JP2024502347A - 抗コロナウイルス完全ヒト広域スペクトル中和抗体７６ｅ１及びその適用 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗コロナウイルス完全ヒト広域スペクトル中和抗体及びその適用を開示する。具体的には、コロナウイルスＳタンパク質のＳ２領域に対する完全ヒトモノクローナル抗体、当該抗体をコードする核酸配列及びその調製方法を開示する。当該抗体は、様々なコロナウイルスに効果的且つ広範囲に結合して中和することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のコロナウイルス感染症関連疾患の予防及び治療に使用されることができ、ワクチン設計としてのその潜在的な適用をさらに開示する。

Description

本発明は、医学の分野に関し、具体的には、抗コロナウイルス完全ヒト広域スペクトル中和抗体７６Ｅ１及びその適用に関する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の発生により、コロナウイルスに対する注目及び研究が再び高まっている。２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＮＬ６３－ＣｏＶ等の一般的なコロナウイルスは、軽度の呼吸器疾患のみを引き起こす。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶは、より強い感染力及び病原性を有しており、人間の健康及び経済的・社会的安定を深刻に脅かしている。２０２０年８月３１日の時点で、世界中で合計２５３１．５萬人が診断され、８４．６萬人が死亡した（新型コロナウイルス肺炎のリアルタイム追跡２０２０／０８／３１）。従って、効果的な予防法及び治療法の開発が急務となっている。

モノクローナル抗体の臨床介入は、ウイルス感染症の予防及び治療に非常に効果的であり、ＲＳウイルス感染症の予防に臨床的に使用されて成功している。大量の前臨床データ及び初期臨床データは、モノクローナル抗体が様々なウイルスによって引き起こされる感染症を効果的に予防及び治療できることを示す。従って、予防的及び治療的中和抗体の開発は、現在の新型コロナウイルスの流行、将来の新たな突然のコロナウイルス感染症の発生と戦うことに対して非常に価値がある。

コロナウイルスの表面のスパイクタンパク質は、中和抗体を誘導する重要な抗原であり、中和抗体は、Ｓタンパク質の受容体への結合を遮断するか、又はウイルスと宿主細胞膜との融合を阻害することで中和効果を発揮する。Ｓタンパク質は、Ｓ１及びＳ２等の二つの機能ドメインで構成される。ここで、Ｓ１は、宿主細胞上の特定の受容体に結合してウイルス感染を促進する役割を担っており、様々なコロナウイルス間の配列は、非常に多様である。Ｓ２は、ウイルスと細胞膜との融合を媒介し、Ｓ１よりも保存されている。現在、中国内外の多くの研究室が、新型コロナウイルスの回復患者からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を標的とする完全ヒトモノクローナル抗体を相次いで単離しており、これらの抗体のほとんどは、Ｓタンパク質の受容体結合領域（ＲＢＤ）を標的とし、ＲＢＤと宿主受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との間の相互作用を遮断することで、ウイルスの宿主細胞への感染を阻害する。様々なコロナウイルスのＲＢＤの違いにより、これらの抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のみを中和することができ、他のコロナウイルスに対して広域中和活性を有さないか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶのみに対して弱い交差中和効果を有し、将来の新型コロナウイルスや突然の新型コロナウイルスには対処できない。最近、多くの文献で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が世界中で突然変異しており、一部の突然変異、特にＲＢＤの突然変異により、以前に分離された中和抗体が無効になることが報告されている。ＲＢＤを標的とする中和抗体耐性部位の出現により、その使用範囲が制限されている。従って、コロナウイルス広域スペクトル中和抗体及びネオエピトープに対する抗体を見つけることが特に重要である。現時点では、新型コロナウイルスの保存領域Ｓ２を標的とする抗体が報告されておらず、系統的な研究が不足している。

従って、当技術分野では、新型コロナウイルス感染を予防及び制御できる、より有効な完全ヒトモノクローナル抗体を開発する必要性が依然として存在する。

本発明の目的は、コロナウイルス感染を予防及び制御できる完全ヒト広域スペクトル中和抗体を提供することである。

本発明の第１の態様は、抗体の重鎖可変領域を提供し、前記重鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示されるＣＤＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示されるＣＤＲ２、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５に示されるＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含む。

別の好ましい例において、上記アミノ酸配列中の任意の一種のアミノ酸配列は、任意選択で少なくとも一つ（例えば、１－３個、好ましくは１－２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換を受け且つコロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む。

別の好ましい例において、前記重鎖可変領域は、ヒト由来のＦＲ領域又はマウス由来のＦＲ領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明の第２の態様は、抗体の重鎖を提供し、前記重鎖は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域を有する。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖は、重鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒト由来、マウス由来又はウサギ由来である。

本発明の第３の態様は、抗体の軽鎖可変領域を提供し、前記軽鎖可変領域は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６に示されるＣＤＲ１’、
アミノ酸配列がＥＶＮであるＣＤＲ２’、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８に示されるＣＤＲ３’の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含む。

別の好ましい例において、上記アミノ酸配列中の任意の一種のアミノ酸配列は、任意選択で少なくとも一つ（例えば、１－３個、好ましくは１－２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換を受け且つコロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む。

別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域は、ヒト由来のＦＲ領域又はマウス由来のＦＲ領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明の第４の態様は、抗体の軽鎖を提供し、前記軽鎖は、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有する。
別の好ましい例において、前記抗体の軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含む。
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来、マウス由来又はウサギ由来である。

本発明の第５の態様は、抗体を提供し、前記抗体は、
（１）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、及び／又は
（２）本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有するか、
又は、前記抗体は、本発明の第２の態様に記載の重鎖、及び／又は本発明の第４の態様に記載の軽鎖を有する。

別の好ましい例において、前記抗体は、特異的な抗コロナウイルス抗体、好ましくは特異的な抗Ｓタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はその組み合わせから選択される。

別の好ましい例において、前記抗体は、二本鎖抗体、又は一本鎖抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体である。
別の好ましい例において、前記抗体は、部分的又は完全にヒト化されたモノクローナル抗体である。

別の好ましい例において、前記抗体は、薬物コンジュゲートの形態である。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１示されたとおりであり、前記抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されたとおりである。

本発明の第６の態様は、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、又は本発明の第５の態様に記載の抗体、及び
（ｉｉ）発現及び／又は精製を助けるための任意選択のタグ配列を有する。

別の好ましい例において、前記タグ配列は、６Ｈｉｓタグ、ＧＧＧＳ配列、ＦＬＡＧタグを含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質（又はポリペプチド）は、融合タンパク質を含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、単量体、二量体、又は多量体である。

別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、コロナウイルスＳタンパク質、好ましくはＳ２タンパク質、より好ましくはＳタンパク質の８０９－８２３位のペプチド、最も好ましくはＳタンパク質の８０９－８３３位のペプチドに特異的に結合する。

本発明の第７の態様は、ＣＡＲ構築物を提供し、前記ＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖセグメントは、コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）に特異的に結合する結合領域であり、前記ｓｃＦｖは、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域及び本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域を有する。

本発明の第８の態様は、組換え免疫細胞を提供し、前記免疫細胞は、本発明の第７の態様に記載の外因性ＣＡＲ構築物を発現する。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）に由来する。

本発明の第９の態様は、抗体薬物コンジュゲートを提供し、前記抗体薬物コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、もしくは本発明の第５の態様に記載の抗体、又はその組み合わせからなる群から選択される抗体部分と、及び
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分にカップリングするカップリング部分とを含む。

別の好ましい例において、前記コンジュゲートは、蛍光又は発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピューター断層撮影）造影剤、又は検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２等）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、磁性ナノ粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）又は任意の形態のナノ粒子等から選択される。
別の好ましい例において、前記抗体部分は、化学結合又はリンカーを介して前記カップリング部分にカップリングする。

本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、もしくは本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、又はその組み合わせからなる群から選択される、有効成分の使用を提供し、前記有効成分は、薬剤、試薬、検出プレート又はキットの調製に使用される。

別の好ましい例において、前記試薬、検出プレート又はキットは、コロナウイルスの検出に使用される。
別の好ましい例において、前記薬剤は、コロナウイルス感染を治療又は予防するために使用される。
別の好ましい例において、前記試薬は、チップ、抗体をコーティングする免疫粒子を含む。

本発明の第１１の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、もしくは本発明の第５の態様に記載の抗体、本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、本発明の第８の態様に記載の免疫細胞、本発明の第９の態様に記載の抗体薬物コンジュゲート、又はその組み合わせからなる群から選択される有効成分、及び
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。

別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体製剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、コロナウイルス感染を予防及び／又は治療するために使用される。

本発明の第１２の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、
（１）本発明の第１の態様に記載の重鎖可変領域、本発明の第２の態様に記載の重鎖、本発明の第３の態様に記載の軽鎖可変領域、本発明の第４の態様に記載の軽鎖、又は本発明の第５の態様に記載の抗体、又は
（２）本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質、
（３）本発明の第７の態様に記載のＣＡＲ構築物からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９に示される配列を有する。

本発明の第１３の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第１２の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス等の哺乳類細胞ウイルス、レトロウイルス、又は他のベクターを含む。

本発明の第１４の態様は、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第１３の態様に記載のベクターを含むか、又はゲノムには本発明の第１２の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれる。

本発明の第１５の態様は、サンプル中のコロナウイルスを検出するための方法を提供し、前記方法は、
（１）サンプルを本発明の第５の態様に記載の抗体と接触させる段階と、
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出する段階とを含み、ここで、複合体の形成は、サンプル中にコロナウイルスが存在することを表わす。
別の好ましい例において、前記検出は、非治療及び非診断目的である。

本発明は、サンプル中のコロナウイルスＳタンパク質を検出するための方法をさらに提供し、前記方法は、
（１）サンプルを本発明の第５の態様に記載の抗体と接触させる段階と、
（２）抗原－抗体複合体が形成されているかどうかを検出する段階とを含み、ここで、複合体の形成は、サンプル中にコロナウイルスＳタンパク質が存在することを表わす。
別の好ましい例において、前記コロナウイルスＳタンパク質は、コロナウイルスＳ２タンパク質である。
別の好ましい例において、前記検出は、非治療及び非診断目的である。

本発明の第１６の態様は、検出プレートを提供し、前記検出プレートは、基板（サポートプレート）及びテストストリップを含み、前記テストストリップは、本発明の第５の態様に記載の抗体又は本発明の第９の態様に記載の免疫コンジュゲートを含む。

本発明の第１７の態様は、キットを提供し、前記キットは、
（１）本発明の第５の態様に記載の抗体を含む第１の容器と、及び／又は
（２）本発明の第５の態様に記載の抗体に対する二次抗体を含む第２の容器とを含むか、
又は、前記キットは、本発明の第１６の態様に記載の検出プレートを含む。

本発明の第１８の態様は、組換えポリペプチドの調製方法を提供し、前記方法は、
（ａ）発現に適した条件下で、本発明の第１４の態様に記載の宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）培養物から組換えポリペプチドを単離する段階とを含み、前記組換えポリペプチドは、本発明の第５の態様に記載の抗体又は本発明の第６の態様に記載の組換えタンパク質である。

本発明の第１９の態様は、コロナウイルス感染を治療するための方法を提供し、前記方法は、必要とする対象に、本発明の第５の態様に記載の抗体、前記抗体の抗体－薬物コンジュゲート、又は前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、又はその組み合わせを投与する段階を含む。

本発明の第２０の態様は、ワクチン組成物を提供し、前記組成物は、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸配列又はその部分配列のポリペプチドと、及び
（ｉｉ）ワクチン上に許容される担体とを含み、
（ｉ）において、前記部分配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含む。

別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなアミノ酸配列の同一性≧８５％、好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％を有する。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなアミノ酸配列の同一性≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％を有する。

別の好ましい例において、前記担体は、薬学的に許容される担体である。
別の好ましい例において、前記薬学的に許容される担体は、液体、好ましくは水、生理食塩水又は緩衝液を含む。
別の好ましい例において、前記担体は、補助性物質をさらに含み、好ましくは充填剤、潤滑剤、流動促進剤、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等である。
別の好ましい例において、前記担体は、細胞トランスフェクション試薬をさらに含む。

別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、二種混合ワクチン又は複数種混合ワクチンである。
別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、新型コロナウイルス感染を予防するためのワクチンである。
別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１又はその組み合わせからなる群から選択される一種又は複数種の病原体に由来するワクチン成分をさらに含むことができる。

別の好ましい例において、前記ワクチン成分は、不活化株、弱毒化株、又はタンパク質、ポリペプチド、核酸等を含む。
別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含む。
別の好ましい例において、前記アジュバントは、顆粒状アジュバント及び非顆粒状アジュバントを含む。

別の好ましい例において、前記顆粒型アジュバントは、アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、免疫刺激複合体、又はその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記非顆粒型アジュバントは、ムラミルジペプチド及びその誘導体、サポニン、リピドＡ、サイトカイン、誘導多糖、細菌毒素、マイコバクテリウム（結核菌、ＢＣＧ）、ブレビバクテリウム、百日咳菌等の微生物及びその生成物、プロポリス、又はその組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、注射剤の形態である。
別の好ましい例において、前記ワクチン組成物は、組換えサブユニットワクチン、ベクターワクチン、合成ペプチドワクチン、核酸ワクチン又はその組み合わせである。

本発明の第２１の態様は、阻害剤を提供し、前記阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８２３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３の線状エピトープを標的とし、新型コロナウイルスの感染を阻害するために使用される。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドであり、ここで、前記部分配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含む。

別の好ましい例において、前記阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０又は１１に示されるようなアミノ酸配列の同一性≧８５％、好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％を有する。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０又は１１に示されるようなアミノ酸配列の同一性≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％又は≧９９％を有する。

別の好ましい例において、前記阻害剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０又は１１に示されるようなポリペプチドである。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３線状エピトープ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３線状エピトープを標的とする小分子化合物である。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、（ａ）及び（ｂ）の組み合わせである。

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しい又は好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長Ｓタンパク質、Ｓ１タンパク質及びＳ２タンパク質に対する７６Ｅ１抗体の結合活性を示す。ここで、７６Ｅ１抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長Ｓタンパク質及びＳ２タンパク質には結合できるが、Ｓ１タンパク質には結合できない。 ７６Ｅ１抗体が様々なコロナウイルスのＳタンパク質に広域的に結合できることを示す。ここで、図２Ａ－Ｃは、７株のヒトに感染するコロナウイルスＳタンパク質への７６Ｅ１／７６Ｆ６／２８－１２の結合状況を示し、図２Ｄは、７株のインビトロで精製されたコロナウイルスＳタンパク質と７６Ｅ１との間の親和性分析の結果を示し、図２Ｅ－Ｇは、細胞表面のＳタンパク質に対する７６Ｅ１の結合活性のフローサイトメトリー分析の結果を示し、図２Ｈ－Ｉは、７６Ｅ１抗体が様々な新型コロナウイルス突然変異株に広域的に結合できることを示す。 ７６Ｅ１抗体が様々なコロナウイルスのＳタンパク質に広域的に結合できることを示す。ここで、図２Ａ－Ｃは、７株のヒトに感染するコロナウイルスＳタンパク質への７６Ｅ１／７６Ｆ６／２８－１２の結合状況を示し、図２Ｄは、７株のインビトロで精製されたコロナウイルスＳタンパク質と７６Ｅ１との間の親和性分析の結果を示し、図２Ｅ－Ｇは、細胞表面のＳタンパク質に対する７６Ｅ１の結合活性のフローサイトメトリー分析の結果を示し、図２Ｈ－Ｉは、７６Ｅ１抗体が様々な新型コロナウイルス突然変異株に広域的に結合できることを示す。 ７６Ｅ１抗体が様々なコロナウイルスのＳタンパク質に広域的に結合できることを示す。ここで、図２Ａ－Ｃは、７株のヒトに感染するコロナウイルスＳタンパク質への７６Ｅ１／７６Ｆ６／２８－１２の結合状況を示し、図２Ｄは、７株のインビトロで精製されたコロナウイルスＳタンパク質と７６Ｅ１との間の親和性分析の結果を示し、図２Ｅ－Ｇは、細胞表面のＳタンパク質に対する７６Ｅ１の結合活性のフローサイトメトリー分析の結果を示し、図２Ｈ－Ｉは、７６Ｅ１抗体が様々な新型コロナウイルス突然変異株に広域的に結合できることを示す。

７６Ｅ１抗体が様々なコロナウイルス及び新型コロナウイルス突然変異株の偽ウイルスを広域的に中和できることを示す。 ７６Ｅ１抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の真ウイルスを中和できることを示す。 ７６Ｅ１抗体がＳ２ ８０９－８３３及び８０９－８２３の線状エピトープを識別することを示す。 ウイルスと細胞膜の融合を阻害する７６Ｅ１抗体のクリスタルバイオレット染色の結果を示す。

Ｓ２’酵素消化部位の酵素消化を阻害する７６Ｅ１抗体のウェスタンブロットの結果を示す。 ７６Ｅ１抗体の動物保護実験方案を示す。 ７６Ｅ１抗体がＡＣＥ２ヒト化マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスの感染から保護し、その体重減少を軽減させ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルス感染後のＡＣＥ２ヒト化マウスの肺部ウイルス量を減少させることを示す。

本発明者らは、広範囲で綿密な研究を通じて、コロナウイルスＳ２タンパク質に対する完全ヒトモノクローナル抗体７６Ｅ１を予期せずに入手した。当該抗体は、コロナウイルスＳ２タンパク質に広域的に結合することができ、コロナウイルスに対して高い結合中和活性を有し、広域スペクトルの識別及び広域スペクトルの中和を有し、コロナウイルスが感染しやすい細胞に感染するのを阻害又は阻止することができる。インビトロ及びインビボ実験により、７６Ｅ１抗体がコロナウイルス感染を効果的に予防及び制御することが確認される。これに基づいて、本発明によって完了される。

本発明では、新型コロナウイルスに感染して回復した患者のボランティアＰＢＭＣから、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ技術により、抗コロナウイルス完全ヒト広域スペクトル中和抗体７６Ｅ１をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ結合実験及び細胞レベルの中和実験により、７６Ｅ１抗体がコロナウイルスＳ２タンパク質に対して広域結合活性及び広域中和活性を有することが確認された。７６Ｅ１抗体は、完全ヒト抗体に属し、マウス成分を含まないため、免疫原性が低く、安全性が高くなり、これは、コロナウイルス感染に対する当該抗体の潜在的な臨床応用価値を示し、臨床におけるコロナウイルス感染に対する新たな候補薬を提供する。本発明の抗体は、コロナウイルスＳタンパク質に結合し、特にＳタンパク質融合ペプチドの８０９－８２３位又はＳタンパク質融合ペプチドの８０９－８３３位に結合し、７６Ｅ１抗体エピトープの発見は、コロナウイルスワクチンの設計に新しいアィデア及び参照資料も提供する。

用語
本発明をより容易に理解するために、特定の技術的及び化学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書で明確に定義しない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的及び化学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本発明を説明する前に、本発明は、記載された具体的な方法及び実験条件に限定されないことを理解されたく、そのような方法及び条件は、変化し得るからである。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明することのみを意図し、限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。

別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用されるように、具体的に記載された数値に関して使用される場合、「約」という用語は、当該値が記載された値から１％以下しか変化できないことを意味する。例えば、本明細書で使用されるように、「約１００」という用語は、９９～１０１の間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。

本発明で使用されるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載されたとおりである。
本明細書で使用されるように、「治療」という用語は、本発明のコロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）に対するモノクローナル抗体及びその組成物を含む、患者への内部又は外部治療剤の投与を指し、前記患者は、一種又は複数種の疾患症状を有し、前記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有することが知られている。通常、一種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（治療有効量）で患者に投与する。

本明細書で使用されるように、「任意選択」又は「任意選択で」という用語は、後述する事件又は状況が発生する可能性があるが、かならず発生するのではないことを意味する。例えば、「任意選択で１－３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が必ずではないが、１個、２個又は３個を有することができることを意味する。

本発明に記載の「配列同一性」は、適切な交換、挿入又は欠失等の突然変異を有する状況下で最適と比較される場合の二つの核酸又は二つのアミノ酸配列の間の同一性程度を指す。本発明中に記載の配列とその同一性を有する配列の間の配列同一性は、少なくとも８５％、９０％又は９５％、好ましくは少なくとも９５％であり得る。非限定的な実施例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％を含む。

コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＣｏＶ）
コロナウイルスは、系統的に分類すると、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス属（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）に属する。コロナウイルス属のウイルスは、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、及び直鎖状一本鎖プラス鎖のゲノムを有するＲＮＡウイルスであり、自然化に広く存在する大きなクラスのウイルスである。コロナウイルスの直径は、約８０～１２０ｎｍであり、ゲノム５′末端は、メチル化されたキャップ構造を有し、３′末端は、ｐｏｌｙ（Ａ）テールを有し、ゲノムの全長は、約２７－３２ｋｂであり、既知のＲＮＡウイルス中で最も大きなゲノムを有するウイルスである。それは、ヒト、マウス、ブタ、ネコ、イヌ、オオカミ、ニワトリ、ウシ、家畜等の脊椎動物のみに感染する。

２０１９年の新型コロナウイルス（新型コロナウイルス肺炎ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、今までヒトに感染できる既知の７番目のコロナウイルスであり、残りの六つは、それぞれＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群を引き起こす）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群を引き起こす）である。

より優れた治療効果を有する新型コロナウイルス抗体薬を取得し、且つ新たな抗体識別エピトープを探索するために、本発明は、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ技術を使用して、ヒト末梢血ＰＢＭＣから広域スペクトル中和抗体７６Ｅ１を単離した。新たな抗体の発見は、広域スペクトル中和抗体の治療応用に新たな選択肢を提供し、もう一方では、新しいエピトープの発見は、広域スペクトルワクチンの開発に新しいアィデアを提供した。

抗体
本明細書で使用されるように、「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）及び二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖及び軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を有し、別の端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域に対向し、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域に対向する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域間で界面を形成する。

本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体中の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合及び特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分散されていない。これは、軽鎖及び重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中する。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与するが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、様々なエフェクター機能を示す。

脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に従って、二つの異なるクラス（κ及びλと呼ばれる）のいずれかに割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの五つの主なクラスがあり、そのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２等のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は、当業者に周知である。

本明細書で使用されるように、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、即ち、当該集団に含まれる個々の抗体は、いくつかの可能性のある自然に発生する突然変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して非常に特異的である。また、従来のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基に対する異なる抗体を有する）とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を表し、これは、抗体精製に特定の方法が必要であると解釈されるべきではない。

本発明は、前記抗コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）モノクローナル抗体の対応するアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体、前記抗コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）モノクローナル抗体可変領域鎖を有するモノクローナル抗体、ならびにこれらの鎖を有する他のタンパク質又はタンパク質コンジュゲート及び融合発現生成物をさらに含む。具体的には、本発明は、当該超可変領域が本発明の軽鎖及び重鎖の超可変領域と同一であるか、又は少なくとも９０％相同性、好ましくは少なくとも９５％相同性である限り、超可変領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）を含む軽鎖及び重鎖を有する任意のタンパク質又はタンパク質コンジュゲート及び融合発現生成物（即ち、免疫コンジュゲート及び融合発現生成物）を含む。

当業者に知られているように、免疫コンジュゲート及融合発現生成物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素ならびに他の診断用分子又は治療用分子を前記抗コロナウイルスＳタンパク質モノクローナル抗体又はその断片に結合して形成されるコンジュゲートを含む。本発明は、前記抗コロナウイルスＳタンパク質モノクローナル抗体又はその断片に結合する細胞表面マーカー又は抗原をさらに含む。

「抗体の抗原結合断片」（又は「抗体断片」と略称する）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ又は複数の断片を指す。完全長抗体の断片を利用して、抗体の抗原結合機能を発揮できることが示される。「抗体の抗原結合断片」という用語に含まれる結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片のＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域上のジスルフィド架橋によって接続された二つのＦａｂ断片を含む二価断片のＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨドメイン及びＶＬドメインからなるＦｖ断片を含む。Ｆｖ抗体は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域を含まず、すべての抗原結合部位の最小抗体断片を有する。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。

本発明は、完全なモノクローナル抗体だけでなく、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’）２断片等の免疫活性を有する抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖も含む。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、一般に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続又は非連続アミノ酸を独特の空間的立体構造でふくむ。

「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的に結合する」及び「特異的に結合する」という用語は、抗原上の所定のエピトープへの抗体の結合を指す。通常、抗体は、約１０^－７Ｍ未満、例えば約１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満又はｌ０^－１０Ｍ未満又はそれ以下の的親和性（ＫＤ）で結合する。

本明細書で使用されるように、「抗原決定基」という用語は、抗原上で非連続で、本発明の抗体又は抗原結合断片によって識別される三次元部位を指す。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫学的活性を有する抗体の断片又は抗体及び他の配列によって形成された融合タンパク質も含む。従って、本発明は、前記抗体の断片、誘導体及び類似体をさらに含む。

本発明において、抗体は、当業者に周知の技術を使用して調製されたマウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒトの抗体を含む。組換え抗体は、当技術分野で周知のＤＮＡの組換え技術を使用して調製されることができる、ヒト及び非ヒト部分を含む、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体等の有用な抗体である。「マウス由来抗体」という用語は、本発明において、当技術分野の知識及び技術に従って調製される、コロナウイルスＳタンパク質に対するモノクローナル抗体を指す。「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、マウス由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とを融合させることによって形成される抗体であり、マウス由来抗体によって誘導される免疫応答反応を低減することができる。ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれる「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、マウスのＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワーク、即ち異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列に移植することによって産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質成分を保持しているため、キメラ抗体によって誘発される異種反応を克服することができる。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベース又は公開された参照文献から入手することができる。免疫原性の低下及び活性の低下を避けるために、前記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最小限の復帰突然変異又は復帰突然変異を実行して、活性を維持することができる。

本発明において、抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はより多くの多重特異性であり得る。
本明細書で使用されるように、「重鎖可変領域」及び「ＶＨ」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、「可変領域」及び「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」という用語は、交換可能に使用される。

「ＣＤＲ」という用語は、主に抗原結合に寄与する、抗体の可変ドメイン内の六つの超可変領域のうちの一つを指す。前記六つのＣＤＲの最も一般的に使用される定義の一つは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２）によって提供される。

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、
ＣＤＲ１：ＧＦＳＦＫＤＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３）、
ＣＤＲ２：ＩＳＧＤＴＲＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４）、及び
ＣＤＲ３：ＡＡＬＶＩＶＡＡＧＤＤＦＤＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５） の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含む。

別の好ましい例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されたとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、順次に重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＦＳＦＫＤＹＧＭＨＷＩＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＩＳＲＩＳＧＤＴＲＧＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＩＶＳＲＤＮＳＲＮＳＬＦＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＬＶＩＶＡＡＧＤＤＦＤＬＷＧＱＧＴＶＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１）

別の好ましい例において、前記重鎖可変領域の核酸コード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８に示されたとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、順次に重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の核酸コード配列である。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＧＡＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８）

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、前記重鎖可変領域及び重鎖決定領域を含み、前記重鎖可変領域は、マウス由来であってもヒト由来であってもよい。
本明細書で使用されるように、「軽鎖可変領域」及び「Ｖ_Ｌ」という用語は、交換可能に使用される。

本発明の好ましい実施形態において、本発明による抗体の軽鎖可変領域は、
ＣＤＲ１’：ＳＳＤＩＧＳＹＮＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６）、
ＣＤＲ２’：ＥＶＮ、及び
ＣＤＲ３’：ＣＳＹＧＧＲＮＮＬＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７）からなる群から選択される相補性決定領域ＣＤＲを有する。

別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されたとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、順次に軽鎖可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
ＱＳＡＬＴＱＰＬＳＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＤＩＧＳＹＮＦＶＳＷＹＲＱＹＰＧＫＡＰＫＶＭＩＹＥＶＮＫＲＰＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＶＳＧＬＱＨＥＤＥＡＤＹＹＣＣＳＹＧＧＲＮＮＬＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２）

別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域の核酸コード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９に示されたとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、順次に軽鎖可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’の核酸コード配列である。
ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９）

本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の軽鎖は、上記軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み、前記軽鎖定常領域は、マウス由来であってもヒト由来であってもよい。

本発明の抗体の機能は、この抗体軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子の億医的遺伝子配列によって決定され、コロナウイルスのＳ２タンパク質に広域的に結合することができ、コロナウイルスが感受性のある細胞に感染するのを防ぐことができる。この抗体可変領域遺伝子又は相補性決定領域（ＣＤＲ）遺伝子を使用すると、原核細胞及び真核細胞を使用する任意の発現系で、様々な形態の遺伝子操作抗体を操作及び生産することができる。

本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、又は「本発明のポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、すべてコロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）に特異的に結合する抗体、例えば、重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列）及び／又は軽鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列）を有するタンパク質又はポリペプチドを指す。それらは、出発メチオニンを含んでも含まなくてもよい。

別の好ましい例において、前記抗体は、抗コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）のマウス又は人マウスキメラモノクローナル抗体であり、その重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域は、ヒト化重鎖定常領域又は軽鎖定常領域であり得る。より好ましくは、前記ヒト化重鎖定常領域又は軽鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２等の重鎖定常領域又は軽鎖定常領域である。

一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖及び軽鎖の可変領域に位置する三つの特定の領域によって説明でき、当該セクションを四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割され、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存され、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβフォールディングは、空間構造的に近接し、重鎖のＣＤＲ及びそれに対応する軽鎖のＣＤＲは、抗体の抗原結合部位を構成する。同種の抗体のアミノ酸配列を比較することにより、ＦＲ又はＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を決定することができる。

本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域は、それらの少なくともいくつかが抗原との結合に関与するため、特に興味深い。従って、本発明は、そのＣＤＲがここで同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有する限り、ＣＤＲを有するそれらのモノクローナル抗体の軽鎖和重鎖可変領域をゆする分子を含む。

本発明は、完全なモノクローナル抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体の断片又は抗体と他の配列とで形成される融合タンパク質も含む。従って、本発明は、前記抗体の断片、誘導体及び類似体をさらに含む。例えば、本発明の抗体に基づくＦｃ断片の改変では、抗体の半減期を延長するために、ＣＨ２領域に三つの突然変異点Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅが導入される。

本明細書に使用されるように、「断片」、「誘導体」及び「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能又は活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体又は類似体は、（ｉ）一つの又は複数の保存的又は非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされる場合とされない場合であり得る）、又は（ｉｉ）一つの又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチド又は（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列又は分泌配列又はこのポリペプチドを精製するための配列又はタンパク質配列又は６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示に従って、これらの断片、誘導体及び類似体は、当業者の周知の範囲内である

本発明の抗体とは、コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。当該用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異形態をさらに含む。これらの変異形態は、一つ又は複数（通常は、１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個である）のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、及びＣ末端及び／又はＮ末端での一つ又は複数（通常は、２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内である）のアミノ酸の追加を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野において、類似又は近似の性能を有するアミノ酸によって置換される場合、通常、タンパク質の機能を変化させない。別の例として、Ｃ末端及び／又はＮ末端での一つ又は複数のアミノ酸の追加も、通常、タンパク質の機能を変化させない。当該用語は、本発明の抗体の活性断片及び活性誘導体をさらに含む。

当該ポリペプチドの変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高い又は低いストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコーティングＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、及び本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチド又はタンパク質を含む。

本発明は、ヒト抗体又はその断片を含む融合タンパク質等の他のポリペプチドをさらに提供する。ほとんどの全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明の抗体の断片をさらに含む。通常、当該断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約６０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続アミノ酸を有する。

本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」は、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が同様又は類似の性質を有するアミノ酸の置換によって形成されたポリペプチドを指す。これらの保存性変異体ポリペプチドは、表Ａに従って、アミノ酸置換を行うことにより生成されるのが最もよい。

本発明は、前記抗体又はその断片又はその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態又はＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８又は９に示されるコード領域配列と同じであるか、又は縮重される変異体である。本明細書で使用されるように、「縮重される変異体」とは、本発明において、本発明のポリペプチドと同一のアミノ酸配列をコードするが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８又は９に示されるコード領域配列とは異なる核酸配列を指す。

本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列及び様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（及び任意の追加のコード配列）及び非コード配列を含む。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。

本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０oＣ等のより低いイオン強度及びより高い温度でのハイブリダイズ及び溶出、又は（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２oＣ等の変性剤の添加、又は（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を有する。

本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列又はその断片は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法又は人工合成法によって得ることができる。特に断片の長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さな断片を合成した後、接続して非常に長い配列の断片を獲得する。さらに、重鎖のコード配列及び発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。

関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。

現在、完全に化学的合成によって本発明のタンパク質（又はその断片又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（又はベクター等）及び細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。

本発明は、前記適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。

宿主細胞は、例えば、細菌細胞等の原核細胞、又は例えば、酵母細胞等の下等真核細胞、又は例えば、哺乳動物細胞等の上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、チャイニーズハムスター菌の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７及び２９３細胞の動物細胞等を含む。

組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ_２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクション及びエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。

得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換又は化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。

前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、又は細胞膜で発現されるか、又は細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的及びその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離及び精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本発明の抗体は、単独で使用することができ、検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分又は任意のこれらの物質の組み合わせと結合又はカップリングすることができる。

診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光又は発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、又は検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。

カップリングできる治療剤は、インスリン、ＩＬ－２、インターフェロン、カルシトニン、ＧＨＲＨペプチド、腸ペプチド類似体、アルブミン、抗体断片、サイトカイン、及びホルモンを含むが、これらに限定されない。

さらに、本発明の抗体と結合又はカップリングできる治療剤は、１．放射性核種、２．生物学的毒性、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素、１０．化学療法剤（例えば、シスプラチン）又は任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。

本発明は、組成物をさらに提供する。好ましい例において、前記組成物は、本発明の上記抗体又はその活性断片又はその融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質及び治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、経口、呼吸器、腫瘍内、静脈内、又は局所投与を含む（これらに限定されない）。

本発明の医薬組成物は、コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）分子に結合するために直接使用されることができ、従って、薬物の半減期を延長するために使用されることができ、さらに、他の治療剤と同時に使用することができる。

本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明のモノクローナル抗体（又はそのコンジュゲート）及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。このような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水又はグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤及び溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤とともに使用することもできる。

医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路及び患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。

検出用途及びキット
本発明の抗体は、例えば試料の検出等の検出適用に使用され、それによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される試料（サンプル）は、細胞、組織試料及び生検標本を含む。本発明で使用される「生検」という用語は、当業者に知られているあらゆる種類の生検を含むものとする。従って、本発明で使用される生検は、内視鏡又は器官の穿刺又は針生検によって調製される組織試料を含むことができる。

本発明で使用される試料は、固定又は保存された細胞又は組織試料を含む。
本発明は、本発明の抗体（又はその断片）を含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書緩衝剤等を含む。好ましい例において、本発明の抗体は、検出プレートに固定化されることができる。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３線状エピトープ
本発明によって提供されるモノクローナル抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８２３線状エピトープ（抗原性エピトープペプチド）に結合し、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３線状エピトープ（抗原性エピトープペプチド）に結合し、具体的な配列は、次のとおりである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３線状エピトープ（抗原性エピトープペプチド）：
ＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８２３線状エピトープ（抗原性エピトープペプチド）：
ＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１）
ここで、８１５（Ｒ）、８１９（Ｅ）、８２３（Ｆ）は、本発明の抗体７６Ｅ１が機能する最も重要なエピトープであり、８２０（Ｄ）及び８２２（Ｌ）は、二次重要なエピトープである。

当該エピトープに基づいて、本発明は、ワクチン組成物をさらに提供し、前記ワクチン組成物は、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸配列又はその部分配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列）を含むポリペプチドと、及び
（ｉｉ）ワクチン上に許容される担体とを含む。

さらに、本発明は、阻害剤を提供し、前記阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８２３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３の線状エピトープを標的とし、新型コロナウイルスの感染を阻害するために使用される。

別の好ましい例において、前記阻害剤は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸配列又はその部分配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含む）を含むポリペプチドである。

別の好ましい例において、前記阻害剤は、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３線状エピトープを標的とする小分子化合物である。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、（ａ）及び（ｂ）の組み合わせである。

本発明の主な利点は、次のとおりである。
（１）本発明の完全ヒトモノクローナル抗体は、コロナウイルスのＳタンパク質を特異的に識別して結合することができ、コロナウイルスに対して非常に高い中和活性を有し、ヒトに感染するコロナウイルス２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＮＬ６３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶの７株を中和し、感染しやすい細胞にコロナウイルスが感染するのを効果的に阻害又は防止することができる。
（２）本発明の完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なコロナウイルスに対して広域結合活性及び広域中和活性を有し、様々なコロナウイルスを効果的に中和することができる。

（３）本発明は、マウス由来部分を含まない完全ヒトモノクローナル抗体７６Ｅ１であり、ヒトに対して、免疫原性が低く、安全性が高く、ヒト抗マウス等の他の種類に由来する抗体媒介性免疫拒絶反応を回避することができる。
（４）本発明の完全ヒトモノクローナル抗体７６Ｅ１は、コロナウイルスＳタンパク質、特にＳ２タンパク質上の融合ペプチドに結合し、それは、ヒト段落の線状エピトープであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸（例えば、８０９－８３３アミノ酸）であり、７６Ｅ１抗体エピトープの発掘も、コロナウイルスワクチンの設計にいくつかのアィデア及び参考情報を提供する。

以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、又はメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージ及び部数は、重量パーセンテージ及び重量部数で計算される。

本発明の実施例又は試験例において具体的な条件を示していない実験は、通常、従来の条件、又は原料／商品メーカーが提示する条件に従って実施され、具体的な出所が示されていない試薬は、市場で購入された従来の試薬である。

以下に、本発明のコロナウイルスＳタンパク質を中和することができる中和型完全ヒトモノクローナル抗体の調製及び抗体特性分析工程を説明する。
実施例１．抗体遺伝子及び抗体発現を取得するための単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ法
１．１．末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の所得
健康なボランティア体内から末梢血を採取し、従来のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｈ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ）会社である）密度勾配遠心分離によって、１０^７以上の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得る。

Ｆｉｃｏｌｌ分離法：
（１）血液を、５０ｍｌの遠心分離管（予め４％のクエン酸ナトリウム１ｍｌを含む）に収集し、全血２０ｍｌを収集し、８－１０回均等に転倒混合し（即ち、クエン酸ナトリウムの最終濃度が０．４％になるようにする）、
（２）等量のＲＰＭＩ１６４０を加え（クエン酸ナトリウムを含む）、均等に混合し、
（３）１５ｍｌの透明遠心分離管を用いて、３ｍｌのリンパ球分離液をプレーティングし、その上に６ｍｌの血液サンプルを注意深く加える。分離界面を形成し（又は４ｍｌの分離液に８ｍｌの血液サンプルを加える）、
（４）室温化で８００ｇ、２０分間遠心分離し（２０００ｒｐｍ、２０分間）、
（５）界面層細胞を注意深く吸い取り、新しいチューブに移し、
（６）ＲＰＭＩ１６４０（クエン酸ナトリウムを含む）を加え、液体密度が下がるまで希釈する。８００ｇ／２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。上清を捨て、
（７）ＲＰＭＩ１６４０で細胞を２－３回洗浄し、備蓄する。

１．２．スパイクタンパク質Ｓ特異性記憶Ｂ細胞の取得
ＦＩＴＣ－ＣＤ１９／ＡＰＣ－ＩｇＧ／ＢＶ４２１－Ｓタンパク質をマーカーとして使用し、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標） Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ７８０－ＡＰＣ－Ｃｙ７は、死細胞を除去し、ＣＤ４／ＣＤ１４／ＣＤ８－ｐｅｒｃｐ５．５は、マクロファージ及びＴ細胞等を除去し、フローサイトメトリーによって特異的なＢ細胞を取得し、９６ウェルＲＴ－ＰＣＲプレートに１ウェルあたり１細胞ずつ移して、Ｓタンパク質特異性記憶Ｂ細胞を取得する。
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、哺乳類細胞のＣＨＯ発現系によって発現される。Ｓタンパク質配列は、ｎＣｏＶ－ＳＨ０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＴ１２１２１５．１）を参照し、上海ＧＥＮＥｒａｙ会社で全遺伝子合成が行われ、
（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）で標識して、ビオチン標識Ｓタンパク質を検出し、
（３）選別された細胞の標識：ＰＢＭＣ細胞を実験群＋対照群に分け、細胞数に応じてマーカーを加え、暗所で染色し、標識し、ＰＢＳで再懸濁した後、４０μｍのＢＤ ｆａｌｃｏｎろ過膜でろ過し、
（４）特異的Ｂ細胞の選別：ＢＤ ＦＡＣＳ Ｉｎｆｌｕｘを使用してスクリーニングし、前方角及び側方角に従って、ＰＢＭＣからリンパ球をスクリーニングし、次に異なる対照群の調節及び補償を通じて、Ｓタンパク質の特異性記憶Ｂ細胞を得、それを、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）用に９６ウェルプレートに１ウェルあたり１細胞ずつ選別し、プレートをドライアイスに置く。

１．３．抗体遺伝子の取得及びベクターの構築
取得した単一記憶Ｂ細胞をＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡを取得し、次にｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲによって抗体遺伝子の可変領域を取得し、アガロース核酸ゲルを実行して、重鎖及び軽鎖が対になるゲルブロックを回収及びシーケンシングする。取得した抗体遺伝子配列を検索する。次に抗体遺伝子を、それぞれ対応するＩｇＨ、Ｉｇκ及びＩｇλ発現ベクターに連結する。完全ヒト抗体発現ベクターＩｇＨ、Ｉｇκ及びＩｇλ（それぞれ抗体ｈｅａｖｙ鎖、ｋａｐｐａ鎖、ｌａｍｂｄａ鎖を発現する）は、Ｐａｔｒｉｃｋ Ｗｉｌｓｏｎ実験室から寄贈された。

１．４．抗体の発現及び精製
完全ヒト抗体発現のためにＣＨＯ細胞を一時的にトランスフェクトする。トランスフェクションの１日目（-１日目）、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を最終密度３×１０^６-４×１０^６生細胞／ｍＬに分割し、細胞を一晩増殖させる。翌日（０日目）、生細胞の密度和生存率を測定する。細胞密度は、約７×１０^６-１０×１０^６生細胞／ｍＬに達する必要がある。トランスフェクションを続行するには、生存率が９５-９９％である必要がある。最終密度６×１０^６生細胞／ｍＬになるように細胞を希釈する。予め冷やした試薬（４℃）を使用してＥｘｐｉ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製する。室温下でＥｘｐｉ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を１-５分間インキュベートした後、溶液をＣＨＯ細胞培養フラスコにゆっくりと移し、添加中に培養フラスコを穏やかに振とうする。細胞をオービタルシェーカー（３７℃のインキュベーターは、８％ＣＯ_２の過失空気条件を含む）で培養する。７－１１日間培養し、細胞の半分が死亡した時点で上清を収集し、抗体を生成し始めることができる。

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ａｇａｒｏｓｅ ４ＦＦ充填剤（ＧＥから購入される）を使用して抗体を精製する。まず、収集したＣＨＯ細胞懸濁液を４０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、収集した上清を０．４５ｕｍのｆｉｌｔｅｒでろ過し、精製する。重力式スピンカラムを使用し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ａｇａｒｏｓｅ ４ＦＦ充填剤を加え、カラム容積の３倍の２０％エタノールを使用して充填剤を安定させ、その後カラム容積の５倍の結合緩衝液を使用してカラムを平衡化し、次にサンプルをローディンクし、カラム容積の１０倍の結合緩衝液を使用してカラムを平衡化し、最後にカラム容積の３倍の溶出緩衝液でカラムを溶出し、溶出した抗体溶液に中和ｂｕｆｆｅｒを加えて、溶出したサンプルのｐＨを約７．５とする。抗体溶液を５Ｌの１＊ＰＢＳで３回透析し、即ち抗体を濃縮して－８０℃に保存することができる。

１．５．実験結果：
単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ及びＮｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を使用して、分子量約４００ｂｐの一致する抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を取得する。アガロースゲルを回収し、シーケンシングする。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ 及ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／でシーケンシング結果を比較して、抗体の生殖系列遺伝子情報及び抗体重鎖及び軽鎖遺伝子の超可変領域情報を取得し、発現ベクターの構築及び後続の発現精製を実行する。最後に、当該技術により、コロナウイルスを広域的に中和する完全ヒトモノクローナル抗体の取得に成功し、７６Ｅ１と名付けられる。

完全ヒト抗体７６Ｅ１の重鎖可変領域の遺伝子配列は、次のとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、重鎖遺伝子可変領域中の超可変領域の配列であり、順次に重鎖遺伝子ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列である。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＧＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＧＡＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：８）

完全ヒト抗体７６Ｅ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、次のとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、順次に重鎖アミノ酸ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３配列である。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＥＡＳＧＦＳＦＫＤＹＧＭＨＷＩＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＩＳＲＩＳＧＤＴＲＧＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＩＶＳＲＤＮＳＲＮＳＬＦＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＬＶＩＶＡＡＧＤＤＦＤＬＷＧＱＧＴＶＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１）

完全ヒト抗体７６Ｅ１の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、次のとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、軽鎖遺伝子の可変領域中の超可変領域の配列であり、順次にＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’及びＣＤＲ３’配列である。
ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：９）

完全ヒト抗体７６Ｅ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、次のとおりであり、ここで、下線を引いた配列は、順次に軽鎖アミノ酸ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’及びＣＤＲ３’配列である。
ＱＳＡＬＴＱＰＬＳＶＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＤＩＧＳＹＮＦＶＳＷＹＲＱＹＰＧＫＡＰＫＶＭＩＹＥＶＮＫＲＰＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＶＳＧＬＱＨＥＤＥＡＤＹＹＣＣＳＹＧＧＲＮＮＬＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２）

実施例２．抗体の特性分析
２．１．抗体結合抗原活性のＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡを使用して、発現された抗体が様々なコロナウイルスＳタンパク質を識別するかどうかを検出する。様々なコロナウイルスＳタンパク質は、北京ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ株式会社から購入される。２８－１２は、自分の研究室で調製された陰性対照抗体である。Ｓタンパク質ＥＬＩＳＡプレート、０．５μｇ／ｍＬ、ウェルあたり１００μＬを４℃下で一晩コーティングする。翌日ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。２％ＢＳＡ、ウェルあたり２００μＬ、３７℃で２時間ブロックする。再びＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。７６Ｅ１および対照抗体を３倍に連続希釈し、初期試験濃度は、１０μｇ／ｍｌである。サンプルをウェルあたり１００μＬ、３７℃で２時間ローディングする。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）-Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｉｇｍａ）をウェルあたり１００μＬ、３７℃、１時間で１：８０００に希釈する。ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。基質ＴＭＢ１００μＬ／ウェルを加えて発色させ、色が浅い場合は、暗所で３７℃で１５分間反応させる。ウェルあたり５０μＬの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させる。ＯＤ_４５０を測定し、データを処理する。

２．２．バイオフィルム層干渉技術（ＢＬＩ）親和性検出
この実験は、生化学細胞研究所の分子プラットフォームでＯＣＴＥＴ ＲＥＤ ９６機器を使用して実施される。まず、ＡＨＣ ｓｅｎｓｏｒをＰＢＳ含有９６ウェル黒色プレートに置き、少なくとも１０分間浸し、サンプル７６Ｅ１を２０ｕｇ／ｍｌの濃度で加え、抗原を濃度勾配し、２００ｎＭ－１００ｎＭ－５０ｎＭ－２５ｎＭ－１２．５ｎＭ－６．２５ｎＭに２倍連続希釈し、抗体抗原、再生ｂｕｆｆｅｒ及びＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを別の黒色プレートに加え、機器上に置き、プログラムを設定して実行を開始し、プログラムは、ｂａｓｅｌｉｎｅ １２０ｓ→ｌｏａｄｉｎｇ Ａｂ→３００ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ→２４０ｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ→９００ｓ－ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ→９００ｓ－ｒｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ→５ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ→５ｓ－ｒｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ→５ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ→５ｓ－ｒｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ→５ｓ－ｂａｓｅｌｉｎｅ→５ｓであり、ソフトウェアでデータを分析し、抗原抗体親和性ＫＤ値を計算する。

２．３．偽ウイルス中和実験
全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ等のヒトコロナウイルスＳタンパク質プラスミド及びｐＮＬ４－３プラスミドを、１０ｃｍの培養皿で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、６時間で液体を交換し、４８時間後に上清液を収集し、完全培地で希釈する。抗体を連続希釈し、等量のウイルスと混合し、３７℃下で１時間培養する。抗体及びウイルスの混合物を、安定的に発現したヒトＡＣＥ２のＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は対応するコロナウイルス受容体を発現する細胞に移す。３７℃下で４８時間培養する。上清を除去し、細胞に溶解緩衝液を加え、十分に溶解する。ルシフェラーゼ活性（Ｐｒｏｍｅｇａ）を検出する。実験群のルシフェラーゼ値とウイルス対照群のみのルシフェラーゼ値とを比較することによって、中和効率を計算する。計算式は、次のとおりである。
阻害活性パーセンテージ（％）＝（ウイルス対照平均値－試験ウェルの読み取り値）／（ウイルス対照平均値－細胞対照平均値）×１００
ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって計算される。

２．４．シンシチウム形成実験
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするプラスミドは、それぞれＨｅｌａ細胞にトランスフェクトされる。同時に、別のＨｅｌａ細胞には、ｈＡＣＥ２及びｈＤｐｐ４をコードするプラスミドをそれぞれトランスフェクトする。トランスフェクションの４８時間後、Ｓタンパク質を発現するＨｅｌａ細胞を様々な濃度の抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。ＡＣＥ２を発現するＨｅｌａ細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を発現する上記細胞抗体混合物と１：１の比率で混合し、３７℃下で１２時間培養する。同様に、ｈＤｐｐ４を発現するＨｅｌａ細胞は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質を発現する上記細胞抗体混合物を１：１で混合し、３７℃下で１２時間培養する。４％ＰＦＡで細胞を１５分間固定する。クリスタルバイオレット染色を２時間実行する。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７３共焦点顕微鏡を使用して画像を収集及び分析する。

２．５．酵素消化阻害実験
新たに精製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を調製し、それぞれ、７６Ｅ１及び対照抗体２８－１２と１：５の比率で室温下で１時間インキュベートし、質量比Ｔｒｙｐｓｉｎ：ＨＡ＝１：１００に従ってＴＰＣＫ－Ｔｒｙｐｓｉｎを加え、室温（２２℃）下で酵素消化を実行し、Ｔｒｙｐｓｉｎの添加時間を０分として記録し、それぞれ１０分間、２０分間、４０分間で混合物のサンプルを取り出した後、タンパク質ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒをすぐに添加し、１００℃でサンプルを１０分間煮沸し、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）により、６ｘＨｉｓ抗体を使用してＨｉｓ発色状況を検出して、ＨＡプロテアーゼの切断状況を判断する。

２．６．真ウイルス中和実験
（１）細胞接種：対数増殖期のＶｅｒｏ－Ｅ６細胞（新型コロナウイルス）又はＲＤ細胞（ＯＣ４３）を取り、９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００μｌ、ウェルあたり４×１０^４細胞で接種する。

（２）中和実験：
試験サンプルの希釈：１０μｇ／ｍｌの事前希釈サンプル６０μｌを９６ウェルプレートの列１（列Ｂ－Ｇ）に加え、ウイルス希釈液６０μｌを加えて、抗体最終濃度は、５μｇ／ｍｌになり、残りのウェルには、順次に３倍希釈したサンプル６０μｌを加える。列１は、細胞対照（Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＣ）に１２０μｌの無血清培地を加え、列８は、６０μｌの無血清をウイルス対照（Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＶＣ）に加える。

ウイルス希釈：ウイルスストック溶液の力価は、２．５×１０^５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、ウイルスストック溶液２００μｌを取り、２５ｍｌの無血清培地を加え、十分に混合し、ウイルスを１００ＴＣＩＤ５０／５０μｌに希釈する。
ウイルスの滴下：ウイルス（細胞対照を除く）を９６ウェルプレートに垂直に滴下し、サンプル量６０μｌ／ウェルを加え、最終的なウイルス－抗体混合液１２０μｌを得る。

中和：ローディングした細胞培養プレートをシェーカーで均等に混合し、３７℃のインキュベーターに入れ、１時間中和する。中和完了後、細胞を接種した培養プレートの上清液を吸引し、次にウイルス－血清混合液を１００μｌ／ウェル加え、３７℃下でＣＯ_２インキュベーターに入れて１時間培養し、感染させる。ウイルス感染完了後、培養プレート上の上清液を吸引し、プラーク形成実験サンプルを１％メチルセルロース含有維持培地（ＤＭＥＭ培地は、２％ＦＢＳを含む）に加え、３７℃下でＣＯ_２インキュベーターで７２－９６時間培養する。倒立顕微鏡を使用して４日目の結果を観察及び記録し、上清を捨て、プラーク形成実験サンプルをホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット染色し、プラークを数えて分析する。１００％阻害率を試験するには、２日目に倒立顕微鏡でＣＰＥを観察し、結果を記録する。

２．７．動物保護実験
マウスを用いた７６Ｅ１の予防実験：
１０週齢のｈＡＣＥトランスジェニック雌マウスを予めバイオセーフティレベル３実験室の動物実験室に配置し、４－６匹／群の３群に分け、０日目に、３群のマウスに、５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇの７６Ｅ１抗体及び対照としてのＰＢＳをそれぞれ接種する。２４時間後、０．５％ペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔し、鼻腔を通じて３．７ｘ１０＾４個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子をマウスに投与する。３日間継続的に体重を測定し、３日目に、マウスを安楽死させ、肺組織を解剖及び収集して、ウイルスＲＮＡの測定及び組織病理学的検査を実行する。

Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、肺組織からウイルスＲＮＡを抽出し、逆転写キット（中国Ｔｉａｎｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。Ｓｕｐｅｒ Ｒｅａｌ Ｐｒｅ Ｍｉｘ Ｐｌｕｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎキット及び上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子特異的プライマーを使用して、リアルタイム定量ＰＣＲを実行して、肺組織内のウイルスＲＮＡ含有量を測定する。
マウスの肺を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定する。ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して、組織パラフィン切片を染色する。Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で切片を観察する。

２．８．実験結果
（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２領域にのみ結合できる７６Ｅ１抗体
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に結合する７６Ｅ１抗体のエピトープ位置を研究するために、ＥＬＩＳＡ法を使用して、それぞれＳ全長、Ｓ１、Ｓ２タンパク質に対する７６Ｅ１抗体の結合活性を検証する。図１に示されるように、７６Ｅ１抗体は、Ｓ全長タンパク質及びＳ２タンパク質に結合できるが、Ｓ１には結合できない。７６Ｅ１抗体は、これまでに報告された受容体結合領域を標的とするほとんどの抗体とは異なり、主にＳ２を標的とし、これは、その作用メカニズムもＲＢＤを標的とする抗体とは異なることを意味する。

（２）様々なコロナウイルスＳタンパク質に広域的に結合できる７６Ｅ１抗体
Ｓ２領域は、Ｓタンパク質の茎に位置し、その配列は、様々なコロナウイルス間で高度に保存される。７６Ｅ１抗体が様々なコロナウイルスＳタンパク質に結合する能力を研究するために、ＥＬＩＳＡ法を使用して、インビトロで精製された様々な可溶性コロナウイルスＳタンパク質に対する７６Ｅ１抗体の結合活性を検証する。７６Ｆ６は、ＲＢＤを標的とする抗体であり、陰性対照抗体として使用される。本発明者らの実験室が所有する抗インフルエンザ完全ヒト抗体２８－１２を陰性アイソタイプ対照抗体として使用する。図２Ａ－Ｃに示されるように、７６Ｅ１抗体は、ヒトに感染する２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＮＬ６３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶの７株のコロナウイルスＳタンパク質に広域的に結合することができる。ＲＢＤ抗体７６Ｆ６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にのみ結合でき、陰性対照抗体２８－１２は、様々なコロナウイルスＳタンパク質に結合しない。

同時に、バイオフィルム層干渉技術によって、インビトロで精製された上記７株のコロナウイルスＳタンパク質と７６Ｅ１との間の親和性を分析する。７６Ｅ１及び７株のコロナウイルスＳタンパク質は、いずれもより高い親和性活性を示し、親和性は、ｎＭレベル以上に達する（図２、Ｄ）。細胞表面上のＳタンパク質に対する７６Ｅ１の結合活性をさらに研究するために、様々なＳタンパク質をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリーによって、細胞膜表面上のＳタンパク質に対する７６Ｅ１の結合活性を検出する。結果は、７６Ｅ１が七つの細胞表面に発現するＳタンパク質にすべて結合できるが、７６Ｆ６がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質にのみ結合できることを示す（図２、Ｅ）。しかしながら、７６Ｅ１は、三量体Ｓタンパク質の融合前の形態に結合できず、これは、７６Ｅ１がＳタンパク質の構造変化中の特定の形態を識別することを意味する（図２、Ｆ、Ｇ）。図２Ｈに示されるように、７６Ｅ１抗体は、様々な新型コロナウイルス突然変異株のＳタンパク質に結合でき、ウイルスの突然変異に抵抗することができる。図２Ｉに示されるように、７６Ｅ１抗体は、様々な新型コロナウイルス突然変異株のＳタンパク質に高い親和性で結合する。

（３）様々なコロナウイルスの偽ウイルスを広域的に中和できる７６Ｅ１抗体
７６Ｅ１の機能をさらに確認するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な突然変異株の偽ウイルスをパッケージングし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの中和実験をヒトＡＣＥ２を安定的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞で実行し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＨＣｏＶ－２２９Ｅ偽ウイルスの中和実験をｈｕｈ７細胞で実行する。実験は、７６Ｅ１が様々な能力で様々なの株の偽ウイルスを中和し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び突然変異株に対して最高の中和活性を有し、最高のＩＣ_５０が３９７ｎｇ／ｍｌであることを示す（図３、Ａ－Ｆ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＡＲＳ－ ＣｏＶ及びＨＣｏＶ－２２９Ｅが続く（図３、Ｇ－Ｉ）。

（４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスを中和できる７６Ｅ１抗体
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスに対する７６Ｅ１の中和活性をさらに確認するために、ＢＳＬ－３実験室でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスの中和活性の検出を実行する。結果は、７６Ｅ１が三つの感受性細胞株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルス感染を効果的に阻害できることを示す（図４）。

（５）Ｓ２ ８０９－８３３および８０９－８２３の線状エピトープを識別する７６Ｅ１抗体
まず、ＥＬＩＳＡ実験により、７６Ｅ１が変性後のＳタンパク質に対して依然としてより高い結合活性を維持していることが判明され、７６Ｅ１が主にＳタンパク質の線状エピトープを識別していることを示唆する。７株のコロナウイルスＳタンパク質の配列を比較することにより、Ｓ２条の６箇所の配列が高度に保存されていることが判明される。７６Ｅ１がこれら７株のウイルスのＳタンパク質に広域的に結合できるため、７６Ｅ１のエピトープは、これら六つのポリペプチド上に位置する可能性が最も高い。ＥＬＩＳＡ実験により、７６Ｅ１が８０９－８３３ポリペプチドに結合できることを示す（図５、Ａ－Ｃ）。短縮型Ｓタンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸ポリペプチド、及び各部位が個別にアラニンに突然変異した一連のポリペプチドを合成することにより、８１５（Ｒ）、８１９（Ｅ）、８２３（Ｆ）が本発明の抗体７６Ｅ１に作用する最も重要なエピトープであり、８２０（Ｄ）および８２２（Ｌ）が２番目に重要なエピトープであり、７６Ｅ１が８０９－８２３ポリペプチドに結合できることが判明される（図５Ｄ）。

従って、７６Ｅ１の主なエピトープは、当該ポリペプチド上に位置する。当該ポリペプチドは、融合ペプチドであり、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を仲介する際に重要な役割を果たす。また、当該ポリペプチドは、すべてのコロナウイルス間で高度に保存され（図５Ｅ）、７６Ｅ１は、４種類（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）のコロナウイルスすべての対応するポリペプチド配列を識別できる（新型コロナウイルスＳｐｉｋｅタンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸に相当する）（図５Ｆ）。

（６）ウイルスと細胞膜との融合を阻害することでウイルス感染を阻害する７６Ｅ１抗体
７６Ｅ１がＳタンパク質融合ペプチドに結合するため、７６Ｅ１は、ウイルスと細胞膜との融合を阻害することによりウイルス感染を阻害すると推測される。Ｈｅｌａ細胞Ｓプラスミド及びＡＣＥ２プラスミドをそれぞれトランスフェクトすることにより、Ｈｅｌａ－Ｓ細胞とＨｅｌａ－ＡＣＥ２細胞とを混合・融合させることでウイルスエンベロープと宿主エンベロープとの融合プロセスを模擬する。結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対して、７６Ｅ１が膜融合を効果的に阻害できるが、対照抗体２８－１２が膜融合を阻害できないことを示す（図６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶと比較して、ＭＥＲＳ－ＣｏＶによって媒介される膜融合は少ないが、７６Ｅ１は、依然として膜融合を効果的に阻害できるが、対照抗体２８－１２は阻害できない（図６）。上記実験により、７６Ｅ１がウイルスと細胞膜との融合を阻害することによりウイルス感染を阻害することが確認される。

（７）Ｓ２’酵素消化部位の酵素消化を阻害することで膜融合を阻害する７６Ｅ１
Ｓタンパク質は、Ｓ１／Ｓ２及びＳ２’によって酵素消化され、それによって融合ペプチドが露出され、ウイルスと細胞膜との融合を促進する。７６Ｅ１の識別エピトープがＳ２’酵素消化部位に近いため、７６Ｅ１は、Ｓ２’の酵素消化を阻害できると推測される。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ実験により、７６Ｅ１がＳタンパク質のＳ２’の酵素消化を阻害できるが、対照抗体が阻害できないことを示す（図７）。

（８）ＡＣＥ２ヒト化マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスの感染から保護する７６Ｅ１抗体
治療及び予防の動物実験を設計する（図８）。結果は、７６Ｅ１抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスに感染したＡＣＥ２ヒト化マウスの体重減少を減少させ、７６Ｅ１抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真ウイルスに感染したＡＣＥ２ヒト化マウスの肺部ウイルス量を減少させることを示す（図９）。

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (16)

1. 抗体の重鎖可変領域であって、
   前記重鎖可変領域は、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：３に示されるＣＤＲ１、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：４に示されるＣＤＲ２、及び
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：５に示されるＣＤＲ３の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
   ここで、前記アミノ酸配列中の任意の一種のアミノ酸配列は、任意選択で少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換を受け、且つコロナウイルスＳタンパク質の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、前記抗体の重鎖可変領域。
2. 抗体の重鎖であって、
   前記重鎖は、請求項１に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする、前記抗体の重鎖。
3. 抗体の軽鎖可変領域であって、
   前記軽鎖可変領域は、
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：６に示されるＣＤＲ１’、
   アミノ酸配列がＥＶＮであるＣＤＲ２’、及び
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：７に示されるＣＤＲ３’の三つの相補性決定領域ＣＤＲを含み、
   ここで、前記アミノ酸配列中の任意の一種のアミノ酸配列は、任意選択で少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換を受け、且つコロナウイルスＳタンパク質の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、前記抗体の軽鎖可変領域。
4. 抗体の軽鎖であって、
   前記軽鎖は、請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記抗体の軽鎖。
5. 抗体であって、
   前記抗体は、
   （１）請求項１に記載の重鎖可変領域、及び／又は
   （２）請求項３に記載の軽鎖可変領域を有するか、
   又は、前記抗体は、請求項２に記載の重鎖、及び／又は請求項４に記載の軽鎖を有し、
   ここで、前記アミノ酸配列中の任意の一種のアミノ酸配列は、任意選択で少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾及び／又は置換を受け、且つコロナウイルスＳタンパク質の結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含むことを特徴とする、前記抗体。
6. 前記抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されたとおりであり、前記抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されたとおりであり、
   また、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるアミノ酸配列に対して同一性≧８５％を有する重鎖可変領域配列、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるアミノ酸配列に対して同一性≧８５％を有する軽鎖可変領域配列を有することを特徴とする
   請求項５に記載の抗体。
7. 前記抗体は、特異的な抗コロナウイルス抗体、好ましくは特異的な抗コロナウイルスＳタンパク質（好ましくはＳ２タンパク質）抗体であることを特徴とする
   請求項５に記載の抗体。
8. 組換えタンパク質であって、
   前記組換えタンパク質は、
   （ｉ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、又は請求項５に記載の抗体、及び
   （ｉｉ）発現及び／又は精製を助けるための任意選択のタグ配列を有することを特徴とする、前記組換えタンパク質。
9. ＣＡＲ構築物であって、
   前記ＣＡＲ構築物の抗原結合領域のｓｃＦｖセグメントは、コロナウイルス融合タンパク質に特異的に結合する結合領域であり、前記ｓｃＦｖは、請求項１に記載の重鎖可変領域及び請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記ＣＡＲ構築物。
10. 抗体薬物コンジュゲートであって、
    前記抗体薬物コンジュゲートは、
    （ａ）請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、もしくは請求項５に記載の抗体、又はその組み合わせからなる群から選択される抗体部分と、及び
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はその組み合わせからなる群から選択される前記抗体部分にカップリングするカップリング部分とを含むことを特徴とする、前記抗体薬物コンジュゲート。
11. 請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、もしくは請求項５に記載の抗体、請求項８に記載の組換えタンパク質、又はその組み合わせからなる群から選択される、有効成分の使用であって、
    前記有効成分は、薬剤、試薬、検出プレート又はキットの調製に使用されることを特徴とする、前記有効成分の使用。
12. 抗原性エピトープペプチドであって、
    前記抗原性エピトープペプチドの配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸を含むことを特徴とする、前記抗原性エピトープペプチド。
13. ワクチン組成物であって、
    前記組成物は、
    （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドと、及び
    （ｉｉ）ワクチン上に許容される担体とを含み、
    （ｉ）において、前記部分配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記ワクチン組成物。
14. 阻害剤であって、
    前記阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８２３又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質８０９－８３３の線状エピトープを標的とし、新型コロナウイルスの感染を阻害するために使用されることを特徴とする、前記阻害剤。
15. 前記阻害剤は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１０に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８３３位のアミノ酸配列又はその部分配列を含むポリペプチドであり、ここで、前記部分配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１１に示されるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２タンパク質の８０９－８２３位のアミノ酸配列を含むことを特徴とする
    請求項１４に記載の阻害剤。
16. コロナウイルス感染を治療するための方法であって、
    前記方法は、必要とする対象に、請求項５に記載の抗体、前記抗体の抗体－薬物コンジュゲート、もしくは前記抗体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞、又はその組み合わせを投与する段階を含むことを特徴とする、前記コロナウイルス感染を治療するための方法。