよい。対象者は任意の年齢層でもよい。対象者は６５歳以上の対象者であってもよい。対象者は、免疫低下者であってもよい。対象者は、医師、看護師、介護士などの病院職員を含む介護従事者であってもよい。

用量および回数は、対象者および／または疾患の重症度に応じて、任意の適切な用量および回数であり得る。本発明の実施において、採用されるαＶβ３インテグリンアンタゴニストの量または用量範囲は、典型的には、本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストに関連する生理学的応答を効果的に誘導、促進、または増強するものである。１つの態様において、用量範囲は、採用される本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストが、コロナウイルス感染またはコロナウイルスによって引き起こされる疾患に罹患しているか、またはコロナウイルス感染またはコロナウイルスによって引き起こされる疾患を発症する実質的な危険性がある患者において、医学的に有意な効果を誘導、促進、または増強するように選択される。

使用において、用量または量は、毎日１回投与してもよいし、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、６日おき、７日おきに１回投与してもよい。単回投与でも反復投与でもよい。投与は、毎週、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月ごとに行うことができる。２～１４日間、毎日投与することもできる。

治療のための使用では、感染または診断後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日目の少なくとも１つであってもよい、または代替的に、１週目、２週目、３週目、４週目、５週目、６週目、７週目、８週目、９週目、１０週目、１１週目、１２週目、１３週目、１４週目、１５週目、１６週目、１７週目、１８週目、１９週目もしくは２０週目のうちの少なくとも１回、またはそれらの任意の組み合わせで、単回投与、連続投与または分割投与、のそれぞれまたはそれらの任意の組み合わせを使用する。

治療は、約０．１９ｎｇ／ｋｇ以下の量の本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストの１日投与量を対象者に投与することによって提供され得る。

１つの実施形態では、治療上有効な量は１００ｍｇ／ｍ^２未満である。「ｍｇ／ｍ^２」は、体表面積１ｍ^２毎のｍｇ数を意味し、体表面積の計算方法は、www.halls.md/body-surface-area/bsa.htmに記載されている。

１つの実施形態では、治療上有効な量は５０ｍｇ／ｍ^２未満である。１つの実施形態では、治療上有効な量は１０ｍｇ／ｍ^２未満である。１つの実施形態において、治療上有効な量は５ｍｇ／ｍ^２未満である。１つの実施形態において、治療上有効な量は、１ｍｇ／ｍ^２未満である。１つの実施形態では、治療上有効な量は、０．００１～５０ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態において、治療上有効な量は、０．００１～１０ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態において、治療上有効な量は、０．００１～１．０ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態において、治療上有効な量は、０．０１～１０ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態において、治療上有効な量は、０．１～１０ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態において、治療上有効な量は、０．００１～１．０ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態では、治療上有効な量は０．０１～１ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態では、治療上有効な量は０．１～１ｍｇ／ｍ^２である。１つの実施形態では、治療上有効な量は、１日１回、２～１４日間にわたって投与される。

１つの実施形態では、１０ｍｇ／ｍ^２以下の投与量が患者に投与される。１つの実施形態において、１０ｍｇ／ｍ^２未満の投与量が患者に投与される。１つの実施形態において、１ｍｇ／ｍ^２以下の投与量が対象に投与される。実施形態では、１ｍｇ／ｍ^２未満の投与量が対象に投与される。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストには逆用量応答（inverse dose response）があり、高用量では効果が減弱するか全く効果がないことを見出した。これを図４（Ｂ）に示す。アンタゴニストは、逆用量応答パターンで効果を誘発した。

また、本発明は、コロナウイルス感染に関連する対象者のバリア機能喪失の治療または予防方法における使用のための、本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストを提供する。

また、本発明は、対象者のコロナウイルス感染に関連する心血管機能障害または作用の治療方法または予防方法における使用のための、本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストを提供する。心血管作用は、凝固亢進、血小板活性化、内皮機能障害、深部静脈血栓症、肺塞栓症、脳卒中、心筋梗塞、播種性血管内凝固障害、肺血管系における微小血栓のような肺における微小血管閉塞、および右心室機能障害を伴う急性炎症作用を含む、本明細書に記載の作用の１つまたは複数である。

また、本発明は、対象者のコロナウイルス感染に伴う敗血症の治療方法または予防方法における使用のための、本発明のαＶβ３インテグリンアンタゴニストを提供する。それは、コロナウイルス感染に伴う敗血症、重症敗血症または敗血症性ショックの発症を予防または阻止し得る。

コロナウイルス感染症またはコロナウイルスによって引き起こされる疾患の治療方法または予防方法が提供され、前記方法は、対象者への本発明のαＶβ３アンタゴニストの投与を含む。

また、本発明は、対象者のコロナウイルス感染に関連するバリア機能の喪失の治療方法または予防方法を提供し、前記方法は、対象者への本発明のαＶβ３アンタゴニストの投与を含む。

また、本発明は、対象者のコロナウイルス感染に関連する敗血症の治療方法または予防方法であって、前記方法は、対象者への本発明のαＶβ３アンタゴニストの投与を含む。

また、本発明は、対象者のコロナウイルス感染に関連する心血管機能障害または影響の治療方法または予防方法を提供し、前記方法は、対象者への本発明のαＶβ３アンタゴニストの投与を含む。

コロナウイルスは本明細書に記載されている通りである。本発明の医療用途に関連して記載した実施形態または好ましい特徴は、本発明の治療または予防方法にも適用されることが理解されるであろう。

（定義および一般的選択）
本明細書で使用される場合、特段の指示がない限り、以下の用語は、当該用語が当該技術分野において享受し得るより広い（またはより狭い）意味に加え、以下の意味を有することが意図される。

文脈上別段の定めがない限り、本明細書において単数形の使用は複数形を含むものとし、その逆もまた同様とする。ある実体に関連して使用される「a」または「an」という用語は、その実体の１つ以上を指すものとする。そのため、本明細書において、「a」（または「an」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という記載を互換的に使用する。

本明細書で使用される場合、用語「comprise」、またはその活用形（「comprises」または「comprising」など）は、記載された任意の完全体（たとえば、特徴、要素、特性、性質、方法／プロセス工程または制限）または完全体群（たとえば、特徴、要素、特性、性質、方法／プロセス工程または制限）を含むことを示すが、他の完全体または完全体群を排除しないことを示すと解釈される。したがって、本明細書で使用する場合、用語「含む（comprising）」は非排他的またはオープンエンドであり、追加の未記載の完全体または方法／方法工程を除外するものではない。

本明細書において、「疾患」という用語は、生理学的機能を損ない、かつ、特定の症状を伴う、任意の異常状態を定義するために使用される。この用語は、病因の性質に無関係に（あるいは、疾患の病因学的基礎が確立されているかどうかに無関係に）、生理学的機能が損なわれている任意の障害、疾患、異常、病理、病気、状態、または症候群を包含するために広く使用される。したがって、感染症、外傷、傷害、手術、放射線アブレーション、中毒、または栄養欠乏から生じる状態も含まれる。

本文脈において、治療または予防されるべき「疾患」は、コロナウイルス、特にバリア機能の喪失を特徴とするコロナウイルスである。コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、たとえば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）であってもよい。

本明細書で使用される場合、用語「治療（treatment）」または「治療する（treating）」は、疾患の症状を治癒、改善または軽減するか、あるいは、その原因を除去（またはその影響を軽減）する介入（たとえば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、この用語は、「療法（therapy）」という用語と同義に用いられる。治療とは、対象者の状態の永続的または一時的な改善によって現れる。この場合、治療には予防（prevention）または予防（prophylaxis）の初期段階を含めることができる。

本明細書で使用する場合、「予防（prevention）」または「予防する（preventing）」という用語は、対象者における疾患（たとえばＣＯＶＩＤ－１９）の発症または進行、および／または疾患（たとえばＣＯＶＩＤ－１９）の重症度を予防または遅延させる介入（たとえば、対象者への薬剤の投与）を指す。この場合、治療という用語は「予防（prophylaxis）」という用語と同義に使用される。

本明細書で使用される場合、αＶβ３アンタゴニストに適用される「有効量または治療上有効な量」という用語は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に相応して対象者に投与することができる量であって、個体において所望の効果（たとえば、コロナウイルスの受容体への結合を防止する）を提供するのに十分な量を定義する。その量は、個体の年齢および全身状態、投与様式および他の因子によって、対象毎に異なる。したがって、正確な有効量を特定することは不可能であるが、当業者であれば、日常的な実施および背景となる一般的知識を用いて、個々の症例における適切な「有効」量を決定することができるであろう。本文脈における治療結果には、個体において、対象者の細胞に感染するウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）の量の減少、および／または呼吸不全の発生の遅延もしくは抑制が含まれる。治療結果は、完全な治癒である必要はない。治療結果は、対象者の状態の永続的または一時的な改善であってもよい。「量」は、「投与量」と互換的に用いられる。

上記で定義した治療および有効量の文脈において、用語「個体」（文脈が許す限り、「対象者」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」を含むものと解釈される）は、治療が適応とされる任意の個体、特に哺乳類個体を定義する。哺乳類個体は、ヒト、家畜、農耕動物、動物園動物、スポーツ動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ウシなどのペット動物、類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類、イヌ、オオカミなどのイヌ科動物、ネコ、ライオン、トラなどのネコ科動物；ウマ、ロバ、シマウマなどのウマ科動物；ウシ、ブタ、ヒツジなどの食用動物；シカ、キリンなどの偶蹄類；マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、対象者はヒトである。

「αＶβ３」は、細胞接着を促進する、細胞表面糖タンパク質レセプターのインテグリン超遺伝子ファミリーのメンバーである。保存されたＲＧＤアミノ酸配列を含む種々の血漿タンパク質および細胞外マトリックスタンパク質と結合し、細胞接着を調節する。破骨細胞で高発現し、骨吸収に関与しているほか、血管平滑筋細胞および内皮細胞、一部の腫瘍細胞にも多く存在し、血管新生や細胞移動に関与している（Felding et al, Curr Opin Cell Biol. 1993; 5; 864-868）。「血管内皮αＶβ３」とは、血管内皮細胞によって発現されるαＶβ３インテグリンを指す。

「αＶドメイン」とは、血管内皮αＶβ３インテグリンのαＶドメインを指す。ヒト血管内皮αＶドメインの配列は配列番号１に記載されている：

ＩＴＡＶ＿ＨＵＭＡＮ インテグリンα－Ｖ ＯＳ＝ホモサピエンス （配列番号１）
MAFPPRRRLRLGPRGLPLLLSGLLLPLCRAFNLDVDSPAEYSGPEGSYFGFAVDFFVPSASSRMFLLVGAPKANTTQPGIVEGGQVLKCDWSSTRRCQPIEFDATGNRDYAKDDPLEFKSHQWFGASVRSKQDKILACAPLYHWRTEMKQEREPVGTCFLQDGTKTVEYAPCRSQDIDADGQGFCQGGFSIDFTKADRVLLGGPGSFYWQGQLISDQVAEIVSKYDPNVYSIKYNNQLATRTAQAIFDDSYLGYSVAVGDFNGDGIDDFVSGVPRAARTLGMVYIYDGKNMSSLYNFTGEQMAAYFGFSVAATDINGDDYADVFIGAPLFMDRGSDGKLQEVGQVSVSLQRASGDFQTTKLNGFEVFARFGSAIAPLGDLDQDGFNDIAIAAPYGGEDKKGIVYIFNGRSTGLNAVPSQILEGQWAARSMPPSFGYSMKGATDIDKNGYPDLIVGAFGVDRAILYRARPVITVNAGLEVYPSILNQDNKTCSLPGTALKVSCFNVRFCLKADGKGVLPRKLNFQVELLLDKLKQKGAIRRALFLYSRSPSHSKNMTISRGGLMQCEELIAYLRDESEFRDKLTPITIFMEYRLDYRTAADTTGLQPILNQFTPANISRQAHILLDCGEDNVCKPKLEVSVDSDQKKIYIGDDNPLTLIVKAQNQGEGAYEAELIVSIPLQADFIGVVRNNEALARLSCAFKTENQTRQVVCDLGNPMKAGTQLLAGLRFSVHQQSEMDTSVKFDLQIQSSNLFDKVSPVVSHKVDLAVLAAVEIRGVSSPDHVFLPIPNWEHKENPETEEDVGPVVQHIYELRNNGPSSFSKAMLHLQWPYKYNNNTLLYILHYDIDGPMNCTSDMEINPLRIKISSLQTTEKNDTVAGQGERDHLITKRDLALSEGDIHTLGCGVAQCLKIVCQVGRLDRGKSAILYVKSLLWTETFMNKENQNHSYSLKSSASFNVIEFPYKNLPIEDITNSTLVTTNVTWGIQPAPMPVPVWVIILAVLAGLLLLAVLVFVMYRMGFFKRVRPPQEEQEREQLQPHENGEGNSET

「β３ドメイン」とは、血管内皮αＶβ３インテグリンのβ３ドメインを指す。ヒト血管内皮β３ドメインの配列は配列番号２に記載されている：

ＩＴＢ３＿ＨＵＭＡＮ インテグリンβ－３ ＯＳ＝ホモサピエンス（配列番号２）
MRARPRPRPLWATVLALGALAGVGVGGPNICTTRGVSSCQQCLAVSPMCAWCSDEALPLGSPRCDLKENLLKDNCAPESIEFPVSEARVLEDRPLSDKGSGDSSQVTQVSPQRIALRLRPDDSKNFSIQVRQVEDYPVDIYYLMDLSYSMKDDLWSIQNLGTKLATQMRKLTSNLRIGFGAFVDKPVSPYMYISPPEALENPCYDMKTTCLPMFGYKHVLTLTDQVTRFNEEVKKQSVSRNRDAPEGGFDAIMQATVCDEKIGWRNDASHLLVFTTDAKTHIALDGRLAGIVQPNDGQCHVGSDNHYSASTTMDYPSLGLMTEKLSQKNINLIFAVTENVVNLYQNYSELIPGTTVGVLSMDSSNVLQLIVDAYGKIRSKVELEVRDLPEELSLSFNATCLNNEVIPGLKSCMGLKIGDTVSFSIEAKVRGCPQEKEKSFTIKPVGFKDSLIVQVTFDCDCACQAQAEPNSHRCNNGNGTFECGVCRCGPGWLGSQCECSEEDYRPSQQDECSPREGQPVCSQRGECLCGQCVCHSSDFGKITGKYCECDDFSCVRYKGEMCSGHGQCSCGDCLCDSDWTGYYCNCTTRTDTCMSSNGLLCSGRGKCECGSCVCIQPGSYGDTCEKCPTCPDACTFKKECVECKKFDRGALHDENTCNRYCRDEIESVKELKDTGKDAVNCTYKNEDDCVVRFQYYEDSSGKSILYVVEEPECPKGPDILVVLLSVMGAILLIGLAALLIWKLLITIHDRKEFAKFEEERARAKWDTANNPLYKEATSTFTNITYRGT

「αＶβ３アンタゴニスト」という用語は、受容体自体を活性化することなくαＶβ３インテグリンに結合する化合物または分子を指す。例は、ペプチド（環状および非環状）、非ペプチドリガンド、ディスインテグリン、ペプチド模倣物、抗体、遺伝子阻害剤などを含む。環状ペプチドの例はシレンジタイドである。抗体アンタゴニストの例は文献、たとえば米国特許第５６５２１１０号明細書に記載されている。αＶβ３アンタゴニストは、Millard et al (Theranostics 2011; 1: 154=188)、Kim et al(Mol Pharm 2013 Oct 7,3603-3611)、Pfaff et al(J Biol Chem 1994; 269, 20233-20238)、Healyet al(Biochemistry 1995; 34, 3948-3955)、欧州特許出願公開第２２９８３０８号明細書(University of Southern California)、Koivunen et al(J Biol Chem 1993; 268; 20205-20210, and 1994; 124: 373-380)、Ruoslahti et al(Annu Rev Cell Dev Biol. 1996; 12: 697-715)、およびPonce et al(Faseb J. 2001; 15; 1389-1397)に記載されている。１つの実施形態において、αＶβ３アンタゴニストは、αＶインテグリンに対して選択的である。

本文脈において、好ましくは、アンタゴニストは、内皮αＶβ３インテグリンに結合し、コロナウイルスと宿主インテグリンとの結合を阻止するか、または減少させるものである。特に、アンタゴニストは血管内皮細胞に結合するものである。これらは、ヒト大動脈内皮細胞、微小血管内皮細胞、およびヒト臍帯静脈内皮細胞を含むが、これらに限定されない。アンタゴニストは、αＶβ３インテグリンと反管腔側で結合するものである。イン・ビトロ結合アッセイは当技術分野で知られており、以下に記載される。例としては、欧州特許出願公開第０７７０６２２号明細書（参照により本明細書の一部をなす）に記載されている、シレンジタイドおよびその変異体を含む。以下に記載するイン・ビトロ接着アッセイを用いて文献に記載されているαＶβ３アンタゴニストを試験して、機能的なαＶβ３アンタゴニストを同定することは、当業者にとって慣用な事項である。

「シレンジタイド」は、αＶβ３受容体に対する強力なインテグリン阻害剤である。これは、αＶインテグリンに選択的な環状ペプチド（ｃｙｃｌｏ（－ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ－）である（Jonczyk et al、欧州特許出願第０７７０６２２号）。この分子の合成と活性は１９９９年に発表された（Dechantsreiter et al J Med Chem 1999 Aug 12; 42(16)）。シレンジタイドは癌の治療に適応がある（欧州特許出願公開第２５７８２２５号明細書、欧州特許出願公開第２３３８５１８号明細書、欧州特許出願公開第２４４１４６４号明細書；参照により本明細書の一部をなす）。

「シレンジタイドの機能的変異体」とは、αＶβ３受容体のインテグリン阻害剤である米国特許第６００１９６１号明細書に記載されたシレンジタイドの変異体、具体的には、配列番号１～４０に記載された環状ペプチドを意味する（米国特許第６００１９６１号明細書、第１２～１３欄；参照により本明細書の一部をなす）。「機能的変異体」とは、同一機能を有する変異体であり、たとえば、修飾によって異なるものであるが、同一機能を維持するシレンジタイドの変異体、すなわちインテグリン阻害剤である。典型的には、シレンジタイドの機能的変異体は、ＲＧＤ配列またはモチーフからなる環状ペプチドである。

「低分子量アンタゴニスト」とは、５０ＫＤａ未満の分子量を有するアンタゴニストを意味する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、２０ＫＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、１０ＫＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、５ＫＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、４ＫＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、３ＫＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、２ＫＤａ未満の分子量を有する。１つの実施形態において、低分子量アンタゴニストは、１ＫＤａ未満の分子量を有する。

「αＶβ３抗体」とは、αＶβ３インテグリンに結合する抗体を意味する。１つの実施形態では、抗体はαＶβ３またはαＶβ５インテグリンに特異的に結合する。１つの実施形態では、抗体はαＶβ３インテグリンに特異的に結合する。αＶβ３抗体の例は文献に記載されており（Liu et al Drug Dev Res 2008; 69(6) 329-339）、たとえば市販されている：
ＭＡＢ１９７６、Merck Milliporeから市販されているマウスモノクローナル抗体（クローンＬＭ６０９）、ＡＶＡＳＴＩＮとしても知られている；
Ｖｉｔａｘｉｎ Ｉ、ヒト化モノクローナル抗体（Coleman et al, Circulation Research 1999; 84; 1268-1276）；
ＡＢＥＧＲＩＮ、Medimmune社製のＶｉｔａｘｉｎ Ｉの誘導体；
ＣＮＴＯ９５、複数のαＶインテグリンを認識し、αＶβ３またはαＶβ５インテグリンに高親和性で結合する完全ヒト化抗体（Trika et al.Int J Cancer 2004;110;326-335）；
ｃ７Ｅ３ Ｆａｂ（ＡＢＣＩＸＩＭＡＢまたはＲＥＯＰＲＯ）およびｃ７Ｅ３（Ｆａｂ’）２、親となる無傷のマウスｍＡｂ ７Ｅ３のマウス－ヒトキメラおよびマウスｍＡｂフラグメント（Trikha et al.Angiogenesis 1999; 3; 53-60）；
１７Ｅ６抗体（Mitjans et al J Cell Sci 1995; 108; 2825-2838）。
「αＶβ３抗体」という用語は、αＶドメイン、β３ドメイン、またはαＶドメインとβ３ドメインの両方に選択的に結合する抗体を含む。用語「機能的αＶβ３抗体」とは、血管内皮αＶβ３インテグリンに結合し、後述のイン・ビトロ接着アッセイにおいて黄色ブドウ球菌または大腸菌の内皮細胞への接着を少なくとも部分的に阻止することができる、αＶβ３抗体を意味する。

「ディスインテグリン」とは、αＶβ３に結合してその機能を阻害することができる、毒蛇毒由来の低分子量ＲＧＤ含有システイン豊富ペプチドのファミリーを意味する。たとえば、トリグラミン、キストリン、ビチスタチン、バーボリン、エキスタチン、コントルトロスタチンなどがあり、これらはすべてLiu et al Drug Dev Res 2008; 69(6) 329-339に記載または参照されている。

「ペプチド模倣物」とは、ペプチド性αＶβ３アンタゴニストの生物学的作用を模倣することができる非ペプチド性構造要素を含む化合物を意味する。例は、Liu et al, Drug Dev Res 2008; 69(6) 329-339に記載または参照されているＳＣ－６８４４８およびＳＣＨ２２１１５３、およびBello et al, Neurosurgery 2003: 52; 177186に記載されているＩＳ２０１を含む。

「遺伝子阻害剤」とは、αＶβ３の発現低下を引き起こすことができる核酸を意味する。いくつかの実施形態において、薬剤は核酸である。核酸薬剤は、たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、およびそれらの任意の組み合わせから選択することができる。薬剤が核酸である場合、薬剤自体を対象者に投与するか、または薬剤を発現／コードするベクターを対象者に投与することができる。いくつかの実施形態において、薬剤を発現／コードするベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

本発明の方法を実施するために、αＶβ３アンタゴニストは、経口投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、局所投与、直腸投与、経鼻投与、膀胱投与、膣投与、または移植リザーバーを介して投与することができる。αＶβ３アンタゴニストは、任意の形態の肺送達によって送達することができる。このような送達手段は、定量吸入器、ネブライザーおよび吸入器、たとえば乾燥粉末吸入器を含むが、それらに限定されない。本明細書で使用する際に、用語「非経口的」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。無菌の注射可能組成物（たとえば、無菌の注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液）は、適切な分散剤または湿潤剤（ツイーン８０など）および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術にしたがって処方することができる。また、無菌注射製剤は、たとえば１，３－ブタンジオール中の溶液のように、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液であってもよい。使用できる希釈剤または溶媒は、マンニトール、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液であってもよい。さらに、無菌の固定油が、従来から溶媒または懸濁媒体として使用されている（たとえば、合成モノグリセリドまたはジグリセリド）。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注射剤の調製に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油のような薬学的に許容される天然油、特にポリオキシエチル化されたものも有用である。これらの油性溶液または油性懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤を含むこともできる。他の一般的に使用される界面活性剤（ツイーン類またはスパン類）、または薬学的に許容される固体剤形、液体剤形、または他の剤形の製造において一般的に使用される他の類似の乳化剤または生物学的利用能増強剤もまた、製剤化の目的のために使用することができる。好ましくは、投与は経口投与である。典型的には、投与は静脈内投与である。典型的には、投与は肺投与である。

経口投与用組成物は、カプセル剤、錠剤、乳剤および水性懸濁剤、分散剤および溶液を含むがこれらに限定されない、経口的に許容される任意の剤形とすることができる。賦形剤と混合して、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース剤などの形態、硬質または軟質のゼラチンカプセル剤、または錠剤に圧縮して使用することができる。不活性化を防ぐための材料によるコーティング、または当該材料との共投与を行ってもよい。別の態様において、本発明のアンタゴニストまたは組成物は、たとえば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口投与することができる。

経口用の錠剤の場合、一般的に使用される担体は、乳糖やトウモロコシデンプンを含む。一般的に、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も添加される。カプセル形態で経口投与する場合、有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液または乳剤を経口投与する場合、乳化剤または懸濁剤と組み合わせた油性相中に有効成分を懸濁または溶解させることができる。所望により、甘味剤、香料、着色剤を添加することもできる。鼻用エアロゾルまたは吸入用組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術にしたがって調製することができる。縮合多環式化合物含有組成物は、直腸投与用の坐薬の形態で投与することもできる。医薬組成物中の担体は、製剤の有効成分と適合性があり（安定化できることが好ましい）、治療される対象者にとって有害ではないという意味で、「許容可能」ものでなければならない。たとえば、縮合多環式化合物と高可溶性の複合体を形成する１種または複数種の可溶化剤を、活性化合物の送達のための医薬担体として利用することができる。他の担体の例は、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｄ＆Ｃイエロー＃１０などを含む。

本発明のいくつかの実施形態において、投与または送達は、リポソーム、混合リポソーム、オレオソーム、ニオソーム、エトソーム、ミリカプセル、カプセル、マクロカプセル、ナノカプセル、ナノ構造脂質キャリア、スポンジ、シクロデキストリン、ベシクル、ミセル、界面活性剤の混合ミセル、界面活性剤－リン脂質混合ミセル、ミリスフィア、スフィア、リポスフィア、粒子、ナノスフィア、ナノ粒子、ミリパーティクル、固体ナノパーティクル、ならびに、逆ミセルの内部構造を持つ油中水型マイクロエマルションを含むマイクロエマルション、ナノエマルションミクロスフェアー、マイクロパーティクルの１種を用いて行ってもよい。

これらの送達系は、本発明のアンタゴニストまたは組成物の浸透性を高めるように適合させることができる。これにより、薬物動態学的および薬力学的特性が改善することができる。送達系は、本発明の化合物またはペプチドが一定期間中に徐々に放出され、好ましくは一定期間にわたって一定の放出速度で放出される、徐放系であってもよい。送達系は、当該技術分野で公知の方法によって調製される。徐放系に含まれる活性物質の量は、組成物が送達される場所および放出の持続時間、ならびに治療またはケアされる状態、疾患および／または障害の種類に依存する。

「抗体」とは、任意の形態の無傷のαＶβ３結合免疫グロブリンを指し、モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化もしくはヒト型、またはαＶβ３に結合する抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない。この用語は、本明細書において「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃドメイン」と呼ばれる、Ｆｃ領域のＦｃ（結晶化可能フラグメント）領域またはＦｃＲｎ結合フラグメントを有するモノクローナルまたはポリクローナルαＶβ３結合フラグメントを含む。１つの実施形態では、抗体は、除去または修飾されたＦｃ領域を有し、細菌のプロテインＡと相互作用できないようにされている。このような抗体を作製する方法は、Hay et al (Immunochemistry 12(5): 373-378)、Parkham et al (J. Immunol 1983: 131(6): 2895-2902)、およびBaldwin et al (J. Immunol Methods 1989 121(2): 209-217)に記載されている。αＶβ３結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷な抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって生産されてもよい。αＶβ３結合フラグメントは、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。Ｆｃドメインは、抗体の２つまたは３つのクラスに寄与する２つの重鎖の一部を含む。Ｆｃドメインを、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは酵素的（たとえばパパイン開裂）または無傷の抗体の化学的開裂によって生産してもよい。

抗体は、ＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＡ分子、またはＩｇＤ分子であってよい。好ましい実施形態では、抗体分子はＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプである。抗体のクラスおよびサブクラスは、たとえば、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いるなど、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。αＶβ３に特異的な抗体は市販されており、前述した。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット、ならびに他の技術によって決定することができる。あるいは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列決定すること、アミノ酸配列を免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較し、抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによっても、クラスおよびサブクラスを決定することができる。

抗体はバイオ医薬品の主要なクラスである。治療目的の抗体は、ハイブリドーマを含み、多くの場合に、細胞株（たとえば、ＣＨＯ細胞、ハムスター株ＢＨＫ２１、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞株、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ、２９３、Ｌ９２９、ＭＥＬ、ＪＥＧ－３、マウスリンパ球（ＮＳ０およびＳｐ２／０－Ａｇ １４を含む））から産生され、通常は特定の抗体の単一クローンである。治療目的で使用される抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体に分類され、組換え法によって産生される。「マウス抗体」は完全なマウス抗体であり、循環半減期が短く免疫原性が高いため、ヒトにおける使用は制限されている。「キメラ抗体」は遺伝子工学的に作製された抗体で、マウスとヒトの両方の配列を含む。その比率は、マウスの寄与率が約３３％、ヒトの寄与率が約６７％である。通常、可変領域はマウス由来で、Ｆｃフラグメントを含む定常領域はヒトＩｇＧ由来である。

「ヒト化抗体」とは、遺伝子工学的に操作された抗体で、マウスの含有量が約５－１０％に減少している。このような場合、ＣＤＲ欠損ヒトＩｇＧ足場に対する組換え技術によって、マウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲと限られた数の構造アミノ酸が移植される。完全ヒト抗体またはヒト抗体は、ヒト化マウスで作製され、マウス配列を全く含まない抗体、またはファージライブラリーやリボソームディスプレイを用いてイン・ビトロで作製された抗体、あるいはヒト提供者（ドナー）から得られた抗体を指す。特定の実施形態では、異なる種または完全ヒト抗体由来の部分から誘導される、キメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化（ＣＤＲ－移植）抗体も本発明に包含される。これらの抗体の種々の部分は、従来の技術によって化学的に結合させることもできるし、遺伝子工学的技術を用いて連続したタンパク質として調製することもできる。たとえば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させて連続タンパク質を産生することができる。たとえば、Cabilly et al.、米国特許第４８１６５６７号明細書；Cabilly et al.、欧州特許出願公開第０，１２５，０２３号明細書；Boss et al.、米国特許第４８１６３９７号、Boss et al.ら、欧州特許出願公開第0,120,694号明細書、Neuberger, M. S. et al.、国際特許公開第８６／０１５３３号パンフレット、Neuberger, M. S. et al.ら、欧州特許第０１９４２７６号明細書、Winter、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；およびWinter、欧州特許第０２３９４００号明細書を参照されたい。霊長類化抗体については、Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992)を参照されたい。単一鎖抗体については、たとえば、Ladner et al.、米国特許第４９４６７７８号明細書；およびBird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)を参照されたい。

さらに、本明細書において「抗体調製物」と呼ばれる抗体の混合物を、本発明の方法にしたがって使用することができる。このような抗体調製物は、抗体のポリクローナルおよびモノクローナル混合物を含む。ヒト化抗体は、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含むことができる。たとえば、少なくとも１つの部分はヒト由来であり得る。たとえば、ヒト化抗体は、マウスのような必要な特異性を有する非ヒト由来の免疫グロブリン由来の部分と、ヒト由来の免疫グロブリン配列（たとえば、キメラ免疫グロブリン）由来の部分とを、含むことができる。ヒト化抗体は、従来の技術（たとえば、合成的）により免疫グロブリン配列を化学的に結合させて調製してもよいし、遺伝子操作技術（たとえば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて、連続したポリペプチド鎖を産生する）を用いて連続したポリペプチドとして調製してもよい。あるいはまた、ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニック動物またはヒト化動物でヒト化抗体を作製することもできる（Lonberg, N.、「Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies」、Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994): 49-101を参照されたい）。本発明のヒト化抗体の別の例は、非ヒト由来のＣＤＲ（たとえば、非ヒト由来の抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲ）と、ヒト由来の軽鎖および／または重鎖由来のフレームワーク領域（たとえば、フレームワークの変化を伴うかまたは伴わないＣＤＲグラフト抗体）とを含む１つまたは複数の免疫グロブリン鎖を含む免疫グロブリンである。キメラ抗体またはＣＤＲグラフト単鎖抗体も、「ヒト化抗体」という用語に包含される。

免疫グロブリンを調製する方法、抗原で免疫する方法、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、本明細書に記載されているように、または他の適切な技術を用いて行うことができる。種々の方法が記載されている。たとえば、Kohler et al., Nature, 256:495-497(1975)、およびEur. J. Immunol. 6: 511-519(1976)；Milstein et al., Nature 266: 550-552(1977)；Koprowski et al.、米国特許第４１７２１２４号明細書；Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.)；Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F. M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, N.Y.), Chapter 11, (1991; Rasmussen SK, Rasmussen LK, Weilguny D, Tolstrup AB. Biotechnol Lett.)を参照されたい。本発明の方法で使用できるポリクローナル抗体は、免疫動物の血清（免疫原としてαＶβ３特異的ペプチドまたは組換えタンパク質を使用）由来の抗体分子の不均一な集団である。αＶβ３に対するモノクローナル抗体の調製のために、適当な不死細胞株（たとえば、ＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株）と抗体産生細胞との融合によりハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節の細胞は、目的の抗原（αＶβ３特異的ペプチドまたは組換えタンパク質）で免疫した動物から得られる。ハイブリドーマは、選択的培養条件を用いて単離し、限界希釈によってクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ法（ＥＬＩＳＡなど）により選択することができる。抗体はヒト提供者の血漿から精製することができる。これはＩＶＩｇの現在のアプローチであり、多数の提供者からプールされた正常血漿から免疫グロブリンを分離する（http://www.fda.gov/cber/gdlns/igivimmuno.htm、およびHaeney Clin Exp Immunol.1994 July; 97(Suppl 1): 11-15を参照されたい）。必要な特異性を有する抗体を産生または単離するための他の適切な方法を使用することができる。当該方法は、たとえば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）の免疫に依存する方法などを含む。たとえば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993)；Jakobovitsら, Nature, 362: 255-258 (1993)；Ｌｏｎｂｅｒｇ et al.、米国特許第５５４５８０６号明細書；Ｓｕｒａｎｉ et al.、米国特許第５，５４５，８０７号明細書を参照されたい。

抗体は２つ以上の結合部位を有してもよい。複数の結合部位を有する場合、結合部位は互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。たとえば、天然に存在する免疫グロブリンは２つの同一の結合部位を有し、一本鎖抗体またはＦａｂフラグメントは１つの結合部位を有する一方で、「二重特異性」または「二官能性」抗体は２つの異なる結合部位を有する。個々の抗体の内在化する能力、ペイロードを送達する能力、標的細胞を殺傷する能力は、親和性および抗体が係合する特定の標的エピトープによって大きく異なる。所与の標的（この場合ＩＬ１ＲＡＰＬ－１）に対して、ＡＤＣコンジュゲーション用の抗体のパネル（種々の結合親和性およびエピトープをカバーする）を開発する必要がある。ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変領域および定常領域を有する全ての抗体を含む。１つの実施形態では、可変領域および定常領域の全てがヒト免疫グロブリン配列由来である（完全ヒト抗体）。用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１つまたは複数の領域と、１つまたは複数の他の異なる抗体由来の１つまたは複数の領域とを含む抗体を指す。１つの実施形態では、１つまたは複数のＣＤＲは特定のヒト抗体由来である。より好ましい実施形態では、ＣＤＲの全てがヒト抗体由来である。別の好ましい実施形態では、２つ以上のヒト抗体由来のＣＤＲがキメラ抗体中で混合され、マッチングされる。たとえば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１と、第２のヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３との組み合わせを含んでもよく、重鎖由来のＣＤＲは第３の抗体由来であってもよい。さらに、フレームワーク領域は、同じ抗体、ヒト抗体などの１つまたは複数の異なる抗体、またはヒト化抗体由来のいずれかに由来してもよい。

本明細書で使用する場合、「組成物」という用語は、人の手によって作られたものを意味し、天然に存在する組成物を含まないと理解されるべきである。組成物は、単位用量形態、すなわち、単位用量、または単位用量の倍数もしくは小単位を含む別個の部分の形態で製剤化することができる。

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」という用語は、１つまたは複数の医薬的に許容される希釈剤、賦形剤または担体を含むことができる。本発明のペプチドおよび組成物を単独で投与することができるとしても、一般的には、それらは、特にヒト治療のために、薬学的担体、賦形剤または希釈剤と混和して投与されるであろう。医薬組成物は、ヒトおよび獣医学において、ヒト用または動物用として使用することができる。本明細書に記載される種々の異なる形態の医薬組成物のためのそのような適切な賦形剤の例は、
A Wade and PJ Weller編"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994)に記載されている。特に、局所送達のための製剤は、David Osborne and Antonio Aman編"Topical Drug Delivery Formulations"に記載されており、その全内容は参照により本明細書の一部をなすものとする。治療用に許容される担体または希釈剤は、製薬技術において周知であり、たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。適切な担体の例は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどを含む。適切な希釈剤の例は、エタノール、グリセロールおよび水を含む。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬慣行を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、または担体、賦形剤または希釈剤に加えて、任意の適切な結合剤、滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。適切な結合剤の例は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、自由流動ラクトース、β－ラクトースのような天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールなどを含む。適切な滑剤の例は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを含む。医薬組成物中に、保存剤、安定剤、染料、さらには香料を提供することができる。保存剤の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ヒドロキシ安息香酸のエステルなどを含む。酸化防止剤および懸濁剤も使用することができる。

「誘導体」という用語は、構造上の修飾、たとえばある原子もしくは原子団または官能基を別の原子もしくは原子団または官能基で置換することによって、別の化合物と相違する化合物を意味する。

本明細書において「バリア機能の喪失」とは、正常なバリア機能の減衰を指す。バリアは、身体の任意の部分においてもよく、内皮細胞バリアまたは上皮細胞バリアであってもよい。

本発明のアンタゴニストまたはそれを含む組成物は、単独で投与することも、他の薬理学的に活性な薬剤または追加成分と組み合わせて投与することもできる。このような併用療法は、単一の剤形での複数の薬剤の一括での投与、または別個の個別の剤形での複数の薬剤の投与を含むが、それに限定されるものではない、異なる治療レジメンを包含することが理解されるであろう。薬剤が別個の剤形中に存在する場合、投与は同時またはほぼ同時であってもよいし、異なる薬剤の投与を包含する任意の所定のレジメンにしたがってもよい。

このような追加成分は、組成物に含めることが有益なものであってもよいし、組成物の使用目的に応じて有益なものであってもよい。追加成分は、活性成分であっても機能性成分であってもよいし、その両方であってもよい。薬剤が別個の剤形中に存在する場合、投与は同時またはほぼ同時であってもよいし、異なる薬剤の投与を包含する任意の所定のレジメンにしたがってもよい。

追加成分は、呼吸器疾患もしくは肺疾患またはその症状の治療に適したものであってもよい。追加成分は、ＡＲＤＳまたはその症状、腎臓、または急性腎障害（ＡＫＩ）、凝固障害、心臓病、および／または神経病理の治療に適したものであってもよい。追加成分は、バリア機能が低下した疾患の治療に適したものであってもよい。追加成分は、抗ウイルス薬および／または抗生物質であってもよい。これは併用療法と呼ばれることもある。

バリア機能またはバリア状態が低下した疾患に適した治療剤は、下痢止め剤、ヒトまたは動物の出血性ウイルスに対する薬剤を含むが、それらに限定されない。このような薬剤は当該技術分野で公知であり、その全てが本発明に包含されることが理解されよう。追加成分は、疼痛の治療に適したものであってよく、当該技術分野で知られている任意の適切な成分であってよい。

記載されている追加成分は、２つ以上の利点を提供する可能性があることを理解されたい。本明細書に記載された分類は、明確性および便宜のみを目的としたものであり、記載された特定の用途またはカテゴリーに追加成分を限定することを意図したものではない。

追加成分の性質および量は、本発明の利点を許容できないほど変化させるべきではない。典型的な前記追加の活性剤は、微量でのみ存在する。いくつかの実施形態では、組成物中に追加成分が存在しないこともある。含まれる追加成分の量は、使用される追加成分の種類、追加成分の性質、組成物の成分、組成物中の成分またはペプチドの量、および／または組成物の意図される使用など、多数の要因に依存する。

追加成分は活性剤であってもよい。ある製品では「活性」成分とみなされる成分が、別の製品では「機能性」成分または「賦形剤」成分である場合があり、その逆もまたしかりであることを理解されたい。また、有効成分としての役割と、機能性成分または賦形剤成分としての役割の両方を果たす成分もあることが理解されるであろう。

また、組成物は、本発明のアンタゴニストおよびそのための適切な塩の任意の適切な組み合わせを含む組成物を含む。任意の適切な塩、たとえば、任意の適切な形態のアルカリ土類金属塩（たとえば、緩衝塩）を、本発明のペプチドの安定化に使用してもよい（好ましくは、塩の量は、ペプチドの酸化および／または沈殿が回避されるような量である）。適切な塩は、典型的には、塩化ナトリウム、コハク酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、および塩化カルシウムを含む。塩基と１つ以上の本発明のペプチドとを含む組成物もまた提供される。

「敗血症」は、患者が以下の症状のうち少なくとも２つを示し、さらに感染の可能性が高いか、感染が確認された場合に診断される：
・ ３８．３℃（華氏１０１度）以上または３６℃（華氏９６．８度）未満の体温
・ 毎分９０回以上の心拍数
・ 毎分２０回以上の呼吸数

重症敗血症は、患者が、臓器が機能不全に陥っている可能性を示す以下の徴候および症状の少なくとも１つを示した場合に診断される：
・ 尿量の著しい減少
・ 精神状態の急激な変化
・ 血小板数の減少（血小板減少症）
・ 呼吸困難
・ 心臓のポンプ機能異常
・ 腹痛

敗血症性ショックは、重症敗血症の症状に加えて、患者が極度の低血圧を示し、単純な補液に十分反応しない場合に診断される。

次に、本発明を具体的な実施例を参照して説明する。これらは単に例示的なものであり、説明のみを目的とするものである。これらは、特許請求の範囲または記載された発明の範囲をいかなる意味においても制限するものではない。これらの実施例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の態様を構成するものである。

（実施例１）
（方法論）
（細胞およびウイルスの培養条件）
ヒト大腸細胞株（Ｃａｃｏ－２）を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ高グルコース培地で維持した。初期誘導（primary derived）ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）を、１０，０００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補足したEndothelial Cell Media MV(PromoCell)で維持した。細胞を１０ダイン／ｃｍ^２の剪断血行力学的力にさらして、血管ストレスの生理的条件を模倣した。特段の記載がない限り、この研究の期間全体を通して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（N. Fletcher（University College Dublin、アイルランド）から寄贈）を２．５の感染多重度（ＭＯＩ）で使用した。

（パラニトロフェニルリン酸結合アッセイ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＣａｃｏ－２およびＨＡｏＥＣの相互作用を、蛍光基質パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を用いた結合アッセイで評価した。不活化ウイルスのアリコートを９６ウェルプレートに３７℃で２時間にわたって固定化し、その後１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。３７℃において２時間にわたって、ＭＯＩ＝８でＨＡｏＥＣを播種した。処理した細胞に、αＶβ３アンタゴニスト、シレンジタイド（H. Kessler（Technical University of Munchen、ドイツ）から寄贈）を、０．０５μＭ、０．００５μＭ、および０．０００５μＭで１時間にわたって投与した。細胞を固定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２上に加え、２時間にわたって接着させた。細胞内アルカリホスファターゼの基質となる蛍光マーカーであるパラニトロフェニルホスフェートを含む溶解緩衝液（０．１ＭのＮａＯＡｃ、１５ｍＭのｐＮＰＰ、０．１％のトリトンＸ－１００、ｐＨ＝５．５）を加えた。反応を１ＭのＮａＯＨで停止し、自動プレートリーダー（Victor, Perkins-Elmer）を用い、４０５ｎｍにおいて、ｐＮＰＰ活性を読み取った。細胞溶解後、得られた蛍光シグナルを４０５ｎｍの吸光度から測定した。結合率（％）は、薬物無添加の対照に対する相対値で分析した。

（トランスウェル透過性アッセイ）
Ｃａｃｏ－２または剪断ＨＡｏＥＣの内皮バリア傷害を、トランスウェル透過性アッセイを用いて評価した。トップチャンバーに播種した処理細胞に０．０００５μＭのシレンジタイドを１時間にわたって投与し、２４時間にわたるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、フルオレセインイソチオシアネート－デキストラン（２５０ｕｇ／ｍＬ、４０ｋＤａ、Sigma-Aldrich）を内皮細胞に添加した。透過性は、下部チャンバーに通過したＦＩＴＣ－デキストランの濃度を定量することによって評価した。励起波長４９０ｎｍ、および発光波長５２０ｎｍにおいて、蛍光強度を測定した。

（免疫蛍光顕微鏡検査）
剪断ＨＡｏＥＣ上のＶＥ－カドヘリン（血管内皮カドヘリン）発現を、免疫蛍光顕微鏡で測定した。剪断ＨＡｏＥＣをスライドグラスに固定し、２４時間にわたってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。その後、AlexaFluor 488（SantaCruz Biotechnology）を結合（conjugated）させた抗ＶＥ－カドヘリンマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体、ならびに、蛍光マウンティング培地（Invitrogen）中の４，６－ジアミノ－２－フェニルインドールを用いて、細胞を染色した。処理した細胞を、１時間にわたって０．０００５μＭのシレンジタイドに暴露した。AxioObserver Z1顕微鏡（Zeiss）を用いて画像を取得した。ＶＥ－カドヘリンの濃度は、ImageJソフトウェア（米国国立衛生研究所）を用いて、バックグラウンドから差し引いた細胞の蛍光強度を測定することにより計算した。

（蛍光ベースのタンパク質相互作用アッセイ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と内皮αＶβ３との相互作用を、蛍光ベースのタンパク質アッセイを用いて定量した。プレートに、３７℃で２時間にわたって、３０μｇ／ｍＬの組替ヒト新型（Novel）コロナウイルススパイクタンパク質（Cusabio社製）を塗被した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で２時間にわたって１％ＢＳＡでブロックした。プレートを前述のように洗浄し、５０μｇ／ｍＬの組換ヒトインテグリンαＶβ３タンパク質を３７℃で２時間にわたって添加した。洗浄後、プレートを、試薬希釈液で１：１００に希釈したAlexaFluor 488結合－抗インテグリンαＶβ３クローンＬＭ６０９とともにインキュベートした。１時間後、自動プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおいて、ＬＭ６０９の活性を測定した。

（インテグリン・スパイク蛋白質の構造モデリング）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質およびインテグリンαＶβ３とＲＧＤリガンドとの複合体の構造を、RCSB Protein Data Bankから入手した（それぞれPDB ID: ６ＶＸＸおよび１Ｌ５Ｇ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＧＤモチーフを、αＶβ３と複合体化したＲＧＤリガンドの配列に整列させ、相互作用のシミュレーションモデルを作成した。すべてのαＶβ３－スパイクタンパク質の構造および図は、Molecular Operating Environment (MOE)およびPyMolを用いて可視化し、作成した。

（統計分析）
データは（平均値）±（平均値の標準誤差）で示した。実験は、最低３回の独立した実験を行い、３重化して実施した。グループ間の統計誤差は、Dunnettのpost hoc検定またはｔ検定による分散分析（ANOVA）で評価した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。

（結果と考察）
内皮は微生物による攻撃の最前線にあり、単層膜の完全性を確保すると同時に、ストレスに対する活発な反応を維持するという重要な役割を担っている。病原体による傷害に応じて、繊細な内皮のバランスが崩れ、血管系の調節不全に傾く。この引き金となる反応は、重篤な感染症に罹患すると中断されることなく過剰になり、敗血症を引き起こすおそれがある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染における上皮障害および内皮障害と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染における内皮の関与との相関は、いまだ不明である。しかし、ＣＯＶＩＤ－１９患者では、乳酸脱水素酵素の上昇、Ｄ－ダイマー、サイトカインストームのような敗血症に類似した症状が頻繁にみられることから、敗血症が共通の転帰であることがわかる。さらに、ＣＯＶＩＤ－１９非生存者の１００％が敗血症を発症し、全身性炎症、微小血栓症、急性心血管系合併症、重篤な臓器機能障害を経験する。

（ヒト上皮細胞を介した細胞外輸送は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞外マトリックスへの侵入を促進する）
病理組織学的データから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がヒトの上皮細胞を積極的に標的とし感染し、重篤な細胞障害作用を引き起こすことが確認された。ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺で一般的に経験されるこれらの主要な症状は、びまん性肺胞損傷、気管気管支炎、そして興味深いことに血管損傷を含む。本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が上皮層と間質腔の下にある内皮に侵入できるかどうかを調べた。イン・ビトロにおいてウイルスによるアポトーシスおよびサイトカインの発現上昇は一貫して報告されているが、おそらくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が上皮を通過する別のルートが存在するのであろう。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の高発現はＣＯＶＩＤ－１９患者で広く報告されており、この炎症性サイトカインの増加は腸管上皮バリア透過性を増大する。デングウイルスやヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの他のウイルス感染でみられるのと同様に、このような細胞間結合の破綻は、ウイルス侵入のための副細胞機構を促進する。

本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が上皮細胞と強く結合し（図１（Ａ））、その係合は、感染後４８時間以上にわたって著しく増大する、上皮のバリア形成の喪失をもたらすことを証明した（図１（Ｂ））。この横断は、間質腔へのウイルスの播種を促進し、ウイルスの循環系への侵入を促進し、全身の主要臓器に至るメカニズムを提供する。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と内皮αＶβ３との複合体のイン・シリコ解析は、新たな結合ポケットの可能性を明らかにする）
蓄積されたデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性と感染力の増強はスパイクタンパク質の変異に起因していることを示唆する。配列解析は、すべてのコロナウイルスの先祖には見られなかった新規変異が明らかにする（図２（Ａ）、（Ｂ））。Ｋ４０３Ｒの点変異により、広く認識されているインテグリン認識モチーフ、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）がスパイクタンパク質に導入された。この領域は、主要なヒト内皮インテグリンであるαＶβ３と高い親和性で結合する。驚くべきことに、この進化的モチーフはＡＣＥ２結合部位の近傍に存在するが、ＡＣＥ２結合部位内には存在しない。したがって、スパイクタンパク質は、ＡＣＥ２と並行して、第２のヒト・レセプターを利用する可能性がある。このことは、宿主組織により確実な接着をもたらすだけでなく、両方のレセプターを同時に発現する細胞間でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の拡散を容易にするであろう。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とαＶβ３との構造的相互作用を理解するために、本発明者らは理論的複合体のイン・シリコ分子シミュレーションを構築した。スパイクタンパク質－ＡＣＥ２複合体を、RCSB Protein Data Bankから入手したαＶβ３－ＲＧＤ複合体と比較した。最初に、本発明者らは、αＶβ３とその天然のリガンドであるＲＧＤモチーフとの相互作用を調べた（図３（Ａ））。続いて、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質内に新規ＲＧＤ部位を発見し（図３（Ｂ））、スパイクタンパク質のＲＧＤ部位をαＶβ３構造にドッキングして整列させることにより、統合型ウイルス－宿主複合体を作製した（図３（Ｃ））。興味深いことには、スパイクタンパク質内のＲＧＤモチーフは、αＶβ３のリガンド結合ポケットと完全に整列しており、この相互作用が感染中に起こる可能性が示唆された。次に本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｋ３９０とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｒ４０３の対照的な生化学的性質を調べた。リジンおよびアルギニンはともに、水素結合および静電結合を介してリガンドと受容体との接触を維持するのに重要な役割を果たすため、タンパク質表面に頻繁に現れる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質では、関心のある領域内の柔軟なグリシン残基および嵩高いアスパラギン酸残基が共有されている（図２）。しかし、単独のアミン基を維持するリジンとは対照的に、アルギニンのグアニジニウム基は、３つの非対称アミンにより、αＶβ３とより大きな相互作用をもたらす。この結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とαＶβ３との間の静電的接触点が増加し、スパイクタンパク質が受容体に接近する。さらに、アルギニンの高いｐＫａは、グアニジニウムのπ結合を介した正電荷の非局在化により、より安定なイオン結合を提供し、より多くの共鳴形態をもたらす。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのリジン残基と比較すると、部位４０３のアルギニンへの置換は、αＶβ３相互作用にとってより好ましいと考えられる。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、進化的ＲＧＤ変異によりヒト血管内皮細胞と相互作用する）
ＡＣＥ２は宿主の付着、侵入、浸潤に関与する唯一の受容体として同定されたが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は依然としてＡＣＥ２陰性の結腸腸管細胞および肝細胞を標的とすることが可能である。ＣＯＶＩＤ－１９患者では急性肝障害が顕著であるため、これは特に重要である。ＡＣＥ２のＲＮＡ発現は、肺胞上皮および消化管内で高レベルであることを示している。対照的に、インテグリンαＶβ３は、消化器系、呼吸器系、泌尿器系を含む間葉系由来のほぼ全ての組織および細胞における細胞膜発現および表面膜発現を維持している．さらに、αＶβ３はＡＣＥ２よりも肺胞や血管内皮で高い発現パターンを示す。この発見は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が第２の宿主受容体を獲得することにより、大きな利益を得たことを示している。それぞれ主要な上皮および内皮受容体であるＡＣＥ２およびαＶβ３の両方に結合することは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がその組織感染範囲を拡大したことを説明しうる。本発明者らは、精製しタグ付けしたスパイクタンパク質とヒト内皮αＶβ３との相互作用を調べることによってこの問題を検討し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質がαＶβ３と強く結合することを見出した（図４（Ａ））。さらに、エクス・ビボ感染モデルでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は活性化マーカーであるＴＮＦ－αの存在下でヒト血管内皮細胞に接着することが示された。驚くべき発見は、スパイクタンパク質とαＶβ３との相互作用が、特異的αＶβ３アンタゴニストであるシレンジタイド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ残基からなるトリペプチドである）によって、用量依存的に阻害されることであった（図４（Ｂ））。このαＶβ３アンタゴニスト分子は、αＶβ３に高い親和性で結合し、０．０００５μＭで使用するとウイルスと内皮との相互作用を消失させることができた。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による血管透過性ならびに細胞間結合の破壊は、宿主のαＶβ３受容体を阻害することで防止できる）
ＣＯＶＩＤ－１９の主な症状発現は内皮バリアの完全性の喪失であり、これは血管漏出、組織水腫、低酸素症を促進し、またすべての主要臓器へのウイルスの播種を促進し、多臓器不全、最終的には死に至る。血管内皮カドヘリン（ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）は重要なタイトジャンクションタンパク質で、無傷の内皮層の維持に重要な役割を果たす。ヒト内皮細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を添加すると、内皮細胞の透過性が著しく増加し、バリアジャンクションの破綻を示唆した（図５Ａ）。内皮の形態の変化は、細胞間結合の破壊および単層全体としての接触の喪失を伴うと考えられるので、これは重要な発見であった。これを調べるため、本発明者らは定量的免疫蛍光法を用いてＶＥ－カドヘリンの消失を測定した。未感染のヒト内皮細胞はタイトバリア形成を維持していた。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染すると、ヒト内皮細胞上のＶＥ－カドヘリン表面発現は有意に減少し、感染後の細胞－細胞間の剥離およびバリアの完全性の喪失を示唆した（図５Ｂ、図５Ｃ）。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に代表されるＲＧＤ含有リガンドによるβ３サブユニットが活性化されたためと考えられる。以前の研究では、β３の関与がＶＥ－カドヘリンの内在化をもたらし、血管漏出を増加させることが示された。顕著な観察は、シレンジタイドが内皮αＶβ３へのウイルス接着を阻害し、感染時のＶＥ－カドヘリンの減少を防いだことであった。また、バリア透過性の発生を制限し、ＶＥ－カドヘリンレベルを感染していないレベルに戻した（図５Ｂ、図５Ｃ）。

結論として、上皮に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合は、透過性の著しい変化を引き起こすことによって、傍細胞侵入経路を形成する。この破壊の後、ウイルスは間質腔を通過し、血管内皮の上皮に発現したαＶβ３に付着する。この相互作用は、αＶβ３との結合を促進するスパイクタンパク質内の進化的Ｋ４０３Ｒモチーフによるものと思われる。この突然変異誘発によって、ＣＯＶＩＤ－１９の病態における血管内皮の役割の謎が解明される可能性がある。さらに、重要な観察は、Clustal 5およびVUI 202012/01変異体を含むすべての主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体において、ＲＧＤ部位が保存されていることであり、これらのコロナウイルスがαＶβ３に固定する能力を維持していることを示唆する。これは、ＲＧＤモチーフを欠くすべてのコロナウイルスの先祖とは対照的である。本発明者らの研究で明らかになったことは、αＶβ３アンタゴニストであるシレンジタイドの添加が、宿主への付着およびバリアー完全性の破壊の両方を有意に阻止するということである。

（実施例２）
（材料と方法）
（細胞およびウイルスの培養条件）
ヒト大腸細胞株（Ｃａｃｏ－２； ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３７）を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ高グルコース培地で維持した。初期誘導（primary derived）ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ； Promocell C-12271）を、１０，０００単位／ｍＬペニシリンと１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したEndothelial Cell Media MV(PromoCell)で維持した。ＨＡｏＥＣを１０ダイン／ｃｍ^２の剪断血行力学的力にさらして、血管ストレスの生理的条件を模倣した。ヒト２０１９－ｎＣｏＶ株2019-nCoV/Italy-INMI1を、European Virus Archive Global（参照番号：００８Ｖ－０３８９３）から入手し、この研究の期間中、０．４の感染多重度（ＭＯＩ、および１．０８×１０^５ ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルス力価で使用した。

（パラニトロフェニルリン酸感染モデル）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＣａｃｏ－２およびＨＡｏＥＣの相互作用を、蛍光基質パラニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を用いた結合アッセイ法で評価した。不活化ウイルスのアリコートを９６ウェルプレートに３７℃で２時間にわたって固定化し、続いて１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。細胞を３７℃で２時間にわたって播種した。処理した細胞にαＶβ３アンタゴニストであるシレンジタイド（H. Kessler（Technical University of Munchen、ドイツ）から寄贈）を、０．０５μＭ、０．００５μＭ、０．０００５μＭで１時間にわたって投与した。細胞には、同様の条件で、GLPG0187(MedChemExpress)またはSB-273005(SelleckChem)も投与した。細胞を固定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２上に加え、２時間にわたって接着させた。細胞内アルカリホスファターゼの基質として働く蛍光マーカーのパラニトロフェニルホスフェートを含む溶解緩衝液（０．１ＭのＮａＯＡｃ、１５ｍＭのｐＮＰＰ、０．１％のトリトンＸ－１００、ｐＨ＝５．５）を加えた。反応を１ＭのＮａＯＨで停止し、自動プレートリーダー(Victor, Perkins-Elmer)を用い、４０５ｎｍにおいて、ｐＮＰＰ活性を読み取った。細胞溶解後、得られた蛍光シグナルを４０５ｎｍの吸光度から測定した。結合率（％）は、未処理細胞に対する相対値で分析した。

（免疫蛍光顕微鏡検査）
剪断ＨＡｏＥＣ上のＶＥ－カドヘリン（血管内皮カドヘリン）発現を、免疫蛍光顕微鏡で測定した。剪断ＨＡｏＥＣをスライドグラスに固定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を２４時間にわたって行った。細胞はその後、蛍光マウンティング培地(Invitrogen)中で、AlexaFluor 488 (1:100, F-8 sc-9989, SantaCruz Biotechnology)および４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールを結合させた抗ＶＥ－カドヘリンマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体で染色した。処理された細胞を、０．０００５μＭのシレンジタイドに１時間にわたって暴露した。内在化ＶＥ－カドヘリンを測定するため、抗体インキュベーション後、細胞を短時間酸洗浄した（２５ｍＭのグリシン、３％のＢＳＡ、ｐＨ＝２．７）。その後、細胞を４％のホルムアルデヒドで固定し、透過処理した後、ＤＡＰＩでコートしたスライドグラスに載せて処理した。AxioObserver Z1顕微鏡（Zeiss）を用いて画像を取得した。ＶＥ－カドヘリンの濃度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（米国国立衛生研究所）を用いて、バックグラウンドから差し引いた細胞の蛍光強度を測定することにより計算した。

（ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウェスタンブロット）
エクス・ビボ感染アッセイ後、内皮細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、使用するまで－２０℃で保存した。サンプルを、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。この後、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、５％脱脂乳で１時間にわたってブロッキングした。抗ＶＥカドヘリン一次抗体(Clone: F-8, Cat. No: sc-9989, 1:200, SantaCruz)および抗ＧＡＰＤＨ一次抗体(6000-4-1 mouse mAB, 1:2000, ProteinTech)を用いて、終夜にわたって４℃で膜をプローブした。翌日、抗マウスＩｇＧ二次抗体(sc525405, 1:5000, SantaCruz)を用いた。化学発光を用いてタンパク質を検出した。

（蛍光ベースのタンパク質相互作用アッセイ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質と内皮αＶβ３との相互作用と、蛍光ベースのタンパク質アッセイを用いて定量した。プレートに２５ｎｇの組替えインテグリンαＶβ３(Cat.No. 3050-AV-050, BioTechne)を、終夜にわたって４℃で被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡを用いて３７℃で２時間にわたってブロックした。プレートは記載の方法で洗浄した。抗－β３モノクローナル抗体(Clone:B-7, Cat.No:SC-46655, SantaCruz)および抗－αＶβ３モノクローナル抗体(Clone: MAB1976, Sigma)を試薬希釈剤中に添加し（５μｇ／ｍＬ）、室温で１時間にたたって、スパイクタンパク質－インテグリン認識中のインテグリンサブユニットの直接的関与を試験した。この後、組換えスパイクタンパク質(Cat.No.:CSB-MP3324GMYSP, Cusabio)を、室温において５０ｎＭで１時間にわたって添加した。AlexaFluor 405に結合させた抗スパイクタンパク質(Clone: 1035206, BioTechne)を、１：１００で、暗所で１時間にわたって添加した。サンプルは、自動プレートリーダーを用いて、４０５ｎｍの吸光度を読み取った。

（分子モデリング）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質(Delta V.O.C.)および野生型の低温電子顕微鏡立体（Cryo-EM 3D）構造を、RCSB Protein Data Bank(PDB ID:7V8Aおよび7KNB)から入手した。野生型スパイクタンパク質はＭＯＥのProtein Builderツールを用いて置換変異誘発を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロンＶ．Ｏ．Ｃ．のモデルを作成した。ＦＡＳＴＡ配列をＮＣＢＩから取得し、ClustalOmega多重配列整列ツールを用いて整列させた。ＭＯＥのAMBER10:EHT力場を用いて複合体のエネルギー最小化を行い、分子内相互作用を決定し、ドッキング前後のモデリングバイアスを除去した。SCWRLアルゴリズムおよびAMBER2力場を用い、Yasaraの分子動力学シミュレーション機能によって結合親和性を得た。すべての構造および図は、Molecular Operating Environment (MOE)およびPyMolを用いて可視化し、作成した。

（結果と考察）
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト大腸上皮細胞への結合に対するシレンジタイドの効果）
図７に示すように、イン・ビトロ感染モデルにおいて、シレンジタイド（０．００５μＭおよび０．０５μＭ）は、ヒト大腸上皮細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を効果的に減少させた。

（シレンジタイドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質とαＶβ３の結合を阻害する）
本発明者らは、αＶβ３抗体およびβ３抗体の両方が、αＶβ３に対するスパイクタンパク質の結合を阻害することを示し、受容体間の有意な相互作用を明らかにした。シレンジタイドは、０．０００５μＭで組換えスパイクタンパク質とαＶβ３との結合を阻害する。これは図８に示されている。

（阻害剤ＧＬＰＧ０１８７およびＳＢ２７３００５、ならびにシレンジタイド存在下でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血管内皮細胞への接着）
その結果、αＶβ３インテグリン阻害剤ＧＬＰＧ０１８７およびＳＢ２７３００５は、ある濃度範囲（５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．００５ｍＭ）においてヒト血管内皮細胞へのウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の付着を阻害できなかった。これらの結果を図９に示す。

この所見とは対照的に、シレンジタイドは、ある濃度範囲（０．０５ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．０００５ｍＭ）でヒト血管内皮細胞へのウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の付着を用量依存的に阻害した。

これらのデータから、ヒト血管内皮細胞へのウイルス付着の阻止において、他のインテグリンアンタゴニストと比較して、シレンジタイドが予期せぬ有益な異なる挙動を示すことが示唆される。

（シレンジタイドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後のＶＥ－カドヘリンの内在化を阻止する）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、血管内皮は深刻な単層機能不全に陥り、ＶＥ－カドヘリンが細胞外から細胞内へと移動することが確認された。イン・ビトロ感染モデルにおいて、シレンジタイドの存在下でＶＥ－カドヘリンの内在化は阻止された（０．０００５μＭ）。ＶＥ－カドヘリン総量は健常細胞、感染細胞、および処理細胞のいずれにおいても不変に維持されており、ＶＥ－カドヘリンの移動パターンが明らかになった（図１０）。

（イン・シリコ・モデリング）
懸念されるα－、β－、γ－、δ－、およびο－スパイクタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体を整列させて、４０３－４０５のＲＧＤ部位の保存を示した（図１１）。ο－スパイクタンパク質とδ－スパイクタンパク質のイン・シリコモデリングから、ο－スパイクタンパク質のＲＧＤモチーフは、δ－スパイクタンパク質よりも溶媒に向かう外方へと延在していることが明らかになった。

（等価物）
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳細に説明するものである。これらの説明を考慮することにより、当業者には、その実施における多数の修正および変形が生じることが予想される。それらの修正および変形は、本明細書に添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (16)

1. 対象者のコロナウイルス感染の治療方法または予防方法における使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体であって、前記機能的変異体はＲＧＤ配列を含むことを特徴とする、シレンジタイドまたはその機能的変異体。
2. コロナウイルスが、スパイクタンパク質のレセプター結合領域にＲＧＤ領域を含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
3. コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象者がＣＯＶＩＤ－１９に罹患していることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
4. 血管内皮細胞上のαＶβ３インテグリンに結合することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
5. 前記シレンジタイドまたはその機能的変異体が、１０ｍｇ／ｍ^２未満の用量で投与されることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
6. 前記用量が１ｍｇ／ｍ^２未満であることを特徴とする、請求項５に記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
7. 感染に伴うバリア機能の喪失の早期治療または予防のための、請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
8. コロナウイルス感染に関連する心血管機能障害または影響の治療または予防における使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体であって、前記機能的変異体がＲＧＤ配列を含むことを特徴とする、シレンジタイドまたはその機能的変異体。
9. シレンジタイドまたはその機能的変異体、および任意選択的に少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物として製剤化されることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
10. 組成物が肺送達または静脈内送達のために処方されていることを特徴とする、請求項９に記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
11. 組成物が経口送達のために処方されていることを特徴とする、請求項９に記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
12. 前記シレンジタイドまたはその機能的変異体が、呼吸器疾患もしくは肺疾患またはその症状の治療に適した１つまたは複数の追加の薬剤とともに投与されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのシレンジタイドまたはその機能的変異体。
13. 対象者のコロナウイルス感染を治療または予防する方法であって、対象者に対して、シレンジタイドまたはその機能的変異体を投与することを含み、前記機能的変異体はＲＧＤ配列を含むことを特徴とする、方法。
14. 対象者のコロナウイルス感染に関連するバリア機能喪失を治療または予防する方法であって、対象者に対して、シレンジタイドまたはその機能的変異体を投与することを含み、前記機能的変異体はＲＧＤ配列を含むことを特徴とする、方法。
15. 対象者のコロナウイルス感染に関連する心血管機能障害または効果を治療または予防する方法であって、対象者に対して、シレンジタイドまたはその機能的変異体を投与することを含み、前記機能的変異体はＲＧＤ配列を含むことを特徴とする、方法。
16. コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、対象者がＣＯＶＩＤ－１９に罹患している、請求項１３から１５のいずれかに記載の方法。

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