JP4147305B2 - ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原とこの表面抗原による細胞分離法 - Google Patents
ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原とこの表面抗原による細胞分離法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4147305B2 JP4147305B2 JP2004015682A JP2004015682A JP4147305B2 JP 4147305 B2 JP4147305 B2 JP 4147305B2 JP 2004015682 A JP2004015682 A JP 2004015682A JP 2004015682 A JP2004015682 A JP 2004015682A JP 4147305 B2 JP4147305 B2 JP 4147305B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- integrin
- surface antigen
- cd49f
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 124
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 title claims description 25
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 title claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 31
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 title 1
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 claims description 32
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 claims description 31
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 claims description 26
- 101001015006 Homo sapiens Integrin beta-4 Proteins 0.000 claims description 24
- 102100033000 Integrin beta-4 Human genes 0.000 claims description 24
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 23
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 23
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 20
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 claims description 19
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 17
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 17
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 claims description 15
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 claims description 14
- 108010075348 Activated-Leukocyte Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 13
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 claims description 13
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 102000000426 Integrin alpha6 Human genes 0.000 claims description 12
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 claims description 12
- JVJUWEFOGFCHKR-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl 1-(3,4-dimethylphenyl)cyclopentane-1-carboxylate;hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=C(C)C(C)=CC=1C1(C(=O)OCCN(CC)CC)CCCC1 JVJUWEFOGFCHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 101000798427 Gallus gallus Basigin Proteins 0.000 claims description 11
- 101000994378 Homo sapiens Integrin alpha-3 Proteins 0.000 claims description 11
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100032819 Integrin alpha-3 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 11
- 102000010803 Netrins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010063605 Netrins Proteins 0.000 claims description 11
- -1 Sca-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims description 11
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims description 11
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 10
- 108010022238 Integrin beta4 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000012334 Integrin beta4 Human genes 0.000 claims description 10
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 claims description 9
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 claims description 5
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 5
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 claims description 5
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 5
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 claims description 4
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100021747 Leukemia inhibitory factor receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 101710142062 Leukemia inhibitory factor receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 7
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 101001008874 Homo sapiens Mast/stem cell growth factor receptor Kit Proteins 0.000 description 4
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 3
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010072255 Integrin alpha3beta1 Proteins 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 3
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 2
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 2
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 2-[3-nitro-2-(2-nitrophenyl)-4-oxochromen-8-yl]acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(C(C=2[N+]([O-])=O)=O)=C1OC=2C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O QZDDFQLIQRYMBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150069931 Abcg2 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007470 Adenosine A2B Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010085273 Adenosine A2B receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000532370 Atla Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100022595 Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Human genes 0.000 description 1
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058590 CD47 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006355 CD47 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 101100351961 Caenorhabditis elegans pgp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000994369 Homo sapiens Integrin alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 description 1
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108060004056 Integrin alpha Chain Proteins 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 108010030465 Integrin alpha6beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 101500025418 Mus musculus Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108050000637 N-cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102100031900 Neogenin Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 108010074223 Netrin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000009065 Netrin-1 Human genes 0.000 description 1
- 229930187135 Olivomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101150114644 Rapgef3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006383 Type IV transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- CAWBRCOBJNWRLK-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[4-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-1h-indole-6-carboxylate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C=2NC3=CC(=CC=C3C=2)C(=O)OCOC(C)=O)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O CAWBRCOBJNWRLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTECHUXHORNEGZ-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 3',6'-bis(acetyloxymethoxy)-2',7'-bis[3-(acetyloxymethoxy)-3-oxopropyl]-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-5-carboxylate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(C(=O)OCOC(C)=O)=CC=C2C21C1=CC(CCC(=O)OCOC(C)=O)=C(OCOC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CCC(=O)OCOC(=O)C)C(OCOC(C)=O)=C1 NTECHUXHORNEGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108010036236 extracellular matrix receptor Proteins 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N fura-2-acetoxymethyl ester Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=CC2=C1OC(C=1OC(=CN=1)C(=O)OCOC(C)=O)=C2 VPSRLGDRGCKUTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004891 granulocyte-monocyte colony-forming unit Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- PNDZEEPOYCVIIY-UHFFFAOYSA-N indo-1 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C=2N=C3[CH]C(=CC=C3C=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 PNDZEEPOYCVIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000017777 integrin alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 1
- WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N murodermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=2NC=NC=2)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N2)C(C)C)=O)CSSC1)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 108010076969 neogenin Proteins 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- CZDBNBLGZNWKMC-MWQNXGTOSA-N olivomycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1)O[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@H](O)[C@H](OC)[C@H](C)O1 CZDBNBLGZNWKMC-MWQNXGTOSA-N 0.000 description 1
- 229950005848 olivomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003681 parotid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=CC(N)=C2)C2=[O+]C2=C1C=CC(N)=C2 TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原を利用した細胞の分離方法に関する。
再生医療に有用なポテンシャルを有する幹細胞についての研究が盛んになされている。今日までに報告された代表的な幹細胞として、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、並びに膵幹細胞が挙げられる。
間葉系幹細胞はヒト成体骨髄液より分離された（Pittenger, M.F. et al., Science 284, 143 (1999))。この細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞へのin vitroにおける分化誘導が可能である。神経幹細胞（Gage, P.H., Science 287, 1433-1438 (2000))については1992年に成体の中枢神経系からの最初の分離の報告がなされており、2001年には成体の皮膚真皮から神経細胞に分化可能な幹細胞の分離（Toma, J.G. et al., Nature Cell Biology, 3, 778-784 (2001))が報告されている。
造血幹細胞は既に多くの研究がなされているが、その分化機能について報告されたのは比較的新しい。1999年に骨髄細胞が肝細胞に分化することがPatersenらによって明らかにされ（Petersen B.E. et al., Science 284, 1168 (1999))、翌年にはマウス造血幹細胞をc-kittil、Thr-1low、Linneg、Sca-1+にてsortingした細胞分画が、幹細胞に分化転換することが示されている（Lagasse, E. et al., Nature Medicine 6, 1229-1234 (2000))。この他にも造血幹細胞には分化転換能があると考えられており、心筋（Orlic, D. et al., Nature 410, 701-705 (2001))や、さらには肺胞上皮、腸管上皮、皮膚（Orlic, D. et al.,上掲）への分化も報告されている。
以上のように、間葉系もしくは外胚葉系の細胞についての幹細胞研究は進んでいるが、内胚葉系幹細胞の報告は未だ少ない。ヒト肝幹細胞についてはその存在が確実視されているが、未だ確定的な幹細胞の報告はない。膵臓についてはCorneliusらのグループが成体マウス膵臓より膵島産生幹細胞(islet producing stem cells (IPSCs)）の分離を行っており、さらにIPSCsよりin vitroにて作製した膵島の移植実験を報告している（Ramiya, V.K. et al., Nature Medicine 6, 278-282 (2000))。この細胞についても、ａ、ｂ、ｄ細胞への分化は確認されているが、その他の細胞への分化能は確認されていない。膵島よりネスチン(nestin）陽性にて分離した幹細胞が膵臓の内、外分泌および肝臓の表現型へと分化したとの報告はあるが（Zulewski, H. et al., Diabetes 50, 521-533 (2001))、分化マーカーの免疫組織学的検索は示されていない。
Pittenger, M.F. et al., Science 284, 143 (1999)
Gage, P.H., Science 287, 1433-1438 (2000)
Toma, J.G. et al., Nature Cell Biology, 3, 778-784 (2001)
Petersen B.E. et al., Science 284, 1168 (1999)
Lagasse, E. et al., Nature Medicine 6, 1229-1234 (2000)
Orlic, D. et al., Nature 410, 701-705 (2001)
Ramiya, V.K. et al., Nature Medicine 6, 278-282 (2000)
Zulewski, H. et al., Diabetes 50, 521-533 (2001)
本発明は、ヒト又はマウス成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原を同定し、この表面抗原を用いた、内胚葉系幹細胞の簡便かつ効率的な分離法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヒト及びマウスの成体唾液腺由来の内胚葉系幹細胞の表面抗原について研究を行った結果、ヒト膵臓細胞に分化可能な細胞の特徴的な表面抗原はCD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、β2-microglobulinであることを同定し、またマウス膵臓細胞に分化可能な細胞の特徴的な表面抗原はCD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinであることを同定することに成功した。本発明で同定されたこれらの抗原の発現を指標とすることにより、膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を簡便かつ効率的に分離することが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、β2-microglobulinから成る群から選択される少なくとも１以上の表面抗原の発現を指標として、ヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法が提供される。
好ましくは、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、β2-microglobulinの全ての発現を指標とすることができる。
好ましくは、CD34、 CD38、CD45、CD133、CD11b/18、CD26、CD68、CD135、LIF-R、及びG-CSFRが発現が陰性であることをさらなる指標とすることができる。
好ましくは、CD34、 CD38、CD45、CD133、CD11b/18、CD26、CD68、CD135、LIF-R、及びG-CSFRが発現が陰性であることをさらなる指標とすることができる。
好ましくは、ヒト唾液腺由来の細胞混合物から、上記表面抗原の発現の有無を指標として、ヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離することができる。
好ましくは、フローサイトメトリーにより細胞を分離することができる。
好ましくは、フローサイトメトリーにより細胞を分離することができる。
本発明の別の側面によれば、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、及びβ2-microglobulinに対する抗体から成る群から選択される少なくとも１以上の抗体を含む、上記したヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法を行うための試薬キットが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、CD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinから成る群から選択される少なくとも１以上の表面抗原の発現を指標として、マウス由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法が提供される。
好ましくは、Sca-1の発現を指標とすることができる。
好ましくは、マウス唾液腺由来の細胞混合物から、上記表面抗原の発現の有無を指標として、マウス由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離することができる。
好ましくは、フローサイトメトリーにより細胞を分離することができる。
好ましくは、マウス唾液腺由来の細胞混合物から、上記表面抗原の発現の有無を指標として、マウス由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離することができる。
好ましくは、フローサイトメトリーにより細胞を分離することができる。
本発明のさらに別の側面によれば、CD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinに対する抗体から成る群から選択される少なくとも１以上の抗体を含む、上記したマウス由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法を行うための試薬キットが提供される。
本発明により、ヒト又はマウス成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原が同定された。本発明で同定された表面抗原を用いることにより、ヒト又はマウス成体の唾液腺並びにその他の臓器から、膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を簡便かつ効率的に分離することが可能になる。これにより、移植を受ける患者自身又は提供者から容易にこの幹細胞（即ち、膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞）を調製する方法が確立されることになる。本発明によるヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法は、膵臓再生などの再生医療に大いに貢献するものである。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、例えば、（１）ヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を含む細胞混合物（例えば、ヒト唾液腺由来の細胞混合物など）と、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、及びβ2-microglobulinから成る群から選択される少なくとも１以上（好ましくは少なくとも２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは４以上であり、抗原の種類は１種から１４種の任意の数とすることができる）の表面抗原に対する抗体とを、前記細胞上の前記表面抗原と前記抗体とが反応できる条件下で接触させる工程；及び（２）前記抗体に結合した前記細胞を前記細胞混合物から分離する工程、により行うことができる。
本発明の方法は、例えば、（１）ヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を含む細胞混合物（例えば、ヒト唾液腺由来の細胞混合物など）と、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、及びβ2-microglobulinから成る群から選択される少なくとも１以上（好ましくは少なくとも２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは４以上であり、抗原の種類は１種から１４種の任意の数とすることができる）の表面抗原に対する抗体とを、前記細胞上の前記表面抗原と前記抗体とが反応できる条件下で接触させる工程；及び（２）前記抗体に結合した前記細胞を前記細胞混合物から分離する工程、により行うことができる。
別の態様によれば、本発明の方法は、例えば、（１）マウス由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を含む細胞混合物（例えば、マウス唾液腺由来の細胞混合物など）と、CD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinから成る群から選択される少なくとも１以上（好ましくは少なくとも２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは４以上であり、抗原の種類は１種から８種の任意の数とすることができる）の表面抗原に対する抗体とを、前記細胞上の前記表面抗原と前記抗体とが反応できる条件下で接触させる工程；及び（２）前記抗体に結合した前記細胞を前記細胞混合物から分離する工程、により行うことができる。
以下、本発明でマーカーとして使用する各種抗原について説明する。
CD9: CD9は24kDaのtype IV膜貫通型タンパクであり、血小板、プレB細胞、単球、内皮細胞、上皮細胞に発現している。CD9分子はintegrinなどの他の細胞表面タンパクとも結合し、細胞接着、シグナル伝達、細胞運動などに関与している。
CD13: CD13(aminopeptidase N)は150kDaのtype II 膜貫通型タンパクであり、myeloid系の殆どの細胞に発現している。CD13はT及びBリンパ球、赤血球、血小板には発現していない。CD13は一部の上皮細胞、線維芽細胞、破骨細胞に発現している。CD13は正常骨髄に於いては、CFU-GM(granulocyte-monocyte colony forming units)に発現している。
CD29: CD29(integrinβ1)は130kDaのtype I 膜貫通型タンパクであり、CD49a, b, c, d, e, fと結合してVLA-1〜6までのheterodimer を形成する。インテグリンα鎖の種類により、発現の見られる細胞は異なっている。これらheterodimerを形成しているβ１インテグリンファミリーは、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリクスと結合する。
CD9: CD9は24kDaのtype IV膜貫通型タンパクであり、血小板、プレB細胞、単球、内皮細胞、上皮細胞に発現している。CD9分子はintegrinなどの他の細胞表面タンパクとも結合し、細胞接着、シグナル伝達、細胞運動などに関与している。
CD13: CD13(aminopeptidase N)は150kDaのtype II 膜貫通型タンパクであり、myeloid系の殆どの細胞に発現している。CD13はT及びBリンパ球、赤血球、血小板には発現していない。CD13は一部の上皮細胞、線維芽細胞、破骨細胞に発現している。CD13は正常骨髄に於いては、CFU-GM(granulocyte-monocyte colony forming units)に発現している。
CD29: CD29(integrinβ1)は130kDaのtype I 膜貫通型タンパクであり、CD49a, b, c, d, e, fと結合してVLA-1〜6までのheterodimer を形成する。インテグリンα鎖の種類により、発現の見られる細胞は異なっている。これらheterodimerを形成しているβ１インテグリンファミリーは、コラーゲン、ラミニン等の細胞外マトリクスと結合する。
CD44(hyaluronate receptor): CD44は80〜95kDaのtype I 膜貫通型タンパクであり、ヒアルロン酸の受容体であるphagocyte glycoprotein-1(Pgp-1)として知られている。CD44は赤血球、白血球、上皮細胞に発現している。またIII型細胞外マトリクス受容体であり、細胞遊走やリンパ球のホーミングに機能的な役割を果たしている。
CD49f(integrin α6)：CD49fはintegrin α6とも称され、CD29と二量体を形成する膜タンパク質である。CD29と二量体を形成したCD49fは、細胞外マトリックスであるラミニンの受容体（VLA-6）として知られている。T細胞、血小板、単球、上皮細胞、内皮細胞、胎盤のトロホブラスト、胎児期の唾液腺原基を構成する未分化上皮細胞、胎児肝細胞などで発現している。
CD90(Thy-1): CD90は18kDaの細胞表面糖タンパクである。骨髄のCD34陽性を示す造血幹細胞に発現している。また神経細胞の一部、肝臓の前駆細胞にも発現が見られる。
CD49f(integrin α6)：CD49fはintegrin α6とも称され、CD29と二量体を形成する膜タンパク質である。CD29と二量体を形成したCD49fは、細胞外マトリックスであるラミニンの受容体（VLA-6）として知られている。T細胞、血小板、単球、上皮細胞、内皮細胞、胎盤のトロホブラスト、胎児期の唾液腺原基を構成する未分化上皮細胞、胎児肝細胞などで発現している。
CD90(Thy-1): CD90は18kDaの細胞表面糖タンパクである。骨髄のCD34陽性を示す造血幹細胞に発現している。また神経細胞の一部、肝臓の前駆細胞にも発現が見られる。
CD104(integrinβ4): CD104は205kDaの膜タンパクであり、CD49f(integrinα6)と結合して、CD49f/CD104複合体を形成する。CD104は上皮細胞、シュワン細胞に発現している。またCD49f/CD104複合体は上皮のヘミスモゾームに発現しており、表皮と基底膜の結合に関与している。
CD105(endogrin): CD105は95kDaのサブユニットのhomodimerにより形成される膜タンパクであり、血管内皮細胞や胎盤のsyncytiotrophoblastsに発現している。またCD105はヒト臍帯静脈内皮細胞ではTGF-β受容体システムの構成要素の一つでもあり、高い親和性にてTGF-β１及びβ３と結合する。CD105の発現は腫瘍もしくは創傷治癒部等の血管形成部位に於ける組織の活性化内皮細胞にて発現が上昇している。
CD106(VCAM-1): CD106は100-110kDaのtype I 糖タンパクである。サイトカインで刺激を受けた活性化内皮細胞の表面に高レベルで発現しており、VCAM-1(vascular cell adhesion molecule)として知られている。VCAM-1はインテグリンα４β１(VLA-4)と結合する。骨髄ストロマ細胞、濾胞樹状細胞（脾臓）にも発現している。リンパ球の浸潤、B細胞の分化に関与している。
CD105(endogrin): CD105は95kDaのサブユニットのhomodimerにより形成される膜タンパクであり、血管内皮細胞や胎盤のsyncytiotrophoblastsに発現している。またCD105はヒト臍帯静脈内皮細胞ではTGF-β受容体システムの構成要素の一つでもあり、高い親和性にてTGF-β１及びβ３と結合する。CD105の発現は腫瘍もしくは創傷治癒部等の血管形成部位に於ける組織の活性化内皮細胞にて発現が上昇している。
CD106(VCAM-1): CD106は100-110kDaのtype I 糖タンパクである。サイトカインで刺激を受けた活性化内皮細胞の表面に高レベルで発現しており、VCAM-1(vascular cell adhesion molecule)として知られている。VCAM-1はインテグリンα４β１(VLA-4)と結合する。骨髄ストロマ細胞、濾胞樹状細胞（脾臓）にも発現している。リンパ球の浸潤、B細胞の分化に関与している。
CD165: CD165は37〜42kDaの膜タンパクであり、末梢血のリンパ球、単球、未熟胸腺細胞、血小板、膵臓ランゲルハンス島細胞、腎臓ボーマン嚢細胞、神経細胞に発現している。また胸腺上皮細胞に発現している。胸腺細胞と胸腺上皮細胞の接着に関与している。
CD166(ALCAM): CD166(activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM))は100-105kDaの膜タンパクであり、CD６のリガンドである。ALCAMは免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、神経細胞、活性化T細胞、活性化単球、上皮細胞、線維芽細胞に発現している。CD166は胸腺上皮細胞とCD6陽性細胞の相互接着に重要である。
CD147(neurothelin): CD147は30-50kDaの膜タンパクであり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属している。Neurothelinは血液−脳関門(Blood brain barrier)に特異的な分子である。またCD147は胎児の血液−脳関門の発達にも関与している。
CD166(ALCAM): CD166(activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM))は100-105kDaの膜タンパクであり、CD６のリガンドである。ALCAMは免疫グロブリンスーパーファミリーに属しており、神経細胞、活性化T細胞、活性化単球、上皮細胞、線維芽細胞に発現している。CD166は胸腺上皮細胞とCD6陽性細胞の相互接着に重要である。
CD147(neurothelin): CD147は30-50kDaの膜タンパクであり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属している。Neurothelinは血液−脳関門(Blood brain barrier)に特異的な分子である。またCD147は胎児の血液−脳関門の発達にも関与している。
low affinity NGF-R (p75NGFR): nerve growth factor receptor (NGFR) p75は75kDaのタンパクであり、神経細胞軸索、シュワン細胞、末梢神経の傍神経細胞に発現が見られる。また一部の上皮、間葉細胞、リンパ組織で発現している。脾臓、リンパ節のリンパ系細胞、濾胞樹状細胞にもp75の発現が見られる。
β2-microglobulin: β2-microglobulinは12kDaのβ鎖であり、44kDaのα鎖と結合してHLA class I 複合体を形成する。
CD47: CD47は47-52kDaの接着分子であり、CD47抗原はインテグリン関連タンパク(IAP)として知られている。造血細胞、白血球、血小板、赤血球に発現している。カチオンの細胞内流入を調節する事によるシグナル伝達に関与している。
β2-microglobulin: β2-microglobulinは12kDaのβ鎖であり、44kDaのα鎖と結合してHLA class I 複合体を形成する。
CD47: CD47は47-52kDaの接着分子であり、CD47抗原はインテグリン関連タンパク(IAP)として知られている。造血細胞、白血球、血小板、赤血球に発現している。カチオンの細胞内流入を調節する事によるシグナル伝達に関与している。
CD49c: CD49cは150kDaのtype I 膜タンパクであり、CD29(integrin β1)と結合してVLA-3(integrin α３β１)を形成する。インテグリンα３β１のリガンドとしてラミニン５、１型、４型コラーゲン、フィブロネクチンがある。多くの上皮細胞、線維芽細胞、活性化リンパ球にて発現している。
Sca-1: Sca-1(Ly6-A/E)は、18kDaのphosphatidylinositol-anchoredタンパクであり、マウス骨髄の造血幹細胞に発現している。Ly-6A/Eは骨髄及び末梢血のBリンパ球、胸腺及び末梢血のTリンパ球の一部に発現している。
Netrin: Netrinはラミニン関連分泌タンパクのファミリーの一つであり、発生期に於ける細胞遊走や軸索伸長のガイダンスに必要である。Netrin-1の発現は、発生期に於ける神経系及び間葉系の組織に於いて広範に見られる。
Sca-1: Sca-1(Ly6-A/E)は、18kDaのphosphatidylinositol-anchoredタンパクであり、マウス骨髄の造血幹細胞に発現している。Ly-6A/Eは骨髄及び末梢血のBリンパ球、胸腺及び末梢血のTリンパ球の一部に発現している。
Netrin: Netrinはラミニン関連分泌タンパクのファミリーの一つであり、発生期に於ける細胞遊走や軸索伸長のガイダンスに必要である。Netrin-1の発現は、発生期に於ける神経系及び間葉系の組織に於いて広範に見られる。
上記した各種表面抗原に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体の何れでもよく、当業者であれば常法により容易に取得可能であり、また各種の市販品の抗体を使用することもできる。
本発明の方法は、好ましくはフローサイトメトリーで行うことができる。フローサイトメトリーは、細胞を浮遊液にし、高速でフローセル中を通過させ、光学的な手法によって細胞の計測を行う方法である。フローサイトメトリーでは、蛍光色素によって細胞を染色することが必要であり、試料が微細管を通過する過程で発する蛍光を高感度検出器によって測定する。即ち、フローサイトメトリー では、通常、数十μｍ〜数百μｍ内径程度の微細な管状のフローセルに被検液を流しながらこれに励起光を照射し、流動する被検液中で発せられる蛍光を受光し検出する。
フローサイトメトリーで細胞の蛍光発光を検出・測定する場合、上記した各種抗体は、蛍光標識物質で標識した標識抗体として使用することが好ましい。本発明で用いる蛍光標識物質の種類は、フローサイトメトリー で検出できるものであれば特に限定されず、例えば、フィコエリスリン、ＦＩＴＣが挙げられるが、この他にも、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、ヘキスト33258/33342、DAPI、アクリジンオレンジ、クロモマイシン、ミトラマイシン、オリボマイシン、パイロニンY 、チアゾールオレンジ、ローダミン101 イソチオシアネート、BCECF 、BCECF-AM、C.SNARF-1 、C.SNARF-1-AMA 、エクオリン、Indo-1、Indo-1-AM 、Fluo-3、Fluo-3-AM 、Fura-2、Fura-2-AM 、オキソノール、ローダミン123 、 10-N-ノニ−アクリジンオレンジ、フルオレセイン、フルオレセインジアセテート、カルボキシフルオレセイン(CF)、カルボキシフルオレセインジアセテート (CFDA)、カルボキシジクロロフルオレセイン(CDCF)、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート(CDCFDA)などが挙げられる。
フローサイトメトリー で検出する時に用いる蛍光標識抗体は、抗体に直接上記蛍光物質を結合させてもよいし、抗体にはビオチンを標識しておき、蛍光物質にはアビジンを結合させてもよい。
本発明の方法により単離されることができる膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞は、例えば、再生医療のために患者に移植することができる。再生医療のために細胞を患者に移植する場合、移植による拒絶反応を防止する観点から、患者自身の細胞を移植することが最も好ましい。本発明の方法では、ヒト成体から細胞を取得することができるので、移植を受ける患者自身から、膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を単離することができ、移植するのに非常に有利である。
本発明の方法により単離されることができる膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞は、膵臓に分化することができるので、該細胞を移植して膵臓の再生を行うことが可能である。本発明の方法により単離されることができる膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞の移植は、該細胞の浮遊液を患者に注入することにより容易に行うことができる。注入は、膵臓又はその近傍、又は静脈内等に対して行うことができる。また、注入する細胞の数は特に限定されず、症状や患者の体重、投与方法等に応じて適宜設定することができるが、通常は１０2から１０10個程度である。
本発明は、膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法で使用するためのキットにも関する。該キットは、膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を直接分離するために使用することができる抗体を含む。即ち、本発明のキットには、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、及びβ2-microglobulinに対する抗体から成る群から選択される少なくとも１以上の抗体、又はCD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinに対する抗体から成る群から選択される少なくとも１以上の抗体を含む。抗体は適当な担体などに固定化された固定化抗体でもよいし、適当な標識物質で標識された標識抗体でもよい。また、キットには、本発明により分離方法を実施するのに必要な補助試薬（例えば、二次抗体、検出試薬、緩衝液など）を含めることもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：
（１）ヒト唾液腺由来前駆細胞のFACS法による分離と初代培養
材料として頚部手術時に廃棄される患者検体を使用した。患者にはinformed consent を行い、同意の得られた患者からのみ検体を採取した。唾液腺は顎下腺もしくは耳下腺を使用した。HBV, HCV, HIV, ATLA全て陰性であり、頚部への放射線照射歴のない患者の検体を細胞分離に用いた。唾液腺は剪刀にて細切し、collagenase／hyaluronidase／dispase 消化後に細胞分散液を得た。ほぼ単一に分散された細胞はFITC-conjugated 抗ヒト CD49f 抗体 (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) で 4℃、20分間インキュベーションした。3回染色用 バッファーで洗浄した後、APC-conjugated抗ヒト CD90 抗体 (BD PharMingen) で 4℃、20分間インキュベーションした。細胞は再度3回染色用バッファーで洗浄し、染色用bufferに懸濁した。 ラベルした細胞は、FACS Vantage SE (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を使用して細胞分離を行った。 FACS解析時には、唾液腺細胞分散液は、前方散乱光と側方散乱光によりゲートをかけ、小型で顆粒の少ない細胞を選択した。さらにCD49fとCD90の染色パターンにより4つの分画に分けた。即ち CD49f-/CD90- (43.12±3.81%)、CD49f+/CD90- (50.48±3.19%)、CD49f-/CD90+ (4.37±0.36%)、CD49f+/CD90+ (2.03±0.77%) の4分画である。この内、CD49f+/CD90+ 分画の細胞のみをセルソーターにて分離した。分離された細胞は、タイプ１コラーゲンコート培養皿に播いて初代培養を開始した。初代培養開始時の細胞密度は、0.5~1.0x106cells/100mm dishである。初代培養には以下の組成の培地を使用した。即ち、イスコヴ改変ダルベッコ培地(Iscove's modified Dulbecco's Medium (Invitrogen)) に20ng/ml 組み換えヒト表皮成長因子(recombinant human epidermal growth factor (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))、20ng/ml 組み換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子(recombinant human fibroblast growth factor basic (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN))、 10ng/ml 組み換えヒト血小板由来成長因子(recombinant human platelet derived growth factor-AA (R&D))、1% N-2 添加物(N-2 supplement (Invitrogen))、 10mM ニコチン酸アミド(nicotinamide (Sigma))を添加した培地である。
（１）ヒト唾液腺由来前駆細胞のFACS法による分離と初代培養
材料として頚部手術時に廃棄される患者検体を使用した。患者にはinformed consent を行い、同意の得られた患者からのみ検体を採取した。唾液腺は顎下腺もしくは耳下腺を使用した。HBV, HCV, HIV, ATLA全て陰性であり、頚部への放射線照射歴のない患者の検体を細胞分離に用いた。唾液腺は剪刀にて細切し、collagenase／hyaluronidase／dispase 消化後に細胞分散液を得た。ほぼ単一に分散された細胞はFITC-conjugated 抗ヒト CD49f 抗体 (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) で 4℃、20分間インキュベーションした。3回染色用 バッファーで洗浄した後、APC-conjugated抗ヒト CD90 抗体 (BD PharMingen) で 4℃、20分間インキュベーションした。細胞は再度3回染色用バッファーで洗浄し、染色用bufferに懸濁した。 ラベルした細胞は、FACS Vantage SE (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を使用して細胞分離を行った。 FACS解析時には、唾液腺細胞分散液は、前方散乱光と側方散乱光によりゲートをかけ、小型で顆粒の少ない細胞を選択した。さらにCD49fとCD90の染色パターンにより4つの分画に分けた。即ち CD49f-/CD90- (43.12±3.81%)、CD49f+/CD90- (50.48±3.19%)、CD49f-/CD90+ (4.37±0.36%)、CD49f+/CD90+ (2.03±0.77%) の4分画である。この内、CD49f+/CD90+ 分画の細胞のみをセルソーターにて分離した。分離された細胞は、タイプ１コラーゲンコート培養皿に播いて初代培養を開始した。初代培養開始時の細胞密度は、0.5~1.0x106cells/100mm dishである。初代培養には以下の組成の培地を使用した。即ち、イスコヴ改変ダルベッコ培地(Iscove's modified Dulbecco's Medium (Invitrogen)) に20ng/ml 組み換えヒト表皮成長因子(recombinant human epidermal growth factor (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))、20ng/ml 組み換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子(recombinant human fibroblast growth factor basic (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN))、 10ng/ml 組み換えヒト血小板由来成長因子(recombinant human platelet derived growth factor-AA (R&D))、1% N-2 添加物(N-2 supplement (Invitrogen))、 10mM ニコチン酸アミド(nicotinamide (Sigma))を添加した培地である。
（２）ヒト唾液腺由来前駆細胞の表面抗原の検索
培養細胞はトリプシン-EDTA (Invitrogen) 処理して培養皿より回収した。細胞は、染色用バッファーにて３回洗浄し、各種の１次抗体とインキュベーションを行った。 使用した１次抗体は以下の通りである。マウス IgG1 アイソタイプコントロール、 CD9、CD11b/18、CD13、CD26、CD29-Phycoerythrin、CD38、 CD44s、CD45、CD49f、CD68、CD90-APC、CD104、CD105、CD106、CD117、CD147、CD166、β2-microglobulin-Phycoerythrin (BD PharMingen)、CD130、NGFR(p75)、LIF-R、G-CSFR、CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Germany)、 ABCG2/BCRP1 (eBioscience, San Diego, CA)、CD34-FITC (SantaCruz Biotechnology, Inc., SantaCruz, CA)である。二次抗体としてアレクサ488-conjugated 抗マウスIgG、もしくは抗ラットIgGを使用した。細胞は洗浄用バッファーで３回洗浄し、FACS caliber (BD Biosciences)を用いて解析を行った。VIA-PROBE (BD PharMingen) は死細胞除去のために使用した。
培養細胞はトリプシン-EDTA (Invitrogen) 処理して培養皿より回収した。細胞は、染色用バッファーにて３回洗浄し、各種の１次抗体とインキュベーションを行った。 使用した１次抗体は以下の通りである。マウス IgG1 アイソタイプコントロール、 CD9、CD11b/18、CD13、CD26、CD29-Phycoerythrin、CD38、 CD44s、CD45、CD49f、CD68、CD90-APC、CD104、CD105、CD106、CD117、CD147、CD166、β2-microglobulin-Phycoerythrin (BD PharMingen)、CD130、NGFR(p75)、LIF-R、G-CSFR、CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Germany)、 ABCG2/BCRP1 (eBioscience, San Diego, CA)、CD34-FITC (SantaCruz Biotechnology, Inc., SantaCruz, CA)である。二次抗体としてアレクサ488-conjugated 抗マウスIgG、もしくは抗ラットIgGを使用した。細胞は洗浄用バッファーで３回洗浄し、FACS caliber (BD Biosciences)を用いて解析を行った。VIA-PROBE (BD PharMingen) は死細胞除去のために使用した。
（３）表面抗原検索結果
単層培養に於けるヒト-SGP細胞についてフローサイトメトリー検索を行った。前方散乱光及び、側方散乱光のパターンから、ヒト-SGP細胞はほぼ均一な細胞集団であると考えられた。細胞は、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、β2-microglobulin陽性であった。CD49f及びCD90 の発現は特に強度であった。 CD130 (gp130) は弱陽性であった。造血系のマーカーであるCD34、CD38、CD45と、神経幹細胞のマーカーであるCD133は陰性であった。またCD11b/18、CD26、CD68、CD135、LIF-R、G-CSFR陰性であった。1%未満の細胞はCD117 (c-kit) 及びABCG2 (ATP-Binding cassette G2)に陽性を示した。ヒトSGP細胞の表面抗原検索の結果を図１に示す。
単層培養に於けるヒト-SGP細胞についてフローサイトメトリー検索を行った。前方散乱光及び、側方散乱光のパターンから、ヒト-SGP細胞はほぼ均一な細胞集団であると考えられた。細胞は、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、β2-microglobulin陽性であった。CD49f及びCD90 の発現は特に強度であった。 CD130 (gp130) は弱陽性であった。造血系のマーカーであるCD34、CD38、CD45と、神経幹細胞のマーカーであるCD133は陰性であった。またCD11b/18、CD26、CD68、CD135、LIF-R、G-CSFR陰性であった。1%未満の細胞はCD117 (c-kit) 及びABCG2 (ATP-Binding cassette G2)に陽性を示した。ヒトSGP細胞の表面抗原検索の結果を図１に示す。
実施例２：
（１）マウス唾液腺由来前駆細胞のFACS法による分離と初代培養
マウスはC57Black6背景の週令５〜６週のオスを用いた。用いる唾液腺は総排出管結紮６日後の顎下腺とした。ジエチルエーテルを用い吸入麻酔した後に、頸部を正中切開し、両側顎下腺を剥離し、顎下腺総排泄管を二重結紮した。導管結紮６日後に顎下腺を摘出した。顎下線は剪刀にて細切し、collagenase／hyaluronidase／dispase 消化後に細胞分散液を得た。ほぼ単一に分散された細胞は抗マウスSca-1抗体 (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)、RPE-conjugated抗マウス CD117/c-Kit 抗体 (BD PharMingen) を用い 4℃、20分間インキュベーションし、３回染色用バッファーを用い洗浄後、FITC-conjugated抗ラットIgG抗体（BD Pharmingen）を用い４℃、２０分間インキュベーションした。細胞は再度3回染色用バッファーで洗浄し、染色用bufferに懸濁した。 ラベルした細胞は、FACS Vantage SE (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を使用して細胞分離を行った。 FACS解析時には、唾液腺細胞分散液は、前方散乱光と側方散乱光によりゲートをかけ、小型で顆粒の少ない細胞を選択した。さらにSca-1とc-Kitの染色パターンにより4つの分画に分けた。即ち Sca-1-/c-Kit-、Sca-1+/c-Kit-、Sca-1-/c-Kit+、Sca-1+/c-Kit+の4分画である。この内、Sca-1+/c-Kit+ 分画（0.68 +/- 0.07 %）の細胞のみをセルソーターにて分離した。分離された細胞は、タイプ１コラーゲンコート培養皿に播いて初代培養を開始した。初代培養開始時の細胞密度は、1.0x106cells/100mm dishである。初代培養には以下の組成の培地を使用した。即ち、ウイリアムズＥ培地(Williams' Medium E (Invitrogen)) に20ng/ml マウス表皮成長因子(mouse epidermal growth factor (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))、 10mM ニコチン酸アミド(nicotinamide (Sigma))、1x Non Essential Amino Acid Solution (Invitrogen)、 1x Insulin-Transferrin-Selenium-X（Invitrogen）を添加した培地である。 ３日に一度、メディウム交換を行った。得られた細胞のほとんどはpolygonalな形態の上皮様細胞であり、限界希釈法を用いて単一細胞から再増殖してきたマウス顎下腺由来細胞を６系列樹立した。その６つの細胞群は形態、増殖能、アルブミン産生細胞・インスリン産生細胞への分化能が等しく、以後そのうちの一つをマウス唾液腺由来前駆細胞-1（mSGP-1）として、実験を進めた。
（１）マウス唾液腺由来前駆細胞のFACS法による分離と初代培養
マウスはC57Black6背景の週令５〜６週のオスを用いた。用いる唾液腺は総排出管結紮６日後の顎下腺とした。ジエチルエーテルを用い吸入麻酔した後に、頸部を正中切開し、両側顎下腺を剥離し、顎下腺総排泄管を二重結紮した。導管結紮６日後に顎下腺を摘出した。顎下線は剪刀にて細切し、collagenase／hyaluronidase／dispase 消化後に細胞分散液を得た。ほぼ単一に分散された細胞は抗マウスSca-1抗体 (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA)、RPE-conjugated抗マウス CD117/c-Kit 抗体 (BD PharMingen) を用い 4℃、20分間インキュベーションし、３回染色用バッファーを用い洗浄後、FITC-conjugated抗ラットIgG抗体（BD Pharmingen）を用い４℃、２０分間インキュベーションした。細胞は再度3回染色用バッファーで洗浄し、染色用bufferに懸濁した。 ラベルした細胞は、FACS Vantage SE (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)を使用して細胞分離を行った。 FACS解析時には、唾液腺細胞分散液は、前方散乱光と側方散乱光によりゲートをかけ、小型で顆粒の少ない細胞を選択した。さらにSca-1とc-Kitの染色パターンにより4つの分画に分けた。即ち Sca-1-/c-Kit-、Sca-1+/c-Kit-、Sca-1-/c-Kit+、Sca-1+/c-Kit+の4分画である。この内、Sca-1+/c-Kit+ 分画（0.68 +/- 0.07 %）の細胞のみをセルソーターにて分離した。分離された細胞は、タイプ１コラーゲンコート培養皿に播いて初代培養を開始した。初代培養開始時の細胞密度は、1.0x106cells/100mm dishである。初代培養には以下の組成の培地を使用した。即ち、ウイリアムズＥ培地(Williams' Medium E (Invitrogen)) に20ng/ml マウス表皮成長因子(mouse epidermal growth factor (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO))、 10mM ニコチン酸アミド(nicotinamide (Sigma))、1x Non Essential Amino Acid Solution (Invitrogen)、 1x Insulin-Transferrin-Selenium-X（Invitrogen）を添加した培地である。 ３日に一度、メディウム交換を行った。得られた細胞のほとんどはpolygonalな形態の上皮様細胞であり、限界希釈法を用いて単一細胞から再増殖してきたマウス顎下腺由来細胞を６系列樹立した。その６つの細胞群は形態、増殖能、アルブミン産生細胞・インスリン産生細胞への分化能が等しく、以後そのうちの一つをマウス唾液腺由来前駆細胞-1（mSGP-1）として、実験を進めた。
（２）マウス唾液腺由来前駆細胞の表面抗原
培養細胞はトリプシン-EDTA (Invitrogen) 処理して培養皿より回収した。細胞は、染色用バッファーにて３回洗浄し、各種の１次抗体とインキュベーションを行った。 使用した１次抗体は以下の通りである。ラットIgG1アイソタイプコントロール、CD11b、CD29、CD34-FITC、CD44s、CD45、CD47、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD61、CD90.1、CD104、CD117、CD140a、Flk-1、Sca-1 (BD PharMingen)、E-cadherin、P-cadherin、N-cadherin、DCC、Neogenin、Adenosine A2b receptor、Netrin、Mdr-1、Met、Epac（Santa Cruz Biotechnology）である。二次抗体としてアレクサ488-conjugated 抗ラビットIgG、抗ヤギIgGもしくは抗ラットIgGを使用した。細胞は洗浄用バッファーで３回洗浄し、FACS caliber (BD Biosciences)を用いて解析を行った。VIA-PROBE (BD PharMingen) は死細胞除去の為に使用した。
培養細胞はトリプシン-EDTA (Invitrogen) 処理して培養皿より回収した。細胞は、染色用バッファーにて３回洗浄し、各種の１次抗体とインキュベーションを行った。 使用した１次抗体は以下の通りである。ラットIgG1アイソタイプコントロール、CD11b、CD29、CD34-FITC、CD44s、CD45、CD47、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD61、CD90.1、CD104、CD117、CD140a、Flk-1、Sca-1 (BD PharMingen)、E-cadherin、P-cadherin、N-cadherin、DCC、Neogenin、Adenosine A2b receptor、Netrin、Mdr-1、Met、Epac（Santa Cruz Biotechnology）である。二次抗体としてアレクサ488-conjugated 抗ラビットIgG、抗ヤギIgGもしくは抗ラットIgGを使用した。細胞は洗浄用バッファーで３回洗浄し、FACS caliber (BD Biosciences)を用いて解析を行った。VIA-PROBE (BD PharMingen) は死細胞除去の為に使用した。
（３）表面抗原検索結果
単層培養に於けるmSGP細胞についてフローサイトメトリー検索を行った。前方散乱光及び、側方散乱光のパターンから、mSGP細胞はほぼ均一な細胞集団であると考えられた。 細胞はCD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1、Netrinが陽性であった。Sca-1 の発現は特に強度であった。マウスSGP細胞の表面抗原検索の結果を図２に示す。
単層培養に於けるmSGP細胞についてフローサイトメトリー検索を行った。前方散乱光及び、側方散乱光のパターンから、mSGP細胞はほぼ均一な細胞集団であると考えられた。 細胞はCD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1、Netrinが陽性であった。Sca-1 の発現は特に強度であった。マウスSGP細胞の表面抗原検索の結果を図２に示す。
Claims (7)
- ヒト唾液腺由来の細胞混合物から、CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、β2-microglobulinの全ての発現を指標として、ヒト由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法。
- CD34、 CD38、CD45、CD133、CD11b/18、CD26、CD68、CD135、LIF-R、及びG-CSFRが発現が陰性であることをさらなる指標とする、請求項１に記載の方法。
- フローサイトメトリーにより細胞を分離する、請求項１又は２に記載の方法。
- CD9、CD13、CD29(integrin β1)、CD44 (hyaluronate receptor)、CD49f(integrin α6)、CD90(Thy-1), CD104(integrin β4)、CD105(endogrin)、CD106(VCAM-1)、CD165、CD166(ALCAM)、CD147(neurothelin)、low affinity NGF-R p75NGFR 、及びβ2-microglobulinに対する抗体を含む、請求項１から３の何れかに記載の方法を行うための試薬キット。
- マウス唾液腺由来の細胞混合物から、CD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinの全ての発現を指標として、マウス由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞を分離する方法。
- フローサイトメトリーにより細胞を分離する、請求項５に記載の方法。
- CD29、CD44、CD47、CD49c、CD49f、CD104、Sca-1及びNetrinに対する抗体を含む、請求項５又は６に記載の方法を行うための試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004015682A JP4147305B2 (ja) | 2004-01-23 | 2004-01-23 | ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原とこの表面抗原による細胞分離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004015682A JP4147305B2 (ja) | 2004-01-23 | 2004-01-23 | ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原とこの表面抗原による細胞分離法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005204590A JP2005204590A (ja) | 2005-08-04 |
| JP4147305B2 true JP4147305B2 (ja) | 2008-09-10 |
Family
ID=34901083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004015682A Expired - Lifetime JP4147305B2 (ja) | 2004-01-23 | 2004-01-23 | ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原とこの表面抗原による細胞分離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4147305B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022154474A1 (ko) * | 2021-01-12 | 2022-07-21 | (주)셀라토즈테라퓨틱스 | 신경 재생 활성을 가진 신경재생촉진세포의 스크리닝 방법 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10073096B2 (en) | 2012-10-05 | 2018-09-11 | Life Technologies Corporation | Markers capable of distinguishing cell pluripotency and uses thereof |
| WO2016143866A1 (ja) * | 2015-03-10 | 2016-09-15 | 国立大学法人東北大学 | 胎盤を構成する細胞への分化能を有する哺乳動物の未分化前駆細胞及びその製造方法 |
-
2004
- 2004-01-23 JP JP2004015682A patent/JP4147305B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022154474A1 (ko) * | 2021-01-12 | 2022-07-21 | (주)셀라토즈테라퓨틱스 | 신경 재생 활성을 가진 신경재생촉진세포의 스크리닝 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005204590A (ja) | 2005-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Diaz‐Romero et al. | Immunophenotypic analysis of human articular chondrocytes: changes in surface markers associated with cell expansion in monolayer culture | |
| Majumdar et al. | Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow‐derived multipotential stromal cells | |
| Radcliffe et al. | Temporal analysis of equine bone marrow aspirate during establishment of putative mesenchymal progenitor cell populations | |
| Charbord et al. | Comparative study of stromal cell lines derived from embryonic, fetal, and postnatal mouse blood-forming tissues | |
| US7718376B2 (en) | Identification and isolation of somatic stem cells and uses thereof | |
| US20050079606A1 (en) | Pluripotent stem cells originating in skeletal muscle intestinal tissue | |
| US20110033923A1 (en) | Marker for stem cells and its use | |
| JP2007503815A (ja) | 富化された膵臓幹細胞および前駆細胞集団、ならびにこれらの集団の同定、単離および富化方法 | |
| Ratajczak et al. | Identification of very small embryonic/epiblast-like stem cells (VSELs) circulating in peripheral blood during organ/tissue injuries | |
| JP2004531270A (ja) | 肝移植細胞、アッセイ法、およびその使用法 | |
| WO2012162741A1 (en) | Enrichment of cardiomyocytes | |
| US7833697B2 (en) | Endothelial stem cells, populations, methods of isolation and use thereof | |
| Burrows et al. | Expression of adhesion molecules by human decidual large granular lymphocytes | |
| CN114158274A (zh) | 真皮鞘杯细胞的鉴别方法 | |
| JP2006511206A (ja) | 富化された中枢神経系幹細胞集団および前駆体細胞集団、ならびにこれらの集団を同定し、単離し、そして富化する方法 | |
| JP4147305B2 (ja) | ヒト成体由来の膵臓内分泌細胞に分化可能な細胞に特有な表面抗原とこの表面抗原による細胞分離法 | |
| Fomin et al. | Coexpression of CD14 and CD326 discriminate hepatic precursors in the human fetal liver | |
| US8747838B2 (en) | Method for isolating smooth muscle stem cells | |
| Blanco-Bose et al. | Laminin-induced change in conformation of preexisting α7β1 integrin signals secondary myofiber formation | |
| JP4173022B2 (ja) | 未分化造血細胞検出用マーカー | |
| Medina et al. | Efficient differentiation into skin cells of bone marrow cells recovered in a pellet after density gradient fractionation | |
| Gigant et al. | CD34+ cells homing: quantitative expression of adhesion molecules and adhesion of CD34+ cells to endothelial cells exposed to shear stress | |
| JP4477461B2 (ja) | 皮膚幹／前駆性細胞のマーカー、分析、精製方法 | |
| Kräter | Bone marrow niche-mimetics modulate hematopoietic stem cell function via adhesion signaling in vitro | |
| JP2006050974A (ja) | 心筋前駆細胞の単離方法及び単離用デバイス |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061013 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080226 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080425 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080527 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4147305 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |