JP2024502646A - 神経再生活性を有する神経再生促進細胞のスクリーニング方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞のスクリーニング方法及び前記神経再生促進細胞を含む薬学的組成物に関する。本発明の神経再生促進細胞は、ＣＤマーカーの発現パターンが幹細胞と比較して完全に異なり、神経再生効果に優れているところ、神経疾患の予防又は治療分野で様々に活用可能である。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞のスクリーニング方法及び前記神経再生促進細胞を含む神経疾患の予防又は治療用薬学組成物に関する。
〔背景技術〕
中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）は、特定刺激によって別の細胞に分化し得る分化の柔軟性を有しており、逆分化幹細胞が持つ腫瘍発生の可能性、胚芽幹細胞が持つ倫理的問題などから自由であるので、細胞治療剤の開発に多用されている。中間葉幹細胞は成体幹細胞であり、通常、成人の脂肪、臍帯血、骨髄などの組織から分離して使用する。これらの組織を分離する方法は、侵襲的であり、苦痛を誘発し、多数の幹細胞が得られないという限界がある。
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
そこで、本発明者らは、中間葉幹細胞から分化した様々な細胞のうち、神経再生促進細胞に分化した細胞の特定ＣＤマーカー分析によって、神経再生効果を示す神経再生促進細胞をスクリーニングする方法を導出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記スクリーニング方法でスクリーニングされた神経再生促進細胞を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記神経再生促進細胞を有効成分として含む、神経疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
〔課題を解決するための手段〕
本発明の一態様によれば、本発明は、下記の段階を含む中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）のスクリーニング方法を提供する：
ｉ）中間葉幹細胞から分化した細胞を準備する段階；及び
ｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて上方調節された（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階。
本発明の他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含む中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）のスクリーニング方法を提供する：
ｉ）中間葉幹細胞から分化した細胞を準備する段階；及び
ｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ２６及びＣＤ１４１からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて下方調節された（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階。
本発明者らは、様々な由来の中間葉幹細胞を分化させ、これらの分化した様々な細胞に対して多数のマーカーのそれぞれの発現様相を確認した結果、驚くべきことに、神経再生促進細胞に分化した細胞が特定マーカー（例えば、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２のようなＣＤマーカー）の発現様相において互いに共通する傾向性を示すということを確認した。
本発明で用語「神経再生促進細胞」、「Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ」又は「ＮＲＰＣ」は、中間葉幹細胞から分化した細胞で、神経再生効果（例えば、損傷した神経細胞において末梢神経を髄鞘化したり、神経再生に必要なサイトカインを分泌したりして構造的又は機能的の面で直間接的に神経再生を促進する効果）を保有した細胞を意味する。
本発明の好ましい具現例によれば、前記スクリーニング方法は、下記の段階を含んでよい：
ｉ）中間葉幹細胞から分化した細胞を準備する段階；
ｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて上方調節された（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階；及び
ｉｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ２６及びＣＤ１４１からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて下方調節された（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階。
本発明の好ましい具現例によれば、前記スクリーニング方法は、下記の段階を含んでよい：
ｉ）中間葉幹細胞から分化した細胞を準備する段階；
ｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ２６及びＣＤ１４１からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて下方調節された（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階；及び
ｉｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて上方調節された（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階。
本発明において用語「幹細胞」は、自己複製能力を有しながら２つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞のことを指し、前記幹細胞は、成体幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞又は胚芽幹細胞を含み、好ましくは、中間葉幹細胞である。
本発明において用語「中間葉幹細胞」は、ヒト又は哺乳類の組織から分離した未分化した幹細胞を意味する。中間葉幹細胞は様々な組織に由来してよく、特に、扁桃、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜、及び胎盤からなる群から選ばれる１種以上に由来し得る。各組織から幹細胞を分離する技術は、当該業界に既に公知されている。
本発明の好ましい具現例によれば、前記中間葉幹細胞は、扁桃又は脂肪に由来するものである。
本発明の一実施例によれば、扁桃又は脂肪に由来する中間葉幹細胞を利用することが最も好ましいことを確認した。
本発明において用語「ＣＤ」又は「ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」分子は、細胞表面に存在する表面分子構造を意味し、前記ＣＤ分子は、細胞の集団ごとに共通に現れるものがあり、それらを細胞集団を区分するために利用（すなわち、マーカー用途）する。同じ系列の細胞は同じ種類のＣＤ分子を有しており、同じ細胞集団であっても分化又は活性化段階によって異なるＣＤ分子を有しているところ、これは、細胞の系統、分化段階及び活性化などを確認するために有用に用いられる。
本発明の一実施例によれば、本発明の幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞と、中間葉幹細胞のＣＤ分子発現パターンを比較することによって、本発明に係る神経再生促進細胞が中間葉幹細胞と異なる細胞であることを立証した。また、本発明において中間葉幹細胞に比べて発現が上方調節されるＣＤ１０、ＣＤ３９、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２、ＣＤ１２１ａ及びＣＤ３３８などや、下方調節されるＣＤ２６、ＣＤ５４、ＣＤ１２６及びＣＤ１４１などを神経再生促進細胞の分化マーカーとして利用可能である。
本発明の好ましい具現例によれば、前記段階ｉ）の分化した細胞は、中間葉幹細胞を培養して神経球を形成した後、これを分化させたものである。
本発明の好ましい具現例によれば、前記神経再生活性は、末梢神経の髄鞘化（ｍｙｅｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を含む。
本発明において用語「髄鞘化」は、髄鞘が末梢神経の軸索突起を巻いて刺激の伝達速度をより速くする現象を意味する。損傷した末梢神経は、髄鞘化によって正常化（すなわち、再生）する。
本発明の一実施例によれば、本発明のスクリーニング方法でスクリーニングされた候補細胞のうちの一部の細胞は、後根神経節共同培養過程によって細胞形態学的に髄鞘化がなされた。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記スクリーニング方法でスクリーニングされた神経再生促進細胞を提供する。
本発明の好ましい具現例によれば、前記神経再生促進細胞は、下記の特徴を有する：
ａ）分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２の発現が上方調節される；及び
ｂ）分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ２６及びＣＤ１４１の発現が下方調節される。
前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１２１ａの発現が、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上上方調節される。
本発明の一実施例によれば、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１２１ａの発現が、Ｔ－ＭＳＣ－１－１由来神経再生促進細胞は９４％、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来神経再生促進細胞は７１％、Ｔ－ＭＳＣ－１－３由来神経再生促進細胞は５１％、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来神経再生促進細胞は４８％上方調節され、平均して６６％以上上方調節されたことを確認した。
前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１０６の発現が、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上上方調節される。
本発明の一実施例によれば、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１０６の発現が、Ｔ－ＭＳＣ－１－１由来神経再生促進細胞は３０％、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来神経再生促進細胞は１１％、Ｔ－ＭＳＣ－１－３由来神経再生促進細胞は１６％、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来神経再生促進細胞は１３％上方調節され、平均して１７％以上上方調節された。
前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１１２の発現が、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上上方調節される。
本発明の一実施例によれば、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１１２の発現が、Ｔ－ＭＳＣ－１－１由来神経再生促進細胞は４９％、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来神経再生促進細胞は２５％、Ｔ－ＭＳＣ－１－３由来神経再生促進細胞は３０％、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来神経再生促進細胞は１９％上方調節され、平均して３０％以上上方調節された。
本発明の好ましい具現例によれば、前記神経再生促進細胞は、マーカーＣＤ２６の発現が、分化前の中間葉幹細胞に比べて下方調節されたものである。
前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ２６の発現が、好ましくは５％以上、より好ましくは８％以上下方調節される。
本発明の一実施例によれば、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ２６の発現が、Ｔ－ＭＳＣ－１－１由来神経再生促進細胞は９％、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来神経再生促進細胞は１１％、Ｔ－ＭＳＣ－１－３由来神経再生促進細胞は２７％、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来神経再生促進細胞は１６％下方調節され、平均して１６％以上下方調節された。
前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較して、マーカーＣＤ１４１の発現が、好ましくは５％以上、より好ましくは８％以上下方調節される。
本発明の一実施例によれば、分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１４１の発現が、Ｔ－ＭＳＣ－１－１由来神経再生促進細胞は９％、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来神経再生促進細胞は２０％、Ｔ－ＭＳＣ－１－３由来神経再生促進細胞は１６％、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来神経再生促進細胞は３８％下方調節され、平均して２０％以上下方調節された。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記神経再生促進細胞を有効成分として含む神経疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記神経再生促進細胞の有効量を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、神経疾患の治療方法を提供する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記神経再生促進細胞の治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）を提供する。
本発明において用語「神経疾患」は、遺伝又は老化などの内部的要因又は外傷などの外部的要因によって神経組織が損傷して誘発される疾患を意味する。
本発明の好ましい具現例によれば、前記神経疾患は、シャルコー・マリー・トゥース神経病症、糖尿病性末梢神経病症、脊髄損傷、筋萎縮側索硬化症、手根管症候群、小児痲痺、ハンセン病、筋ジストロフィー、多発性筋炎及び重症筋無力症からなる群から選ばれる１以上の疾患である。
本発明において用語「対象」は、本発明の組成物又は前記神経再生促進細胞を投与する必要がある個体を意味し、哺乳類、鳥類、爬虫類、両棲類、魚類など、投与対象に限定されない。
本発明において「予防」は、本発明に係る組成物の投与によって神経疾患を抑制又は遅延させる全ての行為を指す。また、「治療」は、本発明に係る組成物の投与によって神経疾患の症状が好転したり有利に変更したりする全ての行為を意味する。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬学的組成物は、薬剤学的に許容される担体又は賦形剤を含む。
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量の形態で製造されたり又は多回容量容器内に内入させて製造されてよい。
本発明に係る薬学的組成物は、通常の方法によって様々な形態で剤形化して使用することができる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形に剤形化でき、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。
本発明の組成物は、幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞とともに、神経疾患に対して予防又は治療効果を有する公知の有効成分を１種以上含有してよい。
本発明の薬学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、経皮投与、皮下注入、筋肉内注入、硝子体内注入（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、網膜下注入（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脈絡膜上腔注入（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、点眼投与（ｅｙｅ ｄｒｏｐ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳室内注入（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脊椎腔内注入（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、羊膜内注入（ｉｎｔｒａａｍｎｉｏｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、動脈内注入（ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、関節腔内注入（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心臓内注入（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、陰茎海綿体内注入（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脳内注入（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脳髄槽注入（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、冠状内注入（ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、頭蓋内注入（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜内注入（ｉｎｔｒａｄｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、硬膜外注入（ｅｐｉｄｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、海馬内注入（ｉｎｔｒａｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、鼻腔内注入（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、骨腔内注入（ｉｎｔｒａｏｓｓｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内注入（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腔内注入（ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、脊髄内注入（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸郭内注入（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、胸腺内注入（ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、子宮内注入（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膣内注入（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、心室内注入（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、膀胱内注入（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、結膜下注入（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腫瘍内注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、局所注入及び腹腔注入（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などで投与できる。
前記非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてよい。
本発明の薬学的組成物の投与量は、前記薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／又は投与経路などによって多様化してよく、前記薬学的組成物の投与によって達成しようとする反応の種類及び程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、当該個体に同時に又は異時に併用される薬物、その他組成物の成分などをはじめとする様々な因子及び医薬分野でよく知られた類似因子によって多様化でき、当該技術の分野における通常の知識を有する者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方できる。
本発明の薬学的組成物の投与経路及び投与方式はそれぞれ独立していてよく、その方式において特に限定されず、目的とする該当の部位に前記薬学的組成物が到達できればいかなる投与経路及び投与方式に従ってもよい。
〔発明の効果〕
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明は、中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞のスクリーニング方法及び前記神経再生促進細胞を含む薬学的組成物を提供する。
（ｉｉ）本発明の神経再生促進細胞は、ＣＤマーカーの発現パターンが中間葉幹細胞と比較して完全に異なり、神経再生効果を保有するところ、神経疾患の予防又は治療分野で多様に活用可能である。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕扁桃由来中間葉幹細胞であるＴ－ＭＳＣ－１－１を神経再生促進細胞に誘導した場合の結果を日別に取った写真である。
〔図２〕ＣＤマーカースクリーニングによって本発明に係る神経再生促進細胞のＣＤマーカー発現をヒートマップで示した結果である。
〔図３〕神経再生促進細胞において、扁桃由来中間葉幹細胞と比較して発現量に差があるＣＤマーカーをスクリーニングした結果である。図３Ａは、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現量が増加したＣＤマーカーを、図３Ｂは、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現量が減少したＣＤマーカーを比較した結果である。
〔図４〕神経再生促進細胞において、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現が増加したＣＤマーカー及び発現が減少したＣＤマーカーの発現パターンを比較した結果である。
〔図５〕神経再生促進細胞において共通に発現が増加又は減少したＣＤマーカーのスクリーニング結果を示すヒストグラムである。
〔図６〕神経再生促進細胞において共通に発現が増加したマーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２の発現様相を扁桃由来中間葉幹細胞と比較した結果である。
〔図７〕神経再生促進細胞において共通に発現が減少したマーカーＣＤ２６及びＣＤ１４１の発現様相を扁桃由来中間葉幹細胞と比較した結果である。
〔図８〕扁桃由来中間葉幹細胞（Ｔ－ＭＳＣｓ）、神経再生促進細胞（ＮＲＰＣｓ）のＣＤマーカー発現パターンを比較するために、ＣＤマーカーの発現を比較した結果をヒートマップで示す図である。
〔図９〕神経再生促進細胞の神経突起の成長を測定して比較するために神経突起伸長アッセイ（Ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ）を行った結果である。
〔図１０〕候補細胞と後根神経節の共同培養過程によって一部の細胞において細胞形態学的に髄鞘化がなされることを確認した結果である。
〔図１１〕ＣＤスクリーニング（ＣＤ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）で選別された上方、下方調節されたＣＤマーカーを個別抗体を用いて流細胞分析した結果である。
〔図１２〕Ｔ－ＭＳＣとＮＲＰＣで分析したサイトカインアレイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ）分析結果をヒートマップで図式化した結果（左）と、Ｔ－ＭＳＣに対比してＮＲＰＣで共通に増加したサイトカインを比率別に区分した結果（右）を示す（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ：ＮＲＰＣ１－１／Ｔ－ＭＳＣ１－１、ＮＲＰＣ１－２／Ｔ－ＭＳＣ１－２）。
〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
〔実施例〕
実施例１．中間葉幹細胞の準備
１－１．扁桃由来中間葉幹細胞の分離及び培養
イファ女子大学校医科大学から供与された多数の供与者に由来する扁桃組織を左及び右に区分し、扁桃組織を、ゲンタマイシン２０ｕｇ／ｍｌ添加のＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）１０ｍｌが入っているチューブに入れ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後に洗浄した。前記組織洗浄過程は２回反復した。洗浄された扁桃組織を、滅菌されたはさみを用いて細かく切って粉砕した。
扁桃組織から扁桃由来中間葉幹細胞を分離するために、前記粉砕された扁桃組織に同一重さの酵素反応液を添加した後、３７℃、２００ｒｐｍ条件の振盪培養器で６０分間培養した。前記酵素反応液の組成は表１に示す。
前記培養物に５％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を添加して混合した後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後に上澄液を除去し、ＤＰＢＳ３０ｍｌでペレットを再浮遊させた後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後に上澄液を除去し、ペレットにＤＰＢＳ １０ｍｌを添加後に再浮遊させて懸濁液を製造した。前記懸濁液を１００μｍ濾過器に通過させた。濾過器に残っている扁桃由来中間葉幹細胞をＤＰＢＳ２０ｍｌで洗浄した後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後に上澄液を除去した後、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を入れて３７℃恒温水槽で５分間反応させた。前記懸濁液にＤＰＢＳを入れ、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後に上澄液を除去した後、高グルコースＤＭＥＭ培地（１０％ ＦＢＳ、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）でペレットを再浮遊させて細胞懸濁液を製造した。製造された細胞懸濁液の細胞を計数した。また、前記細胞懸濁液をＴ１７５フラスコにシードし、３７℃及び二酸化炭素濃度５％条件である培養器で培養した。
１－２．脂肪由来中間葉幹細胞の分離及び培養
脂肪由来中間葉幹細胞はＬＯＮＺＡから購入した（Ｈｕｍａｎ Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｃａｔ＃ＰＴ－５００６，Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｓｓ）。前記購入した脂肪由来中間葉幹細胞は、ＬＯＮＺＡから提供する培養培地（Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ ＡＤＳＤ，Ｃａｔ＃ＰＴ－４５０５）を用いて培養した。
実施例２．神経球の形成
前記実施例１に記載された中間葉幹細胞を培養して神経球を形成した。具体的には、継代培養して継代数４～７の中間葉幹細胞を準備した。前記中間葉幹細胞の培養培地を除去した後、中間葉幹細胞をＤＰＢＳで洗浄した。洗浄された細胞にＴｒｙｐＬＥを処理して細胞を収穫し、収穫された細胞を計数した。収穫された細胞を遠心分離して上澄液を除去した後、神経球形成培地を入れて再浮遊させた。前記神経球形成培地の組成は、表２に示す。
神経球形成培地に再浮遊された細胞を、低付着表面ディッシュ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｄｉｓｈ）（６０ｍｍ）に１×１０６個シードした。シードされた細胞は、３７℃及び二酸化炭素濃度５％条件で３日間培養した。培養３日後に、ディッシュに生成された神経球を１５ｍｌチューブに収集した。収集された細胞を遠心分離後に上澄液を除去した後、新しい神経球形成培地を添加して再浮遊させ、神経球懸濁液を製造した。神経球懸濁液は低付着表面ディッシュに移した後、神経球を３７℃及び二酸化炭素濃度５％条件で４日間培養した。
実施例３．神経球を用いて神経再生促進細胞（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ，ＮＲＰＣ）候補細胞への分化
前記実施例２で生成された神経球を２３～２６Ｇ注射器針を用いて均一に粉砕した。粉砕された神経球はピペットを用いて１５ｍｌチューブに移した後、遠心分離後に上澄液を除去した。前記チューブに神経再生促進細胞誘導培地を添加した後、粉砕された神経球を再浮遊した。前記神経再生促進細胞誘導培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、１）５～２０％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）、２）５～２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、３）１００～４００μＭのブチルヒドロキシアニソール（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、４）５～４０μＭフォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ，ＭｅｄＣｈｅＥｘｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ）、５）０．１～１０％のＮ２補充剤（Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）、６）１～１００ｎｇ／ｍｌ脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、７）１～１００ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）、８）０．０１～１ｎｇ／ｍｌソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ，ＳＨＨ，Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、９）１～１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ，（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、１０）５０～３００ｎｇ／ｍｌのヘレグリンベータ１（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ－ｂｅｔａ １，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を３個以上組み合わせて様々な培地を作って利用した。
前記様々な培地で再浮遊された神経球は、ラミニン（２μｇ／ｍｌ）でコートされたＴ１７５フラスコに全てシードした。シードされた神経球は８～１０日間培養したし、３日間隔でそれぞれの神経再生促進細胞誘導培地を交換した（図１）。
実施例４．神経再生促進細胞候補細胞の末梢神経の髄鞘化（ｍｙｅｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）確認を用いた１次スクリーニング
前記実施例３で製造した神経再生促進細胞候補に対して、末梢神経の髄鞘化（ｍｙｅｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）機能があるかを確認した。具体的には、分化した候補神経再生促進細胞と後根神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ，ＤＲＧ）の共同培養による髄鞘化を確認するために、候補細胞と後根神経節を共同培養した。
ラット（Ｒａｔ）から分離した後根神経節（ＤＲＧ）細胞は、ＬＯＮＺＡから購入した（Ｒａｔ Ｄｏｒｓａｌ Ｒｏｏｔ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｃａｔ＃ Ｒ－ＤＲＧ－５０５，Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｓｓ）。該購入した後根神経節を候補細胞上に載せて共同培養させた。共同培養のために、前記ＤＲＧ細胞を購入したＬＯＮＺＡから提供する培養培地（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ（ＰＮＧＭ）、Ｃａｔ＃ ＣＣ－４４６１）を用いて培養した。
培養液は毎３日ごとに入れ換えた。前記候補細胞と後根神経節の共同培養過程によって一部の細胞で細胞形態学的に髄鞘化がなされていることを確認した（図１０）。
実施例５．神経再生促進細胞のＣＤマーカー発現分析を用いた２次スクリーニング
前記実施例４で髄鞘化を確認した神経再生促進細胞候補群のうち、細胞形態学的に髄鞘化が最もよくなされたＴ－ＭＳＣ－１－１（扁桃由来中間葉幹細胞１）、Ｔ－ＭＳＣ－１－２（扁桃由来中間葉幹細胞２）、Ｔ－ＭＳＣ－１－３（扁桃由来中間葉幹細胞３）、Ｔ－ＭＳＣ－１－４（扁桃由来中間葉幹細胞４）とそれらから分化した神経再生促進細胞に対して、総２４２個のＣＤマーカー発現を分析した。
ＣＤマーカー分析のために３×１０７個の目的細胞を収集した。ＤＰＢＳで目的細胞を洗浄した後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、ＤＰＢＳで１回反復洗浄した。遠心分離後に、３０ｍｌのＦＡＣＳバッファーでペレットを再浮遊させた。丸底の９６ウェルプレートを準備して細胞浮遊液を１００ｕｌ（１×１０５ｃｅｌｌ）ずつ各ウェルに分注した。ＣＤマーカーの１次抗体を９６ウェルプレートの各ウェルに１０ｕｌずつ添加した。遮光して氷の上で３０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーをウェル当たり１００ｕｌずつ分注して９６ウェルプレートを洗浄した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、ＦＡＣＳバッファーを各ウェルに２００ｕｌ添加後に、３００ｇで５分間遠心分離した。２次抗体を１：２００の比率（１．２５ｕｇ／ｍｌ）でＦＡＣＳバッファーに製造して準備した。遠心分離終了後に上澄液を除去した後、準備した２次抗体を各ウェルに１００ｕｌずつ添加した。遮光して氷の上で２０～３０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーを各ウェルに１００ｕｌ添加して洗浄した後、３００ｇで５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、ＦＡＣＳバッファーを各ウェルに２００ｕｌずつ添加して目的細胞を洗浄した。洗浄過程は２回反復した。洗浄過程後に、ＦＡＣＳバッファーを各ウェルに２００ｕｌずつ分注して細胞を再浮遊させた後、流細胞分析（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ又はＦＡＣＳ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）によって目的細胞からＣＤマーカーの発現を確認した。
誘導された神経再生促進細胞のＣＤマーカーの発現をヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）で比較した結果を図２に示す。図２に示すように、神経再生促進細胞（ＮＲＰＣｓ）及び中間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）はＣＤマーカーの発現パターンが類似しているが、一部のマーカーは発現パターンが異なっていることを確認した。
Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来の中間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）と神経再生促進細胞（ＮＲＰＣｓ）のＣＤマーカーの発現パターンを比較した結果、発現が増加又は減少したＣＤマーカーを神経再生促進細胞の分化マーカーとして利用する。前記発現が増加又は減少したＣＤマーカーは、図３に示す。
図３Ａに示すように、Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３、Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞において、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現が増加したＣＤマーカーは、ＣＤ１０、ＣＤ３９、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２、ＣＤ１２１ａ及びＣＤ３３８などがあったし（４つのＮＲＰＣのうち、少なくとも３つのＮＲＰＣで増加したマーカー）；図３Ｂに示すように、発現が減少したＣＤマーカーは、ＣＤ２６ＣＤ５４、ＣＤ１２６及びＣＤ１４１などがあった（４つのＮＲＰＣのうち、少なくとも３つのＮＲＰＣで減少したマーカー）。
前記扁桃由来神経再生促進細胞のＣＤマーカーの発現増加率及び減少率を比較した結果は、図４に示す。
図４に示すように、Ｔ－ＭＳＣ－１－１由来の神経再生促進細胞は、発現の増加したＣＤマーカーが１２個であり、発現の減少したＣＤマーカーは９個であることを確認した。また、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来の神経再生促進細胞は、発現の増加したＣＤマーカーが８個であり、発現の減少したＣＤマーカーが９個であることを確認した。Ｔ－ＭＳＣ－１－３由来の神経再生促進細胞は、発現の増加したＣＤマーカーが４０個であり、発現の減少したＣＤマーカーが３個であることを確認した。Ｔ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞は、発現の増加したＣＤマーカーが１７個であり、発現の減少したＣＤマーカーが６個であることを確認した。
前記結果から、Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３及びＴ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞の全てから、発現の増加又は減少したＣＤマーカーを選別した。選別されたマーカーは次の通りである：
－ 共通に発現が増加したＣＤマーカー：ＣＤ１０６、ＣＤ１１２、ＣＤ１２１ａ
－ 共通に発現が減少したＣＤマーカー：ＣＤ２６、ＣＤ１４１
前記共通に発現が増加したＣＤマーカー及び共通に発現が減少したＣＤマーカーのパターンは、実施例１－２の脂肪由来中間葉幹細胞から分化させた神経再生促進細胞においても同一に現れた。
Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３及びＴ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞の全てにおいて発現が増加又は減少したＣＤマーカーのＣＤスクリーニング結果をヒストグラムで図５に示す。
図５に示すように、神経再生促進細胞において共通に発現が増加したＣＤマーカーであるＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２は、分化後に発現率が１０％以上高くなることを確認した。一方、共通に発現が減少したマーカーＣＤ２６、ＣＤ１４１は、分化後に発現率が減少したし、減少率が約９％以上であることを確認した。前記結果は、共通に発現が変化されたマーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２、ＣＤ２６及びＣＤ１４１が神経再生促進細胞の分化マーカーとして用いられてよく、特に、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２が代表の分化マーカーとして用いられてよいことを意味する。
６－１．共発現マーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２の発現比較
マーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２は、Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３及びＴ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞において共通に、中間葉幹細胞と比較して発現が１０％以上増加したものであり、神経再生促進細胞の大きい特徴の一つである。そこで、Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３及びＴ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞においてマーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２を比較し、その結果を図６に示した。
図６に示すように、マーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２は、扁桃由来中間葉幹細胞（Ｔ－ＭＳＣｓ）に比べて神経再生促進細胞（ＮＲＰＣｓ）において発現が顕著に増加していることを確認した。
６－２．共発現マーカーＣＤ２６及びＣＤ１４１の発現比較
マーカーＣＤ２６及びＣＤ１４１は、Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３及びＴ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞において共通に発現が減少したＣＤマーカーである。前記Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｔ－ＭＳＣ－１－３及びＴ－ＭＳＣ－１－４由来の神経再生促進細胞において前記ＣＤマーカーの発現を比較し、その結果を図７に示した。
図７に示すように、神経再生促進細胞は、扁桃由来中間葉幹細胞に比べてＣＤ２６及びＣＤ１４１の発現が減少していることを確認した。
６－３．ＣＤマーカー発現パターン比較
扁桃由来中間葉幹細胞、神経再生促進細胞のＣＤマーカー発現パターンを比較するために、実施例６－１及び６－２で共発現ＣＤマーカーの発現を比較した結果に基づいてヒートマップを作成し、図８に示した。
図８に示すように、神経再生促進細胞は、扁桃由来中間葉幹細胞と比較して共発現マーカーの発現が異なっていることを確認した。
６－４．共発現ＣＤマーカーの平均発現
扁桃由来中間葉幹細胞、神経再生促進細胞のＣＤマーカーの発現パターンが細胞の凍結後にも同一であるかを比較するために、凍結前の生細胞である状態、凍結後に解凍された細胞、解凍した細胞を付着して培養した細胞において、例６－１、例６－２で共発現ＣＤマーカーの発現を確認し、共発現ＣＤマーカーの平均発現率結果を図１１に示した。
図１１に示すように、神経再生促進細胞は、凍結後にも扁桃由来中間葉幹細胞に比べてＣＤ１０６、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１１２の発現が増加し、ＣＤ２６、ＣＤ１４１の発現が減少していることを確認した。この結果から、凍結状態に関係なく神経再生促進細胞は扁桃由来中間葉幹細胞と比較して共発現マーカーの発現が異なることを確認した。
実施例７．本願発明の神経再生促進細胞の神経突起伸長（Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）効果
神経細胞体の樹状突起の１つが長く伸長した神経突起（ｎｅｕｒｉｔｅ又はｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ）は、軸索の成長再生に必要な物質又は伝達物質、神経成長因子などの輸送に関連していることが知られている（Ｌ ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅｐａｉｒ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ａｘｏｎ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ，２００１）。本願発明の神経再生促進細胞の神経突起の成長を測定して比較するために神経突起伸長アッセイ（Ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ）を行った。
上記の方法は、Ｎ１Ｅ－１１５（ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を培養し、微細な多孔性のフィルター（Ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ ｋｉｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）にシードする。シードした細胞を神経再生促進細胞、幹細胞から収集した培養液で４８時間培養し、微細な多孔性フィルターを透過して伸長された神経突起を染色して吸光度を測定した。神経突起伸長アッセイ（Ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ）を用いた神経突起検出方法により、本願発明の神経再生促進細胞の培養液からＮ１Ｅ－１１５（ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）の神経突起（軸索）成長を調節又は刺激することを確認することによって神経再生効果を確認した。
そこで、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来の神経再生促進細胞、扁桃由来幹細胞培養液から生長したＮ１Ｅ－１１５細胞の神経突起を比較し、その結果を図９に示した（ＮＲＰＣｓ：Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来の神経再生促進細胞、Ｔ－ＭＳＣｓ：Ｔ－ＭＳＣ－１－２、Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：陰性対照群、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：陽性対照群）。比較の結果、扁桃由来幹細胞に比べて神経再生促進細胞で多数の神経突起が観察されたし、吸光度測定の結果からも、神経再生促進細胞において扁桃幹細胞と比較して吸光度が高く増加することを確認した（－ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：多孔性フィルター（Ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ ｋｉｔに提供されるｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｓｅｒｔ）をＢＳＡでコートする。Ｎ１Ｅ－１１５細胞を培地（ＤＭＥＭ培地＋２０ｕｇ／ｍｌゲンタマイシン）に培養する。－ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ：多孔性フィルターをラミニンでコートする。Ｎ１Ｅ－１１５細胞を培地（ＤＭＥＭ培地＋２０ｕｇ／ｍｌゲンタマイシン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に培養する。－ ＮＲＰＣ、Ｔ－ＭＳＣ試験群：多孔性フィルターをＢＳＡでコートする。Ｎ１Ｅ－１１５細胞をそれぞれのＮＲＰＣ、Ｔ－ＭＳＣの培養液に培養する）。
実施例８．神経再生促進細胞のサイトカインアレイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ）分析
前記実施例４で髄鞘化が最もよくなされたＴ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２とそれらから分化した神経再生促進細胞に対して、５０７個のサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）発現を分析した。
サイトカイン分析のために目的細胞を培養した。目的細胞をフラスコに同一の細胞数でシードした後、３～４日間培養した。目的細胞が培養されているフラスコ面積が８０％以上到達した時に既存培養液を除去し、ＤＰＢＳで目的細胞を２回反復洗浄した。洗浄後、目的細胞の培養培地に含まれたサイトカインの影響を排除するために、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）、サイトカインなどが添加されていないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）培地に交換した。目的細胞を３０時間培養した後、目的細胞の培養液を収集した。
収集された培養液は３，６００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄液をセルロース膜（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）がある遠心管（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｔｕｂｅ）に移し、３，６００ｒｐｍで２０分間遠心分離して濃縮した。遠心分離後に分離膜を通過した条件培地は廃棄し、廃棄した条件培地の分だけの培養液を添加し、濃縮を続けた。濃縮された培養液が１ｍｌ以下になるまで遠心分離を持続し、完了した濃縮培養液はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイで定量した。濃縮された培養液はＤＭＥＭ培地を混合して最終濃度１ｍｇ／ｍｌにした。
５０７個のサイトカインを検出可能な抗体が塗布されているメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ Ｋｉｔ，ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）にブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を処理して３０分間反応させた。メンブレン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ）にあるブロッキングバッファーを除去し、濃縮された培養液に交換して冷蔵条件で一晩反応させた。メンブレンを洗浄バッファーで７回反復して洗浄した。メンブレンにＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて室温で２時間反応させた。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液を除去した後、メンブレンを洗浄バッファーで７回反復洗浄した。洗浄後に、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬（ｒｅｇｅｎｔ）を用いてメンブレンを濡らした後、ｉｍａｇｅｒ機器を用いてサイトカインの発現を確認した。
神経再生促進細胞のサイトカインの発現をヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）で比較した結果を図１２に示した。図１２に示すように、神経再生促進細胞と扁桃由来中間葉幹細胞は発現パターンが互いに異なっていることを確認した。
Ｔ－ＭＳＣ－１－１、Ｔ－ＭＳＣ－１－２由来の中間葉幹細胞及び神経再生促進細胞のサイトカインの発現を比較した結果、発現の増加したサイトカインは図１２の通りであった。
－ １．５倍以上：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－４、ＢＩＫ、ＢＭＰＲ－ＩＡ／ＡＬＫ－３、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ－１／ＨＣＣ－３、ＣＣＲ１、ＥＮ－ＲＡＧＥ、Ｅｏｔａｘｉｎ－３／ＣＣＬ２６、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＧＦ－１０／ＫＧＦ－２、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２１、Ｆｌｔ－３ Ｌｉｇａｎｄ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ－ｌｉｋｅ １、ＧＡＳＰ－１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ＧＣＰ－２／ＣＸＣＬ６、ＧＦＲ ａｌｐｈａ－３、ＧＲＥＭＬＩＮ、ＧＲＯ－ａ、ＨＧＦ 、ＨＲＧ－ｂｅｔａ １、Ｉ－３０９、ＩＣＡＭ－１、ＩＦＮ－ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ Ｒ２、ＩＧＦＢＰ－２、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＬ－４、ＩＬ－５ Ｒ ａｌｐｈａ、ＩＬ－１０ Ｒ ｂｅｔａ、ＩＬ－１ ２Ｒ ｂｅｔａ １、ＩＬ－１３ Ｒ ａｌｐｈａ ２、ＩＬ－２０ Ｒ ｂｅｔａ、ＩＬ－２２ ＢＰ、ＩＬ－２３ Ｒ、ＦＡＣＸ、ＬＩＦ、ＬＩＦ Ｒ ａｌｐｈａ、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－１、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ－２、ＬＲＰ－１、ＭＣＰ－４／ＣＣＬ１３、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＦＧ－Ｅ８、ＭＩＣＡ、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ－１ｄ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１６／ＭＴ３－ＭＭＰ、ＭＭＰ－２５／ＭＴ６－ＭＭＰ、ＮＡＰ－２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄ、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ３／ＴＳＧ－１４、Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ、ＰＦ４／ＣＸＣＬ４、ＰＬＵＮＣ、Ｐ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＥＬＭ ｂｅｔａ、ＲＯＢＯ４、Ｓ１００Ａ１０、ＳＡＡ、ＳＣＦ、ＳＩＧＩＲＲ、Ｓｍａｄ １、Ｓｍａｄ ５、Ｓｍａｄ ８、Ｐｒｄｘ６、Ｔａｒｃ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ－１、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ３、ＴＧＦ－ｂｅｔａ ５、Ｔｉｅ－２、ＴＩＭＰ－１、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ｕＰＡ
－ １．７５倍以上：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－４、ＢＩＫ、ＣＣＲ１、ＦＧＦ－２１、ＧＲＯ－ａ、ＨＧＦ、ＩＬ－１０Ｒ ｂｅｔａ、ＩＬ－１２Ｒ ｂｅｔａ １、ＭＣＰ－４／ＣＣＬ１３、ＭＩＰ－１ｂ、ＭＩＰ－１ｄ、ＮｅｕｒｏＤ１、ＰＤＧＦ－Ｃ、Ｐｒｄｘ６、ＴＩＭＰ－１、ｕＰＡ
－ ２倍以上：ＢＩＫ、ＧＲＯ－ａ、ＨＧＦ、ＭＣＰ－４／ＣＣＬ１３、ｕＰＡ
要するに、本発明者らは、扁桃及び脂肪由来中間葉幹細胞から神経再生促進細胞を製造し、そのＣＤマーカー分析によって発現パターンを確認した。また、前記神経再生促進細胞の神経再生効果を確認した。これは、医療廃棄物として捨てられていた扁桃組織から、神経再生効果がある細胞を製造できることを意味するところ、本発明の神経再生促進細胞は神経再生分野において多様に活用可能である。
以上、本発明の実施例について説明したが、当該技術の分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を様々に修正及び変更させることができ、それらも本発明の権利範囲内に含まれるといえよう。
扁桃由来中間葉幹細胞であるＴ－ＭＳＣ－１－１を神経再生促進細胞に誘導した場合の結果を日別に取った写真である。 ＣＤマーカースクリーニングによって本発明に係る神経再生促進細胞のＣＤマーカー発現をヒートマップで示した結果である。 神経再生促進細胞において、扁桃由来中間葉幹細胞と比較して発現量に差があるＣＤマーカーをスクリーニングした結果である。図３Ａは、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現量が増加したＣＤマーカーを、図３Ｂは、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現量が減少したＣＤマーカーを比較した結果である。 神経再生促進細胞において、扁桃由来中間葉幹細胞に比べて発現が増加したＣＤマーカー及び発現が減少したＣＤマーカーの発現パターンを比較した結果である。 神経再生促進細胞において共通に発現が増加又は減少したＣＤマーカーのスクリーニング結果を示すヒストグラムである。 神経再生促進細胞において共通に発現が増加したマーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２の発現様相を扁桃由来中間葉幹細胞と比較した結果である。 神経再生促進細胞において共通に発現が減少したマーカーＣＤ２６及びＣＤ１４１の発現様相を扁桃由来中間葉幹細胞と比較した結果である。 扁桃由来中間葉幹細胞（Ｔ－ＭＳＣｓ）、神経再生促進細胞（ＮＲＰＣｓ）のＣＤマーカー発現パターンを比較するために、ＣＤマーカーの発現を比較した結果をヒートマップで示す図である。 神経再生促進細胞の神経突起の成長を測定して比較するために神経突起伸長アッセイ（Ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙ）を行った結果である。 候補細胞と後根神経節の共同培養過程によって一部の細胞において細胞形態学的に髄鞘化がなされることを確認した結果である。 ＣＤスクリーニング（ＣＤ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）で選別された上方、下方調節されたＣＤマーカーを個別抗体を用いて流細胞分析した結果である。 Ｔ－ＭＳＣとＮＲＰＣで分析したサイトカインアレイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｒｒａｙ）分析結果をヒートマップで図式化した結果（左）と、Ｔ－ＭＳＣに対比してＮＲＰＣで共通に増加したサイトカインを比率別に区分した結果（右）を示す（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ：ＮＲＰＣ１－１／Ｔ－ＭＳＣ１－１、ＮＲＰＣ１－２／Ｔ－ＭＳＣ１－２）。

Claims (15)

  1. 下記の段階を含む中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）のスクリーニング方法：
    ｉ）中間葉幹細胞から分化した細胞を準備する段階；及び
    ｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて上方調節された（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階。
  2. 下記の段階を含む中間葉幹細胞由来の神経再生活性を有する神経再生促進細胞（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ）のスクリーニング方法：
    ｉ）中間葉幹細胞から分化した細胞を準備する段階；及び
    ｉｉ）前記段階ｉ）の分化した細胞のうち、ＣＤ２６及びＣＤ１４１からなる群から選ばれる１以上のマーカーが、分化前の中間葉幹細胞に比べて下方調節された（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞を選別する段階。
  3. 前記中間葉幹細胞は扁桃又は脂肪に由来することを特徴とする、請求項１又は２に記載の神経再生促進細胞のスクリーニング方法。
  4. 前記段階ｉ）の分化した細胞は、中間葉幹細胞を培養して神経球を形成した後、それを分化させたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の神経再生促進細胞のスクリーニング方法。
  5. 前記神経再生活性は、末梢神経の髄鞘化（ｍｙｅｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の神経再生促進細胞のスクリーニング方法。
  6. 請求項１又は２に記載のスクリーニング方法によってスクリーニングされた神経再生促進細胞であって、前記神経再生促進細胞は、下記の特徴を有する神経再生促進細胞：
    ａ）分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１２１ａ、ＣＤ１０６及びＣＤ１１２の発現が上方調節され；及び
    ｂ）分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ２６及びＣＤ１４１の発現が下方調節される。
  7. 前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１２１ａの発現が３０％以上上方調節されたことを特徴とする、請求項６に記載の神経再生促進細胞。
  8. 前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１０６の発現が５％以上上方調節されたことを特徴とする、請求項６に記載の神経再生促進細胞。
  9. 前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１１２の発現が１０％以上上方調節されたことを特徴とする、請求項６に記載の神経再生促進細胞。
  10. 前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ２６の発現が５％以上下方調節されたことを特徴とする、請求項６に記載の神経再生促進細胞。
  11. 前記神経再生促進細胞は、分化前の中間葉幹細胞と比較してマーカーＣＤ１４１の発現が５％以上下方調節されたことを特徴とする、請求項６に記載の神経再生促進細胞。
  12. 請求項６に記載の神経再生促進細胞を有効成分として含み、薬剤学的に許容される担体を含む、神経疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
  13. 前記神経疾患は、シャルコー・マリー・トゥース神経病症、糖尿病性末梢神経病症、脊髄損傷、筋萎縮側索硬化症、手根管症候群、小児痲痺、ハンセン病、筋ジストロフィー、多発性筋炎及び重症筋無力症からなる群から選ばれる１以上の疾患であることを特徴とする、請求項１２に記載の薬学的組成物。
  14. 請求項６に記載の神経再生促進細胞の有効量を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、神経疾患の治療方法。
  15. 請求項６に記載の神経再生促進細胞の神経疾患治療用途。

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