JP2024506910A - 操作された細胞外小胞およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

細胞外小胞を作製するための組成物および方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、細胞を改変する方法および対象の疾患を処置する方法に使用される。核酸配列（例えば、異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列）および異種ポリペプチドを細胞に送達するためのプラスミドシステムおよび細胞外小胞が本明細書で提供される。本明細書に記載のプラスミドシステムおよび細胞外小胞を使用して細胞を改変する方法も提供される。

Description

先行する関連出願
本出願は、２０２２年２月１２日に出願された米国仮出願第６３／１４８，８７２号に基づく利益および優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
分野

本開示は、真核生物遺伝子編集のための組成物およびそれを使用する方法を記載する。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照

配列表の公式コピーは、２０２２年２月７日に作成された、１２１ＫＢのサイズを有する１２９３１９０＿ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔというファイルを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集エフェクターは、オフターゲット効果および免疫応答を減少させることが重要である。最近、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達のために細胞外小胞（ＥＶ）が研究されている。しかしながら、ＲＮＰ送達ビヒクルとしてのこれらのＥＶの効率は限られていた。したがって、機能性ＲＮＰをＥＶに効率的に充填するための組成物および方法が必要である。

要旨
核酸配列（例えば、異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列）および異種ポリペプチドを細胞に送達するためのプラスミドシステムおよび細胞外小胞が本明細書で提供される。本明細書に記載のプラスミドシステムおよび細胞外小胞を使用して細胞を改変する方法も提供される。

プラスミドシステムであって、（ａ）核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドであって、核酸配列が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列とを含む、第１の哺乳動物発現プラスミド；および（ｂ）ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドであって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が、第１の哺乳動物発現プラスミドの少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、第２の哺乳動物発現プラスミド、を含むプラスミドシステムが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、プラスミドシステムは、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、第１の哺乳動物発現プラスミドの核酸配列は、アデノシン塩基対エディタ（ＡＢＥ）をコードする核酸配列をコードし、ＡＢＥは、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、アデニン塩基エディタは、ＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする。いくつかの実施形態では、アプタマー配列は、ＭＳ２アプタマー配列、ＰＰ７アプタマー配列、ＢｏｘＢアプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰは同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＢＰは、Ｃｏｍ結合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む。

また、細胞外小胞であって、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）とを含む融合タンパク質を含み、ＡＢＰが少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、細胞外小胞も提供される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列は、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、アデニン塩基対エディタ（ＡＢＥ）を含み、ＡＢＥは、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、アデニン塩基エディタは、ＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする。いくつかの実施形態では、アプタマー配列は、ＭＳ２アプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰは同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＢＰは、Ｃｏｍ結合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームまたは微小胞である。

細胞外小胞の生産方法であって、（ａ）本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれかの第１の哺乳動物発現プラスミドおよび第２の哺乳動物発現プラスミドで複数の真核細胞をトランスフェクトすること；および（ｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、細胞外小胞が生産されるのに十分な時間培養すること、を含む方法がさらに提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、複数の真核細胞を、本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれかのエンベローププラスミドでトランスフェクトすることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質を含み、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）は、少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質であって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）がアプタマーコード配列に結合する、融合タンパク質；および（ｃ）ＶＳＶ－Ｇタンパク質、を含む。

いくつかの実施形態では、複数の真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、培養されたトランスフェクトされた真核細胞から細胞外小胞を単離することをさらに含む。

本明細書で提供される方法のいずれかによって作製された細胞外小胞も提供される。

細胞内のゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に複数の細胞外小胞を形質導入することを含み、複数の細胞外小胞が本明細書に記載の細胞外小胞を含み、ＲＮＰが細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、それによりゲノム標的配列を改変する、方法がさらに提供される。いくつかの実施形態では、複数の真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、複数の真核細胞は、対象内に存在する細胞である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象に複数の細胞外小胞が注射される。

本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれかを含有する細胞も提供される。本明細書に記載の細胞を改変するための方法のいずれかを使用して改変された細胞も提供される。

対象の疾患を処置する方法であって、ａ）対象から細胞を得ること；ｂ）本明細書に記載の細胞を改変するための方法のいずれかを使用して対象の細胞を改変すること；およびｃ）改変された細胞を対象に投与すること、を含む方法がさらに提供される。いくつかの実施形態では、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、疾患は鎌状赤血球貧血である。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。

図面の説明
本出願は、以下の図面を含む。図面は、組成物および方法の特定の実施形態および／または特徴を例示すること、ならびに組成物および方法の任意の説明（複数可）を補足することを意図している。図面は、記載された説明が明示的に示さない限り、組成物および方法の範囲を限定しない。

図１Ａは、本開示の特定の態様によるＣｏｍおよびＣＤ６３を含む融合タンパク質を示す。Ｃｏｍを、リンカーペプチドを間に挟んでＣＤ６３のＮ末端、Ｃ末端または両末端に融合した。リンカー１およびリンカー２の配列は、それぞれ「ＧＧＨＮＳＧＧＧＧＧＱＳＰＧＰＡＡ」（配列番号１１５）および「ＳＧＧＧＧＳＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶ」（配列番号１１６）であった。

図１Ｂは、本開示の特定の態様によるエクソソームへのＣａｓ９またはＡＢＥ ＲＮＰの動員を示す図である。ＲＮＰは、ｃｏｍ／Ｃｏｍ相互作用を介して原形質膜上のＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍと会合し、次いでエンドサイトーシスを介してエンドソーム系に入る（工程１）。初期エンドソームは、外側エンドソーム膜の内側への出芽に続いて多胞体（ＭＶＢ）になる（工程２）。ＭＶＢの膜が細胞膜と融合すると、管腔内小胞はエクソソームとして培地に放出される（工程３）。ここで、Ｃｏｍはモノマーとして描かれているが、ホモダイマーとして機能し得る。

図１Ｃは、本開示の特定の態様によるＣａｓ９ ＲＮＰの微小胞への動員（工程４）を示す。

図２Ａは、本開示のある特定の態様によるＣｏｍ融合タンパク質およびＣＤ６３融合タンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。ＣＤ６３、ＣＤ６３－Ｃｏｍ、Ｃｏｍ－ＣＤ６３およびＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ発現のためのプラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ＣＤ６３またはＣＤ６３融合タンパク質の発現を抗ＣＤ６３抗体によって検出した。ローディング対照のためにＧＡＰＤＨを検出した。

図２Ｂは、本開示の特定の態様による遺伝子編集活性のフローサイトメトリー検出を示す。２．５ｘ１０^４個のＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞を、４８時間で６０万個の細胞によって分泌されたＲＮＰ濃縮ＥＶで処理した。ＲＮＰは、ＩＬ２ＲＧ標的化ＳａＣａｓ９ ＲＮＰ（ｎ＝６）であった。＊＊＊は、示された条件間でｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡに続くテューキー事後検定）。

図２Ｃは、水疱性口内炎ウイルス－Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ）が、本開示の特定の態様によるＥＶ送達ＲＮＰの遺伝子編集活性を改善することを示す。ＩＬ２ＲＧ標的化ＳａＣａｓ９ ＲＮＰを、ＶＳＶ－Ｇタンパク質を含むまたは含まないＥＶにパッケージングした。ＲＮＰ濃縮ＥＶをＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞に添加して、フローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性細胞を調べた（ｎ＝３）。＃＃は、ＶＳＶ－Ｇなし群と比較してｐ＜０．０１；＊＊＊は、他のすべての条件と比較した場合、ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡに続くテューキー事後検定）。

図２Ｄは、本開示の特定の態様によるフローサイトメトリーによるＥＶ送達ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰの遺伝子編集活性の検出を示す。ＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞（２．５ｘ１０^４個）を、４８時間で６０万個の細胞によって分泌されたＲＮＰ濃縮ＥＶで処理した。ＲＮＰは、ＩＬ２ＲＧ標的化ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰであった。＊＊＊は、示された条件間でｐ＜０．０００１（ｎ＝３、ＡＮＯＶＡに続くテューキー事後検定）。

図３は、本開示の特定の態様によるＲＮＰロードＥＶの最も効率的な生産のためのＤＮＡ比の最適化を示す。示された量のｐＣｏｍ－ＣＤ６３－ＣｏｍおよびｐＸ６０１－Ｔｅｔｒａ－ｃｏｍ－ＩＬ２ＲＧ ＤＮＡを、ＲＮＰロードＥＶを作製するためのトランスフェクションに使用した。４８時間で５０万個の細胞によって生産されたＲＮＰロードＥＶを濃縮し、２．５ｘ１０^４個のＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞に添加した。ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによって検出した。＊＊＊は、示された条件の間でｐ＜０．０００１を示す（ｎ＝３、ＡＮＯＶＡに続くテューキー事後検定）。

図４は、本開示の特定の態様によるＶＳＶ－ＧおよびＶＳＶ－Ｇ－Ｃｏｍ融合タンパク質の検出を示すウェスタンブロットである。対照細胞を擬似トランスフェクトした。

図５Ａは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって駆動され、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよび肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムに隣接するｓｇＲＮＡの概略図である。ｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９に対するＩＬ２ＲＧ標的化ｓｇＲＮＡであった。

図５Ｂは、本開示の特定の態様による、余分なｓｇＲＮＡの有りまたは無しで、ＥＶ送達ＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９ ＲＮＰ（それぞれＩＬ２ＲＧおよびＤＭＤエクソン５３を標的とする）の遺伝子編集活性の比較である。ＲＮＰロードＥＶを、図５Ａに示すそれぞれのプラスミドＤＮＡ有りおよび無しで調製した。遺伝子編集活性を、ＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞においてフローサイトメトリーによってアッセイした。

図６Ａは、本開示の特定の態様によるＥＶ中のＳａＣａｓ９ ＲＮＰの濃縮を示す。ｃｏｍ改変有りおよび無しのＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ、ＳａＣａｓ９およびＩＬ２ＲＧ ｓｇＲＮＡを５ｘ１０^６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞で共発現させ、ＥＶを４８時間収集した。ＥＶの１／５をウェスタンブロットによって分析した。タンパク質バンド下の数は、タンパク質標準に基づいて推定タンパク質質量（ｎｇ）であった。

図６Ｂは、本開示の特定の態様によるＥＶへのＳｐＣａｓ９ ＲＮＰおよびＡＢＥの濃縮を示す。ＩＬ２ＲＧおよび部位５は、それぞれＳｐＣａｓ９およびＡＢＥを標的とした。実験条件は、図６Ａと同様であった。

図６Ｃは、本開示の特定の態様によるＥＶへのｓｇＲＮＡのＣｏｍおよびｃｏｍ依存的濃縮を示す。ＳａＣａｓ９およびＩＬ２ＲＧ標的化ｓｇＲＮＡをＥＶにパッケージングした（ｎ＝３）。ｓｇＲＮＡは、未改変（ｃｏｍ－）またはテトラループを置き換えるｃｏｍ（ｃｏｍ＋）であった。Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍを含まないＥＶでは、代わりにＣＤ６３が過剰発現された。ＲＮＡをＥＶから抽出し、ｓｇＲＮＡを、プライマーＳｃｉｄ－ｇ２ＦおよびｓｇＲＮＡ－Ｒ３を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによって検出した。＊＊＊は、他のすべての条件と比較した場合、ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡに続くテューキー事後検定）。

図７Ａは、本開示の特定の態様によるＥＶ中のタンパク質のウェスタンブロット分析である。ＩＬ２ＲＧ標的化ＳａＣａｓ９ ＲＮＰ有りまたは無しで、細胞からＥＶを収集した。ＥＶの１／２０が４８時間で１００万個の細胞によって分泌され、ロードされた。

図７Ｂは、本開示の特定の態様によるＥＶの透過型電気顕微鏡分析を示す。

図７Ｃは、本開示の特定の態様によるＥＶ粒子濃度のナノ粒子追跡分析を示す。

図７Ｄは、本開示の特定の態様によるＥＶサイズ分布のナノ粒子追跡分析を示す。４８時間で５００万個の細胞によって分泌されたＥＶを、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄの分析のために５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。

図８Ａは、本開示の特定の態様によるＥＶ送達ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰの分解のウェスタンブロットである。矢印はＳｐＣａｓ９タンパク質の位置を示す。アスタリスクは、同様のロードを示す非特異的なバンドを示す。４８時間で２０万個の細胞によって分泌されたＥＶを２．５ｘ１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。

図８Ｂは、本開示の特定の態様による、様々な時点でのＣａｓ９タンパク質レベルのデンシトメトリー分析（ＩＭＡＧＥＪ）を示す。半減期は、１回の位相減衰を用いて推定した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５）。

図８Ｃは、本開示の特定の態様によるＥＶ送達ＳａＣａｓ９ ＲＮＰの分解のウェスタンブロットである。矢印はＳａＣａｓ９タンパク質の位置を示す。アスタリスクは、同様のロードを示す非特異的なバンドを示す。４８時間で２０万個の細胞によって分泌されたＥＶを２．５ｘ１０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。

図９Ａは、本開示の特定の態様による２つの遺伝子座の同時標的化を検出するための例示的な戦略を示す図である。３つのｓｇＲＮＡ、Ｓａ－５０、Ｓａ－５１およびＳｐ－５３は、それぞれＤＭＤイントロン５０、イントロン５１およびエクソン５３を標的とする。欠失のＰＣＲ検出に使用したプライマー５０－Ｆ、５１－Ｒおよび５３－Ｒも示す。実線のボックスはｈＤＭＤエクソン５１～５３を示す。配列除去前のプライマー間の距離を列挙する。

図９Ｂは、本開示の特定の態様によれば、異なる遺伝子座を標的とする共パッケージングされたＳａＣａｓ９ ＲＮＰがマルチプレックスゲノム編集においてより効率的であったことを示す。

図９Ｃは、本開示の特定の態様による、効率的なマルチプレックスゲノム編集のためにＳａＣａｓ９ ＲＮＰおよびＳｐＣａｓ９ ＲＮＰをＥＶに共パッケージングすることができることを示す。

定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示しない限り、複数の言及を含む。

本明細書における用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその変形の使用は、その後に列挙されるエレメントおよびその均等物ならびに追加のエレメントを包含することを意味する。特定のエレメントを「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と列挙された実施形態は、これらの特定のエレメント「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とも考えられる。本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された１またはそれを超える項目のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合は組み合わせの欠如を指し、包含する。

本明細書で使用する場合、移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法的な変形）は、列挙された材料または工程および特許請求された発明の「基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈される。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（原文の強調）参照。ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照のこと。したがって、本明細書で使用される「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきではない。

「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。ＲＮＡが記載される場合、その対応するＤＮＡも記載され、ウリジンはチミジンとして表されることが理解される。同様に、ＤＮＡが記載される場合、その対応するＲＮＡも記載され、チミジンはウリジンによって表される。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段示されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変された変異体（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１またはそれを超える選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。本発明のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステムアンドループ構造などを含むがこれらに限定されない配列のすべての形態を包含する。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生産またはコードに関与するＤＮＡのセグメントを指すことができる。それは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。あるいは、「遺伝子」という用語は、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡの生産またはコードに関与するＤＮＡのセグメントを指すことができる。

本明細書で使用される場合、「異種」という語句は、天然に通常見られないものを指す。「異種ポリペプチド」という用語は、天然の所与の細胞に通常見られないポリペプチドを指す。したがって、異種ポリペプチドは、（ａ）その宿主細胞に対して外来性であり得る（すなわち、細胞に対して外因性である）か、または（ｂ）宿主細胞中に天然に見出される（すなわち、内因性）が、細胞中に不自然な量（すなわち、宿主細胞中に自然に見られる量よりも多いまたは少ない量）で存在する。「異種プロモーター」という用語は、天然の所与の細胞に通常見られない、または所与のタンパク質を発現するポリヌクレオチドに作動可能に連結されて通常見られないプロモーター配列を指す。

「処置する」とは、疾患、症状または障害の処置または改善または予防における成功の任意の徴候を指し、減少；寛解；症候を減らすこと、または疾患症状を患者にとってより耐えやすくすること；変性または低下の速度を減速させること；または、変性の最終点がより衰弱しにくくなることなどの任意の客観的または主観的パラメータを含む。症候の処置または改善は、客観的または主観的パラメータに基づくことができ、医師による検査の結果を含む。したがって、「処置する」という用語は、本明細書に記載の疾患、症状または障害に関連する症候または症状の発生を予防もしくは遅延させるため、緩和するため、または停止もしくは阻害するための本開示の化合物または薬剤の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症候、または疾患の副作用の低減、排除、または予防を指す。本開示の方法を使用する「処置すること」または「処置」は、本明細書に記載の疾患、症状または障害に関連する疾患または障害のリスクが高い可能性があるが、まだ症候を経験していないまたは示していない対象における症候の発症を予防すること、疾患または障害の症候を阻害すること（その発症を遅延させるまたは停止させること）、疾患の症候または副作用を軽減すること（緩和的処置を含む）、および疾患の症候を軽減すること（退行を引き起こすこと）を含む。処置は、予防的（疾患の発症を予防もしくは遅延させるため、またはその臨床的もしくは亜臨床的な症候の発現を予防するため）、または疾患または症状の発現後の症候の治療的抑制または緩和であり得る。本明細書で用いる「処置」という用語には、予防（例えば、予防的）、治癒的、または緩和的治療が含まれる。

「プロモーター」は、核酸の転写を指示する１またはそれを超える核酸制御配列として定義される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、必要に応じて、転写の開始部位から数千塩基対に位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。３つの用語はすべて、１またはそれを超えるアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、この用語は、全長タンパク質、切断型タンパク質、およびその断片、ならびにアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合によって連結されている。全体を通して使用される「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、２またはそれを超えるタンパク質またはその断片を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、約３～１０個のアミノ酸を含むリンカーは、発現時にタンパク質の適切な折り畳みを促進するのを助けるために、任意の２つのタンパク質またはその断片の間に配置することができる。

本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈で使用される「同一性」または「実質的同一性」という用語は、参照配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を指す。あるいは、同一性パーセントは、６０％～１００％の任意の整数であり得る。例示的な実施形態は、本明細書中に記載されるプログラム；好ましくは、以下に記載されるような標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用する参照配列と比較して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。本明細書に記載の任意のヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば配列番号１～４９のいずれか１つと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を、本明細書で提供される組成物および方法で使用することができることが理解される。核酸配列は、本明細書に記載の任意の核酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなることができることが理解される。同様に、ポリペプチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチド配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなることができる。配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することも、代替パラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０～６００、約２０～５０、約２０～１００、約５０～約２００または約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同セアライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法におって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって、または手動アライメントおよび目視検査によって行われ得る。

パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリ配列中の長さＷのショートワードを同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチング残差に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残差に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。ワードヒットの各方向への伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したときに停止される。累積スコアは、１またはそれを超える負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために０以下になるか、またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードサイズ（Ｗ）２８、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝１、Ｎ＝－２、および両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．０１未満、より好ましくは約１０－５未満、最も好ましくは約１０－２０未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。

全体を通して使用されるように、対象とは個体を意味する。例えば、対象は、霊長類などの哺乳動物、より具体的にはヒトである。非ヒト霊長類も対象である。対象という用語には、例えばネコ、イヌなどの飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）が含まれる。したがって、獣医学的使用ならびに医学的使用および製剤が本明細書で企図される。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、生体および生まれたばかりの対象は、雄であろうと雌であろうと網羅されることが意図されている。本明細書で使用される場合、患者または対象は互換的に使用され得、疾患または障害に罹患している対象を指し得る。

「発現カセット」は、宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的または合成的に作製された核酸構築物である。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結され、その後に転写終結シグナル配列が続いている、転写されるポリヌクレオチドを含む。発現カセットは、ヒトグロビン遺伝子由来の５’または３’非翻訳領域などの特定の調節配列を含んでも含まなくてもよい。

「レポーター遺伝子」は、酵素活性または化学蛍光特性などの生化学的特徴のために容易に検出可能なタンパク質をコードする。これらのレポータータンパク質は、選択マーカーとして使用することができる。そのようなレポーターの１つの具体例は、緑色蛍光タンパク質である。このタンパク質から生成された蛍光は、様々な市販の蛍光検出システムで検出することができる。他のレポーターを染色によって検出することができる。レポーターはまた、適切な基質と接触したときに検出可能なシグナルを生成する酵素であり得る。レポーターは、検出可能な生成物の形成を触媒する酵素であり得る。適切な酵素には、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼおよびヒドロラーゼが含まれるが、これらに限定されない。レポーターは、基質が真核生物の原形質膜に対して実質的に不透過性である酵素をコードすることができ、したがって、シグナル形成を厳密に制御することを可能にする。酵素をコードする適切なレポーター遺伝子の具体例としては、限定されないが、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；Ａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｖａｐｎｅｋ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４－８６９）；ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）；β－ガラクトシダーゼ；ＬａｃＺ；β．－グルクロニダーゼ；およびアルカリホスファターゼ（Ｔｏｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１－２３８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）が挙げられ、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の適切なレポーターには、エピトープを特異的に認識する標識抗体で検出することができる特定のエピトープをコードするものが含まれる。

「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、外来核酸に対する防御のための広範なクラスの細菌系を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、広範囲の真正細菌および古細菌生物に見られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型のサブタイプが含まれる。Ｍａｋａｒｏｖａ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１３（１１）：７２２－３６）によって記載されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの分類は、共有された特徴および進化的類似性に基づいて５つのタイプおよび１６のサブタイプを定義する。これらは、ゲノムＤＮＡを切断するエフェクター複合体の構造に基づいて２つの大きなクラスに分類される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムがゲノム工学に最初に使用され、その後、２０１５年にＶ型が使用された。野生型ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、外来核酸を認識して切断するためにガイドＲＮＡと複合体を形成するＲＮＡ媒介ヌクレアーゼＣａｓタンパク質またはホモログ（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」と呼ばれる）を利用する。Ｃａｓ９タンパク質はまた、活性化ＲＮＡ（トランス活性化ＲＮＡまたはｔｒａｃｒ ＲＮＡとも呼ばれる）を使用する。ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡと活性化ＲＮＡの両方の活性を有するガイドＲＮＡも、それと共に使用されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのタイプに応じて、当技術分野で公知である。いくつかの場合では、そのような二重活性ガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。活性化ＲＮＡ配列を含まない合成ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡと呼ばれることもある。本開示では、ｓｇＲＮＡおよびｇＲＮＡという用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成し、リボ核タンパク質複合体を標的ＤＮＡ配列に局在化させるＲＮＡ分子を指すために交換可能に使用される。

本明細書で提供される組成物および方法では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたヌクレアーゼであり得る。全体を通して使用される「触媒的に損なわれた」とは、ＤＮＡの一方または両方の鎖を切断するためのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ酵素活性の低下を指す。触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの例としては、触媒的に損なわれたＣａｓ９、触媒的に損なわれたＣｐｆ１および触媒的に損なわれたＣ２ｃ２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するかまたはニックを入れる触媒的に損なわれたＣａｓ９、例えばＣａｓ９ Ｄ１０Ａである。いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼであり得、エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を切断することができない、すなわち、二本鎖切断を行うことができない。改変には、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化するための１またはそれを超えるアミノ酸の改変が含まれるが、これらに限定されない。例えば、限定するものではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９においてＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ突然変異を作製して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を低減または不活性化することができる。他の改変には、ヌクレアーゼ活性を示す配列がＣａｓ９に存在しないように、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメインの全部または一部を除去することが含まれる。したがって、触媒的に損なわれたＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を低下させるように改変されたポリペプチド配列、またはヌクレアーゼ活性を低下させるようにポリペプチド配列（単数または複数）の除去を含み得る。触媒的に損なわれたＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されていても、ＤＮＡに結合する能力を保持する。したがって、触媒的に損なわれたＣａｓ９は、ＤＮＡ結合に必要なポリペプチド配列（単数または複数）を含むが、改変されたヌクレアーゼ配列を含むか、またはヌクレアーゼ活性を担うヌクレアーゼ配列を欠く。他の部位特異的ヌクレアーゼ、例えばＣｐｆ１またはＣ２ｃ２におけるヌクレアーゼ活性を低下させるために同様の修飾を行うことができることが理解される。いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインのポリペプチド配列を欠いておりＤＮＡ結合機能を保持するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の全長Ｃａｓ９配列である。他の例では、Ｃａｓ９タンパク質配列は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠くＣａｓ９ポリペプチド配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、ＤＮＡ結合機能を保持する。

本明細書で使用される場合、ｓｇＲＮＡ活性またはＲＮＰ活性、すなわち複合体のＲＮＰ活性の文脈における「活性」は、（１）ｇＲＮＡおよび（２）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ｓｇＲＮＡが標的遺伝エレメントに結合する能力を指す。典型的には、活性はまた、ＲＮＰ（すなわち、およびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成したｓｇＲＮＡ）が細胞のゲノムを編集する能力も指す。いくつかの例では、活性は、ＡＢＥ ＲＮＰ（すなわち、ＡＢＥと複合体を形成したｓｇＲＮＡ）が塩基対を編集する、すなわちＤＮＡの１本の鎖においてＡからＧへの変化を行う能力を指す。

本明細書で使用される場合、細胞のゲノムの編集の文脈における「編集」という語句は、標的ゲノム領域でゲノムの配列の構造変化を誘導すること、例えば、ゲノム配列を切断し、切断部位で、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して細胞のゲノムにドナー配列を挿入すること、または配列を切断し、非相同組換え末端結合（ＮＨＥＪ）を介して修復を可能にすることを指す。いくつかの例では、編集はＡＢＥによって実行される。例えば、編集は、標的ゲノム領域におけるＤＮＡの一方の鎖におけるＡからＧへの変化（またはＤＮＡの反対鎖におけるＴからＣへの変化）の形態をとることができる。ヌクレオチド配列は、ポリペプチドまたはその断片をコードすることができる。例えば、Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ－Ｔ ｔｏ Ｇ－Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」、Ｎａｔｕｒｅ ５５１：４６４－４７１（２０１７）を参照。

本明細書で使用される場合、「アデニン塩基エディタ」または「ＡＢＥ」は、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質を指す。場合によっては、アデノシンデアミナーゼは、ＤＮＡの一本鎖上のアデニンを脱アミノ化してイノシンを形成するｔａｄＡ酵素である。Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，（２０１７）を参照のこと。いくつかの例では、ＡＢＥは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、１またはそれを超えるコピー、例えば２、３、４コピーなどのアデノシンデアミナーゼとを含む融合タンパク質である。いくつかの例では、ＡＢＥは、配列番号２７を含む核酸配列によってコードされる融合タンパク質を含む。いくつかの例では、ＡＢＥは配列番号２８を含む。

本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質複合体」「ＲＮＰ」などの用語は、（１）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｃｒＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡ）、（２）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、（３）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ、または（４）それらの組み合わせ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと触媒的に損なわれたＣａｓ９タンパク質とを含む複合体、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡガイド）の間の複合体を指す。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれている。いくつかの実施形態では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、アデノシンデアミナーゼに融合される。

本明細書で使用される場合、「細胞」は、任意の真核細胞、例えばヒトＴ細胞、または、Ｔ細胞（例えばＴＣＲ受容体分子を発現するＴ細胞）に分化することができる細胞であり得る。これらには、造血幹細胞および造血幹細胞に由来する細胞が含まれる。細胞の集団、例えば、本明細書において提供されるゲノム編集方法のいずれかによって作製されたウイルス粒子または遺伝子改変細胞を含む細胞の集団も提供される。

本明細書中で使用される場合、語句「造血幹細胞」は、血球を生じ得る幹細胞のタイプを示す。造血幹細胞は、骨髄系列もしくはリンパ系列の細胞、またはそれらの組み合わせを生じさせることができる。造血幹細胞は主に骨髄に見られるが、末梢血またはその一部から単離することができる。様々な細胞表面マーカーを使用して、造血幹細胞を同定、選別または精製することができる。いくつかの場合では、造血幹細胞は、ｃ－ｋｉｔ＋およびｌｉｎ－として同定される。いくつかの場合では、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－として同定される。いくつかの場合では、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４－、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－として同定される。いくつかの場合では、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ１３３＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／－、Ｃ－ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ｌｉｎ－として同定される。いくつかの場合では、マウス造血幹細胞は、ＣＤ３４ｌｏ／－、ＳＣＡ－１＋、Ｔｈｙ１＋／ｌｏ、ＣＤ３８＋，Ｃ－ｋｉｔ＋、ｌｉｎ－として同定される。いくつかの場合では、造血幹細胞は、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８－ＣＤ２４４－である。

本明細書中で使用される場合、語句「造血細胞」は、造血幹細胞に由来する細胞を示す。造血細胞は、生物、系、器官または組織（例えば、血液またはその一部）からの単離によって得られるかまたは提供され得る。あるいは、造血幹細胞が単離され得、造血細胞は、幹細胞を分化させることによって得られるかまたは提供され得る。造血細胞には、さらなる細胞型に分化する可能性が限られている細胞が含まれる。そのような造血細胞には、多能性前駆細胞、系統限定前駆細胞、一般的な骨髄系前駆細胞、顆粒球－マクロファージ前駆細胞、または巨核球－赤血球前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。造血細胞には、リンパ球、赤血球、顆粒球、単球、および血小板などのリンパ系および骨髄系の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、造血細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞などの免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は自然免疫細胞である。

本明細書中で使用される場合、語句「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞受容体分子を発現するリンパ系細胞を示す。Ｔ細胞には、ヒトアルファベータ（αβ）Ｔ細胞およびヒトガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞が含まれる。Ｔ細胞には、ナイーブＴ細胞、刺激Ｔ細胞、初代Ｔ細胞（例えば、培養されていない）、培養Ｔ細胞、不死化Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、それらの組み合わせ、またはそれらの部分集団が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得る。Ｔ細胞はまた、ＣＤ４－、ＣＤ８－、またはＣＤ４－およびＣＤ８－であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパー細胞、例えばＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ９、ＴＨ１７またはＴＦＨ型のヘルパー細胞であり得る。Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。制御性Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３＋またはＦＯＸＰ３－であり得る。Ｔ細胞は、アルファ／ベータＴ細胞またはガンマ／デルタＴ細胞であり得る。いくつかの場合では、Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ制御性Ｔ細胞である。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、１型制御性（Ｔｒ１）、ＴＨ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８－、Ｔｒｅｇ１７、およびＱａ－１拘束性Ｔ細胞からなる群より選択される制御性Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせもしくは部分集団である。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞である。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏＣＤ１２７ｈｉエフェクターＴ細胞である。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏＣＤ１２７ｈｉＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ４５ＲＯ－ナイーブＴ細胞である。Ｔ細胞は、遺伝子操作された組換えＴ細胞であり得る。

本明細書で使用される場合、初代細胞の文脈における「初代」という語句は、形質転換または不死化されていない細胞である。そのような初代細胞は、限られた回数を培養、継代培養、または継代することができる（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の培養）。いくつかの場合では、初代細胞をインビトロ培養条件に適合させる。いくつかの場合では、初代細胞は、生物、系、器官または組織から単離され、必要に応じて選別され、培養または継代培養なしで直接利用される。いくつかの場合では、初代細胞は刺激され、活性化され、または分化される。例えば、初代Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、またはそれらの組み合わせと接触させる（例えば、その存在下で培養する）ことによって活性化することができる。

本明細書で使用される場合、「細胞外小胞（ＥＶ）」という用語は、真核細胞から自然に放出される膜結合小胞を指す。したがって、ＥＶは、細胞由来小胞、すなわち、内部空間（管腔）を取り囲む膜を含む脂質二重層で区切られた粒子である。一般に、ＥＶは直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲である。ＥＶには、エクソソームおよび微小胞が含まれるが、これらに限定されない。ＥＶは細胞によって放出され、尿、血漿、脳脊髄液、唾液などを含むほとんどの生物学的流体中、ならびに組織培養馴化培地中に見出される
詳細な説明

以下の説明は、本組成物および方法の様々な態様および実施形態を列挙する。特定の実施形態は、組成物および方法の範囲を定義することを意図しない。むしろ、実施形態は、開示される組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物および方法の非限定的な例を提供するにすぎない。説明は、当業者の観点から読まれるべきである。したがって、当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。

本明細書では、ＥＶを使用して核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）およびＲＮＰを真核細胞に効率的に送達するための組成物、システム、製造方法、および方法が提供される。本明細書に記載の組成物および方法を使用して、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）およびＲＮＰをＥＶに効率的にパッケージングし、真核細胞に送達することができる。例えば、ＥＶを介した、（１）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび（２）ｓｇＲＮＡを含むＲＮＰの細胞への効率的な送達のための構成要素、システム、製造方法および方法が提供される。本明細書に記載のＥＶは半減期が限られているため、ＲＮＡおよびＤＮＡオフターゲット媒介突然変異誘発のリスクを低減する。真核細胞へのＲＮＰの送達は、例えば、オフターゲット効果を低減しながら、初代細胞などのトランスフェクトが困難な細胞における効率的な送達を可能にする。
プラスミドシステム

本開示のＥＶを生成するために使用される哺乳動物細胞にＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列、すなわちｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを送達するために使用されるプラスミドシステムが本明細書で提供される。例えば、プラスミドシステムであって、（ａ）核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドであって、核酸配列が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列とを含む、第１の哺乳動物発現プラスミド；および（ｂ）ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドであって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が、第１の哺乳動物発現プラスミドの少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、第２の哺乳動物発現プラスミド、を含むプラスミドシステムが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、プラスミドシステムは、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドをさらに含む。

本明細書で提供されるシステムの第１の哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列、例えばＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡのコード配列を含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡコード配列は、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に配置され得る。いくつかの例では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡ内の内部位置、例えば、折り畳まれたｇＲＮＡ内に形成されたループの１またはそれを超えるもの挿入され得る。例えば、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質に対するものである場合、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ｇＲＮＡのテトラループ、ステムループ２（ＳＴ２）または３’末端に配置され得る。いくつかの例では、１～３０ヌクレオチドのスペーサーは、ｇＲＮＡと少なくとも１つのアプタマーコード配列との間に、または少なくとも１つのアプタマーコード配列に隣接して配置され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡコード配列は、ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む。

本明細書で提供されるシステムでは、第１の哺乳動物発現プラスミドは、システムの第２の哺乳動物発現プラスミドによってコードされるアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）によって特異的に結合されるアプタマー配列をコードする少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む。本開示の文脈では、アプタマー配列は、ＡＢＰによって特異的に結合される三次ループ構造を形成するＲＮＡ配列である。ＡＢＰは、ＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質ドメインである。適切なアプタマーコード配列は、既知のバクテリオファージアプタマー配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的なアプタマーのコード配列には、上記の表１に示すアプタマー配列をコードするものが含まれる。いくつかの例では、アプタマーはＡＢＰのダイマーによって結合される。これらのアプタマー配列は、バクテリオファージタンパク質が特異的に結合することが知られているＲＮＡ配列である。いくつかの状況では、少なくとも１つのアプタマーコード配列は、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアプタマーコード配列はｃｏｍアプタマーであり、ＡＢＰはＣｏｍタンパク質である。

いくつかの例では、第１の哺乳動物発現ベクターは、その下流に１つのアプタマーコード配列を含むｓｇＲＮＡを含む。他の例では、ｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアプタマーコード配列を含み得る。例えば、いくつかの例では、ｇＲＮＡは、タンデムに２つのアプタマーコード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、２またはそれを超えるタンデムアプタマーコード配列は同じである。いくつかの実施形態では、２またはそれを超えるタンデムアプタマーコード配列は異なる。

全体を通して使用されるように、ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ部位特異的ヌクレアーゼ）と相互作用し、ｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが細胞のゲノム内の標的核酸に共局在するように、細胞のゲノム内の標的核酸（ゲノム標的配列）に特異的に結合またはハイブリダイズする単一ガイドＲＮＡ配列である。各ｓｇＲＮＡは、ゲノム中の標的ＤＮＡ配列に特異的に結合またはハイブリダイズする、約１０～５０ヌクレオチド長のＤＮＡ標的化配列またはプロトスペーサー配列を含む。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長であり得る。例えば、ＤＮＡ標的化配列は、約１５～３０ヌクレオチド、約１５～２５ヌクレオチド、約１０～２５ヌクレオチド、または約１８～２３ヌクレオチドであり得る。一例では、ＤＮＡ標的化配列は約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。

一般に、ＤＮＡ標的化配列は、標的ＤＮＡ配列に相補的（例えば、完全に補完）または実質的に相補的（例えば、１～４個のミスマッチを有する）に設計される。いくつかの場合では、ＤＮＡ標的化配列は、複数の遺伝エレメントに結合するためにゆらぎ塩基または縮重塩基を組み込むことができる。いくつかの場合では、結合領域の３’または５’末端の１９ヌクレオチドは、標的遺伝エレメント（単数または複数）に完全に相補的である。いくつかの場合では、結合領域を変更して安定性を高めることができる。例えば、非天然ヌクレオチドを組み込んで、分解に対するＲＮＡ耐性を増加させることができる。いくつかの場合では、結合領域における二次構造の形成を回避または低減するように、結合領域を変更または設計することができる。いくつかの場合では、Ｇ－Ｃ含有量を最適化するように結合領域を設計することができる。いくつかの場合では、Ｇ－Ｃ含有量は、好ましくは約４０％～約６０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％）である。いくつかの場合では、結合領域は、ｓｇＲＮＡの効率的な転写を促進する配列から始まるように選択することができる。例えば、結合領域は、Ｇヌクレオチドで５’末端から始まり得る。いくつかの場合では、結合領域は、限定されないが、メチル化またはリン酸化ヌクレオチドなどの改変ヌクレオチドを含み得る。

本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間の塩基対合、例えば、限定するものではないが、ｓｇＲＮＡと標的配列との間の塩基対合を指す。相補的なヌクレオチドは、一般に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、ならびにＧおよびＣである。本明細書中に記載されるガイドＲＮＡは、配列、例えば、ゲノム配列に対して完全に相補的または実質的に相補的である（例えば、１～４個のミスマッチを有する）ＤＮＡ標的化配列を含み得る。

ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用するか結合するｓｇＲＮＡ定常領域を含む。本明細書で提供される構築物では、ｓｇＲＮＡの定常領域は、約７５～２５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例では、定常領域は、ステム、ステムループ、ヘアピン、ヘアピンの間の領域、および／または定常領域のネクサスにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるヌクレオチド置換を含む改変された定常領域である。いくつかの例では、改変された定常領域が由来する天然または野生型ｓｇＲＮＡ定常領域の活性と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の活性を有する改変された定常領域が、本明細書に記載の構築物において使用され得る。特に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと直接相互作用するヌクレオチドまたは定常領域の二次構造にとって重要なヌクレオチドにおいて改変を行うべきではない。

本明細書中に記載されるシステムのいずれかの第１の哺乳動物発現プラスミド上にコードされるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイド部位特異的ヌクレアーゼである。例えば、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチド（ＩＩ型）またはＣｐｆ１ポリペプチド（Ｖ型）であり得る。例えば、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６ Ａｕｇｕｓｔ ５；３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３；Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３２：５１７－５２１（２０１６）、およびＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３（３）：ｐ．７５９－７７１，２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５を参照のこと。全体を通して使用される「Ｃａｓ９ポリペプチド」という用語は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする任意の細菌種において同定されたＣａｓ９タンパク質、またはその断片もしくは誘導体を意味する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：４６７－４７７（２０１１）（補足情報を含む）を参照されたい。Ｃａｓ９およびＣａｓ９ホモログなどのＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、以下の分類群の細菌を含むがこれらに限定されない多種多様な真正細菌に見られる：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ－Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ－Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）である。別の例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）である。さらなるＣａｓ９タンパク質およびそのホモログは、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｋｓｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３ Ｍａｙ １；１０（５）：７２６－７３７；Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｊｕｎｅ；９（６）：４６７－４７７；Ｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１３ Ｓｅｐ ２４；１１０（３９）：１５６４４－９；Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ｍａｙ ９；４９７（７４４８）：２５４－７；およびＪｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインは、宿主細胞における効率的な活性または増強された安定性のために最適化することができる。他のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼには、Ｃｐｆ１（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １６３，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ７５９－７７１，２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５を参照されたい）およびそのホモログが含まれる。

全長Ｃａｓ９は、認識ドメインと、ＤＮＡ配列に二本鎖切断を生成する２つのヌクレアーゼドメイン（それぞれＨＮＨおよびＲｕｖＣ）とを含むエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９のアミノ酸配列では、ＨＮＨは直線的に連続しているが、ＲｕｖＣは３つの領域に分離されており、１つは認識ドメインの左側であり、他の２つはＨＮＨドメインに隣接する認識ドメインの右側である。Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前にある２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと相互作用することによって、細胞内のゲノム部位を標的とする。これは、細胞のゲノムＤＮＡの二本鎖切断をもたらす。いくつかの例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼを利用することができる。別の例として、直交ＰＡＭモチーフ要件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接するＮＧＧ ＰＡＭ配列を有しない配列を標的とすることができる。直交ＰＡＭ配列特異性を有する例示的なＣａｓ９タンパク質としては、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１１１６－１１２１（２０１３）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。様々なＣａｓ９ヌクレアーゼを、本明細書中に記載される方法において利用することができる。例えば、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’にＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えばＳｐＣａｓ９）を利用することができる。そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧ配列を含有するゲノムの任意の領域を標的とすることができる。別の例では、ガイドＲＮＡによって標的化される領域のすぐ３’側にＮＮＧＲＲＴ（配列番号１０６）またはＮＮＧＲＲ（Ｎ）（配列番号１０７）ＰＡＭを必要とするＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えばＳａＣａｓ９）を利用することができる。別の例として、直交ＰＡＭモチーフ要件を有するＣａｓ９タンパク質を利用して、隣接するＮＧＧ ＰＡＭ配列を有しない配列を標的とすることができる。直交ＰＡＭ配列特異性を有する例示的なＣａｓ９タンパク質としては、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０，１１１６－１１２１（２０１３）に記載されているもの、およびＺｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １６３，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐ７５９－７７１，２２ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのいずれも、触媒的に損なわれたものであり得る。いくつかの場合では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、例えばＣａｓ９ Ｄ１０Ａである。いくつかの例では、Ｃａｓ９ １０Ａは、配列番号２１によってコードされる。いくつかの例では、Ｃａｓ９ １０Ａは配列番号２２を含む。通常、Ｃａｓ９ニッカーゼがガイドＲＮＡとの複合体の一部として標的核酸に結合すると、一本鎖切断またはニックが標的核酸に導入される。構造的に異なるガイドＲＮＡにそれぞれ結合したＣａｓ９ニッカーゼのペアを、標的ゲノム領域の２つの近位部位にターゲティングすることができる。例示的なＣａｓ９ニッカーゼには、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９ヌクレアーゼが含まれる。

いくつかの実施形態では、第１の哺乳動物発現プラスミドの核酸配列は、アデノシン塩基対エディタ（ＡＢＥ）をコードする核酸配列をコードし、ＡＢＥは、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、アデニン塩基エディタは、ＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である。

本明細書に記載のプラスミドシステムは、ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドを含み、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）は、第１の哺乳動物発現プラスミドの少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する。

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合したＡＢＰおよび／またはＣＤ６３のＣ末端に融合したＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰは同じである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰは異なる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＢＰは、第１の哺乳動物発現プラスミド中のｃｏｍアプタマーに結合するＣｏｍである。

本明細書で使用される場合、ＣＤ６３、ＣＤ６３抗原またはその断片は、テトラスパニンファミリーとしても知られる膜貫通４タンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ６３は、細胞外小胞の細胞表面に見られる４つの疎水性ドメインの存在を特徴とする細胞表面タンパク質である。ＣＤ６３の例示的なアミノ酸配列は、配列番号４３として示されている。配列番号４３は、配列番号４２によってコードされる。ＣＤ６３のアイソフォームまたはその断片のいずれも、本明細書中に記載される組成物および方法において使用され得ることが理解される。例示的なＣＤ６３アイソフォームタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２４４３１８．１、ＮＰ＿００１７７１．１、ＮＰ＿００１２５４６２７．１、ＮＰ＿００１２４４３１９．１、ＮＰ＿００１２４４３２０．１、ＮＰ＿００１２４４３２９．１、ＮＰ＿００１２４４３３０．１、ＮＰ＿００１２４４３２１．１、およびＸＰ＿０２４３０５０５１．１で示される。

哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ、ｓｇＲＮＡコード配列またはＣＤ６３－ＡＢＰ融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む。本明細書に記載のシステムはまた、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするエンベロープコード配列を有するエンベローププラスミドを含み得る。例えば、Ｅｎｖヌクレオチド配列は、ＶＳＶ－Ｇをコードし得る。エンベロープコード配列は、真核生物プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの例では、真核生物プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。

本明細書で使用される場合、「水疱性口内炎ウイルスＧ」または「ＶＳＶ－Ｇ」は、レシピエント細胞におけるエンドソーム系からの本明細書に記載のＥＶのいずれかの輸送またはエスケープを促進するために使用することができるウイルス性エンベロープタンパク質である。例示的なＶＳＶ－Ｇアミノ酸配列は、配列番号４５として示されている。配列番号４５は、配列番号４４によってコードされる。別の例示的なＶＳＶ－Ｇタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ４７９４４．１に記載されている。

いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターがＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列に作動可能に連結され、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターがｇＲＮＡコード配列に作動可能に連結される。

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、哺乳動物種から選択される。例えば、これらのプロモーター配列は、いくつか例を挙げると、ヒト、ウシ、ヒツジ、スイギュウ、ブタ、またはマウスから選択することができる。いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列は、ＣＭＶ、ＦＥ１αまたはＳＶ４０配列である。いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、Ｕ６またはＨ１配列である。いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列は、改変ＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種由来の野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列を、本明細書中に提供した構築物において使用することができる。いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列は、改変ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列である。例えば、任意の哺乳動物種由来の野生型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ配列を、本明細書中に提供した構築物において使用することができる。当業者は、２つのポリペプチドまたは核酸の同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、同一性は、上記のように、同一性がその最高レベルになるように２つの配列を整列させた後に計算することができる。いくつかの例では、真核生物プロモーターは誘導性または調節性プロモーターである。

ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターから転写されるコード配列には、ポリ（Ａ）シグナルおよびコード配列の下流の転写ターミネーター配列が含まれる。一般的に使用される哺乳動物ターミネーター（ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、およびｒｂＧｌｏｂ）には、ポリアデニル化と終結の両方を促進する配列モチーフＡＡＵＡＡＡ（配列番号１０８）が含まれる。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから転写されるコード配列は、ターミネーター配列としてコード配列の下流のＴ残基の単純なランを含む。配列に基づくエレメントであるターミネーターの役割は、転写単位（遺伝子など）の末端を定義し、新しく合成されたＲＮＡを転写機構から放出するプロセスを開始することである。ターミネーターは、

転写される遺伝子の下流に見られ、典型的には、ポリアデニル化シグナルまたはポリ（Ａ）シグナルなどの任意の３’調節エレメントの直後に生じる。

いくつかの例では、哺乳動物発現プラスミドはまた、ＣＲＩＳＰＲ構成要素をコードする配列の下流に位置するＲＮＡ安定化配列、またはＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列の下流に位置する場合はアプタマーコード配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム構成要素コード配列の下流で転写され、転写されたＲＮＡ配列の寿命を安定化する。一例では、ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列の下流に配置される。別の例では、ＲＮＡ安定化配列をコードするポリヌクレオチド配列は、ｇＲＮＡコード配列の下流に配置される。例示的なＲＮＡ安定化配列は、配列番号１７（ＤＮＡ）および配列番号１８（ＲＮＡ）に示されるヒトβグロビン遺伝子の３’ＵＴＲの配列である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ安定化配列は、配列番号１７の２またはそれを超えるコピーを含む。他のＲＮＡ安定化配列は、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２３９（７）：２０３４－２０４０（２０１０）ａｎｄ Ｎｅｗｂｕｒｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４８（２）：２９７－３１０（１９８７）に記載されている。いくつかの例では、１～３０ヌクレオチドのスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ構成要素コード配列と、ＲＮＡ安定化配列をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列との間に配置され得る。

いくつかの例では、本明細書中に記載される哺乳動物発現プラスミドのいずれかは、１またはそれを超える発現カセットを含み得る。いくつかの例では、第１の哺乳動物発現プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする第１の発現カセットと、少なくとも１つのアプタマーを含むｇＲＮＡをコードする第２の発現カセットとを含む。いくつかの例では、哺乳動物発現プラスミドはレポーター遺伝子も含み得る。

本開示に記載のシステムの構成要素を含むキットも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書中に記載されるプラスミドの１またはそれを超えるものを含む。
細胞外小胞

別の態様では、ＥＶ、例えば、本明細書に記載のシステムおよび方法のいずれかによって作製されたＥＶが提供される。いくつかの実施形態では、ＥＶはエクソソームおよび／または微小胞である。本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された細胞外小胞も提供される。複数のＥＶも提供される。ＥＶは、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）とを含む融合タンパク質を含み、ＡＢＰは、少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をさらに含む。

少なくとも１つのアプタマーがｇＲＮＡ配列に結合または挿入されている本明細書に記載の第１の哺乳動物発現プラスミドのいずれかを使用して、ＲＮＰを含有するＥＶを生成することができる。これらのＥＶは、目的の真核細胞を形質導入するのに有用である。

いくつかの実施形態では、細胞のゲノム内の異なる部位を標的とする１またはそれを超える第１の哺乳動物発現プラスミドを使用して、細胞のゲノム内の１またはそれを超える部位を標的とする１またはそれを超えるＲＮＰを含有するＥＶを生成する。例えば、限定するものではないが、細胞のゲノムの部位Ａを標的とするｓｇＲＮＡを含む第１の哺乳動物発現プラスミドおよび細胞のゲノムの部位Ｂを標的とするｓｇＲＮＡを含む第１の哺乳動物発現プラスミドを、ＣＤ６３－ＡＢＰ融合タンパク質をコードする第２の哺乳動物発現プラスミドとともに細胞に形質導入して、部位Ａを標的とするＲＮＰおよび部位Ｂを標的とするＲＮＰを含むＥＶを生成することができる。ゲノム内の３またはそれを超える部位、４またはそれを超える部位、５またはそれを超える部位、または６またはそれを超える部位を標的とするＥＶは、同様の方法を使用して生成することができる。

ＥＶは、１またはそれを超えるＡＢＰを含む融合タンパク質を含み得る。いくつかの例では、ＥＶは、少なくとも１つのＡＢＰと融合したＣＤ６３またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合したＡＢＰおよび／またはＣＤ６３のＣ末端に融合したＡＢＰを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰは同じである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰは異なる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＡＢＰはＣｏｍであり、ｇＲＮＡに結合または挿入されたｃｏｍアプタマーに結合する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ６３のＮ末端および／またはＣＤ６３のＣ末端に融合した２またはそれを超えるＡＢＰをタンデムに含む。

ＡＢＰは、ＲＮＡアプタマー配列に結合するポリペプチド配列である。上記のように、いくつかのＡＢＰが本開示での使用に適している。特に、適切なＡＢＰには、ステムループ構造を形成するＲＮＡ配列である既知のＲＮＡアプタマー配列に特異的に結合するバクテリオファージＲＮＡ結合タンパク質が含まれる。例示的な非ウイルスアプタマー結合タンパク質としては、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮペプチド、およびＣｏｍタンパク質が挙げられる。ラムダＮペプチドは、タンパク質のＲＮＡ結合ドメインであるラムダＮタンパク質のアミノ酸１～２２であり得る。これらのＡＢＰおよびそれらが結合するアプタマー配列に関する情報は、上記の表１に提供されている。

上記のように、ｇＲＮＡは、一般に、ＤＮＡ標的化配列と、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと相互作用する定常領域とを含む。いくつかの例では、ｇＲＮＡはトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、それがＣａｓ９タンパク質または誘導体と共に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。他の例では、ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。例えば、ｇＲＮＡは、それがＣｐｆ１タンパク質または誘導体と共に使用されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まなくてもよい。

いくつかの例では、ｇＲＮＡは、少なくとも１つのアプタマー配列を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡの５’末端または３’末端に配置され得る。いくつかの例では、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡ内の内部位置、例えば、折り畳まれたｇＲＮＡ内に形成されたループの１またはそれを超えるもの挿入され得る。例えば、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質に対するものである場合、少なくとも１つのアプタマー配列は、ｇＲＮＡのテトラループ、ステムループ２（ＳＴ２）または３’末端に配置され得る。いくつかの例では、１～３０リボヌクレオチドのスペーサーは、ｇＲＮＡと少なくとも１つのアプタマー配列との間に、または少なくとも１つのアプタマー配列に隣接して配置され得る。
ＥＶの作製方法

本開示で提供されるプラスミドおよびシステムのいずれかを使用してＥＶを生産する方法を本明細書に記載する。例えば、細胞外小胞の生産方法であって、（ａ）複数の真核細胞に、本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれかの第１の哺乳動物発現プラスミド（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡをコードするプラスミド）および第２の哺乳動物発現プラスミド（すなわち、ＣＤ６３－ＡＢＰ融合タンパク質をコードするプラスミド）をトランスフェクトすること；および（ｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、細胞外小胞が生産されるのに十分な時間培養することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、複数の真核細胞を、本明細書に記載のプラスミドシステムのいずれかのエンベローププラスミド（すなわち、ＶＳＶ－Ｇをコードするプラスミド）でトランスフェクトすることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質を含み、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）は、少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質であって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）がアプタマーコード配列に結合する、融合タンパク質；および（ｃ）ＶＳＶ－Ｇタンパク質、を含む。

いくつかの実施形態では、複数の真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、培養されたトランスフェクトされた真核細胞から細胞外小胞を単離することをさらに含む。ＥＶを単離する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｋｏｎｏｓｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｌａｔｅｓｔ Ｔｒｅｎｄｓ」、Ｈｉｎｄａｗｉ ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌ．２０１８，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ８５４５３４７；およびＦｕｒｉ ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ」、Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５（１２）：２６３（２０１７）を参照のこと。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、初代筋芽細胞、神経幹細胞、多能性幹細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される。
遺伝子編集方法

真核細胞のゲノム中のＤＮＡ標的、例えば遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて本開示で提供されるプラスミドおよびシステムを使用する方法が本明細書に記載される。

本明細書で提供される方法では、改変される目的の標的ゲノム配列を含む真核細胞に、少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）に融合したＣＤ６３またはその断片ならびに（１）ｇＲＮＡおよび（２）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含むＲＮＰを含む融合タンパク質を含むＥＶを形質導入する。いくつかの実施形態では、ＥＶは、（１）少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）に融合したＣＤ６３またはその断片を含む融合タンパク質；（２）（ａ）ｇＲＮＡおよび（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含むＲＮＰ；および（３）エンベロープタンパク質またはその断片（例えば、ＶＳＶ－Ｇまたはその断片）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＳＶ－Ｇは、形質導入された細胞へのＥＶの進入を促進する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、触媒的に損なわれている。いくつかの実施形態では、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＡＢＥの一部としてアデノシンデアミナーゼに融合される。触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの例は、上に記載されている。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたはＡＢＥによる編集効率の増加をもたらす。例えば、本明細書に記載のＲＮＰを含むＥＶのいずれかを使用する場合、本明細書に提供される方法では、編集効率は、ＲＮＰが非ＥＶ送達を使用して送達される場合の編集効率と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える割合で増加させることができる。いくつかの例では、遺伝子編集効率の増加は、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍またはそれを超える増加である。いくつかの実施形態では、増加はＲＮＰのレンチウイルス送達と比較したものである。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法を使用して、本明細書に記載のＥＶを使用してＲＮＰを細胞に送達する形質導入効率は、非ＥＶ送達と比較して増加する。いくつかの例では、形質導入効率は、非ＥＶ送達を使用してＲＮＰを細胞に送達する場合の形質導入効率と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える割合で増加する。いくつかの例では、形質導入効率の増加は、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍またはそれを超える増加である。いくつかの実施形態では、増加はＲＮＰのレンチウイルス送達と比較したものである。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子編集方法は、ガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット遺伝子編集事象、例えば、関連するＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたはＡＢＥの減少をもたらす。例えば、本明細書で提供される方法においてＡＢＥを使用する場合、ガイド非依存性ＲＮＡオフターゲット活性は、非ＥＶ送達を使用してＲＮＰを送達する場合のＲＮＡオフターゲット活性と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える割合で低下させることができる。いくつかの例では、ガイド非依存性ＤＮＡオフターゲット遺伝子編集事象も減少する。例えば、本明細書で提供される方法では、非ＥＶ送達を使用してＲＮＰを送達する場合、ガイド依存性ＤＮＡオフターゲット活性を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％、９９％またはそれを超える割合で低下させることができる。

いくつかの例では、形質導入された真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの例では、真核細胞は、インビトロ培養細胞であり得る。いくつかの例において、真核細胞は、対象から得られたエクスビボ細胞であり得る。他の例では、真核細胞は、対象内に存在する。全体を通して使用されるように、対象とは個体を意味する。例えば、対象は、霊長類などの哺乳動物、より具体的にはヒトである。非ヒト霊長類も対象である。対象という用語には、例えばネコ、イヌなどの飼育動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）が含まれる。したがって、獣医学的使用ならびに医学的使用および製剤が本明細書で企図される。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、生体および生まれたばかりの対象は、雄であろうと雌であろうと網羅されることが意図されている。本明細書で使用される場合、患者または対象は互換的に使用され得、疾患または障害に罹患している対象を指し得る。本開示によって提供されるＥＶは、既知の日常的な方法に従って対象に注射され得る。いくつかの例では、システムのウイルス粒子は、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内、または特定の臓器に注射される。ＥＶはまた、例えば腫瘍に埋め込まれてもよい。

いくつかの例では、提供される方法は、目的の標的遺伝子座を改変するためのものであり、この方法は、複数の真核細胞に複数のＥＶを形質導入することを含み、複数のＥＶは、少なくとも１つのＡＢＰに融合されたＣＤ６３またはその断片を含む融合タンパク質；ならびに（１）ｇＲＮＡおよび（２）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体を含み、ＲＮＰが細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが細胞のゲノムＤＮＡを変化させる。上記のように、各ＲＮＰが異なる遺伝子座を標的とする２またはそれを超えるＲＮＰを含むＥＶを使用して、真核細胞における２またはそれを超える目的の遺伝子座を改変することができる。上記のように、ＲＮＰは、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成するｇＲＮＡ配列に結合または挿入されたアプタマー配列の相互作用を介してＥＶにパッケージングされる。

記載される方法は、機能のためにｓｇＲＮＡの定常領域を必要とする任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと共に使用することができる。これらには、ＲＮＡガイド部位特異的ヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例としては、ＩＩ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする任意の細菌種に存在するヌクレアーゼが挙げられる。適切なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、本開示を通して記載される。例えば、限定するものではないが、部位特異的ヌクレアーゼは、触媒的に損なわれたＣａｓ９ポリペプチド、触媒的に損なわれたＣｐｆ１ポリペプチド、触媒的に損なわれたＣａｓ９ニッカーゼまたはそれらの誘導体であり得る。

一般に、ｓｇＲＮＡは、遺伝子またはその近傍の特定の領域を標的とする。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、例えば、鎌状赤血球貧血を引き起こすヒトβグロビン遺伝子の単一塩基突然変異を修正するために、単一塩基変化が必要な領域を標的とすることができる。ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載のＲＮＰを細胞のゲノム配列中の特定の部位に可能にする。ＲＮＰがゲノム配列中の特定の部位に結合すると、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、特定の部位でＤＮＡの１またはそれを超える鎖を切断する。ＡＢＥが使用される場合、ＡＢＥは一方の鎖のアデノシン（Ａ）をイノシン形成に触媒し、一方で、触媒的に損なわれたエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ Ｄ１０Ａは、反対の鎖、すなわち編集されていない鎖にニックを入れる。イノシンはポリメラーゼ酵素によってグアノシンとして読み取られるので、ＤＮＡ修復および複製機構は標的部位で元のＡ－Ｔ塩基対をＧ－Ｃ塩基対で置き換える。Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）を参照のこと。

いくつかの例では、本開示に記載されるシステム構成要素に対する改変は、真核細胞への形質導入後にシステム構成要素がどのように機能するかを損なわない。むしろ、構成要素は、真核細胞への形質導入時に未改変の構成要素と同様またはより良好に機能し得る。例えば、ＥＶ中のＣＤ６３－ＡＢＰ融合タンパク質は、真核細胞のＥＶ形質導入を妨害しない可能性がある。同様に、ＥＶにパッケージングされたＲＮＰが少なくとも１つのアプタマー配列を含む場合、少なくとも１つのアプタマー配列は、真核細胞のＥＶ形質導入を妨害しない可能性がある。いくつかの例では、ＣＤ６３－ＡＢＰ融合タンパク質を含有するＥＶは、ＣＤ６３－ＡＢＰ融合タンパク質を含まないＥＶと比較して、真核細胞への形質導入時により大きな遺伝子編集をもたらし得る。

真核細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボであり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、（対象から単離された）初代細胞である。本明細書で使用される場合、初代細胞は、形質転換または不死化されていない細胞である。そのような初代細胞は、限られた回数を培養、継代培養、または継代することができる（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の培養）。いくつかの場合では、初代細胞をインビトロ培養条件に適合させる。いくつかの場合では、初代細胞は、生物、系、器官または組織から単離され、必要に応じて選別され、培養または継代培養なしで直接利用される。いくつかの場合では、初代細胞は刺激され、活性化され、または分化される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変細胞の集団を増殖させるのに有効な条件下で培養される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法のいずれかによって改変された細胞は、精製される。いくつかの場合では、細胞を対象から取り出し、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて改変し、患者に再投与する。

いくつかの例では、細胞が上記のＥＶで形質導入されると、細胞は、検出可能な表現型を発現する細胞のプールが複数の形質導入細胞から選択され得るように、遺伝子編集が起こるのを可能にするのに十分な時間培養される。表現型は、例えば、細胞増殖、生存または増殖であり得る。いくつかの例では、表現型は、細胞傷害剤、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、転写因子、キナーゼ（例えば、受容体チロシンキナーゼ）、プロモーター（例えば、異種プロモーター）の制御下にある遺伝子（例えば、外因性遺伝子）、チェックポイント遺伝子または細胞周期調節因子、成長因子、ホルモン、ＤＮＡ損傷剤、薬物、または化学療法薬などの薬剤の存在下での細胞成長、生存、または増殖である。表現型はまた、タンパク質発現、ＲＮＡ発現、タンパク質活性、または細胞運動性、遊走もしくは浸潤性であり得る。いくつかの例では、表現型に基づいて細胞を選択することは、蛍光活性化細胞選別、細胞の親和性精製、または細胞運動性に基づく選択を含む。

いくつかの例では、細胞を選択することは、増幅、シーケンシング、ＳＮＰ分析などによる細胞のゲノムＤＮＡの分析も含み得る。シーケンシング方法としては、限定されないが、ショットガンシーケンシング、ブリッジＰＣＲ、サンガーシーケンシング（マイクロ流体サンガーシーケンシングを含む）、パイロシーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング、ナノポアＤＮＡシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）、イオン半導体シーケンシング、ライゲーションシーケンシング、合成によるシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）、ポロニーシーケンシング、４５４シーケンシング、固相シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ヘリスコープ一分子シーケンシング、質量分析シーケンシング、パイロシーケンシング、支持オリゴ配位検出（ＳＯＬｉＤ）シーケンシング、ＤＮＡマイクロアレイシーケンシング、ＲＮＡＰシーケンシング、トンネル電流ＤＮＡシーケンシング、および将来同定される任意の他のＤＮＡシーケンシング方法が挙げられる。本明細書に記載の１またはそれを超えるシーケンシング方法は、ハイスループットシーケンシング方法で使用することができる。本明細書で使用される場合、「ハイスループットシーケンシング」という用語は、所与の時点で１よりも多くの核酸配列がシーケンシングされる核酸のシーケンシングに関連するすべての方法を指す。
処置方法

本明細書に記載される方法および組成物のいずれも、対象の疾患（例えば、癌、血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血またはベータサラセミア）、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患または他の炎症性障害）を処置するために使用することができる。

いくつかの方法では、処置される癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃部の癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、結腸癌、慢性骨髄性癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ））、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌腫、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、精巣癌、横紋筋肉腫、およびホジキンリンパ腫から選択される。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

いくつかの方法では、例えば本明細書に記載のＥＶのいずれかを対象に送達することによって、対象の細胞をインビボで改変する。例えば、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５１：１－１２（２０１９））を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＥＶは、標的、例えば腫瘍細胞上の腫瘍抗原に結合する結合部分を含むようにＥＶを改変することによって、細胞または組織を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、所望のリガンドでコーティングされたＰＥＧ化ＥＶが細胞表面標的に特異的に標的化され得るように、所望のリガンドをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との会合を介してＥＶに連結することができる。例えば、Ｒｏｃｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ．２０１６，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ５０２９６１９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１６を参照されたい。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載のＥＶのいずれかを対象に投与する。本明細書で使用される場合、「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１またはそれを超える投与、適用または投薬で投与することができる。いくつかの実施形態では、ＥＶは医薬組成物で送達される。典型的には、そのような医薬組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤を使用して、インビボ、エクスビボまたはインビトロで使用するために製剤化される。

対象に投与されるＥＶの投与量は、処置または緩和される疾患または症候、投与経路、ならびに当業者に知られている様々な他の関連パラメータに依存する。対象に投与されるＥＶの量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法でＥＶタンパク質、例えばＣＤ６３を定量することによって決定することができる。対象に送達されるタンパク質の量は、それぞれＥＶ中のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９のウェスタンブロット検出によって決定することができる。ＥＶの集団も本明細書において提供されることが理解される。本明細書に記載される組成物のいずれかにおけるＥＶ濃度は、多くの異なる方法、例えば単位あたり（多くの場合は体積）、または用量あたりのＥＶタンパク質の量、単位あたり（多くの場合は体積であり、対象あたり、体重１ｋｇあたりなど）のＥＶまたは粒子の数で表すことができる。例えば、限定するものではないが、約１０^６～約１０^２５個のＥＶを含む組成物を、１またはそれを超える用量で対象に投与することができる。例えば、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１６、１０^１７、１０^１８、１０^１９、１０^２０、１０^２１、１０^２２、１０^２３、１０^２４、１０^２５またはこれらの量の間の任意の他の量のＥＶを含む組成物を、１またはそれを超える投与で対象に投与することができる。

いくつかの方法では、対象の疾患を処置する方法は、ａ）対象から細胞を得ること；ｂ）本明細書に提供される方法のいずれかを使用して細胞を改変すること；およびｃ）改変された細胞を対象に投与することを含む。いくつかの方法では、改変細胞を対象に投与する前に、改変細胞を増殖および／または分化させる。いくつかの実施形態では、改変は、真核細胞を本明細書に記載のＥＶのいずれかと接触させることによって起こり、ＥＶによって細胞に送達されるＲＮＰ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとｇＲＮＡとを含む複合体）は、ｓｇＲＮＡによって標的化されるゲノム内の部位に結合し、細胞のゲノムを改変する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、突然変異を修正する、遺伝子の機能的コピーを挿入する、腫瘍抗原をコードする核酸配列を挿入する、塩基を編集する、または疾患を処置するために細胞のゲノム配列をその他の方法で変更するように改変される。

必要に応じて、疾患は、対象における癌、血液障害（例えば、鎌状赤血球貧血またはベータサラセミア）、感染性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主疾患または他の炎症性障害からなる群から選択される。癌を処置するためのいくつかの方法において、対象から得られた細胞は、腫瘍特異的抗原を発現するように改変される。全体を通して使用される場合、「腫瘍特異的抗原」という語句は、癌細胞に固有の抗原、または非癌性細胞よりも癌細胞でより豊富に発現される抗原を意味する。必要に応じて、対象から得られた細胞はＴ細胞である。必要に応じて、改変された細胞は、対象への投与前に増殖される。

本開示で論じられているすべての特許、特許公報、特許出願、雑誌記事、書籍、技術参考文献などは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の図および説明は、本開示の明確な理解に関連するエレメントを示すために簡略化されていることを理解されたい。図面は例示を目的として提示されており、構造図として提示されていないことを理解されたい。省略された詳細および改変または代替の実施形態は、当業者の理解の範囲内である。

本開示の特定の態様では、エレメントもしくは構造を提供するために、または所与の機能（単数または複数）を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素に置き換えてもよく、複数の構成要素を単一の構成要素に置き換えてもよいことが理解されよう。そのような置換が本開示の特定の実施形態を実施するように機能しない場合を除いて、そのような置換は本開示の範囲内であると考えられる。

本明細書に提示される例は、本開示の潜在的かつ具体的な実施態様を例示することを意図している。例は、主に当業者のための本開示の例示を意図していることが理解されよう。本開示の趣旨から逸脱することなく、これらの図または本明細書に記載された操作には変形があり得る。例えば、特定の場合には、方法工程または操作を異なる順序で実施または実行することができ、あるいは操作を追加、削除または改変することができる。

値の範囲が提供される場合、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、下限の単位の最小の端数まで、その範囲の上限と下限との間の各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または記載されていない介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値との間の任意のより狭い範囲が包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれてもよく、または除外されてもよく、いずれかの限界もしくは両方の限界がより小さい範囲に含まれるかまたはいずれの限界も含まれない各範囲もまた、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本技術に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も含まれる。

図面に示されたまたは上述された構成要素、ならびに図示または説明されていない構成要素および工程の異なる配置が可能である。同様に、いくつかの特徴および部分的な組み合わせは有用であり、他の特徴および部分的な組み合わせを参照せずに採用することができる。本開示の実施形態は、例示を目的として説明されており、限定を目的とするものではなく、代替の実施形態が本特許の読者には明らかになるであろう。したがって、本開示は、上述または図面に示された実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態および改変を行うことができる。

本明細書で引用される刊行物およびそれらが引用される資料は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
例示的な実施形態

本発明の例示的な実施形態は以下を含む：

１．プラスミドシステムであって、（ａ）核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドであって、核酸配列が、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列とを含む、第１の哺乳動物発現プラスミド；および（ｂ）ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドであって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が、第１の哺乳動物発現プラスミドの少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、第２の哺乳動物発現プラスミド、を含むプラスミドシステム。

２．水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドをさらに含む、実施形態１に記載のプラスミドシステム。

３．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である、実施形態１または２に記載のプラスミドシステム。

４．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、実施形態１～３のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

５．触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列がＣａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、実施形態４に記載のプラスミドシステム。

６．第１の哺乳動物発現プラスミドの核酸配列が、アデノシン塩基対エディタ（ＡＢＥ）をコードする核酸配列をコードし、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である、実施形態４または５に記載のプラスミドシステム。

７．アデニン塩基エディタがＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である、実施形態６に記載のプラスミドシステム。

８．少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする、実施形態１～７のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

９．アプタマー配列が、ＭＳ２アプタマー配列、ｐｐ７アプタマー、Ｂｏｘ－Ｂアプタマー、またはｃｏｍアプタマー配列である、実施形態８に記載のプラスミドシステム。

１０．融合タンパク質が、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰが同じである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

１１．第１および第２のＡＢＰがＣｏｍ結合タンパク質である、実施形態１０に記載のプラスミドシステム。

１２．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

１３．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む、実施形態１２に記載のプラスミドシステム。

１４．細胞外小胞であって、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）とを含む融合タンパク質を含み、ＡＢＰが少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、細胞外小胞。

１５．ＶＳＶ－Ｇタンパク質をさらに含む、実施形態１４に記載の細胞外小胞。

１６．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である、実施形態１４または１５に記載の細胞外小胞。

１７．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の細胞外小胞。

１８．触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列がＣａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、実施形態１７に記載の細胞外小胞。

１９．ＲＮＰがアデニン塩基対エディタ（ＡＢＥ）を含み、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である、実施形態１７または１８に記載の細胞外小胞。

２０．アデニン塩基エディタがＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である、実施形態１９に記載の細胞外小胞。

２１．少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする、実施形態１４～２０のいずれか１つに記載の細胞外小胞。

２２．アプタマー配列が、ＭＳ２アプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である、実施形態２１に記載の細胞外小胞。

２３．融合タンパク質が、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰが同じである、実施形態１４～２２のいずれか１つに記載の細胞外小胞。

２４．第１および第２のＡＢＰがＣｏｍ結合タンパク質である、実施形態２３に記載の細胞外小胞。

２５．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態１４から２４のいずれか１つに記載の細胞外小胞。

２６．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む、実施形態２５に記載の細胞外小胞。

２７．細胞外小胞がエクソソームまたは微小胞である、実施形態１４～２６のいずれか１つに記載の細胞外小胞。

２８．細胞外小胞の生産方法であって、
（ａ）実施形態１～１３のいずれか１つに記載のシステムの第１の哺乳動物発現プラスミドおよび第２の哺乳動物発現プラスミドで複数の真核細胞をトランスフェクトすること；およびｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、細胞外小胞が生産されるのに十分な時間培養すること、を含む方法。

２９．複数の真核細胞を、実施形態２～１３のいずれかに記載のシステムのエンベローププラスミドでトランスフェクトすることをさらに含む、実施形態２８に記載の方法。

３０．実施形態２８または２９に記載の方法であって、細胞外小胞が、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質を含み、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、方法。

３１．実施形態２９に記載の方法であって、細胞外小胞が、
（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質であって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）がアプタマーコード配列に結合する、融合タンパク質；および（ｃ）ＶＳＶ－Ｇタンパク質、を含む方法。

３２．複数の真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の方法。

３３．培養されたトランスフェクトされた真核細胞から細胞外小胞を単離することをさらに含む、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の方法。

３４．実施形態２８～３３のいずれか１つに記載の方法によって作製された細胞外小胞。

３５．細胞内のゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に複数の細胞外小胞を形質導入することを含み、複数の細胞外小胞が実施形態１４～２７のいずれか１つに記載の細胞外小胞を含み、ＲＮＰが細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、それによりゲノム標的配列を改変する、方法。

３６．複数の真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態３５に記載の方法。

３７．複数の真核細胞が対象内に存在する細胞である、実施形態３５または３６に記載の方法。

３８．対象がヒト対象である、実施形態３７に記載の方法。

３９．対象に複数の細胞外小胞が注射される、実施形態３８に記載の方法。

４０．実施形態１～１３のいずれか１つに記載のプラスミドシステムを含む細胞。

４１．実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法を使用して改変された細胞。

４２．対象の疾患を処置する方法であって、

ａ）対象から細胞を得ること；ｂ）実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法を使用して対象の細胞を改変すること；およびｃ）改変された細胞を対象に投与すること、を含む方法。

４３．疾患が癌である、実施形態４２に記載の方法。

４４．疾患が鎌状赤血球貧血である、実施形態４２に記載の方法。

４５．細胞がＴ細胞である、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の方法。

４６．プラスミドシステムであって、（ａ）核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドであって、核酸配列が、（ｉ）異種ポリペプチドをコードする核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列とを含む、第１の哺乳動物発現プラスミド；および（ｂ）ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドであって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が、第１の哺乳動物発現プラスミドの少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、第２の哺乳動物発現プラスミド、を含むプラスミドシステム。

４７．第１の哺乳動物発現プラスミドの核酸配列がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードし、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列をさらに含む、実施形態４６に記載のプラスミドシステム。

４８．異種ポリペプチドをコードする核酸配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態４６に記載のプラスミドシステム。

４９．ｇＲＮＡコード配列が少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態４７に記載のプラスミドシステム。

５０．水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドをさらに含む、実施形態４６～４９のいずれかに記載のプラスミドシステム。

５１．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である、実施形態４７に記載のプラスミドシステム。

５２．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、実施形態４７に記載のプラスミドシステム。

５３．触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列がＣａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、実施形態５２に記載のプラスミドシステム。

５４．第１の哺乳動物発現プラスミドの核酸配列が、アデノシン塩基対エディタ（ＡＢＥ）をコードする核酸配列をコードし、ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼと触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である、実施形態５２または５３に記載のプラスミドシステム。

５５．アデニン塩基エディタがＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である、実施形態５４に記載のプラスミドシステム。

５６．少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする、実施形態４６～５５のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

５７．アプタマー配列が、ＭＳ２アプタマー配列、ｐｐ７アプタマー、Ｂｏｘ－Ｂアプタマー、またはｃｏｍアプタマー配列である、実施形態５６に記載のプラスミドシステム。

５８．融合タンパク質が、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰが同じである、実施形態４６～５７のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

５９．第１および第２のＡＢＰがＣｏｍ結合タンパク質である、実施形態５８に記載のプラスミドシステム。

６０．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態４９～５９のいずれか１つに記載のプラスミドシステム。

６１．ｓｇＲＮＡコード配列が、ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む、実施形態６０に記載のプラスミドシステム。

６２．細胞外小胞であって、（ａ）異種ポリペプチドと少なくとも１つのアプタマーコード配列とをコードするｍＲＮＡ；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）とを含む融合タンパク質を含み、ＡＢＰが少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、細胞外小胞。

６３．ＶＳＶ－Ｇタンパク質をさらに含む、実施形態６２に記載の細胞外小胞。

６４．融合タンパク質が、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、第１および第２のＡＢＰが同じである、実施形態６２に記載の細胞外小胞。

６５．第１および第２のＡＢＰがＣｏｍ結合タンパク質である、請求項６４に記載の細胞外小胞。

６６．細胞外小胞がエクソソームまたは微小胞である、実施形態６２～６５のいずれか１つに記載の細胞外小胞。

６７．細胞外小胞の生産方法であって、
（ａ）実施形態４６～６１のいずれか１つに記載のシステムの第１の哺乳動物発現プラスミドおよび第２の哺乳動物発現プラスミドで複数の真核細胞をトランスフェクトすること；およびｂ）トランスフェクトされた真核細胞を、細胞外小胞が生産されるのに十分な時間培養すること、を含む方法。

６８．第１の哺乳動物発現プラスミドの核酸配列がＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードし、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列をさらに含む、実施形態６７に記載の方法

６９．異種ポリペプチドをコードする核酸配列が、少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態６７または６８に記載の方法。

７０．ｇＲＮＡコード配列が少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、実施形態６８に記載の方法

７１．複数の真核生物を、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドでトランスフェクトすることをさらに含む、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の方法。

７２．実施形態７１に記載の方法であって、細胞外小胞が、
（ａ）異種ポリペプチドと少なくとも１つのアプタマー配列とをコードするｍＲＮＡ；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質を含み、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、方法。

７３．実施形態７１に記載の方法であって、細胞外小胞が、
（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質であって、アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）がアプタマーコード配列に結合する、融合タンパク質；および（ｃ）ＶＳＶ－Ｇタンパク質、を含む方法。

７４．複数の真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態６７～７３のいずれか１つに記載の方法。

７５．培養されたトランスフェクトされた真核細胞から細胞外小胞を単離することをさらに含む、実施形態７４に記載の方法。

７６．実施形態６７～７５のいずれか１つに記載の方法によって作製された細胞外小胞。

７７．細胞内のゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に複数の細胞外小胞を形質導入することを含み、複数の細胞外小胞が実施形態６２～６６のおよび７６いずれか１つに記載の細胞外小胞を含み、ＲＮＰが細胞のゲノムＤＮＡ中のゲノム標的配列に結合し、それによりゲノム標的配列を改変する、方法。

７８．複数の真核細胞が哺乳動物細胞である、実施形態７７に記載の方法。

７９．複数の真核細胞が対象内に存在する細胞である、実施形態７８に記載の方法。

８０．対象がヒト対象である、実施形態７９に記載の方法。

８１．対象に複数の細胞外小胞が注射される、実施形態８０に記載の方法。

８２．実施形態４６～６１のいずれか１つに記載のプラスミドシステムを含む細胞。

８４．実施形態７７～８１のいずれか１つに記載の方法を使用して改変された細胞。

８５．対象の疾患を処置する方法であって、
ａ）対象から細胞を得ること；
ｂ）実施形態７７～８１のいずれか１つに記載の方法を使用して対象の細胞を改変すること；および
ｃ）改変された細胞を対象に投与すること、を含む方法。

８６．疾患が癌である、実施形態８５に記載の方法。

８７．疾患が鎌状赤血球貧血である、実施形態８５に記載の方法。

８８．細胞がＴ細胞である、実施形態８６または８７に記載の方法。

実施例１．材料および方法
プラスミド。ＣＤ６３－ｐＥＧＦＰ－Ｃ２（Ａｄｄｇｅｎｅ＃６２９６４）およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）はＡｄｄｇｅｎｅから購入した。本明細書中に記載される研究のために生成されたプラスミドを表２に提供する。遺伝子合成はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）によって行った。生成したすべての構築物をサンガーシーケンシングによって確認した。プライマー、オリゴおよび合成ＤＮＡ断片の配列情報を表３に示す。ｓｇＲＮＡの標的配列を表４に列挙する。生成したすべての構築物をサンガーシーケンシングによって確認した。プライマーおよびオリゴヌクレオチドの配列情報を表３および表４に列挙する。表２に列挙したプラスミドの構成要素の配列は、核酸リンカー、例えば約２～１００塩基のリンカーによって分離することができることが理解される。必要に応じて、本明細書に記載される構築物のいずれかは、構築物中の１またはそれを超えるポリペプチド配列の発現を促進するために、例えばプロモーター配列とポリペプチド配列（例えば、ＣＤ６３、ＡＢＥなど）をコードする核酸との間に１またはそれを超えるイントロンを含むことができる。

遺伝子編集活性のためのＧＦＰレポーターアッセイ。ヒトβヘモグロビン（ＨＢＢ）鎌状赤血球変異体およびヒトＩＬ２ＲＧに対する標的配列を有するＨＥＫ２９３Ｔ由来ＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＥＧＦＰレポーター細胞（Ｊａｖｉｄｉ－Ｐａｒｓｉｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２，ｅ０１７７４４４（２０１７））、ならびにヒトＤＭＤエクソン５３からの標的配列を有するＤＭＤレポーター細胞（Ｌｙｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １５，ｅ０２３９４６８（２０２０））を使用して、それぞれＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧおよびＤＭＤエクソン５３を標的にするＣａｓ９ ＲＮＰの遺伝子編集活性を検出した。ＧＦＰレポーター細胞は、ＥＧＦＰコード配列の開始コドンの直後にそれぞれの標的配列を挿入することによるＥＧＦＰリーディングフレームの破壊のために、ＥＧＦＰを発現しなかった。遺伝子編集後に形成されたＩＮＤＥＬは、ＥＧＦＰリーディングフレームを回復させ、ＥＧＦＰ発現をもたらし得る。ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ））によって分析した。

Ｃａｓ９またはＡＢＥ ＲＮＰ濃縮細胞外小胞（ＥＶ）の生産。ＲＮＰ濃縮ＥＶを、３つのプラスミド：ＡＢＰ ＣｏｍとＣＤ６３との間の融合タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡ、ＶＳＶ－Ｇを発現するｐＤＭ２．Ｇ、ならびに遺伝子編集エフェクター（ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９またはＡＢＥ）およびそれぞれの遺伝子特異的ｓｇＲＮＡを発現する標的プラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによって生産した（様々な標的プラスミドについては表２を参照）。簡潔には、１０ｃｍ皿において成長させた５００万個の活発に増殖するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地とインキュベーションした。３μｇのＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ融合タンパク質発現プラスミド、３μｇのｐＭＤ２．Ｇおよび１２μｇの標的プラスミドＤＮＡを０．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地中で混合した。５４μｌのＦｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））または５４μｇのポリエチレンイミン（Ｓｙｎｃｈｅｍｂｉｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ－３５４２１，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を０．５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地中で混合した。次いで、ＤＮＡ混合物およびトランスフェクション試薬混合物を混合し、室温で１５分間インキュベートした後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地中の細胞に添加した。トランスフェクションの２４時間後、培地を１０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地に交換し、トランスフェクションの７２時間後にＲＮＰ濃縮ＥＶを回収した。他の組織培養容器で成長させた細胞のトランスフェクションのために、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬の量を組織培養表面積に基づいてスケーリングした。

ＥＶ濃度。超遠心分離を使用して、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（ＰｌｏＳ Ｏｎｅ １２，ｅ ｅ０１８５９９２（２０１７））に記載されている手順に従って組織培養培地からＥＶを濃縮した。手短に言えば、細胞培養培地を１０００×ｇで３０分間、４°Ｃで遠心分離して、細胞残屑を除去した。上清を１２０，０００×ｇで７０分間、４°Ｃで遠心分離した。ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、同じ条件下で再度遠心分離した。ＥＶを含有する得られたペレットをＰＢＳに再懸濁した。典型的には、インビトロ実験のために、１０ｍｌの上清からのＥＶを５００μｌ（２０Ｘ濃度）に再懸濁した。これらのＥＶは、－８０°Ｃで保存するか、直ちに使用することができる。

ＥＶのナノ粒子追跡分析。装置のソフトウェア（バージョンＮＴＡ３．２）を使用して、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ５００装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を使用して、ＥＶの流体力学的直径および濃度を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を用いて機器をプライミングし、温度を２５°Ｃに維持した。試料を検査する前に、５０ｎｍおよび１００ｎｍのポリスチレンナノ粒子標準（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して正確な粒子追跡を検証した。ＥＶを含有する濃縮試料をＰＢＳで１０００倍に連続希釈した。各試料中のＥＶ濃度の定量のための線形範囲は、１０～４０，０００倍希釈の間であった。したがって、すべての試料をＰＢＳで１，０００倍希釈した。５つの独立した測定値（それぞれ６０秒）を各試料について三連で得た。データは、これらの測定値の平均（濃度決定のための希釈係数を掛けたもの）±平均の標準誤差として報告する。

ＥＶ媒介ＲＮＰ送達。６０～２０００万個の細胞の上清から濃縮されたＲＮＰ濃縮ＥＶを、２４ウェルプレート中のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１１０５８０２１，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で成長させた２．５ｘ１０^４個の細胞に添加した。培地中のＦＢＳの存在はＥＶ媒介ＲＮＰ送達を阻害するので、培地の血清が低いことが重要である。１２～２４時間インキュベートした後、培地を１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換した。ＥＶ処理の３６時間後、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって遺伝子編集を分析した。

ＥＶ送達Ｃａｓ９の分解を調べる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０^４個）を、増殖を制限するために２４ウェルプレート中の０．５％ ＦＢＳを含むＲＭＰＩ１６４０培地で成長させた。細胞を異なる時間にＲＮＰロードＥＶで処理したが、同時に回収した。４８時間で２０万個の細胞によって分泌されたＥＶ（約８ｘ１０^９個の小胞）を各ウェルに添加した。ＥＶ処理の直前に、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地に交換した。ＥＶ添加の６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後に細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、ウェスタンブロット分析のためにＬａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解した。

ＥＶのウェスタンブロッティング分析。４８時間で５ｘ１０^６個の細胞によって分泌されたＥＶを濃縮し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。６０μｌのＥＶ溶液を等体積の２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、９５°Ｃで５分間煮沸した。１０μｌの各試料を、ウェスタンブロット分析のために１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの各レーンにロードした。使用した抗体には、マウスモノクローナル抗ＳａＣａｓ９抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．ＭＡＢ１３１８７２，ｃｌｏｎｅ ６Ｆ７，１：１０００（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、ＧＡＰＤＨ抗体（ＣＳＴ、１：１０００）、ＲＡＢ５Ｂ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．ａｂ２３００２０，１：１０００（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））、ＣＤ９抗体ＳＢＩ，Ｃａｔ．ＥＸＯＡＢ－ＣＤ９Ａ－１，１：１０００（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））、ＶＳＶ－Ｇ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｖ４８８８，１：１０００）、ＣＤ６３抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．ａｂ６８４１８，１：１０００）、ＧＲＰ９４抗体（ＣＳＴ，Ｃａｔ．２０２９２Ｔ，１：１０００（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ））および抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｃａｔ Ｎｏ．３１４６０，１：５０００）二次抗体が含まれた。化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウェスタンブロッティング基質、Ｃａｔ．３２１０６（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を使用して、ＬＡＳ－３０００システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ（Ｖａｌｈａｌｌａ，ＮＹ））下でタンパク質シグナルを可視化した。デンシトメトリー（ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４９）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、ウェスタンブロッティング画像に基づいてタンパク質量を定量した。

ＲＴ－ｑＰＣＲおよびｑＰＣＲ分析。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｃａｔ Ｎｏ．７４１３６（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して、収集したＥＶからＲＮＡを単離した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＨＢＢ ｓｇＲＮＡ１およびＨＢＢ ｓｇＲＮＡ１ Ｔｅｔｒａ－ｃｏｍ検出のために、ｓｇＲＮＡ－Ｆ１およびｓｇＲＮＡ－Ｒ３をＳＹＢＲ（商標）ＧｒｅｅｎベースのＲＴ－ｑＰＣＲにおけるプライマーとして使用した。ＡＢＥ－ｇ５－ｏｎＦおよびｇ５－ＡＢＥ－ＲをｑＰＣＲプライマーとして使用して、部位５での塩基編集を検出した。ＰＣＲをＡＢＩ ７５００装置で実行した。プライマー情報を表３に含める。

透過型電子顕微鏡法。透過型電子顕微鏡法を、Ｗａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ Ｂａｐｔｉｓｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｉｎｓｔｏｎ－Ｓａｌｅｍ，ＮＣ）のＣｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅで行った。回収したＥＶ（約６．０ｘ１０^１１個の小胞／ｍｌ）を酢酸ウラニルで染色した。粒子を平らな炭素グリッドに吸収させ、乾燥させ、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ ３０電子顕微鏡（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ）で観察した。粒子の直径は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．４９）を用いて測定した。

次世代シーケンシングおよびデータ解析。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養細胞から単離した。標的配列を含むＤＮＡ領域を、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）からの校正用ＨｏｔＳｔａｒｔ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘによって増幅した。各標的配列を増幅するために使用したＰＣＲプライマーを表３に列挙した。精製したＰＣＲ産物をＧｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃ．（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）に出荷し、Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＥＺサービスを用いて次世代シーケンシングを行った。通常、５０，０００リード／アンプリコンが得られた。挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）の分析を、オンラインＣａｓ－Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア２８およびＣＲＩＳＰＲＥＳＳＯ２ ２９を用いて行ったところ、非常に類似した結果が得られた。

ＲＮＰロードＥＶのマウス前脛骨筋（ＴＡ）への筋肉内注射。５月齢の雌ｄｅｌ５２ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスを注射に使用した。これらのマウスは、ｍｄｘバックグラウンドにエクソン５２欠失を有するヒトＤＭＤ遺伝子のコピーを保有する（Ｖｅｌｔｒｏｐ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３，ｅ０１９３２８９（２０１８））。４８時間で５００万細胞（低用量）または４０００万細胞（高用量）によって分泌されたＥＶを、ハミルトンシリンジを使用して各ＴＡ筋に注射した。注射の７日後にマウスを屠殺した。ＴＡ筋を凍結切片のために除去した。組織をＯＣＴ包埋化合物にマウントし、液体窒素で凍結した。組織学的分析のために、各ブロックから２００μｍ離れた３つの連続１０μｍ厚切片の６つまたは７つのブロックを収集した。残りの組織を使用して、ＮＧＳ分析のためにゲノムＤＮＡを精製した。

免疫組織化学アッセイ。切片を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。３回のＰＢＳ洗浄後、切片を０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００ ＰＢＳ緩衝液で１０分間、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｔ．Ｘ０９０９３０－２，Ａｇｉｌｅｎｔ）で３０分間インキュベートした。次いで、切片を抗ジストロフィン一次抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ３０６８０５０，１：１００００）と１時間インキュベートした。次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３二次抗体（Ａ－２１０５２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，１：５０００）を、３回のＰＢＳ洗浄後に組織と４５分間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで６回洗浄し、ＤＡＰＩ含有封入剤に５分間封入した。スライドを蛍光顕微鏡下で観察した。

統計分析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０）を統計分析に使用した。Ｔ検定を使用して、２つの群の平均を比較した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った後、２つよりも多くの群からのデータを分析するためにテューキー事後検定を行った。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
実施例２．細胞外小胞（ＥＶ）におけるＣＤ６３、アプタマーおよびＡＢＰ媒介ＲＮＰ濃縮

上記の実験を使用して、ｃｏｍとＣｏｍとの間の特異的相互作用がＲＮＰをＥＶに濃縮することができるかどうかを決定した。ＣＤ６３は、細胞質にＮ末端およびＣ末端を有するテトラスパン膜貫通タンパク質である。Ｃｏｍが原形質膜の細胞質側を向くように、ＣｏｍをＣＤ６３のＮ末端、Ｃ末端または両末端に融合した（図１Ａ）。エクソソーム生成中、Ｃａｓ９またはＡＢＥ ＲＮＰは、ＣＤ６３－Ｃｏｍ、ｃｏｍ－ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の間の相互作用を介してエクソソーム中で濃縮されると仮定された（図１Ｂ）。あるいは、ＲＮＰはまた、細胞表面からの膜小胞の外側への出芽および分裂を介して微小胞に濃縮され得る（図１Ｃ）。これらの研究では、エクソソームおよび微小胞を含む、生産されたすべての小胞構造が、小胞生成の機構にかかわらずＥＶと呼ばれることが理解される。

Ｃｏｍの融合がＣＤ６３発現に影響を及ぼすかどうかを調べたところ、ＣＤ６３のいずれの端にＣｏｍを融合してもＣＤ６３の発現は損なわれないことがわかった。実際、Ｃ末端にＣｏｍを融合すると、ＣＤ６３の発現が大幅に増加した（図２Ａ）。ＣＤ６３へのＣｏｍ融合がＳａＣａｓ９ ＲＮＰのＥＶへのパッケージングを可能にするかどうかも試験した。細胞からのＥＶの脱出は制限され得るので、ＥＶがレシピエント細胞におけるエンドソーム系からのエスケープを促進するためにＶＳＶ－Ｇタンパク質を有するように、ＥＶ産生細胞においてＶＳＶ－Ｇを発現させた。Ｃｏｍ－ＣＤ６３、ＣＤ６３－ＣｏｍまたはＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＶＳＶ－Ｇ、ＳａＣａｓ９およびｃｏｍ改変ＩＬ２ＲＧ標的化ｓｇＲＮＡ １２と共発現させた。ＥＶをトランスフェクト細胞の上清から回収し、超遠心分離によって濃縮した。再懸濁したＥＶを、以前に記載されたＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞（Ｊａｖｉｄｉ－Ｐａｒｓｉｊａｎｉ ２０１７）の培地に添加した。これらの細胞は、ＥＧＦＰコード配列の開始コドンの直後に１１９ｎｔのＨＢＢ鎌状突然変異およびＩＬ２ＲＧ標的配列を挿入することによるＥＧＦＰリーディングフレームの破壊のために、ＥＧＦＰを発現しなかった。遺伝子編集後に形成されたＩＮＤＥＬは、ＥＧＦＰリーディングフレームを回復させ、ＥＧＦＰ発現をもたらし得る。

フローサイトメトリー分析により、アプタマー結合タンパク質Ｃｏｍまたはアプタマーｃｏｍがなければ、ＧＦＰ陽性細胞はほとんど観察することができず、ＥＶへのＲＮＰのランダムパッケージングを示すことがわかった。ｓｇＲＮＡをアプタマーｃｏｍで改変した場合、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍが最も多くのＧＦＰ陽性レポーター細胞を生成し、次いでＣＤ６３－ＣｏｍおよびＣｏｍ－ＣＤ６３であった（図２Ｂ）。ＣＤ６３－ＣｏｍはＣｏｍ－ＣＤ６３よりも強い発現レベルを有し、ＥＶ送達ＲＮＰはまた、Ｃｏｍ－ＣＤ６３よりも多くのＧＦＰ陽性細胞を生成した。Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍの発現はＣＤ６３－Ｃｏｍの発現よりも弱かったが、そのＥＶ関連ＲＮＰは有意により多くのＧＦＰ陽性細胞を生成した。データは、両方の末端におけるＣｏｍがＲＮＰの動員に対して相乗効果を有することを示唆した。データは、ＡＢＰ（Ｃｏｍ）およびアプタマー（ｃｏｍ）の両方が、高い遺伝子編集活性を有するＥＶ関連ＲＮＰを生成するために必要であることを示した。

Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍは、最も高い遺伝子編集活性を有するＥＶ関連ＲＮＰを生成したので、さらなる実験で使用した。Ｃｏｍ－ＣＤ６３－ＣｏｍおよびＣａｓ９ ＲＮＰを発現するプラスミドＤＮＡの異なる比を試験し、それらが１：４の質量比である場合に最良の活性が得られた（図３）。

ＶＳＶ－Ｇは、ＥＶがレシピエント細胞のエンドソーム系からのエスケープを助けるためにＥＶ産生細胞で共発現された。ＶＳＶ－ＧがＥＶ関連ＲＮＰの機能的送達に必要であるかどうかを確認するために、ＶＳＶ－Ｇの非存在下でＥＶ関連ＲＮＰを生成した。これらのＲＮＰは、ＧＦＰ陽性レポーター細胞のバックグラウンドレベルを生成した（図２Ｃ）。ＣｏｍをＶＳＶ－ＧのＣ末端に融合することが遺伝子編集活性をさらに増加させることができるかどうかを試験した。この融合は、ＥＶ関連ＲＮＰの遺伝子編集活性を大幅に低下させた。２つの可能性がこの観察の根底にあり得る：１）ＣｏｍをＶＳＶ－ＧのＣ末端に融合すると、ＶＳＶ－Ｇの発現が５０％を超えて減少し（図４）；２）そうすることは、ＶＳＶ－Ｇの融合活性を妨害し得る。

データは、ＲＮＰがＥＶ中で濃縮され、ＥＶによって機能的に送達され得ることを示した。さらに、アプタマーｃｏｍ、ＡＢＰ Ｃｏｍ、および必要に応じてＶＳＶ－Ｇタンパク質は、ＥＶによるＲＮＰの機能的送達に使用することができる。

ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰがＥＶによってパッケージングおよび送達され得るかどうかについても試験した。ＳＴ２ループをｃｏｍアプタマーで置き換えると、ＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの機能が最も保存され、レンチウイルス様粒子によるＳｐＣａｓ９ ＲＮＰの効率的な送達が可能になる。したがって、同様に改変されたｓｇＲＮＡを使用してＳｐＣａｓ９ ＲＮＰをＥＶにパッケージングした。様々なＣｏｍ－ＣＤ６３融合タンパク質、ＶＳＶ－Ｇ、ＳｐＣａｓ９、およびＳＴ２－ｃｏｍ改変ＩＬ２ＲＧ標的化ｓｇＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において共発現させた。得られたＥＶをＨＢＢ－ＩＬ２ＲＧ ＧＦＰレポーター細胞に適用した。ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰはＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍによって効率的にパッケージングされ、ＡＢＰとアプタマーの両方が最良の遺伝子編集活性のために必要であった（図２Ｄ）。したがって、ＡＢＰ／アプタマー相互作用を使用して、ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰをＥＶにパッケージングすることができる。

ＡＢＥ部位５（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３、２０番染色体、３２７５２９６０－３２７５２９７９）３１を標的にするアデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）ＲＮＰをＥＶにパッケージングした。ｑＰＣＲは、ＥＶ送達部位５のＡＢＥ ＲＮＰが、ＥＶ送達非標的化ＡＢＥ ＲＮＰと比較して２４．３±０．７倍（ｎ＝３）の塩基編集産物を生成したことを示した。データは、ＥＶがＡＢＥ ＲＮＰを濃縮および送達することもできることを示している。

Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｇＲＮＡの核外輸送は非効率的であり得る。ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよび肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムが隣接するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター駆動ｓｇＲＮＡを、いくつかの研究で使用した。この設計は、リボザイム切断後に成熟ｓｇＲＮＡを生成することが示されている（Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１８３４１（２０１５）。この設計は、ＥＶ送達ＲＮＰの遺伝子編集活性をわずかに増加させただけであった（図５）。これは、ｓｇＲＮＡ核外輸送がこれらの研究における制限因子ではないことを示唆した。アプタマー改変ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡを膜小胞に動員するための活性濃縮機構を提供することが可能である。
実施例３．Ｃｏｍ／ｃｏｍ相互作用は、ＥＶにＲＮＰを濃縮した

Ｃｏｍ／ｃｏｍ相互作用がＥＶにＲＮＰを濃縮するかどうかをウェスタンブロッティングによって調べた。ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰをロードしたＥＶを、ｃｏｍアプタマーを用いておよび用いずに調製した。それぞれのＥＶにおいて、ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９およびＡＢＥ含有量が検出された。２～５倍のＣａｓ９またはＡＢＥタンパク質が、非改変ｓｇＲＮＡ（ｃｏｍ－）を有するＲＮＰと比較して、ｃｏｍ－改変ｓｇＲＮＡ（ｃｏｍ＋）を有するＲＮＰにおいて検出されたが、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍタンパク質の量は同程度であった（図６Ａ～６Ｂ）。これらの観察と一致して、Ｃｏｍおよびｃｏｍの存在はＥＶにおいて最も多くのｓｇＲＮＡをパッケージングした（図６Ｃ）。データは、Ｃｏｍ／ｃｏｍ相互作用がＲＮＰをＥＶに濃縮したが、ＲＮＰのランダムパッケージングがあったことを示した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して、１００万個のトランスフェクト細胞が４８時間で約６２５ｎｇの総ＥＶタンパク質を分泌することが分かった。その中で、既知濃度のＣａｓ９タンパク質のウェスタンブロッティングに基づいて、６５ｎｇのＳａＣａｓ９、８０ｎｇのＳｐＣａｓ９および３５ｎｇのＡＢＥタンパク質が検出された（図６Ａ～６Ｂ）。
実施例４．ＥＶ送達ＲＮＰは、異なる細胞の複数の標的に対して効率的な遺伝子編集を達成した

異なる細胞中の様々な標的を標的にするＥＶ送達ＲＮＰのゲノム編集活性をＮＧＳによって確認した。表５に示すように、ＩＮＤＥＬは、ＧＦＰレポーター細胞、ＥＶが生成されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および、ＥＶ供給源細胞とは異なる細胞であってトランスフェクトするのが困難なＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、異なるレンチウイルス組込み標的で観察された。ＥＶ送達ＡＢＥ ＲＮＰで処理した異なる細胞の部位５でのＡからＧへの変化も検出された（表５）。

ＥＶ関連ＲＮＰ（図６Ａ～Ｂ）の産生速度の推定に基づいて、これらの実験で使用したＥＶ送達ＲＮＰの量は、１０５個の細胞について０．１３～６．４μｇであった。最高投与量は、典型的なエレクトロポレーション実験で使用された投与量（１０μｇ）よりも低かった。
実施例５．ＲＮＰ濃縮によるＥＶの特性評価

過剰発現したＣｏｍ－ＣＤ６３－ＣｏｍがＥＶ生合成に影響を及ぼすかどうかを、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ過剰発現を有するおよび有しない細胞からＥＶを単離し、ウェスタンブロッティングによってタンパク質発現を調べることによって調べた。エクソソームマーカータンパク質ＣＤ９およびＲＡＢ５Ｂの発現は、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ過剰発現を有する細胞から単離されたＥＶから減少しないことが見出され（図７Ａ）、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ過剰発現がＥＶ生合成全体を減少させないことを示唆した。さらに、Ｃａｓ９ ＲＮＰの過剰発現もＥＶ生合成を損なわなかった。Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ過剰発現は、ＥＶにおけるＣＤ６３反応性抗原の検出を大幅に増加させた。観察されたＣＤ６３サイズは予想よりもはるかに大きく、バンドは拡散しているように見えた。両方の観察結果は、ＣＤ６３の不均一なグリコシル化の結果であった。同じ理由で、内因性ＣＤ６３と過剰発現Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍとの間のサイズ差は明らかではなかった。細胞Ｃｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ（図２Ａ）と比較して、ＥＶ中のＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍは明らかにより大きく、より不均一なサイズに見えた。ＥＶ中のＣＤ６３タンパク質は、高度のグリコシル化を有していたと思われる。予想通り、ＶＳＶ－ＧおよびＣａｓ９は、それぞれのタンパク質を過剰発現する細胞からのＥＶにおいてのみ観察された。エンドソーム経路に関与しないタンパク質であるＧＲＰ９４はＥＶ調製物では観察されず、細胞タンパク質汚染が最小限であることを示唆した。

透過型電子顕微鏡法を実施して、ＣＤ６３過剰発現なし、ＣＤ６３またはＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ過剰発現ありの細胞（すべての細胞がＶＳＶ－ＧおよびＣａｓ９ ＲＮＰを過剰発現した）から単離したＥＶの形態を調べた。これらの細胞から単離されたＥＶの形態に差は観察されなかった（図７Ｂ）。本発明者らは、細胞から単離されたＥＶの粒子数およびサイズを調べるためにナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）を実施し、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－ＣｏｍおよびＣａｓ９ ＲＮＰを過剰発現すると、生成されたＥＶ粒子の総数がわずかに減少することを見出した（図７Ｃ）。さらに、Ｃｏｍ－ＣＤ６３－ＣｏｍおよびＣａｓ９ ＲＮＰを過剰発現すると、ＥＶサイズ分布が変化し、直径１００ｎｍのＥＶが減少し、直径２００ｎｍのＥＶが増加した（図７Ｄ）。サイズ分布の右シフトは、総ＥＶ数はＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ過剰発現で減少したが、ＥＶにおけるＣＤ９およびＲＡＢ５Ｂ発現が減少しなかった理由を説明した。
実施例６．ＥＶによって送達されるＣａｓ９ ＲＮＰの短い半減期

ヒト細胞におけるＥＶ送達ＲＮＰの運命を調べるために、ＥＶ送達、ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰを標的にするＤＭＤエクソン５３をＨＥＫ２９３Ｔ培養物に添加し、ＥＶ添加後の異なる時間に細胞を回収した。ウェスタンブロッティングにより、送達の６時間後、ＳｐＣａｓ９タンパク質レベルが最も高く、その後、ＳｐＣａｓ９タンパク質レベルが急速に減少したことが分かった（図８Ａ）。デンシトメトリー分析により、送達後１８時間で、Ｃａｓ９レベルが送達後６時間のＣａｓ９レベルのわずか１０％であることが明らかになった（図８Ｂ）。ヒト細胞におけるＥＶ送達ＳｐＣａｓ９タンパク質の半減期は３時間であると推定された。

ＥＶ送達ＩＬ２ＲＧ標的化ＳａＣａｓ９ ＲＮＰを使用して同様の実験を行い、ＲＮＰの同様の迅速な分解（図５Ｃ）が観察された。したがって、ＥＶによって送達されたＣａｓ９ ＲＮＰは、半減期が非常に短かった。この短い半減期は、ＥＶ送達ＲＮＰの特異性および安全性を保証する。
実施例７．マルチプレックス遺伝子編集のためのＲＮＰ濃縮ＥＶの単一調製

各ＣＤ６３分子は２つのＣｏｍ分子に融合され、各ＥＶは１よりも多くのＣｏｍ－ＣＤ６３－Ｃｏｍ分子を有し得るので、ＥＶは複数の遺伝子座を同時に標的とするためのＲＮＰの送達に理想的であり得ると推論された。２つの標的部位間の２３６１ｂｐを除去するために（図９Ａ）、ＤＭＤイントロン５０（Ｓａ－５０）およびイントロン５１（Ｓａ－５１）をそれぞれ標的とする２つのＳａＣａｓ９ ＲＮＰを試験した。ＤＭＤイントロン５０を標的とするＲＮＰ、ＤＭＤイントロン５１を標的とするＲＮＰ、および両方のイントロンを標的とするＲＮＰをロードしたＥＶを調製した。両方のイントロンを標的とするＲＮＰをロードしたＥＶを、各標的プラスミドＤＮＡの半分を使用するだけで単一のＥＶ調製物で調製した。２つの個別にパッケージングされたＲＮＰを一緒に使用して、エクソン５１除去について、共パッケージングされたＲＮＰと比較した。すべてのＲＮＰロードＥＶを並行して調製し、同様に濃縮した。ＰＣＲを使用してエクソン５１除去を検出したエクソン５１除去なしでは：２６４５ｂｐがプライマーＤＭＤ５０－ＦおよびＤＭＤ５１－Ｒ２で増幅され（図９Ａ）、それ以外では２８４ｂｐ産物が増幅される。２８４ｂｐアンプリコンは、共パッケージングされたＲＮＰで処理した細胞で観察されたが、２つの個別にパッケージングされたＲＮＰで処理した細胞では観察されなかった（図９Ｂ）。ＤＮＡシーケンシングにより、約２８４ｂｐのアンプリコンが２つのｓｇＲＮＡ間の配列を欠失させた結果であることが確認された。この実験は、１つの単一調製物が１よりも多くの遺伝子座を標的とするＲＮＰをロードしたＥＶを生産することができ、そのようにすることがマルチプレックス遺伝子標的化のためにより効率的であることを示した。

１つの単一調製物中のＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ ＲＮＰのパッケージングも試験した。この場合、ＳａＣａｓ９ ＲＮＰを標的とするＤＭＤイントロン５０およびＳｐＣａｓ９ ＲＮＰを標的とするＤＭＤエクソン５３をＥＶに個別にパッケージングまたは共パッケージングした。９６ｋｂ離れた２つの標的部位間の配列を除去するために、２つの個別にパッケージングされたＲＮＰを一緒に使用して共パッケージングされたＲＮＰと比較した（図９Ａ）。ＰＣＲは、９６ｋｂの欠失を示しＤＮＡシーケンシングによって確認された予想される２６３ｂｐ ＤＮＡアンプリコンが、共パッケージングされたＲＮＰで処理した細胞でのみ観察されたが、２つの個別にパッケージングされたＲＮＰで処理した細胞では観察されなかったことを示した（図９Ｃ）。したがって、異なる種由来のＣａｓ９のＲＮＰもまた、効率的なマルチプレックス遺伝子編集のために単一調製物でＥＶに共パッケージングすることができる。
実施例８．ＥＶ送達ＲＮＰのインビボ活性

ＥＶ送達ＤＭＤエクソン５３標的化ＲＮＰのインビボ活性を調べた。４８時間で４０００万個の細胞によって生産されたＲＮＰロードＥＶを濃縮し、ｄｅｌ５２ｈＤＭＤ／ｍｄｘマウスの各ＴＡ筋に注射した。１週間後、マウスを屠殺し、ＴＡ筋を回収して標的遺伝子編集を調べた。ゲノムＤＮＡをＴＡ筋から単離し、標的ＤＮＡ領域をＮＧＳ分析のために増幅した。最大０．２％のＩＮＤＥＬ率（１５７９８２リードのうち３１６リード）がＲＮＰ注射筋肉において観察され、０％のＩＮＤＥＬ率がＰＢＳ注射筋肉において観察された（カイ二乗検定により、５１３０２リードのうち０、ｐ＜０．０００１）。ＩＮＤＥＬはすべて、予測された切断部位の周囲にあった。

注射ＴＡ筋におけるジストロフィンの発現を調べるために免疫染色を行った。これらのマウスは、ジストロフィンのリーディングフレームを回復させる自発的エクソン５３スキッピングのために骨格筋におけるジストロフィン発現のバックグラウンドが低い。ＲＮＰ注射ＴＡ筋では、より強いジストロフィン発現を有する領域が観察されたが、これはＰＢＳ注射筋では観察されなかった。

本明細書に記載の研究は、アプタマー結合タンパク質（ＣＤ６３に融合）とアプタマー（ｓｇＲＮＡに挿入）との間の特異的相互作用を使用して、ＥＶ中のＣａｓ９およびＡＢＥ ＲＮＰを積極的に濃縮できることを示した。この例では、ｃｏｍ／Ｃｏｍ相互作用は、細胞の細胞質およびエクソソームの管腔にあるＣＤ６３のＮ末端およびＣ末端にＲＮＰを会合する。ＣＤ６３はエクソソーム中に豊富であるので、この方法は、ＥＶへのＣａｓ９およびＡＢＥ ＲＮＰを特異的に濃縮した。実際、ＲＮＰ濃縮機構のないＥＶと比較して、最大１０倍の遺伝子編集活性が観察された（例えば、アプタマーｃｏｍまたはアプタマー結合タンパク質Ｃｏｍなし）。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡは、ＲＮＰ濃縮機構のない条件にも存在したので、これらの条件で観察された低い遺伝子編集活性は、ＥＶ移入プラスミドＤＮＡの主な寄与を除外した。

アプタマー結合タンパク質ＣｏｍをＣＤ６３のＮ末端およびＣ末端の両方に付加すると、遺伝子編集活性に対して相乗効果が示されたことは興味深い。この観察にはいくつかの説明があり得る：１）Ｃｏｍはホモダイマーとして機能し得、ＣＤ６３のＮ末端およびＣ末端の両方にＣｏｍを融合することは、機能単位を作製する可能性を高めるか、または２）Ｃａｓ９分子の閾値が機能的である必要があり、ＣＤ６３のＮ末端およびＣ末端の両方にＣｏｍを融合することにより、その閾値に達する可能性が増大する。

別の興味深い所見は、ＥＶ送達ＲＮＰのゲノム編集活性にＶＳＶ－Ｇが重要であり得ることである。最も可能性の高い説明は、ＶＳＶ－Ｇがレシピエント細胞におけるエンドソーム系からのＲＮＰのエスケープを助けるということである。本明細書中に記載される研究に基づいて、インタクトで遊離のＣ末端が、ＶＳＶ－Ｇがエンドソームのエスケープを誘導するために重要である可能性が高い。

ＥＶ媒介ＲＮＰ送達システムの利点は、１よりも多くの遺伝子座を標的とするＲＮＰおよび異なる種からのＣａｓ９タンパク質を有するＲＮＰが、単一のＲＮＰ調製物中のＥＶに濃縮され得ることである。本明細書で実証されるように、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ ＲＮＰの共パッケージングが可能である。他の種由来のＣａｓ９タンパク質もまた、ｃｏｍアプタマーがそれらのｓｇＲＮＡに挿入され得る限り、共パッケージングされ得ることが予想される。さらに、共パッケージングされたＲＮＰは、マルチプレックスゲノム編集のための個別にパッケージングされたＲＮＰの組み合わせよりも活性である。これらの特徴は、ＥＶを、免疫拒絶のリスクを低減するための抗原のノックアウト、ゲノムからのＨＩＶプロウイルスＤＮＡの根絶、および癌治療における応答の増強を含む、多くの状況で必要とされるマルチプレックスゲノム編集のための理想的な送達ツールにする。

これらの利点に加えて、ＥＶは、例えば、循環中の補体系によって不活性化される傾向があるウイルス様粒子と比較して、全身送達により適している可能性がある。また、ＥＶは血液脳関門を通過する能力を有し、したがって治療の可能性を拡大する。要約すると、ＲＮＰを効率的かつ機能的にＥＶにパッケージングすることができる。ＥＶ送達ＲＮＰは、高いオンターゲット遺伝子編集活性を示す。

Claims (52)

1. プラスミドシステムであって、
   （ａ）核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドであって、前記核酸配列が、
   （ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と、
   （ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コード配列とを含む、第１の哺乳動物発現プラスミド；および
   （ｂ）ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドであって、前記アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が、前記第１の哺乳動物発現プラスミドの前記少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、第２の哺乳動物発現プラスミド、を含むプラスミドシステム。
2. 水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドをさらに含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
3. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である、請求項１に記載のプラスミドシステム。
4. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載のプラスミドシステム。
5. 前記触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列がＣａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、請求項４に記載のプラスミドシステム。
6. 前記第１の哺乳動物発現プラスミドの前記核酸配列が、アデノシン塩基対エディタ（ＡＢＥ）をコードする核酸配列をコードし、前記ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼと前記触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である、請求項４に記載のプラスミドシステム。
7. 前記アデニン塩基エディタがＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である、請求項６に記載のプラスミドシステム。
8. 前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする、請求項１に記載のプラスミドシステム。
9. 前記アプタマー配列が、ＭＳ２アプタマー配列、ｐｐ７アプタマー、Ｂｏｘ－Ｂアプタマー、またはｃｏｍアプタマー配列である、請求項８に記載のプラスミドシステム。
10. 前記融合タンパク質が、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、前記第１および第２のＡＢＰが同じである、請求項１に記載のプラスミドシステム。
11. 前記第１および第２のＡＢＰがＣｏｍ結合タンパク質である、請求項１０に記載のプラスミドシステム。
12. 前記ｓｇＲＮＡコード配列が、前記ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項１に記載のプラスミドシステム。
13. 前記ｓｇＲＮＡコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む、請求項１２に記載のプラスミドシステム。
14. 細胞外小胞であって、
    （ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むリボヌクレオチドタンパク質（ＲＮＰ）複合体；および
    （ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）とを含む融合タンパク質を含み、前記ＡＢＰが前記少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、細胞外小胞。
15. ＶＳＶ－Ｇタンパク質をさらに含む、請求項１４に記載の細胞外小胞。
16. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質またはこれらの誘導体である、請求項１４に記載の細胞外小胞。
17. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、請求項１４に記載の細胞外小胞。
18. 前記触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼコード配列がＣａｓ９ Ｄ１０Ａタンパク質をコードする、請求項１７に記載の細胞外小胞。
19. 前記ＲＮＰがアデニン塩基対エディタ（ＡＢＥ）を含み、前記ＡＢＥが、アデノシンデアミナーゼと前記触媒的に損なわれたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質である、請求項１７に記載の細胞外小胞。
20. 前記アデニン塩基エディタがＡＢＥ ７．１０またはＡＢＥ８である、請求項１９に記載の細胞外小胞。
21. 前記少なくとも１つのアプタマーコード配列が、ＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、ラムダＮ ＲＮＡ結合ドメイン、またはＣｏｍタンパク質からなる群から選択されるＡＢＰによって特異的に結合されたアプタマー配列をコードする、請求項１４に記載の細胞外小胞。
22. 前記アプタマー配列が、ＭＳ２アプタマー配列またはｃｏｍアプタマー配列である、請求項２１に記載の細胞外小胞。
23. 前記融合タンパク質が、ＣＤ６３のＮ末端に融合した第１のＡＢＰおよびＣＤ６３のＣ末端に融合した第２のＡＢＰを含み、前記第１および第２のＡＢＰが同じである、請求項１４に記載の細胞外小胞。
24. 前記第１および第２のＡＢＰがＣｏｍ結合タンパク質である、請求項２３に記載の細胞外小胞。
25. 前記ｓｇＲＮＡコード配列が、前記ｓｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項１４に記載の細胞外小胞。
26. 前記ｓｇＲＮＡコード配列が、前記ｇＲＮＡコード配列のテトラループまたはＳＴ２ループに挿入された少なくとも１つのｃｏｍアプタマー配列を含む、請求項２５に記載の細胞外小胞。
27. 前記細胞外小胞がエクソソームまたは微小胞である、請求項１４に記載の細胞外小胞。
28. 細胞外小胞の生産方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のシステムの前記第１の哺乳動物発現プラスミドおよび前記第２の哺乳動物発現プラスミドで複数の真核細胞をトランスフェクトすること；および
    ｂ）前記トランスフェクトされた真核細胞を、細胞外小胞が生産されるのに十分な時間培養すること、を含む方法。
29. 前記複数の真核細胞を、請求項２に記載のシステムの前記エンベローププラスミドでトランスフェクトすることをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. 請求項２８に記載の方法であって、前記細胞外小胞が、
    （ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；および
    （ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質を含み、前記アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が前記少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、方法。
31. 請求項２９に記載の方法であって、前記細胞外小胞が、
    （ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列を含むｇＲＮＡとを含むＲＮＰ；
    （ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質であって、前記アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が前記アプタマーコード配列に結合する、融合タンパク質；および
    （ｃ）ＶＳＶ－Ｇタンパク質、を含む方法。
32. 前記複数の真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の方法。
33. 前記培養されたトランスフェクトされた真核細胞から前記細胞外小胞を単離することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
34. 請求項２８に記載の方法によって作製された細胞外小胞。
35. 細胞内のゲノム標的配列を改変する方法であって、複数の真核細胞に複数の細胞外小胞を形質導入することを含み、前記複数の細胞外小胞が請求項１４に記載の細胞外小胞を含み、前記ＲＮＰが前記細胞のゲノムＤＮＡ中の前記ゲノム標的配列に結合し、それにより前記ゲノム標的配列を改変する、方法。
36. 前記複数の真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記複数の真核細胞が対象内に存在する細胞である、請求項３５に記載の方法。
38. 前記対象がヒト対象である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記対象に前記複数の細胞外小胞が注射される、請求項３８に記載の方法。
40. 請求項１に記載のプラスミドシステムを含む細胞。
41. 請求項３５に記載の方法を使用して改変された細胞。
42. 対象の疾患を処置する方法であって、
    ａ）前記対象から細胞を得ること；
    ｂ）請求項３５に記載の方法を使用して前記対象の前記細胞を改変すること；および
    ｃ）前記改変された細胞を前記対象に投与すること、を含む方法。
43. 前記疾患が癌である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記疾患が鎌状赤血球貧血である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記細胞がＴ細胞である、請求項４２に記載の方法。
46. プラスミドシステムであって、
    （ａ）核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第１の哺乳動物発現プラスミドであって、前記核酸配列が、
    （ｉ）異種ポリペプチドをコードする核酸配列と、
    （ｉｉ）少なくとも１つのアプタマーコード配列とを含む、第１の哺乳動物発現プラスミド；および
    （ｂ）ＣＤ６３および少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含む第２の哺乳動物発現プラスミドであって、前記アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が、前記第１の哺乳動物発現プラスミドの前記少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、第２の哺乳動物発現プラスミド、を含むプラスミドシステム。
47. 前記異種ポリペプチドをコードする前記核酸配列が、前記少なくとも１つのアプタマーコード配列を含む、請求項４６に記載のプラスミドシステム。
48. 細胞外小胞であって、
    （ａ）異種ポリペプチドと少なくとも１つのアプタマーコード配列とをコードするｍＲＮＡ；および（ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）とを含む融合タンパク質を含み、前記ＡＢＰが前記少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、細胞外小胞。
49. 細胞外小胞の生産方法であって、
    （ａ）請求項４６に記載のシステムの前記第１の哺乳動物発現プラスミドおよび前記第２の哺乳動物発現プラスミドで複数の真核細胞をトランスフェクトすること；および
    ｂ）前記トランスフェクトされた真核細胞を、細胞外小胞が生産されるのに十分な時間培養すること、を含む方法。
50. 請求項４９に記載の方法であって、前記細胞外小胞が、
    （ａ）前記異種ポリペプチドと前記少なくとも１つのアプタマー配列とをコードするｍＲＮＡ；および
    （ｂ）ＣＤ６３と少なくとも１つのアプタマー結合タンパク質とを含む融合タンパク質を含み、前記アプタマー結合タンパク質（ＡＢＰ）が前記少なくとも１つのアプタマーコード配列に結合する、方法。
51. 請求項４６に記載のプラスミドシステムを含む細胞。
52. 異種ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項４８に記載の細胞外小胞と接触させることを含む方法。

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