CN116802501A - 具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法及包含上述神经元再生促进细胞的药物组合物。本发明的神经元再生促进细胞的CD标记物的表达模式与干细胞完全不同，神经元再生效果突出，因此可以在神经疾病的预防或治疗中多种多样地使用。
Description
技术领域
本发明涉及源自干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法及包含上述神经元再生促进细胞的用于预防或治疗神经疾病的药物组合物。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)具有可在特定刺激下分化为其他细胞的分化灵活性，由于其有利于去分化干细胞所具有的肿瘤发生可能性、胚胎干细胞所具有的伦理问题等，因此在细胞治疗剂的开发中广为使用。间充质干细胞为成体干细胞，因此可以从普通成人的脂肪、脐带血、骨髓等组织中分离来使用。但分离这些组织的方法具有破坏性，会引发痛苦，而且还无法得到大量的干细胞，因此存在局限性。
发明内容
技术问题
于是，本发明人导出在从间充质干细胞分化的多种细胞中，通过分析分化为神经元再生促进细胞的细胞特定CD标记物来筛选表现出神经元再生效果的神经元再生促进细胞的方法，从而完成本发明。
因此，本发明的目的在于，提供源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞(Neuronal Regeneration Promoting Cell)的筛选方法。
本发明的再一目的在于，提供通过上述筛选方法筛选的神经元再生促进细胞。
本发明的另一目的在于，提供包含上述神经元再生促进细胞作为有效成分的用于预防或治疗神经疾病的药物组合物。
本发明的其他目的及优点将通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围以及附图得到进一步明确。
技术方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供包括如下步骤的源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法：步骤i)，准备从间充质干细胞分化的细胞；以及步骤ii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD121a、CD106及CD112组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞上调的(up-regulated)细胞。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包括如下步骤的源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法：步骤i)，准备从间充质干细胞分化的细胞；以及步骤ii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD26及CD141组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞下调(down-regulated)的细胞。
本发明人分析多种来源的间充质干细胞，对上述分化的多种细胞确认许多标记物各自的表达状态，结果确认到在分化为神经元再生促进细胞的情况下，特定标记物(例如CD121a、CD106、CD112等CD标记物)的表达状态表现出惊人的共同倾向性。
本发明的术语“神经元再生促进细胞”、“Neuronal Regeneration PromotingCell”或“NRPC”是指作为从间充质干细胞分化的细胞而保有神经元再生效果(例如，在受损的神经细胞中使末梢神经髓鞘化，或者通过分泌神经元再生所需的细胞因子来在结构或功能方面直接或间接促进神经元再生的效果)的细胞。
根据本发明的优选实例，上述筛选方法包括下述步骤：步骤i)，准备从间充质干细胞分化的细胞；步骤ii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD121a、CD106及CD112组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞上调的细胞；以及步骤iii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD26及CD141组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞下调的细胞。
根据本发明的优选实例，上述筛选方法包括如下步骤：步骤i)，准备从间充质干细胞分化的细胞；步骤ii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD26及CD141组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞下调的细胞；以及步骤iii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD121a、CD106及CD112组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞上调的细胞。
本发明的术语“干细胞”是指在具有自我复制能力的同时具有分化为两个以上细胞的能力的细胞，上述干细胞包括成体干细胞、全能干细胞、诱导性多能干细胞或胚胎干细胞，优选地，为间充质干细胞。
本发明的术语“间充质干细胞”是指从人类或哺乳动物的组织中分离出来的干细胞。间充质干细胞可以源自多种组织，尤其，可以源自选自由扁桃体、脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、绒毛膜、蜕膜及胎盘组成的组中的一种以上。从各组织中分离干细胞的技术是本发明所属技术领域中公知的。
根据本发明的优选实例，上述间充质干细胞源自扁桃体或脂肪。
根据本发明的一实施例，确认到利用源自扁桃体或脂肪的间充质干细胞为最优选。
本发明的术语“CD”或“分化簇(cluster of differentiation)”分子是指存在于细胞表面的表面分子结构，上述CD分子在各细胞集团中共同出现，用于区分这些细胞集团(即，标记物用途)。同系列的细胞具有相同种类的CD分子，但即使相同的细胞集团，随着处于分化或激活阶段而具有不同的CD分子，因此通过此有效用在细胞的系统、分化阶段及激活等的确认中。
根据本发明的一实施例，通过比较本发明的源自干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞与间充质干细胞的CD分子表达模式，来验证本发明的神经元再生促进细胞为与间充质干细胞不同的细胞。并且，在本发明中，与间充质干细胞相比，可以把表达上调的CD10、CD39、CD106、CD112、CD121a及CD338等，或者上调的CD26、CD54、CD126及CD141等用作神经元再生促进细胞的分化标记物。
根据本发明的优选实例，上述步骤i)的分化的细胞为培养间充质干细胞形成神经球后分化而来的。
根据本发明的优选实例，上述神经元再生活性包括末梢神经的髓鞘化(myelinization)。
本发明的术语“髓鞘化”是指通过髓鞘包裹末梢神经的轴突周围来进一步提高刺激的传导速度的现象。受损的末梢神经通过髓鞘化得以正常化(即，再生)。
根据本发明的一实施例，通过本发明的筛选方法筛选的候选细胞中的一部分细胞通过与背根神经节的共培养过程在细胞形态学上实现髓鞘化。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供通过上述筛选方法筛选的神经元再生促进细胞。
根据本发明的优选实例，上述神经元再生促进细胞具有如下特征：a)与分化前的间充质干细胞相比，标记物CD121a、CD106及CD112的表达上调；以及b)与分化前的间充质干细胞相比，标记物CD26及CD141的表达下调。
优选地，上述神经元再生促进细胞的标记物CD121a的表达比分化前的间充质干细胞上调30％以上，更优选地，上调40％以上。
根据本发明的一实施例，确认到与分化前的间充质干细胞的标记物CD121a的表达相比，源自T-MSC-1-1的神经元再生促进细胞上调94％，源自T-MSC-1-2的神经元再生促进细胞上调71％，源自T-MSC-1-3的神经元再生促进细胞上调51％，源自T-MSC-1-4的神经元再生促进细胞上调48％，平均上调66％以上。
优选地，上述神经元再生促进细胞的标记物CD106的表达比分化前的间充质干细胞上调5％以上，更优选地，上调10％以上。
根据本发明的一实施例，确认到与分化前的间充质干细胞的标记物CD106的表达相比，源自T-MSC-1-1的神经元再生促进细胞上调30％，源自T-MSC-1-2的神经元再生促进细胞上调11％，源自T-MSC-1-3的神经元再生促进细胞上调16％，源自T-MSC-1-4的神经元再生促进细胞上调13％，平均上调17％以上。
优选地，上述神经元再生促进细胞的标记物CD112的表达比分化前的间充质干细胞上调10％以上，更优选地，上调15％以上。
根据本发明的一实施例，确认到与分化前的间充质干细胞的标记物CD112的表达相比，源自T-MSC-1-1的神经元再生促进细胞上调49％，源自T-MSC-1-2的神经元再生促进细胞上调25％，源自T-MSC-1-3的神经元再生促进细胞上调30％，源自T-MSC-1-4的神经元再生促进细胞上调19％，平均上调30％以上。
根据本发明的优选实例，上述神经元再生促进细胞的标记物CD26的表达比分化前的间充质干细胞下调。
优选地，上述神经元再生促进细胞的标记物CD26的表达比分化前的间充质干细胞下调5％以上，更优选地，下调8％以上。
根据本发明的一实施例，确认到与分化前的间充质干细胞的标记物CD26的表达相比，源自T-MSC-1-1的神经元再生促进细胞下调9％，源自T-MSC-1-2的神经元再生促进细胞下调11％，源自T-MSC-1-3的神经元再生促进细胞下调27％，源自T-MSC-1-4的神经元再生促进细胞下调16％，平均下调16％以上。
优选地，上述神经元再生促进细胞的标记物CD141的表达比分化前的间充质干细胞下调5％以上，更优选地，下调8％以上。
根据本发明的一实施例，确认到与分化前的间充质干细胞的标记物CD141的表达相比，源自T-MSC-1-1的神经元再生促进细胞下调9％，源自T-MSC-1-2的神经元再生促进细胞下调20％，源自T-MSC-1-3的神经元再生促进细胞下调16％，源自T-MSC-1-4的神经元再生促进细胞下调38％，平均下调20％以上。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述神经元再生促进细胞作为有效成分的用于预防或治疗神经疾病的药物组合物。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供神经疾病的治疗方法，包括向对象(subject)给药有效量的上述神经元再生促进细胞的步骤。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供上述神经元再生促进细胞的治疗用途(for use in therapy)。
本发明的术语“神经疾病”是指神经组织因遗传或老化等内部因素或外伤等外部因素使神经组织受损而诱发的疾病。
根据本发明的优选实例，上述神经疾病为选自由夏科-马里-图思病、糖尿病性末梢神经病症、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化症、腕管综合征、脊髓灰质炎、麻风、肌营养不良症、多发性肌炎及重症肌无力组成的组中的一种以上疾病。
本发明的术语“对象”是指需要给药本发明的组合物或上述神经元再生促进细胞的个体，包括但不限于哺乳类、鸟类、爬虫类、两栖类、鱼类等给药对象。
在本发明中，“预防”是指通过给药本发明的组合物来抑制或迟延神经疾病的所有行为。并且，“治疗”是指通过给药本发明的组合物来使神经疾病的症状好转或变更为治愈的所有行为。
根据本发明的优选实例，本发明的药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物可以根据本发明所属技术领域的普通技术人员易于实施的方法利用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制为单位剂量形态或装入多剂量容器中来制备。
本发明的药物组合物可以根据通常的方法配制为多种形态来使用。例如，可以配制为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬混液、乳剂、糖浆剂等口服剂型，也可以配制为外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态来使用。
除源自干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞以外，本发明的组合物还可以包含一种以上公知的对神经疾病具有预防或治疗效果的有效成分。
本发明的药物组合物可以口服或胃肠外给药，优选地，可以胃肠外给药，例如，可以通过静脉内注射、经皮给药、皮下注射、肌肉内注射肌肉、玻璃体内注射(intravitrealinjection)、视网膜下注射(subretinal injection)、脉络膜上注射(suprachoroidalinjection)、滴眼给药(eye drop administration)、脑室内注射(intracerebroventricular injection)、脊椎腔内注射(intrathecal injection)、羊膜内注射(intraamniotic injection)、动脉内注射(intraarterial injection)、关节腔内注射(intraarticular injection)、心脏内注射(intracardiac injection)、阴茎海绵体内注射(intracavernous injection)、脑内注射(intracerebral injection)、脑池内注射(intracisternal injection)、冠状动脉内(intracoronary injection)、颅骨内注射(intracranial injection)、硬膜内注射(intradural injection)、硬膜外注射(epiduralinjection)、海马体内注射(intrahippocampal injection)、鼻腔内注射(intranasalinjection)、骨髓腔内注射(intraosseous injection)、腹腔内注射(intraperitonealinjection)、胸腔内注射(intrapleural injection)、脊髓内注射(intraspinalinjection)、胸廓内注射(intrathoracic injection)、胸腺内注射(intrathymicinjection)、子宫内注射(intrauterine injection)、阴道内注射(intravaginalinjection)、心室内注射(intraventricular injection)、膀胱内注射(intravesicalinjection)、结膜下注射(subconjunctival injection)、肿瘤内注射(intratumoralinjection)、局部注射及腹腔注射(intraperitoneal injection)等来给药。
用于上述胃肠外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬混剂、油剂、冷冻干燥制剂、栓剂。非水性溶剂、助悬溶剂可以使用丙二醇(Propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的之类等。栓剂的基剂可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸酯、甘油明胶等。
本发明的药物组合物的给药量可以根据上述药物组合物的配制方法、给药方式、给药时间和/或给药途径等的不同而多种多样，可以根据通过给药上述药物组合物索要实现的反应的种类和程度、成为给药对象的个体的种类、年龄、一般健康状态、疾病的症状或程度、性别、饮食、代谢、相关个体同时或不同时一同使用的药物、其他组合物的成分等多种因素及医药领域中广为人知的相似因素而多种多样，本发明所属技术领域的普通技术人员可以轻松确定并处方所目标的治疗的有效给药量。
本发明的药物组合物的给药途径及给药方式可以分别独立，其方式不受特别限制，可以使用能够使上述药物组合物到达所目标的相关部位的任意的给药途径及给药方式。
发明的效果
本发明的特征及优点简要如下。
(i)本发明提供源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法及包含上述神经元再生促进细胞药物组合物。
(ii)本发明的神经元再生促进细胞的CD标记物的表达状态与间充质干细胞完全不同，保有神经元再生效果，因此可以在神经疾病的预防或治疗领域中多种多样地使用。
附图说明
图1示出按照不同天数拍摄的利用作为扁桃体来源间充质干细胞的T-MSC-1-1诱导神经元再生促进细胞时的结果的照片。
图2为通过CD标记物的筛选示出本发明的神经元再生促进细胞的CD标记物表达的热图的结果。
图3a及图3b示出在神经元再生促进细胞中筛选与扁桃体来源间充质干细胞相比表达量具有差异的CD标记物的结果。图3a为比较表达量比扁桃体来源间充质干细胞增加的CD标记物的结果，图3b为比较表达量比扁桃体来源间充质干细胞减少的CD标记物的结果。
图4为比较神经元再生促进细胞中表达比扁桃体来源间充质干细胞增加的CD标记物及表达减少的CD标记物的表达模式的结果。
图5为通过直方图示出在神经元再生促进细胞中表达共同增加或减少的CD标记物的筛选结果。
图6示出神经元再生促进细胞中表达共同增加的标记物CD121a、CD106及CD112的表达模式与扁桃体来源间充质干细胞比较的结果。
图7示出神经元再生促进细胞中表达共同减少的标记物CD26及CD141的表达模式与扁桃体来源间充质干细胞比较的结果。
图8是为了比较扁桃体来源间充质干细胞(T-MSCs)、神经元再生促进细胞(NRPCs)的CD标记物表达状态而通过热图示出的比较CD标记物的表达的结果。
图9示出实施神经突生长测定(Neurite outgrowth assay)来测量神经元再生促进细胞的神经突的生长并比较的结果。
图10为在细胞形态学上确认通过候选细胞与背根神经节的共培养过程使一部分细胞实现髓鞘化的结果。
图11为对使用CD筛选(screening)筛选的上调、下调的CD标记物(marker)利用单独的抗体实施流式细胞分析的结果。
图12为示出将在T-MSC和NRPC中分析的细胞因子阵列(Cytokine array)的分析结果图示化为热图的结果(左)以及按照不同比例区分与T-MSC相比在NRPC中共同增加的细胞因子(Cytokine)的结果(右)(差异倍数(Fold change)：NRPC 1-1/T-MSC 1-1、NRPC 1-2/T-MSC 1-2)。
具体实施方式
以下，通过实施例更为详细地说明本发明。但本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。
实施例
实施例1.准备间充质干细胞
1-1.扁桃体来源间充质干细胞分离及培养
将梨花女子大学医学院提供的源自多个捐献者的扁桃体组织区分为左和右，将扁桃体组织放入装有10ml的添加有20μg/ml的庆大霉素(Gentamicin)的杜氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS，Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)的试管中，以1500rpm的转速离心分离5分钟后洗涤。上述洗涤组织的过程重复2次。使用灭菌的剪子将洗涤的扁桃体组织细细地剪切粉碎。
为了从扁桃体组织中分离扁桃体来源间充质干细胞，向上述粉碎的扁桃体组织中加入同等重量的酶反应液后，在37℃、200rpm的条件的振荡培养器中培养60分钟。上述酶反应液的组成如下述表1所示。
表1
向上述培养物中加入5％的胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)后，以1500rpm的转速离心分离5分钟。离心分离后去除上清液，使用30ml的杜氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS)使颗粒重新悬浮后以1500rpm的转速离心分离5分钟。离心分离后去除上清液，加入10ml的杜氏磷酸盐缓冲溶液使颗粒重新悬浮来制备悬浮液。使上述悬浮液通过100μm的过滤器。使用20ml的杜氏磷酸盐缓冲溶液清洗扁桃体来源间充质干细胞后，以1500rpm的转速离心分离5分钟。离心分离后去除上清液，放入ACK裂解缓冲液(Lysis buffer)并在37℃的恒温水槽中反应5分钟。向上述悬浮液中放入杜氏磷酸盐缓冲溶液后以1500rpm的转速离心分离5分钟。离心分离后去除上清液，使用高葡萄糖杜氏改良伊戈尔培养基(High glucose DMEM)(10％的胎牛血清，20μg/ml的庆大霉素)使颗粒重新悬浮来制备细胞悬浮液。计数制备的细胞悬浮液的细胞。并且，将上述细胞悬浮液接种到T175烧瓶中，在37℃及二氧化碳浓度为5％的条件的培养器中培养。
1-2.脂肪来源间充质干细胞的分离及培养
从龙沙公司(LONZA)购入脂肪来源间充质干细胞(Human Adipose-Derived StemCells，Cat#PT-5006，龙沙公司，瑞士(Swiss))。利用龙沙公司提供的培养基(BulletkitADSD，Cat#PT-4505)培养上述购入的脂肪来源间充质干细胞。
实施例2.神经球的形成
通过培养上述实施例1中估计在的间充质干细胞来形成神经球。具体地，通过传代培养准备传代数为4至7的间充质干细胞。去除上述间充质干细胞的培养基后使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤间充质干细胞。向洗涤的细胞处理TrypLE来收获细胞，计数收获的细胞。离心分离收获的细胞并去除上清液后，放入神经球形成培养基后再悬浮。上述神经球形成培养基的组成如下述表2所示。
表2
以1×106个的数量在装有神经球形成培养基的超低吸附培养皿(Ultra Lowattachment dish)60mm中接种再悬浮的细胞。在37℃及二氧化碳浓度为5％的条件下培养接种的细胞3天。培养3天后，将培养皿中生成的神经球收集到15ml的试管中。离心分离收集的细胞后去除上清液，加入新的神经球形成培养基再悬浮来制备神经球悬浮液。将神经球悬浮液移到超低吸附培养皿中后，在37℃及二氧化碳浓度为5％的条件下培养神经球4天。
实施例3.利用神经球分化为神经元再生促进细胞候选细胞
使用23G～26G的注射器针头均匀地粉碎上述实施例2中生成的神经球。使用吸管将粉碎的神经球移到15ml的试管中，离心分离后去除上清液。向上述试管中加入神经元再生促进细胞诱导培养基后使粉碎的神经球再悬浮。上述神经元再生促进细胞诱导培养基为与包含GlutaMAX的杜氏改良伊戈尔培养基/F12组合如下成分中的三种以上来制备并使用的：1)5％至20％的胎牛血清，2)5ng/ml至20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(派普泰克公司(Peprotech)，美国(USA))，3)100μM至400μM的丁基羟基苯甲醚(butylatedhydroxyanisole，西格玛公司(Sigma)，美国)，4)5μM至40μM的佛司可林(Forskolin，MedCheExpress公司，美国)，5)0.1％至10％的N2补充剂(N2 supplements，赛默飞世尔公司(Gibco)，美国)，6)1ng/ml至100ng/ml的脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF，西格玛公司(Sigma-Aldrich)，美国)，7)1ng/ml至100ng/ml的神经生长因子(nerve growth factor，NGF，圣克鲁兹公司(Santa Cruz)，美国)，8)0.01ng/ml至1ng/ml的音猬因子(sonic hedgehog，SHH，R&D Systems公司，美国)，9)1ng/ml至10ng/ml的血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA，Platelet Derived Growth Factor-AA，派普泰克公司，美国)，10)50ng/ml至300ng/ml的调蛋白β1(Heregulin-beta1，派普泰克公司，美国)。
将在上述多种培养基中再悬浮的神经球都接种到涂敷有层粘连蛋白(2μg/ml)的T175烧瓶中。培养接种的神经球8天～10天，间隔3天更换各神经元再生促进细胞诱导培养基(图1)。
实施例4.通过确认神经元再生促进细胞候选细胞的末梢神经髓鞘化的一次筛选
对于上述实施例3中制备的神经元再生促进细胞候选细胞，确认是否具有末梢神经的髓鞘化功能。具体地，为了通过分化的候选神经元再生促进细胞与背根神经节(Dorsalroot ganglia，DRG)的共培养确认髓鞘化，将候选细胞与背根神经节共培养。
从龙沙公司购入从大鼠(Rat)中分离的背根神经节(DRG)细胞(Rat Dorsal RootGanglion Cells，Cat#R-DRG-505，龙沙公司，瑞士)。将上述购入的背根神经节放在候选细胞上进行共培养。为了共培养，利用购入上述背根神经节细胞的龙沙公司提供的培养基(原代神经元生长培养基子弹试剂盒(Primary Neuron Growth Medium Bullet Kit，PNGM)，Cat#CC-4461)进行培养。
每三天更换培养液。通过上述候选细胞与背根神经节的共培养过程在细胞形态学上确认到一部分细胞实现髓鞘化(图10)。
实施例5.通过分析神经元再生促进细胞的CD标记物表达的二次筛选
对在上述实施例4中确认髓鞘化的经元再生促进细胞候选组中细胞形态学上髓鞘化最好的T-MSC-1-1(扁桃体来源间充质干细胞1)、T-MSC-1-2(扁桃体来源间充质干细胞2)、T-MSC-1-3(扁桃体来源间充质干细胞3)、T-MSC-1-4(扁桃体来源间充质干细胞以及它们4)以及从它们分化的神经元再生促进细胞的共242个CD标记物的表达进行分析。
为了分析CD标记物，收集3×107个目标细胞。使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤目标细胞后以2000rpm的转速离心分离5分钟。去除上清液后重复使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤1次。离心分离后，使用30ml的流式细胞荧光分选(FACS)缓冲液使颗粒再悬浮。准备制备为圆底的96孔培养板(96well plate)，向各孔(well)中分注100μl(1×105cell)的细胞悬浮液。向96孔培养板的各孔中加入10μl的CD标记物(marker)的一抗。遮光后在冰上反应30分钟。向每孔分注100μl的流式细胞荧光分选缓冲液后洗涤96孔培养板，以300g的条件离心分离5分钟。去除上清液后，向每孔中加入200μl的流式细胞荧光分选缓冲液后，以300g的条件离心分离5分钟。在流式细胞荧光分选缓冲液中以1∶200的比例制备二抗(1.25μg/ml)来准备。离心分离结束后，去除上清液后，向各孔中加入100μl的准备好的二抗。遮光后在冰上反应20分钟～30分钟。向各孔中加入100μl的流式细胞荧光分选缓冲液并洗涤后，以300g的条件离心分离5分钟。去除上清液后，向各孔中加入200μl的流式细胞荧光分选缓冲液来洗涤目标细胞。重复洗涤过程2次。洗涤过程后，向各孔中分注200μl的流式细胞荧光分选缓冲液来使细胞再悬浮后，通过流式细胞分析(流式细胞仪(Flow Cytometry)或者流式细胞荧光分选技术(FACS；Fluorescence-activated cell sorting))来在目标细胞中确认CD标记物的表达。
通过热图(heat map)比较诱导的神经元再生促进细胞的CD标记物的表达的结果如图2所示。如图2所示，神经元再生促进细胞(NRPCs)及间充质干细胞(MSCs)的CD标记物的表达模式相似，但确认到一部分标记物的表达模式不同。
比较T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3、T-MSC-1-4来源的间充质干细胞(MSCs)与神经元再生促进细胞(NRPCs)的CD标记物的表达模式的结果，将表达增加或减少的CD标记物用作神经元再生促进细胞的分化标记物。上述表达增加或减少的CD标记物如图3a及图3b所示。
如图3a所示，与扁桃体来源间充质干细胞相比，T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3、T-MSC-1-4来源的神经元再生促进细胞中表达增加的CD标记物有CD10、CD39、CD106、CD112、CD121a及CD338等(在4种NRPC中至少在3个以上的NRPC中增加的标记物)；如图3b所示，表达减少的CD标记物有CD26、CD54、CD126及CD141等(在4种NRPC中至少在3个以上的NRPC中减少的标记物).
比较上述扁桃体来源神经元再生促进细胞的CD标记物的表达增加率及减少率的结果如图4所示。
如图4所示，确认到T-MSC-1-1来源神经元再生促进细胞中表达增加的CD标记物为12个，表达减少的CD标记物为9个。并且，确认到T-MSC-1-2来源神经元再生促进细胞中表达增加的CD标记物为8个，表达减少的CD标记物为9个。确认到T-MSC-1-3来源神经元再生促进细胞中表达增加的CD标记物为40个，表达减少的CD标记物为3个。确认到T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中表达增加的CD标记物为17个，表达减少的CD标记物为6个。
从上述结果中筛选在T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3及T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中表达都增加或减少的CD标记物。筛选的标记物如下。
-表达共同增加的CD标记物：CD106、CD112、CD121a。
-表达共同减少的CD标记物：CD26、CD141。
从实施例1-2的脂肪来源间充质干细胞中分化的神经元再生促进细胞也表现出与上述表达共同增加的CD标记物及表达共同减少的CD标记物相同的形态。
使用直方图示出的T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3及T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中表达都增加或都减少的CD标记物的CD筛选结果如图5所示。
如图5所示，确认到神经元再生促进细胞中表达共同增加的CD标记物CD121a、CD106、CD112在分化后的表达率提高10％以上。另一方面，确认到神经元再生促进细胞中表达共同减少的标记物CD26、CD141在分化后的表达率减少，减少率约为9％以上。上述结果表示表达共同变化的CD121a、CD106、CD112、CD26及CD141可以用作神经元再生促进细胞的分化标记物，尤其，CD121a、CD106及CD112可以用作代表性的分化标记物。
6-1.比较共表达标记物CD121a、CD106及CD112的表达
与间充质细胞相比，标记物CD121a、CD106及CD112在T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3及T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中的表达共同增加10％以上，为神经元再生促进细胞的大特征之一。于是，在T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3及T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中比较标记物CD121a、CD106及CD112，结果如图6所示。
如图6所示，确认到与扁桃体来源间充质干细胞(T-MSCs)相比，标记物CD121a、CD106、CD112在神经元再生促进细胞(NRPCs)中的表达显著增加。
6-2.比较共表达标记物CD26及CD141的表达
标记物CD26及CD141为在T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3及T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中表达共同减少的CD标记物。在上述T-MSC-1-1、T-MSC-1-2、T-MSC-1-3及T-MSC-1-4来源神经元再生促进细胞中比较上述CD标记物的表达，结果如图7所示。
如图7所示，确认到与扁桃体来源间充质干细胞相比，神经元再生促进细胞中CD26及CD141的表达减少。
6-3.比较CD标记物表达模式
为了比较扁桃体来源间充质干细胞、神经元再生促进细胞的CD标记物表达模式，基于比较实施例6-1及6-2中共表达的CD标记物的表达结果绘制热图，如图8所示。
如图8所示，确认到神经元再生促进细胞的共表达标记物的表达与扁桃体来源间充质干细胞不同。
6-4.共表达CD标记物的平均表达
为了比较扁桃体来源间充质干细胞、神经元再生促进细胞的CD标记物的表达模式在冷冻后是否相同，在冷冻前活细胞的状态、冷冻后解冻的细胞、附着解冻的细胞培养的细胞中确认实施例6-1、实施例6-2中共表达CD标记物的表达，共表达CD标记物的平均表达率结果如图11所示。
如图11所示，确认到神经元再生促进细胞的CD106、CD121a、CD112的表达在冷冻后仍比扁桃体来源间充质干细胞增加，CD26、CD141的表达仍减少。上述结果确认，与冷冻状态无关地，神经元再生促进细胞的共表达标记物的表达与扁桃体来源间充质干细胞不同。
实施例7.本发明的神经元再生促进细胞的神经突生长(Neurite Outgrowth)效果
已知神经细胞体的一个树突伸长的神经突(neurite或neuronal process)与轴突的生长再生所需的物质或递质、神经生长因子等的输送相关(L McKerracher et al.,Spinal Cord Repair:Strategies to Promote Axon Regeneration,Neurobiol Dis,2001)。为了测定本发明的神经元再生促进细胞的神经突的生长，进行了神经突生长测定(Neurite outgrowth assay)。
上述方法为培养N1E-115(小鼠神经母细胞瘤细胞株(mouse neuroblastoma cellline)，ATCC公司，美国)后接种到微细的多孔过滤器(神经突生长测定试剂盒(Neuriteoutgrowth assay kit)，密理博公司(Millipore)，美国)。在从神经元再生促进细胞、干细胞收集的培养液中培养接种的细胞48小时后，染色透过微细的多孔过滤器并伸长的神经突来测量吸光度。通过神经突生长测定的神经突测定方法确认本发明的神经元再生促进细胞的培养液调节或刺激N1E-115(小鼠神经母细胞瘤(mouse neuroblastoma))的神经突(轴突)的生长，从而确认其神经再生效果。
于是，比较在T-MSC-1-2来源神经元再生促进细胞、扁桃体来源干细胞的培养液中生长的N1E-115细胞的神经突，结果如图9所示(NRPCs：T-MSC-1-2来源神经元再生促进细胞，T-MSCs：T-MSC-1-2，Negative control：阴性对照组，Positive control：阳性对照组)。结果，与扁桃体来源干细胞相比，神经元再生促进细胞中观察到更多的神经突，在吸光度测量中也确认到与扁桃体干细胞相比，神经元再生促进细胞的吸光度增高(-阴性对照组(Negative control)：使用牛血清白蛋白(BSA)涂敷多孔过滤器(神经突生长测定试剂盒提供的膜蛋白插入)，在培养基(杜氏改良伊戈尔培养基+20μg/ml的庆大霉素)中培养N1E-115细胞。-阳性对照组(Positive control)：使用层粘连蛋白(Laminin)涂敷多孔过滤器，在培养基(杜氏改良伊戈尔培养基+20μg/ml的庆大霉素+1mg/ml的牛血清白蛋白)中培养N1E-115细胞。-NRPC、T-MSC试验组：使用牛血清白蛋白涂敷多孔过滤器，分别在NRPC、T-MSC的培养液中培养N1E-115细胞)。
实施例8.神经元再生促进细胞的细胞因子阵列分析
对于上述实施例4中髓鞘化最好的T-MSC-1-1、T-MSC-1-2以及由它们分化的神经元再生促进细胞，分析507个细胞因子的表达。
为了分析细胞因子，培养目标细胞。以相同的细胞数量将目标细胞接种在烧瓶(flask)中后，培养3天～4天。当目标细胞达到培养的烧瓶面积的80％以上时，去除培养液并使用杜氏磷酸盐缓冲溶液重复洗涤目标细胞2次。洗涤后，为了排除目标细胞的培养基种包含的细胞因子的影响，更换未添加胎牛血清、细胞因子等的杜氏改良伊戈尔培养基。培养目标细胞30小时后，收集目标细胞的培养液。
以3600rpm的转速离心分离收集的培养液30分钟后，将上清液移到有纤维素膜(cellulose membrane)的离心管(Centrifugal tube)中，以3600rpm的转速离心分离20分钟来浓缩。废弃离心分离后通过分离膜的条件培养基，加入与废弃的条件培养基等量的培养液后持续浓缩。持续离心分离直至浓缩的培养液为1ml以下，结束的浓缩培养液通过布拉德福德测定(Bradford assay)来定量。将浓缩的培养液与杜氏改良伊戈尔培养基混合使最终浓度为1mg/ml。
向涂敷有能够检测出507个细胞因子的抗体的膜(membrane)(细胞因子阵列试剂盒(Cytokine array Kit)，瑞博奥公司(RayBiotech)，美国)处理封闭缓冲液(blockingbuffer)来反应30分钟。去除膜中的封闭缓冲液(blocking buffer)并更换浓缩的培养液后在冷藏条件下过夜反应。使用洗涤缓冲液(wash buffer)重复洗涤膜7次。向膜中放入标记辣根过氧化物酶的链霉亲和素溶液(HRP-conjugated Streptavidin solution)后在室温下反应2小时。去除标记辣根过氧化物酶的链霉亲和素溶液后，使用洗涤缓冲液洗涤膜7次。洗涤后，使用增强型化学发光(ECL，Enhanced chemiluminescence)试剂(reagent)湿润膜后，利用成像仪(imager)确认细胞因子的表达。
通过热图比较神经元再生促进细胞的细胞因子的表达的结果如图12所示。如图12所示，确认到神经元再生促进细胞的表达模式与扁桃体来源间充质干细胞不同。
比较T-MSC-1-1、T-MSC-1-2来源间充质干细胞及神经元再生促进细胞的细胞因子的表达的结果，表达增加的细胞因子如图12所示。
-1.5倍以上：血管生成素(Angiopoietin)-1、血管生成素-4、BIK、BMPR-IA/ALK-3、CCL14/HCC-1/HCC-3、CCR1、EN-RAGE、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)-3/CCL26、成纤维细胞生长因子(FGF)R4、成纤维细胞生长因子-10/角质细胞生长因子(KGF)-2、成纤维细胞生长因子-19、成纤维细胞生长因子-21、Flt-3配体(Ligand)、Follistatin-like 1、GASP-1/WFIKKNRP、GCP-2/CXCL6、GFRα-3、GREMLIN、GRO-a、肝细胞生长因子(HGF)、HRG-β1、I-309、ICAM-1、IFN-α/βR2、IGFBP-2、IGF-I、白细胞介素(IL)-4、白细胞介素-5Rα、白细胞介素-10Rβ、白细胞介素-12Rβ1、白细胞介素-13Rα2、白细胞介素-20Rβ、白细胞介素-22BP、白细胞介素-23R、FACX、LIF、LIF Rα、LIGHT/TNFSF14、Lipocalin-1、Lipocalin-2、LRP-1、MCP-4/CCL13、M-CSF、MDC、MFG-E8、MICA、MIP-1b、MIP-1d、金属基质蛋白酶(MMP)-2、金属基质蛋白酶-3、金属基质蛋白酶-7、金属基质蛋白酶-8、金属基质蛋白酶-10、金属基质蛋白酶-12、金属基质蛋白酶-16/MT3-金属基质蛋白酶、金属基质蛋白酶-25/MT6-金属基质蛋白酶、NAP-2、NeuroD1、血小板衍生生长因子(PDGF)-AB、血小板衍生生长因子-BB、血小板衍生生长因子-C、血小板衍生生长因子-D、穿透素(Pentraxin)3/TSG-14、Persephin、PF4/CXCL4、PLUNC、P选择素(P-selectin)、RANTES、RELMβ、ROBO4、S100A10、SAA、SCF、SIGIRR、Smad 1、Smad 5、Smad 8、Prdx6、Tarc、TCCR/WSX-1、转化生长因子(TGF)-β3、转化生长因子-β5、Tie-2、TIMP-1、TROY/TNFRSF19、uPA。
-1.75倍以上：血管生成素-1、血管生成素-4、BIK、CCR1、成纤维细胞生长因子-21、GRO-a、肝细胞生长因子、白细胞介素-10Rβ、白细胞介素-12Rβ1、MCP-4/CCL13、MIP-1b、MIP-1d、NeuroD1、血小板衍生生长因子-C、Prdx6、TIMP-1、uPA。
-2倍以上：BIK、GRO-a、肝细胞生长因子、MCP-4/CCL13、uPA。
综上所述，本发明人从扁桃体及脂肪来源间充质干细胞制备神经元再生促进细胞，通过分析其CD标记物来确认表达模式。并且，确认到上述神经元再生促进细胞的神经元再生效果。这意味着可以从曾作为医疗废弃物废弃的扁桃体组织中制备具有神经元再生效果的细胞，因此本发明的神经元再生促进细胞可以在神经元再生领域中多种多样地使用。
以上，详细说明了本发明的实施例，但本发明所属技术领域的普通技术人员可以在不脱离发明要求保护范围中记载的本发明的思想的范围内通过结构要素的附加、变更、删除或追加等来多种多样地修正及变更本发明，这些修正和变更也应该包括在本发明的权力范围内。
Claims (15)
1.一种源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法，其特征在于，包括：
步骤i)，准备从间充质干细胞分化的细胞；以及
步骤ii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD121a、CD106及CD112组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞上调的细胞。
2.一种源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法，其特征在于，包括：
步骤i)，准备从间充质干细胞分化的细胞；以及
步骤ii)，从上述步骤i)的分化的细胞中筛选选自由CD26及CD141组成的组中的一种以上标记物比分化前的间充质干细胞下调的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法，其特征在于，上述间充质干细胞源自扁桃体或脂肪。
4.根据权利要求1或2所述的源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法，其特征在于，将上述步骤i)的分化的细胞为培养间充质干细胞形成神经球后分化而来的。
5.根据权利要求1或2所述的源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法，其特征在于，上述神经元再生活性包括末梢神经的髓鞘化。
6.一种神经元再生促进细胞，其通过权利要求1或2所述的源自间充质干细胞的具有神经元再生活性的神经元再生促进细胞的筛选方法筛选，其特征在于，
a)与分化前的间充质干细胞相比，标记物CD121a、CD106及CD112的表达上调；以及
b)与分化前的间充质干细胞相比，标记物CD26及CD141的表达下调。
7.根据权利要求6所述的神经元再生促进细胞，其特征在于，上述神经元再生促进细胞的标记物CD121a的表达比分化前的间充质干细胞上调30％以上。
8.根据权利要求6所述的神经元再生促进细胞，其特征在于，上述神经元再生促进细胞的标记物CD106的表达比分化前的间充质干细胞上调5％以上。
9.根据权利要求6所述的神经元再生促进细胞，其特征在于，上述神经元再生促进细胞的标记物CD112的表达比分化前的间充质干细胞上调10％以上。
10.根据权利要求6所述的神经元再生促进细胞，其特征在于，上述神经元再生促进细胞的标记物CD26的表达比分化前的间充质干细胞下调5％以上。
11.根据权利要求6所述的神经元再生促进细胞，其特征在于，上述神经元再生促进细胞的标记物CD141的表达比分化前的间充质干细胞下调5％以上。
12.一种用于预防或治疗神经疾病的药物组合物，其特征在于，包含权利要求6所述的神经元再生促进细胞作为有效成分，还包含药学上可接受的载体。
13.根据权利要求12所述的用于预防或治疗神经疾病的药物组合物，其特征在于，上述神经疾病为选自由夏科-马里-图思病、糖尿病性末梢神经病症、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化症、腕管综合征、脊髓灰质炎、麻风、肌营养不良症、多发性肌炎及重症肌无力组成的组中的一种以上疾病。
14.一种神经疾病的治疗方法，其特征在于，包括向对象给药有效量的权利要求6所述的神经元再生促进细胞的步骤。
15.一种权利要求6所述的神经元再生促进细胞的神经疾病治疗用途。
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