JP2024503822A - Ｇｐｃ３及びｃｄ４７を標的とする二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

ＧＰＣ３及びＣＤ４７を標的とする二重特異性抗体を提供する。

Description

肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中で多発する癌のうち６番目であり、癌に関連する死亡の大きな支配的な要因のうち３番目の要因でもある。新発性又は再発性後期のＨＣＣ患者にとって、治療のオプションが限られている。現在、ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）とレンバチニブ（Ｌｅｎｔｉｖａｎｉｂ）の２種類のマルチキナーゼ阻害剤のみが、ＦＤＡによって後期ＨＣＣのファーストライン系統的な治療薬として承認されている。しかしながら、それらの治療メリット及び応答率は高くないことが多い。腫瘍抗原標的抗体及び免疫調節抗体に基づく免疫療法は、ＨＣＣ治療結果を改善する可能性がある新たな方法を代表している。

グリピカン－３（ＧＰＣ３）は、最も十分に特徴付けられたＨＣＣ関連抗原の一つである。それはグリピカンファミリーのメンバーであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜にアンカーされたヘパラン硫酸プロテオグリカンである。多くの研究により、ＧＰＣ３は、ＨＣＣにおいて特異的にアップレギュレートされ、正常（ひいては肝硬変）な肝組織において極めて低く発現し又は発現しないことが実証され、抗体療法に用いられる優れた腫瘍特異的標的となる。しかしながら、ヒト化抗ＧＰＣ３抗体（例えばＧＣ３３）は、単一療法として第ＩＩ相臨床試験において臨床的な利益をもたらすものではなく、これは、最適な標準未満の投与及び／又は不利な免疫環境に起因する可能性がある。

ＣＤ４７は抑制性先天免疫チェックポイントである。それは、骨髄系細胞（特にマクロファージ）上の受容体Ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α（ＳＩＲＰα）と相互作用して「僕を食べないで」というシグナルを発し、癌細胞が免疫監視を避けることができるようにする。したがって、ＣＤ４７を標的とする抗体によってＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断することは、癌細胞の貪食除去を増強する望ましい方策が示されている。ＨＣＣを含む多くの固形腫瘍において、ＣＤ４７の発現アップレギュレーションが存在し、抗ＣＤ４７抗体はＨＣＣ腫瘍の成長を抑制することができる。しかしながら、現在臨床開発されているＣＤ４７標的抗体は迅速に除去され、血液毒性を引き起こし、これは主にＣＤ４７が正常細胞、特に赤血球で発現するためである。

第１の態様において、本発明は、ＣＤ４７に結合する能力を有し、ＳＩＲＰａと競合してＣＤ４７に結合する単離された抗ＣＤ４７抗体又はその断片に関する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、ＣＤ４７に結合することができる。好ましくは、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）に結合する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、ヒト抗ＣＤ４７抗体である。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、モノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、高い親和性でＣＤ４７に結合し、解離定数（ＫＤ）は約１０ｎＭ未満、例えば４ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、０．０６ｎＭの低抗体濃度でも、細胞表面上のｈＣＤ４７、例えば、Ｒａｊｉ及びＨＥＫ－２９３細胞表面上のｈＣＤ４７に結合することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαの相互作用を遮断し、標的細胞を貪食させることができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、マクロファージを媒介とするＨＬ－６０の有効な貪食を誘導することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、ヒトリンパ腫又は乳癌を軽減又はひいては治癒することができる。例えば、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、免疫不全マウスにおいてヒトリンパ腫に対する抗腫瘍作用を発揮することができる。例えば、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、免疫不全マウスにおいてヒト乳癌に対する抗腫瘍作用を発揮することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片を使用することにより、Ｒａｊｉが移植されたＮＳＧマウスにおける大きな腫瘍が縮小されることが示された。

非特異的結合実験において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、５００ｎＭの高抗体濃度でも、ヒトＣＤ４７を発現しないＣＨＯ、Ｈｅｐａ１－６、Ｂ１６Ｆ１０、ＢＨＫ－２１、ＣＴ２６細胞株に対して結合活性を示さなかった。

本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、良好な熱安定性を示す。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、可溶性のｈＣＤ４７に結合することができる。好ましくは、前記抗ｈＣＤ４７抗体は、可溶性のｈＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ｈＣＤ４７抗体又はその断片は、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインの１～１１８番目の残基に結合することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、及び、（６）（１）～（５）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であるが、そのうち少なくとも１つは、１、２、３、４又は５個のアミノ酸の付加、欠失、保存アミノ酸の置換又はそれらの組み合わせを含むものから選択され、及び、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、及び、（６）（１）～（５）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であるが、そのうち少なくとも１つは、１、２、３、４又は５個のアミノ酸の付加、欠失、保存アミノ酸の置換又はそれらの組み合わせを含むものから選択される。

一実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、及び、（６）（１）～（５）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であるが、そのうち少なくとも１つは、１、２、３、４又は５個のアミノ酸の付加、欠失、保存アミノ酸の置換又はそれらの組み合わせを含むものから選択される。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４１に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４１に示されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、エピトープ結合活性を保持するアミノ酸配列を有し、
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６に示されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、エピトープ結合活性を保持するアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるアミノ酸配列、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列、及び、（６）それぞれ（１）～（５）のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有し、エピトープ結合活性を保持する２つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤアイソタイプである。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである。

好ましくは、本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。

いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド分子上又は独立したポリヌクレオチド分子上で、重鎖可変領域全体又は軽鎖可変領域全体又は両方をコードしてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチド分子上又は独立したポリヌクレオチド分子上で、一部の重鎖可変領域又は一部の軽鎖可変領域又はその両方の一部をコードしてもよい。

別の態様では、本発明は、１種又は複数種の本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む単離された細胞又はベクターを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、被験者においてＣＤ４７が過剰発現され又はアップレギュレートされた障害を治療するための薬物の製造における本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片の用途を提供する。

前記被験者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被験者であってもよい。哺乳動物被験者は、ヒト、家畜、農場動物及び動物園、スポーツ又はペット動物、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等を含む。

いくつかの実施形態において、前記障害は癌であり、固形腫瘍癌（例えば、肺癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、膠芽腫、骨髄芽腫、平滑筋肉腫、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫など）及び液体癌（例えば、血液癌、白血病、リンパ腫）及び脳癌を含むが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態において、前記障害は、感染（例えば、慢性感染）及び／又は免疫学的疾患もしくは障害（例えば、炎症性疾患であり、多発性硬化症、関節炎などを含むが、それらに限定されない）である。

別の態様では、本発明は、本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片を前記患者に投与することを含む、被験者においてＣＤ４７が過剰発現され又はアップレギュレートされた障害を治療するための方法を提供する。

前記被験者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被験者であってもよい。哺乳動物被験者は、ヒト、家畜、農場動物及び動物園、スポーツ又はペット動物、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等を含む。

別の態様では、本発明は、ＣＤ４７を含む疑いのある細胞を本発明の抗ＣＤ４７抗体又はその断片に曝露し、前記抗ＣＤ４７抗体又はその断片と前記細胞との結合を特定することを含む、ＣＤ４７の存在を特定する方法を提供する。

前記方法は、被験者においてＣＤ４７が過剰発現され又はアップレギュレートされた障害を診断する方法であってもよい。

前記被験者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被験者であってもよい。哺乳動物被験者は、ヒト、家畜、農場動物及び動物園、スポーツ又はペット動物、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等を含む。

第２の態様において、本発明は、ＧＰＣ３及びＣＤ４７の両方に特異的に結合する能力を有する二重特異性抗体又はその断片に関する。好ましくは、前記二重特異性抗体又はその断片は、ｈＧＰＣ３及びｈＣＤ４７の両方に特異的に結合する能力を有する。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＧＰＣ３（ｈＧＰＣ３）に結合する第１の抗原結合部分と、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）に結合する第２の抗原結合部分とを含む二重特異性抗体である。以下、本発明の二重特異性抗体をＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂともいう。

いくつかの実施形態において、ヒトＧＰＣ３に結合する前記第１の抗原結合部分は、
（ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインとを含む。

いくつかの実施形態において、ヒトＧＰＣ３に結合する第１の抗原結合部分は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ４７に結合する前記第２の抗原結合部分は、
（ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインと、（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインとを含む。

いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ４７に結合する第１の抗原結合部分は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ抗体ドメインは、ヒンジ部分、ＣＨ３部分及びＣＨ２部分を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ抗体ドメインは、さらに、ヘテロ二量化を促進するドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ部分は、２つの重鎖のヘテロ二量化を可能にするノブ（ｋｎｏｂ）ドメイン及びホール（ｈｏｌｅ）ドメインを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、前記ノブドメイン及びホールドメインは、それぞれＣＨ３部分に位置する。

好ましくは、前記ノブドメインはノブ変異を有し、前記ホールドメインはホール変異を有する。好ましくは、前記ノブ変異はＴ３６６ＷとＳ３５４Ｃであり、前記ホール変異はＹ４０７Ｖ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３６６Ｓであり、さらにヘテロ二量化を促進するためにシステイン変異が付加されている。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ＣＨ１部分及びＣＬ部分を有する。

いくつかの実施形態において、ＣＨ１部分とＣＬ部分は互いに置き換えられる。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、第１の抗原結合部分、ＣＨ１部分、ヒンジ部分、ＣＨ２部分及びＣＨ３領域を含むノブ鎖（ＨＣ１鎖）と、第２の抗原結合部分、ＣＬ部分、ヒンジ部分、ＣＨ２部分及びＣＨ３部分を含むホール鎖（ＨＣ２鎖）とを含む。好ましくは、本発明の二重特異性抗体は、ＶＬ及びＣＬを含むＬＣ１部分と、ＶＬ及びＣＨ１を含むＬＣ２部分とをさらに含む。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のアミノ酸配列を有するＨＣ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列を有するＬＣ１部分と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有するＨＣ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２のアミノ酸配列を有するＬＣ２部分とを含み、ＨＣ１及びＨＣ２は、３つのジスルフィド結合を介してノブ・イン・ホールの形で相互接続され、ＬＣ１及びＬＣ２は、ジスルフィド結合を介してそれぞれＨＣ１及びＨＣ２に取り付けられる。

具体的には、従来報告されているＫｉＨｓ及びＣｒｏｓｓＭａｂ技術を用いてオリジナル野生型ＨＣ及びＬＣ発現ベクターを改良した。簡単に言えば、部位特異的変異導入によりいくつかの変異をＨＣのＣＨ３ドメインに導入して、「ノブ鎖」（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）と「ホール鎖」（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を生成する。ホール鎖のＣＨ１ドメインとＬＣのＣＬドメインとを交換して、それぞれ対をなす交換重鎖（ＣＬ－ホール鎖）と軽鎖（ＣＨ１－ＬＣ）を生成する。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、二重抗原を発現する細胞（ＧＰＣ３⁺ＣＤ４７⁺二重陽性細胞）に対する特異性を大幅に向上させた。

いくつかの実施形態において、抗ＣＤ４７ ｍＡｂと比較して、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＤ４７／ＳＩＲＰα遺伝子で修飾されたマウスにおいて、優れた安全性及び血清半減期の延長が示されている。

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、増強されたＦｃ媒介機能と、二重抗原を発現する腫瘍（例えば、Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞）に対する選択的成長抑制とが示されている。

いくつかの実施形態において、異種移植ＨＣＣモデルにおいて、本発明の二重特異性抗体の性能は、抗ＣＤ４７又は抗ＧＰＣ３ ｍＡｂを用いた単一療法、及び抗ＣＤ４７及び抗ＧＰＣ３ ｍＡｂを用いた併用療法よりも優れている。

本発明において、マクロファージと好中球がイン・ビボで前記二重特異性抗体のＦｃ依存性抗腫瘍活性に関与することを見出した。

第３の態様において、本発明は、第２の態様における二重特異性抗体のＨＣＣの治療のための用途に関する。

本発明の二重特異性抗体は、ＧＰＣ３及びＣＤ４７に結合して、ＨＣＣ腫瘍細胞を特異的に標的とし、魅力的な半減期を示し、薬物動態学及び潜在的な不利作用試験において血液学的毒性を示さない。

本発明の二重特異性抗体の安全性、長半減期及び優先的な抗腫瘍活性は、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を用いた併用療法に比べて顕著な優位性を有意に示した。

本発明は、ＣＤ４７阻害を利用してどうすればＣＤ４７陽性ＨＣＣの治療に追加の細胞貪食促進の抗腫瘍応答を増加できるかを説明した。

本発明において、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいて、好中球は前記二重特異性抗体の抗腫瘍効果に必要であることを見出した。

本発明の二重特異性抗体は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を利用することもでき、他のＴ細胞刺激性免疫チェックポイント阻害剤又は化学療法薬と併用剤として使用する場合、そのＨＣＣ治療効果がさらに最大化する可能性がある。免疫活性（ｉｍｍｕｎｅ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）モデルにおいて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂとＴ細胞免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１又は抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）を一緒に投与してさらに研究し、それらの対応する寄与を理解する必要がある。

単一のモノクローナル抗体に比べて非常に強い抗腫瘍活性を示すことに加えて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂによる治療は、ＧＰＣ３とＣＤ４７標的を独立して認識する２種類の抗体による併用療法よりも優れた抗腫瘍効果を提供する。この観察は、二重特異性抗体を使用して２つの抗原を結合させることが、ある形態の相乗効果によって改善された臨床的価値を提供することをサポートする。要するに、本発明は、二重特異性抗体を開発し、ＨＣＣに対して安全で効率的な抗腫瘍活性を有することを実証した。最終的に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＨＣＣ治療における特定のメカニズムへの理解がますます多くなるにつれて、より多くの一般的な傾向を発見する可能性があり、二重特異性抗体の開発をサポートして先天性免疫応答を増強し、新規な治療方策を採用して癌治療結果をさらに改善することができる。

いくつかの研究では、１つの分子内に２つの異なる抗原結合特異性を組み合わせた、Ｔ細胞連結二重特異性抗体（Ｔ－ＢｓＡｂ）という方策を使用しており、このような抗体は、１つのアームでＴ細胞に連結し、もう１つのアームで腫瘍抗原に連結する。Ｔ細胞免疫応答を利用して悪性細胞に対抗する以外、ますます多くの証拠が、癌治療における免疫系の影響を強調した。例えば、研究はＧＰＣ３陽性ＨＣＣ患者におけるマクロファージ募集が報告されている。がん細胞の貪食は、マクロファージを媒介とする抗腫瘍活性の主なメカニズムである。そのため、マクロファージを利用することは、このようなタイプのＨＣＣに対する抗腫瘍効果を向上させる有望な方策であると推測される。
定義

グリピカン－３（ＧＰＣ３）は、最も十分に特徴付けられたＨＣＣ関連抗原の一つである。それはグリピカンファミリーのメンバーであり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜にアンカーされたヘパラン硫酸プロテオグリカンである。多くの研究により、ＧＰＣ３は、ＨＣＣにおいて特異的にアップレギュレートされ、正常（ひいては肝硬変）な肝組織において極めて低く発現し又は発現しないことが実証され、抗体療法に用いられる優れた腫瘍特異的標的となる。しかしながら、ヒト化抗ＧＰＣ３抗体（例えばＧＣ３３）は、単一療法として第ＩＩ相臨床試験において臨床的な利益をもたらすものではなく、これは、最適な標準未満の投与及び／又は不利な免疫環境に起因する可能性がある。

ＣＤ４７は抑制性先天免疫チェックポイントである。それは、骨髄系細胞（特にマクロファージ）上の受容体Ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α（ＳＩＲＰα）と相互作用して「僕を食べないで」というシグナルを発し、癌細胞が免疫監視を避けることができるようにする。したがって、ＣＤ４７を標的とする抗体によってＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断することは、癌細胞の貪食除去を増強する望ましい方策が示されている。ＨＣＣを含む多くの固形腫瘍において、ＣＤ４７の発現アップレギュレーションが存在し、抗ＣＤ４７抗体はＨＣＣ腫瘍の成長を抑制することができる。しかしながら、現在臨床開発されているＣＤ４７標的抗体は迅速に除去され、血液毒性を引き起こし、これは主にＣＤ４７が正常細胞、特に赤血球で発現するためである。

本明細書で使用される具体的な数がない指示対象は、１つ以上（例えば、少なくとも１つ）の指示対象物を意味する。

用語「又は」は、文脈が明確に指示しない限り、本明細書において用語「及び／又は」を意味し、「及び／又は」と交換して使用することができる。

「約」及び「凡そ」は、通常、計測の性質又は精度を考慮して、計測された量の許容される誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所定値又は値の範囲の２０％以内、通常１０％以内、より通常５％以内である。

本明細書で開示される製品及び方法は、指定された配列又はそれと同一又は類似の配列、例えば、指定された配列と少なくとも約８５％又は９５％の配列同一性を有する配列を有するポリペプチド及びポリヌクレオチドを包含する。アミノ酸配列の場合、用語「８５％又は９５％の配列同一性」は、本明細書において、第１のアミノ酸が十分又は極めて少ない数のアミノ酸残基を含み、前記アミノ酸残基が第２のアミノ酸配列において整列されたアミノ酸残基とは、ｉ）同じであり、又はｉｉ）保存的置換であることにより、前記第１及び第２のアミノ酸配列が共通のドメイン及び／又は共通の機能活性を有することができることを意味する。例えば、参照配列（例えば、本明細書で提供される配列）と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、共通ドメインを含むアミノ酸配列である。

ヌクレオチド配列の場合、用語「８５％又は９５％配列同一性」は、本明細書において、第１の核酸配列が十分又は極めて少ない数のヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチドが第２の核酸配列において整列されたヌクレオチドとは同じであることにより、前記第１及び第２のヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、共通の構造性ポリペプチドドメイン又は共通の機能性ポリペプチド活性をコードすることを意味する。例えば、参照配列（例えば、本明細書で提供される配列）と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列である。

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性を特定するために、配列を最適な比較の目的で整列させる（例えば、第１及び第２アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に最適な比較のために空孔を導入することができ、比較の目的で非相同配列を無視することができる）。好ましい実施形態では、比較のために整列された参照配列の長さは、前記参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、５０％、６０％であり、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置と第二の配列における対応する位置が同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、前記分子は当該位置において同一である。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを意味する。

用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用される。

本明細書で使用される用語「抗体又は抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖又はその断片を意味する。用語「抗体分子」は、例えば、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）を含む。一実施形態では、抗体分子は、全長抗体又は全長免疫グロブリン鎖を含む。一実施形態では、抗体分子は、全長抗体又は全長免疫グロブリン鎖の抗原結合又は機能性断片を含む。本明細書で使用される場合、抗体分子は抗原に「結合」し、このような結合は当業者に理解される。一実施形態では、抗体は、約１×１０^-5Ｍ以下、１×１０^-6Ｍ以下、又は１×１０^-7Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で抗原に結合する。

例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略記する）及び軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＬと略記する）を含むことができる。一実施形態では、抗体分子は、重鎖及び軽鎖を含むか、又はそれらによって構成される。別の例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列及び２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それにより、２つの抗原結合部位、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、二重抗体（Ｄａｂ）（二価かつ二重特異性）及びキメラ（例えばヒト化）抗体を形成し、それらは、完全な抗体の修飾によって産生され得るか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して最初から合成され得る。これらの機能性抗体断片は、それらに対応する抗原又は受容体に選択的に結合する能力を保持する。抗体及び抗体断片は、任意の抗体クラスに由来してもよく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含むがそれらに限定されず、また任意の抗体サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に由来してもよい。抗体分子の製剤は、モノクローナル又はポリクローナルのものであってもよい。抗体分子は、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植又はイン・ビトロで生成された抗体であってもよい。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有してもよい。抗体は、例えばκ又はλから選択される軽鎖を有してもよい。本明細書では、用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、用語「抗体」と交換可能に使用される。

本明細書で使用される用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、抗体の一部であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどである。抗体断片は、完全抗体が認識する同一の抗原に結合する。用語「抗体断片」は、アプタマー、鏡像体（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）及び二重抗体を含む。用語「抗体断片」は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体と同様に機能する、任意の合成された又は遺伝子工学によって改変されたタンパク質も含む。

抗体分子の抗原結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＫ及びＣＨ部分によって構成される一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）₂断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ部分によって構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体単一アームのＶＬ及びＶＨ部分によって構成されるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ部分によって構成される二重抗体（ｄＡｂ）断片、（ｖｉ）ラクダ又はラクダ化可変部分、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）単一部分の抗体、を含む。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を含む任意の適切な方法を使用して取得することができ、完全な抗体と同様の方法で実用的にスクリーニングすることができる。用語「抗体断片」は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体と同様に機能する、任意の合成された又は遺伝子工学によって改変されたタンパク質も含む。

「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質を意味する。幾つかの場合、前記領域は、１０から約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで連結されている。前記リンカーは、柔軟性を得るためにグリシンを豊富に含み、可溶性を得るためにセリン又はトレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを連結又は正反対にすることができる。定常領域を除去してリンカーを導入したが、このようなタンパク質はオリジナル免疫グロブリンの特異性を保持した。ＳｃＦｖ分子は当分野において既知である。

軽鎖及び重鎖は、「定常」領域と「可変」領域に分けられる。軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）の両方の可変ドメインは抗原認識と特異性を決定する。軽鎖定常ドメイン（ＣＫ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を提供する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３及びＣＫ部分は実際にはそれぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。

可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識して特異的に結合することを可能にする。抗体のＶＬ部分とＶＨ部分、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わせて可変領域を形成し、３次元抗原結合部位を限定する。このような４級抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＫ鎖のそれぞれにおける３つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）によって定義される。

本明細書で使用される用語「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、抗体可変領域において抗原特異性及び結合親和性を提供するアミノ酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）が存在し、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）が存在する。

所定のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Kabatら、(1991)、「免疫学的に重要なタンパク質の配列」（Sequences of Proteins of Immunological Interest）、第５版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD）に記載のスキーム（「Kabat」番号スキーム）を含む、任意の公知のスキームを使用して特定することができる。

各ＶＨ及びＶＬは、通常、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含み、それらは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に、アミノ末端からカルボキシ末端まで配列されている。

「被験者」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」は、診断、予後又は治療を必要とする任意の被験者、特に哺乳動物被験者を意味する。哺乳動物被験者は、ヒト、家畜、農場動物及び動物園、スポーツ又はペット動物、例えば犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛、乳牛等を含む。

本明細書で使用される「治療を必要とする患者」又は「治療を必要とする被験者」という語句は、例えば検出、診断手続き及び／又は治療のために用いられる本開示の抗体又は組成物の投与から利益を得る被験者、例えば哺乳動物被験者を含む。

本明細書で使用される用語「エピトープ」は、抗体分子と特異的に相互作用する抗原（例えば、ヒトＧＰＣ３（ｈＧＣＰ３）及びヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７））の部分を意味する。このような基（本明細書においてエピトープ決定基とも呼ばれる）は、通常、アミノ酸側鎖又は糖側鎖のような要素又は前記要素の一部を含む。エピトープ決定基は、本分野において既知又は本明細書に開示された方法、例えば、結晶学により、又は水素－重水素交換により特定することができる。抗体分子における少なくとも１つ又は幾つかの、エピトープ決定基と特異的に相互作用する部分は、通常、ＣＤＲに位置する。通常、エピトープは特定の３次元構造特徴を有する。通常、エピトープは特定の電荷特徴を有する。幾つかのエピトープは線形型エピトープであり、他のエピトープはコンフォメーション型エピトープである。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子からなる抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、又はハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、ライブラリー選択及びスクリーニング又は組換え方法）によって調製することができる。

前記抗体分子はポリクローナル又はモノクローナル抗体であってもよい。他の実施形態において、抗体は、例えば、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、又は組み合わせ方法によって組換え産生することができる。

１つの実施形態において、前記抗体は、完全ヒト抗体（例えば、酵母ディスプレイによって産生された抗体、ファージディスプレイによって産生された抗体又はマウスにおいて製造された抗体であり、それらは遺伝子工学によって改変されてヒト免疫グロブリン配列由来の抗体を産生する）、又は非ヒト抗体、例えば、ネズミ科（マウス又はラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）又はラクダ抗体である。げっ歯類動物抗体を産生する方法は、当分野で既知である。

ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。関心抗原で免疫したこれらのトランスジェニックマウスに由来する脾臓細胞を、ヒトタンパク質由来のエピトープに対して特定の親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマの産生に用いた。

抗体は、可変領域又はその一部（たとえばＣＤＲ）が非ヒト生体、たとえばラット又はマウスにおいて産生される抗体であり得る。キメラ、ＣＤＲ移植及びヒト化抗体は、本発明の範囲内にある。非ヒト生体（例えば、ラット又はマウス）において産生され、次いで（例えば、可変フレームワーク領域又は定常領域において）改変されてヒトにおける抗原性を低下させる抗体もまた、本発明の範囲内である。

本発明の範囲には、特定のアミノ酸を置換、欠失又は付加したヒト化抗体も含まれる。ドナーからアミノ酸を選択する基準は、ＵＳ５５８５０８９に記載され、たとえばＵＳ５５８５０８９の第１２－第１６欄に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体のヒト化のための他の技術は、ＰａｄｌａｎらのＥＰ５１９５９６Ａ１（１９９２年１２月２３日公開）に記載されている。

他の実施形態では、前記抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥの重鎖定常領域から選択された重鎖定常領域、特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４（例えばヒト）の重鎖定常領域から選択された重鎖定常領域を有する。

抗体定常領域を改変する方法は、当分野において既知である。抗体の定常部分における少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基に置換することにより、機能が変化した抗体を産生することができ、例えば、エフェクターリガンド（例えば、細胞上のＦｃＲ又は補体のＣＩ成分）に対して改変された親和性を有する（例えば、ＥＰ３８８１５１Ａｌ、米国特許番号５６２４８２１及び米国特許番号５６４８２６０を参照されたい。全ての前記特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる）。抗体構造を安定化させるアミノ酸変異、例えばヒトＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ（Ｅｕ番号）も想定された。

本発明の分子は、それらの機能に実質的な影響を与えない追加の保存的又は非必須のアミノ酸置換を有し得ることを理解されたい。

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換された置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。保存的アミノ酸置換は以下のとおりである。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により得られたＢＣ７及びＢＣ１８抗体とｈＣＤ４７との結合動力学を示す。 ＳＰＲ分析により得られたＢＣ１８、ＡＢ６．１２、Ｈｕ５Ｆ９抗体とｈＣＤ４７との結合動力学を示す。 ＥＬＩＳＡによって得られた抗ｈＣＤ４７抗体のＣＤ４７への結合及びＳＩＲＰαとの競合能力の比較を示す。 ＦＡＣＳ分析により得られた抗ｈＣＤ４７抗体の比較を示す。 ＢＣ１８及びＢＣ７の細胞表面ＣＤ４７との結合を示す。 ＢＣ１８及びＢＣ７がＨＬ－６０を誘導して有効なマクロファージ媒介貪食を行うことを示す。 免疫不全マウスで構築されたヒトリンパ腫モデルにおいて、ＢＣ１８が強い抗腫瘍作用を発揮することを示す。 免疫不全マウスで構築されたヒト乳癌モデルにおいて、ＢＣ１８が強い抗腫瘍作用を発揮することを示す。 ＳＰＲ分析により得られたＢＣ１８、ＢＣ７及びそれらの変異体の結合動力学を示す。 構築されたＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの概略構成を示す。 抗体の構築及び精製抗体の親和性及び純度の特徴付けを示す。 ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが二重抗原を発現する細胞に対して大幅に向上した特異性を有することを示す。 ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが優れた安全性を有することを示す。 ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰヒト化マウスにおいて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療後に血液毒性が観察されなかったことを示す。 ＣＤ４７ノックアウトのＪｕｒｋａｔに基づくエフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６Ａ－ＣＤ４７^KO）及びＨｅｐ３Ｂ細胞（Ｈｅｐ３Ｂ－ＣＤ４７^KO）の産生を示す。 二重抗原を発現する腫瘍に対して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが増強されたＦｃ媒介の機能と選択的成長抑制を発揮することを示す。 異種移植ＨＣＣモデルにおいて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの性能が単一療法及び抗ＣＤ４７と抗ＧＰＣ３ ｍＡｂとの併用療法よりも優れることを示す。 ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂによるＨｅｐ３Ｂ異種移植マウスの総生存率の中央値の向上を示す。 イン・ビボで、マクロファージ及び好中球がＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＦｃ依存性抗腫瘍活性に関与することを示す。 ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ Ｆｃ変異体（ＧＰＣ３／ＣＤ４７－ＤＡＮＧ）の産生を示す。 免疫細胞の枯渇効果及び腫瘍浸潤マクロファージの分析を示す。

提供された特定の実施形態及び実施例の記載は、解釈的であって、制限的ではない。当業者であれば、様々なノンクリティカルなパラメータを変更又は修正することができるが、基本的に同様の結果が得られることを容易に認識するであろう。

実施例

実施例１．改良されたファージディスプレイ抗体技術に基づき、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに対するヒトモノクローナル抗体を産生する。

抗原精製
ヒトＰＢＭＣのｃＤＮＡからヒトＣＤ４７の細胞外ドメイン（ＣＤ４７－ＥＣＤ）の１～１１８番目の残基をコードする遺伝子断片を得た後、それを精製用Ｈｉｓ６タグ及びビオチン化用Ａｖｉタグを含む発現ベクターにサブクローニングした。ＣＤ４７発現プラスミドとビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）発現プラスミドを１：１の比率で２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションすることにより、Ｃ末端にビオチン修飾を有するＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ６（ＣＤ４７－Ｂｉｏ）を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ寒天（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞培養上清からＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ６を精製した。

ファージディスプレイ抗体ライブラリー
９３名の健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から、ヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリーを構築した。前記ライブラリーのサイズは、合計１．１×１０¹⁰のメンバーである。

ファージ抗体ライブラリーの選択及びスクリーニング
前記ライブラリーから、表面にｓｃＦｖを発現するファージ粒子（ファージ－Ａｂ）を調製し、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに対する抗体の選択に用いた。ＣＤ４７－Ｂｉｏをストレプトアビジン結合磁性Ｍ－２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に捕捉した後、前記ライブラリーから調製されたファージ粒子とインキュベートした。選択を２ラウンド行った。１ラウンドの選択につき、高親和性抗体を得るために、磁気ビーズに捕捉されたＣＤ４７－Ｂｉｏの量を最適化し、大量の洗浄工程を適用した。結合したファージ－Ａｂを塩基性トリエタノールアミン溶液で溶出した。その後、合計９５個のモノクローナルを選別し、救済してファージ－Ａｂを産生し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりＣＤ４７－Ｂｉｏと特異的に結合するモノクローナルをスクリーニングした。ＣＤ４７－Ｂｉｏと４５０ｎｍに結合する光学濃度値＞０．２のクローンを陽性とし、陰性クローンは＜０．１の値を与えた。陽性クローンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域の遺伝子に対してシーケンシングを行った後、それらの対応するアミノ酸配列を比較して、重複したクローンを除去し、異なる配列を有する独特の抗体を同定してさらに特徴付ける。最後に５種類の抗体を同定し、それらをＢＣ２、ＢＣ７、ＢＣ１２、ＢＣ１５、ＢＣ１８と命名した。

ＳＩＲＰα－ｄ１の精製
ヒトＰＢＭＣのｃＤＮＡから、ヒトＳＩＲＰ第１ドメイン（ＳＩＲＰα－ｄ１）の１～１４８番目の残基をコードする遺伝子断片を増幅する。ＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃ融合タンパク質を発現するために、ＳＩＲＰα－ｄ１遺伝子を発現ベクターに含まれるマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ断片のＮ末端にサブクローニングした。発現ベクターで２９３Ｆ又は２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションすることにより前記タンパク質を発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。スルホ－ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてビオチン化ＳＩＲＰα－ｄ１タンパク質を調製した。

ＥＬＩＳＡ又は中和アッセイに用いる精製ファージ－ｓｃＦｖの調製
ＰＥＧ／ＮａＣｌにより１０～３０ｍＬの細菌培養上清中のファージ－ｓｃＦｖを沈殿させた後、分光光度計により定量した。同じ濃度に規格化された連続希釈ファージ－Ａｂの用量応答に基づいて、異なるファージ－ｓｃＦｖの抗原結合又はＳＩＲＰα競合アッセイの活性を評価した。

ｓｃＦｖ－ｈＦｃミニボディの調製
ファージ－ｓｃＦｖ発現ベクターからのｓｃＦｖコード遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、ここで、発現ベクターはｓｃＦｖのＣ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片を含む。ｓｃＦｖ－ｈＦｃを産生するために、ｓｃＦｖ－ｈＦｃ発現プラスミドを用いて２９３Ｆ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を一過性トランスフェクションし、トランスフェクション後５日後、細胞培養上清を収集し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（プロテイン A-セファロースＣＬ－４Ｂ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりｓｃＦｖ－ｈＦｃを精製した。

全長ＩｇＧ１抗体の調製
ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬコード配列を抗体の重鎖（ＨＣ）発現ベクター及び軽鎖（ＬＣ）発現ベクターに独立にサブクローニングした。ＩｇＧ１抗体を調製するために、２種の発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）を用いて、１：１の割合で２９３Ｆ又は２９３Ｔ細胞に一過性コトランスフェクションした。トランスフェクションの５日後、細胞培養上清を収集し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧ１を精製した。

ＥＬＩＳＡアッセイ
ＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡ：２μｇ／ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた中性アビジン（Ｓｉｇｍａ）をＵ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ^TM）にコートし、各ウェル１００μＬ、４℃で一晩又は３７℃で１時間置いた。その後、２μｇ／ｍＬの２％無脂乳を含むＰＢＳに溶解したｂｉｏ－ＣＤ４７を１ウェルあたり１００μＬの量で、３０℃で１時間インキュベートすることによりプレート上に捕捉した。ファージ－ｓｃＦｖに基づくＥＬＩＳＡでは、２％無脂乳を含むＰＢＳに溶解した連続希釈ファージ－ｓｃＦｖを１ウェルあたり１００μＬの量添加した。ＨＲＰ結合マウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、３０℃で３０ｍｉｎインキュベートすることにより、特異的に結合したファージ－ｓｃＦｖを検出した。各インキュベーションステップの間に、ＥＬＩＳＡプレートを１ウェルあたり２００μＬのＰＢＳＴ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で６回洗浄した。ＨＲＰ結合抗体でインキュベートした後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）と３０℃で５～１０ｍｉｎインキュベートすることによりＥＬＩＳＡシグナルを発生させ、その後、１ウェルあたり５０μＬの２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄で反応を停止した。４５０ｎｍにおける吸光値をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）により読み取った。ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＩｇＧ１に基づくＥＬＩＳＡについて、方法は、結合した抗体がＨＲＰ結合マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）によって検出されることを除いて、上記のファージ－ｓｃＦｖの説明と基本的に同じである。

ＳＩＲＰ競合ＥＬＩＳＡ：２μｇ／ｍＬのＣＤ４７－ＥＣＤ－Ｈｉｓ₆を１ウェルあたり１００μＬの量でＵ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ）にコートし、４℃で一晩又は３７℃で１時間置いた。０．８ｎＭ又は０．５ｎＭ ｂｉｏ－ＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃと、異なる濃度の試験抗体又はＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃとを、２％の脱脂乳を含むＰＢＳに混合し、その後、１ウェルあたり１００μＬの量で、３０℃で１時間インキュベートしてプレート上に捕捉した。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３０℃で３０ｍｉｎインキュベートすることにより、特異的に結合したｂｉｏ－ＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃを検出した。洗浄、発色及び読み取り工程はｈＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡと同じである。データ分析では、ＯＤ４５０値を阻害％に変換した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
表面プラズモン共鳴測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＢＤ）又はＢｉａｃｏｒｅ Ｘ２００（ＢＤ）において行われた。抗ＣＤ４７抗体を固定化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＣＭ５バイオセンサチップに捕捉し、該チップは標準的な１級アミンカップリングを用いて生成される。いずれの測定も、ｐＨ７．４、又はｐＨ６．８、又はｐＨ６．０のＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中、２５℃で行い、塩化マグネシウムを用いて表面再生を行った。各フローセルにＣＤ４７の連続希釈液を３０μｌ／ｍｉｎの流速で注入した。いずれのデータもＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトを用い、１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて分析した。

ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ２００上で行われる。１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７ｓｃＦｖ－ｈＦｃを１０μｌ／ｍｉｎの流速でＣＭ５チップに３０ｓ捕捉した。２倍連続希釈したＣＤ４７（３２ｎｍｏｌで開始、合計５個の濃度）を、３０μｌ／ｍｉｎの流速で抗体が結合した表面に１ｍｉｎ注入し、その後、１ｍｉｎの解離段階であった。サイクル毎に表面を塩化マグネシウムで再生した。

ＣＨＯ－４７安定細胞株の産生
ヒトＰＢＭＣの全ｃＤＮＡからヒトＣＤ４７（型２、アミノ酸３０５個）のｃＤＮＡをクローニングし、ｎｅｏ耐性配列を含む発現プラスミドに導入した。ｈＣＤ４７発現プラスミドでトランスフェクションした後、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で選択することにより、ヒトＣＤ４７が安定にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－４７）を取得し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）でフローサイトメトリーにより同等の表面発現まで選別した。

フローサイトメトリーアッセイ
ＣＤ４７結合試験では、ＣＨＯ－４７、又はｈＣＤ４７を発現する他の細胞株と、連続希釈した抗ＣＤ４７抗体とを４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞とＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）とを４℃で０．５時間インキュベートした。ＳＩＲＰα競合ＦＡＣＳの場合、１０ｎＭのｂｉｏ－ＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃを異なる濃度のテスト抗体と混合し、ＣＨＯ－４７又は他のＣＤ４７陽性細胞とを４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞とＦＩＴＣ標識抗ストレプトアビジン特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）とを４℃で０．５時間インキュベートした。非特異的ＦＡＣＳ結合の場合、ｈＣＤ４７を発現しない細胞（例えばＣＨＯ）を高濃度（例えば５００ｎＭ）のテスト抗体とインキュベートした。ＣＤ４７結合試験と同様に、その後細胞をＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。インキュベーション後、細胞を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で３回洗浄した。その後、細胞を４００μＬのＢＳＡを含まないＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）上でフローサイトメトリーにより細胞に結合した抗体を検出した。

上記ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ分析により、２種類の良好な抗体ＢＣ１８とＢＣ７を同定した。ＳＰＲアッセイにおいて、ＢＣ１８は最も良い動力学性能を示し、そのうち、ＫＤ値は１．４３ｎＭであり、それに次いでＢＣ７は、３．２７ｎＭのＫＤ値を有する（図１及び表２）。そこで、さらに同定するためにＢＣ１８とＢＣ７を選択する。

イン・ビトロでのＢＣ１８及びＢＣ７の更なる特徴付け
ＢＣ１８及びＢＣ７と他の開示された治療性ＣＤ４７ ｍＡｂとの比較
次に、ＢＣ１８及びＢＣ７を全長ヒトＩｇＧ１形式に変換した。次いで、ＳＰＲアッセイ（図２）、ＥＬＩＳＡ（図３）及びＦＡＣＳ（図４）により、ＣＤ４７結合親和性及びＳＩＲＰα競合能をＢ６Ｈ１２、ＡＢ６．１２、Ｈｕ５Ｆ９と比較した。Ｂ６Ｈ１２は、ブロードスペクトル腫瘍治療効果を示す公開されたＣＤ４７抗体である。ＡＢ６．１２及びＨｕ５Ｆ９は、第Ｉ相臨床試験中の２種類の抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（ＷＯ２０１１／１４３６２４Ａ２、ＵＳ２０１３／０２２４１８８Ａ１）である。ＢＣ１８は、ＡＢ６．１２、Ｈｕ５Ｆ９とは異なる動力学性能を示し、匹敵するＫＤ値を有する。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＢＣ１８及びＢＣ７の両方は、Ｂ６Ｈ１２よりも強いＣＤ４７結合及びＳＩＲＰα競合活性を示した（図３Ａ及び図３Ｃ）。ＢＣ１８は、ＣＤ４７結合及びＳＩＲＰα競合活性の両方において、ＡＢ６．１２より優れ、且つＨｕ５Ｆ９に近い（図３Ｂ及び図３Ｄ）。細胞表面レベルにおいて、ＢＣ１８は、ＡＢ６．１２及びＨｕ５Ｆ９と匹敵するＣＤ４７結合及びＳＩＲＰα競合活性を示した（図４）。

図２では、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００上でＳＰＲを行った。１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７の全長ＩｇＧ１抗体を１０μｌ／ｍｉｎの流速でＣＭ５チップに３０ｓ捕捉した。２倍連続希釈したＣＤ４７（１００ｎｍｏｌで開始、合計７個の濃度）を、３０μｌ／ｍｉｎの流速で、抗体が結合した表面に１２０ｓを注入し、その後、２４０ｓの解離段階であった。サイクル毎に表面を塩化マグネシウムで再生した。

図３はＥＬＩＳＡによって得られた抗ｈＣＤ４７抗体のＣＤ４７結合及びＳＩＲＰα競合能力の比較を示す。図３において、Ａ．全長ＩｇＧ１形式の抗体は、３倍連続希釈した（１０ｎＭで開始、合計１２個の濃度）。Ｂ．全長ＩｇＧ１形式の抗体を３倍連続希釈した（４０ｎＭで開始、合計１２個の濃度）。Ｃ－Ｄ．ＳＩＲＰα競合ＥＬＩＳＡ。Ｃ．０．８ｎＭのビオチン化されたＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃを、テストされた２倍連続希釈した濃度（４０ｎｍｏｌで開始、合計８個の濃度）の全長ＩｇＧ１又はＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃと混合した。Ｄ．０．５ｎＭのビオチン化されたＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃをテストされた３倍連続希釈した濃度（２００ｎｍｏｌで開始、合計１２個の濃度）の全長ＩｇＧ又はＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃと混合した。

図４はＦＡＣＳ分析により得られた抗ｈＣＤ４７抗体の比較を示す。図４において、Ａ．ＣＤ４７はＦＡＣＳに結合されている。全長ＩｇＧ１形式の抗体を３倍連続希釈した（４０ｎｍｏｌで開始、合計８個の濃度）。Ｂ．ＳＩＲＰα競合ＦＡＣＳである。１００ｎＭのビオチン化されたＳＩＲＰα－ｄ１－ｍＦｃを、テストされた３倍連続希釈した濃度（４０ｎｍｏｌで開始、合計８個の濃度）の全長ＩｇＧと混合した。ＳＡ－ＦＩＴＣはＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを表す。

ＢＣ１８及びＢＣ７と、腫瘍細胞で発現するＣＤ４７との結合
この実験では、ヒトＣＤ４７を発現する２種類のヒト細胞株であるＲａｊｉ及びＨＥＫ－２９３を使用した。ＲａｊｉはヒトＢリンパ芽球細胞株であり、ＨＥＫ－２９３Ｔはヒト胚腎細胞株である。ＢＣ１８の結合はＦＩＴＣ抗ヒトＦｃ抗体を用いて検出し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩにより分析した（図５）。０．０６ｎＭの低抗体濃度でも、ＢＣ１８及びＢＣ７は、Ｒａｊｉ及びＨＥＫ－２９３細胞表面上のｈＣＤ４７に結合することができる。ＢＣ１８と細胞表面ｈＣＤ４７との結合親和性はＢＣ７よりやや強い。

図５には、ＢＣ１８及びＢＣ７が細胞表面ＣＤ４７に結合可能であることが示されている。Ｒａｊｉ（Ａ）又は２９３Ｔ（Ｂ）細胞を、５倍連続希釈した（２００ｎｍｏｌで開始、合計８個の濃度）全長ＩｇＧ１形式の抗体とインキュベートした。ＦＩＴＣ結合抗ｈＦｃ抗体とインキュベートした後、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩにより細胞を分析した。

イン・ビトロ貪食アッセイ
その後、ＢＣ１８及びＢＣ７でＣＤ４７／ＳＩＲＰαの相互作用を遮断して標的細胞を貪食できるかどうかを調査した。標的細胞としてＨＬ－６０細胞株を用い、それをＣＦＳＥで標識した。ヒト末梢血由来マクロファージを用いて貪食活性を測定し、蛍光顕微鏡を用いて取り込まれた細胞数をカウントした。ＢＣ１８及びＢＣ７の両方は、ＨＬ－６０細胞の有効な貪食を誘導し、ｈＳＩＲＰａ－ｈＦｃ及びｍＢ６Ｈ１２よりも優れた作用を示した（図６）。

イン・ビトロ貪食アッセイ
ヒトマクロファージは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来する。ヒトＢリンパ芽球（Ｒａｊｉ）、ＨＬ－６０又はＪｕｒｋａｔを標的細胞として選択した。標的細胞を５μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ｈＦｃを有する抗ＣＤ４７抗体を、ＣＦＳＥ＋Ｒａｊｉ細胞に１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。２ｈインキュベートした後、オプソニン化した標的細胞とＲＰＭＩ培地１６４０に保持されたマクロファージを３７℃で共培養した。共焦点顕微鏡により各サンプルの３つの異なる点の写真を撮影し、少なくとも２００個のマクロファージをカウントし、１００個のマクロファージが標的細胞をどの程度貪食したかを計算した。

図６は、ＢＣ１８及びＢＣ７が誘導したマクロファージを媒介とするＨＬ－６０の有効な貪食を示す。図６では、ＨＬ－６０をＣＦＳＥで標識し、１０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＦｃ形式のＢＣ１８、ＢＣ７、ｈＳＩＲＰα－ｈＦｃ、ｍＢ６Ｈ１２の存在下でヒト末梢血由来のマクロファージと共にインキュベートした。陰性対照としてＰＢＳを用いた。２時間後、正副二通に共焦点顕微鏡によりマクロファージを撮像し、貪食指数（マクロファージ１００個あたりに取り込まれた標的細胞の数）を特定した。線は平均値を示す。

ＢＣ１８は、ヒトリンパ腫又は乳癌を軽減し、ひいては治癒することができる。
次に、ＢＣ１８がイン・ビボでヒトがん細胞を除去する能力を調べた。リンパ腫細胞株ＲａｊｉをＮＯＤ－ＳＣＩＤ（図７Ａ）又はＮＳＧ（図７Ｂ）マウスの右脇腹に皮下注射により移植した。ビヒクル（ＰＢＳ）、ＢＣ１８、又はｈＢ６Ｈ１２、ｈＳＩＲＰα－ｈＦｃとともに、１０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間に１回腹腔内投与し、合計６回であった。実験中の腫瘍サイズの分析により、ＢＣ１８で治療したマウスにおいて、腫瘍負荷が顕著に低下し、生存率が向上した。同時に、ＮＯＤ－ＳＣＩＤグループでは、ＢＣ１８は、ｈＢ６Ｈ１２及びｈＳＩＲＰαよりも有効である。さらに、乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を用いて、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ（図８Ａ）又はＮＳＧ（図８Ｂ）マウスの乳腺脂肪パッドに皮下注射により移植した。知覚可能な腫瘍が形成されると、これらのマウスもＰＢＳ、ＢＣ１８、又はｈＢ６Ｈ１２、ｈＳＩＲＰα－ｈＦｃとともに１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週２回投与し、合計３週間投与した。ＢＣ１８もＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する治療効果を示した。

図７は、ＢＣ１８が免疫不全マウスにおいてヒトリンパ腫の腫瘍サイズを有意に低減できることを示す。１×１０⁶個のＲａｊｉ細胞をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（Ａ）又はＮＳＧマウス（Ｂ）の右下脇腹に皮下移植した。左側の図は腫瘍体積である。右側の図は生存曲線である。腫瘍サイズを測定し、楕円球の式（π／６×長さ×幅²）により体積を算出した。使用された抗体は、全長ＩｇＧ１の形態を採用した。曲線は、各グループの平均値を示している。黒矢印は、１回の注射又は治療の開始及び終了を示す。各マウスに６回注射した。

図８は、ＢＣ１８が免疫不全マウスにおいてヒト乳がんの腫瘍サイズを有意に低減できることを示す。１×１０⁶個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（Ａ）又はＮＳＧマウス（Ｂ）の乳腺脂肪パッドに皮下移植した。Ａ．左側の図は腫瘍体積である。右側の図は生存曲線である。Ｂ．左側の図は腫瘍体積曲線である。右側の図は接種後の５４日目にイン・ビトロで測定した腫瘍体積である。腫瘍サイズを測定し、楕円球の式（π／６×長さ×幅²）により体積を算出した。使用された抗体は、全長ＩｇＧ１の形態を採用した。曲線は、各グループの平均値を示している。黒矢印は、１回の注射又は治療の開始及び終了を示す。各マウスに６回注射した。

ＢＣ１８及びＢＣ７のさらなる修飾
ＢＣ１８とＢＣ７の配列は非常に類似している。免疫原性を低下させ、安定性を向上させるために、ＢＣ１８及びＢＣ７をそれらの生殖系列配列（ＩＧＫＶ１－１２．０１、ＩＧＫＶ１Ｄ－１６．０１、ＩＧＨＶ４－５９．０８）に従ってＢＣ７ｍ０３、ＢＣ７ｍ０４、ＢＣ１８ｍ０３に変異させた。それらの変異体は、ＢＣ１８と類似し且つＢＣ７よりも優れた動力学性能を有する（図９）。同時に、それらの熱安定性が向上した（表２）。また、ヒトＣＤ４７を発現しないＣＨＯ、Ｈｅｐａ１－６、Ｂ１６Ｆ１０、ＢＨＫ－２１、ＣＴ２６細胞株については、ＢＣ１８、ＢＣ１８ｍ０３、ＢＣ７ｍ０３及びＢＣ７ｍ０４は、５００ｎＭの高い抗体濃度でも結合活性を示さなかった。

図９は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により得られたＢＣ１８、ＢＣ７及びそれらの変異体の結合動力学を示す。ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００上で行われた。１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７全長ＩｇＧ１抗体を、１０μｌ／ｍｉｎの流速でＣＭ５チップに３０ｓ捕捉した。２倍連続希釈したＣＤ４７（１００ｎｍｏｌで開始、合計７個の濃度）を、３０μｌ／ｍｉｎの流速で、抗体が結合した表面に１２０ｓを注入し、その後、２４０ｓの解離段階であった。サイクル毎に表面を塩化マグネシウムで再生した。

熱安定性アッセイ
Protein Thermal Shift Dye Kit（Thermo Fisher）により、ユーザガイドに従って抗体の熱安定性を測定した。簡単に言えば、１２．５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬの抗体又はＰＢＳと、５μＬのProtein Thermal Shift緩衝液と、２．５μＬの希釈されたProtein Thermal Shift Dyeとを混合し、氷上で予冷した反応プレートに添加した。その後、プレートを7500 Fast Real-Time PCR Systemにロードし、融解曲線実験を行った。Ｔｍ値はProtein Thermal Shiftソフトにより分析した。

表２ Protein Thermal Shift Dye Kitにより測定したＢＣ７、ＢＣ１８及びそれらの変異体のＴｍＤ値

実施例２ 二重特異性抗体

材料及び方法
細胞株
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞は、製造元の仕様書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って培養した。Ｒａｊｉ細胞は、中国科学院典型培養物寄託センターの細胞ライブラリーに由来する。Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞株（ヒトＧＰＣ３を発現）は、エレクトロポレーション及びその後のＧ４１８選択及び単一細胞クローン分離によって産生された。ヒトＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３Ｂは、魯鳳民博士（中国北京、北京大学医学部）によって寄付されたものである。Ｈｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３細胞株は、先に述べたように構築した。ＣＤ４７遺伝子ノックアウト細胞株Ｈｅｐ３Ｂ－ＣＤ４７^KO及びＪｕｒｋａｔ－ＣＤ１６Ａ－ＣＤ４７^KOは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いて産生された。Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H及びＪｕｒｋａｔ－ＣＤ１６Ａ－ＣＤ４７^KO細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３及びＨｅｐ３Ｂ－ＣＤ４７^KO細胞は、１０％ＦＢＳを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。

二重特異性抗体構築
ＧＣ３３の可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子配列はＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成された。抗ヒトＣＤ４７抗体ＢＣ１８は、我々のヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変ドメイン断片）ファージディスプレイ抗体ライブラリーから選ばれた。そして、そのＶＨとＶＬの遺伝子をシーケンシングした。ＧＣ３３及びＢＣ１８のＶＨ及びＶＬのコード配列をそれぞれヒトＩｇＧ１重鎖（ＨＣ）発現ベクター及び軽鎖（ＬＣ）発現ベクターにサブクローニングした。

二重特異性抗体を構築するために、従来報告されているＫｉＨ及びＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用してオリジナル野生型ＨＣ及びＬＣ発現ベクター（ブランク）を修飾した。簡単に言えば、部位特異的変異導入によっていくつかの変異をＨＣのＣＨ３ドメインに導入し、「ノブ鎖」（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）と「ホール鎖」（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を産生した。ホール鎖のＣＨ１ドメインとＬＣのＣＬドメインとを交換して、それぞれ対を成す交換重鎖（ＣＬ－ホール鎖）と軽鎖（ＣＨ１－ＬＣ）を産生した。その後、必要に応じてＧＣ３３、ＢＣ１８及び対照抗体のＶＨ及びＶＬ断片をノブ鎖、ＣＬ－ホール鎖又はＣＨ１－ＬＣ発現ベクターにクローニングした。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
いずれのＳＰＲ分析もＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。各種モノクローナル抗体とそれ自体の抗原との結合親和性を測定するために、まず、ＣＭ５センサチップに固定化されたプロテインＡ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＧＣ３３又はＢＣ１８（アイソタイプヒトＩｇＧ１）を捕捉し、次に、各フローセルに、連続希釈した濃度で分析物（ｈＧＰＣ３－△ＨＳ又はｈＣＤ４７タンパク質、補足材料及び方法を参照）を注入した。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトを用いて、結合速度（Ｋ_結合（Ｋ_on））、解離速度（Ｋ_解離（Ｋ_off））、及び親和定数（Ｋ_D）を算出した。以上のようにして、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ又はＧＰＣ３／ＣＤ４７－ＤＡＮＧ変異体とｍＦｃγＲとの結合の動力学分析を行った（このとき、分析物は連続希釈されたｍＦｃγＲであった）。

ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの同時結合を確認するために、アミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、ｈＧＰＣ３－△ＨＳを、～６００個の応答ユニット（ＲＵ）の表面密度でＣＭ５センサーチップに共有結合した。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂを２０μｇ／ｍＬで注入し、解離段階を８０ｓとし、その後、１ｍＭのｈＣＤ４７－マウスＦｃ（ｍＦｃ）融合タンパク質を注入し、解離段階を１２０ｓとし、その後、３ＭのＭｇＣｌ₂で再生した。

ＦＡＣＳによる結合及び遮断アッセイ
各抗体と単一抗原又は二重抗原を発現する細胞との結合能力を比較するために、Ｒａｊｉ又はＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞（５×１０⁵個／ウェル、９６ウェルプレート中）と０．４μｇ／ｍＬ又は２μｇ／ｍＬテスト抗体をＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。その後、抗体が結合した細胞を洗浄し、ＦＩＴＣと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とを４℃で２０ｍｉｎインキュベートした。これらのサンプルをＦＡＣＳ Ａｒｉａｌ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｒ．４（Ｄｅ Ｎｏｖｏソフトウェア）を用いてデータを処理した。

これらの抗体の結合選択性を評価するために、製造元のプロトコルに従って、Ｒａｊｉ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋ^TM Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でラベルした後、無染色のＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞と１：１の割合で混合した。その後、混合した細胞（１×１０⁶個／ウェル）と０．２μｇ／ｍＬの各抗体とを４℃で３０ｍｉｎインキュベートし、上記のように分析した。

全ての抗ＣＤ４７抗体がＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する能力を評価するために、異なる抗ＣＤ４７抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｒａｊｉ又はＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞と５０ｎＭのビオチン化されたＳＩＲＰα－ｍＦｃとを４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。その後、洗浄後、ストレプトアビジン－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、ＳＩＲＰαと各タイプの細胞との結合を測定した。

赤血球凝集アッセイ
健常ドナーから採取したヒト全血をＰＢＳで洗浄し再懸濁した。１ウェルあたりＰＢＳ中に３百万個のＲＢＣの数でポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に敷き、連続希釈した抗体と室温で１ｈｒインキュベートした。

ｈＣＤ４７／ｈＳＩＰＲαヒト化マウスの産生
全ての動物実験は、中国国家実験動物の飼育及び介護ガイドラインに従って行い、北京国家生物科学研究所が承認したＩＡＣＵＣプロトコルで行った。ヒト化マウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を媒介とする遺伝子編集技術によって産生された。ヒト化Ｓｉｒｐαマウスは、マウスＳｉｒｐα遺伝子の、細胞外ドメインをコードするエクソン２をヒトＳｉｒｐαエクソンの対応するものに置き換えることにより産生される。同様に、マウスＣｄ４７遺伝子の、細胞外ドメインをコードするエクソン２をヒトＣｄ４７エクソンの対応するものに置き換えることにより、ヒト化Ｃｄ４７マウスが産生された。上記２種類のヒト化マウスを一緒に交配することにより、ｈＣｄ４７／ｈＳｉｒｐα二重遺伝子ヒト化マウスを産生した。ホモ接合型ヒト化マウスを本研究に用いた。

マウスにおける薬物動態学及び血液学毒性研究
ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαヒト化マウスにおいて単一用量薬物動態（ＰＫ）研究を行った。８から１０週齢のヒト化マウス（各群ｎ＝３）に１０ｍｇ／ｋｇの各抗体ｉ．ｐ．を注射した。異なる時点で血液試料を採取し、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて各ヒト抗体の血清濃度を測定した。ＰＫデータの評価は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを用いて行った。６から８週齢のヒト化マウス（各群ｎ＝４－６）に１０ｍｇ／ｋｇの各抗体ｉ．ｐ．を注射した。抗体投与後４５ｍｉｎ又は２．５ｈｒ後に眼窩静脈叢から血液試料を採取し、Ｂｅｉｊｉｎｇ ＢｒｉｇｈｔＳｈｉｎｅｓ ＬｔｄでＡＤＶＩＡ ２１２０ｉ機器を用いて赤血球計数を測定した。

ＡＤＣＣレポーターのバイオアッセイ
ＡＤＣＣレポーター遺伝子のバイオアッセイは、以前の報告通りに行われた。９６ウェルの固体白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに、標的細胞（Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H又はＨｅｐ３Ｂ）を１．５×１０⁴の量で播種した。３倍連続希釈した抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ又はＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ及びＪｕｒｋａｔ－ＣＤ１６Ａ－ＣＤ４７^KOエフェクター細胞を添加し、最終的なエフェクター細胞と標的細胞との比（Ｅ：Ｔ）は６：１であった。発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ^TM）を用いて、３７℃、５％ＣＯ₂で約８ｈｒインキュベートした後、ルシフェラーゼ活性を測定した。

ＡＤＣＰアッセイ
ＡＤＣＰアッセイでは、エフェクター細胞として、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を用いた。ＢＭＤＭを調整するために、ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαヒト化マウスの大腿骨と脛骨からマウス骨髄細胞を収集し、１５％Ｌ９２９（ＧＭ－ＣＳＦ分泌）細胞培地を補足したＤＭＥＭ培地で３日間誘導した。標的細胞とインキュベートする前に、分化したＢＭＤＭを１：２００で希釈した抗マウスＦ４／８０抗体－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、クローンＢＭ８）で標識した。

競合性ＡＤＣＰ実験では、Ｒａｊｉ及びＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞を標的細胞として使用し、それらをＣｅｌｌＴｒａｃｅ^TMイエロー又はＣＦＳＥで製造元のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って染色した。蛍光標識した標的細胞を１：１で混合し、４×１０⁵個の細胞／ウェルの密度でプレートに敷いた。ＨＣＣ細胞株のＡＤＣＰ実験では、Ｈｅｐ３Ｂ又はＨｅｐ３Ｂ－ＣＤ４７^KO細胞をＣＦＳＥで染色し、８×１０⁴個の細胞／ウェルの密度でプレートに敷いた。各標的細胞を４μｇ／ｍＬの各抗体とＲＴで１０ｍｉｎインキュベートした後、分化且つ標識されたＢＭＤＭ（～２×１０⁵個の細胞／ウェル）に添加し、３７℃で２ｈｒインキュベートした。ニコンＡ１Ｒ共焦点顕微鏡を用いて、蛍光標識標的細胞のＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＢＭＤＭによる貪食を記録した。貪食されなかった細胞を洗い流した後、顕微鏡イメージングを行った。統計分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定や単方向ＡＮＯＶＡ）はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで行われた。

イン・ビボＨＣＣ異種移植モデル
５×１０⁶個のＨｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３細胞を、６から８週齢の非肥満型糖尿病性重症複合免疫不全症（ＮＯＤ－ＳＣＩＤ）マウスの右脇腹に皮下注射した。等価平均腫瘍体積に基づいて、マウスをランダムにグループ化し（各群ｎ＝５）、毎週２回ｉ．ｐ．注射により１０ｍｇ／ｋｇの各抗体（又はその変異体）を３週間受けた。１５ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をｉ．ｐ．注射した後、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、腫瘍を有するマウスのインビボ腫瘍の生物発光強度を測定した。腫瘍サイズを電子ノギスで測定し、式（ＬＷ²）／２を用いて腫瘍体積を算出し、それぞれＬを最大、Ｗを最小測定径とした。全てのマウスの腫瘍サイズが２０００ｍｍ³を超えると、又は研究終了時に、ＣＯ₂によりそれらを安楽死させた。

インビボ近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングでは、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂとアイソタイプ・コントロール抗体をＣｙ７ ＮＨＳエステル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と結合させた。等価平均腫瘍体積に基づいて、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍を有するマウスをランダムに２群（各群ｎ＝３）に分け、８ｍｇ／ｋｇの各種蛍光標識抗体で注射した。抗体投与後１２、２４、３６及び４８ｈでマウスをイメージングし、７４５及び８００ｎｍの励起及び発光波長を使用した。抗体投与後４８ｈに臓器を解剖してイメージングした。

マクロファージの枯渇については、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療開始３日前に、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスを２００μＬのクロドロナートリポソーム（ＦｏｒｍｕＭａｘ）でｉ．ｐ．注射し、その後、研究終了まで週に１回（１００μＬ）追加注射した。好中球の枯渇について、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスを５日ごとに２００μｇの抗Ｌｙ６Ｇ抗体（１Ａ８クローン、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）でｉ．ｐ．注射した。

統計分析
異なる実験群間の統計的有意性は、スチューデントのｔ検定、単方向ＡＮＯＶＡ又は双方向ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ検定（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）により分析した。いずれの統計分析もグラフ作成もＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて行った。

実施例２ 二重特異性抗体

二重特異性抗体の産生と、二重抗原を発現する細胞に対するＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの特異性が大幅に向上することが実証された。
様々な抗ＧＰＣ３又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂの結合親和性、エピトープ及び抗腫瘍活性を特徴付けた後、２つの抗体、すなわち、ヒトＧＰＣ３を標的とするＣｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ（ＧＣ３３）及びヒトＣＤ４７を標的とするｍＡｂ（ＢＣ１８）を使用して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂを産生した（図１０及び図１１Ａ）。我々のファージディスプレイナイーブ抗体ライブラリー（ｓｃＦｖ）のスクリーニングにより得られたＢＣ１８は、ＣＤ４７とその受容体ＳＩＲＰαとの間の相互作用を効果的に遮断した（図１１Ｂ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により測定されたように、ＧＣ３３及びＢＣ１８の両方は、それらの自身の抗原に対してナノモル範囲の親和性を有する（図１１Ｃ）。ＣＤ４７又はＧＰＣ３のそれぞれについて、対照として２種類のＢｓＡｂ（Ｃｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ又はＧＰＣ３／Ｃｔｒｌ ｂｉＡｂ）を産生した（図１１Ａ）。すべてのｂｉＡｂは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって産生され、その後プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された（図１１Ｄ）。次いで、ＳＰＲの分析に基づき、精製され正確に組み立てたＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの二重特異性を確認し（図１２Ａ）、２種類の対照ｂｉＡｂのそれぞれの特異性を確認した（図１１Ｅ）。

正常組織細胞におけるＣＤ４７の広範な発現は、腫瘍細胞に対する抗体の生物学的利用可能性の低下を引き起こし、抗ＣＤ４７抗体の治療効果を損なう（いわゆる「抗原シンク」現象）可能性がある。我々は、工学的に改変されたＧＰＣ３⁺ＣＤ４７⁺二重陽性細胞（Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H、図１１Ｆ）を用いて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが設計された二重抗原を発現する細胞に対して選択的結合性を有するか否かを研究した。我々は、単一抗原を発現するＲａｊｉ－ＷＴ細胞と比較して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、二重陽性Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞に非常に強い結合を有することを見出し（図１２Ｂ）、これは、我々の二重標的方策が改善された特異性を提供することをサポートした。また、イン・ビトロ実験を設計して抗原シンクのシナリオをシミュレートしたところ、二重陽性細胞と単一陽性細胞の両方が存在した。具体的には、Ｒａｊｉ細胞を濃い赤色の色素で標識し、それらをＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞と１：１で混合し、各種の抗体とインキュベートした。ＦＡＣＳ分析の間、まず細胞のタイプに応じて細胞をゲーティングし、次に抗体結合を分析した。Ｒａｊｉ細胞と比較して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがＲａｊｉ－ＧＰＣ３^Hに優先的に結合し、上記対照抗ＣＤ４７ ｍＡｂ又はＣｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂに対してこの特異性はそれほど顕著ではない（図１２Ｃ）。

次に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＳＩＲＰα／ＣＤ４７遮断活性をテストした。競合性ＦＡＣＳ分析は、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ及びＣｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ（それぞれが、ＣＤ４７を発現するＲａｊｉ－ＷＴ細胞及びＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞へのＳＩＲＰαの結合を同程度に遮断する）に比べて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞に対する遮断活性は、未修飾のＲａｊｉ細胞に対する遮断活性よりも強いことを示した（図１２Ｄ）。要するに、これらの結果は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが二重抗原を発現する腫瘍細胞との優先的な結合及び有効なＳＩＲＰα／ＣＤ４７遮断を実現しやすいことを示している。

抗ＣＤ４７ ｍＡｂと比較して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、ヒトＣＤ４７／ＳＩＲＰα遺伝子で修飾されたマウスにおいて、優れた安全特性及び延長された血清半減期を有する。
深刻な副作用は抗ＣＤ４７抗体治療の主な懸念の一つである。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの血液学的安全性を評価するために、まずヒト赤血球（ＲＢＣ）を用いてイン・ビトロ凝集アッセイを行った。予想通り、抗ＣＤ４７ ｍＡｂは赤血球凝集を起こしたが、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは赤血球凝集を起こさなかった。これに合わせて、Ｃｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂでは赤血球凝集が起こらず、１つの抗体アームのみでＣＤ４７に結合することで赤血球凝集の誘導が回避されることが示された（図１３Ａ）。

ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのイン・ビボ安全特性を評価するために、ヒトＣｄ４７／Ｓｉｒｐα二重遺伝子修飾マウス（ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰαヒト化マウス）を産生した。具体的には、マウスＣｄ４７及びＳｉｒｐα遺伝子の、細胞外ドメインをコードするエクソンをヒトの対応するものに置き換えた（図１４Ａ～１４Ｂ）。ｂｉＡｂについては血液学毒性の顕著な兆候は見られなかったが、抗ＣＤ４７ ｍＡｂはヒト化マウスにおいて１ｈｒで急性赤血球枯渇を誘導した（図１３Ｂ、図１４Ｃ）。また、抗ＣＤ４７ ｍＡｂは体温の著しい低下を引き起こし、ＧＰＣ３／ＣＤ４７又はＣｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂで治療した後にそのような低下は生じなかった（図１３Ｃ）。

ＣＤ４７によって媒介される迅速な薬物除去も臨床応用の懸念である。そのため、上記ヒト化マウスを用いて単一用量のＰＫ研究を行った。Ｃｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂと同様に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは親抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（ｔ１／２～２．４日）と比較して延長された血清半減期（ｔ_1/2～１３．４日）を示した（図１３Ｄ）。これらの延長は、抗体とＣＤ４７を発現する正常体細胞との結合低下（抗原シンク）によるものと考えられる。要するに、これらの結果は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがイン・ビボで抗ＣＤ４７ ｍＡｂよりも明らかに安全であり、有利なＰＫ特性を有することをサポートした。

ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、二重抗原を発現する腫瘍に対して増強されたＦｃ媒介の機能及び選択的成長抑制を有する。
Ｆｃドメインによって媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）は、癌治療中に抗体によって引き起こされる２つの機能である。我々の発見によれば、すなわち、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは二重抗原を発現する腫瘍細胞に優先的に結合することができ（図１２Ｃ）、我々は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞に対するＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを誘導する能力を研究した。ＡＤＣＣアッセイでは、エフェクター細胞として工学的に改変されたＪｕｒｋａｔ Ｔリンパ球を用いたレポーターシステムを用いた（図１５Ａ）。さらにＣＤ４７発現をノックアウトして、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ４７発現によるバックグラウンド毒性問題を克服した（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６Ａ－ＣＤ４７^KO）（図１５Ｂ～１５Ｃ）。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが用量依存的に誘導するＲａｊｉ－ＧＰＣ３Ｈ細胞に対するＡＤＣＣは、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ（Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H及びＲａｊｉ細胞に対して同等の強度のＡＤＣＣを誘導する）と比較して、Ｒａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣよりも強い（図１６Ａ）。

その後、マクロファージとイン・ビトロで共インキュベートした後、Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞のｂｉＡｂ誘導ＡＤＣＰを分析した。この実験では、ヒト化マウス由来のヒトＳＩＲＰαを発現する骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）をエフェクター細胞として用いるとともに、Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^HとＲａｊｉ細胞との混合物を標的細胞として用いた。蛍光顕微鏡法及び貪食定量の結果は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞の優先的な貪食を誘導することを示した（図１６Ｂ）。対照的に、抗ＣＤ４７ ｍＡｂは、２つのタイプの細胞の貪食を誘発し、選択性を示さなかった。

イン・ビボ治療中のＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの二重抗原を発現する腫瘍に対する抗腫瘍効果を研究するために、Ｒａｊｉ又はＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H細胞をそれぞれＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの右脇腹又は左脇腹に移植した両側マウスモデルを使用した（図１６Ｃ）。喜ばしいことに、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ及びＣｔｒｌ／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ（それぞれＲａｊｉ－ＧＰＣ３^H及びＲａｊｉ腫瘍進行を近いレベルで抑制する）の両方と異なり、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＲａｊｉ－ＧＰＣ３Ｈに対する腫瘍抑制効果は、Ｒａｊｉ細胞に比べて明らかに顕著であった（図１６Ｄ）。抗ＧＰＣ３ ｍＡｂは、Ｒａｊｉ－ＧＰＣ３^H腫瘍の進行を阻害せず、それはそのエフェクター機能が弱いためであると考えられる。要するに、これらのイン・ビトロ及びイン・ビボの結果は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが二重抗原を発現する腫瘍に対して増強されたＦｃ媒介の機能及び選択的成長抑制を有することを示す。

異種移植ＨＣＣモデルにおいて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの性能は、単一療法及び抗ＣＤ４７と抗ＧＰＣ３ ｍＡｂとの併用療法より優れている。
ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのイン・ビボでのＨＣＣ進行に対するパフォーマンスをテストするために、我々は異種移植マウスモデルにＧＰＣ３とＣＤ４７の二重陽性ヒトＨＣＣ細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）を使用した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞がＧＰＣ３及びＣＤ４７の両方を中程度で発現すること（図１５Ｄ）を確認した後、イン・ビボの生物発光イメージングを用いて腫瘍成長を測定できるように、ルシフェラーゼを安定的に発現するＨｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３細胞株を構築した。ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスは、これらのＨｅｐ３Ｂ－Ｌｕｃ２３細胞を皮下注射した後、近い平均腫瘍生物発光強度を有する４つの群にランダムに分け、その後、毎週２回抗体治療を受け、合計３週間行った。

ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ又は抗ＣＤ４７ ｍＡｂと比較して、顕著に増強された腫瘍阻害を提供するが、これらのｍＡｂの単一療法も、それぞれＨｅｐ３Ｂ腫瘍成長を阻害したことを指摘すべきである。生物発光イメージングから明らかなように、５匹のＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ群のマウスのうちの３匹において腫瘍が完全に根絶したが、ｍＡｂ単一療法群のマウスでは腫瘍の根絶が検出されなかった（図１７Ａ～１７Ｃ）。同様の投与方法を用いて、各種抗体が腫瘍付きマウスの全体生存率に与える影響も比較した。抗ＣＤ４７ ｍＡｂ及び抗ＧＰＣ３ ｍＡｂの両方は、ＰＢＳ対照と比較して全体生存率を顕著に向上させたが、全てのマウスは、最終的に腫瘍の進行により死亡した。対照的に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは強力な抗腫瘍応答を引き起こし、治療終了後２ヶ月後に５０％のマウス（６匹中３匹）の完全応答（ＣＲ）を引き起こした（図１８Ａ）。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療は生存期間中央値を８８日まで延長し、それに比べて生存期間中央値は抗ＣＤ４７ ｍＡｂ群で６５日、抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ群で６８．５日であった（図１８Ｂ）。次に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂと、抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４７ ｍＡｂを含む併用療法の抗腫瘍性能とを比較した。腫瘍体積及び生物発光強度を測定することにより、腫瘍成長の経時変化をモニタリングした結果、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは上記併用療法よりも優れた抗腫瘍効果を提供した（図１７Ｄ～１７Ｆ）。要するに、これらの結果は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがＧＰＣ３及びＣＤ４７二重陽性ＨＣＣ腫瘍の抗腫瘍活性について有力な実証を提供した。

マクロファージと好中球はイン・ビボでＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＦｃ依存性抗腫瘍活性に関与する。
ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがＨＣＣを治療するための作用メカニズムを研究するために、まず、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対するＦｃ媒介のエフェクター機能を検査した。イン・ビトロＡＤＣＰ実験により、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂはＨｅｐ３Ｂ細胞の顕著な貪食を誘導することが示された。我々はまた、抗ＧＰＣ３ ｍＡｂがＨｅｐ３Ｂ細胞の貪食を誘導せず、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の遺伝子からＣＤ４７をノックアウトする（Ｈｅｐ３Ｂ－ＣＤ４７^KO）と、抗ＧＰＣ３ ｍＡｂの貪食活性が回復したことを発見し（図１９Ａ～１９Ｂ）、この発見は、腫瘍細胞にＣＤ４７を発現させて抗体に誘導される貪食に対する耐性を付与することに関する従来の報告を実証した。イン・ビトロＡＤＣＣアッセイにおいて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、抗ＣＤ４７又は抗ＧＰＣ３ ｍＡｂと同等以上のレベルで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対する用量依存性の細胞毒性効果を誘導した（図１９Ｃ）。

さらにイン・ビボでＦｃ媒介のエフェクター機能を評価するために、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ変異体（ＧＰＣ３／ＣＤ４７－ＤＡＮＧ）を産生し、それはＦｃ領域に２つの突然変異（Ｄ２６５ＡとＮ２９７Ｇ）を有し、この２つの突然変異はＦｃ領域とすべてのタイプのＦｃγＲとの結合を解消できることが知られている。マウスの研究を行う前に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７－ＤＡＮＧはｍＦｃγＲに対して結合活性を示さないが、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂに近い親和性でＨｅｐ３Ｂ細胞に結合する能力を維持していることを実証することに成功した（図２０Ａ～２０Ｂ）。上記Ｈｅｐ３Ｂ－ｌｕｃ異種移植モデルを用いた実験において、ＧＰＣ３／ＣＤ４７－ＤＡＮＧが抗腫瘍効果を提供しないことを発見し（図１９Ｄ）、Ｆｃ媒介のエフェクター機能がｂｉＡｂの抗腫瘍活性に必要であることを示した。全身近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングを用いて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの腫瘍付きマウスにおける分布も評価した。アイソタイプ・コントロール抗体と比較して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、経時的な腫瘍蓄積の増加を示した（図１９Ｅ）。異なる器官における各抗体の蓄積を測定するために、新鮮に解剖した腫瘍及び器官からの蛍光シグナルを定量した。アイソタイプ・コントロール抗体の明らかな非特異的分布と異なり、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂで治療したマウスにおける器官と腫瘍の蛍光比率の顕著な低下は、腫瘍部位におけるその特異的蓄積をサポートした（図１９Ｆ）。

次に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの抗腫瘍効果に寄与する免疫細胞の種類の同定を試みた。ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの免疫障害の免疫背景を考慮して、免疫細胞枯渇法を用いてモデルの３つの主な先天性免疫細胞サブセットであるマクロファージ、好中球及びＮＫ細胞の寄与を評価した。３種類の免疫細胞サブセットのいずれについても、枯渇効率が９０％を超えたことが確認された（図２１Ａ）。マウスからのマクロファージ又は好中球の枯渇は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの抗腫瘍効果の有意な低下をもたらし、ＮＫ細胞の枯渇は何ら影響を及ぼさなかった（図１９Ｇ、図２０Ｂ）。この結果は、マクロファージと好中球の両方がｂｉＡｂの抗腫瘍効果に機能的に寄与することをサポートした。

従来の研究により、ＧＰＣ３のＨＣＣにおける過剰発現がＭ２分極の免疫抑制性マクロファージを募集することが示されたことに鑑みて（抗体治療効果を制限する結果となると考えられる）、さらにＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療後の浸潤マクロファージを分析した。ＦＡＣＳ分析により、ビヒクル対照と比較して、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂで治療したマウスにおいて浸潤マクロファージの頻度が顕著に上昇したことが示された（図２１Ｃ～２１Ｄ）。この結果は、免疫蛍光顕微鏡法の分析結果によってさらにサポートされた（図２１Ｅ）。また、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの治療は、Ｍ１様／Ｍ２様の比率の向上を引き起こすと考えられ、この発見は、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが腫瘍内のマクロファージを炎症促進状態にわずかに偏向させることができることを示した（図２１Ｆ）。総合的に見ると、これらのＮＯＤ－ＳＣＩＤ異種移植腫瘍モデルに由来する結果から、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの抗腫瘍活性は、そのＦｃ媒介のエフェクター機能及びマクロファージと好中球の関与を必要とすることが確認された。

図２１は、（Ａ）マクロファージ、好中球及びＮＫ細胞のイン・ビボでの枯渇である。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療開始３日前に、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスを２００μＬのクロドロナートリポソーム（ＦｏｒｍｕＭａｘ）ｉ．ｐ．注射し、その後、毎週１回追加の注射（１００μＬ）を行い、研究終了まで行った。５日ごとに抗Ｌｙ６Ｇ抗体（１Ａ８クローン、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）２００μｇを用いて好中球の枯渇を行った。週に１回、５０μＬの抗Ａｓｉａｌｏ－ＧＭ１ポリクローナル抗体（Ｐｏｌｙ２１４６０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてＮＫ細胞の枯渇を行った。フローサイトメトリーにより、脾臓及び末梢血における枯渇効果を確認した。（Ｂ）ＮＫ細胞枯渇（抗ＡＳＧＭ１）を行った場合又は行わなかった場合の、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療後のイン・ビボでの腫瘍成長である。腫瘍体積は、ノギス測定に基づいて計算され、平均値±ＳＥＭ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、双方向ＡＮＯＶＡ、その後はＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検定）として示された。（Ｃ）ＣＤ４５⁺免疫細胞から腫瘍浸潤性マクロファージを同定するためのフローサイトメトリーのゲーティング・ストラテジーである。まず、死細胞及び二重結合体を排除した後、ＣＤ４５⁺細胞をゲーティングする。腫瘍内マクロファージは、ＣＤ１１ｂ⁺Ｇｒ－１^-Ｆ４／８０^Highと定義される。（Ｄ）ＦＡＣＳにより得られたＣＤ４５⁺免疫細胞における腫瘍浸潤性マクロファージの百分率である。（Ｅ）腫瘍浸潤性Ｆ４／８０＋細胞数のＩＨＣ分析（左）、及びＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂ治療を使用したか又は使用しない場合の代表的なＦ４／８０染色腫瘍画像（右、×４０拡大）である。（Ｆ）Ｍ１様／Ｍ２様マクロファージ比率をプロットした棒グラフ（左）、及びＣＤ８０及びＣＤ２０６染色によるＭ１様及びＭ２様サブセットを示す代表的なＦＡＣＳプロット（右）を示す。

検討
近年、癌療法において多くの進展が得られているにもかかわらず、後期ＨＣＣ患者のかなりの一部がファーストライン治療又は免疫チェックポイント阻害剤に応答していない。したがって、異なるメカニズムを利用した治療方策を開発することは、ＨＣＣ患者に非常に有利である可能性がある。二重特異性抗体は新たな抗体療法を代表し、様々な腫瘍タイプを治療するために探索されている。本研究において、ＨＣＣ腫瘍細胞を特異的に標的とするために、ＧＰＣ３及びＣＤ４７に結合する二重特異性抗体を産生し、ｈＣＤ４７／ｈＳＩＲＰα二重ヒト化マウスにおけるヒトＣＤ４７を標的とする二重特異性抗体の薬物動態及び潜在的な不利な反応を評価した。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、注目される半減期を有し、血液毒性を示さない。さらに両側マウスモデルを用いて、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂが腫瘍細胞に対して正常細胞を超えた優先活性を有することを経験的に確認した。要するに、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの安全特性、長半減期及び優先的な抗腫瘍活性は、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を利用した併用療法よりも明らかな優位性を強調した。

振り返ってみると、我々のイン・ビトロＡＤＣＰ実験は、ＣＤ４７ノックアウト後に、抗ＧＰＣ３ ｍＡｂが如何にＨｅｐ３Ｂに対して顕著な貪食作用を発揮するかを示した。この結果は、腫瘍細胞におけるＣＤ４７の発現が、腫瘍抗原を標的とする治療抗体の貪食促進を阻害し得ることを報告した、従来の研究を実証した。したがって、我々の作業は、ＣＤ４７阻害を利用して、ＣＤ４７陽性ＨＣＣの治療に追加の貪食促進抗腫瘍応答をどのように増加させるかを説明した。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、抗腫瘍Ｍ１表現型と腫瘍促進Ｍ２表現型との間で連続的な異なる分極状態を示した。従来の研究は、腫瘍におけるＭ２マクロファージレベルの上昇がＨＣＣの予後不良に関連することを示した。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、マクロファージの貪食を活性化することに加えて、Ｍ１／Ｍ２マクロファージの比率を向上させた。この状況は、ＨＣＣ患者にとって追加の利点を有することが合理的であろう。

十分に研究されたマクロファージ抗腫瘍活性に比べて、好中球が抗腫瘍効果を媒介する証拠は比較的に限られている。Ｆｃ受容体を発現する好中球は、最も豊富なヒト循環細胞の毒性エフェクター細胞集団を代表しているが、それらが抗体オプソニン化された癌細胞を殺す確実なメカニズムは依然として捉えにくい。興味深いことに、我々の結果は、好中球細胞がＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおける抗腫瘍効果に必要であることをサポートした。我々の発見と同様に、従来の研究では、好中球の選択的枯渇は、抗ＣＤ５２ ｍＡｂ及び抗ＣＤ２０ ｍＡｂの保護活性を著しく低下させることが示された。ＣＤ４７－ＳＩＲＰａ相互作用の遮断により、好中球細胞による抗体媒介性腫瘍細胞の死滅が増強されることが示された。興味深いことに、ＨＣＣの進行に好中球が関与するという報告もある。そのため、好中球がＨＣＣ患者において、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの抗腫瘍効果を引き起こすか、及びどのように引き起こすかを研究することは興味深い。

ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＨＣＣ患者における抗腫瘍活性を考慮すると、肝臓ＮＫ細胞は無視できない。これらの肝臓総リンパ球の最大５０％を占める細胞はウイルス感染の抑制及び肝腫瘍の発生に関与する。注目すべきことは、多くの研究では、ＨＣＣの発展に伴い、細胞毒性が損なわれ、ＮＫ細胞の浸潤が減少することが観察された。このような腫瘍におけるＮＫ細胞の減少は、ＡＤＣＣ媒介抗体の抗腫瘍効果を顕著に制限する。従来の研究により、ＡＤＣＣ媒介治療性抗体の抗腫瘍効果は、ＮＫ細胞上で発現するＦｃγＲＩＩＩａにおける多型（１５８Ｖ／Ｆ）の影響を受けることが実証された。なお、注意すべきことは、８５％を超える人は低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｆのアロタイプを持っていることが知られている。抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ（ＧＣ３３）の後期ＨＣＣ患者における第ＩＩ相臨床試験の失敗は、最適以下のＡＤＣＣ活性に起因する可能性があり、高親和性ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプを選択するか、或いは高発現レベルのＧＰＣ３及び／又はＦｃγＲＩＩＩａを有する患者は、高ＡＤＣＣ効果を促進し、最終的に結果を改善する可能性がある。この点を考慮すると、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂは、親抗ＧＰＣ３ ｍＡｂに比べて、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（中等レベルのＧＰＣ３を発現）のＡＤＣＣ活性を大きく増強すると考えられる。ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂがＮＫ細胞のＡＤＣＣ増強を引き起こす能力は、より広い範囲のＨＣＣ患者（すなわち、不均質なＧＰＣ３発現スペクトルを有する患者）を治療する全体的な効果を促進する可能性があると予想される。我々が研究したＮＫ機能障害のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスモデルは、ＮＫ細胞がＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂの抗腫瘍効果に関与することに対する明確な確認を排除したが、将来、この種の抗体（併用療法を含む）の臨床前及び臨床試験においてＮＫ細胞活性を密接にモニタリングし、ＡＤＣＣ活性がＮＫ媒介の腫瘍殺傷をどのように促進するかに対する理解を深める可能性がある。

他の宿主免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）も抗腫瘍保護に有意に寄与することを強調すべきである。いくつかの研究により、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞とＴ細胞接着性二重特異性抗体のＨＣＣ異種移植モデルにおける治療効果が実証されたが、これらは現在臨床実践において、特に固形腫瘍について、大量の課題に直面している。注意すべきことは、ＣＤ４７遮断抗体は抗原提示細胞（マクロファージ又は樹状細胞）を利用して腫瘍抗原のＴ細胞への交差提示を促進することができ、これは持続的な適応的抗腫瘍応答をもたらす。従って、我々のＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂもＴ細胞抗腫瘍活性を利用することができ、且つ他のＴ細胞刺激性免疫チェックポイント阻害剤又は化学療法剤と共に併用剤として投与する場合、そのＨＣＣ治療効果がさらに最大化する可能性があると仮定した。将来的には、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂをＴ細胞免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１又は抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ）とともに、免疫活性を有するモデルに投与して、それぞれの寄与を把握する研究を行う必要がある。

興味深いことに、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂを用いた治療は、モノクローナル抗体単独よりもはるかに強い抗腫瘍活性を示すことに加えて、ＧＰＣ３及びＣＤ４７標的をそれぞれ認識する２つの抗体を含む併用療法よりも優れた抗腫瘍効果を提供することに留意した。この観察は、二重特異性抗体を使用して２つの抗原を結合させることにより、ある形態の相乗効果によって改善された臨床的価値を提供できることをサポートした。要するに、ここで二重特異性抗体を開発しており、ＨＣＣに対して安全で有効な抗腫瘍活性を有することを実証した。最終的に、ＧＰＣ３／ＣＤ４７ ｂｉＡｂのＨＣＣ治療における特定のメカニズムがより多く理解されるにつれて、より多くの一般的な傾向を発見することができ、二重特異性抗体の開発をサポートして先天性免疫応答を増強し、新たな治療方策に用いて癌治療結果をさらに改善することができる。

Claims (23)

1. ＣＤ４７に結合する能力を有し、ＳＩＲＰａと競合してＣＤ４７に結合し、好ましくは、ｈＣＤ４７に結合する能力を有する、単離された抗ＣＤ４７抗体又はその断片。
2. ヒト抗ＣＤ４７抗体又はその断片であり、好ましくは、モノクローナルヒト抗ＣＤ４７抗体又はその断片である、請求項１に記載の単離された抗ＣＤ４７抗体又はその断片。
3. 重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
   ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
   （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
   （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
   （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、及び、
   （６）（１）～（５）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３であり、ただし、そのうち少なくとも１つは、１、２、３、４又は５個のアミノ酸の付加 、欠失、保存アミノ酸の置換又はそれらの組み合わせを含むもの
   から選択され、及び、
   ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、及び、
   （６）（１）～（５）に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であり、ただし、そのうち少なくとも１つは、１、２、３、４又は５個のアミノ酸の付加、欠失、保存アミノ酸の置換又はそれらの組み合わせを含むもの
   から選択される、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片。
4. 重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
   ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、
   （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３、及び、
   （６）（１）～（５）に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３であり、ただし、そのうち少なくとも１つは、１、２、３、４又は５個のアミノ酸の付加、欠失、保存アミノ酸の置換又はそれらの組み合わせを含むもの
   から選択される、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片。
5. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
   前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４１に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７～４１に示されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、エピトープ結合活性を保持するアミノ酸配列を有し、
   前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２～４６に示されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、エピトープ結合活性を保持するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片。
6. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列、
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるアミノ酸配列、
   （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列、
   （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示されるアミノ酸配列、
   （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示されるアミノ酸配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列、及び、
   （６）それぞれ（１）～（５）のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有し、エピトープ結合活性を保持する２つのアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
8. 被験者において、好ましくは、前記被験者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被験者であり、ＣＤ４７が過剰発現され又はアップレギュレートされた障害を治療するための請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片又は請求項７に記載の組成物の用途。
9. 前記障害は、以下に限定されず、例えば肺癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、膠芽腫、骨髄芽腫、平滑筋肉腫、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫のような固形腫瘍癌、及び、例えば血液癌、白血病、リンパ腫のような液体癌、脳癌を含む癌；例えば慢性感染のような感染；又は、以下に限定されず、多発性硬化症及び関節炎を含む免疫学的疾患もしくは障害、炎症性疾患である、請求項８に記載の用途。
10. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７抗体又はその断片又は請求項７に記載の組成物を患者に投与することを含み、好ましくは、前記被験者は、診断、予後又は治療を必要とする哺乳動物被験者である、患者のＣＤ４７が過剰発現され又はアップレギュレートされた障害を治療する方法、本発明は、ＧＰＣ３及びＣＤ４７の両方に特異的に結合する能力を有する二重特異性抗体又はその断片に関し、好ましくは、前記二重特異性抗体又はその断片は、ｈＧＰＣ３及びｈＣＤ４７の両方を特異的に結合する能力を有する。
11. ヒトＧＰＣ３（ｈＧＰＣ３）に結合する第１の抗原結合部分と、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗体。
12. 前記ヒトＧＰＣ３に結合する第１の抗原結合部分は、
    （ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインと、
    （ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインとを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
13. 前記ヒトＧＰＣ３に結合する第１の抗原結合部分は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
14. 前記ヒトＣＤ４７に結合する第２の抗原結合部分は、
    （ａ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含むＶＨドメインと、
    （ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、及び（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインとを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
15. 前記ヒトＣＤ４７に結合する第１の抗原結合部分は、
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
16. 前記二重特異性抗体は、Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
17. 前記Ｆｃ領域は、ヒンジ部分、ＣＨ３部分及びＣＨ２部分を含む、請求項１６に記載の二重特異性抗体。
18. 前記Ｆｃ領域は、さらに、ヘテロ二量化を促進するドメインを含み、好ましくは、前記Ｆｃ領域は、２つの重鎖のヘテロ二量化を可能にするノブドメイン及びホールドメインを含み、好ましくは、前記ノブドメイン及びホールドメインは、それぞれＣＨ３部分に位置する請求項１６に記載の二重特異性抗体。
19. 前記ノブドメインはノブ変異を有し、前記ホールドメインはホール変異を有し、好ましくは、前記ノブ変異はＴ３６６ＷとＳ３５４Ｃであり、前記ホール変異はＹ４０７Ｖ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ３４９Ｃである、請求項１８に記載の二重特異性抗体。
20. ＣＨ１部分及びＣＬ部分を有し、好ましくは、ＣＨ１部分とＣＬ部分は互いに置き換えられる、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
21. 第１の抗原結合部分、ＣＨ１部分、ヒンジ部分、ＣＨ２部分及びＣＨ３領域を含むノブ鎖（ＨＣ１鎖）と、第２の抗原結合部分、ＣＬ部分、ヒンジ部分、ＣＨ２部分及びＣＨ３部分を含むホール鎖（ＨＣ２鎖）とを含み、
    好ましくは、前記二重特異性抗体は、ＶＬ及びＣＬを含むＬＣ１部分と、ＶＬ及びＣＨ１を含むＬＣ２部分とをさらに含む、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
22. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のアミノ酸配列を有するＨＣ１と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０のアミノ酸配列を有するＬＣ１部分と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を有するＨＣ２と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２のアミノ酸配列を有するＬＣ２部分とを含み、
    ＨＣ１及びＨＣ２は、３つのジスルフィド結合を介してノブ・イン・ホールの形で相互接続され、ＬＣ１及びＬＣ２は、ジスルフィド結合を介してそれぞれＨＣ１及びＨＣ２に取り付けられる、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
23. ＨＣＣの治療のための請求項１１～２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の用途。