JP2024501882A - 抑制置換遺伝子療法 - Google Patents

抑制置換遺伝子療法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024501882A
JP2024501882A JP2023540565A JP2023540565A JP2024501882A JP 2024501882 A JP2024501882 A JP 2024501882A JP 2023540565 A JP2023540565 A JP 2023540565A JP 2023540565 A JP2023540565 A JP 2023540565A JP 2024501882 A JP2024501882 A JP 2024501882A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotide sequence
nucleic acid
promoter
acid construct
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023540565A
Other languages
English (en)
Inventor
アッカーマン，マイケル・ジェイ
ドツレル，スティーブン・エム
ジャンドロン，ウィリアム
ベインズ，サヘジ
キム，チャン・ソン
テスター，デービッド・ジェイ
Original Assignee
メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ filed Critical メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ
Publication of JP2024501882A publication Critical patent/JP2024501882A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

先天性疾患（例えば、先天性ＱＴ延長症候群などの先天性心疾患）を有する哺乳動物を処置するための方法および物質が、本明細書において提供される。例えば、本明細書は、先天性疾患を有する哺乳動物を処置するための核酸を生成および使用するための方法および物質を提供し、核酸は、患関連変異を含有しない置換ｃＤＮＡをもたらしながら、哺乳動物における変異体疾患関連対立遺伝子の発現を抑制することができる【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２，３１６号、２０２１年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１７９，０８３号、２０２１年６月９日に出願された米国仮特許出願第６３／２０８，５５６号、および２０２１年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，３８８号の優先権を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる（参照により組み込まれる）。
本明細書は、先天性疾患（例えば、先天性ＱＴ延長症候群などの先天性心疾患）を有する哺乳動物を処置するための方法および物質に関する。例えば、本明細書は、先天性疾患を有する哺乳動物に投与することができ、患関連変異を含有しない置換ｃＤＮＡをもたらしながら、哺乳動物における変異体疾患関連対立遺伝子の発現を抑制することができる核酸を生成および使用するための方法および物質を提供する。
先天性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）は、心電図（ＥＣＧ）でのＱＴ間隔の延長と関連する、心筋の再分極の遅延を特徴とする常染色体優性障害である。ＬＱＴＳを有する患者は、トルサジェニック性失神／発作および心臓性突然死（ＳＣＤ）のリスクが増大している。ＬＱＴＳの有病率は２０００人に約１人であり、処置されないときは、より高いリスクの患者は、推定で１０年死亡率が５０％である（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２０：１７６１－１７６７（２００９）；およびＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，３４：３１０９－３１１６（２０１３））。
ＬＱＴＳは、心イオンチャネルまたはそれらの相互作用制御タンパク質における病原性バリアントによって引き起こされる（Ｇｉｕｄｉｃｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，２８：４５３－４６４（２０１８））。１型ＬＱＴＳ（ＬＱＴ１）は、ＬＱＴＳの最も一般的な形態であり、症例の約３５％を占める（Ａｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．，８：１３０８－１３３９（２０１１））。ＬＱＴ１は、心活動電位の再分極中の遅延整流電流遅延（ＩＫｓ）に関与するＫｖ７．１電圧で同期されたカリウムチャネルのα－サブユニットをコードする、ＫＣＮＱ１の機能を喪失したバリアントによって引き起こされる。ＫＣＮＱ１によってコードされたα－サブユニットは、Ｋｖ７．１チャネルアセンブリ中に四量体化するため、病原性ミスセンスバリアントは、影響のない対立遺伝子から翻訳された野生型（ＷＴ）サブユニットとの干渉により、ドミナントネガティブな作用を一般的に呈する。ＬＱＴＳの別の一般的な形態はＬＱＴ２であり、これは、症例の約３０％を占める。ＬＱＴ２を有する患者は、ＫＣＮＱ１と同様に、心活動電位持続時間（ＡＰＤ）において役割を果たす、ＫＣＮＨ２によってコードされるＩＫｒ（Ｋｖ１１．１）カリウムチャネルにおいて機能を喪失した変異を有する（Ｔｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．，２（５）：５０７－５１７（２００５）；Ｇｉｕｄｉｃｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，２８：４５３－４６４（２０１８）；およびＡｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．，８：１３０８－１３３９（２０１１））。それぞれ、機能の獲得およびＩＫｓまたはＩＫｒ電流密度の増加を引き起こすＫＣＮＱ１またはＫＣＮＨ２の病原性バリアントは、ＱＴ短縮症候群（ＳＱＴＳ）を導き得る。ＬＱＴＳの三番目の一般的な形態はＬＱＴ３であり、これは、症例の約１０％を占める。ＬＱＴ３を有する患者は、心ＡＰＤにおいても役割を果たすＳＣＮ５ＡによってコードされるＩＮａ（Ｎａｖ１．５）ナトリウムチャネルにおける機能を獲得した変異を有する（Ｔｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．ＥＰ，４：５６９－５７９（２０１８））。機能喪失およびＩＮａの減少につながるＳＣＮ５Ａの病原性バリアントは、ブルガダ症候群を引き起こし得る（Ｗｉｌｄｅ ａｎｄ Ａｍｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．ＥＰ，４：５６９－５７９（２０１８））。
ＬＱＴＳの管理のための現在の療法には、第一選択治療を提供するβ遮断薬、ならびに左星状神経節切除術（ＬＳＳＤ）または心除細動器（ＩＣＤ）の移植などのより侵襲的な療法が含まれる。しかしながら、これらには、非遵守、破壊的な心発症、または感染を含む制限があり得（Ｒｏｈａｔｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７０：４５３－４６２（２０１７）；Ｐｒｉｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．，１０：１９３２－１９６３（２０１３）；Ａｌ－Ｋｈａｔｉｂ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．，１５：ｅ１９０－ｅ２５２（２０１８）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０９：１８２６－１８３３（２００４）；Ｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ａｒｒｈｙｔｈｍ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．，６：７０５－７１１（２０１３）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２２：１２７２－１２８２（２０１０）；Ｈｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．，７：１６１６－１６２２（２０１０）；およびＫｌｅｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１５：２４７４－２４８０（２００７））、根底にある病原性基盤を処置しない。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）テクノロジーは、遺伝子発現をノックダウンするようサイレンシングする内在遺伝子を利用する。ＬＱＴ２のドミナントネガティブＫＣＮＨ２バリアントを克服する試みは、対立遺伝子特異的ｓｉＲＮＡを使用して、変異型対立遺伝子を選択的にノックダウンした（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ，１０：１２８－１３６（２０１３）；およびＭａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，３５：１０７８－１０８７（２０１４））。しかしながら、この方法の最善の結果は、ハプロ不全である。さらに、それぞれ固有のＬＱＴ２－原因バリアントに対して別個のｓｉＲＮＡを設計および検証する必要があり、数百ものＬＱＴ１－、ＬＱＴ２－、およびＬＱＴ３－原因バリアントが存在するため、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＨ２、およびＳＣＮ５Ａでは実用的ではないであろう（Ｌａｎｄｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４６：Ｄ１０６２－Ｄ１０６７（２０１８））。
本明細書は、少なくとも一部、ＬＱＴ１に対する二重成分「抑制および置換」ＫＣＮＱ１（ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ）遺伝子療法アプローチの開発に基づくものであり、ＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡは、内在性ＫＣＮＱ１対立遺伝子の発現を抑制するために使用され、ＫＣＮＱ１のコドン改変された「ｓｈＲＮＡ－免疫」コピーが、遺伝子置換に使用される。本明細書に記載される通り、「ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ」システムを守備よく使用して、固有のＬＱＴ１－原因ＫＣＮＱ１バリアントを有する四人の患者由来の線維芽細胞またはＰＢＭＣから誘導された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）心筋細胞における活動電位持続時間の延長が救済される。したがって、本明細書は、ＬＱＴ１における成功した前臨床ハイブリッド遺伝子療法を記載し、本明細書において提供されるシステムが、ＫＣＮＱ１機能の完全な救済能力を有することを示す。理論上、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、特定の変異よりむしろＫＣＮＱ１遺伝子全体を標的とするため、本質的にＬＱＴ１を有する任意の患者に適用可能である。
本明細書はまた、少なくとも一部、ＬＱＴ２に対する「抑制および置換」ＫＣＮＨ２（ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ）遺伝子療法アプローチの開発に基づくものであり、ＫＣＮＱ２ ｓｈＲＮＡは、内在性ＫＣＮＱ２対立遺伝子の発現を抑制するために使用され、ＫＣＮＱ２のコドン改変された「ｓｈＲＮＡ－免疫」コピーが、遺伝子置換に使用される。
さらに、本明細書は、少なくとも一部、ＬＱＴ３に対する「抑制および置換」ＳＣＮ５Ａ（ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ）遺伝子療法アプローチの開発に基づくものであり、ＳＣＮ５Ａ ｓｈＲＮＡは、内在性ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の発現を抑制するために使用され、ＳＣＮ５Ａのコドン改変された「ｓｈＲＮＡ－免疫」コピーが、遺伝子置換に使用される。
本明細書に記載される方法および物質を使用して、心筋再分極時間を低減する（例えば、ＡＰＤを短縮することによって）能力を有することにより、臨床医および患者（例えば、ＬＱＴＳ患者）は、処置されていないＬＱＴＳ患者の心臓の機能と比較したとき、健康な心臓の機能により近い心機能に至ることができる。一部の事例では、本明細書に記載される方法および物質を使用して、ＬＱＴＳ患者における心筋再分極時間を低減する能力を有することにより、臨床医および患者は、ＬＱＴＳ症状を低減し、および／またはＬＱＴＳ進行を逆転させることができる。例えば、本明細書に提供される核酸またはウイルス構築物の心臓組織への送達は、心臓欠損を救済し、ＬＱＴＳ患者の生存を増大させることができる。
一態様では、本明細書は、核酸構築物を特徴とする。核酸構築物は、（ａ）細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない。第一のヌクレオチド配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターであってもよい。核酸構築物は、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。レポーターは、蛍光ポリペプチドであることができる。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列（例えば、ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）の下流にあり得、内部リボザイムエントリー配列（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって第二のヌクレオチド配列から分離され得る。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載される核酸構築物（例えば、前段落の核酸構築物）を含有するウイルス粒子を特徴とする。
別の態様では、本明細書は、先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない。先天性心疾患は、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）またはＱＴ短縮症候群（ＳＱＴＳ）であり得る。先天性心疾患は、ＬＱＴ１であり得る。第一のヌクレオチド配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。レポーターは、蛍光ポリペプチドであることができる。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列（例えば、ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）の下流にあり得、ＩＲＥＳによって第二のヌクレオチド配列から分離され得る。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、哺乳動物内の心細胞における活動電位持続時間（ＡＰＤ）を低減する方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）哺乳動物の心細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、心細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない。第一のヌクレオチド配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。
別の態様では、本明細書は、哺乳動物におけるＬＱＴＳの一つまたは複数の症状を低減する方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない。ＬＱＴＳは、ＬＱＴ１であってもよい。第一のヌクレオチド配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、配列番号３６に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、（ａ）細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含むことができる核酸構築物を特徴とし、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない。第一のヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。レポーターは、蛍光ポリペプチドであることができる。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列（例えば、ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）の下流にあり得、ＩＲＥＳまたはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって第二のヌクレオチド配列から分離され得る。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載される核酸構築物（例えば、前段落に記載される核酸構築物）を含有するウイルス粒子を特徴とする。
なお別の態様では、本明細書は、先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない。先天性心疾患は、ＬＱＴＳまたはＳＱＴＳであり得る。先天性心疾患は、ＬＱＴ２であり得る。第一のヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。レポーターは、蛍光ポリペプチドであることができる。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列（例えば、ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ）の下流にあり得、ＩＲＥＳによって第二のヌクレオチド配列から分離され得る。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、哺乳動物内の心細胞におけるＡＰＤを低減する方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）哺乳動物の心細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、心細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない。第一のヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。
なお別の態様では、本明細書は、哺乳動物におけるＬＱＴＳの一つまたは複数の症状を低減する方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列をハイブリダイズし、細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列および（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からのＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない。ＬＱＴＳは、ＬＱＴ２であってもよい。第一のヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載される配列を含むか、本質的にからなるか、またはからなることができ、第二のヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載されるを含むか、本質的にからなるか、またはからなることができる。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、先天性心疾患の原因の一つまたは複数の変異を含有する内在性心臓ポリペプチドによって引き起こされる先天性心疾患を処置するための核酸構築物を特徴とし、核酸構築物は、（ａ）細胞内の内在性心臓ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズすることができ、細胞内の内在性心臓ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および（ｂ）先天性心疾患の原因の一つまたは複数の変異を欠く内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からの先天性心疾患の原因の一つまたは複数の変異を欠く内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンの発現を抑制しない。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または第一および第二のプロモーターは、異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。レポーターは、蛍光ポリペプチドであることができる。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡをコードする第二のヌクレオチド配列の下流にあり得、ＩＲＥＳまたはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって第二のヌクレオチド配列から分離され得る。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別の態様では、本明細書は、本明細書に記載される核酸構築物（例えば、前段落に記載される核酸構築物）を含有するウイルス粒子を特徴とする。
なお別の態様では、本明細書は、先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法を特徴とする。方法は、哺乳動物に、（ａ）細胞内の内在性心臓ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズすることができ、細胞内の内在性心臓ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および（ｂ）先天性心疾患の原因の一つまたは複数の変異を欠く内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンをコードする第二のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を投与することを含むことができ、第二のヌクレオチド配列の標的配列が、第一のヌクレオチド配列の標的配列と比較して、１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含無ことを除き、第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列の標的配列と同一の標的配列を含み、ＲＮＡｉ分子は、細胞内の第二のヌクレオチド配列からの先天性心疾患の原因の一つまたは複数の変異を欠く内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンの発現を抑制しない。第一のヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに作動可能に連結されることができ、第二のヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに作動可能に連結されることができる。第一および第二のプロモーターは、同一であってもよく、または第一および第二のプロモーターは、異なっていてもよい。第一のプロモーターは、Ｕ６プロモーターであってもよく、第二のプロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。核酸構築物は、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。レポーターは、蛍光ポリペプチドであることができる。レポーターをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡをコードする第二のヌクレオチド配列の下流にあり得、ＩＲＥＳによって第二のヌクレオチド配列から分離され得る。核酸構築物は、ウイルスベクター内であってもよい。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクター）であってもよい。細胞は、心筋細胞であってもよい。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および物質を使用できるが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書に記述されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、物質、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
本発明の一つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
図１Ａは、例示的なＫＣＮＱ１－Ｐ２Ａ ＡＡＶ構築物の図であり、図１Ｂは、構築物のＤＮＡ配列（配列番号１０２９）を示す。図１Ｃは、ＫＣＮＱ１標的配列（ｓｈ＃５；配列番号１０２）、対応するｓｈＩＭＭ ＫＣＮＱ１配列（配列番号１０３）、野生型ＫＣＮＱ１ヌクレオチド配列（配列番号１０３０、下線を付したｓｈ＃５配列を含む）、対応するｓｈＩＭＭ ＫＣＮＱ１ヌクレオチド配列（配列番号１０３１、下線を付したｓｈＩＭＭ配列を含む）、およびＫＣＮＱ１アミノ酸配列（配列番号１０３２）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２Ａは、例示的なＫＣＮＨ２－Ｐ２Ａ ＡＡＶ構築物の図であり、図２Ｂは、構築物のＤＮＡ配列（配列番号１０３３）を示す。コードされるＡｍｐＲアミノ酸配列（配列番号２７８４）も示す。図２Ｃは、ＫＣＮＨ２標的配列（ＲＡＢ＿ｓｈ＃４；配列番号２７）、対応するｓｈＩＭＭ ＫＣＮＨ２配列（配列番号２９）、野生型ＫＣＮＨ２ヌクレオチド配列（配列番号１０３４、下線を付したＲＡＢ＿ｓｈ＃４配列を含む）、対応するｓｈＩＭＭ ＫＣＮＨ２ヌクレオチド配列（配列番号１０３５、下線を付したｓｈＩＭＭ配列を含む）、およびＫＣＮＨ２アミノ酸配列（配列番号１０３６）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図３Ａは、例示的なＳＣＮ５Ａ－Ｐ２Ａ Ｌｅｎｔｉ構築物の図であり、図３Ｂは、構築物のＤＮＡ配列（配列番号１０４１）を示す。図３Ｃは、ＳＣＮ５Ａ標的配列（ｓｈ＃４；配列番号３０）、対応するｓｈＩＭＭ ＳＣＮ５Ａ配列（配列番号３２）、野生型ＳＣＮ５Ａヌクレオチド配列（配列番号１０４２、下線を付したｓｈ＃５配列を含む）、対応するｓｈＩＭＭ ＳＣＮ５Ａヌクレオチド配列（配列番号１０４３、下線を付したｓｈＩＭＭ配列を含む）、およびＳＣＮ５Ａアミノ酸配列（配列番号１０４４）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図４Ａは、例示的なＰＫＰ２－Ｐ２Ａ ＡＡＶ構築物の図であり、図４Ｂは、構築物のＤＮＡ配列（配列番号１０３７）を示す。図４Ｃは、ＰＫＰ２標的配列（ｓｈ＃３６；配列番号５２）、対応するｓｈＩＭＭ ＰＫＰ２配列（配列番号９９３）、野生型ＰＫＰ２ヌクレオチド配列（配列番号１０３８、下線を付したｓｈ＃５配列を含む）、対応するｓｈＩＭＭ ＰＫＰ２ヌクレオチド配列（配列番号１０３９、下線を付したｓｈＩＭＭ配列を含む）、およびＰＫＰ２アミノ酸配列（配列番号１０４０）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図５Ａ～５Ｃは、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐベクターについてＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡを試験するために使用される実験から得られた結果を示す。ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＱ１－ＷＴおよび様々なＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡまたは非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。図５Ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した、ＧＡＰＤＨに正規化した４種の市販のｓｈＲＮＡｓ（ｓｈ＃１～４）で共トランスフェクトした細胞のＫＣＮＱ１発現をプロットしたグラフ（上）を含む。コフィリンハウスキーピング対照を有するＫＣＮＱ１の代表的なウェスタンブロットの画像も示す（下）。 図５Ｂは、ウェスタンブロット相対ピクセル密度のＩｍａｇｅＪ定量をプロットしたグラフである。ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４を、最終のＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターに選択し、本明細書に記載するさらなる研究においてｓｈＫＣＮＱ１と称する。結果および代表的な画像を、三つの独立した実験（一実施当たりの処置群当たり一つの生物学的複製を用いて別の週に、開始から終了まで行った各実験の三回の同一繰り返しとして定義した）から得た。グラフは、複数比較のための事後テューキー検定を用いた平均±Ｓ．Ｄ．一方向ＡＮＯＶＡを示す。＊ｐ＜０．０５。 図５Ｃは、ｑＰＣＲを使用して決定した、ＧＡＰＤＨに正規化した、様々なカスタムｓｈＲＮＡ（ｓｈ＃５～ｓｈ＃８）で共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞におけるＫＣＮＱ１のノックダウンをプロットしたグラフである。 図６Ａおよび６Ｂは、ＫＣＮＱ１抑制置換（ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ）ベクターの設計を示す。図６Ａは、ｓｈＫＣＮＱ１（配列番号７）からＫＣＮＱ１－ＷＴ ｃＤＮＡ（配列番号８）の標的配列部分および「ｓｈＲＮＡ－免疫」ＫＣＮＱ１（ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ、下）（配列番号９）の配列アライメント（上）を示し、これは、１０のゆらぎ塩基同義バリアント（下線）を含む。示したアミノ酸配列は、ＫＣＮＱ１ ｐ．Ｖ４５８－Ｐ４６９（ｃ．１３７２－１４０７、ＮＭ＿０００２１８．２）（配列番号１０）である。 図６Ｂは、代表的なＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐベクターマップの概略図である。（Ｕ６）Ｕ６プロモーター；（ＣＭＶ）サイトメガロウイルスプロモーター；（ＭＨＣ）アルファ－ミオシン重鎖プロモーター、（ＭＬＣ）ミオシン軽鎖２プロモーター、（ＴｎＣ）心筋トロポニンＣプロモーター、（ＴｎＴ）心筋トロポニンＴプロモーター、（Ｅ）カルセケストリン－２心筋細胞特異的転写シス制御エンハンサーモチーフ、（ＩＲＥＳ）内部リボソームエントリー部位；および（ＣＦＰ）シアン蛍光タンパク質。 図７Ａおよび７Ｂは、ｓｈＫＣＮＱ１が、ＫＣＮＱ１－ＷＴまたはＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭおよびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＱ１、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞においてＫＣＮＱ１－ＷＴをノックダウンするが、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭをノックダウンしないことを示す。図７Ａは、ＫＣＮＱ１－ＷＴ（白色）およびＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（灰色）を定量する対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した、ＧＡＰＤＨに正規化した相対的ＫＣＮＱ１発現をプロットしたグラフ（上）である。結果を、ハウスキーピング対照としてコフィリンを用いて、ＫＣＮＱ１のウェスタンブロッティング（下）で確認した。 図７Ｂは、ウェスタンブロットピクセル密度のＩｍａｇｅＪ定量をプロットしたグラフである。結果および代表的な画像を、三つの独立した実験（一実施当たりの処置群当たり一つの生物学的複製を用いて別の週に、開始から終了まで行った各実験の三回の同一繰り返しとして定義した）から得た。両方のグラフは、平均±Ｓ．Ｄ．を示す。相対的ＫＣＮＱ１については、複数の比較についての事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを、図７Ａと図７Ｂの両方で使用した。図７ＡにおけるＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いて処理した試料について、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、ＫＣＮＱ１－ＷＴの部分をＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（垂直ブラケット）と比較した。＊ｐ＜０．０５。 図８は、相対的ＫＣＮＱ１レベルをプロットしたグラフであり、ｓｈＫＣＮＱ１およびＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによるＫＣＮＱ１－ＷＴの抑制および置換が用量依存性であったことを示す。ＴＳＡ２０１細胞を、１００ｆｍｏｌ ＫＣＮＱ１－ＷＴおよび広範（０～３００ｆｍｏｌ）のｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＱ１、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトした。ＫＣＮＱ１発現を、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定し、ＧＡＰＤＨに正規化した。マーカーは、合計のＫＣＮＱ１を表す。ＫＣＮＱ１－ＷＴと－ｓｈＩＭＭの両方が同時に存在するときのＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ処置について、ＫＣＮＱ１－ＷＴ（薄い灰色の陰影）およびＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（濃い灰色の陰影）の対立遺伝子特異的割合を示す。 図９は、ｓｈＫＣＮＱ１とＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの両方が、本質的に同じ速度で活性化することを示す、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの二つの構成要素の活性化中の相対的ＫＣＮＱ１レベルをプロットするグラフである。ＴＳＡ２０１細胞を、１００ｆｍｏｌ ＫＣＮＱ１－ＷＴおよび１００ｆｍｏｌ ｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトし、０時間～７２時間の間に異なる時点でＲＮＡを採取した。ＫＣＮＱ１発現を、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定し、ＧＡＰＤＨに正規化した。マーカーは、合計のＫＣＮＱ１を表す。ＫＣＮＱ１－ＷＴと－ｓｈＩＭＭの両方が同時に存在するときのＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ処置について、ＫＣＮＱ１－ＷＴ（薄い灰色の陰影）およびＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（濃い灰色の陰影）の対立遺伝子特異的割合を示す。ＫＣＮＱ１－ＷＴおよびｓｈＣＴで処理した細胞は、ＫＣＮＱ１－ＷＴおよびＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理した細胞と比較してほぼ同一の合計のＫＣＮＱ１を有するが、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐにおいて、ＫＣＮＱ１－ＷＴ（薄い灰色の陰影）の割合は、強く抑制され、一方ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（濃い灰色の陰影）の割合は、存在するＫＣＮＱ１の優勢形態となる。 図１０Ａ～１０Ｃは、ＫＣＮＱ１－ＷＴ、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ、またはＫＣＮＱ１－バリアントおよびＫｖ７．１ベータ－サブユニット、ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞におけるＩＫｓのパッチクランプ分析を示す。図１０Ａは、保持電位－８０ｍＶおよび４秒の持続時間で１０ｍＶの増加での試験電位－４０ｍＶ～＋８０ｍＶで決定した、示した構築物の代表的な電圧クランプＩＫｓトレースを示す。ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭは、ＷＴ ＩＫｓ電流を生成した（上）。ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ、およびＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓは、ＩＫｓ電流を生成しなかった（下）。 図１０Ｂは、トランスフェクトした細胞におけるピーク電流密度をプロットするグラフである。エラーバーは、平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。 図１０Ｃは、＋８０ｍＶ脱分極ステップでのピーク電流密度をプロットするグラフである。エラーバーは、標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。複数比較のための事後テューキー検定を用いた一方向ＡＮＯＶＡを使用した。＊ｐ＜０．０５。 図１１は、ＫＣＮＱ１－ＷＴ、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ、またはＫＣＮＱ１－バリアントで共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞の免疫蛍光を示す一連の代表的な画像である。ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭとＫＣＮＱ１－ＷＴの両方が、細胞膜に輸送された。ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘは、未成熟終止コドンをもたらし、発現したタンパク質をもたらさず、一方、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍは、細胞膜に正しく輸送された。ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓは、検出可能なタンパク質を生成したが、見た目では、ｑＰＣＲおよびウェスタンブロットの結果と一致してより低い発現レベルであった。ＤＡＰＩを使用して、核、ＫＣＮＱ１（緑色）を染色し、合わせた。代表的な画像を、三つの独立した実験（一実施当たりの処置群当たり一つの生物学的複製を用いて別の週に、開始から終了まで行ったこの実験の三回の同一繰り返しとして定義した）から得た。スケールバー＝２０μｍ。 図１２は、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐが、ナンセンスとミスセンスバリアントの両方を含むＬＱＴ１疾患を引き起こすＫＣＮＱ１バリアントをノックダウンし、バリアントをＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭで置換したことを示す、グラフ（上）およびウェスタンブロット（下）を含む。ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＱ１－ＷＴまたはＫＣＮＱ１－バリアントおよびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＱ１、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトした。ｓｈＫＣＮＱ１は、バリアントに依存しない様式でＫＣＮＱ１をノックダウンする。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、ｓｈＫＣＮＱ１を介してＫＣＮＱ１バリアントをノックダウンし、ノックダウン免疫である、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを発現する。図１２の上部にあるグラフは、ＫＣＮＱ１－ＷＴ／バリアント（白色）およびＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（灰色）を測定するための対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して検出した、ＫＣＮＱ１－ＷＴ／バリアントおよびＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの釣り合った発現を示す。全体的なＫＣＮＱ１発現（対立遺伝子特異的ではない）を、ハウスキーピング対照としてコフィリンを用いたウェスタンブロッティングにより検証した（図１２、下）。結果および代表的な画像を、三つの独立した実験（一実施当たりの処置群当たり一つの生物学的複製を用いて別の週に、開始から終了まで行った各実験の三回の同一繰り返しとして定義した）から得た。グラフは、平均±Ｓ．Ｄ．を示す。相対的ＫＣＮＱ１については、複数の比較についての事後テューキー検定を伴う別個の一方向ＡＮＯＶＡを各ＫＣＮＱ１バリアントについて行い、三つの処理を比較し、バリアント間の無関係な比較を回避した。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いて処理した試料において、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、ＫＣＮＱ１－ＷＴの部分をＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（垂直ブラケット）と比較した。＊ｐ＜０．０５。 図１３Ａ～１３Ｄは、ＬＱＴ１を有する四人の患者、無関係な健康対照由来のｉＰＳＣ、ならびにＬＱＴ１患者ｉＰＳＣのうちの二つ（ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ）から生成した２人のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照ｉＰＳＣの品質管理を示す。図１３Ａは、ＬＱＴ１を有する患者（中）、無関係な健康対照（上）、および同質遺伝子対照（下）から誘導したｉＰＳＣにおけるＬＱＴ１－原因ＫＣＮＱ１バリアントのサンガー配列決定確認を示す。 図１３Ｂ～１３Ｄは、正常な核型（図１３Ｂ）、正常な形態を有するｉＰＳＣコロニーの明視野画像（図１３Ｃ）、およびＤＡＰＩ核染色、Ｔｒａ－１－６０またはＳＳＥＡ－４、ＮａｎｏｇまたはＯｃｔ－４を含む多能性のマーカーについての免疫蛍光顕微鏡観察（図１３Ｄ）ならびに合わせた画像を含む、すべてのｉＰＳＣ株について完了した代表的な品質管理を示す。スケールバー＝２０μＭ。（ｓｐｌ）スプライス；（＊）トランスフェクトした標的細胞の正常な編集後の二本鎖切断の再導入を防止するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正中に導入したサイレントバリアント。 同上。 同上。 図１４は、レンチウイルスｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いた形質導入の一週間後の、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ介在性ＬＱＴ１を有する患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭの免疫蛍光を示す代表的な画像を含む。患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭを三つの別個の抗体で染色して、（１）心筋細胞（心筋トロポニンＴ、ＣＴＮＴ）の存在、（２）ｓｈＣＴにおけるｔｕｒｂｏＧＦＰレポーター（ＧＦＰ）またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐにおけるＣＦＰレポーターによって示したレンチウイルスによる形質導入、および（３）内在性またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐでの処理の結果としてのいずれかのＫＣＮＱ１の存在を示した。結果は、心筋細胞の高純度集団を、レンチウイルスｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで均一に形質導入したことを示した。ｓｈＣＴでは、ＫＣＮＱ１の染色が弱かったが、細胞をＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したとき、ＫＣＮＱ１染色は明るく、これは強い発現を示していた。細胞を、核染色のためＤＡＰＩで対比染色した。図は、一つのＬＱＴ１バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ）由来のｉＰＳＣ－ＣＭの代表的な画像を示す。無関係の対照ならびに他の三つのＬＱＴ１バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｉ５６７Ｓ、およびＡ３４４Ａ／ｓｐｌ）から誘導したｉＰＳＣ－ＣＭについての免疫蛍光結果を、図１５Ａ～１５Ｄに示す。スケールバー５０μｍ。 図１５Ａ～１５Ｄは、無関係の対照（図１５Ａ）ならびに三つのＬＱＴ１バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｉ５６７Ｓ、および－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ；それぞれ、図１５Ｂ、１５Ｃ、および１５Ｄ）を含む、図１４に示していないｉＰＳＣ－ＣＭ由来の免疫蛍光画像を示す。免疫蛍光画像を、レンチウイルスｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐでの形質導入の一週間後に取得した。患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭを三つの別個の抗体で染色して、（１）心筋細胞（心筋トロポニンＴ、ＣＴＮＴ）の存在、（２）ｓｈＣＴにおけるｔｕｒｂｏＧＦＰレポーター（ＧＦＰまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐにおけるＣＦＰ）によって示したレンチウイルスによる形質導入、および（３）内在性またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐでの処理の結果としてのいずれかのＫＣＮＱ１の存在を示した。結果は、レンチウイルスｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで均一に形質導入した心筋細胞の高純度集団を示した。ｓｈＣＴにおいて、ＫＣＮＱ１の染色が弱かったが、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐでの処理では、ＫＣＮＱ１染色は明るく、強い発現を示した。細胞を、核染色のためＤＡＰＩで対比染色した。スケールバー＝５０μｍ。 同上。 同上。 同上。 図１６Ａおよび１６Ｂは、活動電位持続時間（ＡＰＤ）が、ｓｈＣＴと比較してＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ含有レンチウイルスで処理したＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて短縮したことを示す。図１６Ａは、無処理、無関係な健康対照ならびにｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ、ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓ、およびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ ｉＰＳＣ－ＣＭについての、１Ｈｚにペース調整した三つの連続的ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素光学活動電位を示す、一連の代表的なトレースを含む。 図１６Ｂは、無処理、無関係な健康対照ならびにｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ、ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓ、およびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ ｉＰＳＣ－ＣＭについてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値をプロットした、一連のグラフを含む。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。測定値の総数（ｎ）を示す。箱ひげ図は、最小および最大値に及ぶ、ウィスカーを含む中央値および四分位範囲を示す。ベースラインＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を、ｓｈＣＴで処理した各ＫＣＮＱ１バリアントを無処置の無関係の対照と比較した、事後ダネット検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって評価した（表５）。ｓｈＣＴでの処理と比較したＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによるＡＰＤの短縮を、各バリアントについて別個のＡＰＤ９０とＡＰＤ５０レベルの両方での対応のない両側スチューデントｔ検定によって評価した。＊ｐ＜０．０００１。 図１７Ａおよび１７Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照が、心臓ＡＰＤの「完全な」補正についてのマーカーとしての役割を果たすことを示す。心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定を、四つのＬＱＴ１ ｉＰＳＣのうちの二つ（ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ）から生成した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて行った。ｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いた処理のデータをここに示し、図１６Ａおよび１６Ｂと変わらなかった。両方の同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭは、ｓｈＣＴで処理したＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭより有意に短いＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を有し、これは、ＫＣＮＱ１における単一の病原性ＬＱＴ１バリアントが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患表現型を救済することができたことを示した。無関係の対照と同様に、同質遺伝子対照を無処理で測定して、正常なＡＰＤについての最も純粋なシグナルを得た。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いたＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ＡＰＤ短縮を生じたが、短縮の程度は可変であった。ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍについては、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、ＡＰＤ９０の延長を過少補正し、ＡＰＤ５０を過剰補正した。ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌでは、ＡＰＤ９０の理想的な補正を達成し、同質遺伝子対照ＡＰＤ９０と一致したが、ＡＰＤ５０の過剰補正も生じた。図１７Ａは、１Ｈｚでペース調整した三つの連続的活動電位を示す代表的なトレースを含む。 図１７Ｂは、無処理の同質遺伝子対照、ならびにｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ ｉＰＳＣ－ＣＭについてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値をプロットした一対のグラフを含む。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。測定値の総数（ｎ）を示す。箱ひげ図は、最小および最大値に及ぶ、ウィスカーを含む中央値および四分位範囲を示す。ＡＰＤ９０のすべての対とＡＰＤ５０のすべての対を比較する、事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを、試験した各ＫＣＮＱ１バリアントについて使用した。図中の特定のｐ値によって示さない限り、＊ｐ＜０．０００１。 図１８Ａ～１８Ｄは、ｉＰＳＣ－ＣＭ ３Ｄオルガノイド培養システムの使用が、標準的な合胞体単層培養で得た結果と類似の結果を達成することができることを示す。３Ｄオルガノイドまたは合胞体単層での培養が、単層培養と類似の初見をもたらすかどうかを評価するために、四人のＬＱＴ１を有する患者のうちの一人（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ）由来のｉＰＳＣ－ＣＭを分離し、スフェロイドを形成するための濃厚なコラーゲン性ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を含有する丸い型に播種した。２～３日後、ｉＰＳＣ－ＣＭは、３Ｄの強力な鼓動する合胞体を形成し、この研究のオルガノイドモデルとして使用した。オルガノイドを、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ、ｓｈＣＴで処理するか、または対照として無処理のままにした。ウイルス形質導入の七日後、オルガノイドを、免疫蛍光法またはＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素によりアッセイした。図１８Ａは、２４ウェル培養プレートにおいて培地に懸濁した鼓動するｉＰＳＣ－ＣＭオルガノイドの画像であり、挿入図に示した画像に拡大した。 図１８Ｂは、固定し、凍結切片化し、心筋細胞マーカー心筋トロポニンＴ（ＣＴＮＴ；上）およびｓｈＣＴにおけるｔｕｒｂｏＧＦＰレポーター（ＧＦＰ；中）またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐにおけるＣＦＰレポーター（下）によって示したレンチウイルス形質導入マーカーを使用して、免疫蛍光のため染色したオルガノイドの代表的な画像を含む。 図１８Ｃは、無処理のＬＱＴ１オルガノイドまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したＬＱＴ１オルガノイドにおけるＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素の代表的なトレースである。 図１８Ｄは、無処理およびＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ ｉＰＳＣ－ＣＭ由来のＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したオルガノイドについてのすべてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値をプロットしたグラフである。＊ｐ＜０．０００１。 図１９Ａ～１９Ｆは、ＬＱＴ１およびＬＱＴ２トランスジェニックウサギ表現型の概要を提供する。ＫＣＮＱ１がコードしたカリウムチャネルサブユニット（左）およびＫＣＮＨ２がコードしたカリウムチャネルサブユニットポリペプチド（右）ならびにトランスジェニック構築物（下）における病原性バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｙ３１５ＳおよびＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓ）の概略図表示を、図１９Ａに示す。 図１９Ｂは、野生型（ＷＴ）、ＬＱＴ１、およびＬＱＴ２ウサギ間のＱＴ間隔の差を示す代表的な心電図トレースを含む。 図１９Ｃは、ＷＴウサギとＬＱＴ１ウサギまたはＬＱＴ２ウサギとの間のＱＴ間隔持続時間の有意差を示す棒グラフである。 図１９Ｄは、ショート－ロング－ショート配列によって始まる、オレストラジオールで処置したＬＱＴ２ウサギにおける自発性多形性心室頻拍（ＴｄＰ）を示す。図１９Ｅは、ＷＴウサギ由来の心筋細胞と比較して、ＬＱＴ１およびＬＱＴ２ウサギ心筋細胞における活動電位持続時間の延長を示した代表的な細胞心活動電位トレースを含む。 同上。 図１９Ｆは、ＷＴ、ＬＱＴ１、およびＬＱＴ２ウサギ心臓から単離した心筋細胞におけるＩＫｓおよびＩＫｒ電流のＩＶ曲線を示し、これは、ＬＱＴ１ウサギにおけるＩＫｓの喪失およびＬＱＴ２ウサギにおけるＩＫｒの喪失を示す。 図２０Ａ～２０Ｃは、ＫＣＮＨ２－Ｇ６０４ＳおよびＫＣＮＨ２－Ｎ６３３Ｓ ｉＰＳＣ株の生成および確認を示す。図２０Ａは、各クローンが、それぞれの性別についての正常な核型を有していたことを示す、核型の画像である。 図２０Ｂは、研究に使用した患者細胞株の各々由来のｉＰＳＣコロニーの位相コントラスト光画像を示す画像である。 図２０Ｃは、特許細胞株の代表的なサンガー配列決定クロマトグラムを含む。四角は、関連するコドンを示し、星は、対象の正確なヌクレオチドを示す。スケールバー＝５０μｍ。 図２１は、ｐ．Ｇ６０４Ｓクローン＃１、ｐ．Ｇ６０４Ｓクローン＃２、ｐ．Ｎ６３３Ｓクローン＃１、およびｐ．Ｎ６３３Ｓクローン＃２についての免疫細胞化学を示す画像である。各株のそれぞれのクローンの各々が、ＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ４多能性マーカーを発現することを示した。スケールバー＝２０μｍ。 図２２は、ｑＰＣＲを使用して決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＫＣＮＨ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図２３は、Ｎ６３３Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤの補正についてのマーカーとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照およびＬＱＴ２ ｉＰＳＣ（Ｎ６３３Ｓ）から生成した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭを使用したＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）研究の結果をプロットしたグラフである。ＡＰＤ９０Ｂ値およびＡＰＤ５０Ｂ値を、ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照およびｓｈＣＴまたはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＨ２－Ｎ６３３Ｓバリアントについて決定した。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得、Ｂａｚｅｔｔ補正したＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値をプロットした。測定値の総数（ｎ）および中央値（水平の黒色の線）を示す。ＡＰＤ９０Ｂのすべての対とＡＰＤ５０Ｂのすべての対を比較する、事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用した。 図２４は、Ｎ６３３Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭおよびＬＱＴ２ ｉＰＳＣ（Ｎ６３３Ｓ）から生成した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値の結果をプロットしたグラフである。無処理（ＵＴ）のＫＣＮＨ２－Ｎ６３３Ｓバリアント、ＳｕｐＲｅｐで処理した同質遺伝子対照、および無処理（ＵＴ）の同質遺伝子対照についてのＡＰＤ９０Ｂ値およびＡＰＤ５０Ｂ値を示す。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。Ｂａｚｅｔｔ補正したＡＰＤ９０ＢおよびＡＰＤ５０Ｂ値を示し、測定値の総数（ｎ）を示す。ドットプロットは、中央値（水平の黒色の線）を示す。ＡＰＤ９０Ｂのすべての対とＡＰＤ５０Ｂのすべての対を比較する、事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用した。 図２５は、Ｇ６０４Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値の結果をプロットしたグラフである。ｓｈＣＴで処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６０４Ｓバリアント、およびＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６０４ＳバリアントについてのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値を示す。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐでのＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ｓｈＣＴで処理したものと比較して、有意なＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０の短縮をもたらす。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。測定値の総数（ｎ）を示す。ドットプロットは、中央値（水平の黒色の線）を示す。ＡＰＤ９０Ｂのすべての対とＡＰＤ５０Ｂのすべての対を比較する、スチューデントｔ検定を使用した。 図２６は、ｓｈＣＴで処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６０４Ｓバリアント（１）、およびＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ（２）、またはｓｈＣＴで処理したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照（３）についてのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値をプロットしたグラフである。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐでのＫＣＮＨ２－Ｇ６０４Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ｓｈＣＴでの処理と比較して、有意なＡＰＤ９０の短縮をもたらした。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。測定値の総数（ｎ）を示す。グラフは、中央値（水平の黒色の線）も示す。事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して、ＡＰＤ９０Ｂのすべての対とＡＰＤ５０Ｂのすべての対を比較した。 図２７は、ｓｈＣＴで処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓバリアント（１）、およびＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ（２）、またはｓｈＣＴで処理したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照（３）についてのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値をプロットしたグラフである。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐでのＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ｓｈＣＴでの処理と比較して、有意なＡＰＤ９０の短縮をもたらした。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０値を平均化して、単一のデータ点を得た。測定値の総数（ｎ）を示す。グラフは、中央値（水平の黒色の線）も示す。事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して、ＡＰＤ９０のすべての対を比較した。 図２８Ａおよび２８Ｂは、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐが、ＬＱＴ２疾患を引き起こすＫＣＮＨ２ミスセンスバリアントをノックダウンし、それらをＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭで置換したことを示す。ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＨ２－ＷＴまたはＫＣＮＨ２－バリアントおよびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＨ２、またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトした。ｓｈＫＣＮＨ２は、バリアントに依存しない様式でＫＣＮＨ２をノックダウンした。図２８Ａは、ＫＣＮＨ２－ＷＴ／バリアント（白色）およびＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（灰色）を測定するための対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して検出した、ＫＣＮＨ２－ＷＴ／バリアントおよびＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭの釣り合った発現をプロットしたグラフである。 図２８Ｂは、ハウスキーピング対照としてＧＡＰＤＨを用いた、すべてのＫＣＮＨ２発現（対立遺伝子特異的ではない）を示すウェスタンブロットの画像である。 図２９Ａおよび２９Ｂは、ｓｈＫＣＮＨ２が、ＫＣＮＨ２－ＷＴまたはＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭおよびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＨ２、またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞においてＫＣＮＨ２－ＷＴをノックダウンしたが、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭをノックダウンしなかったことを示す。図２９Ａは、ＫＣＮＨ２－ＷＴ（白色）およびＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（灰色）を定量するための対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した、ＧＡＰＤＨに正規化した、相対的ＫＣＮＨ２発現をプロットしたグラフである。結果を、ハウスキーピング対照としてＧＡＰＤＨを用いて、ＫＣＮＨ２のウェスタンブロッティング（図２９Ｂ）で確認した。 同上。 図３０Ａ～３０Ｄは、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰが、異種ＴＳＡ２０１細胞においてＫＣＮＨ２電流を生成しなかったことを示す。図３０Ａは、保持電位－８０ｍＶおよび３秒の第二の持続時間で１０ｍＶの増加での試験電位－４０ｍＶ～＋６０ｍＶで決定した、ＫＣＮＥ２を含むＫＣＮＨ２－ＷＴを発現するＴＳＡ２０１細胞からの代表的な細胞ＩＫｒトレース全体のプロットである。 図３０Ｂは、保持電位－８０ｍＶおよび３秒の第二の持続時間で１０ｍＶの増加での試験電位－４０ｍＶ～＋６０ｍＶで決定した、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＴＳＡ２０１細胞からの代表的な細胞外向きトレース全体のプロットを示す。 図３０Ｃは、ＫＣＮＥ２－ｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲｅｄ２（ｎ＝９）およびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ（ｎ＝８）とのＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰについての電流と電圧の関係をプロットしたグラフである。すべての値は、平均±ＳＥＭを表す。 図３０Ｄは、ＫＣＮＥ２－ｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲｅｄ２（ｎ＝９）およびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ（ｎ＝８）とのＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰについての＋１０ｍＶでのピーク電流密度をプロットしたグラフである。すべての値は、平均±ＳＥＭを表す。 図３１Ａ～３１Ｅは、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰが、Ｈ９Ｃ２細胞においてＥ－４０３１感受性外向き電流を生成したことを示す。図３１Ａは、保持電位－８０ｍＶおよび３秒の第二の持続時間で１０ｍＶの増加での試験電位－４０ｍＶ～＋６０ｍＶで決定した、空のＨ９Ｃ２細胞（上のパネル）、Ｅ－４０３１前にＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＨ９Ｃ２細胞（中のパネル）、およびＥ－４０３１後にＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＨ９Ｃ２細胞（下のパネル）からの代表的な細胞外向き電流トレース全体を含む。 図３１Ｂは、空のＨ９Ｃ２細胞およびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＨ９Ｃ２細胞からの外向き電流についての電流と電圧の関係をプロットしたグラフである（ｎ＝９）。すべての値は、平均±ＳＥＭを表す。 図３１Ｃは、空のＨ９Ｃ２細胞およびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＨ９Ｃ２細胞からの＋６０ｍＶでのピーク電流密度をプロットしたグラフである（ｎ＝９）。すべての値は、平均±ＳＥＭを表す。 図３１Ｄは、Ｅ－４０３１前および後に、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＨ９Ｃ２細胞についての電流と電圧の関係をプロットしたグラフである（ｎ＝６）。すべての値は、平均±ＳＥＭを表す。 図３１Ｅは、Ｅ－４０３１の前および後に、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを発現するＨ９Ｃ２細胞からの＋６０ｍＶでのピーク電流密度をプロットしたグラフである（ｎ＝６）。すべての値は、平均±ＳＥＭを表す。 図３２は、ｓｈＣＴで処理したＫＣＮＨ２－Ｎ５８８Ｋバリアント（１）、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ（２）、またはｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照（３）についてのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値をプロットしたグラフである。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐでのＳＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ｓｈＣＴでの処理と比較して、有意なＡＰＤ９０の延長をもたらした。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。測定値の総数（ｎ）を示す。グラフは、中央値（水平の黒色の線）も示す。事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを使用して、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０のすべての対を比較した。 図３３Ａ～３３Ｄは、ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃバリアントを有する患者から誘導したｉＰＳＣの品質管理を示す。図３３Ａは、正常な形態を有するｉＰＳＣコロニーの明視野画像である。 図３３Ｂは、患者から誘導したｉＰＳＣにおけるＬＱＴ３を引き起こすＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃバリアントのサンガー配列決定確認（配列番号１０４７）を示す。 図３３Ｃは、患者の血液試料から生成したｉＰＳＣ株の正常な核型を示す画像である。 図３３Ｄは、ＤＡＰＩ核染色、Ｔｒａ－１－６０またはＳＳＥＡ－４、ＮａｎｏｇまたはＯｃｔ－４を含む多能性のマーカーについての免疫蛍光顕微鏡の画像、および合わせた画像を含む。 図３４は、ｑＰＣＲを使用して決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＳＣＮ５Ａのノックダウンをプロットしたグラフである。 図３５は、代表的なＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐベクターマップを示す概略図である。（ＣＭＶ）サイトメガロウイルスプロモーター；（ＭＣＳ）マルチクローニングサイト；（Ｕ６）Ｕ６プロモーター；（ＣｈｌｏｒＲ）クロラムフェニコール耐性遺伝子；（Ｏｒｉ）複製起点；（ＷＰＲＥ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント；（ＧＦＰ）緑色蛍光タンパク質；（Ｐ２Ａ）２Ａ自己切断ペプチドファミリーのメンバー；（ＨＡ）アミノ酸９８～１０６に対応するヒトインフルエンザ赤血球凝集素分子から誘導したタグ。 図３６Ａおよび３６Ｂは、ＡＰＤが、無処理の細胞と比較して、ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐを含有するレンチウイルスで処理したＬＱＴ３ ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて短縮したことを示す。図３６Ａは、無処理およびＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐで処理したＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭについての１Ｈｚでペース調整した五つの連続的ＦＬＵＯＶＯＬＴ（商標）電圧色素光学活動電位を示す代表的なトレースを含む。 図３６Ｂは、無処理およびＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐで処理したＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭについてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値をプロットしたグラフである。活動電位トレースビデオを、１Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、光学活動電位を得て、そこから、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を決定した。２０秒間の第二のトレース内でのすべての活動電位についてのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を平均化して、単一のデータ点を得た。 図３７は、ｑＰＣＲを使用して決定された、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＭＹＨ７のノックダウンをプロットしたグラフである。 図３８は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＰＫＰ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図３９Ａ～３９Ｄは、ＰＫＰ２－ｃ２１４６－１Ｇ＞Ｃバリアントを有する患者から誘導したｉＰＳＣの品質管理を示す。図３９Ａは、正常な形態を有するｉＰＳＣコロニーの明視野画像を含む。 図３９Ｂは、ＡＣＭを有する患者から誘導したｉＰＳＣにおけるＡＣＭ原因ＰＫＰ２－ｃ２１４６－１Ｇ＞Ｃバリアントのサンガー配列決定確認を示す。 図３９Ｃは、患者の血液試料から生成したｉＰＳＣ株由来のクローンについての正常な核型を示す。 図３９Ｄは、ＤＡＰＩ核染色およびＴｒａ－１－６０またはＳＳＥＡ－４、ＮａｎｏｇまたはＯｃｔ－４を含む多能性のマーカーについての免疫蛍光顕微鏡の画像、ならびに合わせた画像を含む。 図４０は、カルシウム一過性持続時間（ＣＴＤ）および減衰が、無処理の細胞と比較して、ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐを含有するレンチウイルスで処理したＡＣＭ ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて短縮したことを示す、一連のグラフを含む。ＰＫＰ２介在性ＡＣＭ関連不整脈現象が、しばしば労作と関連していることを考え、カルシウム取り扱い測定を、ベースラインとアドレナリン作動薬であるイソプロテレノール（Ｉｓｏ）を用いた処置後の両方で行った。トレースビデオを、０．５Ｈｚでペース調整しながら５０ｆｐで２０秒間の第二の持続時間、取得した。光を放つ細胞を含有する対象の領域を同定し、経時的な蛍光強度の変化を測定して、カルシウム一過性トレースを得て、そこから、値を決定した。２０秒の第二のトレース内のカルシウム一過性のすべての値を平均化して、カルシウム振幅を除くすべてのパラメータについて単一のデータ点を得、ここで、第一の値のみを分析のため得た。 図４１は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＤＳＰのノックダウンをプロットしたグラフである。 図４２は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＭＹＢＰＣ３のノックダウンをプロットしたグラフである。 図４３は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＲＢＭ２０のノックダウンをプロットしたグラフである。 図４４は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＣＡＣＮＡ１Ｃのノックダウンをプロットしたグラフである。 図４５は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＣＡＬＭ１のノックダウンをプロットしたグラフである。 図４６は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＣＡＬＭ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図４７は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＣＡＬＭ３のノックダウンをプロットしたグラフである。 図４８は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＫＣＮＪ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図４９は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＣＡＳＱ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図５０は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＤＳＧ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図５１は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＴＮＮＴ２のノックダウンをプロットしたグラフである。 図５２は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＴＰＭ１のノックダウンをプロットしたグラフである。 図５３は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＬＭＮＡのノックダウンをプロットしたグラフである。 図５４は、ｑＰＣＲによって決定した、様々なｓｈＲＮＡを有するＴＳＡ２０１細胞におけるＰＬＮのノックダウンをプロットしたグラフである。
本明細書は、内在性原因対立遺伝子の抑制および非変異体（非原因）の非抑制コード配列との置換／発現を介して、先天性疾患（例えば、ＬＱＴＳ、またはより具体的には、ＬＱＴ１、ＬＱＴ２、もしくはＬＱＴ３などの先天性心疾患）を有する哺乳動物を処置するための方法および物質を提供する。一般的に、本明細書において提供される方法および物質は、一つまたは複数の補正構成要素（例えば、野生型ポリペプチドをコードし、抑制性構成要素に対して免疫性である疾患関連対立遺伝子のバージョンをコードする核酸）と組み合わせて、哺乳動物（例えば、ＬＱＴＳ、またはより具体的には、ＬＱＴ１、ＬＱＴ２、もしくはＬＱＴ３を有するヒトなどの哺乳動物の心臓）内に存在する一つまたは複数のタイプの細胞（例えば、心筋細胞）内での一つまたは複数の疾患関連対立遺伝子（またはそれらの転写されたＲＮＡ）の発現を抑制するよう設計された一つまたは複数の抑制性構成要素（例えば、ｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ核酸）を含有する、核酸構築物の使用を含む。本明細書において提供される方法および物質を使用して、抑制性構成要素によって標的化される対立遺伝子によって引き起こされる疾患の一つまたは複数の症状または作用を低減することができる。
ある場合では、本明細書は、先天性障害を有する哺乳動物を処置するために使用することができる抑制および補充性（ＳｕｐＲｅｐ）核酸を提供する。本明細書において提供される方法に従って処置することができる障害としては、ＬＱＴＳ（例えば、ＬＱＴ１、ＬＱＴ２、ＬＱＴ３、ＬＱＴ４、ＬＱＴ５、ＬＱＴ６、ＬＱＴ７、ＬＱＴ８、ＬＱＴ９、ＬＱＴ１０、ＬＱＴ１１、ＬＱＴ１２、ＬＱＴ１３、ＬＱＴ１４、ＬＱＴ１５、ＬＱＴ１６、またはＬＱＴ１７）、ブルガダ症候群（ＢｒＳ）、カテコールアミン作動性多型性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、不整脈性心筋症（ＡＣＭ）、肥大型心筋症（ＨＣＭ）、肥大型心筋症（ＤＣＭ）、ＳＱＴＳ、チモシー症候群、左室非圧縮心筋症（ＬＶＮＣ）、骨格筋症、アンダーセン症候群（ＡＴＳ）、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）、心筋症、心房細動、およびトリアディンノックアウト症候群（ＴＫＯＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において提供される核酸は、二つの主要な構成要素－選択された疾患関連対立遺伝子の発現を抑制することができる抑制性遺伝子療法構成要素、および抑制性遺伝子療法構成要素に対して免疫性である選択された疾患関連対立遺伝子の補正バージョンをコードする補正遺伝子療法構成要素を含む。
抑制性構成要素は、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのＲＮＡｉ核酸であってもよい。抑制性構成要素は、任意の適切な長さを有し得る。例えば、抑制性構成要素は、約１０～４０ヌクレオチド長（例えば、約１０～約２０、約１５～約３０、約１８～約２２、約２０～約３０、または約３０～約４０ヌクレオチド長）であり得る。
抑制性構成要素は、病原性変異（例えば、ＬＱＴＳ－原因変異）または他の遺伝子多型を含有しない疾患関連対立遺伝子の領域を標的化するよう設計することができる。このようにして、抑制性構成要素は、野生型対立遺伝子、疾患関連変異を含有する対立遺伝子、または処置されるべき障害の原因ではない他の多型を含有する対立遺伝子を含む、内在性対立遺伝子の多数のバージョンの発現を低減することができる。
ある場合では、抑制性構成要素は、一つまたは複数の病原性変異（例えば、一つまたは複数のＬＱＴＳ－原因変異）または他の遺伝子多型を含有する疾患関連対立遺伝子の領域を標的化する様設計することができる。
補正構成要素は、病原性変異を欠く疾患関連対立遺伝子の補正バージョンをコードする核酸であってもよく、野生型ポリペプチドをコードしてもよい。補正構成要素はまた、補正構成要素が、抑制性遺伝子療法構成要素に対して免疫性である（例えば、抑制されない）ように、標的化遺伝子の内在性バージョンと比較して塩基置換を含有する。例えば、そうでなければ、抑制性構成要素によって標的化される補正構成要素の領域は、対応する野生型配列と比較して、補正構成要素によってコードされるアミノ酸配列を変化させない約１～約１３（例えば、約１～約３、約２～約４、約３～約５、約４～約６、約５～約７、約６～約８、約７～約９、約８～約１０、約９～約１１、約１０～約１２、または約１１～約１３）のゆらぎ塩基同義バリアントを含むことができる。ある場合では、そうでなければ、抑制性構成要素によって標的化される補正構成要素の領域は、対応する野生型配列（例えば、野生型の非病原性配列）と比較して、補正構成要素によってコードされるアミノ酸配列を変化させない１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のゆらぎ塩基同義バリアントを含むことができる。同義バリアントが存在するため、抑制性構成要素の発現は、抑制性構成要素の発現を低減しない。
他の抑制性構成要素／補正構成要素の組み合わせも使用することができる。例えば、ある場合では、補正ｃＤＮＡは、ＵＴＲを含有しないが、ｍＲＮＡの内在性転写は、ＵＴＲを含有するため、抑制性構成要素は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲを標的化するよう設計することができる。このような場合では、抑制性構成要素（例えば、ＲＮＡｉ）は、ＵＴＲに標的化されるため、補正構成要素は、サイレントバリアントを含有する必要はない。ある場合では、抑制性構成要素は、コード配列の５’または３’末端近くの配列を標的化することができ、補正構成要素は、抑制性構成要素によって標的化される配列を含有しない標的化ｃＤＮＡを含むことができる。
ある場合では、補正構成要素は、アミノ酸配列レベルで野生型ポリペプチドと１００％同一でないが、障害を処置するのに十分なレベルで活性を有するポリペプチドをコードしてもよい。アミノ酸置換は、ある場合では、（ａ）置換範囲内のペプチド骨格の構造、（ｂ）特定の部位での分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するその作用がう有意に異ならない置換を選択することによって、なされ得る。例えば、天然に存在する残基は、側鎖の特性に基づいて群：（１）疎水性アミノ酸（メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）；（２）中性親水性アミノ酸（システイン、セリン、およびスレオニン）；（３）酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）；（４）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）；（５）鎖の配向に影響するアミノ酸（グリシンおよびプロリン）；ならびに（６）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン）に分けることができる。これらの群内でなされる置換は、保存的置換とみなすことができる。本明細書において提供されるＳｕｐＲｅｐ構築物の補正構成要素内でコードされ得る保存的置換の非限定的な例としては、アラニンに対するバリン、アルギニンに対するリジン、アスパラギンに対するグルタミン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、システインに対するセリン、グルタミンに対するアスパラギン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシンに対するプロリン、ヒスチジンに対するアルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジンに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するスレオニン、スレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、および／またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられるが、これらに限定されない。
ある場合では、本明細書において提供されるＳｕｐＲｅｐ構築物はまた、レポーターをコードするか、または含有することができる。任意の適切なレポーターを使用することができる。ある場合では、例えば、蛍光レポーター（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、または黄色蛍光タンパク質）を使用することができる。ある場合では、非蛍光タグを含むことができる。赤血球凝集素、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、Ｈｉｓ６、およびＶ５を含むが、これらに限定されない、任意の適切な非蛍光タグを使用することができる。
本明細書において提供されるＳｕｐＲｅｐ構築物の非限定的な例は、ＬＱＴ１を有する哺乳動物を処置するために使用することができるＳｕｐＲｅｐ ＫＣＮＱ１遺伝子療法ベクターである。本明細書の実施例に記載されるように、ＳｕｐＲｅｐ ＫＣＮＱ１遺伝子療法ベクターの治療有効性は、二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ モデルシステムを使用して得られる結果によって支持される。繰り返すと、ＳｕｐＲｅｐ戦略には、直列で生じる二つの構成要素を有する。第一に、ＫＣＮＱ１およびＬＱＴ１について、両方の内在性ＫＣＮＱ１対立遺伝子（ＷＴ対立遺伝子およびＬＱＴ１変異体含有対立遺伝子）の抑制が、ＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡを介して生じる。第二の構成要素は、ｓｈＲＮＡの結合配列内の各コドンのゆらぎ塩基に同義バリアントを含有するｓｈＲＮＡ－免疫（ｓｈＩＭＭ）ＫＣＮＱ１ ｃＤＮＡの発現を介したＫＣＮＱ１の置換を含む。上述のように、これらの同義バリアントは、ＷＴアミノ酸配列を変更しないが、ｓｈＲＮＡによるノックダウン（ＫＤ）を防止し、これによってｓｈＲＮＡに対する「免疫」をもたらす。ｓｈＲＮＡは、別々の変異よりむしろ遺伝子自体を標的化するため、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、変異非依存性であってもよく、これにより、複数のＲＮＡｉを設計する必要性を排除する。
抑制性構成要素および補正構成要素をコードする核酸分子は、共通分子クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、化学核酸合成技術、およびこのような技術の組み合わせを含むが、これらに限定されない技術によって産生することができる。例えば、選択されたポリペプチド（例えば、ＫＣＮＱ１）をコードする核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）を増幅するよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲを使用することができる。
本明細書はまた、先天性障害を有すると同定された哺乳動物を処置するための、本明細書に記載されるＳｕｐＲｅｐ構築物を使用するための方法を提供する。本明細書の実施例に記載されるように、例えば、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターが生成され、ＫＣＮＱ１を抑制および置換するその能力が、ＴＳＡ２０１細胞における異種発現を介して検証された。さらに、ＬＱＴ１疾患表現型は、異なるＬＱＴ１－原因バリアントを有する四人の患者から生成された患者特異的な人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ 心臓モデルにおける心活動電位持続時間（ＡＰＤ）の短縮によって救済された。さらに、本明細書に記載される研究は、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法が、患者自身の補正同質遺伝子対照細胞のゴールドスタンダードと比較したとき、ＡＰＤ正常化に関しておよそ「治療的治癒」であったことを示した。
任意の適切な哺乳動物を、本明細書に記載されるように処置することができる。例えば、先天性障害（例えば、ＬＱＴＳ、またはより具体的には、ＬＱＴ１などの先天性心臓障害）を有するヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラット、およびマウスを含むが、これらに限定されない哺乳動物を、本明細書に記載されるように処置することができる。ある場合では、先天性疾患（例えば、ＬＱＴＳ、またはより具体的には、ＬＱＴ１などの先天性心疾患）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を、内在性疾患関連対立遺伝子の発現を抑制し、置換野生型ｃＤＮＡ（または疾患関連多型を含まないｃＤＮＡ）をもたらす様式で、ＳｕｐＲｅｐ 核酸構築物を哺乳動物に（例えば、哺乳動物の心筋に）投与することによって、処置することができる。哺乳動物は、任意の適切な診断技術を使用して、先天性障害を有すると同定することができる。非限定的な例としては、一つまたは複数の疾患関連対立遺伝子についての遺伝子スクリーニングならびに器官（例えば、心臓）機能欠損の評価（例えば、心電図、心エコー図、運動負荷試験、および／またはリドカイン負荷による）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴ１またはＳＱＴＳを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＫＣＮＱ１であってもよい。ＫＣＮＱ１構築物の例は、図１Ａおよび１Ｂに示される。例示的なＫＣＮＱ１配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００２１８（例えば、バージョンＮＭ＿０００２１８．２またはＮＭ＿００２１８．３）に記載される（図１Ｃ）。ＫＣＮＱ１ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００２０９（例えば、バージョンＮＰ＿０００２０９．２）に記載されるアミノ酸配列を有する（図１Ｃ）。
ＫＣＮＱ１を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ａに記載される。
Figure 2024501882000002
Figure 2024501882000003
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴ２またはＳＱＴＳを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＫＣＮＨ２であってもよい。ＫＣＮＨ２構築物の例は、図２Ａおよび２Ｂに示される。例示的なＫＣＮＨ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００２３８（例えば、バージョンＮＭ＿０００２３８．４；図２Ｃ）に記載される。ＫＣＮＨ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００２２９（例えば、バージョンＮＰ＿０００２２９．１；図２Ｃ）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＫＣＮＨ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｂに記載される。
Figure 2024501882000004
Figure 2024501882000005
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴ３またはＢｒＳを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＳＣＮ５Ａ（ナトリウムチャネルタンパク質タイプ５サブユニットアルファアイソフォームｂをコードする）であってもよい。ＳＣＮ５Ａ構築物の例は、図３Ａおよび３Ｂに示される。例示的なＳＣＮ５Ａ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００３３５（例えば、バージョンＮＭ＿０００３３５．５；図３Ｃ）に記載される。ＳＣＮ５Ａポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００３２６（例えば、バージョンＮＰ＿０００３２６．２：図３Ｃ）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＳＣＮ５Ａを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｃに記載される。
Figure 2024501882000006
Figure 2024501882000007
Figure 2024501882000008
Figure 2024501882000009
ある場合では、哺乳動物は、ＨＣＭまたはＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＭＹＨ７（ミオシン重鎖７をコードする）であってもよい。例示的なＭＹＨ７配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００２５７（例えば、バージョンＮＭ＿０００２５７．４）に記載される。ＭＹＨ７ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００２４８（例えば、バージョンＮＰ＿０００２４８．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＭＹＨ７を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｄに記載される。
Figure 2024501882000010
Figure 2024501882000011
ある場合では、哺乳動物は、ＡＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＤＳＰ（デスモプラキンをコードする）であってもよい。例示的なＤＳＰ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００４４１５（例えば、バージョンＮＭ＿００４４１５．４）に記載される。ＤＳＰポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００４４０６（例えば、バージョンＮＰ＿００４４０６．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＤＳＰを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｅに記載される。
Figure 2024501882000012
Figure 2024501882000013
Figure 2024501882000014
Figure 2024501882000015
Figure 2024501882000016
Figure 2024501882000017
ある場合では、哺乳動物は、ＨＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＭＹＢＰＣ３（ミオシン結合タンパク質Ｃ３をコードする）であってもよい。例示的なＭＹＢＰＣ３配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００２５６（例えば、バージョンＮＭ＿０００２５６．３）に記載される。ＭＹＢＰＣ３ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００２４７（例えば、バージョンＮＰ＿０００２４７．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＭＹＢＰＣ３を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｆに記載される。
Figure 2024501882000018
Figure 2024501882000019
ある場合では、哺乳動物は、ＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＲＢＭ２０（ＲＮＡ結合モチーフタンパク質２０をコードする）であってもよい。例示的なＲＢＭ２０配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１１３４３６３（例えば、バージョンＮＭ＿００１１３４３６３．３）に記載される。ＲＢＭ２０ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１１２７８３５（例えば、バージョンＮＰ＿００１１２７８３５．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＲＢＭ２０を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｇに記載される。
Figure 2024501882000020
Figure 2024501882000021
Figure 2024501882000022
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴＳまたはチモシー症候群を有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（カルシウム電圧でゲートされたチャネル サブユニットアルファ１Ｃをコードする）であってもよい。例示的なＣＡＣＮＡ１Ｃ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００７１９（例えば、バージョンＮＭ＿０００７１９．７）に記載される。ＣＡＣＮＡ１Ｃポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００７１０（例えば、バージョンＮＰ＿０００７１０．５）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＣＮＡ１Ｃを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｈに記載される。
Figure 2024501882000023
Figure 2024501882000024
ある場合では、哺乳動物は、ＡＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＰＫＰ２（プラコフィリン２をコードする）であってもよい。ＰＫＰ２構築物の例は、図４Ａおよび４Ｂに示される。例示的なＰＫＰ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１００５２４２（例えば、バージョンＮＭ＿００１００５２４２．３；図４Ｃ）に記載される。ＰＫＰ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１００５２４２（例えば、バージョンＮＰ＿００１００５２４２．２；図４Ｃ）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＰＫＰ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｉに記載される。
Figure 2024501882000025
Figure 2024501882000026
Figure 2024501882000027
ある場合では、哺乳動物は、ＡＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＤＳＧ２（デスモグレイン２をコードする）であってもよい。例示的なＤＳＧ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１９４３（例えば、バージョンＮＭ＿００１９４３．５）に記載される。ＤＳＧ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１９３４（例えば、バージョンＮＰ＿００１９３４．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＤＳＧ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｊに記載される。
Figure 2024501882000028
Figure 2024501882000029
Figure 2024501882000030
Figure 2024501882000031
ある場合では、哺乳動物は、ＡＣＭ、ＤＣＭ、左室非圧縮心筋症（ＬＶＮＣ）、または骨格筋症を有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＤＥＳ（デスミンをコードする）であってもよい。例示的なＤＥＳ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１９２７（例えば、バージョンＮＭ＿００１９２７．４）に記載される。ＤＥＳポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１９１８（例えば、バージョンＮＰ＿００１９１８．３）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＤＥＳを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｋに記載される。
Figure 2024501882000032
Figure 2024501882000033
ある場合では、哺乳動物は、アンダーセン症候群（ＡＴＳ）またはＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＫＣＮＪ２（カリウム内向き整流性チャネルサブファミリーＪメンバー２をコードする）であってもよい。例示的なＫＣＮＪ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００８９１（例えば、バージョンＮＭ＿０００８９１．３）に記載される。ＫＣＮＪ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００８８２（例えば、バージョンＮＰ＿０００８８２．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＫＣＮＪ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｌに記載される。
Figure 2024501882000034
ある場合では、哺乳動物は、ＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＣＡＳＱ２（カルセケストリン２をコードする）であってもよい。例示的なＣＡＳＱ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１２３２（例えば、バージョンＮＭ＿００１２３２）に記載される。ＣＡＳＱ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１２２３．２（例えば、バージョンＮＰ＿００１２２３．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＳＱ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｍに記載される。
Figure 2024501882000035
Figure 2024501882000036
Figure 2024501882000037
ある場合では、哺乳動物は、ＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＬＭＮＡ（ラミンＡ／Ｃをコードする）であってもよい。例示的なＬＭＮＡ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿１７０７０７（例えば、バージョンＮＭ＿１７０７０７．４）に記載される。ＬＭＮＡポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿７３３８２１（例えば、バージョンＮＰ＿７３３８２１．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＬＭＮＡを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｎに記載される。
Figure 2024501882000038
ある場合では、哺乳動物は、ＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＴＰＭ１（トロポミオシン１をコードする）であってもよい。例示的なＴＰＭ１配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１０１８００５（例えば、バージョンＮＭ＿００１０１８００５．２）に記載される。ＴＰＭ１ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１０１８００５（例えば、バージョンＮＰ＿００１０１８００５．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＴＰＭ１を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｏに記載される。
Figure 2024501882000039
ある場合では、哺乳動物は、ＤＣＭまたはＡＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＰＬＮ（ホスホランバンをコードする）であってもよい。例示的なＰＬＮ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００２６６７（例えば、バージョンＮＭ＿００２６６７．５）に記載される。ＰＬＮポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００２６５８（例えば、バージョンＮＰ＿００２６５８．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＰＬＮを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｐに記載される。
Figure 2024501882000040
ある場合では、哺乳動物は、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体をコードする）であってもよい。例示的なＬＤＬＲ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００５２７（例えば、バージョンＮＭ＿０００５２７．５）に記載される。ＬＤＬＲポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００５１８（例えば、バージョンＮＰ＿０００５１８．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＬＤＬＲを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｑに記載される。
Figure 2024501882000041
Figure 2024501882000042
ある場合では、哺乳動物は、ＦＨを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型をコードする）であってもよい。例示的なＰＣＳＫ９配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿１７４９３６（例えば、バージョンＮＭ＿１７４９３６．４）に記載される。ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿７７７５９６（例えば、バージョンＮＰ＿７７７５９６．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＰＣＳＫ９を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｒに記載される。
Figure 2024501882000043
ある場合では、哺乳動物は、ＨＣＭまたはＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＴＮＮＴ２（心臓型トロポニンＴ２をコードする）であってもよい。例示的なＴＮＮＴ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１２７６３４５（例えば、バージョンＮＭ＿００１２７６３４５．２）に記載される。ＴＮＮＴ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１２６３２７４（例えば、バージョンＮＰ＿００１２６３２７４．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＴＮＮＴ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｓに記載される。
Figure 2024501882000044
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＣＡＬＭ１（カルモジュリン１をコードする）であってもよい。例示的なＣＡＬＭ１配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００６８８８（例えば、バージョンＮＭ＿００６８８８．６）に記載される。ＣＡＬＭ１ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００８８１９（例えば、バージョンＮＰ＿００８８１９．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＬＭ１を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｔに記載される。
Figure 2024501882000045
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＣＡＬＭ２（カルモジュリン２をコードする）であってもよい。例示的なＣＡＬＭ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１７４３（例えば、バージョンＮＭ＿００１７４３．６）に記載される。ＣＡＬＭ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１７３４（例えば、バージョンＮＰ＿００１７３４．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＬＭ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｕに記載される。
Figure 2024501882000046
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＣＡＬＭ３（カルモジュリン３をコードする）であってもよい。例示的なＣＡＬＭ３配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００５１８４（例えば、バージョンＮＭ＿００５１８４．４）に記載される。ＣＡＬＭ３ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００５１７５．２（例えば、バージョンＮＰ＿００５１７５．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＬＭ３を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｖに記載される。
Figure 2024501882000047
ある場合では、哺乳動物は、トリアディンノックアウト症候群（ＴＫＯＳ）を有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＴＲＤＮ（トリアディンをコードする）であってもよい。例示的なＴＲＤＮ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００６０７３（例えば、バージョンＮＭ＿００６０７３．４）に記載される。ＴＲＤＮポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００６０６４（例えば、バージョンＮＰ＿００６０６４．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＬＭ３を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｗに記載される。
Figure 2024501882000048
ある場合では、哺乳動物は、ＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２をコードする）であってもよい。例示的なＲＹＲ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１０３５（例えば、バージョンＮＭ＿００１０３５．３）に記載される。ＲＹＲ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１０２６（例えば、バージョンＮＰ＿００１０２６．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＲＹＲ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｘに記載される。
Figure 2024501882000049
Figure 2024501882000050
ある場合では、哺乳動物は、ＦＨを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＡＰＯＢ（アポリポタンパク質Ｂをコードする）であってもよい。例示的なＡＰＯＢ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００３８４（例えば、バージョンＮＭ＿０００３８４．３）に記載される。ＡＰＯＢポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００３７５（例えば、バージョンＮＰ＿０００３７５．３）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＡＰＯＢを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｙに記載される。
Figure 2024501882000051
Figure 2024501882000052
Figure 2024501882000053
Figure 2024501882000054
Figure 2024501882000055
Figure 2024501882000056
Figure 2024501882000057
Figure 2024501882000058
Figure 2024501882000059
Figure 2024501882000060
Figure 2024501882000061
Figure 2024501882000062
Figure 2024501882000063
Figure 2024501882000064
ある場合では、哺乳動物は、ＤＣＭまたはＨＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＴＮＮＩ３（心臓型トロポニンＩ３をコードする）であってもよい。例示的なＴＮＮＩ３配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００３６３（例えば、バージョンＮＭ＿０００３６３．５）に記載される。ＴＮＮＩ３ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号Ｑ５９Ｈ１８（例えば、バージョンＱ５９Ｈ１８．３）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＴＮＮＩ３を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１Ｚに記載される。
Figure 2024501882000065
ある場合では、哺乳動物は、ＤＣＭまたはＨＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＴＮＮＣ１（遅い骨格および心臓型トロポニンＣ１をコードする）であってもよい。例示的なＴＮＮＣ１配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００３２８０（例えば、バージョンＮＭ＿００３２８０．３）に記載される。ＴＮＮＣ１ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００３２７１（例えば、バージョンＮＰ＿００３２７１．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＴＮＮＣ１を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１ＡＡに記載される。
Figure 2024501882000066
Figure 2024501882000067
Figure 2024501882000068
ある場合では、哺乳動物は、ＨＣＭまたはＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＭＹＬ２（ミオシン軽鎖２をコードする）であってもよい。例示的なＭＹＬ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００４３２（例えば、バージョンＮＭ＿０００４３２．４）に記載される。ＭＹＬ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００４２３（例えば、バージョンＮＰ＿０００４２３．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＭＹＬ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１ＢＢに記載される。
Figure 2024501882000069
Figure 2024501882000070
ある場合では、哺乳動物は、ＨＣＭまたはＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＭＹＬ３（ミオシン軽鎖３をコードする）であってもよい。例示的なＭＹＬ３配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０００２５８（例えば、バージョンＮＭ＿０００２５８．３）に記載される。ＭＹＬ３ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０００２４９（例えば、バージョンＮＰ＿０００２４９．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＭＹＬ３を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１ＣＣに記載される。
Figure 2024501882000071
ある場合では、哺乳動物は、ＨＣＭまたはＤＣＭを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＪＰＨ２（ジャンクトフィリン２をコードする）であってもよい。例示的なＪＰＨ２配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０２０４３３（例えば、バージョンＮＭ＿０２０４３３．５）およびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿１７５９１３（例えば、バージョンＮＭ＿１７５９１３．４）に記載される。ＪＰＨ２ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿０６５１６６（例えば、バージョンＮＰ＿０６５１６６．２）またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿７８７１０９（例えば、バージョンＮＰ＿７８７１０９．２）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＪＰＨ２を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１ＤＤに記載される。
Figure 2024501882000072
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴＳ、ＨＣＭ、または肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）を有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＣＡＶ３（カベオリン３をコードする）を有してもよい。例示的なＣＡＶ３配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿０３３３３７（例えば、バージョンＮＭ＿０３３３３７．３）およびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１２３４（例えば、バージョンＮＭ＿００１２３４．５）に記載される。ＣＡＶ３ポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿２０３１２３（例えば、バージョンＮＰ＿２０３１２３．１）またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１２２５（例えば、バージョンＮＰ＿００１２２５．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＣＡＶ３を標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１ＥＥに記載される。
Figure 2024501882000073
ある場合では、哺乳動物は、ＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有してもよく、抑制され、置換されるべき遺伝子は、ＴＥＣＲＬ（トランス－２，３－エノイル－ＣｏＡ還元酵素様タンパク質をコードする）であってもよい。例示的なＴＥＣＲＬ配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１０１０８７４（例えば、バージョンＮＭ＿００１０１０８７４．５）およびＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＭ＿００１３６３７９６（例えば、バージョンＮＭ＿００１３６３７９６．１）に記載される。ＴＥＣＲＬポリペプチドは、ある場合では、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１０１０８７４（例えば、バージョンＮＰ＿００１０１０８７４．２）またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ登録番号ＮＰ＿００１３５０７２５（例えば、バージョンＮＰ＿００１３５０７２５．１）に記載されるアミノ酸配列を有する。
ＴＥＣＲＬを標的化するｓｈＲＮＡ配列および対応するｓｈＩＭＭ配列の例は、表１ＦＦに記載される。
Figure 2024501882000074
Figure 2024501882000075
Figure 2024501882000076
任意の適切な方法を使用して、生きている哺乳動物内の細胞（例えば、心臓細胞）にＳｕｐＲｅｐ核酸構築物を送達することができる。例えば、抑制性構成要素および置換構成要素を含有するＳｕｐＲｅｐ構築物は、ウイルスベクターなどの、一つまたは複数のベクターを使用して哺乳動物に投与することができる。ある場合では、ＳｕｐＲｅｐ核酸を投与するためのベクターは、抑制的および補正構成要素の一過性発現に使用され得る。ある場合では、ＳｕｐＲｅｐ核酸を投与するためのベクターは、抑制的および補正構成要素の安定な発現に使用され得る。ある場合では、核酸を投与するためのベクターが、安定な発現に使用することができる場合、ベクターは、抑制性構成要素を発現するよう設計された核酸および／または細胞のゲノム内に補正構成要素を発現するよう設計された核酸を組み込むよう操作することができる。このような場合では、任意の適切な方法を使用して、細胞のゲノムに核酸を組み込むことができる。例えば、遺伝子療法技術を使用して、抑制性構成要素（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現するよう設計された核酸および／または細胞のゲノム内に補正構成要素（例えば、抑制性構成要素に対して免疫性である野生型ポリペプチド）を発現するよう設計された核酸を組み込むことができる。ある場合では、安定な発現は、必ずしもゲノムへの組み込みを必要としない。ＡＡＶ９を使用すると、例えば、ＳｕｐＲｅｐ ＤＮＡは、ヒトゲノムに組み込まれることなく、細胞においてそれ自体で存続することができる。組み込まれていないＤＮＡは、典型的には、ゲノムＤＮＡ複製物として破壊されるが、細胞は、複製または分裂してＳｕｐＲｅｐ ＤＮＡを除去しないため、心筋細胞またはニューロンなどの非分裂細胞では、ＳｕｐＲｅｐ ＤＮＡは、無期限に存続することができる。
ＳｕｐＲｅｐ核酸を細胞に投与するためのベクターは、標準的な物質（例えば、パッケージング細胞株、ヘルパーウイルス、およびベクター構築物）を使用して調製することができる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）、およびＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｕｒｔｉｓ Ａ．Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３）を参照のこと。ウイルスベースの核酸送達ベクターは、典型的には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、およびパピローマウイルスなどの動物ウイルスに由来する。ある場合では、ＳｕｐＲｅｐ核酸構築物は、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ血清型１ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型２ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型３ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型４ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型５ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型６ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型７ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型８ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型９ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型１０ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型１１ウイルスベクター、ＡＡＶ血清型１２ウイルスベクター、またはＡＡＶ２末端逆位配列およびゲノムが、ＡＡＶ９カプシド内に含有され、これが、心筋細胞へのＡＡＶ９指向性をもたらし得る、ＡＡＶ血清型２／９ウイルスベクターなどの組換えＡＡＶ血清型ウイルスベクター）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターを使用して細胞に送達することができる。ある場合では、ＡＡＶ９ベクターを使用して、細胞に一つまたは複数のＳｕｐＲｅｐ核酸を送達することができる。
抑制性構成要素をコードする核酸および補正構成要素をコードする核酸に加えて、ウイルスベクターは、抑制性構成要素および補正構成要素をコードする核酸に作動可能に連結された制御エレメントを含有してもよい。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、コードされたＲＮＡおよび／またはポリペプチドの発現を許容するか、または促進するような方法での核酸に対するベクター内の制御エレメントの位置決めを指す。このような制御エレメントには、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、シグナルペプチド、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、または核酸の発現（例えば、転写もしくは翻訳）を調節するための誘導可能なエレメントが含まれ得る。ウイルスベクターに含まれ得るエレメントの選択は、誘導性、標的化、および所望の発現のレベルを含むが、これらに限定されない、いくつかの要員に依存する。例えば、プロモーターをウイルスベクターに含めて、抑制性構成要素（例えば、ｓｈＲＮＡ）および補正構成要素（例えば、抑制性構成要素による抑制に対して免疫性であるＷＴポリペプチド）をコードする核酸の転写を促進することができる。プロモーターは、構成的または誘導可能（例えば、テトラサイクリンもしくはラパマイシンの存在下）であってもよく、一般的または組織特異的な様式でｓｈＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸の発現に影響を与え得る。（例えば、心筋細胞細胞における）抑制性および補正構成要素の発現を駆動するために使用することができるプロモーターの例としては、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖プロモーター、ミオシン軽鎖２プロモーター、心筋トロポニンＴ、および心筋トロポニンＣプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ粒子」は、その核酸ゲノムを細胞に伝達するＡＡＶウイルスのパッケージ化されたカプシド形態を指す。用語「ウイルスゲノム」は、一つのコピーのウイルスゲノムを指す。各ウイルス粒子は、一つのウイルスゲノムを含有し、各ＡＡＶベクターは、一つのウイルスゲノムを含有する。ある場合では、本明細書において提供されるＡＡＶベクターによってコードされるＡＡＶ粒子を含有する組成物は、濃度約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬ（例えば、約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１１ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１２ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１３ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１１ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１２ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１１ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１３ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１１ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１４ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１２ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１３ＡＡＶ粒子／ｍＬ、約１０１２ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１４ＡＡＶ粒子／ｍＬ、または約１０１３ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１４ＡＡＶ粒子／ｍＬ）で投与することができる。ある場合では、本明細書において提供されるＡＡＶベクターによってコードされるＡＡＶ粒子を含有する組成物は、濃度体重キログラム当たり約１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）～約１０１５ｖｇ／ｋｇ（例えば、約１０１０～約１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１０１０～約１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１０１０～約１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１０１１～約１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１０１１～約１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１０１１～約１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１０１２～約１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１０１２～約１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１０１３～約１０１４ｖｇ／ｋｇ）で投与することができる。
ある場合では、ＳｕｐＲｅｐ核酸構築物は、非ウイルスベクターを使用して哺乳動物に投与することができる。核酸送達に非ウイルスベクターを使用する方法は、別に記載される。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｒ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２）を参照のこと。例えば、抑制性構成要素および補正構成要素をコードするＳｕｐＲｅｐ核酸は、ＳｕｐＲｅｐ核酸を含む核酸分子（例えば、プラスミド）の直接注射によって、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子を投与することによって、哺乳動物に投与することができる。ある場合では、抑制性構成要素および補正構成要素を発現するよう設計されたＳｕｐＲｅｐ核酸は、直接注射（例えば、心筋への）、腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、またはナノ粒子および／もしくは薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介して、細胞（例えば、心筋細胞）に送達することができる。
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐおよび／またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐおよび／またはＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ 遺伝子療法が、心筋細胞の大部分に効率的に送達されるとき、再分極予備の遺伝子療法介在性回復は、ギャップ結合を介して分布して、隣接する形質導入されていない心筋細胞を部分的または完全に代償し得る。本明細書に記載される研究からの、光学活動電位の測定中に、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで形質導入された電気的に結合されたｉＰＳＣ－ＣＭにおいて観察された不整脈活性はなく、これは、細胞の効率的な形質導入が、正常なリズムを維持し、形質導入されていない隣接する細胞を代償するのに十分であり得ることを示唆していることは、注目に値した。
任意の適切な量のＳｕｐＲｅｐ核酸は、先天性障害を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することができる。有効量のＳｕｐＲｅｐ核酸は、治療されている障害の一つまたは複数の症状を低減することができる。ある場合では、例えば、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法を使用した、ＫＣＮＱ１（例えば、ＬＱＴ１を有する患者については、ＫＣＮＱ１の複数の病原性バリアントが、常染色体劣性ＬＱＴ１およびイェルベル・ランゲニールセン症候群（ＪＬＮＳ）、または２型ＳＱＴＳ（ＳＱＴ２）などの、遺伝性である場合の重篤な症例）の有効な抑制および補充は、健康な個体の物に類似する（例えば、健康な個体のＩＫｓ電流密度の約５０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％以内）ＩＫｓ電流密度を生じることができる。機能の獲得およびＩＫｓ電流密度の異常な増加を引き起こすＫＣＮＱ１の病原性バリアントは、ＳＱＴＳを導き得る。ある場合では、治療上有効量は、過剰に代償し、ＳＱＴＳを引き起こすことなく、ＬＱＴＳ表現型を改善するのに十分なＩＫｓをもたらすことができる。ＬＱＴ１およびＪＬＮＳにおいて、疾患の重症度は、失われたＩＫｓの程度と相関する（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１５：２４８１－２４８９（２００７））。ヘテロ接合性ナンセンスまたはフレームシフト変異は、ハプロ不全を引き起こし、典型的には、約５０％のＩ-Ｋｓを有する軽度のＬＱＴ１をもたらす。ドミナントネガティブミスセンス変異は、５０％を超えてＩＫｓを低減し、突発的な心臓事象とより強く関連する。最も重篤な症例では、ＪＬＮＳを有する患者は、最小（＜１０％）のＩＫｓをもたらすか、またはＩＫｓをもたらさない二つの変異対立遺伝子を遺伝する（Ｂｈｕｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：３１９－３２７（２００８））。逆に、実質的な機能を獲得したＫＣＮＱ１バリアントは、ＳＱＴ２を引き起こすが、ＩＫｓの増加の正確な程度は、十分に確立されていない（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９：２５１－２５４（２００３）；Ｂｅｌｌｏｃｑ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０９：２３９４－２３９７（２００４）；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，６８：４３３－４４０（２００５）；およびＤａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ，６：１１４６－１１５３（２００９））。したがって、ヒトにおけるＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの治療ウィンドウは、比較的広く、最適な有効性を達成するための柔軟性を可能にし得る。ある場合では、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ投与は、発現を駆動するプロモーターおよび／もしくはエンハンサーによって、または哺乳動物に送達されるウイルス粒子の量によって改変され得る。ある場合では、治療上有効量のＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ構築物は、処置前のＩＫｓと比較して、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％）ＩＫｓを増加させることができる。
ある場合では、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法を使用した、ＫＣＮＨ２（例えば、ＬＱＴ２または１型ＱＴ短縮症候群（ＳＱＴ１）を有する患者について）の有効な抑制および補充は、健康な個体のものと類似（例えば、健康な個体のＩＫｒ電流密度の約５０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％以内）のＩＫｒ電流密度を生じることができる。ある場合では、治療上有効量は、過剰に代償し、ＳＱＴＳを引き起こすことなく、ＬＱＴＳ表現型を改善するのに十分なＩＫｒをもたらすことができる。ＬＱＴ１と同様に、ＬＱＴ２において、疾患の重症度は、失われたＩＫｒの程度と相関する（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０５：７９４－７９９（２００２））。ヘテロ接合性ナンセンスまたはフレームシフト変異は、ハプロ不全を引き起こし、典型的には、約５０％のＩ-Ｋｒを有する軽度のＬＱＴ２をもたらす。ドミナントネガティブミスセンス変異は、５０％よりＩＫｒを低減し、特に、チャネルの細孔領域に局在するとき、心臓事象と最も強く関連する（Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、上記）。逆に、実質的な機能を獲得したＫＣＮＨ２バリアントは、ＳＱＴ１を引き起こし得る（Ｂｒｕｇａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０９：３０－３５（２００４）；ａｎｄ Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＣＣ，５０：４３３－４４１（２０１１））。したがって、ヒトにおけるＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐの治療ウィンドウは、比較的広く、最適な有効性を達成するための柔軟性を可能にし得る。ある場合では、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ投与は、発現を駆動するプロモーターおよび／もしくはエンハンサーによって、または哺乳動物に送達されるウイルス粒子の量によって改変され得る。ある場合では、治療上有効量のＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ構築物は、処置前のＩＫｒと比較して、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％）ＩＫｒを増加させることができる。
ある場合では、ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法を使用したＳＣＮ５Ａ（例えば、ＬＱＴ３を有する患者については、多巣性異所性早発性プルキンエ関連収縮（ＭＥＰＰＣ）症候群、ＳＣＮ５Ａ介在性肥大型心筋症、劣性洞不全症候群、またはＢｒＳ）の有効な抑制および補充は、健康な個体のものと類似（例えば、健康な個体のＩＮａ電流密度の約５０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％以内）のＩＮａ電流密度およびナトリウムチャネル動態を生じることができる。ある場合では、ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ投与は、発現を駆動するプロモーターおよび／もしくはエンハンサーによって、または哺乳動物に送達されるウイルス粒子の量によって改変され得る。ある場合では、治療上有効量のＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ構築物は、処置前のＩＮａ後期電流と比較して、ＩＮａ後期電流またはウィンドウ電流の病理学的増加の量を少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％）抑制することができる。
典型的なＱＴ範囲は、男性について約３５０～４５０ｍｓであり、女性について約３５０～４６０ｍｓであるが、約４３０～４４０を超えるＱＴは、一般的に、境界型の高値であるとみなされる。ＬＱＴＳを有する男性のＱＴは、典型的には、４５０ｍｓより大きく、ＬＱＴＳを有する女性のＱＴは、典型的には、４６０ｍｓより大きい。ほとんどのＬＱＴＳ患者は、５２０ｍｓ未満で最高値に達する。ある場合では、ＬＱＴ１および／またはＬＱＴ２および／またはＬＱＴ３を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されるＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ構築物および／またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ構築物および／またはＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ構築物の有効量は、ＡＰＤが、正常な範囲内にあるように、健康な個体のものと類似の長さにＡＰＤを短縮することができる。ある場合では、ＬＱＴ１および／またはＬＱＴ２および／またはＬＱＴ３を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されるＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ構築物および／またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ構築物および／またはＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ構築物の有効量は、約１０％以内（例えば、健康な個体のＡＰＤの約８％、約５％、または約３％以内）である長さにＡＰＤを短縮することができる。ある場合では、ＬＱＴ１および／またはＬＱＴ２および／またはＬＱＴ３を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に対するＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ構築物および／またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ構築物および／またはＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ構築物の治療上有効量は、処置前のＡＰＤと比較して、少なくとも１０％（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）、ＡＰＤを短縮することができる。
ある場合では、症状は、処置の日、処置の１日後、処置の３ヶ月後、処置の６ヶ月後、処置の１年後および処置後毎年評価することができる。ある場合では、症状は、処置の１日後～処置の７日後（例えば、処置の１日～２日後、処置の１日～３日後、処置の１日～４日後、処置の２日～３日後、処置の２日～４日後、処置の２日～５日後、処置の３日～４日後、処置の３日～５日後、処置の３日～６日後、処置の４日～５日後、処置の４日～６日後、処置の４日～７日後、処置の５日～６日後、処置の５日～７日後、または処置の６日～７日後）に評価することができる。ある場合では、症状は、処置の１週間後～処置の４週間後（例えば、処置の１週間～２週間後、処置の１週間～３週間後、処置の１週間～４週間後、処置の２週間～３週間後、処置の２週間～４週間後、または処置の３週間～４週間後）に評価することができる。ある場合では、症状は、処置の１ヶ月後～処置の１２ヶ月後（例えば、処置の１ヶ月～２ヶ月後、処置の１ヶ月～３ヶ月後、処置の１ヶ月～４ヶ月後、処置の２ヶ月～３ヶ月後、処置の２ヶ月～４ヶ月後、処置の２ヶ月～５ヶ月後、処置の３ヶ月～４ヶ月後、処置の３ヶ月～５ヶ月後、処置の３ヶ月～６ヶ月後、処置の４ヶ月～５ヶ月後、処置の４ヶ月～６ヶ月後、処置の４ヶ月～７ヶ月後、処置の５ヶ月～６ヶ月後、処置の５ヶ月～７ヶ月後、処置の５ヶ月～８ヶ月後、処置の６ヶ月～７ヶ月後、処置の６ヶ月～８ヶ月後、処置の６ヶ月～９ヶ月後、処置の７ヶ月～８ヶ月後、処置の７ヶ月～９ヶ月後、処置の７ヶ月～１０ヶ月後、処置の８ヶ月～９ヶ月後、処置の８ヶ月～１０ヶ月後、処置の８ヶ月～１１ヶ月後、処置の９ヶ月～１０ヶ月後、処置の９ヶ月～１１ヶ月後、処置の９ヶ月～１２ヶ月後、処置の１０ヶ月～１１ヶ月後、処置の１０ヶ月～１２ヶ月後、または処置の１１ヶ月～１２ヶ月後）に評価することができる。ある場合では、症状は、処置の１年後～処置の約２０年後（例えば、処置の１年～５年後、処置の１年～１０年後、処置の１年～１５年後、処置の５年～１０年後、処置の５年～１５年後、処置の５年～２０年後、処置の１０年～１５年後、処置の１０年～２０年後、または処置の１５年～２０年後）に評価することができる。
ある場合では、本明細書において提供される処置は、さらなる投与なしに、単回用量で、先天性疾患（例えば、ＬＱＴＳ、またはより具体的には、ＬＱＴ１またはＬＱＴ２またはＬＱＴ３などの先天性心疾患）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することができる。
ある場合では、本明細書において提供される処置は、先天性疾患（例えば、ＬＱＴＳ、またはより具体的には、ＬＱＴ１などの先天性心疾患）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、少なくとも一日一回、または少なくとも週一回、少なくとも二日間連続もしくは二週間連続で投与することができる。ある場合では、本明細書において提供される処置は、先天性疾患を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５日間または週間連続で投与される。ある場合では、本明細書において提供される処置は、先天性疾患を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、少なくとも一日一回または少なくとも週一回、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間連続で投与される。ある場合では、本明細書において提供される処置は、先天性疾患を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、少なくとも一日一回または少なくとも週一回、長くとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０日間または週間連続で投与される。ある場合では、本明細書において提供される処置は、先天性疾患を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、少なくとも週一回、長くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２週間またはヶ月間連続で投与される。ある場合では、本明細書において提供される処置は、先天性疾患を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月間または年間連続して、対象の生涯全体にわたり慢性的に、あるいは無期限の期間投与される。
一実施形態では、ＫＣＮＱ１遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴ１またはＳＱＴＳを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＫＣＮＱ１遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＫＣＮＱ１遺伝子において、またはＫＣＮＱ１遺伝子によってコードされるか、もしくはＫＣＮＱ１遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．４２１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ１４１Ｍ）、ｃ．９１９Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｖ３０７Ｌ）、ｃ．５１３Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｙ１７１Ｘ）、ｃ．７６０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ２５４Ｍ）、ｃ．１７００Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｉ５６７Ｓ）、ｃ．１３７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｄ４５９Ｄ）、ｃ．１３８０Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｇ４６０Ｇ）、ｃ．１３８３Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｙ４６１Ｙ）、ｃ．１３８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｄ４６２Ｄ）、ｃ．１３８９Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｓ４６３Ｓ）、ｃ．１３９２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｓ４６４Ｓ）、ｃ．１３９５Ａ＞Ｃ（ｐ．Ｖ４６５Ｖ）、ｃ．１３９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４６６Ｒ）、ｃ．１４０１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｋ４６７Ｋ）、およびｃ．１４０４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓ４６８Ｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｒｒｈｙｔｈｍ．２０１６，３２（５）：３８１－３８８；Ｈｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００９，３０：１４８６－１５５１；およびＭｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００８，３７２：７５０－７６３も参照のこと。変異ＫＣＮＱ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＫＣＮＱ１対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＫＣＮＱ１対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＫＣＮＱ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＫＣＮＱ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＫＣＮＱ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＫＣＮＱ１対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＫＣＮＱ１対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＫＣＮＱ１対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＫＣＮＱ１構築物およびｓｈＫＣＮＱ１構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＫＣＮＱ１発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＫＣＮＱ１発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＫＣＮＱ１発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＫＣＮＱ１遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＫＣＮＱ１に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴ１またはＳＱＴＳの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＫＣＮＱ１の病原性変異と関連するＬＱＴ１またはＳＱＴＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神、および／または発作などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＫＣＮＱ１変異と関連するＬＱＴ１またはＳＱＴＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、健康な個体のＩＫｓ電流密度および／または心臓ＡＰＤと類似するＩＫｓ電流密度および／または心臓ＡＰＤをもたらし得る。
別の実施形態では、ＫＣＮＨ２遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴ２またはＳＱＴＳを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＫＣＮＨ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＫＣＮＨ２遺伝子における、またはＫＣＮＨ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１７６４Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｎ５８８Ｋ）、ｃ．８２Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｋ２８Ｅ）、ｃ．２８９３Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｇ９６５Ｘ）、ｃ．３０３６＿３０４８ｄｅｌ（ｐ．Ｒ１０１４ｆｓ）、およびｃ．３１０７＿３１１１ｄｕｐ（ｐ．Ｖ１０３８ｆｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００９，３０：１４８６－１５５１；Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９５，８０：７９５－８０３；およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｒｒｈｙｔｈｍ．２０１６，３２（５）：３７３－３８０も参照のこと。変異ＫＣＮＨ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＫＣＮＨ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＫＣＮＨ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＫＣＮＨ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＫＣＮＨ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＫＣＮＨ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＫＣＮＨ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＫＣＮＨ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＫＣＮＨ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＫＣＮＨ２構築物およびｓｈＫＣＮＨ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＫＣＮＨ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＫＣＮＨ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＫＣＮＨ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＫＣＮＨ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＫＣＮＨ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴ２またはＳＱＴＳの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＫＣＮＨ２の病原性変異と関連するＬＱＴ２またはＳＱＴＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神（例えば、激しい運動もしくは感情的苦悩の期間中）、および／または発作などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＫＣＮＨ２変異と関連するＬＱＴ２またはＳＱＴＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＡＰＤが正常範囲内にあるように、健康な個体の物と類似する長さへのＡＰＤの短縮をもたらし得る。
別の実施形態では、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴ３またはＢｒＳを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＳＣＮ５Ａ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＳＣＮ５Ａ遺伝子における、またはＳＣＮ５Ａ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１００Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ３４Ｃ）、ｃ．１５７１Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ５２４Ｙ）、ｃ．１６７３Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｈ５５８Ｒ）、ｃ．３３０８Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ１１０３Ｙ）、ｃ．３５７８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１１９３Ｑ）、ｃ．３９０８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔ１３０４Ｍ）、ｃ．４５０９＿４５１６ｄｅｌ（ｐ．１５０５－１５０７ｄｅｌ）、ｃ．４８６５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１６２３Ｑ）、およびｃ．５８５１Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｖ１９５１Ｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｋａｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００９，１２０：１７５２－１７６０；およびＨｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００９，３０：１４８６－１５５１も参照のこと。変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を抑制し、それを野生型対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＳＣＮ５Ａ構築物およびｓｈＳＣＮ５Ａ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＳＣＮ５Ａ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＳＣＮ５Ａ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＳＣＮ５Ａ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＳＣＮ５Ａに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴ３またはＢｒＳの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＳＣＮ５Ａの病原性変異と関連するＬＱＴ３またはＢｒＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、失神および／または発作などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＳＣＮ５Ａ変異と関連するＬＱＴ３またはＢｒＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＡＰＤが正常範囲内にあるように、健康な個体の物と類似する長さへのＡＰＤの短縮をもたらし得る。
別の実施形態では、ＭＹＨ７遺伝子の病原性変異と関連するＨＣＭまたはＤＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＭＹＨ７遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＭＹＨ７遺伝子における、またはＭＹＨ７遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１１５６Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｙ３８６Ｈ）、ｃ．１６８０Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｓ５３２Ｐ）、ｃ．１８１６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ６０６Ｍ）、ｃ．２６０２Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ａ８６８Ｐ）、ｃ．２９４５Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｍ９８２Ｔ）、ｃ．４２５８Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１４２０Ｗ）、およびｃ．５７７９Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｉ１９２７Ｆ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｉｌｌａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ． ２０１０，５３：２６１－２６７；Ｖａｎ Ｄｒｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ Ｐｒｏｃ ２００５，８０（４）：４６３－４６９；参考文献を参照のこと。変異ＭＹＨ７対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＨ７対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＭＹＨ７対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＭＹＨ７対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＭＹＨ７対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＭＹＨ７対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＭＹＨ７対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＨ７対立遺伝子を抑制し、それを野生型対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＭＹＨ７構築物およびｓｈＭＹＨ７構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＭＹＨ７発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＭＹＨ７発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＭＹＨ７発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＭＹＨ７遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＭＹＨ７に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＨＣＭまたはＤＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＭＹＨ７の病原性変異と関連するＨＣＭまたはＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、胸痛、不整脈、失神、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらすことができる。ある場合では、病原性ＭＹＨ７変異と関連するＨＣＭまたはＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心肥大および心筋細胞サイズの低減、ならびに／または間質性線維症および心筋混乱の減少をもたらすことができる。
別の実施形態では、ＤＳＰ遺伝子の病原性変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＤＳＰ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＤＳＰ遺伝子における、またはＤＳＰ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１５１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｎ５１Ｘ）、ｃ．４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１６０Ｘ）、ｃ．８９７Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｓ２９９Ｒ）、ｃ．１２６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ４２２Ｋ）、ｃ．１３３３Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｉ４４５Ｖ）、ｃ．３１６０＿３１６９ｄｅｌＡＡＧＡＡＣＡＡ（ｐ．Ｋ１０５２ｆｓＸ２６）、ｃ．３３３７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１１１３Ｘ）、ｃ．４７７５Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｋ１５９２Ｒ）、ｃ．５２１２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１７３８Ｘ）、ｃ．６４７８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ２１６０Ｘ）、およびｃ．６４９６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ２１６６Ｘ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｈｏｎｓａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０１５，３６（１４）：８４７－８５５；Ｓｅｎ－Ｃｈｏｗｄｈｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００７，１１５：１７１０－１７２０；およびＮｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００５，１１２：６３６－６４２も参照のこと。変異ＤＳＰ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＤＳＰ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＤＳＰ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＤＳＰ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＤＳＰ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＤＳＰ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＤＳＰ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＤＳＰ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＤＳＰ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＤＳＰ構築物およびｓｈＤＳＰ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＤＳＰ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＤＳＰ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＤＳＰ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＤＳＰ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＤＳＰに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＡＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＤＳＰの病原性変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心筋の線維脂肪性置換、心室性不整脈、失神、持続性心室頻拍（ＶＴ）もしくは細動（ＶＦ）、および／または心不全などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＤＳＰ変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶ炎症、線維症、および／または収縮機能障害の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＭＹＢＰＣ３遺伝子の病原性変異と関連するＨＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＭＹＢＰＣ３遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＭＹＢＰＣ３遺伝子における、またはＭＹＢＰＣ３遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．３５３５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ１１７９Ｋ）、ｃ．３４１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１１３８Ｈ）、ｃ．３３９２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉ１１３１Ｔ）、ｃ．３１０６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１０３６Ｃ）、ｃ．３００４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１００２Ｗ）、ｃ．２９９２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｑ９９８Ｅ）、ｃ．２８７０Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｔ９５７Ｓ）、ｃ．２６８６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ８９６Ｍ）、ｃ．２４９８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａ８３３Ｖ）、ｃ．２４９７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａ８３３Ｔ）、ｃ．１１４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ３８２ＴＷ）、ｃ．９７７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ３２６Ｑ）、ｃ．７０６Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｓ２３６Ｇ）、およびｃ．４７２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ１５８Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｅｌｍｓ ｅｔ ａｌ．，．Ｃｉｒｃ：Ｇｅｎ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄ．２０２０，１３：３９６－４０５；Ｃａｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．２０１５，５７３（２）：１８８－１９７；Ｍｉｌｌａｔ ｅｔ ａｌ．，上記；およびＰａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ．２０１２，５：１５６－１６６を参照のこと。変異ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＭＹＢＰＣ３対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＭＹＢＰＣ３対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＭＹＢＰＣ３構築物およびｓｈＭＹＢＰＣ３構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＭＹＢＰＣ３発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＭＹＢＰＣ３発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＭＹＢＰＣ３発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＭＹＢＰＣ３遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＭＹＢＰＣ３に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＨＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＭＹＢＰＣ３の病原性変異と関連するＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、および／または疲労などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＭＹＢＰＣ３変異と関連するＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、および／またはエネルギー消費の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＲＢＭ２０遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＲＢＭ２０遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＲＢＭ２０遺伝子における、またはＲＢＭ２０遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１９１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐ６３８Ｌ）、ｃ．１９０１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ６３４Ｑ）、ｃ．１９０６Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｒ６３６Ｓ）、ｃ．１９０７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ６３６Ｈ）、ｃ．１９０９Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｓ６３７Ｇ）、ｃ．１６６１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ５３５Ｉ）、ｃ．１９５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ６３４Ｗ）、ｃ．１９６４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ６３６Ｃ）、およびｃ．２２０５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ７１６Ｑ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００９，５４：９３０－９４１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ．２０１０，３：９０－９７；およびＲｅｆａａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．２０１２，９：３９０－３９６も参照のこと。変異ＲＢＭ２０対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＲＢＭ２０対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＲＢＭ２０対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＲＢＭ２０対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＲＢＭ２０対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＲＢＭ２０対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＲＢＭ２０対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＲＢＭ２０対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＲＢＭ２０対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＲＢＭ２０構築物およびｓｈＲＢＭ２０構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＲＢＭ２０発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＲＢＭ２０発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＲＢＭ２０発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＲＢＭ２０遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＲＢＭ２０に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＲＢＭ２０の病原性変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、胸痛、不整脈、失神、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらすことができる。ある場合では、病原性ＲＢＭ２０変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶサイズの正常化および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはチモシー症候群を有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子において、またはＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．２５７０Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｐ８５７Ｒ）、ｃ．２５００Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｋ８３４Ｑ）、ｃ．２５７０Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐ８５７Ｌ）、ｃ．５７１７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１９０６Ｑ）、ｃ．８２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａ２８Ｔ）、ｃ．２５７８Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｒ８６０Ｇ）、ｃ．３４９７Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉ１６６Ｔ）、ｃ．３４９６Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｉ１１６６Ｖ）、ｃ．４４２５Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｉ１４７５Ｍ）、およびｃ．４４８６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ１４９６Ｋ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ．２０１３，６（３）：２７９－２８９；Ｗｅｍｈｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５，８０：１８６－１９５；参考文献も参照のこと。変異ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＣＡＣＮＡ１Ｃ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＣＡＣＮＡ１Ｃ構築物およびｓｈＣＡＣＮＡ１Ｃ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＣＡＣＮＡ１Ｃ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＣＡＣＮＡ１Ｃ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＣＡＣＮＡ１Ｃ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＣＡＣＮＡ１Ｃに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴＳまたはチモシー症候群の症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＣＡＣＮＡ１Ｃの病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはチモシー症候群を有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神、発作、低血糖のエピソード、および／または低体温のエピソードなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＣＡＣＮＡ１Ｃ変異と関連するＬＱＴＳまたはチモシー症候群を有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、健康な個体のＩＫｓ電流密度および／または心臓ＡＰＤと類似するＩＫｓ電流密度および／または心臓ＡＰＤをもたらし得る。
別の実施形態では、ＰＫＰ２遺伝子の病原性変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＰＫＰ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＰＫＰ２遺伝子において、またはＰＫＰ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．２３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ７９Ｘ）、ｃ．３９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ１３３Ｘ）、ｃ．２３８６Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｃ７９６Ｒ）、ｃ．２０１１ｄｅｌＣ（ｐ．Ｐ６７１ｆｓＸ６８３）、ｃ．１３６８ｄｅｌＡ（ｐ．Ｎ４５６ｆｓＸ４５８）、ｃ．１４５－１４８ｄｅｌＣＡＧＡ（ｐ．Ｓ５０ｆｓＸ１１０）、ｃ．２５０９ｄｅｌＡ（ｐ．Ｖ８３７ｆｓＸ９３０）、ｃ．２４８９＋１Ｇ＞Ａ（ｐ．変異体スプライス産物）、ｃ．１１７１－２Ａ＞Ｇ（ｐ．変異体スプライス産物）、ｃ．２１４６－１Ｇ＞Ｃ（ｐ．変異体スプライス産物）、ｃ．２１９７－２２０２ｉｎｓＧｄｅｌＣＡＣＡＣＣ（ｐ．Ａ７３３ｆｓＸ７４０）、ｃ．１６１３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｗ５３８Ｘ）、ｃ．１２７１Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｆ４２４Ｓ）、ｃ．１６４２ｄｅｌＧ（ｐ．Ｖ５４８ｆｓＸ５６２）、およびｃ．４１９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｓ１４０Ｆ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｄａｌａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６，１１３：１６４１－１６４９；ｖａｎ Ｔｉｎｔｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６，１１３（１３）：１６５０－１６５８；およびＦｒｅｓｓａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐａｃｅ．２０１０，１２（６）：８６１－８６８も参照のこと。変異ＰＫＰ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＰＫＰ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＰＫＰ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＰＫＰ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＰＫＰ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＰＫＰ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＰＫＰ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＰＫＰ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＰＫＰ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＰＫＰ２構築物およびｓｈＰＫＰ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＰＫＰ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＰＫＰ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＰＫＰ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＰＫＰ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＰＫＰ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＡＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＰＫＰ２の病原性変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心筋の線維脂肪性置換、心室性不整脈、失神、持続性ＶＴもしくはＶＦ、および／または心不全などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＰＫＰ２変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶ炎症、線維症、および／または収縮機能障害の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＤＳＧ２遺伝子の病原性変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＤＳＧ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＤＳＧ２遺伝子において、またはＤＳＧ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．３７８＋１Ｇ＞Ｔ（ｐ．変異体スプライス産物）、ｃ．５６０Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｄ１８７Ｇ）、ｃ．１４６ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４９Ｈ）、ｃ．５６０ Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｄ１８７Ｇ）、ｃ．１５２０ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃ５０７Ｙ）、ｃ．１００３Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｔ３３５Ａ）、およびｃ．９６１ Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｆ３２１Ｉ）、ならびにｐ．Ｋ２９４Ｅ、ｐ．Ｄ１５４Ｅ、ｐ．Ｖ３９２Ｉ、ｐ．Ｌ７７２Ｘ、およびｐ．Ｒ７７３Ｋをもたらす変異が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｄｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２１，２２（７）：３７８６；Ｄｅｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１９，１２９：３０３－３１３；およびＸｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１０，５５（６）：５８７－５９７も参照のこと。変異ＤＳＧ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＤＳＧ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＤＳＧ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＤＳＧ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＤＳＧ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＤＳＧ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＤＳＧ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＤＳＧ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＤＳＧ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＤＳＧ２構築物およびｓｈＤＳＧ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＤＳＧ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＤＳＧ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＤＳＧ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＤＳＧ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＤＳＧ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＡＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＤＳＧ２の病原性変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心筋の線維脂肪性置換、心室性不整脈、失神、持続性ＶＴもしくはＶＦ、および／または心不全などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＤＳＧ２変異と関連するＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶ炎症、線維症、および／または収縮機能障害の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＤＥＳ遺伝子の病原性変異と関連するＡＣＭ、ＤＣＭ、ＬＶＮＣ、または骨格筋症を有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＤＥＳ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＤＥＳ遺伝子における、またはＤＥＳ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．４０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌ１３６Ｐ）、ｃ．１００９Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ａ３３７Ｐ）、ｃ．１０１３Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ３３８Ｒ）、ｃ．１１９５Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｄ３９９Ｙ）、およびｃ．１２０１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ４０１Ｋ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｄｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６，９１：２０７－２１４；Ｇｏｕｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００６，２７（９）：９０６－９１３；参考文献を参照のこと。変異ＤＥＳ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＤＥＳ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＤＥＳ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＤＥＳ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＤＥＳ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＤＥＳ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＤＥＳ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＤＥＳ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＤＥＳ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＤＥＳ構築物およびｓｈＤＥＳ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＤＥＳ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＤＥＳ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＤＥＳ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＤＥＳ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＤＥＳに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＡＣＭ、ＤＣＭ、ＬＶＮＣ、または骨格筋症の症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＤＥＳの病原性変異と関連するＡＣＭ、ＤＣＭ、ＬＶＮＣ、または骨格筋症を有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心筋の線維脂肪性置換、心室性不整脈、失神、持続性ＶＴもしくはＶＦ、呼吸困難、疲労、脚および／または足首の浮腫、胸痛、ふらつき、心臓の動悸および／または心不全などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＤＥＳ変異と関連するＡＣＭ、ＤＣＭ、ＬＶＮＣ、または骨格筋症を有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶ炎症、線維症、収縮機能障害、および／または 心内膜心筋肉柱形成、ならびにＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＫＣＮＪ２遺伝子の病原性変異と関連するＡＴＳ（ＬＱＴ７とも称される）またはＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＫＣＮＨ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＫＣＮＪ２遺伝子における、またはＫＣＮＪ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ６７Ｗ）、ｃ．２７１＿２８２ｄｅｌ１２（ｐ．Ａ９１＿Ｌ９４ｄｅｌ）、ｃ．６５３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ２１８Ｑ）、ｃ．９５３Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｎ３１８Ｓ）、ｃ．９６６Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｗ３２２Ｃ）、およびｃ．１２４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐ４１５Ｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｌｉｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１３，１０８：３５３；Ａｎｄｅｌｆｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２００２，７１（３）：６６３－６６８；およびＴｒｉｓｔａｎｉ－Ｆｉｒｏｕｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００２，１１０（３）：３８１－３８８を参照のこと。変異ＫＣＮＪ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＫＣＮＪ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＫＣＮＪ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＫＣＮＪ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＫＣＮＪ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＫＣＮＪ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＫＣＮＪ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＫＣＮＪ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＫＣＮＪ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＫＣＮＪ２構築物およびｓｈＫＣＮＪ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＫＣＮＪ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＫＣＮＪ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＫＣＮＪ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＫＣＮＪ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＫＣＮＪ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＡＴＳまたはＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＫＣＮＪ２の病原性変異と関連するＡＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、筋力低下、失神、ふらつき、眩暈、周期性四肢麻痺、および／または不整脈（例えば、ＶＴ）などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＫＣＮＪ２変異と関連するＡＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心臓のリズムの正常化および／または制御をもたらし得る。
別の実施形態では、ＣＡＳＱ２遺伝子の病原性変異と関連するＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＣＡＳＱ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＣＡＳＱ２遺伝子における、またはＣＡＳＱ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．６２ｄｅｌＡ（ｐ．Ｅ２１Ｇｆｓ＊１５）、ｃ．９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ３３＊）、ｃ．９８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ３３Ｑ）、ｃ．１１５Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｅ３９＊）、ｃ．１１５Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ３９Ｋ）、ｃ．１５８Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｃ５３Ｆ）、ｃ．１６４Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｙ５５Ｃ）、ｃ．１９９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ６７＊）、ｃ．２０４ｄｅｌＡ（ｐ．Ｋ６８Ｎｆｓ＊５）、ｃ．２１３ｄｅｌＡ（ｐ．Ｑ７１Ｈｆｓ＊２）、ｃ．２３０Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌ７７Ｐ）、ｃ．２３４＋２Ｔ＞Ｃ（ｐ．変異体スプライス部位）、ｃ．２５９Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｋ８７＊）、ｃ．３３９－３５４ｄｅｌ（ｐ．Ｓ１１３Ｒｆｓ＊６）、ｃ．５００Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｌ１６７Ｈ）、ｃ．５１８Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｓ１７３Ｉ）、ｃ．５３２＋１Ｇ＞Ａ（ｐ．変異体スプライス部位）、ｃ．５３９Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｋ１８０Ｒ）、ｃ．５４５Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｆ１８２Ｓ）、ｃ．５４６ｄｅｌＴ（ｐ．Ｆ１８２Ｌｆｓ＊２８）、ｃ．５７２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐ１９１Ｌ）、ｃ．６０３ｄｅｌＡ（ｐ．Ｖ２０３Ｌｆｓ＊７）、ｃ．６１８Ａ＞Ｃ（ｐ．Ｋ２０６Ｎ）、およびｃ．６９１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐ２３１Ｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０２０，１４２（１０）：９３２－９４７；およびＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ．２０１６，１３（８）：１６５２－１６６０も参照のこと。変異ＣＡＳＱ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＳＱ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＣＡＳＱ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＣＡＳＱ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＣＡＳＱ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＣＡＳＱ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＣＡＳＱ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＳＱ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＣＡＳＱ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＣＡＳＱ２構築物およびｓｈＣＡＳＱ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＣＡＳＱ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＣＡＳＱ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＣＡＳＱ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＣＡＳＱ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＣＡＳＱ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＣＡＳＱ２の病原性変異と関連するＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、眩暈、ふらつき、失神、および／またはＶＴなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＣＡＳＱ２変異と関連するＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心臓のリズムの正常化および／または制御をもたらし得る。
別の実施形態では、ＬＭＮＡ遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＬＭＮＡ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＬＭＮＡ遺伝子において、またはＬＭＮＡ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．４８１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ１６１Ｋ）、ｃ．１１３０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ３７７Ｈ）、ｃ．１６２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ５４１Ｃ）、ｃ．１６２１Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｒ５４１Ｇ）、ｃ．２６６Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｒ８９Ｌ）、ｃ．７３６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ２４６＊）、ｃ．１１９７＿１２４０ｄｅｌ４４（ｐ．Ｇ４００Ｒｆｓ＊１１）、ｃ．１２９２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｓ４３１＊）、１５２６＿１５２７ｉｎｓＣ（ｐ．Ｔ５１０Ｙｆｓ＊４２）、ｃ．１４４３Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｙ４８１＊）、およびｃ．７６７ Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｖ２５６Ｇ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓａｊ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．２０１３，１４：５５；Ｓｅｂｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．２００３，４０：５６０－５６７；およびＰａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２００８，１５６（１）：１６１－１６９も参照のこと。変異ＬＭＮＡ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＬＭＮＡ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＬＭＮＡ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＬＭＮＡ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＬＭＮＡ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＬＭＮＡ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＬＭＮＡ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＬＭＮＡ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＬＭＮＡ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＬＭＮＡ構築物およびｓｈＬＭＮＡ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＬＭＮＡ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＬＭＮＡ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＬＭＮＡ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＬＭＮＡ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＬＭＮＡに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＬＭＮＡの病原性変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、胸痛、不整脈、失神、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらすことができる。ある場合では、病原性ＬＭＮＡ変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶサイズの正常化および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＴＰＭ１遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＴＰＭ１遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＴＰＭ１遺伝子において、またはＴＰＭ１遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．６８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｄ２３０Ｎ）、ｃ．６８８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｄ２３０Ｎ）、ｃ．２３Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｍ８Ｒ）、ｃ．６３２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ａ２１１Ｇ）、ｃ．７２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａ２４２Ｖ）、ｃ．１６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｄ５５Ｎ）、ｃ．３３７Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｌ１１３Ｖ）、ｃ．３４１Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｅ１１４Ｇ）、ｃ．２７５Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｉ９２Ｔ）、ｃ．４２３Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｍ１４１Ｉ）、およびｃ．４１６Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｅ１３９Ｖ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．２０１４，１６：６０１－６０８；およびＭｃＮａｌｌｙ ａｎｄ Ｍｅｓｔｒｏｎｉ，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１７，１２１：７３１－７４８も参照のこと。変異ＴＰＭ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＰＭ１対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＴＰＭ１対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＴＰＭ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＴＰＭ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＴＰＭ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＴＰＭ１対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＰＭ１対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＴＰＭ１対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＴＰＭ１構築物およびｓｈＴＰＭ１構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＴＰＭ１発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＴＰＭ１発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＴＰＭ１発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＴＰＭ１遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＴＰＭ１に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＴＰＭ１の病原性変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、胸痛、不整脈、失神、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらすことができる。ある場合では、病原性ＴＰＭ１変異と関連するＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶサイズの正常化および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＰＬＮ遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＡＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＰＬＮ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＰＬＮ遺伝子における、またはＰＬＮ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．４０＿４２ｄｅｌＡＧＡ（ｐ．Ｒ１４ｄｅｌ）、ｃ．１１６Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ３９Ｘ）、およびｃ．２５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ９Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。ｔｅ Ｒｉｊｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐａｔｈｏｌ．２０１９，４０：２－６；Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１３，１１２：１１９７－１２０６；Ｆｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６，２２２３５；およびＨａｇｈｉｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３，１１１（６）：８６９－８７６も参照のこと。変異ＰＬＮ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＰＬＮ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＰＬＮ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＰＬＮ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＰＬＮ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＰＬＮ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＰＬＮ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＰＬＮ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＰＬＮ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＰＬＮ構築物およびｓｈＰＬＮ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＰＬＮ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＰＬＮ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＰＬＮ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＰＬＮ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＰＬＮに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭまたはＡＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＰＬＮの病原性変異と関連するＤＣＭまたはＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、胸痛、不整脈、失神、ふらつき、心臓の動悸、心筋の線維脂肪性置換、持続性ＶＴもしくはＶＦ、ならびに／または心不全などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＰＬＮ変異と関連するＤＣＭまたはＡＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＬＶサイズの正常化、ＬＶの強化、ＬＶ炎症の低減、線維症の低減、および／または収縮機能障害の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＬＤＬＲ遺伝子の病原性変異と関連するＦＨを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＬＤＬＲ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＬＤＬＲ遺伝子における、またはＬＤＬＲ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１８４５＋２Ｔ＞Ｃ、ｃ．１０１２Ｔ ＞Ａ（ｐ．Ｃ３３８Ｓ）、ｃ．１２９７Ｇ＞Ｃ（ｐ．Ｄ４３３Ｈ）、ｃ．１７０２Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｌ５６８Ｖ）、およびｃ．２４３１Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｋ８１１＊）、ｃ．９７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ３３Ｘ）、ｃ．３５７ｄｅｌＧ（ｐ．Ｋ１２０ｆｓ）、ｃ．４２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｃ１４３Ｙ）、ｃ．５１７Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｃ１７３Ｒ）、ｃ．１４４８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｗ４８３Ｘ）、ｃ．１７４４Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｌ５８２Ｆ）、ｃ．１７５７Ｃ＞Ａ（ｐ．Ｓ５８６Ｘ）、およびｃ．１８７９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａ６２７Ｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．２０２０，１４（３）：３４６－３５１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１８，１５（６）：４３４－４４０；Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２０１９，２８９：１０１－１０８；およびＧａｌｉｃｉａ－Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０，１０：１７２７も参照のこと。変異ＬＤＬＲ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＬＤＬＲ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＬＤＬＲ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＬＤＬＲ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＬＤＬＲ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＬＤＬＲ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＬＤＬＲ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＬＤＬＲ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＬＤＬＲ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＬＤＬＲ構築物およびｓｈＬＤＬＲ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＬＤＬＲ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＬＤＬＲ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＬＤＬＲ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＬＤＬＲ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＬＤＬＲに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＦＨの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＬＤＬＲの病原性変異と関連するＦＨを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、総およびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、狭心症、ならびに／または黄色腫などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＬＤＬＲ変異と関連するＦＨを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＦＨと関連する脳血管疾患および／または末梢血管疾患を緩和し得る。
別の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子の病原性変異と関連するＦＨを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＰＣＳＫ９遺伝子において、またはＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．３８１Ｔ＞Ａ（ｐ．Ｓ１２７Ｒ）、ｃ．６４４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ２１５Ｈ）、ｃ．６４６Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｆ２１６Ｌ）、ｃ．１１２０Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｄ３７４Ｙ）、ａｎｄ ｃ．１４８６Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ４９６Ｗ）、ならびにｐ．Ｎ１５７Ｋ、ｐ．Ｒ２１８Ｓ、ｐ．Ｒ２３７Ｗ、ｐ．Ｅ６７０Ｇ、ｐ．Ｒ２１８Ｓ、ｐ．Ｒ３５７Ｈ、ｐ．Ｒ４６９Ｗ、ｐ．Ａ４４３Ｔ、ｐ．Ｒ４９６Ｗ、ｐ．Ｎ４２５Ｓ、ｐ．Ｄ３７４Ｈ、ｐ．Ｄ１２９Ｇ、ｐ．Ａ１６８Ｅ、ｐ．Ｇ２３６Ｓ、ｐ．Ｎ３５４Ｉ、ｐ．Ａ２４５Ｔ、ｐ．Ｒ２７２Ｑ、ｐ．Ｒ２７２Ｑ、およびｐ．Ａ２４５Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｙｏｕｎｇｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，” ２０１４ Ｊａｎ ２（Ｕｐｄａｔｅｄ ２０１６ Ｄｅｃ ８），Ｉｎ：Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＧＥＮＥＲＥＶＩＥＷＳ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；およびＧｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．２０２０，１１：１０２０も参照のこと。変異ＰＣＳＫ９対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＰＣＳＫ９対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＰＣＳＫ９対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＰＣＳＫ９対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＰＣＳＫ９対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＰＣＳＫ９対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＰＣＳＫ９対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＰＣＳＫ９対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＰＣＳＫ９対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＰＣＳＫ９構築物およびｓｈＰＣＳＫ９構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＰＣＳＫ９発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＰＣＳＫ９発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＰＣＳＫ９発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＰＣＳＫ９遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＰＣＳＫ９に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＦＨの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＰＣＳＫ９の病原性変異と関連するＦＨを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、総およびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、狭心症、ならびに／または黄色腫などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＰＣＳＫ９変異と関連するＦＨを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＦＨと関連する脳血管疾患および／または末梢血管疾患を緩和し得る。
別の実施形態では、ＴＮＮＴ２遺伝子の病原性変異と関連するＨＣＭまたはＤＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＴＮＮＴ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＴＮＮＴ２遺伝子における、またはＴＮＮＴ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．４２１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１４１Ｗ）、およびｃ．８３５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ２７９Ｘ）、ならびにｐ．Ｐ８０Ｓ、ｐ．Ｄ８６Ａ、ｐ．Ｒ９２Ｌ、ｐ．Ｋ９７Ｎ、ｐ．Ｋ１２４Ｎ、ｐ．Ｒ１３０Ｃ、ｐ．Ｒ１３４Ｇ、およびｐ．Ｒ１４４Ｗが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．２０１５，４（１２）：ｅ００２４４３；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０２０，９９（３４）：ｅ２１８４３；Ｍｉｌｌａｔ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＨｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ．２００９，２：３０６－３１３も参照のこと。変異ＴＮＮＴ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＮＮＴ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＴＮＮＴ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＴＮＮＴ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＴＮＮＴ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＴＮＮＴ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＴＮＮＴ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＮＮＴ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＴＮＮＴ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＴＮＮＴ２構築物およびｓｈＴＮＮＴ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＴＮＮＴ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＴＮＮＴ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＴＮＮＴ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＴＮＮＴ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＴＮＮＴ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＨＣＭまたはＤＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＴＮＮＴ２の病原性変異と関連するＨＣＭまたはＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、不整脈、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＴＮＮＴ２変異と関連するＨＣＭまたはＤＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、エネルギー消費の低減、ＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＣＡＬＭ１遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＣＡＬＭ１遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＣＡＬＭ１遺伝子における、またはＣＡＬＭ１遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｎ５４Ｉ、ｐ．Ｆ９０Ｌ、ｐ．Ｎ９８Ｓ、ｐ．Ｅ１０５Ａ、ｐ．Ｄ１３０Ｇ、ｐ．Ｄ１３２Ｖ、ｐ．Ｅ１４１Ｇ、およびｐ．Ｆ１４２Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８，１１：３９６；および Ｂｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ．２０１６，９：１３６－１４６も参照のこと。変異ＣＡＬＭ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＬＭ１Ｃ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＣＡＬＭ１対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＣＡＬＭ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＣＡＬＭ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＣＡＬＭ１Ｃ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＣＡＬＭ１対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＬＭ１対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＣＡＬＭ１対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＣＡＬＭ１構築物およびｓｈｇｅｎｅ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＣＡＬＭ１発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＣＡＬＭ１発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＣＡＬＭ１発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＣＡＬＭ１遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＣＡＬＭ１に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴＳまたはＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＣＡＬＭ１の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神、発作、眩暈、ふらつき、および／またはＶＴなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＣＡＬＭ１変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＩＫｓ電流密度の正常化、心臓ＡＰＤの正常化、および／または心臓のリズムの制御をもたらし得る。
別の実施形態では、ＣＡＬＭ２遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＣＡＬＭ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＣＡＬＭ２遺伝子における、またはＣＡＬＭ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｄ９６Ｖ、ｐ．Ｎ９８Ｉ、ｐ．Ｎ９８Ｓ、ｐ．Ｄ１３０Ｇ、ｐ．Ｄ１３０Ｖ、ｐ．Ｅ１３２Ｅ、ｐ．Ｄ１３２Ｈ、ｐ．Ｄ１３４Ｈ、およびｐ．Ｑ１３６Ｐが挙げられるが、これらに限定されない。Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＢｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．、上記も参照のこと。変異ＣＡＬＭ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＬＭ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＣＡＬＭ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＣＡＬＭ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＣＡＬＭ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＣＡＬＭ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＣＡＬＭ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＬＭ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＣＡＬＭ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＣＡＬＭ２構築物およびｓｈｇｅｎｅ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＣＡＬＭ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＣＡＬＭ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＣＡＬＭ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＣＡＬＭ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＣＡＬＭ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴＳまたはＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＣＡＬＭ２の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神、発作、眩暈、ふらつき、および／またはＶＴなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＣＡＬＭ２変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＩＫｓ電流密度の正常化、心臓ＡＰＤの正常化、および／または心臓のリズムの制御をもたらし得る。
別の実施形態では、ＣＡＬＭ３遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＣＡＬＭ３遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＣＡＬＭ３遺伝子における、またはＣＡＬＭ３遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｄ９６Ｈ、ｐ．Ａ１０３Ｖ、ｐ．Ｄ１３０Ｇ、およびｐ．Ｆ１４２Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＢｏｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．、上記も参照のこと。変異ＣＡＬＭ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＬＭ３対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＣＡＬＭ３対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＣＡＬＭ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＣＡＬＭ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＣＡＬＭ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＣＡＬＭ３対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＬＭ３対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＣＡＬＭ３対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＣＡＬＭ３構築物およびｓｈｇｅｎｅ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＣＡＬＭ３発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＣＡＬＭ３発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＣＡＬＭ３発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＣＡＬＭ３遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＣＡＬＭ３に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴＳまたはＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＣＡＬＭ３の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神、発作、眩暈、ふらつき、および／またはＶＴなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＣＡＬＭ３変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＩＫｓ電流密度の正常化、心臓ＡＰＤの正常化、および／または心臓のリズムの制御をもたらし得る。
別の実施形態では、ＴＲＤＮ遺伝子の病原性変異と関連するＴＫＯＳを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＴＲＤＮ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＴＲＤＮ遺伝子における、またはＴＲＤＮ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．６１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ２０５Ｘ）、ｃ．２２＋２９Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｎ９ｆｓ＊５）、ｃ．４３８＿４４２ｄｅｌＴＡＡＧＡ（ｐ．Ｋ１４７ｆｓ＊０）、ｃ．５３＿５６ｄｅｌＡＣＡＧ（ｐ．Ｄ１８ｆｓ＊１３）、ｃ．４２３ｄｅｌＡ（ｐ．Ｅ１４２ｆｓ＊３３）、ｃ．５０２Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｅ１６８Ｘ）、ｃ．５０３Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｅ１６８Ｘ）、ｃ．５４５＿５４６ｉｎｓＡ（ｐ．Ｋ１８２ｆｓ＊１０）、ｃ．４２０ｄｅｌＡ（ｐ．Ｋ１４０ｆｓ＊３４）、ｃ．１７６Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｔ５９Ｒ）、ｃ．６１３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｑ２０５Ｘ）、ｃ．５３＿５６ｄｅｌＡＣＡＧ（ｐ．Ｄ１８ｆｓ＊１３）、ｃ．６１８ｄｅｌＧ（ｐ．Ａ２０８ｆｓ＊１５）、およびｃ．２３２＋２Ｔ＞Ａが挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：Ｇｅｎ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄ．１２（２）：ｅ００２４１９；およびＡｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１５，１３１（２３）：２０５１－２０６０も参照のこと。変異ＴＲＤＮ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＲＤＮ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＴＲＤＮ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＴＲＤＮ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＴＲＤＮ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＴＲＤＮ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＴＲＤＮ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＲＤＮ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＴＲＤＮ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＴＲＤＮ構築物およびｓｈＴＲＤＮ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＴＲＤＮ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＴＲＤＮ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＴＲＤＮ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＴＲＤＮ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＴＲＤＮに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＴＫＯＳの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＴＲＤＮの病原性変異と関連するＴＫＯＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、失神、骨格筋症、および／または近位筋力低下などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＴＲＤＮ変異と関連するＴＫＯＳを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、Ｔ波逆転および／またはＱＴ延長の補正をもたらし得る。
別の実施形態では、ＲＹＲ２遺伝子の病原性変異と関連するＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＲＹＲ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＲＹＲ２遺伝子における、またはＲＹＲ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１２５８Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ４２０Ｗ）、ｃ．１２５９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４２０Ｑ）、ｃ．１５１９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ５０７Ｉ）、ｃ．３４０７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａ１１３６Ｖ）、ｃ．５１７０Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｅ１７２４Ｋ）、ｃ．５６５４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ１８８５Ｅ）、ｃ．５６５６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｇ１８８６Ｓ）、ｃ．６５０４Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｈ２１６８Ｑ）、ｃ．７１５８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａ２３８７Ｔ）、ｃ．８８７４Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｑ２９５８Ｒ）、ｃ．１２５３３Ａ＞Ｇ（ｐ．Ｎ４１７８Ｓ）、ｃ．１３５２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａ４５１０Ｔ）、ｃ．１４３１１Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖ４７７１Ｉ）、ｃ．１４５４２Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｉ４８４８Ｖ）、およびｃ．１４８７６Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ４９５９Ｑ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｅｄｅｉｒｏｓ－Ｄｏｍｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００９，５４（２２）：２０６５－２０７４；およびＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４，１０１（３５）：１３０６２－１３０６７も参照のこと。変異ＲＹＲ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＲＹＲ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＲＹＲ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＲＹＲ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＲＹＲ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＲＹＲ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＲＹＲ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＲＹＲ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＲＹＲ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＲＹＲ２構築物およびｓｈＲＹＲ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＲＹＲ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＲＹＲ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＲＹＲ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＲＹＲ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＲＹＲ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＲＹＲ２の病原性変異と関連するＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、眩暈、ふらつき、失神、および／またはＶＴなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＲＹＲ２変異と関連するＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、心臓のリズムの正常化および／または制御をもたらし得る。
別の実施形態では、ＡＰＯＢ遺伝子の病原性変異と関連するＦＨを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＡＰＯＢ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＡＰＯＢ遺伝子における、またはＡＰＯＢ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１００９３Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｈ３３６５Ｄ）、ｃ．４１６３Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１３８８Ｈ）、ｃ．１０５７９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ３５２７Ｗ）、ｐ．Ｐ９９４Ｌ、およびｐ．Ｔ３８２６Ｍが挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２０１８，２７７：Ｐ４４８－４５６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２０１８，１７：２５２；およびＣｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１９，４２：３８５－３９０も参照のこと。変異ＡＰＯＢ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＡＰＯＢ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＡＰＯＢ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＡＰＯＢ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＡＰＯＢ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＡＰＯＢ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＡＰＯＢ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＡＰＯＢ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＡＰＯＢ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＡＰＯＢ構築物およびｓｈＡＰＯＢ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＡＰＯＢ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＡＰＯＢ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＡＰＯＢ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＡＰＯＢ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＡＰＯＢに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＦＨの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＡＰＯＢの病原性変異と関連するＦＨを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、総およびＬＤＬコレステロールレベルの上昇、狭心症、ならびに／または黄色腫などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＡＰＯＢ変異と関連するＦＨを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＦＨと関連する脳血管疾患および／または末梢血管疾患を緩和し得る。
別の実施形態では、ＴＮＮＩ３遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＴＮＮＩ３遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＴＮＮＩ３遺伝子における、またはＴＮＮＩ３遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｋ３６Ｑ、ｐ．Ｎ１８５Ｋ、およびｐ．９８トランケーション、ｃ．４０７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１３６Ｑ）、ｃ．４３３Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ１４５Ｗ）、ｃ．４４８Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｓ１５０Ｃ）、ｃ．５４９Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ｋ１８３Ｎ）、およびｃ．５５７Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｒ１８６Ｑ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，５９５（１４）：４６７７－４６９３；およびＭｉｌｌａｔ ｅｔ ａｌ．、上記も参照のこと。変異ＴＮＮＩ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＮＮＩ３対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＴＮＮＩ３対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＴＮＮＩ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＴＮＮＩ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＴＮＮＩ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＴＮＮＩ３対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＮＮＩ３対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＴＮＮＩ３対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＴＮＮＩ３構築物およびｓｈＴＮＮＩ３構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＴＮＮＩ３発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＴＮＮＩ３発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＴＮＮＩ３発現の少なくとも５０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＴＮＮＩ３遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＴＮＮＩ３に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭまたはＨＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＴＮＮＩ３の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、不整脈、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＴＮＮＩ３変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、エネルギー消費の低減、ＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＴＮＮＣ１遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＴＮＮＣ１遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＴＮＮＣ１遺伝子における、またはＴＮＮＣ１遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．９１Ｇ＞Ｔ（ｐ．Ａ３１Ｓ）、ｐ．Ｙ５Ｈ、ｐ．Ｍ１０３Ｉ、ｐ．Ｉ１４８Ｖ、ｐ．Ａ８Ｖ、ｐ．Ｌ２９Ｑ、ｐ．Ｃ８４Ｙ、ｐ．Ｅ１３４Ｄ、ｐ．Ｄ１４５Ｅ、およびｐ．Ｑ１２２ＡｆｓＸ３０が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐａｒｖａｔｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（３８）：３１８４５－３１８５５；およびＶｅｌｔｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，８：２２１も参照のこと。変異ＴＮＮＣ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＮＮＣ１対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＴＮＮＣ１対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＴＮＮＣ１対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＴＮＮＣ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＴＮＮＣ１対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＴＮＮＣ１対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＮＮＣ１対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＴＮＮＣ１対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＴＮＮＣ１構築物およびｓｈＴＮＮＣ１構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＴＮＮＣ１発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＴＮＮＣ１発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＴＮＮＣ１発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＴＮＮＣ１遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＴＮＮＣ１に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭまたはＨＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＴＮＮＣ１の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、不整脈、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＴＮＮＣ１変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、エネルギー消費の低減、ＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＭＹＬ２遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＭＹＬ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＭＹＬ２遺伝子における、またはＭＹＬ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｄ９４Ａ、ｐ．Ｄ１６６Ａ、ｐ．Ｐ９５Ａ、およびｐ．Ｉ１５８Ｌが挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２０１５，２８２（１２）：２３７９－２３９３；Ａｌｖａｒｅｚ－Ａｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓ．２０１４，２；およびＰｏｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９６，１３：６３－６９も参照のこと。変異ＭＹＬ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＬ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＭＹＬ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＭＹＬ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＭＹＬ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＭＹＬ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＭＹＬ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＬ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＭＹＬ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＭＹＬ２構築物およびｓｈＭＹＬ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＭＹＬ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＭＹＬ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＭＹＬ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＭＹＬ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＭＹＬ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭまたはＨＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＭＹＬ２の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、不整脈、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＭＹＬ２変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、エネルギー消費の低減、ＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＭＹＬ３遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＭＹＬ３遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＭＹＬ３遺伝子における、またはＭＹＬ３遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．１７０Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ａ５７Ｇ）、ｃ．５３０ Ａ＞Ｇ、ｃ．２１５５Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ７１９Ｗ）、ｃ．７７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａ２６Ｖ）、ｃ．２６５４Ａ＞Ｃ（ｐ．Ｎ８８５Ｔ）、およびｃ．１９８７Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｒ６６３Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｏｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６，３７：１５１１－１５２０も参照のこと。変異ＭＹＬ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＬ３対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＭＹＬ３対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＭＹＬ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＭＹＬ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＭＹＬ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＭＹＬ３対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＭＹＬ３対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＭＹＬ３対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＭＹＬ３構築物およびｓｈＭＹＬ３構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＭＹＬ３発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＭＹＬ３発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＭＹＬ３発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＭＹＬ３遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＭＹＬ３に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭまたはＨＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＭＹＬ３の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、不整脈、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＭＹＬ３変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、エネルギー消費の低減、ＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＪＰＨ２遺伝子の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＪＰＨ２遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＪＰＨ２遺伝子における、またはＪＰＨ２遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｓ１０１Ｒ、ｐ．Ｙ１４１Ｈ、ｐ．Ｓ１６５Ｆ、ｐ．Ｔ１６１Ｋ、およびｐ．Ｅ６４１Ｘが挙げられるが、これらに限定されない。Ｌａｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７，４２：１０２６－１０３５；およびＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１９， ９：９０３８も参照のこと。変異ＪＰＨ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＪＰＨ２対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＪＰＨ２対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＪＰＨ２対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＪＰＨ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＪＰＨ２対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＪＰＨ２対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＪＰＨ２対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＪＰＨ２対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＪＰＨ２構築物およびｓｈＪＰＨ２構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＪＰＨ２発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＪＰＨ２発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＪＰＨ２発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＪＰＨ２遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＪＰＨ２に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＤＣＭまたはＨＣＭの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＪＰＨ２の病原性変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、胸痛、失神、眩暈、疲労、脚および／もしくは足首の浮腫、不整脈、ふらつき、ならびに／または心臓の動悸などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＪＰＨ２変異と関連するＤＣＭまたはＨＣＭを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、エネルギー消費の低減、ＬＶサイズの正常化、および／またはＬＶの強化をもたらし得る。
別の実施形態では、ＣＡＶ３遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴＳ、ＨＣＭ、またはＬＧＭＤを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＣＡＶ３遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＣＡＶ３遺伝子における、またはＣＡＶ３遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｃ．２３３ Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔ７８Ｍ）、ｃ．２５３ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａ８５Ｔ）、ｃ．２９０ Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｆ９７Ｃ）、ｃ．４２３ Ｃ＞Ｇ（ｐ．Ｓ１４１Ｒ）、ｐ．Ｐ１０４Ｌ、およびｐ．Ｒ２７Ｑが挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ ２０２０，１１（３）：８３８－８５８；およびＶａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６，１１４：２１０４－２１１２も参照のこと。変異ＣＡＶ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＶ３対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＣＡＶ３対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＣＡＶ３対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＣＡＶ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＣＡＶ３対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＣＡＶ３対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＣＡＶ３対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＣＡＶ３対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＣＡＶ３構築物およびｓｈＣＡＶ３構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＣＡＶ３発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＣＡＶ３発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＣＡＶ３発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＣＡＶ３遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＣＡＶ３に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴＳ、ＨＣＭ、またはＬＧＭＤの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＣＡＶ３の病原性変異と関連するＬＱＴＳ、ＨＣＭ、またはＬＧＭＤを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、呼吸困難、速い心拍、不整脈、胸痛、失神、眩暈、発作、疲労、臀部および肩領域の筋力の萎縮ならびに／または低下、心筋症などの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＣＡＶ３変異と関連するＬＱＴＳ、ＨＣＭ、またはＬＧＭＤを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、収縮性の低減、弛緩の改善、および／またはエネルギー消費の低減をもたらし得る。
別の実施形態では、ＴＥＣＲＬ遺伝子の病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物は、例えば、試料中のＤＮＡがＴＥＣＲＬ遺伝子において病原性変異を含むかどうかを決定するために、哺乳動物から得た生物学的試料を分析すること（例えば、ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ配列決定方法を使用して血液試料を分析すること）によって同定することができる。ＴＥＣＲＬ遺伝子における、またはＴＥＣＲＬ遺伝子によってコードされる病原性変異には、ｐ．Ｒ１９６Ｑ、ｃ．３３１＋１Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｑ１３９Ｘ、ｐ．Ｐ２９０Ｈ、ｐ．Ｓ３０９Ｘ、およびｐ．Ｖ２９８Ａが挙げられるが、これらに限定されない。Ｄｅｖａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６，８（１２）：１３９０－１４０８；およびＭｏｓｃｕ－Ｇｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．２０２０，３１（６）：１５２７－１５３５も参照のこと。変異ＴＥＣＲＬ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＥＣＲＬ対立遺伝子を抑制し、それらを野生型ＴＥＣＲＬ対立遺伝子で置換するように設計することができる。変異ＴＥＣＲＬ対立遺伝子に標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法を使用して設計および調製することができる。例えば、ＳｕｐＲｅｐ構築物は、病原性変異を含有する疾患関連ＴＥＣＲＬ対立遺伝子の領域を標的化することによって、または病原性変異を含有しない疾患関連ＴＥＣＲＬ対立遺伝子の領域を標的化することによって、病原性変異を含有するＴＥＣＲＬ対立遺伝子を標的化するよう生成することができる。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、変異ＴＥＣＲＬ対立遺伝子を抑制し、それを野生型ＴＥＣＲＬ対立遺伝子で置換するそれらの能力について試験することができる。例えば、構築物は、野生型ＴＥＣＲＬ構築物およびｓｈＴＥＣＲＬ構築物で培養された細胞を共トランスフェクトし、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび／またはウェスタンブロッティングでＴＥＣＲＬ発現を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムにおいて試験することができる。ＴＥＣＲＬ発現をノックダウンする比較的高い能力（例えば、ｍＲＮＡ および／またはタンパク質レベルでＴＥＣＲＬ発現の少なくとも７０パーセント、少なくとも７５パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントをノックダウンする能力）を有する構築物を選択することができる。選択された構築物は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）にパッケージングされ、任意の適切な経路の投与（例えば、心筋などの組織への直接注射を介した、あるいは腹腔内投与、鼻腔内投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、脳内投与、実質内投与、あるいはナノ粒子および／または薬物錠剤、カプセル剤、もしくはピルでの経口送達を介した）を使用して、例えば、約１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１０１５ｖｇ／ｋｇ、または約１０１０ＡＡＶ粒子／ｍＬ～約１０１５ＡＡＶ粒子／ｍＬの用量で、ＴＥＣＲＬ遺伝子の病原性変異を有すると同定された哺乳動物に送達することができる。ある場合では、ＴＥＣＲＬに標的化されたＳｕｐＲｅｐ構築物は、非ウイルスベクターにおいて（例えば、プラスミドにおいて、または脂質、ポリマー、もしくはナノ球体と複合体化された核酸分子において）哺乳動物に投与することができ、組織（例えば、心筋）への直接注射によって、または腹腔内、鼻腔内、静脈内、くも膜下腔内、脳内、もしくは実質内投与によって、または経口送達によって送達することができる。投与後、哺乳動物をＬＱＴＳまたはＣＰＶＴの症状についてモニターして、障害の一つまたは複数の症状が減少されているかどうかを決定することができる。例えば、ＴＥＣＲＬの病原性変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、速い心拍、失神、発作、眩暈、ふらつき、および／またはＶＴなどの症状の低減をもたらし得る。ある場合では、病原性ＴＥＣＲＬ変異と関連するＬＱＴＳまたはＣＰＶＴを有する哺乳動物の有効なＳｕｐＲｅｐ処置は、ＩＫｓ電流密度の正常化、心臓ＡＰＤの正常化、および／または心臓のリズムの制御をもたらし得る。
本発明は、以下の実施例でさらに説明され、これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
実施例１－物質および方法
試料：ヒト試料を、ＬＱＴ１を有する患者および無関係な健康対照から得た（表２）。
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐのプラスミドおよびクローニング：ＷＴ ＫＣＮＱ１ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００２１８．２）を、ＮｈｅＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を使用してｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）にサブクローニングした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、二つのミスセンスバリアントｓ（ｐ．Ｔ６６Ｓおよびｐ．Ｙ６７Ｗ）をＥＧＦＰの発色団ドメインに導入し、それをシアン蛍光タンパク質に変換し、ｐＩＲＥＳ２－ＣＦＰ－ＫＣＮＱ１－ＷＴを生成した。部位特異的変異誘発の第２ラウンドを、ｐＩＲＥＳ２－ＣＦＰ－ＫＣＮＱ１－ＷＴを使用して完了し、ＫＣＮＱ１バリアントｐ．Ｙ１７１Ｘ、ｐ．Ｖ２５４Ｍ、およびｐ．Ｉ５６７Ｓ（それぞれ、ｃ．５１３Ｃ＞Ａ、ｃ．７６０Ｇ＞Ａ、およびｃ．１７００Ｔ＞Ｇ）を導入した。四つの予め設計したＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡｓ（ｓｈ＃１～４）を、非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）と共にｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ骨格でＯｒｉＧｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ｓｈＲＮＡ配列を表３Ａに列挙する。ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４を、最終的なＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターに選択し、本明細書全体を通してｓｈＫＣＮＱ１と称する。ＫＣＮＱ１－ＷＴ ｃＤＮＡのＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４（ｓｈＫＣＮＱ１）標的配列内の同義バリアントを含有するＤＮＡ断片：ｃ．１３７７Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３８０Ｃ＞Ａ、ｃ．１３８３Ｔ＞Ｃ、ｃ．１３８６Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３８９Ｔ＞Ｃ、ｃ．１３９２Ｔ＞Ｃ、ｃ．１３９５Ａ＞Ｃ、ｃ．１３９８Ｇ＞Ａ、ｃ．１４０１Ｇ＞Ａ、およびｃ．１４０４Ｃ＞Ｔ（それぞれ、ＫＣＮＱ１：ｐ．Ｄ４５９Ｄ、ｐ．Ｇ４６０Ｇ、ｐ．Ｙ４６１Ｙ、ｐ．Ｄ４６２Ｄ、ｐ．Ｓ４６３Ｓ、ｐ．Ｓ４６４Ｓ、ｐ．Ｖ４６５Ｖ、ｐ．Ｒ４６６Ｒ、ｐ．Ｋ４６７Ｋ、およびｐ．Ｓ４６８Ｓ）を合成し、ＢｇＩＩＩおよびＰｖｕＩ 制限酵素部位を使用してｐＩＲＥＳ２－ＣＦＰ－ＫＣＮＱ１－ＷＴにクローニングして、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（ｐＩＲＥＳ２－ＣＦＰ－ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を生成した。次に、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭおよびＣＦＰレポーターを、５’ＭｌｕＩおよび３’ＢｓｒＧＩ＋リバースＢｓａＩ制限酵素部位を使用して、ｓｈＫＣＮＱ１を含有するｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ骨格にサブクローニングし、プロセスにおいて元のＧＦＰを切除して、最終的なＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ（ｐＣＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＫＣＮＱ１－ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ）を作成した。ＰＣＲクローニングに使用したプライマーは：５’－ＧＧＣＡＣＧＣＧＴＴＴＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣ－３’（フォワードプライマー；配列番号１）および５’－ＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’（リバースプライマー；配列番号２）であった。
ｉＰＳＣ生成のためのＬＱＴ１および無関係の対照患者選択：患者を、遺伝子心臓専門医およびＬＱＴＳ専門家が評価した。皮膚線維芽細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、それぞれ、４ｍｍの皮膚パンチ生検または血液試料により採取した。２３６人のＬＱＴ１を有する患者を含む、様々な遺伝性心チャネル病と診断された約１２００人の患者およびその罹患している、または罹患していない家族から試料を得た。様々なバリアント型（一人のナンセンス、二人のミスセンス、一人の同義スプライス）および表現型に及ぶ、四人のＬＱＴ１患者を選択した。これら四人の患者には、生涯にわたり無症状の患者および強いＬＱＴ１表現型を有する三人の患者が含まれ、これを、５００ｍｓ超のＱＴｃを有する少なくとも一つのＥＣＧを少なくとも一つ有することと、ＬＱＴＳ関連の症状の陽性歴（失神、発作、溺水、突然の心停止）、およびＬＱＴＳ関連の症状の陽性の家族歴と定義した。新規バリアントを宿主とする患者の健康で罹患していないと考えられる父親を、無関係な対照として選択した。
ｉＰＳＣへの線維芽細胞／ＰＢＭＣの再プログラミングおよび品質管理：線維芽細胞またはＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０再プログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）または山中ファクター：ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆ、およびｐＣＸＷＢ－ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）を含有する四つのエピソームＤＮＡプラスミドを用いたエレクトロポレーションを使用して、センダイウイルス遺伝子導入により再プログラムした。誘導後２１日以内に少なくとも二つのコロニーをピックアップし、クローン性に拡大させた。すべてのｉＰＳＣを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州）６ｃｍの培養皿に、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したｍＴｅＳＲ（登録商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標）、カナダ、バンクーバー）中、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養した。８５％コンフルエンスで、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用してｉＰＳＣを継代した。次いで、各クローンを核型決定した。
ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ（およびそれに続く同質遺伝子対照）を有する患者を除いて、すべての系統は正常な核型を有し、これは、１３番染色体と２２番染色体の間の再プログラミング誘導性バランス転座を有していた。心活動電位に重要なイオンチャネルをコードする遺伝子は、１３番染色体または２２番染色体には位置せず、ゆえに、これらの細胞を、依然として研究に含めた。ＫＣＮＱ１バリアント確認を、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ－アンプリコンのサンガー配列決定によって行った。すべてのｉＰＳＣクローンにおける多能性マーカーの発現を、１：２５０希釈で、Ｏｃｔ４（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ５－２７４３８）、Ｎａｎｏｇ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ１－０９７）、Ｔｒａ－１－６０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ｓｃ－２１７０５）、およびＳＳＥＡ－４（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ１－０２１）に対する一次抗体を使用した共焦点免疫蛍光顕微鏡によって確認した。二次抗体は、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ－１１００１）およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ－１１０３７）であった。ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いた対比染色を、５ｍｇ／ｍＬストックから１：２０００希釈で使用した。画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で取得した。
ｉＰＳＣ－ＣＭ培養、分化、および解離：ｉＰＳＣが８５％コンフルエントであったとき、別に記載した通り、心筋細胞（ＣＭ）への分化を誘発した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ２００９、上記；およびＳｃｈｗａｒｔｚ ２０１３、上記）。培地をＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）＋５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＢ２７－マイナスインスリン（ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸））に変えることによって、分化を開始させた（０日目）。２日目に、培地を、５μＭ ＩＷＰ－２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに変えた。４日目に、培地を、維持培地ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに戻した。自発的な鼓動は、典型的には、６～７日目に始まり、１０～１２日目までに残りの細胞に拡大した。ｉＰＳＣ－ＣＭを少なくとも３０日目まで成熟させ、週に二回培地を変えた。３０日後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋解離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用して、ｉＰＳＣ－ＣＭを酵素的に解離した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない）で洗浄し、３７℃で１０分間解離培地中に置き、次いでＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋サポート培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を添加することによって不活化した。細胞を粉砕し、１５ｍＬの円錐管に移し、３００ｒｃｆで３分間遠心分離することによってペレット化した。上清を吸引し、細胞を心筋サポート培地中に懸濁してから、適切なＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート培養ウェアに移した。２４時間後、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに戻した。解離により、播種前後の細胞密度に応じて、単一細胞と小～中規模サイズのｉＰＳＣ－ＣＭクラスターの混合物を得た。自発的な鼓動は、解離の２４時間後に概して回復し、３～７日目に強力な電気カップリングおよびシンシチア形成を伴った。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ 補正した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ：ｉＰＳＣ細胞株のゲノム編集を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（カリフォルニア州、ミルピタス）を介して委託した。ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ（ｃ．７６０Ｇ＞Ａ）およびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ（ｃ．１０３２Ｇ＞Ａ）を保有する二人の患者特異的ＬＱＴ１細胞株について、同質遺伝子「バリアント補正」対照ｉＰＳＣ細胞株を作成した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔｅｍ ＣｅｌｌによるｇＲＮＡ設計ツールを使用して設計した。標的部位への近接性およびオフターゲットプロファイルに基づいて、二つのｇＲＮＡを、次世代シーケンシングによるｇＲＮＡ活性の評価のため選択した。これらの結果に基づいて、ｇＲＮＡｓ ５’－ＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡ－３’（ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ；配列番号：３）および５’－ＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＣＣＣＧＴ－３’（ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ；配列番号４）を選択した。相同性指向性修復中のｇＲＮＡ切断部位における修復鋳型として使用すべき一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドドナー（ｓｓＯＤＮ）を設計した。同質遺伝子対照ｓｓＯＤＮは、５’－ＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＡＣＡＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣ ＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＧｇｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｇｇｇｔｔａｇｇｇｇｔｇｃｇｇｇｇｃｃｃａｇ－３’（ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ；配列番号５）および５’－ｇｔｇｃａｇｃｃａ ｃｃｃｃａｇｇａｃｃｃｃａｇｃｔｇｔｃｃａａｇｇａｇｃｃａｇｇｇａａａａｃｇｃａｃａｃａｃｇｇｇｇｃａｃｃｔａｃＣＧＣＴＧＧＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＡＴ－３’（ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ；配列番号６）であり、大文字＝エクソン、小文字＝イントロン、下線＝編集成功後の再切断を防ぐための同義バリアント、および下線＋太字＋イタリック＝標的バリアントを置換するためのＷＴヌクレオチドであった。
ｇＲＮＡを発現ベクターｐＢＴ－Ｕ６－Ｃａｓ９－２Ａ－ＧＦＰにクローニングし、得られたプラスミドをｓｓＯＤＮと共にｉＰＳＣにトランスフェクトした。親ｉＰＳＣ（５×１０５）を六ウェルプレート上に播種し、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ社）において１１００Ｖ、３０ｍｓ、１Ｐを使用してエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。ｉＰＳＣ集団を、クローニングおよび遺伝子型解析のための限界希釈に供した。ゲノムＤＮＡを各ｉＰＳＣクローンから抽出し、それぞれ、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌバリアントの不在についてサンガー配列決定により分析した。
ＴＳＡ２０１細胞培養およびトランスフェクション：ＴＳＡ２０１細胞（継代２０以下）を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持した。パッチクランプについては、細胞をＴ２５フラスコに分けた。２４時間後、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）において、ｐＩＲＥＳ２－ＣＦＰ－ＫＣＮＱ１－ＷＴ、－ｓｈＩＭＭ、－Ｙ１７１Ｘ、－Ｖ２５４Ｍ、または－Ｉ５６７Ｓ １μｇおよびｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲＥＤ２－ＫＣＮＥ１－ＷＴ １μｇで共トランスフェクトするためのＬＩＰＯＦＥＣＴアミン２０００（登録商標）５μＬを使用して、Ｋｖ７．１チャネル（ＫＣＮＱ１ α－サブユニット＋ＫＣＮＥ１ β－サブユニット）の異種性発現を達成した。４～６時間後、パッチクランプ電気生理学実験の前の４８時間の間、培地をイジ培地で置き換えた。対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、および輸送免疫蛍光顕微鏡のため、５×１０５細胞（または図９の活性化動態時間経過については、１．５×１０６細胞）を、６ウェルプレートのウェル毎に播種した。２４時間後、各図に示した通り、１００ｆｍｏｌ（０．３～０．７μｇ）等モル量（またはそうでなければ示した）の各プラスミドｐＩＲＥＳ２－ＣＦＰ－ＫＣＮＱ１－ＷＴもしくは－バリアント、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＫＣＮＱ１（＃１～＃４）もしくは－ｓｈＣＴ、ｐＣＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ、またはｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲＥＤ２－ＫＣＮＥ１－ＷＴを含むＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０μＬを使用して、細胞を維持培地中で共トランスフェクトした。エンドポイントアッセイを、適切な方法の段落に記載した通り行った。
細胞膜輸送免疫蛍光顕微鏡法：ＴＳＡ２０１細胞を、上記のＫＣＮＱ１－ＷＴ、－ｓｈＩＭＭ、または－バリアントおよびＫＣＮＥ１－ＷＴで共トランスフェクトした。２４時間後、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して細胞を解離させ、８チャンバー培養スライド（ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標）、Ｐｅｐｐｅｒｅｌｌ社、マサチューセッツ州）に播種した。さらに２４時間後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０／５％ヤギ血清で１時間ブロッキングし、１：１００希釈で、ＫＣＮＱ１に対する一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－３６５１８６）を使用して４℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ－０．２％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０でそれぞれ１５分間、３回洗浄し、１：２５０の希釈で二次ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１時間インキュベートし、その後、それぞれ３回、１５分間、再び洗浄した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）対比染色物を、前と同じ１：２０００濃度で第一の洗浄中に添加した。ＶＥＣＴＡＣＨＩＥＬＤ（登録商標）マウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社、カリフォルニア州バーリンガム）をＰＢＳ中で１：１０に希釈し、マウンティング溶液として使用し、画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で取得した。本出願の図面に示した結果は、三つの独立した実験（一実施当たりの処置群当たり一つの生物学的複製を用いて別の週に、開始から終了まで行った各実験の三回の同一繰り返しとして定義した）の代表的なものである。
ウェスタンブロッティング：ＴＳＡ２０１細胞を、上記の通り、ＫＣＮＱ１－ＷＴ、－ｓｈＩＭＭ、または－バリアント、およびｓｈＫＣＮＱ１（＃１～４）、－ｓｈＣＴ、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐと共トランスフェクトした。４８時間後、細胞をタンパク質分解酵素およびホスファターゼ阻害剤を含む１×ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、氷上で１０分間冷却した。溶解物を５０％振幅で１０秒間超音波処理し、細胞片を、４℃、２１，０００ｒｃｆで１５分間ペレット化した。上清を回収し、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ社）によりタンパク質濃度を定量し、その後、ローディング緩衝液（１：２０のβ－メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液）と１：１で混合した。重要なことに、ＫＣＮＱ１タンパク質の不可逆的ＳＤＳ抵抗性の高分子量凝集体を生じたため、溶解物は、９５℃で変性していなかった（Ｓａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１６（Ｐｔ ３）：８２５－８３１（１９９６）；およびＬｉｔｔｌｅ，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，” Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ９：Ｕｎｉｔ ９．８（２００１））。タンパク質（１０μｇ／レーン）を４～１５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社、カリフォルニア州）上で泳動し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用してＰＶＤＦ膜に移した。膜を、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０／３％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で１時間ブロッキングし、ブロッキング溶液中の１：１０００希釈で、ＫＣＮＱ１に対する一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－３６５１８６）およびハウスキーピング対照としてのＣｏｆｉｌｉｎに対する一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－３７６４７６）と共に４℃で一晩インキュベートした。膜を、ＴＢＳ－０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０でそれぞれ１５分間、３回洗浄し、その後、ブロッキング溶液中１：５０００希釈で二次抗体ＨＲＰ抱合ヤギ抗マウス（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓｎｅ、ＭＮ；ＨＡＦ００７）を加えた。膜を、ＴＢＳでそれぞれ１５分間、３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ社）中で３分間インキュベートし、オートラジオグラフィーフィルムを使用して曝露した。ピクセル密度を、自由に利用可能なＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量した。本明細書に示す全てのウェスタンブロットは、三回の独立した実験の代表的な画像である。
対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲ：別に記載する対立遺伝子特異的遺伝子型同定方法（表４）を適合させることによって、（１）総ＫＣＮＱ１、（２）内在性ＫＣＮＱ１（ＫＣＮＱ１－ＷＴおよび－バリアントを含むが、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭは除外される）、ならびに（３）ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを特異的に増幅するためのｑＲＴ－ＰＣＲのため、対立遺伝子特異的プライマーを開発した（Ｒｏｈａｔｇｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；およびＰｒｉｏｒｉ ｅｔ ａｌ．、上記）。総ＫＣＮＱ１については、プライマーをＩＤＴから購入した（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ；ＰＲＩＭＥＴＩＭＥ（商標）ｑＰＣＲプライマーアッセイ、Ｈｓ．ＰＴ．５８．４１０４２３０４）。ｓｈＫＣＮＱ１標的部位にわたる二つのフォワードプライマーをデザインすることによって、対立遺伝子特異的プライマーを生成し、一方が、内在性ＫＣＮＱ１（ＫＣＮＱ１－ＷＴおよび－バリアントに特異的な対立遺伝子）に相補的であり、他方が、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭに特異的な対立遺伝子）に相補的であった。共通のリバースプライマーを、両方の対立遺伝子特異的フォワードプライマーとともに使用した。ハウスキーピング対照として、ＧＡＰＤＨプライマーをＩＤＴ（ＰＲＩＭＥＴＩＭＥ（商標）ｑＰＣＲプライマーアッセイ、Ｈｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８３６）から購入した。標準曲線を使用して、ＰＣＲ増幅バイアスを補正した。ＴＳＡ２０１細胞を、上記の通り、ＫＣＮＱ１－ＷＴ、－ｓｈＩＭＭ、または－バリアント、およびｓｈＫＣＮＱ１（＃１～４）、－ｓｈＣＴ、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐと共トランスフェクトした。４８時間後（または図９の活性化動態時間経過の指定時間で）、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して採取し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して定量した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ社）中のＲＮＡ５００ｎｇを添加することによって、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成した。各試料について、記載した通り、四組のプライマーと共にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、四回のｑＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。まずＫＣＮＱ１をＧＡＰＤＨに正規化し、次に相対的な倍加変化をＫＣＮＱ１－ＷＴおよびｓｈＣＴ処理群と比較することによって、ΔΔＣＴ法を使用してデータを分析した。すべてのｑＲＴ－ＰＣＲ実験（図８の用量応答曲線および図９の時間経過を除く）は、三回の独立した実験の結果である。
ＩＫｓ全細胞パッチクランプ電気生理学：標準的な全細胞パッチクランプ法を使用して、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａシステム、およびｐＣＬＡＭＰバージョン１０．７ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州サンニーベール）を使用して、室温で（２２～２４℃）ＫＣＮＱ１－ＷＴ、－ｓｈＩＭＭ、および－バリアントが生成した遅い遅延整流電流であるＩＫｓを測定した。細胞外（浴）溶液は、以下（ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有した：１５０ ＮａＣｌ、５．４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１．０ＭｇＣｌ２、１Ｎａ－ピルビン酸、および１５ＨＥＰＥＳ。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて７．４に調整した。細胞内（ピペット）溶液は、以下（ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有した：２０ＫＣｌ、１２５Ｋ－アスパラギン酸、１ＭｇＣｌ２、１０ＥＧＴＡ、５Ｍｇ－ＡＴＰ、５ＨＥＰＥＳ、２Ｎａ ２－ホスホクレアチン、および２Ｎａ２－ＧＴＰ。ｐＨを、ＫＯＨを用いて７．２に調整した（Ａｌ－Ｋｈａｔｉｂ ｅｔ ａｌ．、上記）。微小電極を、Ｐ－９７プーラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カリフォルニア州ノバト）で引っ張り、先端熱加工して終抵抗２～３ＭΩを得た。直列抵抗を８０～８５％補正した。電流を１ｋＨｚでフィルタリングし、８ポールのベッセルフィルターを用いて５ｋＨｚでデジタル化した。図１０Ａ～１０Ｃの説明に記載した電圧－クランププロトコールを使用して、活性化の電圧依存性を決定した。データを、Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）およびＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ；ワシントン州、レドモンド）を使用して分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ；カリフォルニア州、サンディエゴ）に適合させた。
レンチウイルスの生成およびｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入：ｉＰＳＣ－ＣＭ（または治療対照としてのｓｈＣＴ）へのＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの適用については、レンチウイルスを使用した。ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチベクターパッケージングキット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カリフォルニア州パロアルト）を使用して、ｐＣＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ（ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ）およびｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＣＴ（ｓｈＣＴ）から、レンチウイルス粒子を生成した。ウイルス粒子の総数を決定するためのｑＲＴ－ＰＣＲ（約１×１０１１ウイルスゲノム／ｍＬ）を含む二つの方法によって、および機能的な感染性粒子の数（約５×１０８感染性単位／ｍＬ）を定義するために連続希釈でＴＳＡ２０１細胞を形質導入することによって、レンチウイルス力価を定量化した。レンチウイルスを、２０～２５感染単位／細胞（４，０００～５，０００ウイルスゲノム／細胞）の多重性感染（ＭＯＩ）でｉＰＳＣ－ＣＭに適用した。上記の通り、分化導入の少なくとも３０日後に達した後、健康な無関係の対照、四人のＬＱＴ１を有する患者、または二人の同質遺伝子対照に由来するｉＰＳＣ－ＣＭを解離させ、ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）（ＭａｔＴｅｋ；Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）用のガラス底インセット付きＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート３５ｍｍディッシュまたは免疫蛍光（ＣＥＬＬＴＲＥＡＴ（登録商標））用の８－チャンバー培養スライドに播種した。２４～４８時間の回復後、ｉＰＳＣ－ＣＭを無処理のままにするか、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐもしくはｓｈＣＴ処置対照を含有するレンチウイルス粒子を用いてＭＯＩ２０～２５で形質導入した。形質導入効率を高めるために、ポリブレン感染試薬（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を形質導入中に終濃度８μｇ／ｍＬまで添加し、ｉＰＳＣ－ＣＭを、３５ｍｍディッシュ中、室温で１．５時間、２５０ｒｃｆで遠心分離した。形質導入の２４時間後、培地を新鮮な維持培地であるＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに交換した。
ｉＰＳＣ－ＣＭにおける免疫蛍光：免疫蛍光を、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴのいずれかを含有するレンチウイルス粒子を用いたｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入の７日後に行った。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／５％のロバ血清で１時間ブロッキングし、ブロッキング溶液中それぞれ１：１００希釈で、ｃＴｎＴ（ａｂｃａｍ、英国、ケンブリッジ、ａｂ４５９３２）、ｓｈＣＴ（ＯｒｉＧｅｎｅ、ＴＡ１５００４１）を用いた処置についてｔｕｒｂｏＧＦＰまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いた処置についてｅＣＦＰ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＭＢＳ９４０１６０９）、およびＫＣＮＱ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１０６４６）に対する一次抗体を使用して、４℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ－０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でそれぞれ１５分間、３回洗浄し、ブロッキング溶液中それぞれ１：２５０希釈で二次ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ＰＬＵＳ（登録商標）４８８ロバ抗ヤギ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ３２８１４）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ＰＬＵＳ（登録商標）５９４ロバ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ３２７４４）、およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ＰＬＵＳ（登録商標）６４７ロバ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ、Ａ３２７９５）において１時間インキュベーとし、その後、それぞれ１５分間、３回再度洗浄した。ＤＡＰＩ対比染色物を、前と同じ１：２０００濃度で第一の洗浄中に添加した。ＶＥＣＴＡＣＨＩＥＬＤ（登録商標）マウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社）をＰＢＳ中で１：１０に希釈し、マウンティング溶液として使用し、画像間で同一の設定を使用して、画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で取得した。
ｉＰＳＣ－ＣＭにおける電圧色素光学活動電位：ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴのいずれかを含有するレンチウイルス粒子を用いたｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入の３～７日後に、電圧色素実験を行った。無関連の対照細胞および同質遺伝子対照を、レンチウイルスで形質導入しなかったが、むしろ無処理のままで、「健康な」ＡＰＤを表す理想的な正常ベースラインをもたらした。撮像の日、ｉＰＳＣ－ＣＭを、予め加温した（３７℃）ＨＥＰＥＳ緩衝タイロード液（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ；Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ、ＭＡ）で洗浄した。ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）膜電位キット（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して、ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）色素０．１２５μＬおよびＰｏｗｅｒＬｏａｄ１．２５μＬを、各３５ｍｍのガラス底ディッシュに対してタイロード液０．５ｍＬに加え、３７℃で２０分間インキュベートした。過剰な色素を、予め加温したタイロード液を用いた三回の洗浄で除去し、最後のタイロード液２ｍＬを、撮像のためｉＰＳＣ－ＣＭに加えた。撮像中、ディッシュを、５％ＣＯ２を伴う、加温した３７℃の段階的上部チャンバー（Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；ソウル、韓国）内で維持した。４０×水対物レンズ倍率下でニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ；東京、日本）を使用して、光学活動電位を、５％電力のＬＥＤ照明を用いて、５０フレーム／秒（ｆｐｓ、露光時間２０ｍｓ）の速度で、２０秒の高速タイムラプスビデオに記録した。ＡＰＤに対するビート速度依存性作用を除去するためのＭｙｏＰａｃｅｒフィールド刺激装置（Ｉｏｎ Ｏｐｔｉｘ；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）を使用して、１Ｈｚ（パルス持続時間９ｍｓ、２５Ｖ）で、ｉＰＳＣ－ＣＭをペース調整した。ビデオは、ｉＰＳＣ－ＣＭ（クラスタおよび単層）の電気結合した同期領域（クラスタおよび単層）に焦点を当て、これは、これらの領域の細胞が、最も最適なペース刺激に従い、蛍光強度の大きな変化（しばしば約８～１２％）によって表す最大のシグナル対ノイズを生じるためである。分析のために、細胞の点滅領域上に対象の長方形領域を描き、ＮＩＳ－エレメントソフトウェア（ニコン）を使用して、対象の各領域内の経時的な蛍光強度を定量化し、これにより、光学活動電位トレースを得た。カスタム社内Ｅｘｃｅｌベースのプログラムを使用して、トレースを、光退色について補正し、振幅を、ベースライン最小蛍光量で割った蛍光の変化として正規化した（ΔＦ／Ｆｍｉｎ）。半自動方式で、ＡＰＤ９０、ＡＰＤ５０、振幅、立ち上がり時間、上昇速度などを含む共通活動電位パラメータを、個々の光学動作電位それぞれについて検出し、２０秒間のトレース内の全拍動にわたり平均した。２０秒間のトレース内のすべての拍動の平均は、単一のデータ点を表す。代表的なトレースについては、最大振幅を１．０にさらに正規化して、ＡＰＤ差の正確な可視化を可能にした。
３Ｄ ｉＰＳＣ－ＣＭオルガノイド培養、免疫蛍光、および光学的作用電位：３Ｄ－オルガノイドを、他で記載（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９０：２２３－２３０（２００２））されたプロトコールに基づき生成した。簡潔に述べると、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘを有する患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭの自発的に拍動している合胞体単層を、上記の通り、解離した。ペレット化したｉＰＳＣ－ＣＭを、１５μＬ当たりｉＰＳＣ－ＣＭ１００万個で、２０％ウシ胎児血清との８０％氷冷未希釈ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の混合物中に再懸濁した。アリコート１５μＬ（それぞれｉＰＳＣ－ＣＭ１００万個を含有する）を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でオルガノイド包埋シート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））に３０分間移動させて、球状形状で固化させた。次いで、オルガノイドを、ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓ中の２４ウェルプレートの個々のウェルに移した。オルガノイドを、レンチウイルスｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで形質導入する前に、少なくとも７日間成熟させた。形質導入の七日後、オルガノイドを、免疫蛍光のために固定するか、またはＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素を使用して電気生理学についてライブイメージングした。免疫蛍光については、オルガノイドをＰＢＳで洗浄し、氷上で４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳで三回洗浄した。オルガノイドを、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｐｌｕｓ（商標）最適切断温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）化合物（Ｔｈｅｒｍｏ）中に懸濁し、使い捨て基材型（Ｔｈｅｒｍｏ）に移し、ドライアイス上で速やかに凍結した。凍結オルガノイドを凍結切片にし、撮像用にスライド上に取り付けた。それぞれ１：１００希釈での、ブロッキング溶液としてＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／５％ヤギ血清、ｃＴｎＴに対する一次抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ４５９３２）およびｓｈＣＴ（ＯｒｉＧｅｎｅ、ＴＡ１５００４１）を用いた処置についてのｔｕｒｂｏＧＦＰまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、ＭＢＳ９４０１６０９）を用いた処置についてのｅＣＦＰを使用して、上記の通り、免疫蛍光を行った。二次抗体は、それぞれ１：２５０希釈のＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ＰＬＵＳ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ３２７２３）およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ＰＬＵＳ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ３２７４０）であった。ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）については、合胞体単層の代わりに、全オルガノイドを使用して、上記の通り、実験を行った。
統計解析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を、すべての統計解析に使用し、図のすべてのデータを適合させた。実用的である限り、個々のデータ点を平均値と共に示す。エラーバーは、図の凡例に別段の記載がない限り、標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。具体的な統計方法を、各図の凡例に示す。簡潔に述べると、必要に応じて三つ以上の群間の比較のため、複数回比較のための、事後テューキーまたはダネット検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡを行った。非両側性スチューデントｔ検定を行い、示した場合の二群間の統計的有意性を決定した。ｐ＜０．０５を、有意であるとみなした。
実施例２－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法構築物の生成
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを作製するために、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉレンチウイルス骨格中の四つの候補ＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ＃１～４）を、非標的化組み換え対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣＴ、表３Ａ）と共に、ＯｒｉＧｅｎｅから購入した。各ＫＣＮＱ１ ｓｈＲＮＡのＫＤ効率を、ＴＳＡ２０１細胞をＫＣＮＱ１－ＷＴおよびｓｈ＃１～４と共トランスフェクトすることによって決定した。ＫＣＮＱ１の発現を、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ、図５Ａ）によって測定し、ウェスタンブロット（図５Ａおよび５Ｂ）によって確認した。試験した四つのｓｈＲＮＡのうち、ｓｈ＃１、ｓｈ＃２、およびｓｈ＃４はすべて、三つのｓｈＲＮＡ間で統計上の有意な差のない、ＫＣＮＱ１の有意なＫＤ（ｍＲＮＡ：６９～７８％ＫＤ、タンパク質：５０～７７％ＫＤ）をもたらした。これらのｓｈＲＮＡのいずれも、理論上、最終的なＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターの一部として使用する可能性がある。未加工の平均ＫＤによって、三つの可能性のある候補から最終的なｓｈＲＮＡを選択するために、ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４は、ｍＲＮＡ（７８％、ｐ＝０．００４）レベルとタンパク質（７７％、ｐ＜０．００４）レベルの両方においてＫＣＮＱ１の最も強力なＫＤをもたらした。さらに、選択時に、ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４標的配列（ヌクレオチドｃ．１３７６－１４０４、エクソン１０～１１境界）を、ゲノム凝集データベース（ｇｎｏｍＡＤ）およびＣｌｉｎＶａｒを使用して評価し、一般的な遺伝子多型とＫＤ効率と干渉し得る公知の病原性ＬＱＴ１原因変異の両方を欠いていることが分かった。したがって、ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４を、最終のＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐに選択肢、本明細書において「ｓｈＫＣＮＱ１」と称する。
続いて、四つのさらなるカスタムメイドｓｈＲＮＡを試験した（ｓｈ＃５～ｓｈ＃８；表３Ｂの配列）。ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＱ１－ＷＴおよびｓｈ＃５～ｓｈ＃８または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＫＣＮＱ１発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ｓｈ＃５は、未加工の値による最も強いノックダウン（９５％）を有した（図５Ｃ）。
ＫＣＮＱ１ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭと呼ぶ、ＫＣＮＱ１の置換ｓｈＲＮＡ免疫バージョンを生成するために、十個の同義バリアントを、ヌクレオチドｃ．１３７６～１４０４であるｓｈＫＣＮＱ１の標的部位内の各コドンのゆらぎ塩基でＷＴ ＫＣＮＱ１ ｃＤＮＡに導入した（図６Ａ）。次いで、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを、ＣＭＶプロモーターの下流で、ｓｈＫＣＮＱ１含有ベクターであるｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉにクローニングした。このステップでは、オリジナルのＧＦＰレポーター（ｓｈＣＴのレポーターを保持していた）は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）をＣＦＰで置き換えた。このインビトロ試験で使用した最終的なＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターを、図６Ｂに説明する。
実施例３－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、ＫＣＮＱ１－ＷＴを抑制し、ＫＣＮＱ１－ＷＴを置換する
ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭが、実際に、ｓｈＫＣＮＱ１によるＫＤに対して免疫性であることを確認するために、ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＱ１－ＷＴまたはＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭおよびｓｈＫＣＮＱ１で共トランスフェクトした。ＫＣＮＱ１－ＷＴ対ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの発現を、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して定量した。各試料を、（１）総ＫＣＮＱ１、（２）ＷＴまたはバリアント含有対立遺伝子を含むが、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを除外する、内在性ＫＣＮＱ１、（３）ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ、および（４）ハウスキーピング対照としてのＧＡＰＤＨを定量するための、対立遺伝子特異的プライマーの固有のセット（表４）を使用して、四回の別個の反応で行った。市販のプライマーを使用して、総ＫＣＮＱ１を増幅した。内在性ＫＣＮＱ１またはＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの排他的増幅のため、二つのフォワードプライマーを、一方が、ＷＴ配列に対して相補的であり、他方が、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを生成するように操作した固有の修飾配列に対して相補的である、ｓｈＫＣＮＱ１標的部位内で設計した。共通のリバースプライマーを両方の反応に使用し、標準曲線を使用して、ＰＣＲ増幅バイアスを補正した。
ｓｈＣＴと比較して、ｓｈＫＣＮＱ１は、ＫＣＮＱ１－ＷＴの有意（８７％）な抑制を引き起こしたが（ｐ＜０．０００１）、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを抑制することができなかった（ｐ＝０．９９７、図７Ａ）。特に、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭと比較してＫＣＮＱ１－ＷＴの発現に差異はなく（ｐ＞０．９９９９）、これは、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭにおける同義バリアントの導入が、ヒトコドンの使用における偏りの結果として、その発現性を妨害しなかったことを示している。次に、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐをＫＣＮＱ１－ＷＴと共トランスフェクトし、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの２５５％置換でＫＣＮＱ１－ＷＴを５２％抑制した（ｐ＜０．０００１、図７Ａ）。二重構成要素ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐベクターは、ｓｈＫＣＮＱ１単独と比較して強力な抑制性は低かったが、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ単独よりもより強力なＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ発現を示した。この理由は不明であるが、様々な量のＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐをトランスフェクトし、用量依存性抑制および置換を引き起こすことを示し、これは、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ発現を必要に応じて調整できることを示唆している（図８）。ｑＲＴ－ＰＣＲによって得た結果を、ｓｈＫＣＮＱ１が、ＫＤ ＫＣＮＱ１－ＷＴ（ｐ＝０．０３７）を有意に達成できたが、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭを達成できなかったことそ示す（ｐ＝０．６１、図７Ａおよび７Ｂ）、ウェスタンブロッティングによって確認した。遺伝子療法を始めるための安全性指標として、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＷＴ－ＫＣＮＱ１およびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭ、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐと共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞の三日間にわたるＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの活性化動態を測定した。ｓｈＣＴを用いた処置と比較して、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭで置換したＫＣＮＱ１－ＷＴの低減を引き起こしたが、総ＫＣＮＱ１は、三日間の発症中のいかなる時点でも変化せず、過剰発現または過小発現を回避した（図９）。
実施例４－ＫＣＮＱ１における原因バリアントであるＬＱＴ１を有する患者の選択
本試験のため、固有のバリアントであるＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ、ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓ、およびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌを有する四人のＬＱＴ１を有する患者を選択した。四つのＫＣＮＱ１バリアントすべてを、現在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓガイドライン（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．，１７：４０５－４２４（２０１５））によって病原性（ＬＱＴ１原因）と分類した。したがって、この遺伝子療法パイロット研究には、軽度の表現型を有する患者におけるハプロ不全を生じるナンセンスの未成熟切断バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ）、ならびに５００ ｍｓを超えるＱＴｃの記録、ＬＱＴＳ関連症状（失神、発作、溺水、突然の心停止）の陽性歴、ならびにＬＱＴＳ関連症状の陽性家族歴を含む強いＬＱＴ１表現型を有する三人の患者における、二つのドミナントネガティブミスセンスバリアント（ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ およびＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓ）およびエクソン７のスキッピングを引き起こす（Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．，２４：６６２－６６９（２００７））同義スプライスバリアント（ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ）を含んでいた（表２）。
四つのバリアント全てが他で記載されているが、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌのみが、ドミナントネガティブ変異として機能的に特徴付けられている（Ｔｓｊｕｉ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｐｉｉｐｐｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３７：５６２－５６８（２００１）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．，１０：８１７－８２６（１９９９）；およびＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：２１１９－２１２４（２００４））。部位特異的変異誘発を使用して、四つのＬＱＴ１患者バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｖ２５４Ｍ、および－Ｉ５６７Ｓ）のうちの三つをＫＣＮＱ１－ＷＴに導入して、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐが、変異に依存しない様式でＫＣＮＱ１バリアントを抑制し、置換する能力を評価した。ＫＣＮＱ１－ＷＴは、全長ｃＤＮＡであり、ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌのようなスプライシングバリアントを評価するために必要なイントロンを含有しないため、ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌを、ＴＳＡ２０１細胞における異種発現研究には含めなかった。
実施例５－ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭおよびＫＣＮＱ１病原性バリアントの機能の検証
ＫＣＮＱ１－ＷＴおよび－ｓｈＩＭＭ、ならびにＬＱＴ１原因バリアントであるＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｖ２５４Ｍ、および－Ｉ５６７Ｓを、Ｋｖ７．１チャネルβ－サブユニットであるＫＣＮＥ１とＴＳＡ２０１細胞に共トランスフェクトした。得られたＩＫｓ電流を、標準的な全細胞パッチクランプによって測定した。代表的なトレースを、図１０Ａに示す。重要なことに、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭは、ＫＣＮＱ１－ＷＴと有意差のない強いＩＫｓ電流を生じた（ｐ＝０．２８、図１０Ｂおよび１０Ｃ）。三つのＬＱＴ１バリアント（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｖ２５４Ｍ、および－Ｉ５６７Ｓ）すべてが、機能の完全な喪失と一致して、ＴＳＡ２０１細胞の最小限のバックグラウンドイオンチャネル活性を超える機能的なＩＫｓ電流を生じなかった（図１０Ａ～１０Ｃ）。ヌル電流を、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘなどのナンセンスバリアント、およびさらにＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍに対して予想し、そのヌル状態は、他で記載（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、上記）されたデータと一致していた。ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓからの電流の完全欠乏は、新規の所見であったが、患者の臨床的に決定的なＬＱＴ１およびほとんどのＬＱＴ１原因バリアントがミスセンスバリアントであるという事実と一致していた。
ＫＣＮＱ１の細胞膜への輸送を評価するために、トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＱ１抗体を使用した免疫蛍光顕微鏡により評価した。ＫＣＮＱ１－ＷＴとＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの両方が、細胞膜に沿って明るい染色を生じ、これは、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの同義バリアントが、正しい輸送と干渉しなかったことを示す（図１１）。ＬＱＴ１バリアントのうち、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘは、早期切断の結果として検出可能なタンパク質を産生せず、一方、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓは、正常な細胞膜輸送を示したが、ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓの全体的な発現は減少したようであった。まとめると、これらの結果は、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭが、ＷＴ機能を有し、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｖ２５４Ｍ、および－Ｉ５６７Ｓが、機能を完全に喪失したＬＱＴ１原因バリアントであることを示した。
実施例６－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、変異非依存性の様式でＫＣＮＱ１バリアントを抑制し、置換する
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法を用いた処置が、変異非依存性の様式でＬＱＴ１原因バリアントを抑制し、置換できることを確認するために、ＴＳＡ２０１細胞を、三つのＫＣＮＱ１バリアントおよびｓｈＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ、またはｓｈＣＴ対照と共トランスフェクトした。すべての三つのＬＱＴ１－原因バリアントを、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定したＫＣＮＱ１－ＷＴと比べて、８７％～９３％ＫＤの範囲で、ｓｈＫＣＮＱ１が抑制した（図１２、上）。三つのバリアントのそれぞれについて抑制は目に見えるように印付けされたが、ｓｈＫＣＮＱ１による抑制は、おそらくこれらのバリアントのベースライン発現が低いことに起因して、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１ＸおよびＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓについて統計的有意性には達しなかった。統計的有意性に達していないにもかかわらず、ｓｈＫＣＮＱ１で処理した任意の試料（ＷＴまたはバリアント）において検出可能なｍＲＮＡ転写物は非常に少なかったことは、注目に値する。特に、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘは、その未成熟終止コドンにより、ベースラインで実質的に発現を減少させ、ｍＲＮＡ転写物の続くナンセンス介在性減衰を予測した（Ｈｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４４：１４８３－１４９５（２０１６））。
ｑＲＴ－ＰＣＲにより得られた結果を、ウェスタンブロッティングにより確認した。ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘは、その早期切断の結果として検出可能なタンパク質を産生しなかったが、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭはｓｈＫＣＮＱ１によって抑制され、ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓは、ｓｈＫＣＮＱ１によっても抑制された淡いベースライン発現を有した（図１２、下）。全体的に、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、三つのＬＱＴ１原因ＫＣＮＱ１バリアントの抑制および置換を引き起こし、これにより、変異非依存性の様式でＫＣＮＱ１を抑制し、置換する能力を検証した。
実施例７－四人のＬＱＴ１を有する患者からのｉＰＳＣ－ＣＭの生成
ｉＰＳＣバイオリポジトリの２３６人のＬＱＴ１を有する患者から、このＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法のＡＰＤ短縮の可能性を試験するために、ｉＰＳＣ－ＣＭに分化したそれらのｉＰＳＣを有する異なるＬＱＴ１変異を有する四人の患者を選択した。健常な無関係な個体を対照として含め、二つの同質遺伝子対照を、それぞれＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ｉ５６７ＳのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正によって生成した。これらの同質遺伝子対照は、可能性のある治療的治癒のゴールドスタンダードとして役立ち、これにより、延長されたＡＰＤの「理想的な」救済／正常化についてのマーカーをもたらし、この理想にどれほど近いくに、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子治療が到達したかを示している。
皮膚線維芽細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、各患者から採取し、これを使用して、ｉＰＳＣを生成した。ＬＱＴ１原因バリアントのサンガー配列決定、核型決定、明視野形態、ならびにＴｒａ－１－６０、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、およびＯｃｔ４を含む多能性マーカーについての免疫蛍光顕微鏡を含む、標準的な品質管理アッセイを、各ｉＰＳＣ株について行った（図１３Ａ～１３Ｄ）。ｉＰＳＣの分化を、他の場所で記載された方法によって誘導して、自発的に拍動するｉＰＳＣ－ＣＭを生成した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：８５５－８６０（２０１４）；およびＭｕｍｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１１１：３４４－３５８（２０１２））。心臓ＡＰＤは、ｉＰＳＣ－ＣＭが経時的に成熟するにつれて短縮することが知られているため、すべての実験を、分化の誘導から少なくとも３０日後に行った（Ｓｈａｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０：１８７９－１８９４（２０１８））。
実施例８－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法はＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭにおいてＫＣＮＱ１を増加させる
ｉＰＳＣ－ＣＭを形質導入し、ＷＴ ＫＣＮＱ１発現を増加させるレンチウイルスＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの能力を評価するために、無関係の対照およびＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭを、レンチウイルスＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴで形質導入し、免疫蛍光顕微鏡を使用して評価した。心筋細胞のマーカーとして、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を使用した。レンチウイルスレポーター（ｓｈＣＴについてはｔｕｒｂｏＧＦＰ、またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐについてはＣＦＰ）を標的化する抗体を使用して、形質導入した細胞を同定し、ＫＣＮＱ１を染色して、ＫＣＮＱ１の全体的な発現に対するＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの作用を可視化した。ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍ ｉＰＳＣ－ＣＭ（図１４）および残りの無関係の対照およびＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの結果（図１５Ａ～１５Ｄ）は、レンチウイルスＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴで均等に形質導入したｉＰＳＣ－ＣＭ培養物内で高純度の心筋細胞を示した。ｓｈＣＴで処理したｉＰＳＣ－ＣＭのベースラインでは、ＫＣＮＱ１は、共焦点顕微鏡でわずかに検出可能であったが、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したｉＰＳＣ－ＣＭは、ＫＣＮＱ１の強い染色を示した（図１４および１５Ａ～１５Ｄ）。これは、ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法による処理が、ＫＣＮＱ１－ｓｈＩＭＭの実質的な過剰発現を駆動することを示唆する。
実施例９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素によって測定ｓした、ＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの心臓ＡＰＤを短縮する
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法による処理が、病理学的に延長したＡＰＤを短縮することによってＬＱＴ１の病態特質を回復することができるかどうかを検証するためのさらなる試験を行った。レンチウイルスｓｈＣＴ対照またはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法のいずれかで処理した四人のＬＱＴ１を有する患者（ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ、－Ｖ２５４Ｍ、－Ｉ５６７Ｓ、または－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌから採取）に由来するｉＰＳＣ－ＣＭにおける光学活動電位を測定した。無関係の対照を、健康なＡＰＤの測定値として処置なしで測定した。すべてのｉＰＳＣ－ＣＭを、ＡＰＤに対する拍率依存性の変化を排除するために、記録中に１Ｈｚでペース調整した。代表的な光学活動電位を、図１６Ａに示す。ｓｈＣＴで処理したとき、全てのＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭは、９０％再分極で有意に長いＡＰＤを有し（ＡＰＤ９０）、四つのうちの三つは、未処置の無関係な健康対照ｉＰＳＣ－ＣＭと比較して５０％再分極で有意に長いＡＰＤを有し（ＡＰＤ５０）、これにより、ＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭをＬＱＴ１のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして検証した。
ＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値、ならびにＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによるＡＰＤの短縮の完全な概要を表５に示す。ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を、ｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理した各ＫＣＮＱ１バリアントを無処置の無関係の対照と比較した、事後ダネット検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって評価した（表５の括弧）。ｓｈＣＴで処理した四つのＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭはすべて、無関係の対照よりも有意に長いＡＰＤ９０を有し、三つのうちの二つも、有意に長いＡＰＤ５０を有し、これより、これらのＬＱＴ１株が、ＬＱＴ１の顕著な特徴である延長したＡＰＤを示すことを確認した。次いで、ｓｈＣＴでの処理と比較したＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによるＡＰＤの短縮を、各バリアントについて別個のＡＰＤ９０とＡＰＤ５０レベルの両方での対応のない両側スチューデントｔ検定によって評価した。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、四つのＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭすべてにおいて、ＡＰＤ９０とＡＰＤ５０の両方の統計上有意な減衰をもたらした（表５および図１６Ｂ）。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したとき、両方のＬＱＴ１株のＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０は、有意に短縮した。特に、ＡＰＤ９０は、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘでは１１７ｍｓ、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍでは１１１ｍｓ、ＫＣＮＱ１－Ｉ５６７Ｓでは８５ｍｓ、およびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌでは２１０ｍｓ短縮された（表５および図１６Ｂ）。
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによる観察したＡＰＤの短縮が、ＷＴへの完全な救済を表すか、またはより短いＡＰＤ値が不完全であるか、または過剰補正であるかを決定するために、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ親ＬＱＴ１ ｉＰＳＣ細胞株から、二つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照を生成した。ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）によって測定し、図１６ＢのｓｈＣＴおよびＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ処置データに対してプロットし、両方の同質遺伝子対照は、ｓｈＣＴで処理した同等物と比較して、有意に短いＡＰＤ９０およびＡＰＤ-５０を有していた（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍの同質遺伝子補正は、ＡＰＤ９０を２００ｍｓ～３８０±１１２ｍｓに短縮し（ｎ＝５８、ｐ＜０．０００１）、ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌの同質遺伝子補正は、ＡＰＤ９０を１７６ｍｓに短縮した（ｎ＝５７、ｐ＜０．００１）。同質遺伝子対照を有するＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値の完全な概要を表６に示す。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法で処理したＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌ ｉＰＳＣ－ＣＭの短縮ＡＰＤ値を、同質遺伝子対照のＡＰＤ値と比較すると、救済の実際の程度に明らかな変動があった。ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４Ｍでは、ＡＰＤ９０の統計上有意な不完全な短縮およびＡＰＤ５０の同時の過補正が存在したが、ＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌでは、ＡＰＤ９０は、有意な差なしに完全な救済を有していたが、ＡＰＤ５０の過剰補正を示した。この変動にもかかわらず、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法を用いた処理は、ＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける活動電位の延長を完全に回復する能力を示した。
実施例１０－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、ＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの３Ｄオルガノイド培養において心臓ＡＰＤを短縮する
ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐのＡＰＤ短縮能力が、２Ｄ合胞体単層ｉＰＳＣ－ＣＭ培養から三次元環境へ翻訳可能であるかどうかを決定するために、ＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭ ３Ｄオルガノイドを、ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ ｉＰＳＣ－ＣＭを使用して、四つのＬＱＴ１バリアントのうちの一つから生成した。ＫＣＮＱ１－Ｙ１７１Ｘ ｉＰＳＣ－ＣＭを解離させ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）スフェロイド型に包埋し、コラーゲン性細胞外構造上で自然に再構成して、３Ｄ心臓オルガノイドを生成した（図１８Ａ）。オルガノイドを、ｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理し、凍結切片にし、心筋細胞およびレンチウイルスレポーター（ｓｈＣＴについてのｔｕｒｂｏＧＦＰおよびＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐについてのＣＦＰ）をマークするための心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）を使用して免疫蛍光について染色し、感染細胞を印付けた。免疫蛍光は、心筋細胞のネットワーク、ならびにｔｕｒｂｏＧＦＰおよびＣＦＰの顕著な染色を明らかにし、これにより、ｓｈＣＴおよびＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによる形質導入さえも示す（図１８Ｂ）。未処理およびＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理したオルガノイドのＡＰＤを、ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）により評価し、これにより、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐが、ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０の統計上有意な短縮をもたらしたことを明らかにし（図１８Ｃおよび１８Ｄ）、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐが、単純な３Ｄオルガノイド環境でＡＰＤ短縮能力を保持していることを示唆している。
まとめると、上述の研究は、二つのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステムを使用して、ＬＱＴＳ、特にＬＱＴ１に対するハイブリッド抑制および置換遺伝子療法構築物のＡＰＤ減衰効果を操作し、検証した。これらの研究結果は、抑制置換遺伝子療法を使用して、病原性基質を直接標的化し、結果として生じる疾患を、ＬＱＴ１だけでなく、一般的にＬＱＴＳ、およびおそらくはほぼ任意の突然死の素因となる常染色体優性遺伝心疾患についても改善することができることを示唆した。
Figure 2024501882000077
ＫＣＮＱ１バリアントを、括弧内のｃＤＮＡ変化によるタンパク質レベルの結果としての変化として列挙する。（ＱＴｃ）Ｂａｚｅｔｔ補正したＱＴ感覚；（ＥＣＧ）心電図；（ＪＬＮＳ）イェルベル・ランゲニールセン症候群；（ＢＢ）β遮断薬；（ＩＣＤ）植込み型心臓除細動器；（ＰＢＭＣ）末梢血単核細胞。
Figure 2024501882000078
＊ｓｈＣＴ＝配列番号１１
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃１（ＤＮＡ）＝配列番号１２；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃１（ＲＮＡ）＝配列番号１６
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃２（ＤＮＡ）＝配列番号１３；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃２（ＲＮＡ）＝配列番号１７
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃３（ＤＮＡ）＝配列番号１４；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃３（ＲＮＡ）＝配列番号１８
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４（ＤＮＡ）＝配列番号１５；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃４（ＲＮＡ）＝配列番号１９
Figure 2024501882000079
＊ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃５（ＤＮＡ）＝配列番号３６；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃５（ＲＮＡ）＝配列番号４０
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃６（ＤＮＡ）＝配列番号３７；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃６（ＲＮＡ）＝配列番号４１
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃７（ＤＮＡ）＝配列番号３８；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃７（ＲＮＡ）＝配列番号４２
ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃８（ＤＮＡ）＝配列番号３９；ＫＣＮＱ１ ｓｈ＃８（ＲＮＡ）＝配列番号４３
Figure 2024501882000080
Figure 2024501882000081
ＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を、ｓｈＣＴまたはＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処理した各ＫＣＮＱ１バリアントを無処置の無関係の対照と比較するための事後ダネット検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって評価した（ＳｕｐＲｅｐ ｖ．ｓｈＣＴカラムに列挙したものを除く全てのｐ値）。ｓｈＣＴで処理した四つのＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭはすべて、無関係の対照よりも有意に長いＡＰＤ９０を有し、四つのうち三つも有意に長いＡＰＤ５０を有した。ｓｈＣＴでの処理と比較したＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐによるＡＰＤの短縮を、各バリアントについて別個のＡＰＤ９０とＡＰＤ５０レベルの両方での対応のない両側スチューデントｔ検定によって評価した。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐは、四つのＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭすべてにおいて、ＡＰＤ９０とＡＰＤ５０の両方の統計上有意な減衰をもたらした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、（ｎ．ｓ．）有意でない。
Figure 2024501882000082
ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値を、事後テューキー検定を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって、それぞれの同質遺伝子対照と比較した（ＳｕｐＲｅｐ ｖ．ｓｈＣＴカラムに列挙したものを除くすべてのｐ値）。同質遺伝子対照のＡＰＤ値は、二つのバリアントの各々、ＫＣＮＱ１－Ｖ２５４ＭおよびＫＣＮＱ１－Ａ３４４Ａ／ｓｐｌについてのＡＰＤの「理想的な」救済のベンチマークとしての役割を果たした。ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐを用いたＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、試験したＬＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの各セットの短縮をもたらし、これにより、各バリアントのそれぞれの同質遺伝子対照に近いＡＰＤを生じた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ｎ．ｓ．）有意でない。
実施例１１－トランスジェニックＬＱＴ１ウサギモデルにおける正常な細胞電気生理学の回復
ＬＱＴ１を引き起こすヒト病原性ＫＣＮＱ１－ｐ．Ｙ３１５Ｓバリアントを用いたＬＱＴ１の確立したヒト化ウサギモデルにおけるＱＴ／ＡＰＤ延長および不整脈感受性を逆転させるためのＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法のＡＡＶ９ベースの遺伝子送達の効果を評価するための実験を行う。動物を、急性的に単離したウサギの心室ＣＭにおける動物全体の不整脈表現型および分子／細胞電気生理学的表現型についてＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐで処置して、正常な分子、細胞、心臓全体、および動物全体の電気生理学的表現型の回復および心室性不整脈の予防に対するＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐベクターのＡＡＶ９介在性送達の効果を決定する。ウサギおよびヒトは、心臓再分極の根底にある類似のＫ＋電流を共有しており（Ｎｅｒｂｏｎｎｅ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５２５（２）：２８５－２９８（２０００））、その結果、トランスジェニックウサギモデルは、障害された再分極を有するヒトの不整脈原疾患を調べるのに有用である。これらの研究で使用するためのトランスジェニックＬＱＴ１およびＬＱＴ２ウサギモデルは、それぞれ、心臓において、ヒトＫＣＮＱ１（ＬＱＴ１、ＫＣＮＱ１－Ｙ３１５Ｓ、ＩＫｓの喪失）またはＫＣＮＨ２（ＬＱＴ２、ＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓ、ＩＫｒの喪失）のいずれかの機能を喪失したドミナントネガティブ細孔局在化バリアントを選択的に過剰発現する。これらのＬＱＴ１およびＬＱＴ２ウサギは、ＱＴ延長、自然発生的トルサード・デ・ポイント（ＴｄＰ）心室頻拍、およびＳＣＤを有するヒトＬＱＴＳ表現型を模倣する（図１９Ａ～１９Ｆ）（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：２２４６－２２５９（２００８）；およびＯｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｒｔ Ｒｈｙｔｈｍ，９：８２３－８３２（２０１２））。ＫＣＮＱ１－Ｙ３１５Ｓ変異およびＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓ変異を、ウサギベータミオシン重鎖（Ｂ－ＭｙＨＣ）プロモーターの制御下でウサギの心臓内で発現させ（図１９Ａ）て、ウサギモデルにおいてそれぞれＬＱＴ１表現型およびＬＱＴ２表現型を生じさせる。ウサギは、それぞれ、ＱＴの有意な延長を示す（図１９Ｂおよび１９Ｃ）、オストラジオールでの処置後の自発性多形性心室頻拍（ＴｄＰ）（図１９Ｄ）およびＩＫｓまたはＩＫｒ電流の除去に起因して、それぞれ（図１９Ｆ）、活動電位持続時間（図１９Ｅ）を示す。ウサギの生成および表現型評価のための詳細な方法は、他で記載されている（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記参照）。ヒトＬＱＴＳ表現型との類似性を考慮すると、これらのモデルは、ｉｎ ｖｉｖｏおよび心臓全体のレベルでの新規のＬＱＴＳ療法を調べるのに固有の利点を有する。
ＬＱＴ１トランスジェニックウサギモデルの治療に焦点を当てるために、ＬＱＴ１ウサギにおけるＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐのＱＴｃ／ＡＰＤ減衰効果を、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ（心臓全体）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ（ウサギ心筋細胞）で詳細に調査する。ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐの抗不整脈特性を、ランゲンドルフ灌流ＬＱＴ１ウサギ心臓においてｅｘ ｖｉｖｏで評価して、この心臓では、ＡＶノードアブレーションおよび低カリウム血症によって不整脈が進んで、ＫＣＮＱ１－Ｙ３１５Ｓトランスジェニックウサギにおいて病原性ＬＱＴ１表現型を逆転させるＫＣＮＱ１ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法送達の能力を評価した。他で記載された（Ｏｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，４０：８４２－８５３（２０１９））プロトコールに従い、すべての実験を、メス（ｆ）およびオス（ｍ）の成体ウサギ（４～７ヶ月齢）で行う。ｉｎ ｖｉｖｏ実験（外科手術、表面ＥＣＧ）については、ウサギを、Ｓ－ケタミンおよびキシラジン（１２．５ｍｇ／ｋｇ／３．５ｍｇ／ｋｇ ＩＭ、続いてＩＶ注入）で麻酔する。術後、ブプレノルフィンによる鎮痛療法を３日間維持する。ヘパリン（５００ＩＥ ＩＶ）およびチオペンタル－ナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）のさらなる注射後に、心拍心臓除去（ランゲンドルフ灌流した心臓における活動電位記録および不整脈評価、ならびに細胞パッチクランプのため）を行う。表面ＥＣＧ３５（Ｏｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記）を使用して、ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはＡＡＶ９－ｓｈａｍベクターのＡＡＶ９送達後のＫＣＮＱ１－Ｙ３１５Ｓトランスジェニックウサギに対して、ｉｎ ｖｉｖｏ心臓表現型決定を行う。同様に、ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐおよびＡＡＶ９－ｓｈＣＴで処置したウサギの分子および細胞電気生理学的特徴決定を、他で記載される（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＯｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記）通り、行う。
トランスジェニックＬＱＴ１ウサギは、二つの内在性野生型ウサギＫＣＮＱ１対立遺伝子および単一のトランスジェニックヒトＫＣＮＱ１変異体（ｐ．Ｙ３１５Ｓ）対立遺伝子を発現する。ヒトおよびウサギＫＣＮＱ１ ｃＤＮＡは、全体で７３％の相同性を有する。ウサギとヒトＫＣＮＱ１の間に１００％の相同性を有するｓｈＲＮＡ（ウサギとヒト対立遺伝子の両方を、ＬＱＴ１ウサギモデルで同時に抑制されるように）を、設計し、試験し、ウイルス粒子を産生する。
ＬＱＴ２ウサギモデルにおいて、一つまたは複数のＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ構築物を使用して、同様の実験を行う。
単離したＬＱＴ１ ＣＭにおけるＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子導入：ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子導入の機能性を、ＬＱＴ１ウサギ由来の単離した心室性ＣＭで試験し、その後、構築物を、ｉｎ ｖｉｖｏでＬＱＴ１ウサギで試験する。特に、左心室ＣＭを、標準的なコラゲナーゼ消化によってトランスジェニックＬＱＴ１ウサギ（ｎ＝５）の心臓から得る（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＯｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記）。ＣＭを４８時間培養で維持し、細胞培養物の半分を、ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐとインキュベートする。次いで、標準的な電圧および電流モードパッチクランプ（以下を参照）を使用して、細胞ＡＰＤおよびＩＫｓの電流密度に対する機能的結果を分析する（偽処理したＬＱＴ１ ＣＭと比較）。
ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子導入ｉｎ ｖｉｖｏ側方開胸術：ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入については、側方開胸を行い、ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはＡＡＶ９－ｓｈＣＴ構築物を両方の心室および両方の心房の心外膜表面に塗る。両方の性別の成体ＬＱＴ１ウサギ（群に分け、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの心臓全体の実験または細胞電気生理学に使用するＬＱＴ１－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐおよびＬＱＴ１－ＡＡＶ９－ｓｈＣＴ対照）を、Ｓ－ケタミンおよびキシラジンで麻酔する。ウサギを挿管して、開胸手術中に適切な換気を確保し、左外側開胸術を行う。ＡＡＶ９－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐまたはＡＡＶ９－ｓｈＣＴを心臓全体の表面上への徹底的な塗布後、胸を閉じ、ウサギを覚醒させる。術後回復の少なくとも１～２週間後、ＬＱＴ１ウサギにおけるＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法の電気生理学的影響を調べるための実験を行う。
ｉｎ ｖｉｖｏでの１２誘導ＥＣＧ記録：成体ＬＱＴ１－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ（メスおよびオス）ならびにＬＱＴ１－ＡＡＶ９－ｓｈＣＴ偽対照（メスおよびオス）ウサギに、従来の１２誘導表面ＥＣＧ記録を行い、正常なＱＴ持続時間の回復および不整脈促進マーカーの減少に対するＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法の作用を決定する。この麻酔レジメンは、心臓再分極に影響を与えないため、ＥＣＧを、Ｓ－ケタミンおよびキシラジンを用いた全身麻酔下で行う（Ｏｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９５：Ｈ２２６４－２２７２（２００８））。ＱＴ、心拍数補正ＱＴ、およびＴｐｅａｋ－Ｔｅｎｄ（Ｔｐ－ｅ）におけるＫＣＮＱ１遺伝子導入介在性変化ならびにＱＴの拍動対心拍の変動（ＱＴ間隔の短期変動；ＳＴＶＱＴ）を計算して、再分極の空間的および時間的不均一性の変化を評価する。
ｅｘ ｖｉｖｏでのランゲンドルフ灌流した心臓における単相性活動電位（ＭＡＰ）測定：ＭＡＰを、別に記載された（Ｏｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記）通り行う。簡潔に述べると、成体ＬＱＴ１－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ（メスおよびオス）ならびにＬＱＴ１－ＡＡＶ９－ｓｈＣＴ偽対照（メスおよびオス）ウサギはを、上記の通り麻酔する。チオペンタル－ナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）ＩＶを用いた安楽死後、心臓を迅速に切除し、ランゲンドルフ灌流セットアップ（ＩＨ５、Ｈｕｇｏ Ｓａｃｈｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に取り付け、加温（３７℃）し、予め酸素化（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）し、流速５０ｍＬ／分で改変クレブス・ヘンゼライト緩衝液を用いて、カニューレ状大動脈を介して逆行的に灌流する。再分極の９０％、７５％、および３０％での活動電位持続時間（ＡＰＤ９０、７５、３０）を評価し、ＡＰ三角測量（ＡＰＤ９０－ＡＰＤ３０）およびＡＰＤ回復（２および４Ｈｚ刺激でのＡＰＤ９０値に基づく）を、各ＬＶ領域について計算する。
ｅｘ ｖｉｖｏでのランゲンドルフ灌流した心臓における不整脈実験：ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法の抗不整脈作用を、Ａｖ結節で剥離したランゲンドルフ灌流したＬＱＴ１－ＫＣＮＱ１－ＳｕｐＲｅｐ（メスおよびオス）ならびにＬＱＴ１－ＡＡＶ９－ｓｈＣＴ（メスおよびオス）心臓において、ｅｘ ｖｉｖｏで評価し、約６０～８０拍動／分の一定速の安定した心室脱出リズム（ＶＥＲ）で自発的に拍動している（Ｈｏｒｎｙｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１７７：３７４４－３７５９（２０２０））。１０分間のベースライン（不整脈なし）記録後、心臓を、２ｍＭの低Ｋ＋含有ＫＨ溶液（１０分）で灌流して、不整脈を誘発する。第二の工程では、１０μＭ ＩＫ１遮断ＢａＣｌ２を、２ｍＭ低Ｋ＋含有ＫＨ溶液に加え、灌流（１０分）して、再分極予備能を低減し、不整脈形成に対する感受性をさらに高める。ＥＣＧを連続的に記録し、不整脈の持続期間（％）および発生率（現象の平均数）をオフラインで測定する。不整脈を、心室の余分な心拍（ＶＥＢ）、二段脈、心室頻拍（ＶＴ）、および心室細動（ＶＦ）として定義する。不整脈率は、ＬＱＴ１心臓では非常に高い（６０～８０％の範囲）が、ＢａＣｌ２と組み合わせた低Ｋ＋ＫＨでは、正常な野生型心臓では重篤な心室性不整脈は発生しない（Ｈｏｒｎｙｉｋ ｅｔ ａｌ．、上記参照）。
ウサギＣＭにおける電気生理学的記録：標準的なコラゲナーゼ消化により、ＫＣＮＱ１ＳｕｐＲｅｐで処置したトランスジェニックＬＱＴ１ウサギおよび偽対照トランスジェニックＬＱＴ１ウサギの心臓から左室ＣＭを得る（Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＯｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記）。細胞電流（ＩＫｓ、ＩＫｒ、Ｉｔｏ、およびＩＫ１）全体ならびに活動電位を、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂパッチクランプアンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して記録し、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａインターフェースを用いて１０ｋＨｚの試料採取頻度でデジタル化し、他に記載された（Ｏｄｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９、上記）ｐＣＬＡＭＰソフトウェアで取得する。
データの解釈：正規分布した値については、スチューデントｔ検定（非両側性）を使用して、２群の平均を比較し、マン・ホイットニーとウィルコクソンの一致対検定を、正規分布ではない値について使用する。フィッシャーの正確な検定を、不整脈の発生率などのカテゴリー変数に使用する。Ｉ－Ｖ曲線では、ボンフェローニ事後解析によって補完した反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、差を評価する。細胞電気生理学データを、ｐＣｌａｍｐ ９．０およびＯｒｉｇｉｎ ７．０ソフトウェアを使用して評価し、結果を平均±ＳＥＭとして得る。すべての他の解析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（Ｇｒａｐｈ－Ｐａｄ）用Ｐｒｉｓｍ ５．０１を用いて行い、それらのデータを、平均±ＳＤとして示し、ｎは、実験数／動物を示し、試験は、両側であり、ｐ＜０．０５を、有意とみなす。ウサギでのすべての実験を、盲検様式で行い、分析する。
実施例１２－ＬＱＴ２ ＳｕｐＲｅｐのための物質および方法
ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐのクローニング：ＷＴ ＫＣＮＨ２ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００２３８．３）をｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社；カリフォルニア州マウンテンビュー）にサブクローニングして、ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＫＣＮＨ２－ＷＴを生成した。ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＫＣＮＨ２－ＷＴにおけるｐ．Ｇ６０４Ｓおよびｐ．Ｎ６３３Ｓバリアントを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）によって生成した。ＤＮＡサンガー配列決定を使用して、ベクターの完全性を確認した。五つのカスタム設計したＫＣＮＨ２ ｓｈＲＮＡｓ（ｓｈ＃１～５）を、非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）と共にｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ骨格でＯｒｉＧｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から注文した。最終的なＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターについては、ＫＣＮＨ２ ｓｈ＃４をリード候補として選択し、ｓｈＫＣＮＨ２と称する。ＫＣＮＨ２－ＷＴ ｃＤＮＡのＫＣＮＨ２ ｓｈ＃４（ｓｈＫＣＮＱ２）標的配列内の十の同義バリアント：ｃ．２６９４Ｃ＞Ｔ、ｃ．２６９７Ｇ＞Ｃ、ｃ．２７００Ｇ＞Ａ、ｃ．２７０３Ｇ＞Ａ、ｃ．２７０６Ａ＞Ｔ、ｃ．２７０９Ｇ＞Ｃ、ｃ．２７１２Ｇ＞Ａ、ｃ．２７１５Ｇ＞Ｃ、ｃ．２７１８Ｇ＞Ｃ、ならびにｃ．２７２１Ｃ＞Ｇ（それぞれ、ＫＣＮＨ２：ｐ．Ｄ８９８Ｄ、ｐ．Ｔ８９９Ｔ、ｐ．Ｅ９００Ｅ、ｐ．Ｑ９０１Ｑ、ｐ．Ｐ９０２Ｐ、ｐ．Ｇ９０３Ｇ、ｐ．Ｅ９０４Ｅ、ｐ．Ｖ９０５Ｖ、ｐ．Ｓ９０６Ｓ、およびｐ．Ａ９０７Ａ）を含有するＤＮＡ断片を合成し、ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＫＣＮＨ２－ＷＴにクローニングして、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を生成した。ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭを、ｓｈＫＣＮＨ２を含有するｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ骨格にサブクローニングして、最終のＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐを生成した。
パッチクランプ実験用のＫＣＮＨ２哺乳動物発現ベクター：野生型ＫＣＮＨ２ ｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）およびＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社；ニュージャージー州ピスカタウェイ）にサブクローニングして、ＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰおよびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを生成した。
パッチクランプ実験のためのＴＳＡ ２０１およびＨ９Ｃ２細胞培養ならびにトランスフェクション：３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１．０％Ｌ－グルタミン、および１．２％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＴＳＡ ２０１およびＨ９Ｃ２細胞を培養した。ＫＣＮＨ２の異種発現を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μｌまたは３μｌを使用することによって達成して、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地中のＫＣＮＥ２－ｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲｅｄ２ １．０μｇまたはＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ １．０μｇと共にｐＩＲＥＳ２－ＫＣＮＨ２－ＥＧＦＰ １．０μｇをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、電気生理学的実験前、４８時間インキュベーとした。
電気生理学的測定：標準的な細胞全体パッチクランプ技術を使用して、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ、およびｐｃｌａｍｐバージョン１０．４ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、室温（ＲＴ）でＫＣＮＥ２－ｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲｅｄ２およびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ電流を用いてｐＩＲＥＳ２－ＫＣＮＨ２－ＷＴ－ＥＧＦＰを測定した。細胞外（浴）溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１５０ ＮａＣｌ、５．４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、１Ｎａ－ピルビン酸、および１５ＨＥＰＥＳを含有していた。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて７．４に調整した。細胞内（ピペット）溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１５０ ＫＣｌ、５ ＮａＣｌ、２ ＣａＣｌ２、５ ＥＧＴＡ、５ ＭｇＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳを含有し、ｐＨを、ＫＯＨを用いて７．２に調整した。Ｐ－９７プルーラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｎｏｖａｔｏ、カリフォルニア州）を使用して微小電極を引き延ばした後、微小電極を最終抵抗２～３ＭΩに先端熱加工した。 直列抵抗を８０～８５％代償した。電流を１ｋＨｚでフィルタリングし、８極のベッセルフィルターを用いて５ｋＨｚでデジタル化した。図３０Ａおよび３１Ａに記載した電圧－クランププロトコールを使用して、活性化の電圧依存性を決定した。データを、Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、ワシントン州、レドモンド）を使用して分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ；カリフォルニア州、サンディエゴ）に適合させた。
ｉＰＳＣ生成のためのＬＱＴ２患者選択：すべての患者を、個人の遺伝子心臓専門医およびＬＱＴＳ専門家が評価した。皮膚線維芽細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、それぞれ、４ｍｍの皮膚パンチ生検および血液試料により採取した。試料を、２１２人のＬＱＴ２を有する患者から得た。本試験のため、二つの異なるＬＱＴ２原因ミスセンスバリアントを有する二人のＬＱＴ２患者（１３歳の男性および１２歳の女性）を、５００ｍｓ超のＱＴｃを有する少なくとも一つのＥＣＧ、ＬＱＴＳ関連症状（失神、発作、突然の心停止）の陽性歴、ならびにＬＱＴＳ関連症状の陽性家族歴として定義した強いＬＱＴ２表現型に基づき選択した（表７）。ＰＢＭＣまたは線維芽細胞を、Ｃｙｔｏｔｕｎｅ ２．０再プログラミングキットを使用して、センダイウイルス形質導入により、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラムした。山中ファクターを用いた感染後２１日以内に、コロニーをピックアップした。各バリアント系統について、生成し、特徴決定し、他の所で記載された（Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｇｅｎｏｍ Ｐｒｅｃｉｓ Ｍｅｄ．１３：４６６－４７５（２０２０））通り、品質管理について分析した。患者特異的ｉＰＳＣクローンの各々についての核型解析を、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが完了し、試験したすべての変異型ｉＰＳＣクローンは、正常な核型を示した（図２０Ａ）。各ｉＰＳＣクローンからゲノムＤＮＡを単離し（図２０Ｂ）、バリアントの存在およびＫＣＮＨ２配列の残りの部分の完全性を、サンガー配列決定によって確認した（図２０Ｃ）。すべてのｉＰＳＣクローンは、Ｎａｎｏｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＡ１－０９７Ｘ）およびＳＳＥＡ－４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＡ１－０２１）多能性マーカーを発現すると確認した（図２１）。すべてのｉＰＳＣを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州）６ｃｍの培養皿に、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したｍＴｅＳＲ－Ｐｌｕｓ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））中、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養した。８５％コンフルエンスで、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用してｉＰＳＣを継代した。
ｉＰＳＣ－ＣＭ培養、分化、および解離：ｉＰＳＣを、他で記載（Ｂｕｒｒｉｄｇｅら、上記；およびＭｕｍｍｅｒｙら、上記）に記載されたプロトコールを使用して、約８５％のコンフルエントに達した後に、ｉＰＳＣを心筋細胞（ＣＭ）に分化させた。０日目に、培地をｍＴｅＳＲ－ＰｌｕｓからＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ＋５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ；ミズーリ州セントルイス）を含有するＢ２７－マイナスインスリン（ＲＰＭＩ／Ｂ２７イン；Ｔｈｅｒｍｏ）を加えた２５ｍＭ ＨＥＰＥＳに変えることによって、分化を開始させた。４８時間後（２日目）に、培地を、５μＭ ＩＷＰ－２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに変えた。４日目に、培地を、ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓ維持培地に戻した。自発的拍動は、６～７日目に始まった。１０～１６日目から、ＲＰＭＩ １６４０培地（グルコースを含まない）中、５００μｇ／ｍｌ組み換えヒトアルブミン、２１７μｇ／ｍｌ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸、および５ｍＭ ＤＬ－乳酸を含有する選択培地中でｉＰＳＣ－ＣＭを培養した。選択後、ｉＰＳＣ－ＣＭを、他で記載された（Ｄｏｚｚｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１４３：１４１１－１４２５（２０２１））通り、ＳＴＥＭｄｉｆｆ心筋細胞解離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用して、酵素的に解離した。２４時間後、細胞を、ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓ培地中で維持した。すべての実験について、分化の少なくとも３０日後に細胞を使用した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ 補正した同質遺伝子対照ｉＰＳＣの生成：ｉＰＳＣ細胞株のゲノム編集を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（カリフォルニア州、ミルピタス）を介して委託した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して、ＬＱＴ２患者細胞株（ｐ．Ｇ６０４Ｓおよびｐ．Ｎ６３３Ｓ）の両方について、同質遺伝子「バリアント補正」対照ｉＰＳＣ細胞株を作成した。簡潔に述べると、各バリアント系統についての二つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、設計し、ｉｎ ｖｉｖｏで検証した。特異性スコア、切断効率、およびオフターゲットプロファイルに基づいて、各患者ｉＰＳＣ株のゲノム編集のため、一つの候補ｇＲＮＡを選択した。修復鋳型として使用すべき一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を設計し、ｇＲＮＡ結合部位におけるサイレント変異を、再切断を防ぐためにｓｓＯＤＮに導入した。ＬＱＴ２患者ｉＰＳＣ株を、Ｎｅｏｎシステムを使用してｇＲＮＡ構築物およびｓｓＯＤＮでトランスフェクトし、トランスフェクトしたｉＰＳＣを、ピューロマイシン選択に供した。単一細胞コロニーを、遺伝子型決定のため選択し、バリアント補正した二つのクローンを、さらなる研究のため拡大した。
ウェスタンブロットおよびｑＲＴ－ＰＣＲ用ＴＳＡ２０１細胞培養ならびにトランスフェクション：ＴＳＡ２０１細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で維持した。対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲおよびウェスタンブロット実験については、５×１０５細胞を、６ウェルプレート中のウェル毎に播種した。２４時間後、１００ｆｍｏｌ（０．３～０．７μｇ）等モル量の各プラスミド（ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ－ＫＣＮＨ２－ＷＴもしくは－バリアント、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＫＣＮＨ２（＃１～＃５）または－ｓｈＣＴ、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ、もしくはｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ）を含むＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）１０μＬを使用して、維持培地中で、細胞を共トランスフェクトした。
ウェスタンブロッティング：ＴＳＡ２０１細胞を、上記の通り、ＫＣＮＨ２－ＷＴ、－ｓｈＩＭＭ、または－バリアントおよびｓｈＫＣＮＨ２（＃１～５）、－ｓｈＣＴ、またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐと共トランスフェクトした。４８時間後、細胞をタンパク質分解酵素およびホスファターゼ阻害剤を含む１×ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。溶解物を、氷上で１０分間冷却し、５０％振幅で１０秒間超音波処理し、細胞片を、４℃、２１，０００ｒｃｆで１５分間ペレット化した。上清を新しいチューブに移し、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用してタンパク質濃度を測定し、その後、ローディング緩衝液（１：２０のβ－メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液）と１：１で混合した。タンパク質（１０μｇ／レーン）を４～１５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社、カリフォルニア州）上で泳動し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使用してＰＶＤＦ膜に移した。０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０／３％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で１時間ブロッキング後、ブロッキング溶液中の１：５００および１：５０００希釈で、ＫＣＮＨ２に対する一次抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ）およびハウスキーピング対照（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－３７６４７６）と共に、４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を３×１５分間、ＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ブロッキング溶液中の１：５０００希釈で二次抗体ＨＲＰ抱合ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でインキュベートした。１時間後、膜をＴＢＳ－Ｔ中で３×１５分間洗浄した。最後に、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光ＥＣＬ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）中でインキュベートし、ＨｙＢｌｏｔ ＣＬオートラジオグラフィーフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｅ３０１２）に曝露した。ピクセル密度を、自由に利用可能なＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量した。
対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲ：対立遺伝子特異的プライマーを、ｑＲＴ－ＰＣＲ用に設計し、他で記載された対立遺伝子特異的遺伝子型決定方法（Ｒｏｈａｔｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１７，７０：４５３－４６２、およびＰｒｉｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，１０：１９３２－１９６３）を適合させることによって、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＨ２－ＷＴおよびバリアントを含むが、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭを除く内在性ＫＣＮＨ２、ならびにＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭを増幅した。合計ＫＣＮＨ２については、プライマーをＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。対立遺伝子特異的プライマーについては、一方が、内在性ＫＣＮＨ２（ＫＣＮＨ２－ＷＴおよび－バリアントに特異的な対立遺伝子）に相補的であり、他方が、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭに特異的な対立遺伝子）に相補的である、ｓｈＫＣＮＨ２標的化部位にわたる二つのリバースプライマーを使用した。共通のフォワードプライマーを、両方の対立遺伝子特異的フォワードプライマーのため使用した。ＧＡＰＤＨプライマー（ＩＤＴ）を、ハウスキーピング対照として使用した。標準曲線を使用して、ＰＣＲ増幅バイアスを補正した。上記の通り、ＴＳＡ２０１細胞を共トランスフェクトした。４８時間後、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＲＮＡを採取し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して測定した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ社）中のＲＮＡ５００ｎｇを添加することによって、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成した。上記の通り、４組のプライマーと共にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、四回のｑＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。まずＫＣＮＨ２をＧＡＰＤＨに正規化し、次に相対的な倍加変化をＫＣＮＨ２－ＷＴおよびｓｈＣＴ処理群と比較することによって、ΔΔＣＴ法を使用してデータを分析した。
レンチウイルスの生成およびｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入：ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴｉＰＳＣ－ＣＭ（処置対照）へのｉＰＳＣ－ＣＭへの適用については、レンチウイルスを使用した。ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチベクターパッケージングキット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カリフォルニア州パロアルト）を使用して、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ）およびｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＣＴ（ｓｈＣＴ）から、レンチウイルス粒子を生成した。分化導入後３０日超経過後、上記の通り、二人のＬＱＴ２を有する患者およびそれぞれの同質遺伝子対照に由来するｉＰＳＣ－ＣＭを解離させ、ＦｌｕｏＶｏｌｔ（ＭａｔＴｅｋ、マサチューセッツ州アシュランド）用のガラス底のはめ込み付きＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート３５ｍｍ皿に播種した。４８時間の回復後、ｉＰＳＣ－ＣＭを、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴを含有するレンチウイルス粒子を用いて形質導入した。ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）感染試薬（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を加えて、形質導入効率を増加させ、ｉＰＳＣ－ＣＭを、３５ｍｍディッシュ中、室温で１．５時間、２５０ｒｃｆで遠心分離した。形質導入の２４時間後、培地を新鮮な維持培地であるＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに交換した。
ｉＰＳＣ－ＣＭにおける電圧色素光学活動電位：ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐまたはｓｈＣＴのいずれかを含有するレンチウイルス粒子を用いて、ｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入の３～７日後に電圧色素実験を実施した。撮像の日、ｉＰＳＣ－ＣＭを、予め加温した（３７℃）ＨＥＰＥＳ緩衝タイロード液（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ；Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ、ＭＡ）で洗浄した。各３５ｍｍのガラス底ディッシュを、ＦｌｕｏＶｏｌｔ色素０．１２５μＬ、ＰｏｗｅｒＬｏａｄ １．２５μＬ、およびタイロード液（ＦｌｕｏＶｏｌｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ）０．５ｍＬと共に、３７℃で２０分間インキュベートした。過剰な色素を、タイロード液を用いて三回洗浄し、最後のタイロード液２ｍＬを、撮像のためｉＰＳＣ－ＣＭに加えた。撮像中、ディッシュを、５％ＣＯ２を伴う、加温した３７℃の段階的上部チャンバー（Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；ソウル、韓国）内で維持した。４０×水対物レンズ倍率下でニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ；東京、日本）を使用して、光学活動電位を、５％電力のＬＥＤ照明を用いて、５０フレーム／秒（ｆｐｓ、露光時間２０ｍｓ）の速度で、２０秒の高速タイムラプスビデオに記録した。ＡＰＤに対するビート速度依存性作用を除去するためのＭｙｏＰａｃｅｒフィールド刺激装置（Ｉｏｎ Ｏｐｔｉｘ；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）を使用して、１Ｈｚ（パルス持続時間９ｍｓ、２５Ｖ）で、ｉＰＳＣ－ＣＭをペース調整した。分析のため、対象の長方形の領域を、細胞の光を放つ領域に描いた。ＮＩＳ－素子ソフトウェア（ニコン）を使用して、対象の各領域内の経時的な蛍光強度を測定し、光学活動電位トレースを得た。トレースを、光退色について補正し、振幅を、カスタム社内Ｅｘｃｅｌベースのプログラムを使用して、ベースライン最小蛍光量で割った蛍光の変化として正規化した（ΔＦ／Ｆｍｉｎ）。半自動方式で、ＡＰＤ９０、ＡＰＤ５０、振幅、立ち上がり時間、上昇速度などを含む共通活動電位パラメータを、個々の光学動作電位それぞれについて検出し、２０秒間のトレース内の全拍動にわたり平均した。２０秒間のトレース内のすべての拍動の平均は、単一のデータ点を表した。代表的なトレースについては、最大振幅を１．０にさらに正規化して、ＡＰＤ差の正確な可視化を可能にした。
統計：すべての統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を使用して行った。適当可能である限り、個々のデータ点を平均値と共に示す。正規分布したパラメータの群平均間の差を、≧３群間の比較のための一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して評価した。複数の事後ＡＮＯＶＡ解析のため、テューキー検定を使用した。Ｐ≦０．０５の値を、統計上有意であるとみなした。パッチクランプ実験については、データ点を、平均値として示し、棒は、平均の標準誤差を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）をｔ検定に使用した。スチューデントｔ検定を行い、二群間の統計的有意性を決定した。Ｅ－４０３１の前後の統計的有意性を決定するために、両側性ｔ検定を行った。ｐ＜０．０５を、有意であるとみなした。
Figure 2024501882000083
ＫＣＮＨ２バリアントを、括弧内のｃＤＮＡ変化によるタンパク質レベルの結果としての変化として列挙する。
ＱＴｃ、Ｂａｚｅｔｔ補正したＱＴ間隔；ＩＣＤ、植込み型心臓除細動器；ＬＣＳＤ、左心交感神経切除；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＳＣＤ、心臓性突然死。
実施例１３－ＫＣＮＨ２のｓｈＲＮＡノックダウン
ＫＣＮＨ２を標的化する１７の固有のｓｈＲＮＡを試験し、約８０％のノックダウン効率で、ＴＳＡ２０１細胞において内在性ＫＣＮＨ２対立遺伝子（変異体と野生型の両方）を抑制した、一つの候補ｓｈＲＮＡ（指定Ｒａｂ＿ｓｈ４）を同定した（図２２）。ｓｈＲＮＡ（５’－ＣＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴ－３’；配列番号２７）（ＲＮＡ配列５’－ＣＡＣＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＧＵＧＵＣＧＧＣＣＵ－３’；配列番号２８）は、ウサギ配列およびヒト配列と完全に相同であった。ｓｈＲＮＡを、レンチウイルス骨格（ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ）およびＡＡＶ９骨格（ｐＧＦＰ－Ａ－ｓｈＡＡＶ）において設計した。このｓｈＲＮＡを同定すると、ＫＣＮＨ２ ｃＤＮＡのｓｈＲＮＡ（配列番号２８）バージョンおよび「ｓｈＲＮＡ－免疫」（５’－ＴＡＣＣＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＣＴＣＣＧＣＧＴ－３’；配列番号２９）バージョンを含有するＳｕｐＲｅｐ構築物を生成した（内在性ＫＣＮＨ２対立遺伝子をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ、および置換野生型ＫＣＮＨ２対立遺伝子を同時にもたらすためのｓｈＲＮＡ－免疫）。ＫＣＮＱ１と同様に、ｓｈＩＭＭ配列は、ｓｈＲＮＡ標的配列内の各コドンのゆらぎ塩基の変化を有し、これは、ｓｈＲＮＡによるノックダウンを防止したが、コードされたアミノ酸配列は変化しなかった。ＳｕｐＲｅｐ構築物を、レンチウイルス骨格（ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ）とＡＡＶ９骨格（ｐＧＦＰ－Ａ－ｓｈＡＡＶ）の両方で設計し、五つのＳｕｐＲｅｐ構築物を、レンチウイルス骨格において、五つを、ＡＡＶ９骨格において生成した。これらの構築物は、それらが含有するレポーター配列（Ｐ２Ａ、融合物－ＧＦＰ、ＩＲＥＳ、ＨＡ－タグ、およびレポーターなし）において異なっていた。合計１０個の構築物は以下の通りであった。
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－Ｐ２Ａ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－融合物－ＧＦＰ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－ＩＲＥＳ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－ＨＡタグ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－レポーターなし
ｓｈＡＡＶ－ＳｕｐＲｅｐ－Ｐ２Ａ
ｓｈＡＡＶ－ＳｕｐＲｅｐ－融合物－ＧＦＰ
ｓｈＡＡＶ－ＳｕｐＲｅｐ－ＩＲＥＳ
ｓｈＡＡＶ－ＳｕｐＲｅｐ－ＨＡタグ
ｓｈＡＡＶ－ＳｕｐＲｅｐ－レポーターなし
ＳｕｐＲｅｐ構築物は、ＣＭＶプロモーターおよびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含有したが、他のプロモーター／エンハンサーを含むように改変することができる。例えば、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶプロモーターよりも小さく、より心臓特異的であるｃＴｎＣプロモーターで置換することができる。さらに、ＨＧＨポリアデニル化シグナルを、より小さなＳＶ４０ターミネーター配列で置き換えることができる。これらの修飾は、ＳｕｐＲｅｐ構築物のサイズを低減し、より高い効率でＡＡＶ９にパッケージングすることを可能にする。
実施例１４－ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＫＣＮＨ２のＳｕｐＲｅｐ補正
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照を、心臓ＡＰＤの「理想的な」補正のためのマーカーとして使用した。ＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素を使用して、Ｎ６３３Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭおよびＬＱＴ２ ｉＰＳＣ（Ｎ６３３Ｓ）から生成した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤを測定した。ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照およびｓｈＣＴまたはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＨ２－Ｎ６３３ＳバリアントについてのＡＰＤ９０Ｂ値およびＡＰＤ５０Ｂ値を、図２３にプロットする。同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭは、ｓｈＣＴで処理したＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭより有意に短いＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を有し、これは、ＫＣＮＱ２における単一の病原性ＬＱＴ２バリアントが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患表現型を救済することができたことを示した。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐを用いたＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理により、ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照のＡＰＤ９０Ｂと有意差のないＡＰＤ９０Ｂの短縮が生じた。ＫＣＮＨ２－Ｎ６３３Ｓについては、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐは、延長したＡＰＤ９０Ｂの「理想的な」補正を達成し、ＡＰＤ５０Ｂを過補正した。
さらなる研究では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照が、心臓ＡＰＤの補正のためのマーカーとして再び役立った。Ｎ６３３Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭおよびＬＱＴ２ ｉＰＳＣ（Ｎ６３３Ｓ）から生成した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値の結果を、図２４にプロットする。無処理（ＵＴ）のＫＣＮＨ２－Ｎ６３３Ｓバリアント、ＳｕｐＲｅｐで処理した同質遺伝子対照、および無処理（ＵＴ）の同質遺伝子対照についてのＡＰＤ９０Ｂ値およびＡＰＤ５０Ｂ値をプロットする。処理したおよび処理していない同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭは、処理していないＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭより有意に短いＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を有し、これは、再度、ＫＣＮＱ２における単一の病原性ＬＱＴ２バリアントが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患表現型を救済することができたことを示した。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐを用いた同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭの処理により、処理していない同質遺伝子対照と比較して、ＡＰＤ９０ＢおよびＡＰＤ５０Ｂの短縮の過補正をもたらした。
Ｇ６０４Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値の結果を図２５にプロットする。ｓｈＣＴまたはＳｕｐＲｅｐで処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６０４ＳバリアントのＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０値をプロットする。ＳｕｐＲｅｐでのＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ｓｈＣＴで処理したものと比較して、有意なＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０の短縮をもたらす。
さらなる研究では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９補正同質遺伝子対照が、心臓ＡＰＤの「理想的な」補正のためのマーカーとして再び役立った。Ｇ６０４Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭおよびＬＱＴ２ ｉＰＳＣ（Ｎ６０４Ｓ）から生成した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値を、図２６にプロットする。ｓｈＣＴ（３）で処理した同質遺伝子対照およびｓｈＣＴ（１）またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ（２）で処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６０４ＳバリアントについてのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値を示す。同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭは、ｓｈＣＴで処理したＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭより有意に短いＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を有し、これは、ＫＣＮＱ２における単一の病原性ＬＱＴ２バリアントが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患表現型を救済することができたことを示した。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐを用いたＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ＡＰＤ９０の短縮を生じた。ＫＣＮＨ２－Ｇ６０４Ｓについては、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐは、ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照と比較して、延長したＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を過補正した。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、ＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓを、「理想的な」心臓ＡＰＤのマーカーをもたらした同質遺伝子対照として役立った野生型細胞に挿入した。Ｇ６２８Ｓ ｉＰＳＣ－ＣＭおよび同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値を、図２７に示す。ｓｈＣＴ（３）で処理した同質遺伝子対照およびｓｈＣＴ（１）またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ（２）で処理したＫＣＮＨ２－Ｇ６２８ＳバリアントについてのＡＰＤ９０値を示す。同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭは、ｓｈＣＴで処理したＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭより有意に短いＡＰＤ９０を有し、これは、ＫＣＮＨ２における単一の病原性ＬＱＴ２バリアントの挿入が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患表現型を救済することができたことを示した。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐを用いたＬＱＴ２ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ＡＰＤ９０の短縮を生じた。ＫＣＮＨ２－Ｇ６２８Ｓについては、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐは、ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照と比較して、延長したＡＰＤ９０を過補正した。
実施例１５－ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、ＫＣＮＨ２－ＷＴを抑制し、置換する
ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭが、実際にｓｈＫＣＮＨ２（ｓｈ＃４）によってＫＤに対して免疫であるかどうかを試験するために、ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＨ２－ＷＴまたはＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭおよびｓｈＫＣＮＨ２で共トランスフェクトした。ＫＣＮＨ２－ＷＴ対ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭの発現を、対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して定量した。各試料を、（１）総ＫＣＮＨ２、（２）ＷＴまたはバリアント含有対立遺伝子を含むが、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭを除外する、内在性ＫＣＮＨ２、（３）ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ、および（４）ハウスキーピング対照としてのＧＡＰＤＨを定量するための、対立遺伝子特異的プライマーの固有のセットを使用して、四回の別個の反応で行った。市販のプライマーを使用して、総ＫＣＮＨ２を増幅した。内在性ＫＣＮＨ２またはＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭの排他的増幅のため、二つのリバースプライマーを、一方が、ＷＴ配列に対して相補的であり、他方が、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭを生成するように操作した固有の修飾配列に対して相補的である、ｓｈＫＣＮＨ２標的部位内で設計した。共通のフォワードプライマーを両方の反応に使用し、標準曲線を使用して、ＰＣＲ増幅バイアスを補正した。結果は、ｓｈＫＣＮＨ２が、ＫＣＮＨ２－ＷＴまたはＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭおよびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＨ２、またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトしたＴＳＡ２０１細胞においてＫＣＮＨ２－ＷＴをノックダウンしたが、ＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭをノックダウンしなかったことを示した（図２８Ａ）。ＧＡＰＤＨに正規化され相対的ＫＣＮＨ２発現を、ＫＣＮＨ２－ＷＴ（白色）およびＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（灰色）を定量する対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。結果を、ハウスキーピング対照としてＧＡＰＤＨを用いて、ＫＣＮＨ２のウェスタンブロッティングで確認した（図２８Ｂ）。
実施例１６－ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐを使用したバリアント非依存性抑制および置換の検証
ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法が、バリアント非依存性の様式で、ＫＣＮＨ２をノックダウンし、置換したかどうかを試験するために、ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＨ２－ＷＴまたはＫＣＮＨ２バリアントおよびｓｈＣＴ、ｓｈＫＣＮＨ２、またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐで共トランスフェクトした。結果は、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐが、ＬＱＴ２疾患を引き起こすＫＣＮＨ２ミスセンスバリアントをノックダウンし、それらをＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭで置換したことを示した。ｓｈＫＣＮＨ２は、バリアントに依存しない様式でＫＣＮＨ２をノックダウンした。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐは、ｓｈＫＣＮＨ２を介してＫＣＮＨ２バリアントをノックダウンし、ノックダウン免疫性であったＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭを発現した。図２９Ａにおけるグラフは、ＫＣＮＨ２－ＷＴ／バリアント（白色）およびＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭ（灰色）を測定するための対立遺伝子特異的ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して検出した、ＫＣＮＨ２－ＷＴ／バリアントおよびＫＣＮＨ２－ｓｈＩＭＭの釣り合った発現を示す。図２９Ｂは、ハウスキーピング対照としてＧＡＰＤＨを用いたウェスタンブロットによって検証したすべてのＫＣＮＨ２発現（対立遺伝子特異的ではない）全体を示す。
実施例１７－ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰは、Ｈ９Ｃ２細胞においてＥ－４０３１感受性外向き電流を生成した
心臓特異的ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰが、心筋細胞においてのみ発現し、非心筋細胞では発現していないかどうかを決定するために、異種発現およびパッチクランプ研究を、ＫＣＮＥ２－ｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲｅｄ２およびＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰと共に両方のＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰについて、ＴＳＡ２０１細胞において行った。ＫＣＮＥ２－ｐＩＲＥＳ２－ｄｓＲｅｄ２と共にＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰの共発現により、堅牢なＩｋｒ電流が明らかになった。しかしながら、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰの発現は、典型的なＫＣＮＨ２電流ではなく、ＴＳＡ２０１細胞からの内在性外向き電流のみを示し（図３０Ａおよび３０Ｂ）、これは、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰが ＴＳＡ２０１細胞で発現しなかったことを示している。ピーク電流密度は、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ発現について、－１０ｍＶ～＋２０ｍＶの電圧範囲を有意に小さくした（図３０Ｃ）。 ＋１０ｍＶで、ピーク電流密度は、４１．４±３．４ｐＡ／ｐＦ（ＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ、ｎ＝９）および２３．２±３．０ｐＡ／ｐＦ（ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ、ｎ＝８、ｐ＜０．０５対ＫＣＮＨ２－ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ）であった（図３０Ｄ）。
心臓特異的ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰが、心筋細胞で発現され、ＫＣＮＨ２電流を生成することができるかどうかを決定するために、ラット新生児心筋細胞であるＨ９Ｃ２細胞において、異種発現およびパッチクランプ研究を行った。空のＨ９Ｃ２細胞は、小さな外向電流のみを示し（図３１Ａ、上のパネル）、ここで、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ発現と同様に、強い外向き電流が明らかになった（図３１Ａ、中のパネル）。この外向き電流を、特定のＫＣＮＨ２チャネルブロッカー（５００ｎＭ Ｅ－４０３１）が阻害した（図３１Ａ、下のパネル）。ピーク電流密度は、ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ発現について、電圧範囲－２０ｍＶ～＋６０ｍＶにわたってに有意に増加した（Ｐ＜０．０５対空のＨ９Ｃ２）（図３１Ｂ）。＋６０ｍＶで、ピーク電流密度は、１７．３±３．８ｐＡ／ｐＦ（空のＨ９Ｃ２、ｎ＝９）および２９．８±３．６ｐＡ／ｐＦ（ＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰ、ｎ＝９、ｐ＜０．０５対空のＨ９Ｃ２）であった（図３１Ｃ）。５００ｎＭ Ｅ－４０３１は、電圧範囲＋１０ｍＶ～＋６０ｍＶにわたって、外向き電流を発現したＫＣＮＨ２－ＡＡＶ－Ｐ２Ａ ＣＴｎＣ－ＥＧＦＰを有意に阻害した（Ｐ＜０．０５対Ｅ－４０３１の前）（図３１Ｄ）。＋６０ｍＶで、ピーク電流密度は、２９．８±５．４ｐＡ／ｐＦ（Ｅ－４０３１の前、ｎ＝６）および１９．１±３．２ｐＡ／ｐＦ（Ｅ－４０３１の後、ｎ＝６、ｐ＜０．０５対Ｅ－４０３１の前）であった（図３１Ｅ）。
実施例１８－ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐは、ＦｌｕｏＶｏｌｔ電圧色素によって測定した、ＳＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける病理学的に短縮した心臓ＡＰＤを延長する
ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐが、ＬＱＴ２とタイプ１ＱＴ短縮（ＳＱＴ１）疾患表現型の両方を救済することができることを示すために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、公知のＳＱＴ１バリアントであるＫＣＮＨ２－Ｎ５８８Ｋを、同質遺伝子対照としての役割を果たす野生型細胞に挿入した（図３２）。同質遺伝子対照は、「理想的な」心臓ＡＰＤのマーカーとしての役目を果たした。Ｎ５８８Ｋ ｉＰＳＣ－ＣＭおよび同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤのＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）電圧色素測定値を、図３２にプロットする。ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照およびｓｈＣＴ（１）またはＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐ（２）で処理したＫＣＮＨ２－Ｎ５８８ＫバリアントについてのＡＰＤ９０値およびＡＰＤ５０値を示す。同質遺伝子対照ｉＰＳＣ－ＣＭ（３）は、ｓｈＣＴで処理したＳＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭより有意に長いＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を有し、これは、ＫＣＮＨ２における単一の病原性タイプ１ＱＴ短縮（ＳＱＴ１）バリアントの挿入が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患表現型を示すことができたことを示した。ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐでのＳＱＴ１ ｉＰＳＣ－ＣＭの処理は、ＡＰＤ９０の延長をもたらした。ＫＣＮＨ２－Ｎ５８８Ｋについては、ＫＣＮＨ２－ＳｕｐＲｅｐは、ｓｈＣＴで処理した同質遺伝子対照と比較して、短縮したＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０を補正した。
実施例１９－ＬＱＴ３ ＳｕｐＲｅｐのための物質および方法
ｉＰＳＣ生成のためのＬＱＴ３患者選択：患者を、遺伝子心臓専門医およびＬＱＴＳ専門家が評価した。皮膚線維芽細胞およびＰＢＭＣを、それぞれ、４ｍｍの皮膚パンチ生検および血液試料により採取した。８０人のＬＱＴ３を有する患者を含む、様々な遺伝性心チャネル病と診断された約１２００人の患者およびその罹患している、または罹患していない家族から試料を得た。ｉＰＳＣの生成については、タンパク質レベルで以下の変化：Ｐ１３３２Ｌ，Ｒ１６２３Ｑ、およびＦ１７６０Ｃをもたらす、四人の変異を生じるＬＱＴ３患者を選択した（表８）。
ｉＰＳＣへの線維芽細胞／ＰＢＭＣの再プログラミングおよび品質管理：線維芽細胞またはＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０再プログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）または山中ファクター：ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆ、およびｐＣＸＷＢ－ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）を含有する四つのエピソームＤＮＡプラスミドを用いたエレクトロポレーションを使用して、センダイウイルス遺伝子導入により再プログラムした。誘導後２１日以内に少なくとも二つのコロニーをピックアップし、クローン性に拡大させた。すべてのｉＰＳＣを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）６ｃｍの培養皿に、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したｍＴｅＳＲ（登録商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））中、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養した。８５％コンフルエンスで、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用してｉＰＳＣを継代した。次いで、各クローンを核型決定した。
すべての株は、正常な核型を有した。ＳＣＮ５Ａバリアント確認を、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ－アンプリコンのサンガー配列決定によって行った。すべてのｉＰＳＣクローンにおける多能性マーカーの発現を、１：２５０希釈で、Ｏｃｔ４（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ５－２７４３８）、Ｎａｎｏｇ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ１－０９７）、Ｔｒａ－１－６０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ｓｃ－２１７０５）、およびＳＳＥＡ－４（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ１－０２１）に対する一次抗体を使用した共焦点免疫蛍光顕微鏡によって確認した。二次抗体は、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ－１１００１）およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ－１１０３７）であった。ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いた対比染色を、５ｍｇ／ｍＬストックから１：２０００希釈で使用した。画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ９８０共焦点顕微鏡で取得した。
ｉＰＳＣの品質管理：ＬＱＴ３原因バリアントのサンガー配列決定、核型決定、明視野形態、ならびにＴｒａ－１－６０、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、およびＯｃｔ４を含む多能性マーカーについての免疫蛍光顕微鏡を含む、標準的な品質管理アッセイを、ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ株について行った（図３３Ａ～３３Ｄ）。ｉＰＳＣの分化を、他の場所で記載された方法によって誘導して、自発的に拍動するｉＰＳＣ－ＣＭを生成した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＭｕｍｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．、上記）。心臓ＡＰＤは、ｉＰＳＣ－ＣＭが経時的に成熟するにつれて短縮することが知られているため、すべての実験を、分化の誘導から少なくとも３０日後に行った（Ｓｈａｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記）。
ｉＰＳＣ－ＣＭ培養、分化、および解離：ｉＰＳＣが８５％コンフルエントであったとき、別に記載した通り、心筋細胞（ＣＭ）への分化を誘発した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ２００９、上記；およびＳｃｈｗａｒｔｚ ２０１３、上記）。培地をＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）＋ ５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＢ２７－マイナスインスリン（ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸））に変えることによって、分化を開始させた（０日目）。２日目に、培地を、５μＭ ＩＷＰ－２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに変えた。４日目に、培地を、維持培地ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに戻した。自発的な鼓動は、典型的には、６～７日目に始まり、１０～１２日目までに残りの細胞に拡大した。ｉＰＳＣ－ＣＭを少なくとも３０日目まで成熟させ、週に二回培地を変えた。３０日後、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋解離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用して、ｉＰＳＣ－ＣＭを酵素的に解離した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない）で洗浄し、３７℃で１０分間解離培地中に置き、次いでＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋サポート培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を添加することによって不活化した。細胞を粉砕し、１５ｍＬの円錐管に移し、３００ｒｃｆで３分間遠心分離することによってペレット化した。上清を吸引し、細胞を心筋サポート培地中に懸濁してから、適切なＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート培養ウェアに移した。２４時間後、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに戻した。解離により、播種前後の細胞密度に応じて、単一細胞と小～中規模サイズのｉＰＳＣ－ＣＭクラスターの混合物を得た。自発的な鼓動は、解離の２４時間後に概して回復し、３～７日目に強力な電気カップリングおよびシンシチア形成を伴った。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ 補正した同質遺伝子対照ｉＰＳＣ：同質遺伝子「バリアント補正」対照ｉＰＳＣ細胞株は、ＳＣＮ５Ａ－Ｒ１６２３Ｑ、ＳＣＮ５Ａ－Ｐ１３３２Ｌ、またはＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ変異のいずれかを有する三人の患者特異的ＬＱＴ３細胞株について市販された。これらの同質遺伝子対照は、可能性のある治療的治癒のゴールドスタンダードとして役立ち、これにより、延長されたＡＰＤの「理想的な」救済／正常化についてのマーカーをもたらし、この理想にどれほど近いくに、ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子治療が到達したかを示している。
レンチウイルスの生成およびｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入：ｉＰＳＣ－ＣＭ（または処置対照としてのｓｈＣＴ）へのＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐの適用については、レンチウイルスを使用した。ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチベクターパッケージングキット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カリフォルニア州パロアルト）を使用して、ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＳＣＮ５Ａ－ｓｈＩＭＭ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＳＣＮ５Ａ－ＧＦＰ－ＳｕｐＲｅｐ）およびｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＳＣＮ５Ａ－ｓｈＩＭＭ－ＨＡ（ＳＣＮ５Ａ－ＨＡ－ＳｕｐＲｅｐ）から、レンチウイルス粒子を生成した。分化導入後少なくとも３０日目に達した後、ＬＱＴ３を有する患者のｉＰＳＣ－ＣＭを解離し、上記の通り、ＦＬＵＯＶＯＬＴ（商標）（ＭａｔＴｅｋ）用のガラス底インセットを有するＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート３５ｍｍ皿または免疫蛍光（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＳＵＰＥＲＩＯＲ（商標））用の１０ウェル培養反応スライドに播種した。２４～４８時間の回復後、ｉＰＳＣ－ＣＭを、未処理のままにするか、またはＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐを含有するレンチウイルス粒子を用いて形質導入した。形質導入効率を高めるために、ポリブレン感染試薬（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を形質導入中に終濃度８μｇ／ｍＬまで添加し、ｉＰＳＣ－ＣＭを、３５ｍｍディッシュ中、室温で１．５時間、２５０ｒｃｆで遠心分離した。形質導入の２４時間後、培地を新鮮なメンテナンス培地、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インと交換した。
ｉＰＳＣ－ＣＭにおける電圧色素光学活動電位：ｓｈＣＴのいずれかを含有するレンチウイルス粒子を用いたｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入の３～７日後に、電圧色素実験を行った。撮像の日、ｉＰＳＣ－ＣＭを、予め加温した（３７℃）ＨＥＰＥＳ緩衝タイロード液（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で洗浄した。ＦＬＵＯＶＯＬＴ（商標）膜電位キット（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して、ＦＬＵＯＶＯＬＴ（商標）色素０．１２５μＬおよびＰｏｗｅｒＬｏａｄ１．２５μＬを、各３５ｍｍのガラス底ディッシュに対してタイロード液０．５ｍＬに加え、３７℃で２０分間インキュベートした。過剰な色素を、予め加温したタイロード液を用いた三回の洗浄で除去し、最後のタイロード液２ｍＬを、撮像のためｉＰＳＣ－ＣＭに加えた。撮像中、ディッシュを、５％ＣＯ２を伴う、加温した３７℃の段階的上部チャンバー（Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）内で維持した。４０×水対物レンズ倍率下でニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、光学活動電位を、５％電力のＬＥＤ照明を用いて、５０フレーム／秒（ｆｐｓ、露光時間２０ｍｓ）の速度で、２０秒の高速タイムラプスビデオに記録した。ＡＰＤに対するビート速度依存性作用を除去するためのＭｙｏＰａｃｅｒフィールド刺激装置（Ｉｏｎ Ｏｐｔｉｘ；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）を使用して、１Ｈｚ（パルス持続時間９ｍｓ、２５Ｖ）で、ｉＰＳＣ－ＣＭをペース調整した。ビデオは、ｉＰＳＣ－ＣＭ（クラスタおよび単層）の電気結合した同期領域（クラスタおよび単層）に焦点を当て、これは、これらの領域の細胞が、最も最適なペース刺激に従い、蛍光強度の大きな変化（しばしば約８～１２％）によって表す最大のシグナル対ノイズを生じるためである。分析のために、細胞の点滅領域上に対象の長方形領域を描き、ＮＩＳ－エレメントソフトウェア（ニコン）を使用して、対象の各領域内の経時的な蛍光強度を定量化し、これにより、光学活動電位トレースを得た。カスタムＥｘｃｅｌベースのプログラムを使用して、トレースを、光退色について補正し、振幅を、ベースライン最小蛍光量で割った蛍光の変化として正規化した（ΔＦ／Ｆｍｉｎ）。半自動方式で、ＡＰＤ９０、ＡＰＤ５０、振幅、立ち上がり時間、上昇速度などを含む共通活動電位パラメータを、個々の光学動作電位それぞれについて検出し、２０秒間のトレース内の全拍動にわたり平均した。２０秒間のトレース内のすべての拍動の平均は、単一のデータ点を表した。代表的なトレースについては、最大振幅を１．０にさらに正規化して、ＡＰＤ差の正確な可視化を可能にした。
統計：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を、すべての統計解析に使用し、図のすべてのデータを適合させた。実用的である限り、個々のデータ点を平均値と共に示す。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。非両側性スチューデントｔ検定を行い、示した場合の二群間の統計的有意性を決定した。ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
Figure 2024501882000084
ＳＣＮ５Ａバリアントは、括弧内のｃＤＮＡ変化を伴うタンパク質レベルの結果としての変化として列挙される。
ＱＴｃ、Ｂａｚｅｔｔ補正したＱＴ間隔；ＩＣＤ、植込み型心臓除細動器；ＰＢＭＣ、抹消血単核細胞；ＬＣＳＤ、左心交感神経切除；ＬＣＳＤ、右心交感神経切除；ＳＣＤ、心臓性突然死。
実施例２０－ＳＣＮ５ＡのｓｈＲＮＡノックダウン
ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐを作製するために、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉレンチウイルス骨格中の六つの候補ＳＣＮ５Ａ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ＃１～６）を試験した。各ＳＣＮ５Ａ ｓｈＲＮＡのＫＤ効率を、ＴＳＡ２０１細胞をＳＣＮ５Ａ－ＷＴおよびｓｈ＃１～６と共トランスフェクトすることによって決定した。ＳＣＮ５Ａの発現を、定量的逆転写ＰＣＲによって測定した（ｑＲＴ－ＰＣＲ、図３４）。試験した六つのｓｈＲＮＡのうち、ｓｈ＃１、ｓｈ＃３、ｓｈ＃４、およびｓｈ＃５はすべて、ＳＣＮ５Ａの有意なＫＤ（ｍＲＮＡ：７８～９１％ＫＤ）をもたらした。したがって、これらのｓｈＲＮＡのいずれも、最終的なＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターの一部として使用する可能性がある。しかしながら、未加工のＫＤにより、ＳＣＮ５Ａ ｓｈ＃１（５’－ＧＧＴＴＣＡＣＴＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＣＡ－３’；配列番号３０）（ＲＮＡ配列５’－ＧＧＵＵＣＡＣＵＣＧＣＵＣＵＵＣＡＡＣＡＵＧＣＵＣＡＵＣＡ－３’；配列番号３１）が、ＳＣＮ５Ａの最も強いＫＤをもたらし、これは、約９１％ノックダウン効率でＴＳＡ２０１細胞における内在性ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子（変異体と野生型の両方）を抑制している（図３４）。さらに、選択時に、ＳＣＮ５Ａ ｓｈ＃１標的配列を、ゲノム凝集データベース（ｇｎｏｍＡＤ）およびＣｌｉｎＶａｒを使用して評価し、一般的な遺伝子多型とＫＤ効率と干渉し得る公知の病原性ＬＱＴ３原因変異の両方を欠いていることが分かった。したがって、ＳＣＮ５Ａ ｓｈ＃１を、最終的なＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐに選択し、「ｓｈＳＣＮ５Ａ」と称する。
ｓｈＲＮＡを、レンチウイルス骨格（ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ）中で設計した。このｓｈＲＮＡを同定すると、ＳＣＮ５Ａ ｃＤＮＡのｓｈＲＮＡ（配列番号３１）バージョンおよび「ｓｈＲＮＡ－免疫」（５’－ＣＧＴＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＡ－３’；配列番号３２）バージョンを含有するＳｕｐＲｅｐ構築物を生成した（内在性ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ、および置換野生型ＳＣＮ５Ａ対立遺伝子を同時にもたらすためのｓｈＲＮＡ－免疫）。ＫＣＮＱ１と同様に、ｓｈＩＭＭ配列は、ｓｈＲＮＡ標的配列内の各コドンのゆらぎ塩基の変化を有し、これは、ｓｈＲＮＡによるノックダウンを防止したが、コードされたアミノ酸配列は変化しなかった。ＳｕｐＲｅｐ構築物を、レンチウイルス骨格（ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ）で設計し、三つのＳｕｐＲｅｐ構築物を、レンチウイルス骨格において生成した。これらの構築物は、それらが含有するレポーター配列（Ｐ２Ａ、ＨＡ－タグ、およびレポーターなし）において異なっていた。合計３つの構築物は、以下の通りであった。
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－Ｐ２Ａ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－ＨＡタグ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－レポーターなし
このｎ ｖｉｔｒｏ試験で使用した最終的なＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターを、図３５に説明する。ＳｕｐＲｅｐ構築物は、ＣＭＶプロモーターおよびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含有したが、他のプロモーター／エンハンサーを含むように改変することができる。例えば、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶプロモーターよりも小さく、より心臓特異的であるｃＴｎＣプロモーターで置換することができる。さらに、ＨＧＨポリアデニル化シグナルを、より小さなＳＶ４０ターミネーター配列で置き換えることができる。これらの修飾は、ＳｕｐＲｅｐ構築物のサイズを低減し、より高い効率でＡＡＶ９にパッケージングすることを可能にする。
実施例２１－ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、ＦＬＵＯＶＯＬＴ（商標）電圧色素によって測定した、ＬＱＴ３ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける心臓ＡＰＤを短縮する
ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法による処理が、病理学的に延長したＡＰＤを短縮することによってＬＱＴ３の病態特質を回復することができるかどうかを試験するためのさらなる試験を行った。ＦＬＵＯＶＯＬＴ（商標）電圧色素を使用して、ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法で処理した、ＬＱＴ３を引き起こすＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃを有する患者由来のｉＰＳＣ－ＣＭにおける光学活動電位を測定した。すべてのｉＰＳＣ－ＣＭを、ＡＰＤに対する拍率依存性の変化を排除するために、記録中に１Ｈｚでペース調整した。代表的な光学活動電位を、図３６Ａに示す。未処置のとき、ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭは、９０％再分極で有意に長いＡＰＤを有し（ＡＰＤ９０）、未処置の無関係な健康対照ｉＰＳＣ－ＣＭと比較して５０％再分極で有意に長いＡＰＤを有し（ＡＰＤ５０）、これにより、ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭをＬＱＴ３のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして検証した。次いで、無処理のＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭと比較したＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐによるＡＰＤの短縮を、各バリアントについてＡＰＤ９０とＡＰＤ５０レベルの両方での対応のない両側スチューデントｔ検定によって評価した。ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐは、ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ ｉＰＳＣ－ＣＭにおけるＡＰＤ９０とＡＰＤ５０の両方の統計上有意な減衰をもたらした（図３６Ｂ）。ＳＣＮ５Ａ－ＳｕｐＲｅｐで処理したとき、ＳＣＮ５Ａ－Ｆ１７６０Ｃ株のＡＰＤ９０およびＡＰＤ５０は、有意に短縮した。これらの結果は、抑制置換遺伝子療法が、病原性基質を直接標的化し、結果として生じるＬＱＴ３の疾患を改善するための有望な戦略であることを示した。
実施例２２－ＭＹＨ７のｓｈＲＮＡノックダウン
ＭＹＨ７を標的化する６の固有のｓｈＲＮＡを試験し、約８５％のノックダウン効率で、ＴＳＡ２０１細胞において内在性ＭＹＨ７対立遺伝子（変異体と野生型の両方）を抑制した、一つの候補ｓｈＲＮＡ（指定ｓｈ２）を同定した（図３７）。ｓｈＲＮＡ（５’－ＧＣＴＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＡＴＴＴ－３’；配列番号３３）（ＲＮＡ配列５’－ＧＣＵＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＵＵＡＵＣＡＣＡＵＵＵ－３’；配列番号３４）は、ヒト配列と完全に相同であった。ｓｈＲＮＡを、レンチウイルス骨格（ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ）中で設計した。このｓｈＲＮＡを同定すると、ＭＹＨ７ ｃＤＮＡのｓｈＲＮＡ（配列番号３４）および「ｓｈＲＮＡ－免疫」（５’－ＡＣＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡＴ－３’；配列番号３５）バージョンを含有するＳｕｐＲｅｐ構築物を生成した（内在性ＭＹＨ７対立遺伝子をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ、および置換野生型 ＭＹＨ７対立遺伝子を同時にもたらすためのｓｈＲＮＡ－免疫）。ＫＣＮＱ１と同様に、ｓｈＩＭＭ配列は、ｓｈＲＮＡ標的配列内の各コドンのゆらぎ塩基の変化を有し、これは、ｓｈＲＮＡによるノックダウンを防止したが、コードされたアミノ酸配列は変化しなかった。ＳｕｐＲｅｐ構築物を、レンチウイルス骨格（ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉ）で設計し、三つのＳｕｐＲｅｐ構築物を、レンチウイルス骨格において生成した。これらの構築物は、それらが含有するレポーター配列（Ｐ２Ａ、ＨＡ－タグ、およびレポーターなし）において異なっていた。合計３つの構築物は、以下の通りであった。
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－Ｐ２Ａ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－ＨＡタグ
ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－レポーターなし
ＳｕｐＲｅｐ構築物は、ＣＭＶプロモーターおよびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含有したが、他のプロモーター／エンハンサーを含むように改変することができる。例えば、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶプロモーターよりも小さく、より心臓特異的であるｃＴｎＣプロモーターで置換することができる。さらに、ＨＧＨポリアデニル化シグナルを、より小さなＳＶ４０ターミネーター配列で置き換えることができる。これらの修飾は、ＳｕｐＲｅｐ構築物のサイズを低減し、より高い効率でＡＡＶ９にパッケージングすることを可能にする。
実施例２３－ＰＫＰ２ ＳｕｐＲｅｐのための物質および方法
ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法構築物の生成：ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐを作製するために、ｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉレンチウイルス骨格中の八つの候補ＰＫＰ２ ｓｈＲＮＡｓ（ｓｈ＃１～８）を試験した。各ＰＫＰ２ ｓｈＲＮＡのＫＤ効率を、ＴＳＡ２０１細胞をＰＫＰ２－ＷＴおよびｓｈ＃１～８と共トランスフェクトすることによって決定した。ＧＡＰＤＨに正規化したＰＫＰ２の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（図３８）。試験した八つのｓｈＲＮＡのうち、ｓｈ＃２、ｓｈ＃４、ｓｈ＃６、およびｓｈ＃７はすべて、ＰＫＰ２の有意なＫＤをもたらした（ｍＲＮＡ：７５～９０％ＫＤ）。これらのｓｈＲＮＡのいずれも、理論上、最終的なＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法ベクターの一部として使用する可能性がある。四つの可能性のある候補から最終的なｓｈＲＮＡを選択するために、未加工のＫＤにより、ＰＫＰ２ ｓｈ＃７（５’－ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＴＡＴ－３’；配列番号５２）（ＲＮＡ配列５’－ＧＣＡＧＡＧＣＵＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＵＡＵ－３’；配列番号５３）は、両方のｍＲＮＡ（９０％）レベルにおいてＰＫＰ２の最も強いＫＤをもたらした。さらに、選択時に、ＳＰＫＰ２ ｓｈ＃７標的配列を、ゲノム凝集データベース（ｇｎｏｍＡＤ）およびＣｌｉｎＶａｒを使用して評価し、一般的な遺伝子多型とＫＤ効率と干渉し得る公知の病原性ＡＣＭ原因変異の両方を欠いていることが分かった。したがって、ＰＫＰ２ ｓｈ＃７を、最終的なＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐに選択し、「ｓｈＰＫＰ２」と称する。
ＰＫＰ２－ｓｈＩＭＭと呼ばれるＰＫＰ２の置換ｓｈＲＮＡ－免疫バージョンを生成するために、１０個の同義バリアントを、ｓｈＰＫＰ２標的部位内の各コドンのゆらぎ塩基でＷＴ ＰＫＰ２ ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００４５７２．４）に導入した（５’－ＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＡＣ－３’；配列番号９９０）。次いで、ＰＫＰ２－ｓｈＩＭＭを、ＣＭＶプロモーターの下流で、ｓｈＰＫＰ２含有ベクターであるｐＧＦＰ－Ｃ－ｓｈＬｅｎｔｉにクローニングした。構築物の三つのバージョン：ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ、ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－ＨＡタグ、ｓｈＬｅｎｔｉ－ＳｕｐＲｅｐ－レポーターなしを作製した。
ｉＰＳＣ生成のためのＰＫＰ２患者選択：患者を、遺伝子心臓専門医が評価した。皮膚線維芽細胞およびＰＢＭＣを、それぞれ、４ｍｍの皮膚パンチ生検および血液試料により採取した。２９人のＰＫＰ２バリアントを有する患者を含む、様々な遺伝性心チャネル病と診断された約１２００人の患者およびその罹患している、または罹患していない家族から試料を得た。ＰＫＰ２バリアント：Ｒ７９Ｘ，Ｅ１４９Ｘ，Ｑ４５７Ｘ、ｃ．２１４６－１Ｇ＞Ｃを有する四人の患者を、ｉＰＳＣの生成のため選択した。
ｉＰＳＣへの線維芽細胞／ＰＢＭＣの再プログラミングおよび品質管理：線維芽細胞またはＰＢＭＣを、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０再プログラミングキット（Ｔｈｅｒｍｏ）または山中ファクター：ｐＣＸＬＥ－ｈＵＬ、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆ、およびｐＣＸＷＢ－ＥＢＮＡ１（Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）を含有する四つのエピソームＤＮＡプラスミドを用いたエレクトロポレーションを使用して、センダイウイルス遺伝子導入により再プログラムした。誘導後２１日以内に少なくとも二つのコロニーをピックアップし、クローン性に拡大させた。すべてのｉＰＳＣを、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）６ｃｍの培養皿に、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したｍＴｅＳＲ（登録商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））中、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中で培養した。８５％コンフルエンスで、ＲｅＬｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用してｉＰＳＣを継代した。次いで、各クローンを核型決定した。
すべての株は、正常な核型を有した。ＰＫＰ２バリアント確認を、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ－アンプリコンのサンガー配列決定によって行った。すべてのｉＰＳＣクローンにおける多能性マーカーの発現を、１：２５０希釈で、Ｏｃｔ４（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ５－２７４３８）、Ｎａｎｏｇ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＰＡ１－０９７）、Ｔｒａ－１－６０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ｓｃ－２１７０５）、およびＳＳＥＡ－４（Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ１－０２１）に対する一次抗体を使用した共焦点免疫蛍光顕微鏡によって確認した。二次抗体は、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ－１１００１）およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ－１１０３７）であった。ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いた対比染色を、５ｍｇ／ｍＬストックから１：２０００希釈で使用した。画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ９８０共焦点顕微鏡で取得した。
ｉＰＳＣの品質管理：ＡＣＭ原因バリアントのサンガー配列決定、核型決定、明視野形態、ならびにＴｒａ－１－６０、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、およびＯｃｔ４を含む多能性マーカーについての免疫蛍光顕微鏡を含む、標準的な品質管理アッセイを、ｃ．２１４６－１Ｇ＞Ｃ ｉＰＳＣ株について行った（図３９Ａ～３９Ｄ）。ｉＰＳＣの分化を、他の場所で記載された方法によって誘導して、自発的に拍動するｉＰＳＣ－ＣＭを生成した（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、上記；およびＭｕｍｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．、上記）。心臓ＡＰＤは、ｉＰＳＣ－ＣＭが経時的に成熟するにつれて短縮することが知られているため、すべての実験を、分化の誘導から少なくとも３０日後に行った（Ｓｈａｈｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記）。
ｉＰＳＣ－ＣＭ培養、分化、および解離：ｉＰＳＣが８５％コンフルエントであったとき、別に記載した通り、心筋細胞（ＣＭ）への分化を誘発した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ２００９、上記；およびＳｃｈｗａｒｔｚ ２０１３、上記）。培地をＲＰＭＩ １６４０ ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）＋ ５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を含有するＢ２７－マイナスインスリン（ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸））に変えることによって、分化を開始させた（０日目）。２日目に、培地を、５μＭ ＩＷＰ－２（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに変えた。４日目に、培地を、維持培地ＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに戻した。自発的な鼓動は、典型的には、６～７日目に始まり、１０～１２日目までに残りの細胞に拡大した。ｉＰＳＣ－ＣＭを少なくとも３０日目まで成熟させ、週に二回培地を変えた。３０日後、ＳＴＥＭＤＩＦＦ（商標）心筋解離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を使用して、ｉＰＳＣ－ＣＭを酵素的に解離した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない）で洗浄し、３７℃で１０分間解離培地中に置き、次いでＳＴＥＭＤＩＦＦ（商標）心筋サポート培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ（登録商標））を添加することによって不活化した。細胞を粉砕し、１５ｍＬの円錐管に移し、３００ｒｃｆで３分間遠心分離することによってペレット化した。上清を吸引し、細胞を心筋サポート培地中に懸濁してから、適切なＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート培養ウェアに移した。２４時間後、培地をＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに戻した。解離により、播種前後の細胞密度に応じて、単一細胞と小～中規模サイズのｉＰＳＣ－ＣＭクラスターの混合物を得た。自発的な鼓動は、解離の２４時間後に概して回復し、３～７日目に強力な電気カップリングおよびシンシチア形成を伴った。
レンチウイルスの生成およびｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入：レンチウイルスを、ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐのｉＰＳＣ－ＣＭへの適用に使用した。ｐＰＡＣＫＨ１ ＨＩＶレンチベクターパッケージングキット（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；カリフォルニア州パロアルト）を使用して、ｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＰＫＰ２－ｓｈＩＭＭ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（ＰＫＰ２－ＧＦＰ－ＳｕｐＲｅｐ）およびｓｈＬｅｎｔｉ－ｓｈＰＫＰ２－ｓｈＩＭＭ－ＨＡ（ＰＫＰ２－ＨＡ－ＳｕｐＲｅｐ）から、レンチウイルス粒子を生成した。分化導入後少なくとも３０日目に達した後、ＡＣＭを有する患者のｉＰＳＣ－ＣＭを解離し、上記の通り、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｆ１４２０１）用のガラス底インセットを有するＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）コート３５ｍｍ皿または免疫蛍光（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ＳＵＰＥＲＩＯＲ（商標））用の１０ウェル培養反応スライドに播種した。２４～４８時間の回復後、ｉＰＳＣ－ＣＭを、未処理のままにするか、またはＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐを含有するレンチウイルス粒子を用いて形質導入した。形質導入効率を高めるために、ポリブレン感染試薬（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を形質導入中に終濃度８μｇ／ｍＬまで添加し、ｉＰＳＣ－ＣＭを、３５ｍｍディッシュ中、室温で１．５時間、２５０ｒｃｆで遠心分離した。形質導入の２４時間後、培地を新鮮な維持培地であるＲＰＭＩ／Ｂ２７－ｉｎｓに交換した。
ｉＰＳＣ－ＣＭにおける細胞内カルシウムアッセイ：ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐを含有するレンチウイルス粒子を用いたｉＰＳＣ－ＣＭの形質導入の３～７日後に、細胞内カルシウムアッセイ実験を行った。撮像の日、ｉＰＳＣ－ＣＭを、予め加温した（３７℃）ＨＥＰＥＳ緩衝タイロード液（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で洗浄した。Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＤＭＳＯ ５０μＬに溶解し、次いで、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ ５μＬおよびＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｆ－１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２μＬを、各３５ｍｍのガラス底ディッシュにタイロード液１ｍＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。過剰な色素を、予め加温したタイロード液を用いた一回の洗浄および二回の５分間の洗浄で除去し、最後のタイロード液１．５ｍＬを、撮像のためｉＰＳＣ－ＣＭに加えた。撮像中、ディッシュを、５％ＣＯ２を伴う、加温した３７℃の段階的上部チャンバー（Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）内で維持した。４０×水対物レンズ倍率下でニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を使用して、カルシウム一過性を、５％電力のＬＥＤ照明を用いて、５０フレーム／秒（ｆｐｓ、露光時間２０ｍｓ）の速度で、２０秒の高速タイムラプスビデオに記録した。カルシウム一過性に対するビート速度依存性作用を除去するためのＭｙｏＰａｃｅｒフィールド刺激装置（Ｉｏｎ Ｏｐｔｉｘ；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）を使用して、０．５Ｈｚ（パルス持続時間９ｍｓ、２５Ｖ）で、ｉＰＳＣ－ＣＭをペース調整した。ビデオは、ｉＰＳＣ－ＣＭ（クラスタおよび単層）の電気結合した同期領域（クラスタおよび単層）に焦点を当て、これは、これらの領域の細胞が、最も最適なペース刺激に従い、蛍光強度の大きな変化によって表す最大のシグナル対ノイズを生じるためである。分析のために、細胞の点滅領域上に対象の長方形領域を描き、ＮＩＳ－エレメントソフトウェア（ニコン）を使用して、対象の各領域内の経時的な蛍光強度を定量化し、これにより、カルシウム一過性のトレースを得た。カスタムＥｘｃｅｌベースのプログラムを使用して、トレースを、光退色について補正し、振幅を、ベースライン最小蛍光量で割った蛍光の変化として正規化した（ΔＦ／Ｆｍｉｎ）。半自動様式では、Ｃａ２＋振幅、５０％および９０％のＣａ２＋一過性持続時間（ＣＴＤ）、５０％減衰までのピークおよび９０％減衰までのピーク、アップストローク時間、上昇速度、Ｖｍａｘなどを含む共通のカルシウム一過性パラメータを、第一の拍動についてのみ取得した場合のＣａ２＋振幅を除き、各個々のカルシウム一過性について検出し、２０秒間のトレース内の全拍動にわたって平均化した。Ｃａ２＋振幅を除くすべてのパラメータについて、２０秒間のトレース内のすべての拍動の平均は、単一のデータ点を表す。ベースライン測定値を記録する際、４００ｎＭイソプロテレノール０．５ｍｌを細胞に加え、最終濃度１００ｎＭにし、カルシウム一過性の記録を、一分毎に計１０分間取得した。ベースライン測定について上述した通り、トレースを解析した。
統計：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を、すべての統計解析に使用し、図のすべてのデータを適合させた。実用的である限り、個々のデータ点を平均値と共に示す。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。複数比較のための事後テューキー検定を用いた二方向ＡＮＯＶＡを使用した。ｐ＜０．０５を、有意であるとみなした。
実施例２４－ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法は、Ｆｌｕｏ－４ ＡＭによって測定したＡＣＭ ｉＰＳＣ－ＣＭにおける一過性持続時間および減衰時間を短縮する
カルシウム一過性分析を行い、ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法による処置が、ＡＣＭの異常なカルシウム取り扱い特徴を救済することができるかどうかを調べた。Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ色素を使用して、ＰＫＰ２－ＳｕｐＲｅｐ遺伝子療法で処置したｃ．２１４６－１Ｇ＞Ｃ ＰＫＰ２バリアントを有する患者に由来するｉＰＳＣ－ＣＭにおけるカルシウム一過性を測定した。すべてのｉＰＳＣ－ＣＭを、カルシウム一過性に対する拍率依存性の変化を排除するために、記録中に０．５Ｈｚでペース調整した。Ｃａ２＋減衰時間の延長は、ＡＲＶＣの重要な病態生理学であり、線維症の上昇およびデスモソーム変化の無菌的炎症介在性増悪などの心筋症状態への心臓組織のリモデリングをもたらしうる。さらに、Ｃａ２＋減衰時間の延長は、ＤＡＤおよびＥＡＤを誘発する、ＮＣＸ１、ＬＴＣＣ、およびＮａ＋チャネルなどの筋鞘チャネル機能の不適応を介して、不整脈電位を速めることができる。これらの研究は、ＳｕｐＲｅｐが、治療レジメンの一回の送達で不整脈電位を無事に救済したことを示した（図４０）。
実施例２５－ＤＳＰのｓｈＲＮＡノックダウン
ＴＳＡ２０１細胞を、ＤＳＰ－ＷＴおよび六つのカスタムＤＳＰ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＤＳＰ発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ＧＡＰＤＨに正規化したＤＳＰ発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。ｓｈ５（５’－ＧＣＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＡＧ ＡＧＡＡＧＡ－３’；配列番号４４）（ＲＮＡ配列５’－ＧＣＡＣＵＡＣＵＧＣＡＵＧＡＵＵＧＡＣＡ ＵＡＧＡＧＡＡＧＡ－３’；配列番号４５）は、約８８％のノックダウン効率で、未加工の値（図４１）による最強のノックダウンを有していた。
実施例２６－ＭＹＢＰＣ３のｓｈＲＮＡノックダウン
ＴＳＡ２０１細胞を、ＭＹＢＰＣ３－ＷＴおよび六つのカスタムＭＹＢＰＣ３ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＭＹＢＰＣ３発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ｓｈ４（５’－ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴ ＡＣＣＧＧＴＴＣＡＡＧＡ－３’；配列番号４６）（ＲＮＡ配列５’－ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＵＵＣＡＡＡＵＡＣＣＧＧＵＵＣＡＡＧＡ－３’；配列番号４７）は、約８２％のノックダウン効率で、未加工の値（図４２）による最強のノックダウンを有していた。
実施例２７－ＲＭＢ２０のｓｈＲＮＡノックダウン
ＴＳＡ２０１細胞を、ＲＢＭ２０－ＷＴおよび六つのカスタムＲＢＭ２０ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＲＢＭ２０発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ｓｈ５（５’－ＧＧＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＣ ＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＴ－３’；配列番号４８）（ＲＮＡ配列５’－ＧＧＵＣＡＵＵＣＡＣＵＣＡＧＵＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＵＵＵ－３’；配列番号４９）は、約８２％のノックダウン効率で、未加工の値（図４３）による最強のノックダウンを有していた。
実施例２８－ＣＡＣＮＡ１ＣのｓｈＲＮＡノックダウン
ＴＳＡ２０１細胞を、ＣＡＣＮＡ１Ｃ－ＷＴおよび六つのカスタムＣＡＣＮＡ１Ｃ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＣＡＣＮＡ１Ｃ発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ｓｈ１（５’－ＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＡ－３’；配列番号５０）（ＲＮＡ配列５’－ＧＧＡＡＣＧＡＧＵＧＧＡＡＵＡＵＣＵＣＵＵＵＣＵＣＡＵＡＡ－３’；配列番号５１）は、約９２％のノックダウン効率で、未加工の値（図４４）による最強のノックダウンを有していた。
実施例２９－ＣＡＬＭ１ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＣＡＬＭ１－ＷＴおよび六つのカスタムＣＡＬＭ１ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＣＡＬＭ１発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ２（５’－ＧＡＡＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡ－３’；配列番号２７３８）（ＲＮＡ配列５’－ＧＡＡＡＧＡＵＡＣＡＧＡＵＡＧＵＧＡＡＧＡＡＧＡＡ－３’；配列番号２７３９）は、約８９％のノックダウン効率で、未加工の値（図４５）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３０－ＣＡＬＭ２ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＣＡＬＭ２－ＷＴおよび六つのカスタムＣＡＬＭ２ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＣＡＬＭ２発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ３（５’－ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＴＴＧＡＣＴ－３’；配列番号２７４０）（ＲＮＡ配列５’－ＧＣＵＧＡＵＧＧＵＡＡＵＧＧＣＡＣＡＡＵＵＧＡＣＵ－３’；配列番号２７４１）は、約７０％のノックダウン効率で、未加工の値（図４６）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３１－ＣＡＬＭ３ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＣＡＬＭ３－ＷＴおよび六つのカスタムＣＡＬＭ３ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＣＡＬＭ３発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ６（５’－ ＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡ－３’；配列番号２７４２）（ＲＮＡ配列５’－ＧＡＵＧＡＧＧＡＧＧＵＧＧＡＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＡ－３’；配列番号２７４３）は、約８７％のノックダウン効率で、未加工の値（図４７）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３２－ＫＣＮＪ２ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＫＣＮＪ２－ＷＴおよび六つのカスタムＫＣＮＪ２ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＫＣＮＪ２発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ５（５’－ＧＴＧＣＣＧＴＡＧＣＴＣＴＴＡＴＣＴＡＧＣＡＡＡＴＧＡＡＡ－３’；配列番号２７４４）（ＲＮＡ配列５’－ＧＵＧＣＣＧＵＡＧＣＵＣＵＵＡＵＣＵＡＧＣＡＡＡＵＧＡＡＡ－３’；配列番号２７４５）は、約７４％のノックダウン効率で、未加工の値（図４８）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３３－ＣＡＳＱ２ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＣＡＳＱ２－ＷＴおよび六つのカスタムＣＡＳＱ２ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＣＡＳＱ２発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ２（５’－ＡＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＴＡ－３’；配列番号２７４６）（ＲＮＡ配列５’－ＡＡＧＧＡＡＧＣＣＵＧＵＡＵＡＵＵＣＵＵＡ－３’；配列番号２７４７）は、約８９％のノックダウン効率で、未加工の値（図４９）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３４－ＤＳＧ２ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＤＳＧ２－ＷＴおよび六つのカスタムＤＳＧ２ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＤＳＧ２発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ５（５’－ ＧＣＡＧＴＣＴＡＧＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧＧＡ－３’；配列番号２７４８）（ＲＮＡ配列５’ －ＧＣＡＧＵＣＵＡＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＵＧＧＡＧＵＡＧＧＡ－３’；配列番号２７４９）は、約７０％のノックダウン効率で、未加工の値（図５０）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３５－ＴＮＮＴ２ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＴＮＮＴ２－ＷＴおよび七つのカスタムＴＮＮＴ２ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～７）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＴＮＮＴ２発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ４（５’－ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＧ－３’；配列番号２７５０）（ＲＮＡ配列５’－ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＧ－３’；配列番号２７５０）は、約９０％のノックダウン効率で、未加工の値（図５１）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３６－ＴＰＭ１ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＴＰＭ１－ＷＴおよび六つのカスタムＴＰＭ１ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＴＰＭ１発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ２（５’－ＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧ－３’；配列番号２７５１）（ＲＮＡ配列５’－ＡＡＧＣＵＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＵＧ－３’；配列番号２７５２）は、約８５％のノックダウン効率で、未加工の値（図５２）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３７－ＬＭＮＡ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＬＭＮＡ－ＷＴおよび六つのカスタムＬＭＮＡ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＬＭＮＡ発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ５（５’－ＧＧＣＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡ－３’；配列番号２７５３）（ＲＮＡ配列５’－ＧＧＣＡＧＡＵＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＵＧＧＡＧＡＵＧＡ－３’；配列番号２７５４）は、約７５％のノックダウン効率で、未加工の値（図５３）による最強のノックダウンを有していた。
実施例３８－ＰＬＮ ｓｈＲＮＡの試験
ＴＳＡ２０１細胞を、ＬＭＮＡ－ＷＴおよび六つのカスタムＰＬＮ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１～６）または非標的化組み換えｓｈＲＮＡ対照（ｓｈＣＴ）で共トランスフェクトした。ＧＡＰＤＨに正規化したＰＬＮ発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。Ｓｈ５（５’－ＴＧＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＴＣ－３’；配列番号２７５５）（ＲＮＡ配列５’－ＵＧＵＣＵＣＵＵＧＣＵＧＡＵＣＵＧＵＡＵＣ－３’；配列番号２７５６）は、約８０％のノックダウン効率で、未加工の値（図５４）による最強のノックダウンを有していた。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］核酸構築物であって、
（ａ）細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物。
［態様２］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様１に記載の核酸構築物。
［態様３］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様１に記載の核酸構築物。
［態様４］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様１～３のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様５］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様４に記載の核酸構築物。
［態様６］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様４に記載の核酸構築物。
［態様７］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターである、態様６に記載の核酸構築物。
［態様８］レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１～７のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様９］前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、態様８に記載の核酸構築物。
［態様１０］前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、内部リボザイムエントリー配列（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、態様８または態様９に記載の核酸構築物。
［態様１１］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様１～１０のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様１２］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、態様１１に記載の核酸構築物。
［態様１３］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様１２に記載の核酸構築物。
［態様１４］前記細胞が、心筋細胞である、態様１～１３のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様１５］態様１～１４のいずれか一に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
［態様１６］先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様１７］前記先天性心疾患が、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）またはＱＴ短縮症候群（ＳＱＴＳ）である、態様１６に記載の方法。
［態様１８］前記先天性心疾患が、ＬＱＴ１である、態様１６に記載の方法。
［態様１９］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様１６～１８のいずれか一に記載の方法。
［態様２０］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様１６～１８のいずれか一に記載の方法。
［態様２１］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様１６～２０のいずれか一に記載の方法。
［態様２２］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様２１に記載の方法。
［態様２３］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様２１に記載の方法。
［態様２４］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様２１に記載の方法。
［態様２５］前記核酸構築物が、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１６～２４のいずれか一に記載の方法。
［態様２６］前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、態様２５に記載の方法。
［態様２７］前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳによって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、態様２５または態様２６に記載の方法。
［態様２８］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様１６～２７のいずれか一に記載の方法。
［態様２９］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様２８に記載の方法。
［態様３０］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様２９に記載の方法。
［態様３１］前記細胞が、心筋細胞である、態様１６～３０のいずれか一に記載の方法。
［態様３２］哺乳動物内の心細胞における活動電位持続時間（ＡＰＤ）を低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）前記哺乳動物の心細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記心細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様３３］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様３２に記載の方法。
［態様３４］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様３２に記載の方法。
［態様３５］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様３２～３４のいずれか一に記載の方法。
［態様３６］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様３５に記載の方法。
［態様３７］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様３５に記載の方法。
［態様３８］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様３７に記載の方法。
［態様３９］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様３２～３８のいずれか一に記載の方法。
［態様４０］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様３９に記載の方法。
［態様４１］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様４０に記載の方法。
［態様４２］哺乳動物におけるＬＱＴＳの一つまたは複数の症状を低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様４３］前記ＬＱＴＳが、ＬＱＴ１である、態様４２に記載の方法。
［態様４４］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様４２または態様４３に記載の方法。
［態様４５］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、態様４２または態様４３に記載の方法。
［態様４６］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様４２～４５のいずれか一に記載の方法。
［態様４７］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様４６に記載の方法。
［態様４８］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様４６に記載の方法。
［態様４９］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様４８に記載の方法。
［態様５０］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様４２～４９のいずれか一に記載の方法。
［態様５１］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様５０に記載の方法。
［態様５２］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様５１に記載の方法。
［態様５３］前記細胞が、心筋細胞である、態様４２～５２のいずれか一に記載の方法。
［態様５４］核酸構築物であって、
（ａ）細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物。
［態様５５］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、態様５４に記載の核酸構築物。
［態様５６］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様５４または態様５５に記載の核酸構築物。
［態様５７］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様５６に記載の核酸構築物。
［態様５８］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様５６に記載の核酸構築物。
［態様５９］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様５８に記載の核酸構築物。
［態様６０］レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様５４～５９のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様６１］前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、態様６０に記載の核酸構築物。
［態様６２］前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳまたはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、態様６０または態様６１に記載の核酸構築物。
［態様６３］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様５４～６２のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様６４］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様６３に記載の核酸構築物。
［態様６５］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様６４に記載の核酸構築物。
［態様６６］前記細胞が、心筋細胞である、態様５４～６５のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様６７］態様５４～６６のいずれか一に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
［態様６８］先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様６９］前記先天性心疾患が、ＬＱＴＳまたはＳＱＴＳである、態様６８に記載の方法。
［態様７０］前記先天性心疾患が、ＬＱＴ２である、態様６８に記載の方法。
［態様７１］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、態様６８～７０のいずれか一に記載の方法。
［態様７２］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様６８～７１のいずれか一に記載の方法。
［態様７３］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様７２に記載の方法。
［態様７４］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様７２に記載の方法。
［態様７５］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様７４に記載の方法。
［態様７６］前記核酸構築物が、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様６８～７５のいずれか一に記載の方法。
［態様７７］前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、態様７６に記載の方法。
［態様７８］前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳによって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、態様７６または態様７７に記載の方法。
［態様７９］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様６８～７８のいずれか一に記載の方法。
［態様８０］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様７９に記載の方法。
［態様８１］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様８０に記載の方法。
［態様８２］前記細胞が、心筋細胞である、態様６８～８１のいずれか一に記載の方法。
［態様８３］哺乳動物内の心細胞におけるＡＰＤを低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）前記哺乳動物の心細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記心細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様８４］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、態様８３に記載の方法。
［態様８５］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様８３または態様８４に記載の方法。
［態様８６］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様８５に記載の方法。
［態様８７］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様８５に記載の方法。
［態様８８］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様８７に記載の方法。
［態様８９］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様８３～８８のいずれか一に記載の方法。
［態様９０］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様８９に記載の方法。
［態様９１］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様９０に記載の方法。
［態様９２］哺乳動物におけるＬＱＴＳの一つまたは複数の症状を低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様９３］前記ＬＱＴＳが、ＬＱＴ２である、態様９２に記載の方法。
［態様９４］前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、態様９２または態様９３に記載の方法。
［態様９５］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様９２～９４のいずれか一に記載の方法。
［態様９６］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様９５に記載の方法。
［態様９７］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様９５に記載の方法。
［態様９８］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様９７に記載の方法。
［態様９９］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様９２～９８のいずれか一に記載の方法。
［態様１００］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様９９に記載の方法。
［態様１０１］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様１００に記載の方法。
［態様１０２］前記細胞が、心筋細胞である、態様９２～１０１のいずれか一に記載の方法。
［態様１０３］前記先天性心疾患の原因である一つまたは複数の変異を含有する内在性心臓ポリペプチドによって引き起こされる先天性心疾患を処置するための核酸構築物であって、
（ａ）細胞内の前記内在性心臓ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内での前記内在性心臓ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンをコードする第二のヌクレオチド配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの、前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの前記置換バージョンの発現を抑制しない、核酸構築物。
［態様１０４］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様１０３に記載の核酸構築物。
［態様１０５］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様１０４に記載の核酸構築物。
［態様１０６］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様１０４に記載の核酸構築物。
［態様１０７］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様１０６に記載の核酸構築物。
［態様１０８］レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１０３～１０７のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様１０９］前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、態様１０８に記載の核酸構築物。
［態様１１０］前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、内部リボザイムエントリー配列（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、態様１０８または態様１０９に記載の核酸構築物。
［態様１１１］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様１０３～１１０のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様１１２］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様１１１に記載の核酸構築物。
［態様１１３］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様１１２に記載の核酸構築物。
［態様１１４］前記細胞が、心筋細胞である、態様１０３～１１３のいずれか一に記載の核酸構築物。
［態様１１５］態様１０３～１１４のいずれか一に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
［態様１１６］先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記哺乳動物に、
（ａ）細胞内の前記内在性心臓ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内での前記内在性心臓ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
（ｂ）前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンをコードする第二のヌクレオチド配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの、前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの前記置換バージョンの発現を抑制しない、核酸構築物を投与することを含む、方法。
［態様１１７］前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、態様１１６に記載の方法。
［態様１１８］前記第一および第二のプロモーターが、同じである、態様１１７に記載の方法。
［態様１１９］前記第一および第二のプロモーターが、異なる、態様１１７に記載の方法。
［態様１２０］前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、態様１１９に記載の方法。
［態様１２１］前記核酸構築物が、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様１１６～１２０のいずれか一に記載の方法。
［態様１２２］前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、態様１２１に記載の方法。
［態様１２３］前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳによって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、態様１２１または態様１２２に記載の方法。
［態様１２４］前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、態様１１６～１２３のいずれか一に記載の方法。
［態様１２５］前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、態様１２４に記載の方法。
［態様１２６］前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、態様１２５に記載の方法。
［態様１２７］前記細胞が、心筋細胞である、態様１１６～１２６のいずれか一に記載の方法。

Claims (127)

  1. 核酸構築物であって、
    （ａ）細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物。
  2. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
  4. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  5. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項４に記載の核酸構築物。
  6. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項４に記載の核酸構築物。
  7. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターである、請求項６に記載の核酸構築物。
  8. レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  9. 前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、請求項８に記載の核酸構築物。
  10. 前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、内部リボザイムエントリー配列（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、請求項８または請求項９に記載の核酸構築物。
  11. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  12. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載の核酸構築物。
  13. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項１２に記載の核酸構築物。
  14. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
  16. 先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  17. 前記先天性心疾患が、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）またはＱＴ短縮症候群（ＳＱＴＳ）である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記先天性心疾患が、ＬＱＴ１である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記核酸構築物が、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳによって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
  28. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項１６～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項１６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 哺乳動物内の心細胞における活動電位持続時間（ＡＰＤ）を低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）前記哺乳動物の心細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記心細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  33. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項４０に記載の方法。
  42. 哺乳動物におけるＬＱＴＳの一つまたは複数の症状を低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＱ１ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＱ１ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  43. 前記ＬＱＴＳが、ＬＱＴ１である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
  45. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号３６に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号９に記載される配列を含む、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
  46. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 核酸構築物であって、
    （ａ）細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物。
  55. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、請求項５４に記載の核酸構築物。
  56. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項５４または請求項５５に記載の核酸構築物。
  57. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項５６に記載の核酸構築物。
  58. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項５６に記載の核酸構築物。
  59. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項５８に記載の核酸構築物。
  60. レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  61. 前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、請求項６０に記載の核酸構築物。
  62. 前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳまたはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、請求項６０または請求項６１に記載の核酸構築物。
  63. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項５４～６２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  64. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項６３に記載の核酸構築物。
  65. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項６４に記載の核酸構築物。
  66. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項５４～６５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  67. 請求項５４～６６のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
  68. 先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  69. 前記先天性心疾患が、ＬＱＴＳまたはＳＱＴＳである、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記先天性心疾患が、ＬＱＴ２である、請求項６８に記載の方法。
  71. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項６８～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記核酸構築物が、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６８～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳによって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、請求項７６または請求項７７に記載の方法。
  79. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項６８～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項６８～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 哺乳動物内の心細胞におけるＡＰＤを低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）前記哺乳動物の心細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記心細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  84. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項８３または請求項８４に記載の方法。
  86. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項８３～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項９０に記載の方法。
  92. 哺乳動物におけるＬＱＴＳの一つまたは複数の症状を低減するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）前記哺乳動物の細胞内の内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内の前記内在性ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）ＫＣＮＨ２ポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列を含む、核酸構築物であって、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの前記ＫＣＮＨ２ポリペプチドの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  93. 前記ＬＱＴＳが、ＬＱＴ２である、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記第一のヌクレオチド配列が、配列番号２７に記載される配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列が、配列番号２９に記載される配列を含む、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
  95. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項９５に記載の方法。
  98. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項９２～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記先天性心疾患の原因である一つまたは複数の変異を含有する内在性心臓ポリペプチドによって引き起こされる先天性心疾患を処置するための核酸構築物であって、
    （ａ）細胞内の前記内在性心臓ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内での前記内在性心臓ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンをコードする第二のヌクレオチド配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの、前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの前記置換バージョンの発現を抑制する、核酸構築物。
  104. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項１０３に記載の核酸構築物。
  105. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項１０４に記載の核酸構築物。
  106. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項１０４に記載の核酸構築物。
  107. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１０６に記載の核酸構築物。
  108. レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０３～１０７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  109. 前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、請求項１０８に記載の核酸構築物。
  110. 前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、内部リボザイムエントリー配列（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａ自己切断ペプチド配列によって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、請求項１０８または請求項１０９に記載の核酸構築物。
  111. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項１０３～１１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  112. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１１１に記載の核酸構築物。
  113. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項１１２に記載の核酸構築物。
  114. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項１０３～１１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  115. 請求項１０３～１１４のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ウイルス粒子。
  116. 先天性心疾患を有する哺乳動物を処置するための方法であって、前記哺乳動物に、
    （ａ）細胞内の前記内在性心臓ポリペプチドをコードする標的配列にハイブリダイズし、前記細胞内での前記内在性心臓ポリペプチドの発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子をコードする第一のヌクレオチド配列、および
    （ｂ）前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの置換バージョンをコードする第二のヌクレオチド配列を含み、前記第二のヌクレオチド配列の前記標的配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と比較して１～１３個の揺らぎ位置バリアントを含むことを除き、前記第二のヌクレオチド配列が、前記第一のヌクレオチド配列の前記標的配列と同一の標的配列を含み、前記ＲＮＡｉ分子が、前記細胞内の前記第二のヌクレオチド配列からの、前記先天性心疾患の原因である前記一つまたは複数の変異を欠く前記内在性心臓ポリペプチドの前記置換バージョンの発現を抑制する、核酸構築物を投与することを含む、方法。
  117. 前記第一のヌクレオチド配列が、第一のプロモーターに作動可能に連結され、前記第二のヌクレオチド配列が、第二のプロモーターに作動可能に連結される、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記第一および第二のプロモーターが、同じである、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記第一および第二のプロモーターが、異なる、請求項１１７に記載の方法。
  120. 前記第一のプロモーターが、Ｕ６プロモーターであり、前記第二のプロモーターが、ＣＭＶプロモーターである、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記核酸構築物が、レポーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１６～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 前記レポーターが、蛍光ポリペプチドである、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記レポーターをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡをコードする前記第二のヌクレオチド配列の下流であり、ＩＲＥＳによって前記第二のヌクレオチド配列から分けられる、請求項１２１または請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記核酸構築物が、ウイルスベクター内にある、請求項１１６～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９ベクターまたはＡＡＶ２／９ベクターである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記細胞が、心筋細胞である、請求項１１６～１２６のいずれか一項に記載の方法。
JP2023540565A 2020-12-30 2021-12-30 抑制置換遺伝子療法 Pending JP2024501882A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063132316P 2020-12-30 2020-12-30
US63/132,316 2020-12-30
US202163179083P 2021-04-23 2021-04-23
US63/179,083 2021-04-23
US202163208556P 2021-06-09 2021-06-09
US63/208,556 2021-06-09
US202163270388P 2021-10-21 2021-10-21
US63/270,388 2021-10-21
PCT/US2021/065682 WO2022147249A1 (en) 2020-12-30 2021-12-30 Suppression-replacement gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024501882A true JP2024501882A (ja) 2024-01-16

Family

ID=82261115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023540565A Pending JP2024501882A (ja) 2020-12-30 2021-12-30 抑制置換遺伝子療法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240093202A1 (ja)
EP (1) EP4271390A1 (ja)
JP (1) JP2024501882A (ja)
KR (1) KR20230126210A (ja)
AU (1) AU2021414237A1 (ja)
CA (1) CA3205602A1 (ja)
IL (1) IL303978A (ja)
WO (1) WO2022147249A1 (ja)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7537928B2 (en) * 2003-08-22 2009-05-26 Masonic Medical Research Laboratory Mutations in ion channel proteins associated with sudden cardiac death
US20050142591A1 (en) * 2003-10-29 2005-06-30 Ackerman Michael J. Method of genetic testing in heritable arrhythmia syndrome patients
US7498316B2 (en) * 2004-04-06 2009-03-03 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using RNA interference
AU2005300688B2 (en) * 2004-11-03 2012-02-02 Almac Diagnostics Limited Transcriptome microarray technology and methods of using the same
ITMI20051047A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Irccs Fond Salvatore Maugeri C Mutazioni associate alla sindrome del qt lungo e loro uso diagnostico
WO2012149406A2 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Assessing and treating humans with long qt syndrome
EP2833923A4 (en) * 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021414237A9 (en) 2024-10-10
EP4271390A1 (en) 2023-11-08
IL303978A (en) 2023-08-01
KR20230126210A (ko) 2023-08-29
WO2022147249A9 (en) 2023-03-02
CA3205602A1 (en) 2022-07-07
WO2022147249A1 (en) 2022-07-07
US20240093202A1 (en) 2024-03-21
AU2021414237A1 (en) 2023-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10828346B2 (en) Compositions and methods for modulating stem cells and uses thereof
EP3265568B1 (en) Gene augmentation therapies for inherited retinal degeneration caused by mutations in the prpf31 gene
CN111630170A (zh) 眼部疾病的细胞模型及用于眼部疾病的疗法
CN112153990A (zh) 用于常染色体显性疾病的基因编辑
TW202421790A (zh) 工程化dna結合蛋白
JP2009213490A (ja) 骨及び／又は関節疾患関連遺伝子
US20200308582A1 (en) Kcnk3-based gene therapy of cardiac arrhythmia
JP6960396B2 (ja) 分裂終了細胞の細胞分裂を誘発するための方法
US20210180023A1 (en) Cardiac repair by reprogramming of adult cardiac fibroblasts into cardiomyocytes
JP2021510529A (ja) ラミノパチーを処置するためのｌｉｎｃ複合体の破壊
JP2010507595A (ja) プロテオグリカンに関連する病態生理学的症状の治療におけるｓｏｘ９機能の阻害
JP2024501882A (ja) 抑制置換遺伝子療法
JP2021101713A (ja) 筋強直性ジストロフィーの処置
WO2020251887A1 (en) Compositions and methods for the treatment of dba using gata1 gene therapy
CN116583292A (zh) 抑制-置换基因疗法
AU2016309948A1 (en) Connexin 45 inhibition for therapy
US20070036787A1 (en) Insulin-induced gene as therapeutic target in diabetes
WO2023212643A1 (en) Method for expressing a muscle-specific gene and cassettes for same
JP2004147642A (ja) 新規タンパク質およびその用途
JP2003171316A (ja) 細胞分化促進因子ｋｋｌｆをコードする核酸含有脂肪蓄積促進剤

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231113