JP2024506919A - Ｄａｐｋ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド及びその製薬上の用途 - Google Patents

Abstract

ＤＡＰＫ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド及びその製薬上の用途である本願は、低分子ポリペプチド医薬品開発の分野に関し、提供される低分子ポリペプチドは、虚血性脳卒中を予防及び治療する薬物の製造、及び同じメカニズムの、例えば、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、うつ病及び自閉症、神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病）などに用いることができる。

Description

本発明は、低分子ポリペプチド医薬品開発の分野に関し、特に、ＤＡＰＫ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド及びその製薬上の用途である。

「脳血管障害」としても知られる脳卒中（Ｓｔｒｏｋｅ）は、突然に発症し、局所的な神経障害を共通の特徴とする一連の急性脳血管疾患であり、発症率は高く、死亡率は高く、障害率は高く、再発率は高く、関連の医療費用は高く合併症は多いが、認知率は低く、治療率は低くコントロール率は低いのが特徴である。世界保健機関の統計によると、脳卒中は世界で第２位の死因であり、成人の身体障害の第１の原因であり、人間の健康と生活の質に深刻な影響を与え、患者の家族と社会に深刻な心理的負担及び経済的損失を及ぼしている。「中国脳卒中予防及び治療報告書２０１８」によると、脳卒中は我が国の成人の死亡と身体障害を引き起こす第一の要因であり、死亡人数が世界の脳血管疾患による死亡の約１／３を占めており、毎年１９６万人が脳血管疾患で死亡し、生存患者数は１２４２万であり、発症率は急速に上昇し、若年化の傾向を見せている。

脳卒中は虚血性及び出血性の２つのタイプに分かれ、そのうち虚血性脳卒中の方は、約８７％を占めており、血栓形成又は塞栓による血流の遮断が引き起こす深刻な神経疾患であり、患者は突然麻痺、言語機能障害又は視力喪失を起こし、あるいは死亡する。現在、効果的な治療は、組換え型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｒｔＰＡ）を用いる血栓溶解療法である。しかしながら、脳卒中のいわゆる治療機会の窓はあまりにも短く、実際の操作では時間をコントロールすることができず、加えて血液再灌流障害が頭蓋内出血を起こしやすいなどの難題があるため、現在、血栓溶解療法を用いられる患者は約５％しかなく、患者のほとんどが対症療法か支持療法を受けている。したがって、神経保護薬を用いて正常な神経細胞を保護し死んでいない神経組織を救うのは、脳梗塞の面積を減らすとともに、血栓溶解薬又は抗凝固療法の合併症を避けることができ、事前に詳しい病因認定と診断を行わなくてもよいため、早期治療が可能になり、また、神経保護薬は出血性脳卒中に使用できるため、その治療効果と将来性が見込まれ、近年脳卒中治療の研究でホットスポットとなっている。しかしながら、世界中の実験室が虚血性脳卒中の神経保護薬として開発している低分子化合物はすでに１０００種類を超えており、２００以上の臨床試験が行われているが、これまでに一般に認められている神経保護薬はまだないため、神経細胞死の軽減による脳卒中の効果的な治療のために、引き続き新しい薬物を開発し、新しい治療方法を検討することは極めて重要である。

虚血性脳卒中の場合は、酸素とグルコースの欠乏のためニューロンが細胞のエネルギーを枯渇させることで、複数のメカニズムが関与する複雑なカスケード反応が起こり、その相互作用がニューロンの損傷と死を引き起こす。これらの反応は、イオン恒常性の不均衡、活性酸素種（ＲＯＳ）と活性窒素種（ＲＮＳ）の発生、及びミトコンドリアの機能障害などを含み、最終的に細胞は壊死又はアポトーシスの２つの方式で死へと向かう。そのうち、カスケード反応に関与する細胞シグナル伝達経路において、細胞死関連プロテインキナーゼ１（Ｄｅａｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １、ＤＡＰＫ１）は、カルモジュリンによって調節されるセリン／トレオニンプロテインキナーゼであり、重要な役割を果たす。ＤＡＰＫ１－ＮＲ２Ｂ経路、ＤＡＰＫ１－ＤＡＮＧＥＲ経路、ＤＡＰＫ１－ｐ５３経路、ＤＡＰＫ１－Ｔａｕ経路などがいずれも酸素とグルコースの欠乏によって誘導される細胞死に関与しており、虚血と酸素欠乏動物モデルの急性治療でこれらのカスケードを遮断するとニューロンの死を効果的に低減させることができることが研究から明らかになったが、これまでにはこの観点から開発に成功した臨床治療用の効果的な薬物がまだなかったため、虚血性脳卒中に対してより多くの薬物を開発する必要がある。

ポリペプチドとは、一般に、アミノ酸の含有数が１００個以内である低分子タンパク質を指し、低分子化合物やタンパク質などの高分子薬物にない利点を有する。低分子化合物と同じように消化が不要であるため、直接注射しても早く吸収され、ほぼ１００％の吸収で利用され且つエネルギーを消費せず、胃腸機能負荷と代謝負荷を引き起こさず、ベクターとして吸収できる一方、高分子と同じように分子としてよく認識され、構造機能相関は明らかであり、薬力学的特性は顕著であり、薬物用量は少なく、生理活性は強く、毒性は小さく、副作用は少なくあるいはなく、蓄積されないため、近年、医薬品の開発で重要な方向性となっている。

［先行技術文献］
［非特許文献］
［非特許文献１］ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３６１４．２０１９．０２．００１ Ｌ Ｗａｎｇ，Ｊ Ｌｉｕ，Ｙ Ｙａｎｇ，Ｂ Ｐｅｎｇ，Ｙ Ｗａｎｇ（２０１９）Ｔｈｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｔｉｌｌ Ｆａｃｅ Ｈｕｇｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ－Ｂｒｉｅｆ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ Ｓｔｒｏｋｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，２０１８．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，３４：１０５－１９．
［非特許文献２］ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｎｍｏｌ．２０１６．０００４６ Ｐ Ｓｉｎｇｈ，Ｐ Ｒａｖａｎａｎ，Ｐ Ｔａｌｗａｒ（２０１６）Ｄｅａｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ １（ＤＡＰＫ１）：Ａ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，９：４６．
［非特許文献３］ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１２０３５－０１６－０００８－ｙ Ｓ Ｗａｎｇ，Ｘ Ｓｈｉ，Ｈ Ｌｉ，Ｐ Ｐａｎｇ，Ｌ Ｐｅｉ，Ｈ Ｓｈｅｎ，Ｙ Ｌｕ（２０１７）ＤＡＰＫ１ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ Ｓｔｒｏｋｅ：ｆｒｏｍ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５４：４７１６－４７２２．
［非特許文献４］ＤＯＩ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ５０５８０４２００ ＭＳｈａｍｌｏｏ，Ｌ Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｔ Ｗｉｅｌｏｃｈ，Ｋ Ｎｉｋｏｌｉｃｈ，Ｒ Ｕｒｆｅｒ，Ｄ Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ（２００５）Ｄｅａｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０：４２２９０－９．
［非特許文献５］ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｊ．ｃｄｄ．４４０２２１２ Ａ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ－Ｌｅｒｅｒ，Ａ Ｋｉｍｃｈｉ（２００７）ＤＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ ｕｎｄｅｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１４：１９０８－１５．
［非特許文献６］ＤＯＩ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４１４６７４２００ Ｗ Ｚｈａｎｇ，Ｓ Ｚｈｅｎｇ，Ｐ Ｓｔｏｒｚ，Ｗ Ｍｉｎ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １－ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８０：１９０３６－４４．
［非特許文献７］ＤＯＩ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．４４０７－０８．２００８ ＲＳｔｅｔｌｅｒ，Ｇ Ｃａｏ，Ｙ Ｇａｏ，Ｆ Ｚｈａｎｇ，Ｓ Ｗａｎｇ，Ｚ Ｗｅｎｇ，Ｐ Ｖｏｓｌｅｒ，Ｌ Ｚｈａｎｇ，Ａ Ｓｉｇｎｏｒｅ，Ｓ Ｇｒａｈａｍ，Ｊ Ｃｈｅｎ（２００８）Ｈｓｐ２７ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｅｓｓ－Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃａｓｃａｄｅ Ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２８：１３０３８－５５．
［非特許文献８］ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１－２２０２－４－３２ Ｙ Ｚｈａｎｇ，Ｘ Ｌｕ，Ｂ Ｂｈａｖｎａｎｉ（２００３）Ｅｑｕｉｎｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，４：３２．
［非特許文献９］ＤＯＩ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ７００５７９－ＭＣＰ２００ Ｓ Ｂｉａｌｉｋ，Ｈ Ｂｅｒｉｓｓｉ，Ａ Ｋｉｍｃｈｉ（２００８）Ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｄｅａｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，７：１０８９－９８．
［非特許文献１０］ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１２８６８－０１５－０１５８－２ Ｊ Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｋ Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｔ Ａｈｍｅｄ，Ｕ Ａｍｊａｄ，Ｂ Ｋｏ，Ｊ Ａｎ，Ｔ Ｍａｈｍｕｄ，Ｍ Ｓａｌａｍａ，Ｓ Ｍｅｉ，Ｄ Ａｓｅｍｏｔａ，Ｉ Ｍａｎｏ（２０１５）Ｄｅａｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（ＤＡＰＫ）－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．１６：２５．
［非特許文献１１］ＤＯＩ：１０．１０２１／ｂｉ０６０４１３ｙ Ａ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ａ Ｖｅｌｅｎｔｚａ，Ｄ Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ Ｄｒｅｓｉｏｓ（２００６）Ｄｅａｔｈ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５：１３６１４－２１．
［非特許文献１２］ＤＯＩ：１０．１１２８／ＭＣＢ．０１５９５－０６ Ａ Ｃｒａｉｇ，Ｊ Ｃｈｒｙｓｔａｌ，Ｋ Ｆｒａｓｅｒ，Ｎ Ｓｐｈｙｒｉｓ，Ｙ Ｌｉｎ，Ｂ Ｈａｒｒｉｏｎ，Ｍ Ｓｃｏｔｔ，Ｉ Ｄｏｒｎｒｅｉｔｅｒ，Ｔ Ｈｕｐｐ（２００７）Ｔｈｅ ＭＤＭｓ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ＤＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐ５３ Ｆｏｒｍｓ ａ Ｄｏｃｋｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒｓ．ＭＣＢ，２７：３５４２－５５．
［非特許文献１３］ＤＯＩ：１０．１０３８／ｅｍｂｏｒ．２００８．２４６ ＥＺａｌｃｋｖａｒ，Ｈ Ｂｅｒｉｓｓｉ，Ｌ Ｍｉｚｒａｃｈｙ，Ｙ Ｉｄｅｌｃｈｕｋ，Ｉ Ｋｏｒｅｎ，Ｍ Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈ Ｓａｂａｎａｙ，Ｒ．Ｐｉｎｋａｓ－Ｋｒａｍａｉｓｋｉ，Ａ Ｋｉｍｃｈｉ（２００９）ＤＡＰ－ｋｉｎａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＢＨ３ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｂｅｃｌｉｎ １ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｃｌｉｎ １ ｆｒｏｍ Ｂｃｌ－ＸＬ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，１０：２８５－９２．
［非特許文献１４］ＤＯＩ：１０．１１２８／ＭＣＢ．２４．１９．８６１１－８６２６．２００４ Ｇ Ｓｈａｎｉ，Ｌ Ｍａｒａｓｈ，Ｄ Ｇｏｚｕａｃｉｋ，Ｓ Ｂｉａｌｉｋ，Ｌ Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｇ Ｓｈｏｈａｔ，Ａ Ｋｉｍｃｈｉ（２００４）Ｄｅａｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ ＺＩＰ ｋｉｎａｓｅ，ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｋｉｎａｓｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｉｔｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＭＣＢ，２４：８６１１－２６．
［非特許文献１５］ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｊ．ｃｄｄ．４４０２２１２ Ａ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ－Ｌｅｒｎｅｒ，Ａ Ｋｉｍｃｈｉ（２００７）ＤＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＪＮＫ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｂｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ ｕｎｄｅｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，１４：１９０８－１５．
［非特許文献１６］ＤＯＩ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｉ０６１５６２ｊ Ｊ Ｆｒａｓｅｒ，Ｔ Ｈｕｐｐ（２００７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ ｔｈａｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＤＡＰＫ－１ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：２６５５－７３．
［非特許文献１７］ＤＯＩ．ｏｒｇ／１０．１５１７／１７５３００５０９０２８２３８２９ Ｊ Ｈｏｗｌ，Ｓ Ｊｏｎｅｓ（２００９）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＨＩＶ－Ｔａｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｎｏｔ ｊｕｓｔ ａｎｙ ｏｌｄ Ｔａｔ？（ＷＯ２００８０８２２５）．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ，１９：１３２９－１３３３．
［非特許文献１８］ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１７４７－０２８５．２０１１．０１３１５．ｘ Ｑ Ｇｕｏ，Ｇ Ｚｈａｏ，Ｆ Ｈａｏ，Ｙ Ｇｕａｎ（２０１２）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＡＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ，７９：６８３－６９０．
［非特許文献１９］ＤＯＩ：１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．１４６４－０７．２００７ Ｈ Ｃｕｉ，Ａ Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ Ｓｕｎ，Ｍ Ｂｅｌｍａｒｅｓ，Ｃ Ｃｏｂｅｙ，ＴＰｈａｎ，ＪＳｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍ Ｓａｌｔｅｒ，Ｙ Ｗａｎｇ，ＲＴａｓｋｅｒ，ＤＧａｒｍａｎ，ＪＲａｂｉｎｏｗｉｚ，Ｐ Ｌｕ，ＭＴｙｍｉａｎｓｋｉ（２００７）ＰＤＺ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ＮＭＤＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＳＤ－９５ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２７：９９０１－１５．
［非特許文献２０］ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｉｎｔ．２０１８．０１．００８ Ｗ Ｆａｎ，Ｘ Ｌｉ，Ｌ Ｈｕａｎｇ，Ｓ Ｈｅ，Ｚ Ｘｉｅ，Ｙ Ｆｕ，Ｗ Ｆａｎｇ，Ｙ Ｌｉ（２０１８）Ｓ－ｏｘｉｒａｃｅｔａｍ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ α７ ｎＡＣｈＲ ａｎｄ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＧＳＫ３β ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ，１１５：５０－６０．
［非特許文献２１］ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｔｒｏｋｅｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｄｉｓ．２０１９．０７．００４ Ｄ Ｘｕ，Ｎ Ｘｉａ，Ｋ Ｈｏｕ，Ｆ Ｌｉ，Ｓ Ｃｈｅｎ，Ｙ Ｈｕ，Ｗ Ｆａｎｇ，Ｙ Ｌｉ（２０１９）Ｃｌｅｍａｔｉｃｈｉｎｅｎｏｓｉｄｅ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｉｎｊｕｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｎｏｔｃｈ／ＮＦ－κＢ Ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ Ｓｔｒｏｋｅ Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ，２８：１０４２８８．
［非特許文献２２］ＤＯＩ：１０．１１６１／０１．ｓｔｒ．３１．１．１９３ Ｓ Ａｈｍｅｄ，Ｙ Ｈｅ，Ａ Ｎａｓｓｉｅｆ，Ｊ Ｘｕ，Ｘ Ｘｕ，Ｃ Ｈｓｕ，Ｆ Ｆａｒａｃｉ（２０００）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｎ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｓｔｒｏｋｅ，３１：１９３－９．
［非特許文献２３］ＤＯＩ：１０．１０９７／０１．ＷＣＢ．０００００９６０６３．８４０７０．Ｃ１ Ｉ Ｙｏｎｅｋｕｒａ，Ｎ Ｋａｗａｈａｒａ，Ｈ Ｎａｋａｔｏｍｉ，Ｋ Ｆｕｒｕｙａ，Ｔ Ｋｉｒｉｎｏ（２００４）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２４：１５１－８．
［非特許文献２４］ＤＯＩ：１０．１１５５／２０１８／６３８１９３２ Ｍ Ｒｕ，Ｈ Ｌｉｕ（２０１８）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｙ－Ｍａｚｅ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ，２０１８：６３８１９３２．
［非特許文献２５］ＤＯＩ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１０４２７３２００ ＡＶｅｌｅｎｔｚａ，Ａ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｃ Ｗｅｉｓｓ，Ｍ Ｅｇｌｉ，Ｄ Ｗａｔｔｅｒｓｏｎ（２００１）Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：３８９４５－６５．

本発明では、上記の当分野の要望から、低分子ポリペプチド薬物という方向で虚血性脳卒中薬物の開発を行い、研究結果に基づいて、虚血性脳卒中を予防及び治療する薬物の開発方法、及び低分子ポリペプチド、その中間生成物（遺伝子配列、発現ベクター）及び虚血性脳卒中を予防及び治療する薬物の製造におけるその用途を提供する。

具体的には、本発明は以下の技術的解決手段の保護を主張する。
１．アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に示されるとおりであることを特徴とするＤＡＰＫ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド。

２．下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸モチーフを備え、
（Ａ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）Ｘ２（Ｓ／Ｔ／Ａ）Ｘ１ＸＸＸ
（Ｂ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）Ｘ２（Ｒ／Ｋ）（Ｓ／Ｔ／Ａ）Ｘ１ＸＸＸ
ただし、各Ｘは、独立的に、いかなるアミノ酸から選ばれてもよく又はアミノ酸がなく、
Ｘ１は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）から選ばれる極性アミノ酸であり、
Ｘ２は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）及びバリン（Ｖ）から選ばれる非極性アミノであり、
ただし、Ｒ／Ｋとは、当該位置においてアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）のいずれでもよいことであり、
ただし、Ｓ／Ｔ／Ａとは、当該位置において、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）又はアラニン（Ａ）のいずれでもよいことであり、
好ましくは、アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも一方に比べて、２つ以下のアミノ酸が違い、即ち、少なくとも８５％の同一性を有することを特徴とするＤＡＰＫ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド。

３．アミノ酸配列が、配列番号６～５４のいずれかに示されるとおりである実施例２に記載の人工低分子干渉ペプチド。

４．構造が、ステープルペプチド又は環状ペプチドであり、例えば、首尾による環形成（アミド結合）、側鎖による環形成、チオエステル結合による環形成、ラクトン結合による環形成、Ｓｅ－ＣｙｓとＳｅ－Ｃｙｓの酸化による環形成、又はジスルフィド結合による環状ペプチドである実施例２に記載の人工低分子干渉ペプチドの模倣ペプチド。

５．人工低分子干渉ペプチドに比べて、ペプチド鎖におけるアミノ酸の順番はＣ末端からＮ末端までに変わっている実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチドのレトロポリペプチド。

６．前記人工低分子干渉ペプチドに比べて、前記人工低分子干渉ペプチドにおける各Ｌ－アミノ酸残基がその対応するＤ型アミノ酸によって置き換えられ、アミノ酸配列は逆になっていると同時に側鎖の元の空間方向及びキラリティーは前記人工低分子干渉ペプチドと同じであり、即ち、前記人工低分子干渉ペプチドと似ている側鎖トポロジー構造が保たれる実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチドのＤ型レトロインベルソペプチド。

７．実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチドにおけるいずれか１つ又は複数のアミノ酸がその対応するＤ型アミノ酸又はホモアミノ酸に置き換えられて得られることを特徴とする実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチドの誘導体ペプチド。

８． ２つ以上の低分子ペプチドが同じ方向に並列する方式で重合して構成され、そのうち各低分子ペプチドのＣ末端は遊離しており、全ての低分子ペプチドのＮ末端は、送達ベクターに接続されるために集まっており、
前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は実施例７に記載の誘導体ペプチドから選ばれることを特徴とするポリペプチド。

９．低分子ペプチドのＮ末端又はＣ末端に１種又は複数種の送達ベクターが融合されて構成され、
前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は実施例７に記載の誘導体ペプチドから選ばれることを特徴とする融合ポリペプチド。

１０．前記送達ベクターが、膜透過性ペプチド、リガンド、受容体タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗体又は高分子重合体から選ばれ、
前記膜透過性ペプチドが、カチオン性細胞膜透過性ペプチド、両親媒性細胞膜透過性ペプチド、疎水性細胞膜透過性ペプチド又は合成細胞膜透過性ペプチドから選ばれ、
前記高分子重合体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンオキシド、ポリジオキサノン、ポリプロピレンフマレート、トリメチレンカーボネート、ポリエステルアミドオキシラン、エステルアミド、β－ヒドロキシフェニルプロピオネート、α－ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリイミドカーボネート、ポリウレタン、ポリ無水物、ヒアルロン酸、キトサン、セルロース、ゼラチン、コラーゲンから選ばれることを特徴とする実施例８に記載のポリペプチド又は実施例９に記載の融合ポリペプチド。

１１．前記カチオン性細胞膜透過性ペプチドが、配列番号５５～配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる群から選ばれ、
前記両親媒性細胞膜透過性ペプチドが、配列番号７３～配列番号８１に示されるアミノ酸配列からなる群から選ばれ、
前記疎水性細胞膜透過性ペプチドが、配列番号８２～配列番号８５に示されるアミノ酸配列からなる群から選ばれ、
前記合成細胞膜透過性ペプチドが、配列番号８６に示されるアミノ酸配列を備えることを特徴とする実施例１０に記載の融合ポリペプチド。

１２．前記人工低分子干渉ペプチドが、配列番号１～３、配列番号６～５４のいずれかに示されるアミノ酸配列を備え、前記膜透過性ペプチドが、配列番号５５～配列番号８６のいずれかに示されるアミノ酸配列を備えることを特徴とする実施例１１に記載の融合ポリペプチド。

１３．アミノ酸配列が、配列番号８７～配列番号９６のいずれかに示されるとおりであることを特徴とする実施例１０に記載の融合ポリペプチド。

１４．低分子ポリペプチドをコードし、前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチドから選ばれることを特徴とする人工的に製造された核酸分子。

１５．実施例１４に記載の核酸分子がロードされていることを特徴とする発現ベクター。

１６．実施例１５に記載のベクターを含有する細胞株又は無細胞発現系であることを特徴とする発現系。

１７．実施例１４に記載の発現系によって発現され、主な成分は、低分子ポリペプチドであり、前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチドから選ばれることを特徴とする発現産物。

１８．ポリペプチド分子と、薬学的に許容される不純物、添加物、溶媒、保護剤、アジュバント、担体及び／又は賦形剤とを含有し、そのうち、前記ポリペプチド分子は、
（１）実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、若しくは実施例７に記載の誘導体ペプチド、又は
（２）低分子ペプチドの修飾物であり、前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、若しくは実施例７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、前記修飾とは、
Ｎ末端、Ｃ末端修飾、標識、環化、脂質化、Ｎ－メチル化、ミリストイル化及びパルミトイル化、グリコシル化、ビオチン化、ＰＥＧ修飾、蛍光標識のうちの１つ又は複数であることを特徴とする薬物。

１９．剤形は、吸入用エアロゾル製剤、経口剤、静脈内投与、動脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、滑膜（腔）内投与、胸骨内投与、又は脊髄内投与用の製剤であることを特徴とする実施例１８に記載の薬物。

２０．低分子ペプチドの製薬上の用途であって、
前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は実施例７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、
前記製薬上の用途とは、興奮毒性メカニズムに関連する疾患を治療又は予防する薬物を製造するために用いられることであり、前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されず、
前記神経変性疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする用途。

２１．低分子ペプチドの製薬上の用途であって、
前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は実施例７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、前記製薬上の用途とは、ＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路に関連する生理学的異常を治療又は予防する薬物を製造するために用いられることであり、前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されず、
前記神経変性疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする用途。

２２．実施例１８又は１９に記載の薬物と、抗凝固薬又は抗血小板薬とを含み、
好ましくは、実施例１８又は１９に記載の薬物及び前記抗凝固薬又は抗血小板薬は、１回用量、１日用量又は１クール用量単位で組み合わせてまとめて包装され、
ただし、前記抗凝固薬とは、アセノクマロール、４－ヒドロキシ－３－（１，２，３，４－テトラヒドロ－１－ナフチル）クマリン（クマテトラリル）、ジクマロール、ジクマロールエチル、フェンプロクモン、ワルファリン、ジフェナジオン、フェニンジオン、チオクロマロール、ベミパリン、セルトパリンナトリウム、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸、アピキサバン、ベトリキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバーロキサバン、ヒルジン、ビバリルジン、組換え型ヒルジン、デシルジンヒルジン、アルガトロバン、ダビガトランエテキシラート、メラガトラン、キシメラガトラン、デフィブロチド、アンチトロンビンIII、ヘパリン、クマディン錠、ダビガトランエテキシラート、アピキサバン（商品名エリキュース）、エドキサバン、エノキサパリン、フォンダパリヌクス、組換え型組織プラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、サルプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、アンクロド、フィブリノリジン、ブリナーゼ、又はそれらの組成物であり、
前記抗血小板薬とは、クロピドグレル、チカグレロル、プラスグレル、ジピリダモール、シロスタゾール、チクロピジン、エプチフィバチド、アスピリン、アブシキシマブ、チロフィバン、ベラプロスト、プロスタサイクリン、イロプロスト、トレプロスチニル、アロキシピリン、カルバスピリンカルシウム、インドブフェン、トリフルサル、ピコタミド、テルトロバン、クロリクロメン、ジタゾール、又はそれらの組成物であることを特徴とする薬物の組み合わせ。

２３．低分子ペプチドの疾患治療のための用途であって、
前記低分子ペプチドは、実施例１～３のいずれかに記載の人工低分子干渉ペプチド、実施例５に記載のレトロポリペプチド、実施例６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は実施例７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、
ただし、投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇまでであり、ここに記載の低分子ペプチドの濃度は、大きく変えてもよく、且つ、選択される投与方式及び対象の体重、年齢、性別などによって選択され、
好ましい用量範囲は、用量が０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇまでであり、
より好ましい用量範囲は、用量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇまでであり、
又は、１つの対象又は１群の対象における治療計画を最適化するために用量範囲を変え、
前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されず、
前記神経変性疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする用途。

２９３Ｔ細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞に酸化ストレスによる損傷が生じた後、ＤＡＰＫ１は活性化されてそれと相互作用するプロテインキナーゼＤ１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｄ１、ＰＫＤ１）のリン酸化を引き起こし、ＰＫＤ１の活性化は、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ １、ＡＳＫ１）に対する結合及びその下流で誘導されるｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ｃ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ、ＪＮＫ）のリン酸化にとって極めて重要であることが報告されており、ＡＳＫ１依存性ＪＮＫシグナル伝達経路は、虚血後にカスパーゼ依存性のアポトーシス及びカスパーゼ非依存性の壊死性細胞死を媒介することも研究から明らかになった。しかしながら、虚血と酸素欠乏下で、ニューロンのＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路が細胞死を引き起こすカスケード反応に関与するかどうかを結論付けている報告や、ＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路の干渉又は遮断は、虚血性神経損傷を効果的に軽減できるかどうか、虚血性脳卒中の治療薬物を開発するための新しい分子標的になれるかどうかに関する報告はまだなかった。

本発明者は、虚血性神経損傷に対するＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路の影響について仮説を打ち出し、これに基づいてＰＫＤの干渉ペプチドを設計し、この上に同じモチーフを備える一連の低分子ペプチドを誘導している。これらの低分子ポリペプチドについて細胞及び動物モデルにおいて一連の試験を行って、本発明の技術的解決手段を得ている。ＰＫＤ１とは、プロテインキナーゼＤ（Ｐｒｏｔａｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｄ、ＰＫＤ）ファミリーに属するプロテインキナーゼＤ１を指し、細胞の中で広範に発現される細胞質セリン－トレオニンキナーゼであり、独特な構造、酵素学的性質及び調節特性を備える。ＰＫＤファミリーは、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３の３つのメンバーを有し、ＰＫＤ２及びＰＫＤ３よりも、ＰＫＤ１の方の研究が多く、一般には、ＰＫＤ２及びＰＫＤ１は分布及び機能において似ており、ＰＫＤ３は主に細胞質と細胞核の間を往復すると考えられている。ドメインに関しては、ＰＫＤの３つのメンバーには高度な相同性がある。ＰＫＤは、ゴルジ体の自己組織化及び形質膜によって誘導される輸送、転移、免疫応答、アポトーシス及び細胞増殖を含む多くの細胞機能に関与することが報告されている（ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｉｏｌ．０００３７．２０１０，生理科学進展，２０１１年第４２卷第５期）。

本発明によって開発される低分子ポリペプチド薬物をインビトロの酸化ストレスによる損傷モデル及び動物全体脳卒中モデルに用いたところ、試験データは次のことを証明した。本発明によって開発される低分子ポリペプチド薬物は、グルタミン酸塩アポトーシスモデルにおいて顕著な神経保護効果を有し、酸素グルコース欠乏が引き起こす初代ニューロンの損傷を効果的に阻害しており、即ち、それはニューロンのＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路に効果的に干渉して、その下流が引き起こすニューロンのカスパーゼ依存性のアポトーシス及びカスパーゼ非依存性の壊死のシグナルを阻害し、虚血性脳卒中後の脳損傷を軽減することができる。したがって、本発明によって開発される低分子干渉ペプチドは、興奮毒性メカニズムに関連する疾患を治療又は予防する薬物の製造に用いることができ、前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病）、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されない。

用語の定義：
用語「天然アミノ酸」とは、生物の体内で自動的に生成される２０種類の通常アミノ酸を指し、一般には、Ｌ型アミノ酸である。

用語「Ｄ型アミノ酸」とは、Ｌ型アミノ酸と構造上キラリティーを備えるアミノ酸を指し、Ｄ－グリセルアルデヒドによって人工的に合成されるアミノ酸である。グリシンを除き、残りのアミノ酸は全て立体異性体（構造の鏡像）を備える。

用語「ホモアミノ酸」（Ｈｏｍｏ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）とは、長鎖アミノ酸と呼ばれ、天然アミノ酸の誘導体であり、１つのメチレン基（ＣＨ_２）をカルボキシ基に隣接する天然のアミノ酸炭素骨格に挿入することより、アミノ酸の炭素鎖を延長させるものであり、これによりポリペプチドの生理活性及び生物学的安定性を改善するものである。

用語「ポリペプチド」、「人工低分子ポリペプチド」は、特に定義又は説明がない限り、いずれも当分野で一般に理解されているアミノ酸配列の特徴を備え、例えば、そのアミノ酸残基は天然のＬ型アミノ酸であり、アミノ酸配列において左末端がα－ＮＨ_２基であり、即ち左側はＮ末端であり、右末端がα－ＣＯＯＨ基であり、即ち右側はＣ末端である。

用語「レトロポリペプチド」は、元のペプチド鎖に比べて、ペプチド鎖におけるアミノ酸の順番がＣ末端からＮ末端までに変わっているものである。例えば、^ＮＳＧＶＲＲＲＲＬＳＮＶＳＬ^Ｃのレトロポリペプチドは、^ＮＬＳＶＮＳＬＲＲＲＲＶＧＳ^Ｃである。

用語「Ｄ型レトロインベルソペプチド」は、天然のＬ型アミノ酸によって構成される元のＬ－アミノ酸からなるペプチドに比べて、元のＬ－アミノ酸からなるペプチドにおける各Ｌ－アミノ酸残基がその対応するＤ型アミノ酸によって置き換えられて得られるものであり、そのアミノ酸配列は逆になっていると同時にその側鎖の元の空間方向及びキラリティーは元のＬ－アミノ酸からなるペプチドと同じであり、即ち、元のＬ－アミノ酸からなるペプチドと似ている側鎖トポロジー構造が保たれる。

図１は、本発明の融合ポリペプチドＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５の同定及び質量分析結果を示し、 （Ａ）ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５の精製産物のＲＰ－ＨＰＬＣ分析のクロマトグラム：合成、精製を経てＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５を生成した後、逆相ＨＰＬＣで分析し、２１０ｎｍで定量し、そのピークの保持時間は１１．７９７分（矢印が指すところ）であり、最終生成物の純度は９８．３％であった。 （Ｂ）ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５の質量スペクトル：液体クロマトグラフィー質量分析でＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチドを同定し、合成ペプチドの分子量は２９２０．０ダルトンであり（矢印が指すところ）、理論上の分子量は２９１９．４３ダルトンであることが分析から明らかになった。 図２は、グルタミン酸によって誘導されるＨＴ２２細胞死に対する本発明の融合ポリペプチドの影響を示し、 （Ａ）３７℃で、０～１６００ｎＭの５つの異なる濃度のＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５を含有しているＨＴ２２細胞を６ｍＭのグルタミン酸（ＧＬＵＴ）の中に２４時間曝露し、ＭＴＴアッセイより決定された細胞の細胞毒性であった。濃度０ｎＭのＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５群を対照とした。細胞死率（％）＝１００％×（対照ＯＤ－投与ＯＤ）／対照ＯＤであった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）であり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で、一元配置分散分析であり、次に、濃度０ｎＭのＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５群と多重比較した（ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）のｔ検定）。（Ｂ）実験の手順及びサンプリング計画である。 図３は、本発明の融合ポリペプチドのニューロンの酸素グルコース欠乏／再灌流モデル（ＯＧＤ／Ｒ）における神経保護機能及び異なる融合ポリペプチドの比較を示し、 （Ａ）ＯＧＤ処理の３０分間前に、異なる濃度のＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５、ＲｖＴＡＴ－ＺＩＰＫ－Ｔ２９９、ＲｖＴＡＴ－ｏｐＭＬＣ－Ｓ２０をラットの初代皮質ニューロン（ＤＩＶ７）に添加した。ＯＧＤ誘導のために、２０ｍＭのｐＨ ７．２の亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）及び被験薬を含有しているＥＢＳＳ（即ち、アールの（Ｅａｒｌｅ’ｓ）平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ））で１．５時間一過性作用し、その後、再灌流をシミュレートするためにＯＧＤ培地を通常のＮＳ基礎培地に置き換え、培養細胞をさらに２０時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイより細胞毒性を測定した。非ＯＧＤ処理細胞培養物が１００％生存しているため対照とし、被験薬による細胞死（％）＝１００％×（対照ＯＤ－被験薬ＯＤ）／対照ＯＤであった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）であり、＊＊＊ｐ＜０．００５で、一元配置分散分析であり、次に、ＯＧＤ対照群と多重比較した（ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）のｔ検定）。（Ｂ）実験の手順及びサンプリング計画である。 図４は、グルタミン酸によって誘導されるＨＴ２２細胞死に対する異なる融合ポリペプチドの影響の比較であり、 ３７℃で、培地の中に４００ｎＭの異なる被験薬（ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５、ＲｖＴＡＴ－ＺＩＰＫ－Ｔ２９９、ＲｖＴＡＴ－ｒＳＰ６－Ｓ２３５、ＲｖＴＡＴ－ｏｐＭＬＣ－Ｓ２０、ＲｖＴＡＴ－ＢＥＣＮ１－Ｔ１９９）が含まれているＨＴ２２細胞を６ｍＭのグルタミン酸に曝露し、２４時間静置した後、ＭＴＴアッセイにより細胞毒性を決定した。培地の中に被験薬が含まれないＨＴ２２細胞を６ｍＭのグルタミン酸塩だけに曝露したものを対照とした。細胞死（％）＝１００％×（対照ＯＤ－投与ＯＤ）／対照ＯＤ。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）であり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１で、一元配置分散分析であり、次に、グルタミン酸対照群と多重比較した（ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）のｔ検定）。 図５は、動物全体の一過性中大脳動脈閉塞と再灌流モデルに対する本発明の融合ポリペプチドの神経保護機能を示し、 （Ａ）実験の手順及びサンプリング計画であり、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに９０分間の中大脳動脈閉塞を行ってから再灌流を開始し（ｔＭＣＡＯ／Ｒ）、４．５時間後に３．５ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇの静脈内注射治療を受け（ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５又は対照としての生理食塩水）、一部の虚血再灌流ラットは２４時間後にＴＴＣ染色を行い、残りの動物は３日目、５日目及び７日目にロータロッド試験を行い、 （Ｂ）脳スライスの代表的な画像、 （Ｃ）生理食塩水群及びＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５治療群のラットの脳梗塞サイズの定量的比較（生理食塩水群ｎ＝１３、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５群ｎ＝１２）、 （Ｄ）ロータロッド試験で運動能力を評価し、ロータロッド装置におけるラットがロータロッドから落下するまでの時間を記録した。（偽手術群ｎ＝８、生理食塩水群ｎ＝６、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５群ｎ＝１０）。データは平均±ＳＥＭであり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定であった。盲検法を用いて動物に対してランダムに群分けして治療した。 図６は、一過性全脳虚血再灌流動物全体脳卒中モデルに対する本発明の融合ポリペプチドの神経保護機能を示し、 （Ａ）実験の手順及びサンプリング計画であり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側の頸動脈を２０分間２回閉塞した後に再灌流し（ｔＢＣＣＡＯ／Ｒ）、ｔＢＣＣＡＯから３時間後に、尾静脈からの７ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇのＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５又は等量の生理食塩水での治療で処理し、２４時間再灌流した後、Ｙ字型迷路による受動的回避試験で検定し、そしてＭＤＡを測定し、脳内の水分含有量を測定し、 （Ｂ）足への電気ショックを受け電気ショック領域を避けることを学んだマウスに対し、Ｙ字型迷路による受動的回避試験で虚血マウスの学習及び記憶能力をテスト及び評価し、 （Ｃ）２４時間再灌流後の脳内のＭＤＡ含有量のＥＬＩＳＡ測定 （Ｄ）２４時間再灌流後の脳内の水分含有量の測定 データは平均±ＳＥＭ（各群ｎ＝１１）であり、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１であり、生理食塩水対照群と比較し、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定であった。盲検法を用いて動物に対してランダムに群分けして治療した。

以下に図面を参照して説明される実施例は例示的なものであり、本願に対する限定ではなく、本願の解釈に供する。当業者は、本願の実施例に基づいて、新規性のある作業をすることなく得ている他の実施例の全てが、本願の請求範囲に属する。

一．低分子干渉ペプチドの開発
本発明者は、虚血性神経損傷に対するＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路の影響について仮説を打ち出し、プロテインキナーゼＤの１９７位と２１０位との間のアミノ酸を選んで低分子干渉ペプチド（ＰＫＤ－Ｓ２０５）を構成し、表１の配列番号１に示すとおりである。

ＤＡＰＫ１には様々なリン酸化特異的基質があるため、ストレス応答によって引き起こされるシグナルカスケード反応では、ＰＫＤ１との相互作用の他に、ＤＡＰＫ１はミオシンＩＩ制御性軽鎖（ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、ＭＬＣ）をリン酸化してミオシンを活性化することにより、細胞膜の空胞化を引き起こす。ＤＡＰＫ１はリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ、ｒＳＰ６）の２３５位のセリン（Ｓｅｒ２３５）をリン酸化して、タンパク質の翻訳率を低下させている。ＤＡＰＫ１はオートファジー誘導タンパク質Ｂｅｃｌｉｎ １（ＢＥＣＮ１）のＢＨ３ドメインの１１９位のトレオニン（Ｔｈｒ１１９）をリン酸化して、Ｂｅｃｌｉｎ １のＢ細胞リンパ腫特大型（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ－ｅｘｔｒａｌａｒｇｅ、Ｂｃｌ－ＸＬ）からの解離を促進し、オートファジーを誘導する。ＤＡＰＫ１はジッパー相互作用プロテインキナーゼ（Ｚｉｐｐｅｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ、ＺＩＰＫ）の２９９位のトレオニンをリン酸化することによりその細胞内位置を変えさせて、細胞死を促進する。

本発明は、また、ＤＡＰＫ１のこれらのリン酸化基質のリン酸化部位に対して、表１の配列番号２～６に示される干渉ペプチドを設計している。

二．細胞膜透過性ペプチド
細胞膜透過性ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＰＰｓ）は、特異的な膜受容体に依存せず独立で細胞膜又は組織関門（例えば、血液脳関門）を通過できる短いペプチドであり、一般に３０個以下のアミノ酸からなり、エンドサイトーシスや直接透過などのメカニズムによりタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの高分子を細胞に運び入れてそのエフェクター機能を発揮させることができ、細胞に入った後に正常に分解されるため、良好な生体適合性を有し、細胞毒性は小さい。

当分野で熟知されている膜透過性ペプチド（例えば、下表に示されるもの）を本発明に用いることができる。

三．融合ポリペプチド
本発明の例示的な実施例ではＴＡＴ（４７～５７）のレトロ配列ＴＡＴ（ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ）を膜透過性ペプチドとして選んで本発明によって開発されている低分子干渉ペプチドに接続させて融合分子を得て、膜透過性ペプチドは低分子干渉ペプチドのＮ末端又はＣ末端に接続され、本発明一部の融合ポリペプチドのアミノ酸配列は下表に示すとおりである。

四．融合ポリペプチドの作製
融合ポリペプチドは、発現系によって発現され、次に、精製されてもよく、これは当分野の成熟している技術であるため、説明を省略する。

本発明によって提供される融合ポリペプチドは、低分子ポリペプチドであり、化学合成を用いることが好ましい。

本発明の後の試験に用いる融合ポリペプチドは、金斯瑞科技生物股▼フン▲公司（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃｈｉｎａ）によってＦｍｏｃに基づく化学的ペプチド固相合成法（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＳＰＰＳ）を利用して合成されたものである。

ＳＰＰＳ法は、アミノ酸を順次樹脂に添加してペプチド鎖を構築することである。合成を完了した後、Ｎ末端でＦｍｏｃ基を脱保護し、次に、側鎖保護基を脱保護し、次に、ペプチドを樹脂から切り出し、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製し、精製溶媒は、アセトニトリル＋脱イオン水であり、それぞれ０．１％のトリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）を加えて緩衝液として、グラジエント溶出を行った。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで純度は９５％より大きいことを確認し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＥＳＩ－ＭＳ）によってその分子量を測定することで成分を決定した（図１）。Ｖａｒｉｏ ＭＩＣＲＯ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて窒素定量法でポリペプチドの含有量を測定した。実際のポリペプチド量は、重量×純度×含有量で計算した。

本明細書で融合ポリペプチドはいずれも白い粉末であり、－２０℃の暗所で保存し、水に完全に可溶であり、滅菌水又は生理食塩水において２００μＭのストック溶液として調製し、損傷モデルにおいて０．１～２μＭの濃度範囲で評価した。

五．インビトロの酸化ストレスによる損傷モデル
１．ＨＴ２２マウス海馬ニューロン株のグルタミン酸負荷モデル
試薬：
ＮＳ基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｉｂｃｏ１０８８８０２２
ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ））：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １０５６９０７７
Ｂ－２７^商標 プラス サプリメント（Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（５０×）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇｉｂｃｏ Ａ３５８２８０１
１．１ グルタミン酸負荷試験
ＨＴ２２マウス海馬ニューロン株細胞を培養し、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えているＤＭＥＭ培地において保持した。細胞を３７℃で５％のＣＯ_２／９５％の空気において保持した。薬物試験を行う時には、６×１０^３個の細胞／ウェルでＨＴ２２細胞を９６ウェルプレートに接種してＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２４時間培養した後、培地を２％のＢ２７（Ｂ－２７^商標 Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×））を添加しているＮＳ基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、及び異なる濃度の被験薬と交換し、ＨＴ２２細胞を６ｍＭのグルタミン酸に曝露して、３７℃で、ＣＯ_２インキュベーターにおいてさらに２４時間持続的に培養した。ＭＴＴ比色アッセイで細胞生存率を測定した。

１．２ ＭＴＴアッセイによる細胞生存率の分析と評価
３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＭＴＴ）測定法で細胞生存率を定量的に測定した。

水溶性の黄色色素ＭＴＴ試薬（最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えて、３７℃でインキュベートした。４時間後、インキュベーション培地を除去して、１００μＬのジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｉｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）を加え、室温で３０分間溶解した後、分光光度法でホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）溶液の５７０ｎｍでの吸光度を測定した。

未処理及び処理済み対照に対する細胞生存率の比を示すために、ＭＴＴ吸光度データを変換し、未処理対照を１００％の生存率と見なす。

１．３ 試験結果
ＨＴ２２細胞を６ｍＭのグルタミン酸塩に曝露すると同時に、異なる濃度のＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ポリペプチドを加え、２４時間後にＭＴＴ比色アッセイで細胞生存率を測定したところ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ及び１６００ｎＭのＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチドが、細胞死をそれぞれ１１％、２２％、３２％、２４％低減させることができた。４００ｎＭ及び１６００ｎＭは顕著な神経保護効果を示しているが、１６００ｎＭの方が神経保護効果は低下していた。

試験結果から、本発明によって提供されるＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５キメラペプチドはグルタミン酸塩アポトーシスモデルにおいて顕著な濃度依存性神経保護効果を有することが明らかになり、且つ、４００ｎＭはＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ポリペプチドの最適な投与濃度であることが示された（図２）。

２．ラットの皮質ニューロン初代培養物の酸素グルコース欠乏（Ｏｘｙｇｅｎ－Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ、ＯＧＤ）再灌流モデル
試薬：
ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３００３０
アールの（Ｅａｒｌｅ’ｓ）平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １４１５５０６３
２．１ 酸素グルコース欠乏再灌流試験
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットの胎生１５日目～１８日目に皮質ニューロンの初代培養物を調製し（Ｗｅｎｘｉａｎｇ Ｆａｎ，Ｘｉａｎｇ Ｌｉ，ＬｉａｎｇｌｉａｎｇＨｕａｎｇ，ＳｈｕｃｈｅｎｇＨｅ，ＺｈｉｃｈｅｎｇＸｉｅ，ＹｕｘｉｎＦｕ，ＷｅｉｒｏｎｇＦａｎｇ，ＹｕｎｍａｎＬｉ Ｓ－ｏｘｉｒａｃｅｔａｍ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ α７ ｎＡＣｈＲ ａｎｄ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＧＳＫ３β ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔｓ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌｕｍｅ １１５，Ｍａｙ ２０１８，Ｐａｇｅｓ ５０－６０ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｉｎｔ．２０１８．０１．００８）、具体的には次のとおりであった。大脳皮質をダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）において解離し、０．２５％のトリプシンで消化し、３７℃で５分間消化した後、ウシ胎児血清（最終濃度１０％）を添加して消化を停止させた。次に、５００ｇで５分間遠心分離した後、パスツールピペットで繰り返しピペッティングすることによって得られた。２％のＢ２７（ｖ／ｖ）、１ｍＭのグルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンを追加しているＮＳ基礎培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）において細胞を解離した。細胞を２４ウェルプレート（０．１ｍｇ／ｍＬのポリＤ－リシンでコーティング）に播種し、各ウェルの密度は１．５×１０^５個の細胞であり、続いて３日ごとに培地を１回交換した。３７℃で、５％のＣＯ_２／９５％の空気の加湿インキュベーターにおいて培養し、使用に備えて７日間保持した。

酸素グルコース欠乏試験は、以前に確立された方法（Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｎ．Ｄ．Ｋｏｄｉｔｈｕｗａｋｋｕ，Ｗ．Ｈｅ，Ｙ．Ｚｈｏｕ，Ｗ．Ｆａｎ，Ｗ．Ｆａｎｇ，Ｇ．Ｈｅ，Ｑ．Ｗｕ，Ｓ．Ｃｈｕ，Ｙ．Ｌｉ Ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｇｅｎｔ Ｎ２ ｏｎ ｒａｔ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，９５（２０１５），ｐｐ．１２－２１）に基づき、いくつかの修正を加えて生体内の虚血と再灌流（Ｉｓｃｈｅｍｉａ／Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ、Ｉ／Ｒ）傷害をシミュレートするものであり、具体的には次のとおりであった。ＯＧＤに曝露する前に、薬物試験群の初代培養では、ＮＳ基礎培地に異なる濃度の被験薬を加え、ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で３０分間静置した後、全ての初代培養から培地を除去し、ＯＧＤ群をグルコースなしアールの（Ｅａｒｌｅ’ｓ）平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）に置き換え、当該溶液は、被験薬を含有している又は含まない亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４、２０ｍＭ、ｐＨ ７．２）であり、対照群を６ｍＭのグルコースを含有しているＥＢＳＳに置き換え、３７℃で引き続き１．５時間インキュベートした。通常のＮＳ基礎培地と交換することによりＯＧＤ負荷を停止させ、３７℃でさらに２０時間インキュベートした。最後に、ＭＴＴ比色アッセイ測定法で細胞生存率を測定した（１．２と同じ）。

２．２ 試験結果
初代ニューロンには、ＯＧＤの３０分間前に２つの濃度段階のＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ポリペプチドを加え、次に、亜ジチオン酸ナトリウムを加えてニューロンの酸素とグルコース欠乏を６０分間誘導し、当該期間後、通常のグルコース及び酸素培養条件に回復させ、２０時間後にＭＴＴ比色アッセイで細胞生存率を測定した。

図３に示されるとおり、酸素グルコース欠乏ニューロンに対するＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５の保護効果は、濃度依存的な用量効果関係を有しており、３００及び１０００ｎＭのＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５が、ニューロンの死を１２％及び２２％と顕著に低減させていた（図３）。また、データからは、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５は濃度依存的にニューロンの死を低減させており、３００ｎＭのＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ポリペプチドは酸素グルコース欠乏によって引き起こされる初代ニューロンの損傷を効果的に阻害できることが明らかになった。

六．動物全体脳卒中モデル
１．縫合法によるラット中大脳動脈閉塞と再灌流モデル
急性脳虚血の場合は、以前の方法（Ｗｅｎｘｉａｎｇ Ｆａｎ，Ｘｉａｎｇ Ｌｉ，Ｌｉａｎｇｌｉａｎｇ Ｈｕａｎｇ，Ｓｈｕｃｈｅｎｇ Ｈｅ，ＺｈｉｃｈｅｎｇＸｉｅ，Ｙｕｘｉｎ Ｆｕ，Ｗｅｉｒｏｎｇ Ｆａｎｇ，Ｙｕｎｍａｎ Ｌｉ Ｓ－ｏｘｉｒａｃｅｔａｍ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ α７ ｎＡＣｈＲ ａｎｄ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＧＳＫ３β ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｒａｔｓ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌｕｍｅ １１５，Ｍａｙ ２０１８，Ｐａｇｅｓ ５０－６０ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｉｎｔ．２０１８．０１．００８）に基づいてラット中大脳動脈閉塞／再灌流（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ／Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ、ｔＭＣＡＯ／Ｒ）脳卒中モデルを確立し、具体的には次のとおりであった。２２０～２５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを用い、自由に餌を摂取し飲水することができ、一定の環境条件（１２／１２時間明暗周期）で飼育した。手術前夜は、自由に飲水することができるが、絶食させた。手術時は、抱水クロラール（３００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）でラットを麻酔した後、ラットを仰向けに手術台上の電気パッドに固定した。外科的処置中に、直腸プローブを用いて継続的に体温を監視し、体温を３６．５～３７．０℃に保持した。ポビドンヨード又は７０％のアルコールで手術領域を消毒し、首の正中線で切開し、リトラクターを用いて気管上の軟組織を軽やかに引き離した。迷走神経の中から総頚動脈（ＣＣＡ）、外頚動脈（ＥＣＡ）及び内頚動脈（ＩＣＡ）を慎重に分離した。遠位端でＥＣＡを結紮し、翼突管動脈がＩＣＡと緊密につながっており、次に、血液の逆流を防ぐために、微細血管用クリップをＩＣＡに置き、もう１つをＣＣＡに置いた。結紮されたＥＣＡに対して焼灼して断端を形成させ、丸い端部を備える４－０ナイロン縫合糸をＥＣＡの断端からＣＣＡの接続部に挿入し、縫合糸を挿入できるよう、ＩＣＡの中に置いた微細血管用クリップを取り除いた。縫合糸をＣＣＡの接続部からＭＣＡに１８～２０ｍｍほど慎重に挿入し、次に、縫合糸を２つの位置（ＥＣＡの断端の底部及びＩＣＡ上）に固定した。９０分間閉塞させた後、縫合糸を慎重に引き抜き、ＥＣＡの切開部を締めくくり、ＣＣＡの中に置いた微細血管用クリップを取り除き、血流の再灌流を確認した後、頚部の皮膚を縫合した。術後の痛みと不快感を軽減するために、手術の切開領域で局所用リドカインゲルを使用し、手術後に水分の補給のために、動物に１．０ｍＬの生理食塩水を皮下注射した。偽手術群は動物に同じプロセスを行い、ただし動脈に縫合糸を挿入して血流を遮断することはしなかった。ｔＭＣＡＯから４．５時間後、３分間以内に被験薬又は滅菌生理食塩水を３．５ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇの用量で静脈内注射した。加熱ランプを用いて回復期間中にマウスの体温を３７℃に維持した。

２．脳組織の処理と梗塞体積の測定
再灌流から２４時間後、ラットを深い麻酔をかけたまま殺し、脳組織全体を取り出し、脳を冠状断にスライスして厚さ２ミリメートルのスライスを得て、次に直ちに３７℃で１％の２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）溶液で１５分間染色した。ＩｍａｇｅＪ画像処理ソフトウェアを用いて、左半球の面積及び右半球の非染色面積（非梗塞面積）を計算し、式：脳梗塞面積のパーセンテージ＝（左半球の面積－右半球の非梗塞面積）／左半球の面積×１００％で梗塞のパーセンテージを計算した。

試験結果：図５（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示されるとおり、動物全体に対するＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチドの治療効果を検定するために、９０分間一過性中大脳動脈塞栓と再灌流（ｔＭＣＡＯ／Ｒ）モデルで治療的研究を行った。ＳＤラットを２群に分け、生理食塩水単独（対照）又は生理食塩水とＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５（３．５ｍｇ／ｋｇ）で治療し、局所的虚血から４．５時間後に尾静脈注射で単一用量のＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５（ｎ＝１３）及び生理食塩水（ｎ＝１２）を与えた。モデル作成から約２４時間後、ＴＴＣ染色で梗塞体積を評価した（図５のＡ）。ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５で治療した後、対照群の脳卒中体積に比べて、総脳梗塞体積が統計学的有意に低減された（約６０％）（図５のＢ、Ｃ）。この結果は、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５が生体内で作用を発揮し、虚血性脳卒中によって引き起こされる脳損傷を軽減できることを証明していた。

３．ロータロッド装置による運動機能の評価
ロータロッド（Ｒｏｔａｒｏｄ）装置を用いて、ＳＤラットに対し、局所的な急性脳虚血前及びその後の７日以内に運動機能試験を行い、ｔＭＣＡＯ／Ｒ手術の３日前に、ラットは３日連続でロータロッド装置において訓練を受けた。最初の坂走行では、動物がロータロッド棒において１分間保持できるよう、４ｒｐｍと設定した。１０分間の休憩後、１８０秒間以内に２０ｒｐｍに安定的に増加させ、棒において１５０秒間以上保持できるようラットを訓練した。次の２日間には、ロータロッド棒において１５０秒間以上保持できない動物に対し、基準を満たすことができるまで、それぞれ改めて基準を設定した。ラットが１８０秒以内にロータロッド棒において保持できる持続時間を計測し、動物がロータロッド棒から落下し又はロータロッドを掴んで２回転してもロータロッド棒に上がる試みをしなかった場合は、試験を終了した。ｔＭＣＡＯ／Ｒ手術の前日にロータロッド試験の平均持続時間を３回記録した。ｔＭＣＡＯ／Ｒ後（又は偽手術後）の３日目、５日目及び７日目にロータロッド装置で試験し、毎日連続して３回計測し、３回の平均を算出し、各回の試験の間に動物は１５分間休憩してもよい。

試験結果：脳内の運動神経の機能障害に対するＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチドの回復状況を一層観察するために、９０分間一過性中大脳動脈塞栓と再灌流（ｔＭＣＡＯ／Ｒ）モデルを用いて治療後研究を行った。ＳＤラットを３群に分け、それぞれが偽モデル群（ｔＭＣＡＯ／Ｒなし）（ｎ＝８）、生理食塩水単独（対照）群（ｎ＝６）又は生理食塩水とＰＫＤ干渉ペプチド（３．５ｍｇ／ｋｇ）治療群（ｎ＝６）であった。ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５と生理食塩水では、局所的虚血から４．５時間後に、尾静脈注射で単一用量のＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５と生理食塩水を与えた。ｔＭＣＡＯ／Ｒモデル作成後の３日目、５日目、７日目にロータロッド試験で神経機能障害を評価した。

ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ１－Ｓ２０５ペプチドで治療した後、ｔＭＣＡＯ／Ｒラットの運動能力が顕著に改善され、治療処理のない対照群に比べて、ｔＭＣＡＯ／Ｒ後５日目及び７日目のロッド保持時間はそれぞれ７０％、７５％増加していた。治療群と未治療群のｔＭＣＡＯ／Ｒ後３日目の平均ロッド保持時間に顕著な差がなかった（図５のＤ、偽手術群ｎ＝８、生理食塩水群ｎ＝６、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５群ｎ＝１０）。結果は、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５が、虚血性脳卒中によって引き起こされるラットの神経行動学的症状を顕著な改善できることを証明していた。

４．一過性両側総頚動脈閉塞と再灌流（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｂｉｌａｔｅｒａｌ Ｃｏｍｍｏｎ Ｃａｒｏｔｉｄ Ａｒｔｅｒｙ Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ、ｔＢＣＣＡＯ／Ｒ）によって誘発されるマウス脳虚血モデル
モデル作成：体重２０～３０ｇ（６～７週齢）のＣ５７ＢＬ／６の雄のマウスを用い、自由に餌を摂取し飲水することができ、一定の環境条件（１２／１２時間明暗周期）で飼育した。１０％の抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してマウスを麻酔し、次に、直腸温度を３７℃に保持するよう、電気パッドに置き、以前に確立された方法に基づいてＢＣＣＡＯ手術を行った。ポビドンヨード、次に７０％のエタノールで、毛を剃ったマウスの腹側の頚部領域を洗浄した。頚部の正中線に皮膚を小さく切開した。内側の胸鎖乳突筋を解剖し、迷走神経と結合組織から慎重に剥離して、総頚動脈を曝露させた。無外傷性血管クリップをかけて各動脈を２０分間閉塞させた。クリップを取り外して、血流を１０分間回復させた。次に、両側の総頚動脈をさらに２０分間閉塞させて、灌流を２４時間回復させた。ｔＢＣＣＡＯから３時間後、３分間以内に被験薬を７ｍｇ／２ｍＬ／ｋｇで静脈内注射した。回復期間中、加熱ランプでマウスの体温を３７℃に保持した。偽手術対照群は両側総頚動脈閉塞を除く全ての外科的処置プロセスを動物に行った。

試験：受動的回避試験によるｔＢＣＣＡＯ／Ｒマウスの学習及び記憶能力の検出
Ｙ字型迷路装置は、互いに１２０°の角度をなす３つのアーム（Ａ、Ｂ及びＣ）によって構成され、中央領域（ＣＺ）を介して接続されている。各アームの下に電気グリッド（ステンレス鋼製）が置かれ、各アームの外側の端部ではいずれも安全領域の光源を提供する電球がある。コンピュータでこの３つのアームのいずれかを開始領域と設定し、試験開始後にそれを非安全領域と定義することができる。残りの２つのアームを、Ｙ字型迷路（Ｙ－ｍａｚｅ）のビデオ追跡及び分析システムによってフットショック（電流刺激）のない安全領域及びフットショックのある非安全領域にランダムに分割した。

当方は、脳卒中後の動物全体の認知及び記憶障害に対するＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチドの改善を検出するために、両側総頚動脈一過性閉塞と再灌流（ｔＢＣＣＡＯ／Ｒ）による全脳虚血性マウスモデルにおいて干渉ペプチドの治療的研究を行った。当該モデルでは、マウスの両側総頚動脈一過性閉塞と再灌流（ｔＢＣＣＡＯ／Ｒ）が主に海馬ニューロンの損傷を引き起こし、動物の認知及び記憶機能に影響を与える。

手術の前日に、研究者は、光源によって引き起こされる電気ショックを避けることができるようマウスを訓練する必要があり、これは臭いの影響を最大限に軽減することができる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３群に分け（各群ｎ＝１１）、偽モデル群、生理食塩水単独の単一用量静脈内注射（対照）群、生理食塩水とＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５（７ｍｇ／ｋｇ）治療群であった。ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチド及び生理食塩水をモデル作成から３時間後に尾静脈より注射した。ｔＢＣＣＡＯ／Ｒモデル作成から２４時間後、Ｙ字型迷路による受動的回避タスクで学習及び記憶能力を検出した（図６のＡ）。

３分間後に、マウスを開始領域に置いて試験を開始した。所定の強度（０．０５～０．８ｍＡ）の電流刺激を実施し、動物は、フットショックを免れるために、隣接する安全領域に逃げ出し、３０秒間保持しなければならない。次に、動物を開始位置に置いて後の試験を行った。安全領域に逃げ出した回数を記録し、非安全領域への逃げ出しはいずれも正しくないと見なす。１０回の試験の平均で平均逃げ出しパーセンテージを計算した。動物を交換する間は、消毒剤及び／又はアルコールスプレーで装置を徹底的に洗浄した。

試験結果：各マウスが正しく回避したパーセンテージでその活動状態を決定し、観察結果から、生理食塩水治療群に比べて、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５治療群のマウスは回避に成功するパーセンテージが顕著に上昇し、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５ペプチドはｔＢＣＣＡＯ／Ｒによって引き起こされる記憶指標の低下を改善しており、治療群は未治療群に比べて、記憶指標が３０％向上していることが明らかになった（図６のＢ）。当該結果は、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ１－Ｓ２０５治療が全脳虚血後の海馬ニューロンの損傷を顕著に軽減できることを裏付けていた。

ｔＢＣＣＡＯ／Ｒマウスの脳におけるマロンジアルデヒド（Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ、ＭＤＡ）の測定
ＭＤＡは、脂質過酸化反応の重要な生成物の１つであり、脂質酸化の程度はＭＤＡレベルの測定によって決定される。チオバルビツール酸（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ、ＴＢＡ）法で組織中のＭＤＡレベルを推定する。前記行為試験を行った後、マウスの首を切り落として脳組織をとった。氷冷した生理食塩水において脳組織を均質化した。溶解物を４℃で、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後に上清を収集し、メーカーのマニュアルに従ってＭＤＡ ＴＢＡキット（南京建城生物工程研究所、中国南京）を用いてＭＤＡの含有量を測定した。標準曲線から結果を評価し、ｎＭ／ｍｇタンパク質として計算した。

ｔＢＣＣＡＯ／Ｒマウスにおける脳浮腫の測定
マウスへのｔＢＣＣＡＯ／Ｒから２４時間後、湿式－乾式法で脳卒中によって誘発される脳浮腫を評価し、脳を解剖した後に直ちに湿重量を決定し、５５℃で組織を、２４時間内で重量が一定になるまで乾燥して乾燥重量を決定した。脳の水分含有量のパーセンテージの算式は、（湿重量－乾燥重量）／湿重量×１００％であった。

測定結果：脳組織におけるＭＤＡの濃度は、ニューロンの虚血損傷の度合いを評価するために用いられる。生理食塩水対照群のｔＢＣＣＡＯ／Ｒマウスに比べて、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５で治療されたｔＢＣＣＡＯ／Ｒマウスの脳内のＭＤＡ濃度が５５％低減しており、ニューロン虚血損傷後のＭＤＡの上昇が明らかに阻害された（図６のＣ）。脳の水分含有量の測定で脳浮腫を評価し、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５治療後、生理食塩水対照群に比べて脳内の水分含有量が明らかに８．５％低減していた（図６のＤ）。結果から、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５は実験的ｔＢＣＣＡＯ／Ｒモデルの脳浮腫及び酸化ストレスによる損傷を軽減できることが明らかになった。

統計方法：動物全体試験では、研究者が脳卒中モデルを作成し脳卒中の同定及び試験指標を評価する時に、試験薬物群及び対照（滅菌生理食塩水）群に盲検法を適用した。全てのデータは平均±ＳＥＭで示す。一元配置分散分析法で２群以上のデータに対して分析し、次に対照群と事後検定又は対応のない両側ｔ検定で多重比較を行って、治療群と未治療対照群との間の平均差を評価する。データが上記の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の設定を満たさない場合は、ノンパラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（クラスカル＝ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定）で対照群との多重比較（ダン（Ｄｕｎｎ）法）を行った。比較する時は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００５を統計学的意味があると見なす。

七．異なる融合ポリペプチドの比較
当研究では、それぞれ、表１に示される他の干渉ペプチドを含む融合ポリペプチドを合成し、ＨＴ２２細胞株のグルタミン酸塩負荷モデル及び初代ニューロン培養物ＯＧＤモデルにおいて評価を行った。

ＯＧＤモデルから次のことを見出した。
本発明によって提供されるＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５（配列番号１のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）及びその相同干渉ペプチド（表１の配列番号２３～配列番号３９のＮ又はＣ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）は、顕著な神経保護を提供しており、３００及び１０００ｎＭでは、それぞれ、濃度依存的に皮質ニューロンの死を１２％、１８％低減しており、
ＲｖＴＡＴ－ＺＩＰＫ－Ｔ２９９（配列番号２のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）及びその相同干渉ペプチド（表１の配列番号８～配列番号２２のＮ又はＣ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）は、１０００ｎＭで皮質ニューロンの死を１２％と効果的に低減することができ、
ＲｖＴＡＴ－ｏｐＭＬＣ－Ｓ２０ペプチド（配列番号４のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）は、ニューロンの生存率を顕著に向上させておらず、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５、ＲｖＴＡＴ－ＺＩＰＫ－Ｔ２９９及びＲｖＴＡＴ－ｏｐＭＬＣ－Ｓ２０を例とする神経保護比較試験の結果を図３に示す。

グルタミン酸塩負荷モデルで次のことを見出した。ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５（配列番号１のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）及びその相同干渉ペプチド（表１の配列番号２３～配列番号３９のＮ又はＣ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）とＲｖＴＡＴ－ＺＩＰＫ－Ｔ２９９（配列番号２のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）及びその相同干渉ペプチド（表１の配列番号２～配列番号２２のＮ又はＣ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）は神経保護ペプチドとして有望であり、２種のペプチドはいずれもＨＴ２２細胞死を平均約３３％低減させることができ、次はＲｖＴＡＴ－ｒＳＰ６－Ｓ２３５（配列番号３のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）及びその相同干渉ペプチド（表１の配列番号４０～配列番号５４のＮ又はＣ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）、ＲｖＴＡＴ－ｏｐＭＬＣ－Ｓ２０（配列番号４のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）とＲｖＴＡＴ－ＢＥＣＮ１－Ｔ１９９（配列番号５のＮ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）及びその相同干渉ペプチド（表１の配列番号６及び７のＮ又はＣ末端に膜透過性ペプチドが接続されている）は、４００ｎＭでは、ＨＴ２２細胞死を、それぞれ、平均約２９％、２５％、２１％低減させており、ＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５、ＲｖＴＡＴ－ｒＳＰ６－Ｓ２３５、ＲｖＴＡＴ－ｏｐＭＬＣ－Ｓ２０及びＲｖＴＡＴ－ＢＥＣＮ１－Ｔ１９９を例とする比較結果を図４に示す。

また上記の結果からは、いずれもＤＡＰＫ１のリン酸化ドメインと相互作用するが、ＤＡＰＫ１基質の干渉ペプチドによって、その神経保護機能の効果が異なり、中でもＲｖＴＡＴ－ＰＫＤ－Ｓ２０５及びその相同干渉ペプチドは最も優れているということも明らかになった。

Claims (23)

1. アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に示されるとおりであることを特徴とするＤＡＰＫ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド。
2. 下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸モチーフを備え、
   （Ａ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）Ｘ２（Ｓ／Ｔ／Ａ）Ｘ１ＸＸＸ
   （Ｂ）ＸＸＸ（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）Ｘ２（Ｒ／Ｋ）（Ｓ／Ｔ／Ａ）Ｘ１ＸＸＸ
   ただし、各Ｘは、独立的に、いかなるアミノ酸から選ばれてもよく又はアミノ酸がなく、
   Ｘ１は、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）から選ばれる極性アミノ酸であり、
   Ｘ２は、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）及びバリン（Ｖ）から選ばれる非極性アミノであり、
   ただし、Ｒ／Ｋとは、当該位置においてアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）のいずれでもよいことであり、
   ただし、Ｓ／Ｔ／Ａとは、当該位置において、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）又はアラニン（Ａ）のいずれでもよいことであり、
   好ましくは、アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列のうちの少なくとも一方に比べて、２つ以下のアミノ酸が違い、即ち、少なくとも８５％の同一性を有することを特徴とするＤＡＰＫ１リン酸化基質の人工低分子干渉ペプチド。
3. アミノ酸配列が、配列番号６～５４のいずれかに示されるとおりである請求項２に記載の人工低分子干渉ペプチド。
4. 構造が、ステープルペプチド又は環状ペプチドであり、例えば、首尾による環形成（アミド結合）、側鎖による環形成、チオエステル結合による環形成、ラクトン結合による環形成、Ｓｅ－ＣｙｓとＳｅ－Ｃｙｓの酸化による環形成、又はジスルフィド結合による環状ペプチドである請求項２に記載の人工低分子干渉ペプチドの模倣ペプチド。
5. 人工低分子干渉ペプチドに比べて、ペプチド鎖におけるアミノ酸の順番はＣ末端からＮ末端までに変わっている請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチドのレトロポリペプチド。
6. 前記人工低分子干渉ペプチドに比べて、前記人工低分子干渉ペプチドにおける各Ｌ－アミノ酸残基がその対応するＤ型アミノ酸によって置き換えられ、アミノ酸配列は逆になっていると同時に側鎖の元の空間方向及びキラリティーは前記人工低分子干渉ペプチドと同じであり、即ち、前記人工低分子干渉ペプチドと似ている側鎖トポロジー構造が保たれる請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチドのＤ型レトロインベルソペプチド。
7. 請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチドにおけるいずれか１つ又は複数のアミノ酸がその対応するＤ型アミノ酸又はホモアミノ酸に置き換えられて得られることを特徴とする請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチドの誘導体ペプチド。
8. ２つ以上の低分子ペプチドが同じ方向に並列する方式で重合して構成され、そのうち各低分子ペプチドのＣ末端は遊離しており、全ての低分子ペプチドのＮ末端は、送達ベクターに接続されるために集まっており、
   前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は請求項７に記載の誘導体ペプチドから選ばれることを特徴とするポリペプチド。
9. 低分子ペプチドのＮ末端又はＣ末端に１種又は複数種の送達ベクターが融合されて構成され、
   前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は請求項７に記載の誘導体ペプチドから選ばれることを特徴とする融合ポリペプチド。
10. 前記送達ベクターが、膜透過性ペプチド、リガンド、受容体タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗体又は高分子重合体から選ばれ、
    前記膜透過性ペプチドが、カチオン性細胞膜透過性ペプチド、両親媒性細胞膜透過性ペプチド、疎水性細胞膜透過性ペプチド又は合成細胞膜透過性ペプチドから選ばれ、
    前記高分子重合体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリエチレンオキシド、ポリジオキサノン、ポリプロピレンフマレート、トリメチレンカーボネート、ポリエステルアミドオキシラン、エステルアミド、β－ヒドロキシフェニルプロピオネート、α－ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリイミドカーボネート、ポリウレタン、ポリ無水物、ヒアルロン酸、キトサン、セルロース、ゼラチン、コラーゲンから選ばれることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の融合ポリペプチド。
11. 前記カチオン性細胞膜透過性ペプチドが、配列番号５５～配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる群から選ばれ、
    前記両親媒性細胞膜透過性ペプチドが、配列番号７３～配列番号８１に示されるアミノ酸配列からなる群から選ばれ、
    前記疎水性細胞膜透過性ペプチドが、配列番号８２～配列番号８５に示されるアミノ酸配列からなる群から選ばれ、
    前記合成細胞膜透過性ペプチドが、配列番号８６に示されるアミノ酸配列を備えることを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
12. 前記人工低分子干渉ペプチドが、配列番号１～３、配列番号６～５４のいずれかに示されるアミノ酸配列を備え、前記膜透過性ペプチドが、配列番号５５～配列番号８６のいずれかに示されるアミノ酸配列を備えることを特徴とする請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
13. アミノ酸配列が、配列番号８７～配列番号９６のいずれかに示されるとおりであることを特徴とする請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
14. 低分子ポリペプチドをコードし、前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチドから選ばれることを特徴とする人工的に製造された核酸分子。
15. 請求項１４に記載の核酸分子がロードされていることを特徴とする発現ベクター。
16. 請求項１５に記載のベクターを含有している細胞株又は無細胞発現系であることを特徴とする発現系。
17. 請求項１４に記載の発現系によって発現され、主な成分は、低分子ポリペプチドであり、前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチドから選ばれることを特徴とする発現産物。
18. ポリペプチド分子と、薬学的に許容される不純物、添加物、溶媒、保護剤、アジュバント、担体及び／又は賦形剤とを含有し、そのうち、前記ポリペプチド分子は、
    （１）請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、若しくは請求項７に記載の誘導体ペプチド、又は
    （２）低分子ペプチドの修飾物であり、前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、若しくは請求項７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、前記修飾とは、
    Ｎ末端、Ｃ末端修飾、標識、環化、脂質化、Ｎ－メチル化、ミリストイル化及びパルミトイル化、グリコシル化、ビオチン化、ＰＥＧ修飾、蛍光標識のうちの１つ又は複数であることを特徴とする薬物。
19. 剤形は、吸入用エアロゾル製剤、経口剤、静脈内投与、動脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、滑膜（腔）内投与、胸骨内投与、又は脊髄内投与用の製剤であることを特徴とする請求項１８に記載の薬物。
20. 低分子ペプチドの製薬上の用途であって、
    前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は請求項７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、
    前記製薬上の用途とは、興奮毒性メカニズムに関連する疾患を治療又は予防する薬物を製造するために用いられることであり、前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されず、
    前記神経変性疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする用途。
21. 低分子ペプチドの製薬上の用途であって、
    前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は請求項７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、前記製薬上の用途とは、ＤＡＰＫ１－ＰＫＤ１経路に関連する生理学的異常を治療又は予防する薬物を製造するために用いられることであり、前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されず、
    前記神経変性疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする用途。
22. 請求項１８又は１９に記載の薬物と、抗凝固薬又は抗血小板薬とを含み、
    好ましくは、請求項１８又は１９に記載の薬物及び前記抗凝固薬又は抗血小板薬は、１回用量、１日用量又は１クール用量単位で組み合わせてまとめて包装され、
    ただし、前記抗凝固薬とは、アセノクマロール、４－ヒドロキシ－３－（１，２，３，４－テトラヒドロ－１－ナフチル）クマリン（クマテトラリル）、ジクマロール、ジクマロールエチル、フェンプロクモン、ワルファリン、ジフェナジオン、フェニンジオン、チオクロマロール、ベミパリン、セルトパリンナトリウム、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸、アピキサバン、ベトリキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバーロキサバン、ヒルジン、ビバリルジン、組換え型ヒルジン、デシルジンヒルジン、アルガトロバン、ダビガトランエテキシラート、メラガトラン、キシメラガトラン、デフィブロチド、アンチトロンビンIII、ヘパリン、クマディン錠、ダビガトランエテキシラート、アピキサバン（商品名エリキュース）、エドキサバン、エノキサパリン、フォンダパリヌクス、組換え型組織プラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、サルプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、アンクロド、フィブリノリジン、ブリナーゼ、又はそれらの組成物であり、
    前記抗血小板薬とは、クロピドグレル、チカグレロル、プラスグレル、ジピリダモール、シロスタゾール、チクロピジン、エプチフィバチド、アスピリン、アブシキシマブ、チロフィバン、ベラプロスト、プロスタサイクリン、イロプロスト、トレプロスチニル、アロキシピリン、カルバスピリンカルシウム、インドブフェン、トリフルサル、ピコタミド、テルトロバン、クロリクロメン、ジタゾール、又はそれらの組成物であることを特徴とする薬物の組み合わせ。
23. 低分子ペプチドの疾患治療のための用途であって、
    前記低分子ペプチドは、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の人工低分子干渉ペプチド、請求項５に記載のレトロポリペプチド、請求項６に記載のＤ型レトロインベルソペプチド、又は請求項７に記載の誘導体ペプチドから選ばれ、
    ただし、投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇまでであり、ここに記載の低分子ペプチドの濃度は、大きく変えてもよく、且つ、選択される投与方式及び対象の体重、年齢、性別などによって選択され、
    好ましい用量範囲は、用量が０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇまでであり、
    より好ましい用量範囲は、用量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇまでであり、
    又は、１つの対象又は１群の対象における治療計画を最適化するために用量範囲を変え、
    前記疾患は、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、新生児低酸素性虚血性脳症、神経変性疾患、うつ病、自閉症を含み、ただしそれらに限定されず、
    前記神経変性疾患とは、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする用途。