CN116583292A - 抑制-置换基因疗法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于治疗患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如先天性长QT综合征)的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于产生核酸并使用所述核酸治疗患有先天性疾病的哺乳动物的方法和材料，其中所述核酸可以抑制所述哺乳动物中的突变疾病相关等位基因的表达，同时提供不含有疾病相关突变的置换cDNA。
Description
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年12月30日提交的美国临时申请序列号63/132,316、于2021年4月23日提交的美国临时申请序列号63/179,083、于2021年6月9日提交的美国临时申请序列号63/208,556和于2021年10月21日提交的美国临时申请序列号63/270,388的优先权的权益。先前申请的公开内容被视为本申请的公开内容的一部分(并且通过引用并入本申请的公开内容中)。
技术领域
本文档涉及用于治疗患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如先天性长QT综合征)的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于产生核酸并使用所述核酸的方法和材料，所述核酸可以施用于患有先天性疾病的哺乳动物，并且可以抑制所述哺乳动物中的突变疾病相关等位基因的表达，同时提供不含有疾病相关突变的置换cDNA。
背景技术
先天性长QT综合征(LQTS)是一种常染色体显性病症，其特征在于与心电图(ECG)上QT间隔延长相关的心肌复极化延迟。患有LQTS的患者具有增加的尖端扭转型晕厥/癫痫发作和心脏性猝死(SCD)的风险。LQTS的患病率为约1/2000，并且在不治疗的情况下，较高风险患者的估计的10年死亡率为50％(Schwartz等人,《循环(Circulation)》,120:1761-1767(2009)；以及Schwartz和Ackerman,《欧洲心脏杂志(Eur.Heart J.)》,34:3109-3116(2013))。
LQTS是由心脏离子通道中的病原性变体或其相互作用的调节蛋白引起的(Giudicessi等人,《心血管医学趋势(Trends Cardiovasc.Med.)》,28:453-464(2018))。1型LQTS(LQT1)是LQTS的最常见形式，占病例的约35％(Ackerman等人,《心律学(HeartRhythm.)》,8:1308-1339(2011))。LQT1是由KCNQ1中的功能丧失变体引起的，所述KCNQ1编码Kv7.1电压门控钾通道的α亚基，所述钾通道负责心脏动作电位复极化期间的缓慢延迟的整流器电流(IKs)。因为KCNQ1编码的α-亚基在Kv7.1通道组装期间四聚化，所以病原性错义变体通常由于对从未受影响的等位基因翻译的野生型(WT)亚基的干扰而表现出显性负效应。LQTS的另一种常见形式是LQT2，其占病例的约30％。在KCNH2编码的IKr(Kv11.1)钾通道中具有LQT2宿主功能丧失突变的患者，所述钾通道与KCNQ1一样在心脏动作电位时程(APD)中起作用(Tester等人,《心律学》,2(5):507-517(2005)；Giudicessi等人,《心血管医学趋势》,28:453-464(2018)；以及Ackerman等人,《心律学》,8:1308-1339(2011))。KCNQ1或KCNH2中分别导致功能获得和IKs或IKr电流密度的异常增加的病原性变体可能引起短的QT综合征(SQTS)。LQTS的第三最常见形式是LQT3，其占病例中的约10％。在SCN5A编码的INa(Nav1.5)钠通道中具有LQT3宿主功能获得突变的患者，所述钾通道也在心脏APD中起作用(Tester等人,《美国心脏病学会杂志.电生理学(J.Am.Coll.Cardiol.EP)》,4:569-579(2018))。SCN5A中导致功能丧失和INa降低的病原性变体可能引起布鲁格达综合征(Brugadasyndrome)(Wilde和Amin,《美国心脏病学会杂志.电生理学》,4:569-579(2018))。
用于管理LQTS的当前疗法包含提供第一线治疗的β阻断剂以及更具侵入性的疗法，如左侧心交感神经切除术(LCSD)或心脏复律除颤器(ICD)的植入。然而，这些疗法可能具有局限性，包含不顺从性、突破性心脏事件或感染(Rohatgi等人,《美国心脏病学会杂志(J.Am.Coll.Cardiol.)》,70:453-462(2017)；Priori等人,《心律学》,10:1932-1963(2013)；Al-Khatib等人,《心律学》,15:e190-e252(2018)；Schwartz等人,《循环》,109:1826-1833(2004)；Bos等人,《循环：心律失常与电生理学杂志(Circ.Arrhythm.Electrophysiol.)》,6:705-711(2013)；Schwartz等人,《循环》,122:1272-1282(2010)；Horner等人,《心律学》,7:1616-1622(2010)；以及Kleemann等人,《循环》,115:2474-2480(2007))，并且所述疗法不治疗潜在的病原性底物。
如小干扰RNA(siRNA)等RNA干扰(RNAi)技术利用内源性基因沉默来敲低基因表达。克服LQT2中的显性阴性KCNH2变体的尝试已经使用等位基因特异性siRNA来选择性地敲低突变等位基因(Lu等人,《心律学》,10:128-136(2013)；以及Matsa等人,《欧洲心脏杂志》,35:1078-1087(2014))。然而，这种方法的最佳可能结果将是单倍体不足的。另外，将有必要针对每个独特的LQT2致病性变体工程化并验证单独的siRNA，这在KCNQ1、KCNH2和SCN5A中将是不切实际的，因为存在数百个LQT1致病性变体、LQT2致病性变体和LQT3致病性变体(Landrum等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,46:D1062-D1067(2018))。
发明内容
本文档至少部分地基于开发用于LQT1的双组分“抑制和置换”KCNQ1(KCNQ1-SupRep)基因疗法方法，其中KCNQ1 shRNA用于抑制内源性KCNQ1等位基因的表达，并且KCNQ1的密码子改变的“shRNA-免疫”拷贝用于基因置换。如本文所述，“KCNQ1-SupRep”系统成功地用于挽救诱导性多能干细胞(iPSC)心肌细胞中的延长的动作电位时程，所述iPSC心肌细胞源自来自具有独特的LQT1致病性KCNQ1变体的四名患者的成纤维细胞或PBMC。因此，本文档描述了在LQT1中成功的临床前杂合基因疗法，并且证明本文提供的系统能够完全挽救KCNQ1功能。从理论上讲，KCNQ1-SupRep基本上可适用于患有LQT1的任何患者，因为它靶向整个KCNQ1基因而不是特异性突变。
本文档还至少部分地基于开发用于LQT2的“抑制和置换”KCNH2(KCNH2-SupRep)基因疗法方法，其中KCNQ2 shRNA用于抑制内源性KCNH2等位基因的表达，并且KCNH2的密码子改变的“shRNA-免疫”拷贝用于基因置换。
另外，本文档至少部分地基于开发用于LQT3的“抑制和置换”SCN5A(SCN5A-SupRep)基因疗法方法，其中SCN5A shRNA用于抑制内源性SCN5A等位基因的表达，并且SCN5A的密码子改变的“shRNA-免疫”拷贝用于基因置换。
与未治疗的LQTS患者心脏的功能相比，使用本文所述的方法和材料具有减少心肌复极化时间(例如，通过缩短APD)的能力可以允许临床医生和患者(例如，LQTS患者)实现更接近地类似于健康心脏的功能的心脏功能。在一些情况下，使用本文所述的方法和材料具有减少LQTS患者的心肌复极化时间的能力可以允许临床医生和患者减轻LQTS症状和/或逆转LQTS进展。例如，向心脏组织递送本文提供的核酸或病毒构建体可以挽救心脏缺陷并且增加LQTS患者的存活率。
在一方面，本文档的特征在于核酸构建体。所述核酸构建体可以包含(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包含与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码所述KCNQ1多肽的所述第二核苷酸序列(例如，编码所述KCNQ1多肽的cDNA)的下游，并且可以通过内部核酶进入序列(IRES)或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种病毒颗粒，所述病毒颗粒含有本文所述的核酸构建体(例如，前述段落的核酸构建体)。
在另一方面，本文档的特征在于一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。所述先天性心脏病可以是长QT综合征(LQTS)或短QT综合征(SQTS)。所述先天性心脏病可以是LQT1。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码所述KCNQ1多肽的所述第二核苷酸序列(例如，编码所述KCNQ1多肽的cDNA)的下游，并且可以通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。病毒可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种用于减少哺乳动物体内的心脏细胞中的动作电位时程(APD)的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的心脏细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述心脏细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。
在另一方面，本文档的特征在于一种用于减少哺乳动物的LQTS的一种或多种症状的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。LQTS可以是LQT1。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:36中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:9中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种核酸构建体，所述核酸构建体可以包含(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:27中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:29中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码所述KCNH2多肽的所述第二核苷酸序列(例如，编码所述KCNH2多肽的cDNA)的下游，并且可以通过IRES或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种病毒颗粒，所述病毒颗粒含有本文所述的核酸构建体(例如，前述段落中描述的核酸构建体)。
在仍另一方面，本文档的特征在于一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。所述先天性心脏病可以是LQTS或SQTS。所述先天性心脏病可以是LQT2。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:27中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:29中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码所述KCNH2多肽的所述第二核苷酸序列(例如，编码所述KCNH2多肽的cDNA)的下游，并且可以通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种用于减少哺乳动物体内的心脏细胞中的APD的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的心脏细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述心脏细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:27中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:29中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。
在又另一方面，本文档的特征在于一种用于减少哺乳动物的LQTS的一种或多种症状的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。LQTS可以是LQT2。所述第一核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:27中所示的序列、基本上由其组成或由其组成，并且所述第二核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:29中所示的序列、基本上由其组成或由其组成。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的或可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种用于治疗由内源性心脏多肽引起的先天性心脏病的核酸构建体，所述内源性心脏多肽含有引起所述先天性心脏病的一个或多个突变，其中所述构建体可以包含(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的所述内源性心脏多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性心脏多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源性心脏多肽的置换形式，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源心脏多肽的置换形式在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的，或者所述第一启动子和所述第二启动子可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且可以通过IRES或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
在另一方面，本文档的特征在于一种病毒颗粒，所述病毒颗粒含有本文所述的核酸构建体(例如，前述段落中描述的核酸构建体)。
在仍另一方面，本文档的特征在于一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法。所述方法可以包含向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体含有(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的所述内源性心脏多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性心脏多肽的表达，以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源性心脏多肽的置换形式，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源心脏多肽的置换形式在所述细胞内的表达。所述第一核苷酸序列可以与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列可以与第二启动子可操作地连接。所述第一启动子和所述第二启动子可以是相同的，或者所述第一启动子和所述第二启动子可以是不同的。所述第一启动子可以是U6启动子，并且所述第二启动子可以是CMV启动子。所述核酸构建体可以进一步包含编码报告基因的核苷酸序列。所述报告基因可以是荧光多肽。编码所述报告基因的所述核苷酸序列可以位于编码cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且可以通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。所述核酸构建体可以在病毒载体内。所述病毒载体可以是AAV载体(例如，AAV血清型9载体或AAV2/9载体)。所述细胞可以是心肌细胞。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似于或等效于本文所述的那些方法和材料的方法和材料可以用于实践本发明，但是下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
在下文的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征、目的和优点将根据说明书和附图，并且根据权利要求书而变得显而易见。
附图说明
图1A是示例性KCNQ1-P2A AAV构建体的图，并且图1B示出了构建体的DNA序列(SEQID NO:1029)。图1C示出了KCNQ1靶序列(sh#5；SEQ ID NO:102)、对应的shIMM KCNQ1序列(SEQ ID NO:103)、野生型KCNQ1核苷酸序列(SEQ ID NO:1030，其中sh#5序列加下划线)、对应的shIMM KCNQ1核苷酸序列(SEQ ID NO:1031，其中shIMM序列加下划线)和KCNQ1氨基酸序列(SEQ ID NO:1032)。
图2A是示例性KCNH2-P2A AAV构建体的图，并且图2B示出了构建体的DNA序列(SEQID NO:1033)。还示出了经编码的AmpR氨基酸序列(SEQ ID NO:2784)。图2C示出了KCNH2靶序列(RAB_sh#4；SEQ ID NO:27)、对应的shIMM KCNH2序列(SEQ ID NO:29)、野生型KCNH2核苷酸序列(SEQ ID NO:1034，其中RAB_sh#4序列加下划线)、对应的shIMM KCNH2核苷酸序列(SEQ ID NO:1035，其中shIMM序列加下划线)和KCNH2氨基酸序列(SEQ ID NO:1036)。
图3A是示例性SCN5A-P2A Lenti构建体的图，并且图3B示出了构建体的DNA序列(SEQ ID NO:1041)。图3C示出了SCN5A靶序列(sh#4；SEQ ID NO:30)、对应的shIMM SCN5A序列(SEQ ID NO:32)、野生型SCN5A核苷酸序列(SEQ ID NO:1042，其中sh#5序列加下划线)、对应的shIMM SCN5A核苷酸序列(SEQ ID NO:1043，其中shIMM序列加下划线)和SCN5A氨基酸序列(SEQ ID NO:1044)。
图4A是示例性PKP2-P2A AAV构建体的图，并且图4B示出了构建体的DNA序列(SEQID NO:1037)。图4C示出了PKP2靶序列(sh#36；SEQ ID NO:52)、对应的shIMM PKP2序列(SEQID NO:993)、野生型PKP2核苷酸序列(SEQ ID NO:1038，其中sh#5序列加下划线)、对应的shIMM PKP2核苷酸序列(SEQ ID NO:1039，其中shIMM序列加下划线)和PKP2氨基酸序列(SEQ ID NO:1040)。
图5A-5C示出了从用于测试KCNQ1-SupRep载体的KCNQ1 shRNA的实验获得的结果。将TSA201细胞用KCNQ1-WT和各种KCNQ1 shRNA或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。图5A包含绘制用四种商业shRNA(sh#1-4)共转染、相对于GAPDH归一化、通过qRT-PCR测量的细胞的KCNQ1表达的图(顶部)。还示出了KCNQ1与丝切蛋白管家对照的代表性蛋白质印迹的图像(底部)。图5B是绘制了蛋白质印迹相对像素密度的ImageJ定量的图。选择KCNQ1 sh#4作为最终的KCNQ1-SupRep基因疗法载体，并且在本文所述的进一步研究中被称为shKCNQ1。从三个独立实验获得结果和代表性图像(定义为每个实验从开始到结束在不同的周进行三次相同的重复，其中每次运行每个处理组一次生物重复)。图示出了平均值±S.D。还使用单向ANOVA和事后图基检验(Tukey's test)进行多重比较。*p<0.05。图5C是绘制了在用各种定制的shRNA(sh#5-sh#8)共转染、相对于GAPDH归一化、使用qPCR确定的TSA201细胞中的KCNQ1的敲低的图。
图6A和6B描绘了针对KCNQ1抑制-置换(KCNQ1-SupRep)载体的设计。图6A示出了shKCNQ1(SEQ ID NO:7)的靶序列部分与KCNQ1-WT cDNA(SEQ ID NO:8)(顶部)和“shRNA-免疫”KCNQ1(KCNQ1-shIMM，底部)(SEQ ID NO:9)的序列比对，其包含10个摆动碱基同义变体(加下划线)。所示的氨基酸序列是KCNQ1 p.V458-P469(c.1372-1407,NM_000218.2)(SEQID NO:10)。图6B是代表性KCNQ1-SupRep载体图的示意图。(U6)U6启动子；(CMV)巨细胞病毒启动子；(MHC)α-肌球蛋白重链启动子；(MLC)肌球蛋白轻链2启动子；(TnC)心肌肌钙蛋白C启动子；(TnT)心肌肌钙蛋白T启动子；(E)肌集钙蛋白-2心肌细胞特异性转录顺式调节增强子基序；(IRES)内部核糖体进入位点；和(CFP)青色荧光蛋白。
图7A和7B显示在用KCNQ1-WT或KCNQ1-shIMM和shCT、shKCNQ1或KCNQ1-SupRep共转染的TSA201细胞中，shKCNQ1敲低KCNQ1-WT但不敲低KCNQ1-shIMM。图7A是绘制了通过定量KCNQ1-WT(白色)和KCNQ1-shIMM(灰色)的等位基因特异性qRT-PCR测量的相对于GAPDH归一化的相对KCNQ1表达的图(顶部)。结果用KCNQ1的蛋白质印迹(底部)来证实，其中丝切蛋白作为管家对照。图7B是绘制了蛋白质印迹像素密度的ImageJ定量的图。从三个独立实验获得结果和代表性图像(定义为每个实验从开始到结束在不同的周进行三次相同的重复，其中每次运行每个处理组一次生物重复)。两个图均示出了平均值±S.D。对于相对KCNQ1，在图7A和图7B中使用单向ANOVA和事后图基检验进行多重比较。对于在图7A中用KCNQ1-SupRep处理的样品，使用未配对的双尾学生t检验来比较KCNQ1-WT与KCNQ1-shIMM相比的比例(竖直括号)。*p<0.05。
图8是绘制了相对KCNQ1水平的图，指示由shKCNQ1和KCNQ1-SupRep抑制和置换KCNQ1-WT是剂量依赖性的。将TSA201细胞用100fmol KCNQ1-WT和一定范围(0-300fmol)的shCT、shKCNQ1或KCNQ1-SupRep共转染。通过等位基因特异性qRT-PCR测量KCNQ1表达并且将其相对于GAPDH归一化。标志物表示总KCNQ1。对于KCNQ1-SupRep处理，当KCNQ1-WT和KCNQ1-shIMM两者同时存在时，示出了KCNQ1-WT(浅灰色阴影)和KCNQ1-shIMM(深灰色阴影)的等位基因特异性比例。
图9是绘制了在KCNQ1-SupRep的两种组分激活期间的相对KCNQ1水平的图，显示shKCNQ1和KCNQ1-shIMM两者以基本相同的速率激活。将TSA201细胞用100fmol KCNQ1-WT和100fmol的shCT、shKCNQ1、KCNQ1-shIMM或KCNQ1-SupRep共转染，并且在0小时至72小时的不同时间点收获RNA。通过等位基因特异性qRT-PCR测量KCNQ1表达并且将其相对于GAPDH归一化。标志物表示总KCNQ1。对于KCNQ1-SupRep处理，当KCNQ1-WT和KCNQ1-shIMM两者同时存在时，示出了KCNQ1-WT(浅灰色阴影)和KCNQ1-shIMM(深灰色阴影)的等位基因特异性比例。与用KCNQ1-WT和KCNQ1-SupRep处理的细胞相比，用KCNQ1-WT和shCT处理的细胞具有几乎相同的总KCNQ1，然而在KCNQ1-SupRep中，KCNQ1-WT(浅灰色阴影)的比例被强烈地抑制，而KCNQ1-shIMM(深灰色阴影)的比例变成存在的KCNQ1的主要形式。
图10A-10C示出了用KCNQ1-WT、KCNQ1-shIMM或KCNQ1-变体和Kv7.1β-亚基KCNE1共转染的TSA201细胞中的IKs的膜片钳分析。图10A示出了所示构建体的代表性电压钳IKs迹线，其由-80mV的保持电位和-40mV至+80mV的测试电位以10mV的增量在4秒的持续时间内确定。KCNQ1-shIMM产生WT IKs电流(顶部)。KCNQ1-Y171X、KCNQ1-V254M和KCNQ1-I567S不产生IKs电流(底部)。图10B是绘制了经转染的细胞中的峰值电流密度的图。误差条表示平均值的标准误差(S.E.M.)。图10C是绘制了在+80mV去极化步骤处的峰值电流密度的图。误差条表示标准偏差(S.D.)。还使用单向ANOVA和事后图基检验进行多重比较。*p<0.05。
图11是一系列代表性图像，其示出了用KCNQ1-WT、KCNQ1-shIMM或KCNQ1-变体转染的TSA201细胞的免疫荧光。KCNQ1-shIMM和KCNQ1-WT两者均运输至细胞膜。KCNQ1-Y171X导致过早的终止密码子并且没有表达的蛋白质，而KCNQ1-V254M恰当地运输至细胞膜。KCNQ1-I567S产生可检测的蛋白质，但是似乎处于与qPCR和蛋白质印迹结果一致的较低表达水平。使用DAPI来染色细胞核KCNQ1(绿色)，并且合并。从三个独立实验获得代表性图像(定义为从开始到结束在不同的周进行本实验的三个相同重复，其中每次运行每个处理组一次生物重复)。比例尺＝20μm。
图12包含图(顶部)和蛋白质印迹(底部)，其显示KCNQ1-SupRep敲低引起LQT1疾病的KCNQ1变体(包含无义变体和错义变体两者)，并且用KCNQ1-shIMM置换变体。将TSA201细胞用KCNQ1-WT或KCNQ1-变体和shCT、shKCNQ1或KCNQ1-SupRep共转染。shKCNQ1以变体独立性方式敲低KCNQ1。KCNQ1-SupRep通过shKCNQ1敲低KCNQ1变体并且表达KCNQ1-shIMM，其是敲低免疫的。图12的顶部处的图显示使用等位基因特异性qRT-PCR检测到的KCNQ1-WT/变体和KCNQ1-shIMM的比例表达，以测量KCNQ1-WT/变体(白色)和KCNQ1-shIMM(灰色)。总体KCNQ1表达(非等位基因特异性)通过用丝切蛋白作为管家对照的蛋白质印迹来验证(图12，底部)。从三个独立实验获得结果和代表性图像(定义为每个实验从开始到结束在不同的周进行三次相同的重复，其中每次运行每个处理组一次生物重复)。图示出了平均值±S.D。对于相对KCNQ1，对每个KCNQ1变体进行多重比较的单独的单向ANOVA和事后图基检验，以比较三种处理并避免变体之间的外来比较。在用KCNQ1-SupRep处理的样品中，使用未配对的双尾学生t检验来比较KCNQ1-WT与KCNQ1-shIMM相比的比例(竖直括号)。*p<0.05。
图13A-13D示出了源自患有LQT1的四名患者的iPSC、不相关的健康对照和从LQT1患者iPSC中的两个LQT1患者iPSC产生的两个CRISPR-Cas9校正的等基因对照iPSC(KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl)的质量控制。图13A示出了源自患有LQT1的患者(中间)、源自不相关的健康对照(顶部)和源自等基因对照(底部)的iPSC中的LQT1致病性KCNQ1变体的桑格测序(Sanger sequencing)确认。图13B-13D示出了针对所有iPSC系完成的代表性质量控制研究，包含正常核型(图13B)、具有正常形态的iPSC集落的明场图像(图13C)以及对于多能性标志物(包含DAPI核染色、Tra-1-60或SSEA-4、Nanog或Oct-4)的免疫荧光显微术和合并图像(图13D)。比例尺＝20μM。(spl)剪接；(*)在CRISPR-Cas9校正期间引入沉默变体，以防止在成功编辑经转染的靶细胞之后再引入双链断裂。
图14包含示出了源自患有KCNQ1-V254M介导的LQT1的患者的iPSC-CM在用慢病毒shCT或KCNQ1-SupRep转导一周之后的免疫荧光的代表性图像。将患者源性iPSC-CM用三种单独的抗体染色，以证明(1)心肌细胞(心脏肌钙蛋白T，CTNT)的存在，(2)由如shCT中的turboGFP报告基因(GFP)或由KCNQ1-SupRep中的CFP报告基因指示的慢病毒转导，以及(3)KCNQ1的存在，内源性或作为KCNQ1-SupRep治疗的结果。结果显示，高纯度的心肌细胞群体用慢病毒shCT或KCNQ1-SupRep均匀地转导。对于shCT，KCNQ1的染色很弱，但是当细胞用KCNQ1-SupRep处理时，KCNQ1染色是明亮的，这指示稳健的表达。将细胞用DAPI复染用于核染色。图示出了来自一个LQT1变体(KCNQ1-V254M)的iPSC-CM的代表性图像。源自不相关对照和其它三个LQT1变体(KCNQ1-Y171X、-I567S和-A344A/spl)的iPSC-CM的免疫荧光结果见于图15A-15D。比例尺50μm。
图15A-15D示出了来自图14中未示出的iPSC-CM的免疫荧光图像，包含不相关对照(图15A)和三个LQT1变体(分别是KCNQ1-Y171X、-I567S和-A344A/spl；图15B、15C和15D)。在用慢病毒shCT或KCNQ1-SupRep转导一周之后获得免疫荧光图像。将患者源性iPSC-CM用三种单独的抗体染色，以证明(1)心肌细胞(心脏肌钙蛋白T；CTNT)的存在，(2)由如shCT中的turboGFP报告基因(KCNQ1-SupRep中的GFP或CFP)指示的慢病毒转导，以及(3)KCNQ1的存在，内源性或作为KCNQ1-SupRep治疗的结果。结果示出了用慢病毒shCT或KCNQ1-SupRep均匀地转导的高纯度心肌细胞群体。在shCT中，KCNQ1的染色很弱，但是在用KCNQ1-SupRep处理中，KCNQ1染色是明亮的并且指示稳健的表达。将细胞用DAPI复染用于核染色。比例尺＝50μm。
图16A和16B显示，与shCT相比，在用含有KCNQ1-SupRep的慢病毒处理的LQT1iPSC-CM中，动作电位时程(APD)缩短。图16A包含一系列代表性迹线，其示出了未处理的不相关的健康对照以及用shCT或KCNQ1-SupRep处理的KCNQ1-Y171X、KCNQ1-V254M、KCNQ1-I567S和KCNQ1-A344A/spl iPSC-CM的以1Hz起搏的三个连续的FluoVoltTM电压染料光学动作电位。图16B包含绘制了未处理的不相关的健康对照以及用shCT或KCNQ1-SupRep处理的KCNQ1-Y171X、KCNQ1-V254M、KCNQ1-I567S和KCNQ1-A344A/spl iPSC-CM的APD90和APD50值的一系列图。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。示出了测量总数(n)。盒形图示出了中值和四分位数间距，其中晶须延伸至最小值和最大值。基线APD90和APD50值是通过单向ANOVA和事后邓尼特检验(Dunnett'stest)来评估的，从而将用shCT处理的每个KCNQ1变体与未处理的不相关对照进行比较(表5)。对于每个变体，分别在APD90和APD50水平下，通过未配对的双尾学生t检验评估与用shCT处理相比由于KCNQ1-SupRep导致的APD缩短。*p<0.0001。
图17A和17B显示，CRISPR-Cas9校正的等基因对照充当心脏APD的“完美”校正的标志物。在从四个LQT1 iPSC中的两个LQT1 iPSC(KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl)产生的等基因对照iPSC-CM中进行心脏APD的FluoVoltTM电压染料测量。用shCT或KCNQ1-SupRep处理的数据在此相对于图16A和16B没有变化。两种等基因对照iPSC-CM均具有比用shCT处理的LQT1 iPSC-CM显著更短的APD90和APD50，这表明KCNQ1中的单个病原性LQT1变体的校正能够在体外挽救疾病表型。如同不相关对照，对等基因对照进行未经处理的测量，以便为正常APD提供最纯的信号。用KCNQ1-SupRep处理LQT1 iPSC-CM导致APD缩短，但是缩短程度是可变的。对于KCNQ1-V254M，KCNQ1-SupRep对延长的APD90校正不足并且对APD50校正过度。在KCNQ1-A344A/spl中，实现了APD90的理想校正并与等基因对照APD90相匹配，但是也发生了APD50的过度校正。图17A包含示出了以1Hz起搏的三个连续的动作电位的代表性迹线。图17B包含绘制了未处理的等基因对照以及用shCT或KCNQ1-SupRep处理的KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl iPSC-CM的APD90和APD50值的一对图。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。示出了测量总数(n)。盒形图示出了中值和四分位数间距，其中晶须延伸至最小值和最大值。将APD90的所有对和APD50的所有对进行比较的单向ANOVA和事后图基检验用于每个所测试的KCNQ1变体。*p<0.0001，除非由图中的特定p值指示。
图18A-18D显示，iPSC-CM 3D类器官培养系统的使用可以获得与在标准合胞体单层培养中获得的结果类似的结果。为了评估在3D类器官或合胞体单层中的培养是否产生与单层培养类似的发现，将来自患有LQT1(KCNQ1-Y171X)的四名患者之一的iPSC-CM解离并铺板到含有厚的胶原的圆形模具中以形成球状体。在2-3天之后，iPSC-CM在3D中形成强搏动合胞体，并且用作此研究的类器官模型。将类器官用KCNQ1-SupRep、shCT处理，或保持未处理作为对照。病毒转导七天后，通过免疫荧光或FluoVoltTM电压染料测定类器官。图18A是悬浮在24孔培养板中的培养基中的搏动iPSC-CM类器官的图像，其中插图中示出了放大图像。图18B包含使用心肌细胞标志物心脏肌钙蛋白T(CTNT；顶部)以及如shCT中的turboGFP报告基因(GFP；中间)或KCNQ1-SupRep中的CFP报告基因(底部)指示的慢病毒转导标志物来固定、冷冻切片并染色以进行免疫荧光的类器官的代表性图像。图18C是未处理的LQT1类器官或用KCNQ1-SupRep处理的LQT1类器官中的FluoVoltTM电压染料的代表性迹线。图18D是绘制了来自KCNQ1-Y171X iPSC-CM的未处理的和经KCNQ1-SupRep处理的类器官的总体APD90和APD50值的图。*p<0.0001。
图19A-19F提供了LQT1和LQT2转基因兔表型的概述。图19A示出了KCNQ1-编码的钾通道亚基(左)和KCNH2-编码的钾通道亚基多肽(右)以及转基因构建体(底部)中的病原性变体(KCNQ1-Y315S和KCNH2-G628S)的示意图。图19B包含示出了野生型(WT)兔、LQT1兔与LQT2兔之间的QT间隔差异的代表性心电图迹线。图19C是示出了WT兔与LQT1兔或LQT2兔之间的QT间隔持续时间的显著差异的条形图。图19D示出了通过短-长-短序列引发的经雌二醇处理的LQT2兔的自发性尖端扭转型室性心动过速(TdP)。图19E包含与来自WT兔的心肌细胞相比，在LQT1兔和LQT2兔心肌细胞中表现出延长的动作电位时程的代表性细胞心脏动作电位迹线。图19F示出了从WT兔、LQT1兔和LQT2兔心脏分离的心肌细胞中的IKs和IKr电流的IV曲线，表明LQT1兔中的IKs的损失以及LQT2兔中的IKr的损失。
图20A-20C显示KCNH2-G604S和KCNH2-N633S iPSC系的产生和确认。图20A是核型的图像，显示每个克隆具有针对其相应性别的正常核型。图20B是示出了来自用于研究的患者细胞系中的每个患者细胞系的iPSC集落的相衬光图像的图像。图20C含有专利细胞系的代表性桑格测序色谱图。框指示相关密码子，并且星指示确切的所关注核苷酸。比例尺＝50μm。
图21是示出了p.G604S克隆#1、p.G604S克隆#2、p.N633S克隆#1和p.N633S克隆#2的免疫细胞化学的图像。证明每个系的相应克隆的每个克隆表达Nanog和SSEA4多能性标志物。比例尺＝20μm。
图22是绘制了使用qPCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的KCNH2的敲低的图。
图23是绘制了使用CRISPR-Cas9校正的等基因对照作为用于校正N633S iPSC-CM和由LQT2 iPSC(N633S)产生的等基因对照iPSC-CM中的心脏APD的标志物的FluoVoltTM研究的结果的图。对于用shCT处理的等基因对照和对于用shCT或KCNH2-SupRep处理的KCNH2-N633S变体，确定APD90B和APD50B值。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点，并且绘制Bazett校正的APD90B和APD50B值。指示测量总数(n)和中值(水平黑线)。使用将APD90B的所有对和APD50B的所有对进行比较的单向ANOVA和事后图基检验。
图24是绘制了在N633S iPSC-CM和由LQT2 iPSC(N633S)产生的等基因对照iPSC-CM中的心脏APD的FluoVoltTM电压染料测量结果的图。示出了未处理(UT)KCNH2-N633S变体、经SupRep处理的等基因对照和未处理(UT)等基因对照的APD90B和APD50B值。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。示出了Bazett校正的APD90B和APD50B值，并且指示测量总数(n)。点图示出了中值(水平黑线)。使用将APD90B的所有对和APD50B的所有对进行比较的单向ANOVA和事后图基检验。
图25是绘制了G604S iPSC-CM中的心脏APD的FluoVoltTM电压染料测量结果的图。示出了用shCT处理的KCNH2-G604S变体和用KCNH2-SupRep处理的KCNH2-G604S变体的APD90和APD50值。与用shCT处理的LQT2 iPSC-CM相比，用KCNH2-SupRep处理LQT2 iPSC-CM引起显著的APD90和APD50缩短。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。示出了测量总数(n)。点图示出了中值(水平黑线)。使用将APD90B的所有对和APD50B的所有对进行比较的学生t检验。
图26是绘制了用shCT(1)和KCNH2-SupRep(2)处理的KCNH2-G604S变体或用shCT(3)处理的CRISPR-Cas9校正的等基因对照的APD90和APD50值的图。与用shCT处理相比，用KCNH2-SupRep处理KCNH2-G604SiPSC-CM引起显著的APD90缩短。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。示出了测量总数(n)。图还示出了中值(水平黑线)。使用单向ANOVA和事后图基检验来比较APD90的所有对和APD50的所有对。
图27是绘制了用shCT(1)、KCNH2-SupRep(2)处理的KCNH2-G628S变体或用shCT(3)处理的CRISPR-Cas9校正的等基因对照的APD90和APD50值的图。与用shCT处理相比，用KCNH2-SupRep处理KCNH2-G628SiPSC-CM引起显著的APD90缩短。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90值进行求平均值以产生单个数据点。示出了测量总数(n)。图还示出了中值(水平黑线)。使用单向ANOVA和事后图基检验来比较APD90的所有对。
图28A和28B显示，KCNH2-SupRep敲低引起LQT2疾病的KCNH2错义变体并用KCNH2-shIMM置换所述变体。将TSA201细胞用KCNH2-WT或KCNH2-变体以及shCT、shKCNH2或KCNH2-SupRep共转染。shKCNH2以变体独立性方式敲低KCNH2。图28A是绘制了使用等位基因特异性qRT-PCR检测到的KCNH2-WT/变体和KCNH2-shIMM的比例表达，以测量KCNH2-WT/变体(白色)和KCNH2-shIMM(灰色)的图。图28B是示出了总体KCNH2表达(不是等位基因特异性的)的蛋白质印迹的图像，其中GAPDH作为管家对照。
图29A和29B显示在用KCNH2-WT或KCNH2-shIMM和shCT、shKCNH2或KCNH2-SupRep共转染的TSA201细胞中，shKCNH2敲低KCNH2-WT但不敲低KCNH2-shIMM。图29A是绘制了相对于GAPDH归一化的相对KCNH2表达的图，如通过等位基因特异性qRT-PCR测量的，以定量KCNH2-WT(白色)和KCNH2-shIMM(灰色)。通过用GAPDH作为管家对照的蛋白质印迹(图29B)确认KCNH2的结果。
图30A-30D显示KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP在异源TSA201细胞中不产生KCNH2电流。图30A是来自表达KCNH2-WT与KCNE2的TSA201细胞的代表性全细胞IKr迹线的图，其由-80mV的保持电位和-40mV至+60mV的测试电位以10mV增量在3秒持续时间内确定。图30B示出了来自表达KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP的TSA201细胞的代表性全细胞外向迹线，其由-80mV的保持电位和-40mV至+60mV的测试电位以10mV增量在3秒持续时间内确定。图30C是绘制了KCNH2-pIRES2-EGFP与KCNE2-pIRES2-dsRed2(n＝9)和KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP(n＝8)的电流-电压关系的图。所有值表示平均值±SEM。图30D是绘制了KCNH2-pIRES2-EGFP与KCNE2-pIRES2-dsRed2(n＝9)和KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP(n＝8)在+10mV下的峰值电流密度的图。所有值表示平均值±SEM。
图31A-31E显示KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP在H9C2细胞中产生E-4031敏感外向电流。图31A包含来自空H9C2细胞(上图)、在E-4031之前表达KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP的H9C2细胞(中图)和在E-4031之后表达KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP的H9C2细胞(下图)的代表性全细胞外向电流迹线，其由-80mV的保持电位和-40mV至+60mV的测试电位以10mV增量在3秒持续时间内确定。图31B是绘制了来自空H9C2细胞和表达KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP(n＝9)的H9C2细胞的外向电流的电流-电压关系的图。所有值表示平均值±SEM。图31C是绘制了来自空H9C2细胞和表达KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP(n＝9)的H9C2细胞在+60mV下的峰值电流密度的图。所有值表示平均值±SEM。图31D是绘制了在E-4031(n＝6)之前和之后表达KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP的H9C2细胞的电流-电压关系的图。所有值表示平均值±SEM。图31E是绘制了在E-4031(n＝6)之前和之后来自表达KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP的H9C2细胞在+60mV下的峰值电流密度的图。所有值表示平均值±SEM。
图32是绘制了用shCT(1)、KCNH2-SupRep(2)处理的KCNH2-N588K变体或用shCT(3)处理的等基因对照的APD90和APD50值的图。与用shCT处理相比，用KCNH2-SupRep处理SQT1iPSC-CM引起显著的APD90延长。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。示出了测量总数(n)。图还示出了中值(水平黑线)。使用单向ANOVA和事后图基检验来比较APD90和APD50的所有对。
图33A-33D示出了对于源自患有SCN5A-F1760C变体的患者的iPSC的质量控制。图33A是具有正常形态的iPSC集落的明场图像。图33B示出了源自患者的iPSC中的引起LQT3的SCN5A-F1760C变体的桑格测序确认(SEQ ID NO:1047)。图33C是示出了从患者的血液样品产生的iPSC系的正常核型的图像。图33D包含多能性标志物(包含DAPI核染色、Tra-1-60或SSEA-4、Nanog或Oct-4)的免疫荧光显微术的图像和合并图像。
图34是绘制了使用qPCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的SCN5A的敲低的图。
图35是示出了代表性SCN5A-SupRep载体图的示意图。(CMV)巨细胞病毒启动子；(MCS)多克隆位点；(U6)U6启动子；(ChlorR)氯霉素抗性基因；(Ori)复制起点；(WPRE)土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件；(GFP)绿色荧光蛋白；(P2A)2A自切割肽家族的成员；(HA)衍生自对应于氨基酸98-106的人流感血凝素分子的标签。
图36A和36B显示与未处理的细胞相比，APD在用含有SCN5A-SupRep的慢病毒处理的LQT3 SCN5A-F1760C iPSC-CM中缩短。图36A包含示出了对于未处理的和经SCN5A-SupRep处理的SCN5A-F1760C iPSC-CM以1Hz起搏的五个连续的FLUOVOLTTM电压染料光学动作电位的代表性迹线。图36B是绘制了未处理的和经SCN5A-SupRep处理的SCN5A-F1760CiPSC-CM的APD90和APD50值的图。以1Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的动作电位迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生光学动作电位，从所述光学动作电位确定APD90和APD50值。对在20秒迹线内的所有动作电位的APD90和APD50值进行求平均值以产生单个数据点。
图37是绘制了使用qPCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的MYH7的敲低的图。
图38是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的PKP2的敲低的图。
图39A-39D示出了源自患有PKP2-c2146-1G>C变体的患者的iPSC的质量控制。图39A包含具有正常形态的iPSC集落的明场图像。图39B示出了源自患有ACM的患者的iPSC中的引起ACM的PKP2-c2146-1G>C变体的桑格测序确认。图39C示出了从患者的血液样品产生的iPSC系的克隆的正常核型。图39D包含对于DAPI核染色和多能性标志物(包含Tra-1-60或SSEA-4、Nanog或Oct-4)的免疫荧光显微术的图像和合并图像。
图40包含显示与未处理的细胞相比，用含有PKP2-SupRep的慢病毒处理的ACMiPSC-CM中钙瞬变持续时间(CTD)和衰变缩短的一系列图。鉴于PKP2介导的ACM相关心律失常事件通常与用力相关，基线下和用肾上腺素能激动剂异丙肾上腺素(Iso)治疗之后进行钙处理测量。以0.5Hz起搏以50fps获得20秒持续时间的迹线视频。鉴定含有闪光细胞的所关注区域，并且测量荧光强度随时间推移的变化，以产生钙瞬变迹线，从所述钙瞬变迹线确定值。对20秒迹线内的钙瞬变的所有值进行求平均值以产生除钙幅度之外的所有参数的单个数据点，其中仅取第一值进行分析。
图41是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的DSP的敲低的图。
图42是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的MYBPC3的敲低的图。
图43是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的RBM20的敲低的图。
图44是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的CACNA1C的敲低的图。
图45是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的CALM1的敲低的图。
图46是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的CALM2的敲低的图。
图47是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的CALM3的敲低的图。
图48是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的KCNJ2的敲低的图。
图49是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的CASQ2的敲低的图。
图50是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的DSG2的敲低的图。
图51是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的TNNT2的敲低的图。
图52是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的TPM1的敲低的图。
图53是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的LMNA的敲低的图。
图54是绘制了通过qRT-PCR确定的具有各种shRNA的TSA201细胞中的PLN的敲低的图。
具体实施方式
本文档提供了用于通过抑制内源性致病性等位基因和用非突变(非致病性)非抑制的编码序列置换/表达来治疗患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如LQTS，或更具体地，LQT1、LQT2或LQT3)的哺乳动物的方法和材料。通常，本文提供的方法和材料涉及使用含有一种或多种抑制组分(例如，RNAi核酸，如shRNA)与一种或多种校正组分(例如，编码编码野生型多肽并且对抑制组分免疫的疾病相关等位基因的一个版本的核酸)的组合的核酸构建体，所述抑制组分被设计成抑制存在于哺乳动物(例如，患有LQTS或更具体地LQT1、LQT2或LQT3的哺乳动物(如人)的心脏)内的一种或多种类型的细胞(例如，心肌细胞)内的一种或多种疾病相关等位基因(或其转录的RNA)的表达。本文提供的方法和材料可以用于减少由抑制组分靶向的等位基因引起的疾病的一种或多种症状或效果。
在一些情况下，本文档提供了一种可以用于治疗患有先天性病症的哺乳动物的抑制和置换(SupRep)核酸。可以根据本文提供的方法进行治疗的病症包含但不限于LQTS(例如，LQT1、LQT2、LQT3、LQT4、LQT5、LQT6、LQT7、LQT8、LQT9、LQT10、LQT11、LQT12、LQT13、LQT14、LQT15、LQT16或LQT17)、布鲁格达综合征(BrS)、儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)、致心律失常性心肌病(ACM)、肥厚型心肌病(HCM)、扩张型心肌病(DCM)、SQTS、提摩西综合征(Timothy syndrome)、左心室非压实性心肌病(LVNC)、骨骼肌病、安徒生-泰维勒综合征(Andersen-Tawil syndrome，ATS)、家族性高胆固醇血症(FH)、心肌病、心房纤维性颤动和三联蛋白敲除综合征(TKOS)。
本文提供的核酸包含两种主要组分：抑制基因疗法组分，所述抑制基因疗法组分可以抑制所选择的疾病相关等位基因的表达；以及校正基因疗法组分，所述校正基因疗法组分编码对抑制基因疗法组分免疫的所选择的疾病相关等位基因的校正版本。
抑制组分可以是例如RNAi核酸，如shRNA、siRNA或微RNA(miRNA)。抑制组分可以具有任何适当的长度。例如，抑制组分的长度可以为约10至40个核苷酸(例如，长度为约10至约20个、约15至约30个、约18至约22个、约20至约30个或约30至约40个核苷酸)。
抑制组分可以被设计成靶向不含有病原性突变(例如，LQTS致病性突变)或其它遗传多态性的疾病相关等位基因的区域。以此方式，抑制组分可以减少内源性等位基因的多个版本的表达，包含野生型等位基因、含有疾病相关突变的等位基因或含有不引起待治疗病症的其它多态性的等位基因。
在一些情况下，抑制组分可以被设计成靶向含有一个或多个病原性突变(例如，一个或多个LQTS致病性突变)或其它遗传多态性的疾病相关等位基因的区域。
校正组分可以是编码缺乏病原性突变的疾病相关等位基因的校正版本的核酸，并且可以编码野生型多肽。与靶基因的内源性版本相比，校正组分还含有碱基置换，使得校正组分对抑制基因疗法组分免疫(例如，不被抑制基因疗法组分抑制)。例如，将以其它方式被抑制组分靶向的校正组分的区域可以包含约1至约13个(例如，约1至约3个、约2至约4个、约3至约5个、约4至约6个、约5至约7个、约6至约8个、约7至约9个、约8至约10个、约9至约11个、约10至约12个或约11至约13个)摆动碱基同义变体，与对应的野生型序列相比，所述摆动碱基同义变体不改变由校正组分编码的氨基酸序列。在一些情况下，将以其它方式被抑制组分靶向的校正组分的区域可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个摆动碱基同义变体，与对应的野生型序列(例如，野生型、非病原性序列)相比，所述摆动碱基同义变体不改变由校正组分编码的氨基酸序列。由于存在同义变体，抑制组分的表达将不会减少校正组分的表达。
也可以使用其它抑制组分/校正组分组合。例如，在一些情况下，抑制组分可以被设计成靶向5'非翻译区(UTR)或3'UTR，因为校正cDNA不含有UTR，但mRNA的内源性转录确实含有UTR。在此类情况下，校正组分不需要含有沉默变体，因为抑制组分(例如，RNAi)靶向UTR。在一些情况下，抑制组分可以靶向靠近编码序列的5'或3'端的序列，并且校正组分可以包含不含有由抑制组分靶向的序列的截短的cDNA。
在一些情况下，校正组分可以编码在氨基酸序列水平上与野生型多肽不是100％相同但在足以治疗病症的水平上具有活性的多肽。在一些情况下，可以通过选择在对维持以下的影响方面没有显著差异的取代来进行氨基酸取代：(a)取代区域中肽主链的结构，(b)特定位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。例如，可以基于侧链性质将天然存在的残基分成多个组：(1)疏水性氨基酸(甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(2)中性亲水性氨基酸(半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；(3)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(4)碱性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(5)影响链取向的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)；以及(6)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。在这些组内进行的取代可以被认为是保守取代。可以在本文提供的SupRep构建体的校正组分内编码的保守取代的非限制性实例包含但不限于缬氨酸取代丙氨酸、赖氨酸取代精氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、谷氨酸取代天冬氨酸、丝氨酸取代半胱氨酸、天冬酰胺取代谷氨酰胺、天冬氨酸取代谷氨酸、脯氨酸取代甘氨酸、精氨酸取代组氨酸、亮氨酸取代异亮氨酸、异亮氨酸取代亮氨酸、精氨酸取代赖氨酸、亮氨酸取代甲硫氨酸、亮氨酸取代苯丙氨酸、甘氨酸取代脯氨酸、苏氨酸取代丝氨酸、丝氨酸取代苏氨酸、酪氨酸取代色氨酸、苯丙氨酸取代酪氨酸和/或亮氨酸取代缬氨酸。
在一些情况下，本文提供的SupRep构建体还可以编码或含有报告基因。可以使用任何适当的报告基因。在一些情况下，例如，可以使用荧光报告基因(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白或黄色荧光蛋白)。在一些情况下，可以包含非荧光标签。可以使用任何适当的非荧光标签，包含但不限于血凝素、标签、His6和V5。
本文提供的SupRep构建体的非限制性实例是可以用于治疗患有LQT1的哺乳动物的SupRep KCNQ1基因疗法载体。如在本文的实例中所述，SupRep KCNQ1基因疗法载体的治疗功效由使用两种体外模型系统获得的结果支持。再次，SupRep策略具有串联发生的两个组件。首先，对于KCNQ1和LQT1，两种内源性KCNQ1等位基因(WT等位基因和含有LQT1突变体的等位基因)的抑制是通过KCNQ1 shRNA发生的。第二组件涉及通过表达在shRNA的结合序列内的每个密码子的摆动碱基处含有同义变体的shRNA-免疫(shIMM)KCNQ1 cDNA来置换KCNQ1。如上所述，这些同义变体不改变WT氨基酸序列，但确实防止shRNA敲低(KD)，由此使其对shRNA“免疫”。KCNQ1-SupRep可以是突变独立的，从而消除设计多个RNAi的需要，因为shRNA靶向基因本身而不是离散突变。
编码抑制组分和校正组分的核酸分子可以通过包含但不限于普通分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、化学核酸合成技术和此类技术的组合的技术来产生。例如，PCR可以与被设计成扩增编码所选择的多肽(例如，KCNQ1)的核酸(例如，基因组DNA或RNA)的寡核苷酸引物一起使用。
本文档还提供了用于使用本文所述的SupRep构建体来治疗鉴定为患有先天性病症的哺乳动物的方法。如在本文的实例中所述，例如，产生了KCNQ1-SupRep基因疗法载体，并且通过在TSA201细胞中的异源表达来验证其抑制和置换KCNQ1的能力。另外，在体外心脏模型中，使用从具有不同的LQT1致病性变体的四名患者产生的患者特异性的、诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞(iPSC-CM)通过缩短心脏动作电位时程(APD)来挽救LQT1疾病表型。另外，本文所述的研究证明，与患者自身的校正的等基因对照细胞的黄金标准相比，根据APD归一化，KCNQ1-SupRep基因疗法近似于“治疗治愈”。
可以如本文所述治疗任何适当的哺乳动物。例如，可以如本文所述治疗患有先天性病症(例如，先天性心脏病症，如LQTS，或更具体地LQT1)的哺乳动物，包含但不限于人、猴、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、兔、大鼠和小鼠。在一些情况下，患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如LQTS，或更具体地LQT1)的哺乳动物(例如，人)可以通过以抑制内源性疾病相关等位基因的表达并提供置换野生型cDNA(或不包含疾病相关多态性的cDNA)的方式向哺乳动物(例如，向哺乳动物的心肌)施用SupRep核酸构建体来治疗。可以使用任何适当的诊断技术将哺乳动物鉴定为患有先天性病症。非限制性实例包含但不限于针对一种或多种疾病相关等位基因的遗传筛选和对器官(例如，心脏)功能缺陷的评估(例如，通过心电图、超声心动图、运动应激测试和/或利多卡因激发)。
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQT1或SQTS，并且待抑制和置换的基因可以是KCNQ1。KCNQ1构建体的实例示于图1A和1B。示例性KCNQ1序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000218(例如，版本NM_000218.2或NM_00218.3)(图1C)中。在一些情况下，KCNQ1多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000209(例如，版本NP_000209.2)中所示的氨基酸序列(图1C)。
靶向KCNQ1的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1A中。
表1A代表性KCNQ1 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有LQT2或SQTS，并且待抑制和置换的基因可以是KCNH2。KCNH2构建体的实例示于图2A和2B。示例性KCNH2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000238(例如，版本NM_000238.4；图2C)中。在一些情况下，KCNH2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000229(例如，版本NP_000229.1；图2C)中所示的氨基酸序列。
靶向KCNH2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1B中。
表1B代表性KCNH2 shRNA和shIMM序列
/>
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQT3或BrS，并且待抑制和置换的基因可以是SCN5A(其编码钠通道蛋白5型亚基α同种型b)。SCN5A构建体的实例示于图3A和3B。示例性SCN5A序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000335(例如，版本NM_000335.5；图3C)中。在一些情况下，SCN5A多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000326(例如，版本NP_000326.2；图3C)中所示的氨基酸序列。
靶向SCN5A的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1C中。
表1C代表性SCN5A shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有HCM或DCM，并且待抑制和置换的基因可以是MYH7(其编码肌球蛋白重链7)。示例性MYH7序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000257(例如，版本NM_000257.4)中。在一些情况下，MYH7多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000248(例如，版本NP_000248.2)中所示的氨基酸序列。
靶向MYH7的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1D中。
表1D代表性MYH7 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有ACM，并且待抑制和置换的基因可以是DSP(其编码桥粒斑蛋白)。示例性DSP序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_004415(例如，版本NM_004415.4)中。在一些情况下，DSP多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_004406(例如，版本NP_004406.2)中所示的氨基酸序列。
靶向DSP的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1E中。
表1E代表性DSP shRNA和shIMM序列
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/>
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在一些情况下，哺乳动物可能患有HCM，并且待抑制和置换的基因可以是MYBPC3(其编码肌球蛋白结合蛋白C3)。示例性MYBPC3序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000256(例如，版本NM_000256.3)中。在一些情况下，MYBPC3多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000247(例如，版本NP_000247.2)中所示的氨基酸序列。
靶向MYBPC3的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1F中。
表1F代表性MYBPC3 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有DCM，并且待抑制和置换的基因可以是RBM20(其编码RNA结合基序蛋白20)。示例性RBM20序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001134363(例如，版本NM_001134363.3)中。在一些情况下，RBM20多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001127835(例如，版本NP_001127835.2)中所示的氨基酸序列。
靶向RBM20的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1G中。
表1G代表性RBM20 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有LQTS或提摩西综合征，并且待抑制和置换的基因可以是CACNA1C(其编码钙电压门控通道亚基α1C)。示例性CACNA1C序列示出于NCBIRefSeq登录号NM_000719(例如，版本NM_000719.7)中。在一些情况下，CACNA1C多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000710(例如，版本NP_000710.5)中所示的氨基酸序列。
靶向CACNA1C的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1H中。
表1H代表性CACNA1C shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有ACM，并且待抑制和置换的基因可以是PKP2(其编码桥粒斑菲素蛋白2)。PKP2构建体的实例示于图4A和4B。示例性PKP2序列示出于NCBIRefSeq登录号NM_001005242(例如，版本NM_001005242.3；图4C)中。在一些情况下，PKP2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001005242(例如，版本NP_001005242.2；图4C)中所示的氨基酸序列。
靶向PKP2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1I中。
表1I代表性PKP2 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有ACM，并且待抑制和置换的基因可以是DSG2(其编码桥粒芯蛋白2)。示例性DSG2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001943(例如，版本NM_001943.5)中。在一些情况下，DSG2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001934(例如，版本NP_001934.2)中所示的氨基酸序列。
靶向DSG2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1J中。
表1J代表性DSG2 shRNA和shIMM序列
/>
在一些情况下，哺乳动物可能患有ACM、DCM、左心室非压实性心肌病(LVNC)或骨骼肌病，并且待抑制和置换的基因可以是DES(其编码肌间线蛋白)。示例性DES序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001927(例如，版本NM_001927.4)中。在一些情况下，DES多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001918(例如，版本NP_001918.3)中所示的氨基酸序列。
靶向DES的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1K中。
表1K代表性DES shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有安徒生-泰维勒综合征(ATS)或CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是KCNJ2(其编码钾内向整流通道亚家族J成员2)。示例性KCNJ2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000891(例如，版本NM_000891.3)中。在一些情况下，KCNJ2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000882(例如，版本NP_000882.1)中所示的氨基酸序列。
靶向KCNJ2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1L中。
表1L代表性KCNJ2 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是CASQ2(其编码肌集钙蛋白2)。示例性CASQ2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001232(例如，版本NM_001232)中。在一些情况下，CASQ2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001223.2(例如，版本NP_001223.2)中所示的氨基酸序列。
靶向CASQ2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1M中。
表1M代表性CASQ2 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有DCM，并且待抑制和置换的基因可以是LMNA(其编码核纤层蛋白A/C)。示例性LMNA序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_170707(例如，版本NM_170707.4)中。在一些情况下，LMNA多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_733821(例如，版本NP_733821.1)中所示的氨基酸序列。
靶向LMNA的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1N中。
表1N代表性LMNA shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有DCM，并且待抑制和置换的基因可以是TPM1(其编码原肌球蛋白1)。示例性TPM1序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001018005(例如，版本NM_001018005.2)中。在一些情况下，TPM1多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001018005(例如，版本NP_001018005.1)中所示的氨基酸序列。
靶向TPM1的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1O中。
表1O
代表性TPM1 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有DCM或ACM，并且待抑制和置换的基因可以是PLN(其编码受磷蛋白)。示例性PLN序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_002667(例如，版本NM_002667.5)中。在一些情况下，PLN多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_002658(例如，版本NP_002658.1)中所示的氨基酸序列。
靶向PLN的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1P中。
表1P
代表性PLN shRNA和shIMM序列
| shRNA序列 | SEQ ID | shIMM序列 | SEQ ID |
| AAGAGCCTCAACCATTGAAAT | 1416 | GAGGGCGTCTACGATAGAGAT | 1417 |
| AACCATTGAAATGCCTCAACA | 1418 | TACGATAGAGATGCCACAGCA | 1419 |
| AATGCCTCAACAAGCACGTCA | 1420 | GATGCCACAGCAGGCTCGACA | 1421 |
| TCAATTTCTGTCTCATCTTAA | 1422 | TTAACTTTTGCCTGATTTTGA | 1423 |
| TGTCTCTTGCTGATCTGTATC | 1424 | TGCCTGTTACTCATTTGCATT | 1425 |
| GTCTCTTGCTGATCTGTAT | 1426 | GCCTGTTACTCATTTGCAT | 1427 |
在一些情况下，哺乳动物可能患有家族性高胆固醇血症(FH)，并且待抑制和置换的基因可以是LDLR(其编码低密度脂蛋白受体)。示例性LDLR序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000527(例如，版本NM_000527.5)中。在一些情况下，LDLR多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000518(例如，版本NP_000518.1)中所示的氨基酸序列。
靶向LDLR的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1Q中。
表1Q代表性LDLR shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有FH，并且待抑制和置换的基因可以是PCSK9(其编码前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)。示例性PCSK9序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_174936(例如，版本NM_174936.4)中。在一些情况下，PCSK9多肽可以具有NCBIRefSeq登录号NP_777596(例如，版本NP_777596.2)中所示的氨基酸序列。
靶向PCSK9的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1R中。
表1R代表性PCSK9 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有HCM或DCM，并且待抑制和置换的基因可以是TNNT2(其编码心脏型肌钙蛋白T2)。示例性TNNT2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001276345(例如，版本NM_001276345.2)中。在一些情况下，TNNT2多肽可以具有NCBIRefSeq登录号NP_001263274(例如，版本NP_001263274.1)中所示的氨基酸序列。
靶向TNNT2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1S中。
表1S代表性TNNT2 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQTS或CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是CALM1(其编码钙调蛋白1)。示例性CALM1序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_006888(例如，版本NM_006888.6)中。在一些情况下，CALM1多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_008819(例如，版本NP_008819.1)中所示的氨基酸序列。
靶向CALM1的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1T中。
表1T代表性CALM1 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQTS或CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是CALM2(其编码钙调蛋白2)。示例性CALM2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001743(例如，版本NM_001743.6)中。在一些情况下，CALM2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001734(例如，版本NP_001734.1)中所示的氨基酸序列。
靶向CALM2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1U中。
表1U代表性CALM2 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQTS或CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是CALM3(其编码钙调蛋白3)。示例性CALM3序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_005184(例如，版本NM_005184.4)中。在一些情况下，CALM3多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_005175.2(例如，版本NP_005175.2)中所示的氨基酸序列。
靶向CALM3的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1V中。
表1V代表性CALM3 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有三联蛋白敲除综合征(TKOS)，并且待抑制和置换的基因可以是TRDN(其编码三联蛋白)。示例性TRDN序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_006073(例如，版本NM_006073.4)中。在一些情况下，TRDN多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_006064(例如，版本NP_006064.2)中所示的氨基酸序列。
靶向CALM3的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1W中。
表1W代表性TRDN shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是RYR2(其编码利阿诺定(ryanodine)受体2)。示例性RYR2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001035(例如，版本NM_001035.3)中。在一些情况下，RYR2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001026(例如，版本NP_001026.2)中所示的氨基酸序列。
靶向RYR2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1X中。
表1X代表性RYR2 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有FH，并且待抑制和置换的基因可以是APOB(其编码载脂蛋白B)。示例性APOB序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000384(例如，版本NM_000384.3)中。在一些情况下，APOB多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000375(例如，版本NP_000375.3)中所示的氨基酸序列。
靶向APOB的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1Y中。
表1Y代表性APOB shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有DCM或HCM，并且待抑制和置换的基因可以是TNNI3(其编码心脏型肌钙蛋白I3)。示例性TNNI3序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000363(例如，版本NM_000363.5)中。在一些情况下，TNNI3多肽可以具有NCBI RefSeq登录号Q59H18(例如，版本Q59H18.3)中所示的氨基酸序列。
靶向TNNI3的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1Z中。
表1Z代表性TNNI3 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有DCM或HCM，并且待抑制和置换的基因可以是TNNC1(其编码慢骨骼和心脏型肌钙蛋白C1)。示例性TNNC1序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_003280(例如，版本NM_003280.3)中。在一些情况下，TNNC1多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_003271(例如，版本NP_003271.1)中所示的氨基酸序列。
靶向TNNC1的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1AA中。
表1AA代表性TNNC1 shRNA和shIMM序列
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在一些情况下，哺乳动物可能患有HCM或DCM，并且待抑制和置换的基因可以是MYL2(其编码肌球蛋白轻链2)。示例性MYL2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000432(例如，版本NM_000432.4)中。在一些情况下，MYL2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000423(例如，版本NP_000423.2)中所示的氨基酸序列。
靶向MYL2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1BB中。
表1BB代表性MYL2 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有HCM或DCM，并且待抑制和置换的基因可以是MYL3(其编码肌球蛋白轻链3)。示例性MYL3序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_000258(例如，版本NM_000258.3)中。在一些情况下，MYL3多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_000249(例如，版本NP_000249.1)中所示的氨基酸序列。
靶向MYL3的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1CC中。
表1CC代表性MYL3 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有HCM或DCM，并且待抑制和置换的基因可以是JPH2(其编码亲联蛋白2)。示例性JPH2序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_020433(例如，版本NM_020433.5)和NCBI RefSeq登录号NM_175913(例如，版本NM_175913.4)中。在一些情况下，JPH2多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_065166(例如，版本NP_065166.2)或NCBIRefSeq登录号NP_787109(例如，版本NP_787109.2)中所示的氨基酸序列。
靶向JPH2的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1DD中。
表1DD代表性JPH2 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQTS、HCM或肢带型肌营养不良症(LGMD)，并且待抑制和置换的基因可以是CAV3(其编码小窝蛋白3)。示例性CAV3序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_033337(例如，版本NM_033337.3)和NCBI RefSeq登录号NM_001234(例如，版本NM_001234.5)中。在一些情况下，CAV3多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_203123(例如，版本NP_203123.1)或NCBI RefSeq登录号NP_001225(例如，版本NP_001225.1)中所示的氨基酸序列。
靶向CAV3的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1EE中。
表1EE代表性CAV3 shRNA和shIMM序列
在一些情况下，哺乳动物可能患有LQTS或CPVT，并且待抑制和置换的基因可以是TECRL(其编码反式-2,3-烯酰-CoA还原酶样蛋白)。示例性TECRL序列示出于NCBI RefSeq登录号NM_001010874(例如，版本NM_001010874.5)和NCBI RefSeq登录号NM_001363796(例如，版本NM_001363796.1)中。在一些情况下，TECRL多肽可以具有NCBI RefSeq登录号NP_001010874(例如，版本NP_001010874.2)或NCBI RefSeq登录号NP_001350725(例如，版本NP_001350725.1)中所示的氨基酸序列。
靶向TECRL的shRNA序列和对应的shIMM序列的实例示出于表1FF中。
表1FF代表性TECRL shRNA和shIMM序列
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可以使用任何适当的方法来向活的哺乳动物体内的细胞(例如，心脏细胞)递送SupRep核酸构建体。例如，可以使用一种或多种如病毒载体等载体将含有抑制组分和置换组分的SupRep构建体施用于哺乳动物。在一些情况下，用于施用SupRep核酸的载体可以用于抑制组分和校正组分的瞬时表达。在一些情况下，用于施用SupRep核酸的载体可以用于抑制组分和校正组分的稳定表达。在一些情况下，当用于施用核酸的载体可以用于稳定表达时，载体可以被工程化以将被设计成表达抑制组分的核酸和/或被设计成表达校正组分的核酸整合到细胞的基因组中。在此类情况下，可以使用任何适当的方法来将核酸整合到细胞的基因组中。例如，基因疗法技术可以用于将被设计成表达抑制组分(例如，shRNA)的核酸和/或被设计成表达校正组分(例如，对抑制组分免疫的野生型多肽)的核酸整合到细胞的基因组中。在一些情况下，稳定表达不一定需要整合到基因组中。例如，使用AAV9，SupRep DNA可以在细胞中自身持续存在，而不整合到人基因组中。非整合DNA通常作为基因组DNA复制而被破坏，但在如心肌细胞或神经元等非分裂细胞中，SupRep DNA可以无限期地持续存在，因为细胞不会复制或分裂以去除SupRep DNA。
用于将SupRep核酸施用于细胞的载体可以使用标准材料(例如，包装细胞系、辅助病毒和载体构建体)来制备。参见例如，《基因疗法方案(Gene Therapy Protocols)》(《分子 医学方法(Methods in Molecular Medicine)》),Jeffrey R.Morgan编辑,新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(Humana Press,Totowa,NJ)(2002)，以及《用于基因疗法的病毒载体：方法与方案(Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols)》,CurtisA.Machida编辑,新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(2003)。基于病毒的核酸递送载体通常源自动物病毒，如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、疱疹病毒和乳头瘤病毒。在一些情况下，可以使用腺相关病毒载体(例如，AAV血清型1病毒载体、AAV血清型2病毒载体、AAV血清型3病毒载体、AAV血清型4病毒载体、AAV血清型5病毒载体、AAV血清型6病毒载体、AAV血清型7病毒载体、AAV血清型8病毒载体、AAV血清型9病毒载体、AAV血清型10病毒载体、AAV血清型11病毒载体、AAV血清型12病毒载体或重组AAV血清型病毒载体，如AAV血清型2/9病毒载体，其中AAV2反向末端重复序列和基因组包含在AAV9衣壳内，这可以导致针对心肌细胞的AAV9趋性)、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘病毒载体来将SupRep核酸构建体递送到细胞。在一些情况下，AAV9载体可以用于将一种或多种SupRep核酸递送到细胞。
除了编码抑制组分的核酸和编码校正组分的核酸之外，病毒载体可以含有与编码抑制组分和校正组分的核酸可操作地连接的调节元件。如本文所使用的，“可操作地连接”是指以允许或促进经编码的RNA和/或多肽的表达的方式将调节元件相对于核酸定位在载体中。此类调节元件可以包含启动子序列、增强子序列、应答元件、信号肽、内部核糖体进入序列(IRES)、P2A自切割肽序列、聚腺苷酸化信号、终止子或调节核酸的表达(例如，转录或翻译)的诱导型元件。可以包含在病毒载体中的元件的选择取决于若干因素，包含但不限于可诱导性、靶向和所期望的表达水平。例如，启动子可以包含在病毒载体中，以促进编码抑制组分(例如，shRNA)和校正组分(例如，对抑制组分的抑制免疫的WT多肽)的核酸的转录。启动子可以是组成型或诱导型的(例如，在存在四环素或雷帕霉素的情况下)，并且可以以一般或组织特异性方式影响编码shRNA或多肽的核酸的表达。可以用于驱动抑制组分和校正组分(例如，在心肌细胞中)的表达的启动子的实例包含但不限于U6启动子、H1启动子、巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子、α-肌球蛋白重链启动子、肌球蛋白轻链2启动子、心脏肌钙蛋白T和心脏肌钙蛋白C启动子。
如本文所使用的，术语“AAV颗粒”是指将其核酸基因组传送到细胞的AAV病毒的包装衣壳形式。术语“病毒基因组”是指病毒基因组的一个拷贝。每个病毒颗粒含有一个病毒基因组，并且每个AAV载体含有一个病毒基因组。在一些情况下，含有由如本文提供的AAV载体编码的AAV颗粒的组合物可以以约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL(例如，约1010 个AAV颗粒/mL至约1011个AAV颗粒/mL、约1010个AAV颗粒/mL至约1012个AAV颗粒/mL、约1010个AAV颗粒/mL至约1013个AAV颗粒/mL、约1011个AAV颗粒/mL至约1012个AAV颗粒/mL、约1011个AAV颗粒/mL至约1013个AAV颗粒/mL、约1011个AAV颗粒/mL至约1014个AAV颗粒/mL、约1012个AAV颗粒/mL至约1013个AAV颗粒/mL、约1012个AAV颗粒/mL至约1014个AAV颗粒/mL或约1013个AAV颗粒/mL至约1014个AAV颗粒/mL)的浓度施用。在一些情况下，含有由如本文提供的AAV载体编码的AAV颗粒的组合物可以以约1010个病毒基因组每千克体重(vg/kg)至约1015vg/kg(例如，约1010至约1011vg/kg、约1010至约1012vg/kg、约1010至约1013vg/kg、约1011至约1012vg/kg、约1011至约1013vg/kg、约1011至约1014vg/kg、约1012至约1013vg/kg、约1012至约1014vg/kg或约1013至约1014vg/kg)的浓度施用。
在一些情况下，可以使用非病毒载体将SupRep核酸构建体施用于哺乳动物。在别处描述了使用非病毒载体进行核酸递送的方法。参见例如，《基因疗法方案》(《分子医学方 法》),Jeffrey R.Morgan编辑,新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(2002)。例如，可以通过直接注射包括SupRep核酸的核酸分子(例如，质粒)或通过施用与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子来将编码抑制组分和校正组分的SupRep核酸施用于哺乳动物。在一些情况下，可以通过直接注射(例如，进入心肌)、腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送来将被设计成为表达抑制组分和校正组分的SupRep核酸递送到细胞(例如，心肌细胞)。
当KCNQ1-SupRep和/或KCNH2-SupRep和/或SCN5A-SupRep基因疗法被有效地递送到大多数心肌细胞时，基因疗法介导的复极化储备的恢复可以通过间隙连接分布以部分或完全补偿相邻的未转导的心肌细胞。根据本文所述的研究，值得注意的是在测量光学动作电位期间，在用KCNQ1-SupRep转导的电耦合的iPSC-CM中未观察到心律失常活性，这表明细胞的有效转导可能足以维持正常节律并补偿未转导的相邻细胞。
可以将任何适当量的SupRep核酸施用于患有先天性病症的哺乳动物(例如，人)。有效量的SupRep核酸可以减轻正在治疗的病症的一种或多种症状。在一些情况下，例如，使用KCNQ1-SupRep基因疗法有效抑制和置换KCNQ1(例如，对于患有LQT1的患者，KCNQ1中的多个病原性变体被遗传的严重病例，如常染色体隐性LQT1以及耶韦尔和朗格-尼尔森综合征(Jervell and Lange-Nielsen syndrome，JLNS)或2型SQTS(SQT2))可以产生与健康个体的IKs电流密度类似的电流密度(例如，在健康个体的IKs电流密度的约50％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％内)。KCNQ1中导致功能获得和IKs电流密度的异常增加的病原性变体可能引起SQTS。在一些情况下，治疗有效量可以提供足够的IKs以改善LQTS表型而不过度补偿和引起SQTS。在LQT1和JLNS中，疾病严重程度与丧失IKs的程度相关(Moss等人,《循环》,115:2481-2489(2007))。杂合的无义或移码突变引起单倍体不足，并且通常导致具有约50％ IKs的轻度LQT1。显性-阴性错义突变使IKs降低超过50％，并且与突破性心脏事件更密切相关。在最严重的情况下，患有JLNS的患者遗传两个突变等位基因，所述两个突变等位基因导致最少(<10％)或无IKs(Bhuiyan等人,《生物物理学与分子生物学进展(Prog.Biophys.Mol.Biol.)》,98:319-327(2008))。相反，具有实质性功能获得的KCNQ1变体引起SQT2，尽管IKs增加的精确程度尚未得到充分证实(Chen等人,《科学(Science)》,299:251-254(2003)；Bellocq等人,《循环》,109:2394-2397(2004)；Hong等人,《心血管研究(Cardiovasc.Res.)》,68:433-440(2005)；以及Das等人,《心律学》,6:1146-1153(2009))。因此，KCNQ1-SupRep在人中的治疗窗口可能相对较宽，从而允许实现最佳功效的灵活性。在一些情况下，KCNQ1-SupRep给药可以由驱动表达的启动子和/或增强子、或由递送到哺乳动物的病毒颗粒的量来修饰。在一些情况下，与治疗之前的IKs相比，治疗有效量的KCNQ1-SupRep构建体可以使IKs增加至少25％(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少100％或至少200％)。
在一些情况下，使用KCNH2-SupRep基因疗法有效抑制和置换KCNH2(例如，对于患有LQT2或1型短QT综合征(SQT1)的患者)可以产生与健康个体的IKr电流密度类似的电流密度(例如，在健康个体的IKr电流密度的约50％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％内)。在一些情况下，治疗有效量可以提供足够的IKr以改善LQTS表型而不过度补偿和引起SQTS。如同LQT1，在LQT2中，疾病严重程度与丧失IKr的程度相关(Moss等人,《循环》,105:794-799(2002))。杂合的无义或移码突变引起单倍体不足，并且通常导致具有约50％ IKr的LQT2。显性-阴性错义突变使IKr降低超过50％，并且与心脏事件更密切相关，尤其是当定位到通道的孔区域时(Moss等人,同上)。相反，具有实质性功能获得的KCNH2变体可能引起SQT1(Brugada等人,《循环》,109:30-35(2004)；以及Sun等人,《分子与细胞心脏病学杂志(JMCC)》,50:433-441(2011))。因此，KCNH2-SupRep在人中的治疗窗口可能相对较宽，从而允许实现最佳功效的灵活性。在一些情况下，KCNH2-SupRep给药可以由驱动表达的启动子和/或增强子、或由递送到哺乳动物的病毒颗粒的量来修饰。在一些情况下，与治疗之前的IKr相比，治疗有效量的KCNH2-SupRep构建体可以使IKr增加至少25％(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少100％或至少200％)。
在一些情况下，使用SCN5A-SupRep基因疗法有效抑制和置换SCN5A(例如，对于患有LQT3、多焦点异位提前浦肯野相关收缩(MEPPC)综合征、SCN5A介导的扩张型心肌病、隐性病窦综合征或BrS的患者)可以产生与健康个体的INa电流密度和钠通道动力学类似的电流密度和钠通道动力学(例如，在健康个体的INa电流密度的约50％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％内)。在一些情况下，SCN5A-SupRep给药可以由驱动表达的启动子和/或增强子、或由递送到哺乳动物的病毒颗粒的量来修饰。在一些情况下，与治疗之前的INa晚期电流相比，治疗有效量的SCN5A-SupRep构建体可以将INa晚期电流或窗口电流的病理性增加的量抑制至少25％(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少100％或至少200％)。
典型的QT范围对于男性为约350-450毫秒，而对于女性为约350-460毫秒，但是高于约430-440的QT通常被认为是边界高的。患有LQTS的男性的QT通常大于450毫秒，而患有LQTS的女性的QT通常大于460毫秒。大多数LQTS患者在不到520毫秒时达到极限。在一些情况下，施用于患有LQT1和/或LQT2和/或LQT3的哺乳动物(例如，人)的有效量的KCNQ1-SupRep构建体和/或KCNH2-SupRep构建体和/或SCN5A-SupRep构建体可以使APD缩短至与健康个体的长度类似的长度，使得APD在正常范围内。在一些情况下，施用于患有LQT1和/或LQT2和/或LQT3的哺乳动物(例如，人)的有效量的KCNQ1-SupRep构建体和/或KCNH2-SupRep构建体和/或SCN5A-SupRep构建体可以使APD缩短至在约10％内(例如，在健康个体的APD的约8％、约5％或约3％内)的长度。在一些情况下，与治疗之前的APD相比，施用于患有LQT1和/或LQT2和/或LQT3的哺乳动物(例如，人)的治疗有效量的KCNQ1-SupRep构建体和/或KCNH2-SupRep构建体和/或SCN5A-SupRep构建体可以使APD缩短至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在一些情况下，可以在治疗当天、治疗后1天、治疗后3个月、治疗后6个月、治疗后1年以及治疗后此后每年评估症状。在一些情况下，可以在治疗后1天与治疗后7天之间(例如，治疗后1天与2天之间、治疗后1天与3天之间、治疗后1天与4天之间、治疗后2天与3天之间、治疗后2天与4天之间、治疗后2天与5天之间、治疗后3天与4天之间、治疗后3天与5天之间、治疗后3天与6天之间、治疗后4天与5天之间、治疗后4天与6天之间、治疗后4天与7天之间、治疗后5天与6天之间、治疗后5天与7天之间或治疗后6天与7天之间)评估症状。在一些情况下，可以在治疗后1周与治疗后4周之间(例如，治疗后1周与2周之间、治疗后1周与3周之间、治疗后1周与4周之间、治疗后2周与3周之间、治疗后2周与4周之间或治疗后3周与4周之间)评估症状。在一些情况下，可以在治疗后1个月与治疗后12个月之间(例如，治疗后1个月与2个月之间、治疗后1个月与3个月之间、治疗后1个月与4个月之间、治疗后2个月与3个月之间、治疗后2个月与4个月之间、治疗后2个月与5个月之间、治疗后3个月与4个月之间、治疗后3个月与5个月之间、治疗后3个月与6个月之间、治疗后4个月与5个月之间、治疗后4个月与6个月之间、治疗后4个月与7个月之间、治疗后5个月与6个月之间、治疗后5个月与7个月之间、治疗后5个月与8个月之间、治疗后6个月与7个月之间、治疗后6个月与8个月之间、治疗后6个月与9个月之间、治疗后7个月与8个月之间、治疗后7个月与9个月之间、治疗后7个月与10个月之间、治疗后8个月与9个月之间、治疗后8个月与10个月之间、治疗后8个月与11个月之间、治疗后9个月与10个月之间、治疗后9个月与11个月之间、治疗后9个月与12个月之间、治疗后10个月与11个月之间、治疗后10个月与12个月之间或治疗后11个月与12个月之间)评估症状。在一些情况下，可以在治疗后1年与治疗后约20年之间(例如，治疗后1年与5年之间、治疗后1年与10年之间、治疗后1年与15年之间、治疗后5年与10年之间、治疗后5年与15年之间、治疗后5年与20年之间、治疗后10年与15年之间、治疗后10年与20年之间或治疗后15年与20年之间)评估症状。
在一些情况下，如本文提供的治疗可以以单次剂量施用于患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如LQTS，或更具体地，LQT1或LQT2或LQT3)的哺乳动物(例如，人)，而无需进一步施用。
在一些情况下，如本文提供的治疗可以施用于患有先天性疾病(例如，先天性心脏病，如LQTS，或更具体地，LQT1)的哺乳动物(例如，人)，每日至少一次或每周至少一次，持续至少连续两天或两周。在一些情况下，将如本文提供的治疗施用于患有先天性疾病的哺乳动物(例如，人)，至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个连续天或周。在一些情况下，将如本文提供的治疗施用于患有先天性疾病的哺乳动物(例如，人)，每日至少一次或每周至少一次，持续至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个连续周。在一些情况下，将如本文提供的治疗施用于患有先天性疾病的哺乳动物(例如，人)，每日至少一次或每周至少一次，持续至多4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续天或周。在一些情况下，将如本文提供的治疗施用于患有先天性疾病的哺乳动物(例如，人)，每周至少一次，持续至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个连续周或月。在一些情况下，在受试者的整个寿命或无限期时段内，将如本文提供的治疗长期施用于患有先天性疾病的哺乳动物(例如，人)，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个连续月或年。
在一个实施例中，患有与KCNQ1基因中的病原性突变相关的LQT1或SQTS的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含KCNQ1基因中的病原性突变。KCNQ1基因中或由KCNQ1基因编码或由KCNQ1基因编码的病原性突变包含但不限于c.421G>A(p.V141M)、c.919G>C(p.V307L)、c.513C>A(p.Y171X)、c.760G>A(p.V254M)、c.1700T>G(p.I567S)、c.1377C>T(p.D459D)、c.1380C>A(p.G460G)、c.1383T>C(p.Y461Y)、c.1386C>T(p.D462D)、c.1389T>C(p.S463S)、c.1392T>C(p.S464S)、c.1395A>C(p.V465V)、c.1398G>A(p.R466R)、c.1401G>A(p.K467K)和c.1404C>T(p.S468S)。还参见，Wu等人,《心律失常杂志(JArrhythm.)》2016,32(5):381-388；Hedley等人,《人类突变(Hum Mutat.)》2009,30:1486-1551；以及Morita等人,《柳叶刀(Lancet)》2008,372:750-763。靶向突变KCNQ1等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变KCNQ1等位基因并且用野生型KCNQ1等位基因置换所述突变KCNQ1等位基因。靶向突变KCNQ1等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关KCNQ1等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关KCNQ1等位基因的区域来靶向含有病原性突变的KCNQ1等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变KCNQ1等位基因并且用野生型KCNQ1等位基因置换所述突变KCNQ1等位基因的能力。例如，可以通过用野生型KCNQ1构建体和shKCNQ1构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量KCNQ1表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低KCNQ1表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的KCNQ1表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在KCNQ1基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向KCNQ1的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQT1或SQTS的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与KCNQ1中的病原性突变相关的LQT1或SQTS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥和/或癫痫发作等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性KCNQ1突变相关的LQT1或SQTS的哺乳动物的有效SupRep治疗可能产生与健康个体的IKs电流密度和/或心脏APD类似的IKs电流密度和/或心脏APD。
在另一个实施例中，患有与KCNH2基因中的病原性突变相关的LQT2或SQTS的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含KCNH2基因中的病原性突变。KCNH2基因中或由KCNH2基因编码的病原性突变包含但不限于c.1764C>G(p.N588K)、c.82A>G(p.K28E)、c.2893G>T(p.G965X)、c.3036_3048del(p.R1014fs)和c.3107_3111dup(p.V1038fs)。还参见，Hedley等人,《人类突变》2009,30:1486-1551；Curran等人,《细胞(Cell)》1995,80:795-803；以及Smith等人,《心律失常杂志》2016,32(5):373-380。靶向突变KCNH2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变KCNH2等位基因并且用野生型KCNH2等位基因置换所述突变KCNH2等位基因。靶向突变KCNH2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关KCNH2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关KCNH2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的KCNH2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变KCNH2等位基因并且用野生型KCNH2等位基因置换所述KCNH2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型KCNH2构建体和shKCNH2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量KCNH2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低KCNH2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的KCNH2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在KCNH2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向KCNH2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQT2或SQTS的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与KCNH2中的病原性突变相关的LQT2或SQTS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥(例如，在剧烈运动或情绪困扰的时段期间)和/或癫痫发作等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性KCNH2突变相关的LQT2或SQTS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使APD缩短至与健康个体的长度类似的长度，使得APD在正常范围内。
在另一个实施例中，患有与SCN5A基因中的病原性突变相关的LQT3或BrS的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含SCN5A基因中的病原性突变。SCN5A基因中或由SCN5A基因编码的病原性突变包含但不限于c.100C>T(p.R34C)、c.1571C>A(p.S524Y)、c.1673A>G(p.H558R)、c.3308C>A(p.S1103Y)、c.3578G>A(p.R1193Q)、c.3908C>T(p.T1304M)、c.4509_4516del(p.1505–1507del)、c.4865G>A(p.R1623Q)和c.5851G>T(p.V1951L)。还参见，Kapa等人,《循环》2009,120:1752-1760；以及Hedley等人,《人类突变》2009,30:1486-1551。靶向突变SCN5A等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变SCN5A等位基因并且用野生型SCN5A等位基因置换所述突变SCN5A等位基因。靶向突变SCN5A等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关SCN5A等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关SCN5A等位基因的区域来靶向含有病原性突变的SCN5A等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变SCN5A等位基因并且用野生型基因等位基因置换所述SCN5A等位基因的能力。例如，可以通过用野生型SCN5A构建体和shSCN5A构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量SCN5A表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低SCN5A表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的SCN5A表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在SCN5A基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向SCN5A的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQT3或BrS的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与SCN5A中的病原性突变相关的LQT3或BrS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如昏厥和/或癫痫发作等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性SCN5A突变相关的LQT3或BrS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使APD缩短至与健康个体的长度类似的长度，使得APD在正常范围内。
在另一个实施例中，患有与MYH7基因中的病原性突变相关的HCM或DCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含MYH7基因中的病原性突变。MYH7基因中或由MYH7基因编码的病原性突变包含但不限于c.1156T>C(p.Y386H)、c.1680T>C(p.S532P)、c.1816G>A(p.V606M)、c.2602G>C(p.A868P)、c.2945T>C(p.M982T)、c.4258A>T(p.R1420W)和c.5779A>T(p.I1927F)。还参见，Millat等人,《欧洲医学遗传学杂志(Eur J MedGenet.)》2010,53:261-267；Van Driest等人,《梅奥临床学报(Mayo Clin Proc)》2005,80(4):463-469；参考文献。靶向突变MYH7等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变MYH7等位基因并且用野生型MYH7等位基因置换所述突变MYH7等位基因。靶向突变MYH7等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关MYH7等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关MYH7等位基因的区域来靶向含有病原性突变的MYH7等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变MYH7等位基因并且用野生型基因等位基因置换所述MYH7等位基因的能力。例如，可以通过用野生型MYH7构建体和shMYH7构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量MYH7表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低MYH7表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的MYH7表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在MYH7基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向MYH7的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的HCM或DCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与MYH7中的病原性突变相关的HCM或DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、疲劳、腿和/或脚踝水肿、胸痛、心律失常、昏厥、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性MYH7突变相关的HCM或DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得心脏肥大和心肌细胞大小减少，和/或间质纤维化和心肌混乱减少。
在另一个实施例中，患有与DSP基因中的病原性突变相关的ACM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含DSP基因中的病原性突变。DSP基因中或由DSP基因编码的病原性突变包含但不限于c.151C>T(p.N51X)、c.478C>T(p.R160X)、c.897C>G(p.S299R)、c.1264G>A(p.E422K)、c.1333A>G(p.I445V)、c.3160_3169delAAGAACAA(p.K1052fsX26)、c.3337C>T(p.R1113X)、c.4775A>G(p.K1592R)、c.5212C>T(p.R1738X)、c.6478C>T(p.R2160X)和c.6496C>T(p.R2166X)。还参见，Bhonsale等人,《欧洲心脏杂志》2015,36(14):847-855；Sen-Chowdhry等人,《循环》2007,115:1710-1720；以及Norman等人,《循环》2005,112:636-642。靶向突变DSP等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变DSP等位基因并且用野生型DSP等位基因置换所述突变DSP等位基因。靶向突变DSP等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关DSP等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关DSP等位基因的区域来靶向含有病原性突变的DSP等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变DSP等位基因并且用野生型DSP等位基因置换所述突变DSP等位基因的能力。例如，可以通过用野生型DSP构建体和shDSP构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量DSP表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低DSP表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的DSP表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在DSP基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向DSP的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的ACM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与DSP中的病原性突变相关的ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心肌的纤维脂肪置换、室性心律失常、晕厥、持续性室性心动过速(VT)或纤维性颤动(VF)和/或心力衰竭等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性DSP突变相关的ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV炎症、纤维化和/或收缩功能障碍得以减轻。
在另一个实施例中，患有与MYBPC3基因中的病原性突变相关的HCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含MYBPC3基因中的病原性突变。MYBPC3基因中或由MYBPC3基因编码的病原性突变包含但不限于c.3535G>A(p.E1179K)、c.3413G>A(p.R1138H)、c.3392T>C(p.I1131T)、c.3106C>T(p.R1036C)、c.3004C>T(p.R1002W)、c.2992C>G(p.Q998E)、c.2870C>G(p.T957S)、c.2686G>A(p.V896M)、c.2498C>T(p.A833V)、c.2497G>A(p.A833T)、c.1144C>T(p.R382TW)、c.977G>A(p.R326Q)、c.706A>G(p.S236G)和c.472G>A(p.V158M)。还参见，Helms等人,《循环：基因组与精准医学(Circ:Gen PrecisionMed.)》2020,13:396-405；Carrier等人,《基因(Gene.)》2015,573(2):188-197；Millat等人,同上；以及Page等人,《循环：心血管遗传学(Circ Cardiovasc Genet.)》2012,5:156-166。靶向突变MYBPC3等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变MYBPC3等位基因并且用野生型MYBPC3等位基因置换所述突变MYBPC3等位基因。靶向突变MYBPC3等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关MYBPC3等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关MYBPC3等位基因的区域来靶向含有病原性突变的MYBPC3等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变MYBPC3等位基因并且用野生型MYBPC3等位基因置换所述MYBPC3等位基因的能力。例如，可以通过用野生型MYBPC3构建体和shMYBPC3构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量MYBPC3表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低MYBPC3表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的MYBPC3表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在MYBPC3基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向MYBPC3的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的HCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与MYBPC3中的病原性突变相关的HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕和/或疲劳等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性MYBPC3突变相关的HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善和/或能量消耗得以降低。
在另一个实施例中，患有与RBM20基因中的病原性突变相关的DCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含RBM20基因中的病原性突变。RBM20基因中或由RBM20基因编码的病原性突变包含但不限于c.1913C>T(p.P638L)、c.1901G>A(p.R634Q)、c.1906C>A(p.R636S)、c.1907G>A(p.R636H)、c.1909A>G(p.S637G)、c.1661G>A(p.V535I)、c.1958C>T(p.R634W)、c.1964C>T(p.R636C)和c.2205G>A(p.R716Q)。还参见，Brauch等人,《美国心脏病学会杂志(J Am Coll Cardiol.)》2009,54:930-941；Li等人,《临床与转化科学(Clin Transl Sci.)》2010,3:90-97；以及Refaat等人,《心律学》2012,9:390-396。靶向突变RBM20等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变RBM20等位基因并且用野生型RBM20等位基因置换所述突变RBM20等位基因。靶向突变RBM20等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关RBM20等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关RBM20等位基因的区域来靶向含有病原性突变的RBM20等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变RBM20等位基因并且用野生型RBM20等位基因置换所述突变RBM20等位基因的能力。例如，可以通过用野生型RBM20构建体和shRBM20构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量RBM20表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低RBM20表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的RBM20表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在RBM20基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向RBM20的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与RBM20中的病原性突变相关的DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、疲劳、腿和/或脚踝水肿、胸痛、心律失常、昏厥、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性RBM20突变相关的DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与CACNA1C基因中的病原性突变相关的LQTS或提摩西综合征的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含CACNA1C基因中的病原性突变。CACNA1C基因中或由CACNA1C基因编码的病原性突变包含但不限于c.2570C>G(p.P857R)、c.2500A>G(p.K834Q)、c.2570C>T(p.P857L)、c.5717G>A(p.R1906Q)、c.82G>A(p.A28T)、c.2578C>G(p.R860G)、c.3497T>C(p.I166T)、c.3496A>G(p.I1166V)、c.4425C>G(p.I1475M)和c.4486G>A(p.E1496K)。还参见，Boczek等人,《循环：心血管遗传学》2013,6(3):279-289；等人,《分子与细胞心脏病学杂志(J Mol Cell Cardiol.)》2015,80:186-195；参考文献。靶向突变CACNA1C等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变CACNA1C等位基因并且用野生型CACNA1C等位基因置换所述突变CACNA1C等位基因。靶向突变CACNA1C等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关CACNA1C等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关CACNA1C等位基因的区域来靶向含有病原性突变的CACNA1C等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变CACNA1C等位基因并且用野生型CACNA1C等位基因置换所述突变CACNA1C等位基因的能力。例如，可以通过用野生型CACNA1C构建体和shCACNA1C构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量CACNA1C表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低CACNA1C表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的CACNA1C表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在CACNA1C基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向CACNA1C的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQTS或提摩西综合征的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与CACNA1C中的病原性突变相关的LQTS或提摩西综合征的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥、癫痫发作、低血糖发作和/或低体温发作等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性CACNA1C突变相关的LQTS或提摩西综合征的哺乳动物的有效SupRep治疗可能产生与健康个体的IKs电流密度和/或心脏APD类似的IKs电流密度和/或心脏APD。
在另一个实施例中，患有与PKP2基因中的病原性突变相关的ACM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含PKP2基因中的病原性突变。PKP2基因中或由PKP2基因编码的病原性突变包含但不限于c.235C>T(p.R79X)、c.397C>T(p.Q133X)、c.2386T>C(p.C796R)、c.2011delC(p.P671fsX683)、c.1368delA(p.N456fsX458)、c.145-148delCAGA(p.S50fsX110)、c.2509delA(p.V837fsX930)、c.2489+1G>A(p.突变剪接产物)、c.1171-2A>G(p.突变剪接产物)、c.2146-1G>C(p.突变剪接产物)、c.2197-2202insGdelCACACC(p.A733fsX740)、c.1613G>A(p.W538X)、c.1271T>C(p.F424S)、c.1642delG(p.V548fsX562)和c.419C>T(p.S140F)。还参见，Dalal等人,《循环》2006,113:1641-1649；van Tintelen等人,《循环》2006,113(13):1650-1658；以及Fressart等人,《欧洲起博、心律失常和心电生理学期刊(Europace.)》2010,12(6):861-868。靶向突变PKP2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变PKP2等位基因并且用野生型PKP2等位基因置换所述突变PKP2等位基因。靶向突变PKP2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关PKP2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关PKP2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的PKP2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变PKP2等位基因并且用野生型PKP2等位基因置换所述突变PKP2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型PKP2构建体和shPKP2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量PKP2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低PKP2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的PKP2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在PKP2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向PKP2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的ACM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与PKP2中的病原性突变相关的ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心肌的纤维脂肪置换、室性心律失常、晕厥、持续性VT或VF和/或心力衰竭等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性PKP2突变相关的ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV炎症、纤维化和/或收缩功能障碍得以减轻。
在另一个实施例中，患有与DSG2基因中的病原性突变相关的ACM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含DSG2基因中的病原性突变。DSG2基因中或由DSG2基因编码的病原性突变包含但不限于c.378+1G>T(p.突变剪接产物)、c.560A>G(p.D187G)、c.146G>A(p.R49H)、c.560A>G(p.D187G)、c.1520G>A(p.C507Y)、c.1003A>G(p.T335A)和c.961T>A(p.F321I)，以及产生p.K294E、p.D154E、p.V392I、p.L772X和p.R773K的突变。还参见，Brodehl等人,《国际分子科学杂志(Int J Mol Sci.)》2021,22(7):3786；Debus等人,《分子与细胞心脏病学杂志》2019,129:303-313；以及Xu等人,《美国心脏病学会杂志》2010,55(6):587-597。靶向突变DSG2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变DSG2等位基因并且用野生型DSG2等位基因置换所述突变DSG2等位基因。靶向突变DSG2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关DSG2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关DSG2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的DSG2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变DSG2等位基因并且用野生型DSG2等位基因置换所述突变DSG2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型DSG2构建体和shDSG2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量DSG2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低DSG2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的DSG2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在DSG2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向DSG2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的ACM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与DSG2中的病原性突变相关的ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心肌的纤维脂肪置换、室性心律失常、晕厥、持续性VT或VF和/或心力衰竭等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性DSG2突变相关的ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV炎症、纤维化和/或收缩功能障碍得以减轻。
在另一个实施例中，患有与DES基因中的病原性突变相关的ACM、DCM、LVNC或骨骼肌病的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含DES基因中的病原性突变。DES基因中或由DES基因编码的病原性突变包含但不限于c.407C>T(p.L136P)、c.1009G>C(p.A337P)、c.1013T>G(p.L338R)、c.1195G>T(p.D399Y)和c.1201G>A(p.E401K)。还参见，Brodehl等人,《分子与细胞心脏病学杂志》2016,91:207-214；Goudeau等人,《人类突变》2006,27(9):906–913；参考文献。靶向突变DES等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变DES等位基因并且用野生型DES等位基因置换所述突变DES等位基因。靶向突变DES等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关DES等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关DES等位基因的区域来靶向含有病原性突变的DES等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变DES等位基因并且用野生型DES等位基因置换所述突变DES等位基因的能力。例如，可以通过用野生型DES构建体和shDES构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量DES表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低DES表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的DES表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在DES基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向DES的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的ACM、DCM、LVNC或骨骼肌病的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与DES中的病原性突变相关的ACM、DCM、LVNC或骨骼肌病的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心肌的纤维脂肪置换、室性心律失常、昏厥、持续性VT或VF、呼吸困难、疲劳、腿和/或脚踝水肿、胸痛、头晕、心悸和/或心力衰竭等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性DES突变相关的ACM、DCM、LVNC或骨骼肌病的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV炎症、纤维化、收缩功能障碍和/或心内膜心肌小梁得以减少，以及LV尺寸得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与KCNJ2基因中的病原性突变相关的ATS(也称为LQT7)或CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含KCNJ2基因中的病原性突变。KCNJ2基因中或由KCNJ2基因编码的病原性突变包含但不限于c.199C>T(p.R67W)、c.271_282del12(p.A91_L94del)、c.653G>A(p.R218Q)、c.953A>G(p.N318S)、c.966G>C(p.W322C)和c.1244C>T(p.P415L)。还参见，Limberg等人,《心脏病学基础研究(Basic ResCardiol.)》2013,108:353；Andelfinger等人,《美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet.)》2002,71(3):663-668；以及Tristani-Firouzi等人,《临床研究杂志(J Clin Invest.)》2002,110(3):381-388。靶向突变KCNJ2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变KCNJ2等位基因并且用野生型KCNJ2等位基因置换所述突变KCNJ2等位基因。靶向突变KCNJ2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关KCNJ2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关KCNJ2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的KCNJ2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变KCNJ2等位基因并且用野生型KCNJ2等位基因置换所述突变KCNJ2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型KCNJ2构建体和shKCNJ2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量KCNJ2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低KCNJ2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的KCNJ2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在KCNJ2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向KCNJ2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的ATS或CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与KCNJ2中的病原性突变相关的ATS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如肌无力、昏厥、头晕、眩晕、周期性麻痹和/或心律失常(例如，VT)等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性KCNJ2突变相关的ATS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得心律得以正常化和/或得以调节。
在另一个实施例中，患有与CASQ2基因中的病原性突变相关的CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含CASQ2基因中的病原性突变。CASQ2基因中或由CASQ2基因编码的病原性突变包含但不限于c.62delA(p.E21Gfs*15)、c.97C>T(p.R33*)、c.98G>A(p.R33Q)、c.115G>T(p.E39*)、c.115G>A(p.E39K)、c.158G>T(p.C53F)、c.164A>G(p.Y55C)、c.199C>T(p.Q67*)、c.204delA(p.K68Nfs*5)、c.213delA(p.Q71Hfs*2)、c.230T>C(p.L77P)、c.234+2T>C(p.突变体剪接位点)、c.259A>T(p.K87*)、c.339-354del(p.S113Rfs*6)、c.500T>A(p.L167H)、c.518G>T(p.S173I)、c.532+1G>A(p.突变体剪接位点)、c.539A>G(p.K180R)、c.545T>C(p.F182S)、c.546delT(p.F182Lfs*28)、c.572C>T(p.P191L)、c.603delA(p.V203Lfs*7)、c.618A>C(p.K206N)和c.691C>T(p.P231S)。还参见，Ng等人,《循环》2020,142(10):932-947；以及Gray等人,《心律学》2016,13(8):1652-1660。靶向突变CASQ2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变CASQ2等位基因并且用野生型CASQ2等位基因置换所述突变CASQ2等位基因。靶向突变CASQ2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关CASQ2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关CASQ2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的CASQ2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变CASQ2等位基因并且用野生型CASQ2等位基因置换所述突变CASQ2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型CASQ2构建体和shCASQ2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量CASQ2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低CASQ2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的CASQ2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在CASQ2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向CASQ2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与CASQ2中的病原性突变相关的CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如眩晕、头晕、昏厥和/或VT等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性CASQ2突变相关的CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得心律得以正常化和/或得以调节。
在另一个实施例中，患有与LMNA基因中的病原性突变相关的DCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含LMNA基因中的病原性突变。LMNA基因中或由LMNA基因编码的病原性突变包含但不限于c.481G>A(p.E161K)、c.1130G>A(p.R377H)、c.1621C>T(p.R541C)、c.1621C>G(p.R541G)、c.266G>T(p.R89L)、c.736C>T(p.Q246*)、c.1197_1240del44(p.G400Rfs*11)、c.1292C>G(p.S431*)、1526_1527insC(p.T510Yfs*42)、c.1443C>G(p.Y481*)和c.767T>G(p.V256G)。还参见，Saj等人,《BMC医学遗传学(BMC MedGenet.)》2013,14:55；Sebillon等人,《医学遗传学杂志(J Med Genet.)》2003,40:560-567；以及Parks等人,《美国心脏杂志(Am Heart J.)》2008,156(1):161-169。靶向突变LMNA等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变LMNA等位基因并且用野生型LMNA等位基因置换所述突变LMNA等位基因。靶向突变LMNA等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关LMNA等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关LMNA等位基因的区域来靶向含有病原性突变的LMNA等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变LMNA等位基因并且用野生型LMNA等位基因置换所述突变LMNA等位基因的能力。例如，可以通过用野生型LMNA构建体和shLMNA构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量LMNA表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低LMNA表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的LMNA表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在LMNA基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向LMNA的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与LMNA中的病原性突变相关的DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、疲劳、腿和/或脚踝水肿、胸痛、心律失常、昏厥、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性LMNA突变相关的DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与TPM1基因中的病原性突变相关的DCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含TPM1基因中的病原性突变。TPM1基因中或由TPM1基因编码的病原性突变包含但不限于c.688G>A(p.D230N)、c.688G>A(p.D230N)、c.23T>G(p.M8R)、c.632C>G(p.A211G)、c.725C>T(p.A242V)、c.163G>A(p.D55N)、c.337C>G(p.L113V)、c.341A>G(p.E114G)、c.275T>C(p.I92T)、c.423G>C(p.M141I)和c.416A>T(p.E139V)。还参见，Pugh等人,《遗传医学(Genet Med.)》2014,16:601-608；以及McNally和Mestroni,《循环研究(Circ Res.)》2017,121:731-748。靶向突变TPM1等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变TPM1等位基因并且用野生型TPM1等位基因置换所述突变TPM1等位基因。靶向突变TPM1等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关TPM1等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关TPM1等位基因的区域来靶向含有病原性突变的TPM1等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变TPM1等位基因并且用野生型TPM1等位基因置换所述突变TPM1等位基因的能力。例如，可以通过用野生型TPM1构建体和shTPM1构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量TPM1表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低TPM1表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的TPM1表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在TPM1基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向TPM1的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与TPM1中的病原性突变相关的DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、疲劳、腿和/或脚踝水肿、胸痛、心律失常、昏厥、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性TPM1突变相关的DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与PLN基因中的病原性突变相关的DCM或ACM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含PLN基因中的病原性突变。PLN基因中或由PLN基因编码的病原性突变包含但不限于c.40_42delAGA(p.R14del)、c.116T>G(p.L39X)和c.25C>T(p.R9C)。还参见，te Rijdt等人,《心血管病理杂志(Cardiovasc Pathol.)》2019,40:2-6；Groeneweg等人,《美国心脏病学杂志(Am JCardiol.)》2013,112:1197-1206；Fish等人,《科学报告(Sci Rep.)》2016,22235；以及Haghighi等人,《临床研究杂志》2003,111(6):869-876。靶向突变PLN等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变PLN等位基因并且用野生型PLN等位基因置换所述突变PLN等位基因。靶向突变PLN等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关PLN等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关PLN等位基因的区域来靶向含有病原性突变的PLN等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变PLN等位基因并且用野生型PLN等位基因置换所述突变PLN等位基因的能力。例如，可以通过用野生型PLN构建体和shPLN构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量PLN表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低PLN表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的PLN表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在PLN基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向PLN的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM或ACM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与PLN中的病原性突变相关的DCM或ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、疲劳、腿和/或脚踝水肿、胸痛、心律失常、昏厥、头晕、心悸、心肌的纤维脂肪置换、持续性VT或VF、和/或心力衰竭等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性PLN突变相关的DCM或ACM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得LV大小得以正常化、LV得以增强、LV炎症得以减轻、纤维化得以减轻和/或收缩功能障碍得以减轻。
在另一个实施例中，患有与LDLR基因中的病原性突变相关的FH的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含LDLR基因中的病原性突变。LDLR基因中或由LDLR基因编码的病原性突变包含但不限于c.1845+2T>C、c.1012T>A(p.C338S)、c.1297G>C(p.D433H)、c.1702C>G(p.L568V)和c.2431A>T(p.K811*)、c.97C>T(p.Q33X)、c.357delG(p.K120fs)、c.428G>A(p.C143Y)、c.517T>C(p.C173R)、c.1448G>A(p.W483X)、c.1744C>T(p.L582F)、c.1757C>A(p.S586X)和c.1879G>A(p.A627T)。还参见，Tada等人,《临床血脂学杂志(J Clin Lipidol.)》2020,14(3):346-351；Wang等人,《老年心脏病杂志(J GeriatrCardiol.)》2018,15(6):434-440；Hori等人,《动脉粥样硬化(Atherosclerosis.)》2019,289:101-108；以及Galicia-Garcia等人,《科学报告》2020,10:1727。靶向突变LDLR等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变LDLR等位基因并且用野生型LDLR等位基因置换所述突变LDLR等位基因。靶向突变LDLR等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关LDLR等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关LDLR等位基因的区域来靶向含有病原性突变的LDLR等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变LDLR等位基因并且用野生型LDLR等位基因置换所述突变LDLR等位基因的能力。例如，可以通过用野生型LDLR构建体和shLDLR构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量LDLR表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低LDLR表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的LDLR表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在LDLR基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向LDLR的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的FH的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与LDLR中的病原性突变相关的FH的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、心绞痛和/或黄色瘤等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性LDLR突变相关的FH的哺乳动物的有效SupRep治疗可以缓解与FH相关的脑血管疾病和/或外周血管疾病。
在另一个实施例中，患有与PCSK9基因中的病原性突变相关的FH的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含PCSK9基因中的病原性突变。PCSK9基因中或由PCSK9基因编码的病原性突变包含但不限于c.381T>A(p.S127R)、c.644G>A(p.R215H)、c.646T>C(p.F216L)、c.1120G>T(p.D374Y)和c.1486C>T(p.R496W)，以及p.N157K、p.R218S、p.R237W、p.E670G、p.R218S、p.R357H、p.R469W、p.A443T、p.R496W、p.N425S、p.D374H、p.D129G、p.A168E、p.G236S、p.N354I、p.A245T、p.R272Q、p.R272Q和p.A245T。还参见，Hori等人,同上；Youngblom等人,“家族性高胆固醇血症(Familial Hypercholesterolemia)”,2014年1月2日(更新日期2016年12月8日),在以下中：Adam等人编辑,西雅图华盛顿大学(University of Washington,Seattle)；以及Guo等人,《遗传学前沿(Front Genet.)》2020,11:1020。靶向突变PCSK9等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变PCSK9等位基因并且用野生型PCSK9等位基因置换所述突变PCSK9等位基因。靶向突变PCSK9等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关PCSK9等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关PCSK9等位基因的区域来靶向含有病原性突变的PCSK9等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变PCSK9等位基因并且用野生型PCSK9等位基因置换所述突变PCSK9等位基因的能力。例如，可以通过用野生型PCSK9构建体和shPCSK9构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量PCSK9表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低PCSK9表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的PCSK9表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在PCSK9基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向PCSK9的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的FH的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与PCSK9中的病原性突变相关的FH的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、心绞痛和/或黄色瘤等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性PCSK9突变相关的FH的哺乳动物的有效SupRep治疗可以缓解与FH相关的脑血管疾病和/或外周血管疾病。/>
在另一个实施例中，患有与TNNT2基因中的病原性突变相关的HCM或DCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含TNNT2基因中的病原性突变。TNNT2基因中或由TNNT2基因编码的病原性突变包含但不限于c.421C>T(p.R141W)和c.835C>T(p.Q279X)，以及p.P80S、p.D86A、p.R92L、p.K97N、p.K124N、p.R130C、p.R134G和p.R144W。还参见，Long等人,《美国心脏协会杂志(J Am Heart Assoc.)》2015,4(12):e002443；Gao等人,《医学(Medicine.)》2020,99(34):e21843；Millat等人,同上；以及Hershberger等人,《循环：心血管遗传学》2009,2:306-313。靶向突变TNNT2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变TNNT2等位基因并且用野生型TNNT2等位基因置换所述突变TNNT2等位基因。靶向突变TNNT2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关TNNT2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关TNNT2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的TNNT2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变TNNT2等位基因并且用野生型TNNT2等位基因置换所述突变TNNT2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型TNNT2构建体和shTNNT2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量TNNT2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低TNNT2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的TNNT2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在TNNT2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向TNNT2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的HCM或DCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与TNNT2中的病原性突变相关的HCM或DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕、疲劳、腿和/或脚踝水肿、心律不齐、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性TNNT2突变相关的HCM或DCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善、能量消耗得以减少、LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与CALM1基因中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含CALM1基因中的病原性突变。CALM1基因中或由CALM1基因编码的病原性突变包含但不限于p.N54I、p.F90L、p.N98S、p.E105A、p.D130G、p.D132V、p.E141G和p.F142L。还参见，Jensen等人,《分子神经科学前沿(FrontMol Neurosci.)》2018,11:396；以及Boczek等人,《循环：心血管遗传学》2016,9:136-146。靶向突变CALM1等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变CALM1等位基因并且用野生型CALM1等位基因置换所述突变CALM1等位基因。靶向突变CALM1等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关CALM1等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关CALM1等位基因的区域来靶向含有病原性突变的CALM1等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变CALM1等位基因并且用野生型CALM1等位基因置换所述突变CALM1等位基因的能力。例如，可以通过用野生型CALM1构建体和sh基因构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量CALM1表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低CALM1表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的CALM1表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在CALM1基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向CALM1的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQTS或CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与CALM1中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥、癫痫发作、眩晕、头晕和/或VT等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性CALM1突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得IKs电流密度得以正常化、心脏APD得以正常化和/或心律得以调节。
在另一个实施例中，患有与CALM2基因中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含CALM2基因中的病原性突变。CALM2基因中或由CALM2基因编码的病原性突变包含但不限于p.D96V、p.N98I、p.N98S、p.D130G、p.D130V、p.E132E、p.D132H、p.D134H和p.Q136P。还参见，Jensen等人,同上；以及Boczek等人同上。靶向突变CALM2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变CALM2等位基因并且用野生型CALM2等位基因置换所述突变CALM2等位基因。靶向突变CALM2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关CALM2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关CALM2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的CALM2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变CALM2等位基因并且用野生型CALM2等位基因置换所述突变CALM2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型CALM2构建体和sh基因构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量CALM2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低CALM2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的CALM2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在CALM2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向CALM2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQTS或CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与CALM2中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥、癫痫发作、眩晕、头晕和/或VT等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性CALM2突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得IKs电流密度得以正常化、心脏APD得以正常化和/或心律得以调节。
在另一个实施例中，患有与CALM3基因中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含CALM3基因中的病原性突变。CALM3基因中或由CALM3基因编码的病原性突变包含但不限于p.D96H、p.A103V、p.D130G和p.F142L。还参见，Jensen等人,同上；以及Boczek等人同上。靶向突变CALM3等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变CALM3等位基因并且用野生型CALM3等位基因置换所述突变CALM3等位基因。靶向突变CALM3等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关CALM3等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关CALM3等位基因的区域来靶向含有病原性突变的CALM3等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变CALM3等位基因并且用野生型CALM3等位基因置换所述突变CALM3等位基因的能力。例如，可以通过用野生型CALM3构建体和sh基因构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量CALM3表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低CALM3表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的CALM3表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在CALM3基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向CALM3的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQTS或CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与CALM3中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥、癫痫发作、眩晕、头晕和/或VT等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性CALM3突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得IKs电流密度得以正常化、心脏APD得以正常化和/或心律得以调节。
在另一个实施例中，患有与TRDN基因中的病原性突变相关的TKOS的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含TRDN基因中的病原性突变。TRDN基因中或由TRDN基因编码的病原性突变包含但不限于c.613C>T(p.Q205X)、c.22+29A>G(p.N9fs*5)、c.438_442delTAAGA(p.K147fs*0)、c.53_56delACAG(p.D18fs*13)、c.423delA(p.E142fs*33)、c.502G>T(p.E168X)、c.503G>T(p.E168X)、c.545_546insA(p.K182fs*10)、c.420delA(p.K140fs*34)、c.176C>G(p.T59R)、c.613C>T(p.Q205X)、c.53_56delACAG(p.D18fs*13)、c.618delG(p.A208fs*15)和c.232+2T>A。还参见，Clemens等人,《循环：基因组与精准医学》12(2):e002419；以及Altmann等人,《循环》2015,131(23):2051-2060。靶向突变TRDN等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变TRDN等位基因并且用野生型TRDN等位基因置换所述突变TRDN等位基因。靶向突变TRDN等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关TRDN等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关TRDN等位基因的区域来靶向含有病原性突变的TRDN等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变TRDN等位基因并且用野生型TRDN等位基因置换所述突变TRDN等位基因的能力。例如，可以通过用野生型TRDN构建体和shTRDN构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量TRDN表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低TRDN表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的TRDN表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在TRDN基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向TRDN的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的TKOS的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与TRDN中的病原性突变相关的TKOS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如昏厥、骨骼肌病和/或近端肌无力等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性TRDN突变相关的TKOS的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得T波倒置和/或QT延长得以校正。
在另一个实施例中，患有与RYR2基因中的病原性突变相关的CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含RYR2基因中的病原性突变。RYR2基因中或由RYR2基因编码的病原性突变包含但不限于c.1258C>T(p.R420W)、c.1259G>A(p.R420Q)、c.1519G>A(p.V507I)、c.3407C>T(p.A1136V)、c.5170G>A(p.E1724K)、c.5654G>A(p.G1885E)、c.5656G>A(p.G1886S)、c.6504C>G(p.H2168Q)、c.7158G>A(p.A2387T)、c.8874A>G(p.Q2958R)、c.12533A>G(p.N4178S)、c.13528G>A(p.A4510T)、c.14311G>A(p.V4771I)、c.14542G>A(p.I4848V)和c.14876G>A(p.R4959Q)。还参见，Medeiros-Domingo等人,《美国心脏病学会杂志》2009,54(22):2065-2074；以及Jiang等人,《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci USA.)》2004,101(35):13062-13067。靶向突变RYR2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变RYR2等位基因并且用野生型RYR2等位基因置换所述突变RYR2等位基因。靶向突变RYR2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关RYR2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关RYR2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的RYR2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变RYR2等位基因并且用野生型RYR2等位基因置换所述突变RYR2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型RYR2构建体和shRYR2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量RYR2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低RYR2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的RYR2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在RYR2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向RYR2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与RYR2中的病原性突变相关的CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如眩晕、头晕、昏厥和/或VT等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性RYR2突变相关的CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得心律得以正常化和/或得以调节。
在另一个实施例中，患有与APOB基因中的病原性突变相关的FH的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含APOB基因中的病原性突变。APOB基因中或由APOB基因编码的病原性突变包含但不限于c.10093C>G(p.H3365D)、c.4163G>A(p.R1388H)、c.10579C>T(p.R3527W)、p.P994L和p.T3826M。还参见，Alves等人,《动脉粥样硬化》2018,277:P448-456；Sun等人,《健康与疾病中的脂质(Lipids Health Dis.)》2018,17:252；以及Cui等人,《临床心脏病学(ClinCardiol.)》2019,42:385-390。靶向突变APOB等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变APOB等位基因并且用野生型APOB等位基因置换所述突变APOB等位基因。靶向突变APOB等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关APOB等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关APOB等位基因的区域来靶向含有病原性突变的APOB等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变APOB等位基因并且用野生型APOB等位基因置换所述突变APOB等位基因的能力。例如，可以通过用野生型APOB构建体和shAPOB构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量APOB表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低APOB表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的APOB表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在APOB基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向APOB的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的FH的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与APOB中的病原性突变相关的FH的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如升高的总胆固醇水平和LDL胆固醇水平、心绞痛和/或黄色瘤等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性APOB突变相关的FH的哺乳动物的有效SupRep治疗可以缓解与FH相关的脑血管疾病和/或外周血管疾病。
在另一个实施例中，患有与TNNI3基因中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含TNNI3基因中的病原性突变。TNNI3基因中或由TNNI3基因编码的病原性突变包含但不限于p.K36Q、p.N185K和p.98截短、c.407G>A(p.R136Q)、c.433C>T(p.R145W)、c.448A>T(p.S150C)、c.549G>T(p.K183N)和c.557G>A(p.R186Q)。还参见，Bollen等人,《生理学杂志(J Physiol.)》2017,595(14):4677-4693；以及Millat等人,同上。靶向突变TNNI3等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变TNNI3等位基因并且用野生型TNNI3等位基因置换所述突变TNNI3等位基因。靶向突变TNNI3等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关TNNI3等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关TNNI3等位基因的区域来靶向含有病原性突变的TNNI3等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变TNNI3等位基因并且用野生型TNNI3等位基因置换所述突变TNNI3等位基因的能力。例如，可以通过用野生型TNNI3构建体和shTNNI3构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量TNNI3表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低TNNI3表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的TNNI3表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在TNNI3基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向TNNI3的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM或HCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与TNNI3中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕、疲劳、腿和/或脚踝水肿、心律不齐、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性TNNI3突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善、能量消耗得以减少、LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与TNNC1基因中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含TNNC1基因中的病原性突变。TNNC1基因中或由TNNC1基因编码的病原性突变包含但不限于c.91G>T(p.A31S)、p.Y5H、p.M103I、p.I148V、p.A8V、p.L29Q、p.C84Y、p.E134D、p.D145E和p.Q122AfsX30。还参见，Parvatiyar等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》2012,287(38):31845-31855；以及Veltri等人,《生理学前沿(Front Physiol.)》2017,8:221。靶向突变TNNC1等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变TNNC1等位基因并且用野生型TNNC1等位基因置换所述突变TNNC1等位基因。靶向突变TNNC1等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关TNNC1等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关TNNC1等位基因的区域来靶向含有病原性突变的TNNC1等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变TNNC1等位基因并且用野生型TNNC1等位基因置换所述突变TNNC1等位基因的能力。例如，可以通过用野生型TNNC1构建体和shTNNC1构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量TNNC1表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低TNNC1表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的TNNC1表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在TNNC1基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向TNNC1的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM或HCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与TNNC1中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕、疲劳、腿和/或脚踝水肿、心律不齐、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性TNNC1突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善、能量消耗得以减少、LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与MYL2基因中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含MYL2基因中的病原性突变。MYL2基因中或由MYL2基因编码的病原性突变包含但不限于p.D94A、p.D166A、p.P95A和p.I158L。还参见，Huang等人,《欧洲生物化学学会联合会杂志(FEBS J.)》2015,282(12):2379-2393；Alvarez-Acosta等人,《心血管疾病杂志(J Cardiovasc Dis.)》2014,2；以及Poetter等人,《自然遗传学(Nat Genet.)》1996,13:63-69。靶向突变MYL2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变MYL2等位基因并且用野生型MYL2等位基因置换所述突变MYL2等位基因。靶向突变MYL2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关MYL2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关MYL2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的MYL2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变MYL2等位基因并且用野生型MYL2等位基因置换所述突变MYL2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型MYL2构建体和shMYL2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量MYL2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低MYL2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的MYL2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在MYL2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向MYL2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM或HCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与MYL2中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕、疲劳、腿和/或脚踝水肿、心律不齐、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性MYL2突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善、能量消耗得以减少、LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与MYL3基因中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含MYL3基因中的病原性突变。MYL3基因中或由MYL3基因编码的病原性突变包含但不限于c.170C>G(p.A57G)、c.530A>G、c.2155C>T(p.R719W)、c.77C>T(p.A26V)、c.2654A>C(p.N885T)和c.1987C>T(p.R663C)。还参见，Poetter等人,同上；以及Zhao等人,《国际分子医学杂志(Int J Mol Med.)》2016,37:1511-1520。靶向突变MYL3等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变MYL3等位基因并且用野生型MYL3等位基因置换所述突变MYL3等位基因。靶向突变MYL3等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关MYL3等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关MYL3等位基因的区域来靶向含有病原性突变的MYL3等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变MYL3等位基因并且用野生型MYL3等位基因置换所述突变MYL3等位基因的能力。例如，可以通过用野生型MYL3构建体和shMYL3构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量MYL3表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低MYL3表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的MYL3表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在MYL3基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向MYL3的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM或HCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与MYL3中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕、疲劳、腿和/或脚踝水肿、心律不齐、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性MYL3突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善、能量消耗得以减少、LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与JPH2基因中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含JPH2基因中的病原性突变。JPH2基因中或由JPH2基因编码的病原性突变包含但不限于p.S101R、p.Y141H、p.S165F、p.T161K和p.E641X。还参见，Landstrom等人,《分子与细胞心脏病学杂志》2007,42:1026-1035；以及Jones等人,《科学报告》2019,9:9038。靶向突变JPH2等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变JPH2等位基因并且用野生型JPH2等位基因置换所述突变JPH2等位基因。靶向突变JPH2等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关JPH2等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关JPH2等位基因的区域来靶向含有病原性突变的JPH2等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变JPH2等位基因并且用野生型JPH2等位基因置换所述突变JPH2等位基因的能力。例如，可以通过用野生型JPH2构建体和shJPH2构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量JPH2表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低JPH2表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的JPH2表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在JPH2基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向JPH2的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的DCM或HCM的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与JPH2中的病原性突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、胸痛、昏厥、眩晕、疲劳、腿和/或脚踝水肿、心律不齐、头晕和/或心悸等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性JPH2突变相关的DCM或HCM的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善、能量消耗得以减少、LV大小得以正常化和/或LV得以增强。
在另一个实施例中，患有与CAV3基因中的病原性突变相关的LQTS、HCM或LGMD的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含CAV3基因中的病原性突变。CAV3基因中或由CAV3基因编码的病原性突变包含但不限于c.233C>T(p.T78M)、c.253G>A(p.A85T)、c.290T>G(p.F97C)、c.423C>G(p.S141R)、p.P104L和p.R27Q。还参见，Shah等人,《恶病质、肌肉减少症和肌肉杂志(J Cachexia Sarcopenia Muscle)》2020,11(3):838-858；以及Vatta等人,《循环》2006,114:2104-2112。靶向突变CAV3等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变CAV3等位基因并且用野生型CAV3等位基因置换所述突变CAV3等位基因。靶向突变CAV3等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关CAV3等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关CAV3等位基因的区域来靶向含有病原性突变的CAV3等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变CAV3等位基因并且用野生型CAV3等位基因置换所述突变CAV3等位基因的能力。例如，可以通过用野生型CAV3构建体和shCAV3构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量CAV3表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低CAV3表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的CAV3表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在CAV3基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向CAV3的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQTS、HCM或LGMD的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与CAV3中的病原性突变相关的LQTS、HCM或LGMD的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如呼吸困难、心跳加速、心律失常、胸痛、昏厥、眩晕、癫痫发作、疲劳、髋和肩区肌肉萎缩和/或无力、心肌病等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性CAV3突变相关的LQTS、HCM或LGMD的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得收缩力得以降低、舒张性得以改善和/或能量消耗得以减少。
在另一个实施例中，患有与TECRL基因中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物可以通过以下鉴定：例如分析从哺乳动物获得的生物样品(例如，使用PCR和/或DNA测序方法分析血液样品)以确定样品中的DNA是否包含TECRL基因中的病原性突变。TECRL基因中或由TECRL基因编码的病原性突变包含但不限于p.R196Q、c.331+1G>A、p.Q139X、p.P290H、p.S309X和p.V298A。还参见，Devalla等人,《欧洲分子生物学学会：分子医学(EMBOMol Med.)》2016,8(12):1390-1408；以及Moscu-Gregor等人,《心血管电生理学杂志(JCardiovasc Electrophysiol.)》2020,31(6):1527-1535。靶向突变TECRL等位基因的SupRep构建体可以被设计成抑制突变TECRL等位基因并且用野生型TECRL等位基因置换所述突变TECRL等位基因。靶向突变TECRL等位基因的SupRep构建体可以使用例如描述于本文的实例中的方法来设计和制备。例如，可以产生SupRep构建体，以通过靶向含有病原性突变的疾病相关TECRL等位基因的区域或通过靶向不含有病原性突变的疾病相关TECRL等位基因的区域来靶向含有病原性突变的TECRL等位基因。可以测试SupRep构建体抑制突变TECRL等位基因并且用野生型TECRL等位基因置换所述突变TECRL等位基因的能力。例如，可以通过用野生型TECRL构建体和shTECRL构建体共转染经培养的细胞并且用qRT-PCR和/或蛋白质印迹测量TECRL表达来在体外模型系统中测试构建体。可以选择具有相对高的敲低TECRL表达的能力(例如，在mRNA和/或蛋白质水平上敲低至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的TECRL表达的能力)的构建体。所选择的构建体可以被包装在病毒颗粒(例如，AAV颗粒)中，并且使用任何适当的施用途径(例如，通过直接注射到如心肌等组织中或通过腹膜内施用、鼻内施用、静脉内施用、鞘内施用、大脑内施用、实质内施用或以纳米颗粒和/或药片、胶囊或丸剂的形式口服递送)以例如约1010vg/kg至约1015vg/kg或约1010个AAV颗粒/mL至约1015个AAV颗粒/mL的剂量递送到被鉴定为在TECRL基因中具有病原性突变的哺乳动物。在一些情况下，靶向TECRL的SupRep构建体可以在非病毒载体中(例如，在质粒中或在与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子中)施用于哺乳动物，并且可以通过直接注射递送到组织(例如，心肌)、或通过腹膜内、鼻内、静脉内、鞘内、大脑内或实质内施用、或通过口服递送。在施用之后，可以监测哺乳动物的LQTS或CPVT的症状，以确定病症的一种或多种症状是否减轻。例如，对患有与TECRL中的病原性突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得如心跳加速、昏厥、癫痫发作、眩晕、头晕和/或VT等症状得以减轻。在一些情况下，对患有与病原性TECRL突变相关的LQTS或CPVT的哺乳动物的有效SupRep治疗可以使得IKs电流密度得以正常化、心脏APD得以正常化和/或心律得以调节。
本发明将在以下实例中进一步描述，所述实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
实例1-材料和方法
样品：人样品是从患有LQT1的患者以及从不相关的健康对照获得的(表2)。
质粒和KCNQ1-SupRep的克隆：使用NheI和BamHI限制性位点，将WT KCNQ1 cDNA(NM_000218.2)亚克隆到pIRES2-EGFP(加利福尼亚州山景城的克隆科技公司(Clontech；Mountain View,CA))中。使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦公司(Agilent；Santa Clara,CA))来将两个错义变体(p.T66S和p.Y67W)引入到EGFP的发色团结构域中，从而将其转化为青色荧光蛋白并产生pIRES2-CFP-KCNQ1-WT。使用pIRES2-CFP-KCNQ1-WT完成第二轮定点诱变，以引入KCNQ1变体p.Y171X、p.V254M和p.I567S(分别是c.513C>A、c.760G>A和c.1700T>G)。pGFP-C-shLenti主链中的四个预先设计的KCNQ1shRNA(sh#1-4)连同非靶向加扰shRNA对照(shCT)购自傲锐基因公司(OriGene)(马里兰州罗克维尔市(Rockville,MD))。shRNA序列列于表3A中。KCNQ1 sh#4被选择用于最终的KCNQ1-SupRep基因疗法载体并且贯穿本文档被称为shKCNQ1。合成在KCNQ1-WT cDNA的KCNQ1 sh#4(shKCNQ1)的靶序列内含有以下十个同义变体的DNA片段：c.1377C>T、c.1380C>A、c.1383T>C、c.1386C>T、c.1389T>C、c.1392T>C、c.1395A>C、c.1398G>A、c.1401G>A和c.1404C>T(分别为KCNQ1：p.D459D、p.G460G、p.Y461Y、p.D462D、p.S463S、p.S464S、p.V465V、p.R466R、p.K467K和p.S468S)，并且使用BgIII和PvuI限制位点将其克隆到pIRES2-CFP-KCNQ1-WT中以产生KCNQ1-shIMM(pIRES2-CFP-KCNQ1-shIMM)(新泽西州皮斯卡塔韦的金思特科技公司(GenScript；Piscataway,NJ))。然后使用5'MluI和3'BsrGI+reverseBsaI限制性位点，将KCNQ1-shIMM和CFP报告基因PCR亚克隆到含有shKCNQ1的pGFP-C-shLenti主链中，在过程中切除原始GFP以产生最终的KCNQ1-SupRep(pCFP-C-shLenti-shKCNQ1-KCNQ1-shIMM)。用于PCR克隆的引物是：5'-GGCACGCGTTTATGGCCGCGGCCTCCTC-3'(正向引物；SEQ ID No:1)和5'-GCCGGTCTCTGTACACCGCTTTACTTGTACAGCTC GTCC-3'(反向引物；SEQ ID NO:2)。
用于iPSC产生的LQT1和不相关的对照患者选择：患者由遗传心脏病专家和LQTS专家进行评估。分别通过4mm皮肤穿孔活检或血液样品收集真皮成纤维细胞或外周血单核细胞(PBMC)。从诊断患有多种遗传性心脏离子通道病(cardiac channelopathy)及其受影响或未受影响的家族成员的近1200名患者，包含236名患有LQT1的患者获得样品。选择四名LQT1患者来跨各种变体类型(一个无义、两个错义、一个同义剪接)和表型。这四名患者包含终身无症状患者和三名具有强LQT1表型的患者(定义为具有至少一个QTc大于500毫秒的ECG)、LQTS相关症状(晕厥、癫痫发作、近乎溺死、心脏骤停)的阳性史和LQTS相关症状的阳性家族史。选择拥有从头变体的患者的可能健康的未受影响的父亲作为不相关对照。
成纤维细胞/PBMC重编程为iPSC和质量控制：使用CytoTune-iPS 2.0重编程试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司(Thermo；Waltham,MA))通过仙台病毒转导或使用含有山中因子(Yamanaka factor)的四种游离型DNA质粒的电穿孔来重编程成纤维细胞或PBMC：pCXLE-hUL、pCXLE-hSK、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F和pCXWB-EBNA1(马萨诸塞州沃特敦的Addgene公司(Addgene；Watertown,MA))。在诱导后21天内挑取至少两个集落并且克隆地扩增。在37℃下，在5％ CO2温育箱中，将所有iPSC在补充有1％青霉素/链霉素的mTeSRTM1(加拿大温哥华(Vancouver,Canada))中在/>包被的(纽约州康宁的康宁公司(Corning；Corning,NY))6cm培养皿上培养。在85％汇合时，使用ReLeSR传代iPSC。然后对每个克隆进行核型分析。
除了具有KCNQ1-V254M(和随后的等基因对照)的患者之外，所有系都具有正常的核型，所述患者在13号染色体与22号染色体之间具有重编程诱导的平衡易位。编码对心脏动作电位至关重要的离子通道的基因没有位于13号染色体或22号染色体上，所以这些细胞仍然包含在研究中。KCNQ1变体确认是通过来自基因组DNA的PCR扩增子的桑格测序进行的。使用针对Oct4(赛默飞世尔公司，PA5-27438)、Nanog(赛默飞世尔公司，PA1-097)、Tra-1-60(得克萨斯州达拉斯的圣克鲁兹公司(Santa Cruz；Dallas,TX)；sc-21705)和SSEA-4(赛默飞世尔公司，MA1-021)的初级抗体以1:250稀释度通过共聚焦免疫荧光显微术证实了多能标志物在所有iPSC克隆中的表达。次级抗体是ALEXA488山羊抗小鼠(赛默飞世尔公司，A-11001)和/>594山羊抗兔(赛默飞世尔公司，A-11037)。用DAPI(赛默飞世尔公司)以1:2000稀释度从5mg/mL的储备液中进行复染。在Zeiss LSM 780共聚焦显微镜上获取图像。
iPSC-CM培养、分化和分解：当iPSC达到85％汇合时，如别处所述诱导分化为心肌细胞(CM)(Schwartz 2009,同上；以及Schwartz 2013,同上)。通过将培养基更换为含有5μMCHIR99021(密苏里州圣路易斯的密理博西格玛公司(MilliporeSigma；St.Louis,MO))的补充有B27-去除胰岛素的RPMI1640GlutaMAXTM加上25mM HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))(RPMI/B27-ins)(赛默飞世尔公司)来开始分化(第0天)。在第2天，将培养基更换为含有5μM IWP-2(密理博西格玛公司)的RPMI/B27-ins。在第4天，将培养基更换回维持培养基RPMI/B27-ins。自发性搏动通常开始于第6-7天，到第10-12天扩增至剩余细胞。允许iPSC-CM成熟直到至少第30天，每周更换两次培养基。在第30天后，使用STEMdiffTM心肌细胞解离试剂盒酶促解离iPSC-CM。简言之，将细胞用PBS(无Ca2+/Mg2+)冲洗并且在37℃下置于解离培养基中10分钟，并且然后通过添加STEMdiffTM心肌细胞支持培养基来失活。将细胞研磨，转移到15mL锥形管中，并且通过以300rcf离心3分钟进行沉淀。在转移到适当的/>包被的培养器皿中之前，抽吸上清液，并且将细胞悬浮于心肌细胞支持培养基中。24小时后，将培养基更换回RPMI/B27-ins。解离产生单细胞和小至中等大小的iPSC-CM簇的混合物，这取决于铺板之前和之后的细胞密度。自发性搏动通常在解离后24小时恢复，在第3-7天之间具有强电耦合和合胞体形成。
CRISPR-Cas9校正的等基因对照iPSC：iPSC细胞系的基因组编辑通过应用干细胞(Applied Stem Cell)(加利福尼亚州苗必达(Milpitas,CA))来收缩。针对携带KCNQ1-V254M(c.760G>A)和KCNQ1-A344A/spl(c.1032G>A)的两种患者特异性LQT1细胞系，产生等基因的“变体校正的”对照iPSC细胞系。使用gRNA设计工具通过应用干细胞设计向导RNA(gRNA)。基于与靶位点的接近度和脱靶谱，选择两个gRNA用于通过下一代测序评估gRNA活性。基于这些结果，选择gRNA 5'-CTGGCGGTGGATGAAGACCA-3'(KCNQ1-V254M；SEQ ID NO:3)和5'-CCCAGCAGTAGGTGCCCCGT-3'(KCNQ1-A344A/spl；SEQ ID NO:4)。单链寡脱氧核苷酸供体(ssODN)被设计成在同源定向修复期间在gRNA切割位点处用作修复模板。等基因对照ssODN是：5'-CAGATCCTGAGGATGCTACACGTCGACCGCCAGGGAGGCACCTGGAGGCTGCTGGGCTCGGTGGTCTTCATCCACCGCCAGgtgggtggcccgggttaggggtgcggggcccag-3'(KCNQ1-V254M；SEQ ID NO:5)和5'-gtgcagccaccccaggaccccagctgtccaaggagccagggaaaacgcacacacggggcacctacCGCTGGGAGCGCAAAGAAGGAGATGGCAAAGACAGAGAAGCAGGAGGCGAT-3'(KCNQ1-A344A/spl；SEQ ID NO:6)，其中大写字母＝外显子，小写字母＝内含子，下划线＝防止成功编辑后重新切割的同义变体，并且下划线+粗体+斜体＝置换靶变体的WT核苷酸。
将gRNA克隆到表达载体pBT-U6-Cas9-2A-GFP中，并且将所得质粒与ssODN一起转染到iPSC中。将亲本iPSC(5x 105)铺板于六孔板上并在Neon转染系统(赛默飞世尔公司)中使用1100V、30毫秒、1P通过电穿孔进行转染。对iPSC群体进行有限稀释以用于克隆和基因型分析。从每个iPSC克隆中提取基因组DNA，并且分别通过桑格测序分析KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl变体的不存在。
TSA201细胞培养和转染：在37℃下，在5％ CO2温育箱中，将TSA201细胞(第20代或更低)维持在补充有10％胎牛血清、1％ L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(康宁公司)中。对于膜片钳，将细胞分裂到T25烧瓶中。24小时后，使用5μL2000(赛默飞世尔公司)共转染含1μg的pIRES2-CFP-KCNQ1-WT、-shIMM、-Y171X、-V254M或-I567S和1μg的pIRES2-dsRED2-KCNE1-WT的/>(赛默飞世尔公司)来实现Kv7.1通道(KCNQ1α-亚基加上KCNE1β-亚基)的异源表达。4-6小时后，在膜片钳电生理学实验之前，用维持培养基置换培养基48小时。对于等位基因特异性qRT-PCR、蛋白质印迹和运输免疫荧光显微术，将每孔5x105个细胞(或对于图9中的激活动力学时程为1.5x 106个细胞)铺板到6孔板中。24小时后，使用10μL/>(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen；Hilden,Germany))与100fmol(介于0.3-0.7μg之间)等摩尔量(或如另外指示的)的每种质粒pIRES2-CFP-KCNQ1-WT或-变体、pGFP-C-shLenti-shKCNQ1(#1-#4)或-shCT、pCFP-C-shLenti-KCNQ1-SupRep或pIRES2-dsRED2-KCNE1-WT，将细胞在维持培养基中共转染，如由每幅图所指示的。如适当方法部分中所述进行终点测定。
细胞膜运输免疫荧光显微术：将TSA201细胞用KCNQ1-WT、-shIMM或-变体和如上所述的KCNE1-WT共转染。24小时后，使用TrypLETM Express(赛默飞世尔公司)将细胞解离并且将其铺板到8室培养载玻片(马萨诸塞州佩珀雷尔市(Pepperell,MA))中。在另外24小时之后，将细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，并用PBS洗涤3次。将细胞用含0.2％Tween-20/5％山羊血清的PBS封闭1小时，并且使用针对KCNQ1的初级抗体(圣克鲁兹公司，sc-365186)以1:100稀释度在4℃下温育过夜。将细胞用PBS-0.2％/>洗涤3次，每次15分钟，并且在次级ALEXA />488山羊抗小鼠(赛默飞世尔公司)中以1:250稀释度温育1小时，然后再洗涤3次，每次15分钟。在第一次洗涤期间，如前所述以1:2000的浓度添加DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)复染剂。将/>封固培养基(加利福尼亚州伯林盖姆的载体实验室公司(Vector Labs；Burlingame,CA))以1:10稀释于PBS中并用作封固溶液，并且在Zeiss LSM 780共聚焦显微镜上获取图像。本文的附图中所示的结果代表三个独立实验(在整个研究中定义为“每个实验从开始到结束在不同的周进行三次相同的重复，其中每次运行每个处理组一次生物重复”)。
蛋白质印迹：将TSA201细胞用如上所述的KCNQ1-WT、-shIMM或-变体和shKCNQ1(#1-4)、-shCT或KCNQ1-SupRep共转染。48小时后，将细胞在具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1XRIPA缓冲液中裂解，并且在冰上冷却10分钟。将裂解液在50％振幅下超声处理10秒，并且将细胞碎片在4℃下以21,000rcf沉淀15分钟。收集上清液，并且在与上样缓冲液(具有1:20β-巯基乙醇的2X Laemmli缓冲液)以1:1混合之前，通过BCA测定(赛默飞世尔公司)定量蛋白质浓度。重要的是，裂解物在95℃下未变性，这将产生KCNQ1蛋白的不可逆SDS抗性高分子量聚集体(Sagné等人,《生物化学杂志》,316(Pt 3):825-831(1996)；以及Little,“点突变的扩增-难治性突变系统(ARMS)分析(Amplification-refractory mutation system(ARMS)analysis of point mutations)”,《当前人类遗传学方案(Curr.Protoc.Hum.Genet.)》,第9章:第9.8单元(2001))。在4-15％ TGX凝胶(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad公司(Bio-Rad；Hercules,CA))上运行蛋白质(10μg/泳道)，并且使用Trans-Blot Turbo转移系统(Bio-Rad公司)将蛋白质转移到PVDF膜。将膜在具有0.1％牛血清白蛋白的三缓冲盐水(TBS)中封闭1小时，并且与针对KCNQ1(圣克鲁兹公司，sc-365186)和作为管家对照的丝切蛋白(圣克鲁兹公司，sc-376476)的初级抗体在封闭溶液中以1:1000稀释度在4℃下温育过夜。在封闭溶液中以1:5000稀释度添加次级抗体HRP缀合的山羊抗小鼠(明尼苏达州明尼阿波里斯市的R&D系统公司(R&D Systems；Minneapolis,MN)；HAF007)之前，将膜用TBS-0.1％/>洗涤3次，每次15分钟。将膜用TBS洗涤3次，每次15分钟，并且在SuperSignalTM West Pico PLUS化学发光ECL底物(赛默飞世尔公司)中温育3分钟并使用放射自显影膜暴露。使用自由可用的ImageJ软件定量像素密度。本文呈现的所有蛋白质印迹都是三个独立实验的代表性图像。
等位基因特异性qRT-PCR：等位基因特异性引物被开发用于qRT-PCR，以通过调整别处描述的等位基因特异性基因分型方法(表4)(Rohatgi等人,同上；以及Priori等人,同上)而特异性扩增(1)总KCNQ1、(2)内源性KCNQ1(包含KCNQ1-WT和-变体，但不包含KCNQ1-shIMM)和(3)KCNQ1-shIMM。对于总KCNQ1，引物购自IDT公司(IDT)(爱荷华州克拉尔维尔(Coralville,IA)；PRIMETIMETM qPCR引物测定，Hs.PT.58.41042304)。通过设计跨shKCNQ1靶位点的两个正向引物来产生等位基因特异性引物，其中一个正向引物与内源性KCNQ1互补(对KCNQ1-WT和-变体具有等位基因特异性)，并且另一个正向引物与KCNQ1-shIMM互补(对KCNQ1-shIMM具有等位基因特异性)。共同的反向引物与两种等位基因特异性正向引物一起使用。GAPDH引物购自IDT公司(PRIMETIMETM qPCR引物测定，Hs.PT.39a.22214836)作为管家对照。使用标准曲线来校正PCR扩增偏差。将TSA201细胞用如上所述的KCNQ1-WT、-shIMM或-变体和shKCNQ1(#1-4)、-shCT或KCNQ1-SupRep共转染。48小时后(或在图9中的激活动力学时程的指定时间)，使用RNeasy试剂盒(凯杰公司)收获RNA并使用NanoDrop ND-1000分光光度计(赛默飞世尔公司)进行定量。通过将500ng RNA加载到SuperScriptTM IVVILOTM Master Mix逆转录试剂盒(赛默飞世尔公司)中来产生互补DNA(cDNA)。对于每个样品，使用SYBR Green Master Mix试剂盒(凯杰公司)用所描述的四组引物运行四个qRT-PCR反应。使用ΔΔCT方法，通过首先将KCNQ1归一化为GAPDH并且然后比较KCNQ1-WT和shCT处理组的相对变化倍数来分析数据。所有qRT-PCR实验(除了图8中的剂量-应答曲线和图9中的时程之外)是三个独立实验的结果。
IKs全细胞膜片钳电生理学：在使用Axopatch 200B放大器、Digidata1440A系统和pCLAMP版本10.7软件(加利福尼亚州森尼维耳市的Axon仪器公司(Axon Instruments；Sunnyvale,CA))的情况下，使用标准全细胞膜片钳技术来在室温(22-24℃)下测量由KCNQ1-WT、-shIMM和-变体产生的慢延迟整流器电流IKs。细胞外(浴)溶液含有以下(mmol/L)：150NaCl、5.4KCl、1.8CaCl2、1.0MgCl2、1丙酮酸钠和15HEPES。用NaOH将pH调节至7.4。细胞内(移液管)溶液含有以下(mmol/L)：20KCl、125K-天冬氨酸盐、1MgCl2、10EGTA、5Mg-ATP、5HEPES、2Na2-磷酸肌酸和2Na2-GTP。用KOH将pH调节至7.2(Al-Khatib等人,同上)。在P-97牵引器(加利福尼亚州诺瓦托的Sutter仪器公司(Sutter Instruments；Novato,CA))上牵引微电极并且火焰抛光至2-3MΩ的最终电阻。串联电阻补偿80-85％。用8极贝塞尔滤波器以1kHz对电流进行滤波，并且以5kHz进行数字化。使用在图10A-10C的描述中描述的电压钳方案来确定激活的电压依赖性。使用Clampfit(Axon仪器公司)和Excel(华盛顿州雷德蒙德的微软公司(Microsoft；Redmond,WA))分析数据，并且将数据用GraphPad Prism 8软件(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad公司(GraphPad；San Diego,CA))拟合。
iPSC-CM的慢病毒产生和转导：为了将KCNQ1-SupRep应用于iPSC-CM(或作为处理对照的shCT)，使用慢病毒。慢病毒颗粒是使用pPACKH1 HIV慢病毒包装试剂盒(加利福尼亚州帕洛阿尔托的SBI系统生物科学公司(SBI System Biosciences；Palo Alto,CA))由pCFP-C-shLenti-shKCNQ1-shIMM(KCNQ1-SupRep)和pGFP-C-shLenti-shCT(shCT)产生的。通过两种方法定量慢病毒滴度，包含qRT-PCR(约1x 1011个病毒基因组/mL)以确定病毒颗粒的总数，以及通过以连续稀释转导TSA201细胞以限定功能性感染颗粒的数量(约5x 108个感染单位/mL)。将慢病毒以20-25个感染单位/细胞(4,000-5,000个病毒基因组/细胞)的感染复数(MOI)应用于iPSC-CM。在分化诱导后至少达到第30天之后，将源自健康的不相关对照、患有LQT1的四名患者或两个等基因对照的iPSC-CM解离并铺板到具有如上所述用于FluoVoltTM(马萨诸塞州亚什兰的MatTek公司(MatTek；Ashland,MA))的玻璃底部插入物或用于免疫荧光的8室培养载玻片的/>包被的35mm培养皿中。在恢复24-48小时后，使iPSC-CM保持不处理或用含有KCNQ1-SupRep或shCT处理对照的慢病毒颗粒以20-25的MOI转导。为了提高转导效率，在转导期间添加聚凝胺感染试剂(密理博西格玛公司)至8μg/mL的最终浓度，并且将iPSC-CM在室温下在35mm培养皿中以250rcf离心1.5小时。转导后24小时后，将培养基更换为新鲜维持培养基RPMI/B27-ins。
iPSC-CM中的免疫荧光：用含有KCNQ1-SupRep或shCT的慢病毒颗粒转导iPSC-CM后7天进行免疫荧光。将细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，并用PBS洗涤3次。将细胞用含0.1％Triton X-100/5％驴血清的PBS封闭1小时，并且使用针对cTnT(英国剑桥的艾博抗公司(abcam；Cambridge,UK)，ab45932)、用于使用shCT(傲锐基因公司，TA150041)处理的turboGFP或用于使用KCNQ1-SupRep(加利福尼亚州圣地亚哥的MyBioSource公司(MyBioSource；San Diego,CA)，MBS9401609)和KCNQ1(圣克鲁兹公司，sc-10646)处理的eCFP的初级抗体在4℃下温育过夜，各自在封闭溶液中以1:100稀释度。将细胞用PBS-0.1％Triton X-100洗涤3次，每次15分钟，并且在次级ALEXA488驴抗山羊(赛默飞世尔公司，A32814)、ALEXAFLUOR/>594驴抗小鼠(赛默飞世尔公司，A32744)和ALEXAFLUOR/>647驴抗兔(赛默飞世尔公司，A32795)中各自以1:250的稀释度在封闭溶液中温育1小时，然后再次洗涤3次，每次15分钟。在第一次洗涤期间，如前所述以1:2000的浓度添加DAPI复染剂。将/>封固培养基(载体实验室公司)以1:10稀释于PBS中并且用作封固溶液，并且在Zeiss LSM 780共聚焦显微镜上使用图像之间的相同设置获取图像。
iPSC-CM中的电压染料光学动作电位：用含有KCNQ1-SupRep或shCT的慢病毒颗粒转导iPSC-CM后3-7天进行电压染料实验。没有用慢病毒转导不相关的对照细胞和等基因对照，而是保持未处理以提供表示“健康”APD的理想正常基线。在成像当天，将iPSC-CM用预热的(37℃)HEPES缓冲的台氏液(Tyrode's solution)(马萨诸塞州黑弗里尔的阿法埃莎公司(Alfa Aesar；Haverhill,MA))冲洗。使用FluoVoltTM膜电位试剂盒(赛默飞世尔公司)，将0.125μL FluoVoltTM染料和1.25μL PowerLoad添加到每个35mm玻璃底部培养皿的0.5mL台氏液中并且在37℃下温育20分钟。用预热的台氏液在三次冲洗中去除过量的染料，并且将最终的2mL台氏液添加到iPSC-CM中进行成像。在成像期间，将培养皿保存在具有5％ CO2的经加热的37℃载物台顶室(韩国首尔的活细胞仪器公司(Live Cell Instrument；Seoul,South Korea))中。使用Nikon Eclipse Ti光学显微镜(日本东京的尼康公司(Nikon；Tokyo,Japan))，在40X-水物镜放大率下，在20秒快速延时视频中以50帧/秒(fps，20毫秒曝光时间)的速率以5％功率的LED照明记录光学动作电位。使用MyoPacer场刺激器(马萨诸塞州韦斯特伍德的Ion Optix公司(Ion Optix；Westwood,MA))以1Hz(9毫秒脉冲持续时间，25V)起搏iPSC-CM来消除对APD的搏动速率依赖性影响。视频集中于iPSC-CM(簇和单层)的电耦合的合胞体区域，因为这些细胞区域最好跟随起搏刺激并且产生由荧光强度的较大变化(通常约8-12％)表示的最大信噪比。为了分析，将所关注矩形区域绘制在细胞的闪光区域上方，并且使用NIS-Elements软件(尼康公司)来定量在每个所关注区域内随时间推移的荧光强度，从而产生光学动作电位迹线。使用定制的内部基于Excel的程序，针对光漂白校正迹线，并且将振幅归一化为荧光变化除以基线最小荧光(ΔF/Fmin)。以半自动的方式，针对每个单独的光学动作电位检测共同的动作电位参数(包含APD90、APD50、振幅、上升时间、上冲程速度等)，并且跨20秒迹线内的所有搏动取平均值。20秒迹线内的所有搏动的平均值表示单个数据点。对于代表性迹线，将最大振幅进一步归一化为1.0，以允许APD差异的准确可视化。
3D iPSC-CM类器官培养、免疫荧光和光学动作电位：基于别处描述的方案产生3D-类器官(Zimmerman等人,《循环研究》,90:223-230(2002))。简言之，如上所述解离来自患有KCNQ1-Y171X的患者的iPSC-CM的自发搏动合胞体单层。将经沉淀的iPSC-CM重悬浮于80％冰冷的未稀释的(康宁公司)与20％胎牛血清(每15μL有1百万个iPSC-CM)的混合物中。在37℃下，在5％ CO2温育箱中，将15μL的等分试样(各自含有1百万个iPSC-CM)转移到类器官包埋板/>中持续30分钟以固化成球形。然后，将类器官转移到RPMI/B27-ins中的24孔板的各个孔中。在用慢病毒shCT或KCNQ1-SupRep转导之前，允许类器官成熟最少7天。转导后七天后，使用FluoVoltTM电压染料将类器官固定用于免疫荧光或实时成像用于电生理学。对于免疫荧光，将类器官用PBS冲洗，在冰上在4％多聚甲醛中固定10分钟，并用PBS洗涤三次。将类器官悬浮于Tissue-PlusTM最佳切割温度(O.C.T.)化合物(赛默飞世尔公司)中，转移到一次性基础模具(赛默飞世尔公司)中，并在干冰上快速冷冻。将经冷冻的类器官冷冻切片并安装在载玻片上进行成像。如上所述，使用含0.1％TritonX-100/5％山羊血清的PBS作为封闭溶液，针对cTnT(艾博抗公司，ab45932)和用于使用shCT(傲锐基因公司，TA150041)处理的turboGFP或用于使用KCNQ1-SupRep(MyBioSource公司，MBS9401609)处理的eCFP的初级抗体，各自以1:100稀释度进行免疫荧光。次级抗体是各自稀释度为1:250的ALEXA/>488山羊抗小鼠(赛默飞世尔公司，A32723)和ALEXAFLUOR/>594山羊抗兔(赛默飞世尔公司，A32740)。对于FluoVoltTM，如上使用整个类器官代替合胞体单层进行实验。
统计分析：GraphPad Prism 8用于所有统计分析并且用于拟合附图的所有数据。在可行的情况下，显示单个数据点和平均值。除非在图例中另外指出，否则误差条表示标准偏差(S.D.)。在每个图例中都指出了具体的统计方法。简言之，在适当情况下，针对三组或更多组之间的比较，采用单向ANOVA与事后图基检验或邓尼特检验进行多重比较。进行未配对的双尾学生t检验以确定在指示时两组之间的统计显著性。p<0.05被认为是显著的。
实例2-KCNQ1-SupRep基因疗法构建体的产生
为了制备KCNQ1-SupRep，pGFP-C-shLenti慢病毒主链中的四个候选KCNQ1 shRNA(sh#1-4)连同非靶向加扰对照shRNA(shCT，表3A)一起购自傲锐基因公司。通过将TSA201细胞用KCNQ1-WT和sh#1-4共转染来确定每个KCNQ1 shRNA的KD效率。KCNQ1的表达通过定量逆转录PCR(qRT-PCR，图5A)测量，并且通过蛋白质印迹(图5A和5B)确认。在所测试的四个shRNA中，sh#1、sh#2和sh#4全都导致KCNQ1的显著KD(mRNA：69-78％ KD，蛋白质：50-77％KD)，其中在三个shRNA之间没有统计学上显著的差异。从理论上说，这些shRNA中的任何shRNA都可以用作最终的KCNQ1-SupRep基因疗法载体的一部分。为了从三种潜在候选物中选择最终的shRNA，通过原始平均KD，KCNQ1 sh#4在mRNA(78％，p＝0.004)和蛋白质(77％，p<0.004)水平上提供了KCNQ1的最强KD。另外，在选择时，使用基因组聚集数据库(GenomeAggregation Database，gnomAD)和ClinVar评估KCNQ1 sh#4靶序列(核苷酸c.1376-1404，外显子10-11边界)，并且发现所述KCNQ1 sh#4靶序列缺乏共同的遗传多态性和所有已知的可能干扰KD效率的病原性LQT1致病性突变两者。因此，KCNQ1sh#4被选择用于最终的KCNQ1-SupRep，并且在本文中被称为“shKCNQ1”。
随后测试四个另外的定制shRNA(sh#5-sh#8；表3B中的序列)。将TSA201细胞用KCNQ1-WT和sh#5-sh#8)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。相对于GAPDH归一化的KCNQ1表达通过qRT-PCR测量。sh#5具有相对于原始值最强的敲低(95％)(图5C)。
为了产生KCNQ1的置换shRNA-免疫版本，称为KCNQ1-shIMM，在shKCNQ1的靶位点内的每个密码子的摆动碱基(核苷酸c.1376-1404)处将十个同义变体引入到WT KCNQ1 cDNA(图6A)中。然后，将KCNQ1-shIMM克隆到位于CMV启动子下游的含有shKCNQ1的载体pGFP-C-shLenti中。在此步骤中，用CFP将原始GFP报告基因(其仍然是shCT的报告基因)交换为内部核糖体进入位点(IRES)。图6B展示了在此体外研究中使用的最终的KCNQ1-SupRep基因疗法载体。
实例3-KCNQ1-SupRep基因疗法抑制和置换KCNQ1-WT
为了确认KCNQ1-shIMM确实对由shKCNQ1产生的KD免疫，将TSA201细胞用KCNQ1-WT或KCNQ1-shIMM和shKCNQ1共转染。使用等位基因特异性qRT-PCR定量KCNQ1-WT对KCNQ1-shIMM的表达。使用一组独特的等位基因特异性引物(表4)，将每个样品在四个单独的反应中运行，以定量(1)总KCNQ1、(2)内源性KCNQ1，其包含WT或含有变体的等位基因但不包含KCNQ1-shIMM、(3)KCNQ1-shIMM和(4)作为管家对照的GAPDH。使用商业引物来扩增总KCNQ1。对于内源性KCNQ1或KCNQ1-shIMM的排他扩增，在shKCNQ1靶位点内设计两个正向引物，一个正向引物与WT序列互补并且另一个正向引物与工程化以产生KCNQ1-shIMM的独特的经修饰的序列互补。两种反应均使用共同的反向引物，并且使用标准曲线来校正PCR扩增偏差。
与shCT相比，shKCNQ1导致KCNQ1-WT的显著(87％)抑制(p<0.0001)，但无法抑制KCNQ1-shIMM(p＝0.997，图7A)。值得注意的是，与KCNQ1-shIMM相比，KCNQ1-WT的表达没有差异(p>0.9999)，这表明在KCNQ1-shIMM中引入同义变体不会由于使用人密码子的不均匀偏差而干扰其表达性。接下来，将KCNQ1-SupRep用KCNQ1-WT共转染，这导致KCNQ1-WT的52％抑制，其中KCNQ1-shIMM的置换率为255％(p<0.0001，图7A)。与单独的shKCNQ1相比，双组分KCNQ1-SupRep载体具有更低效的抑制，但是与单独的KCNQ1-shIMM相比，显示出更强的KCNQ1-shIMM表达。虽然原因不清楚，但不同量的KCNQ1-SupRep被转染并且显示出引起剂量依赖性抑制和置换，这表明KCNQ1-SupRep表达可以根据需要进行调整(图8)。通过蛋白质印迹确认通过qRT-PCR获得的结果，这表明shKCNQ1能够显著KD KCNQ1-WT(p＝0.037)但不能显著KD KCNQ1-shIMM(p＝0.61，图7A和7B)。作为基因疗法开始的安全性度量，使用等位基因特异性qRT-PCR来测量在用WT-KCNQ1和shCT、shKCNQ1、KCNQ1-shIMM或KCNQ1-SupRep共转染的TSA201细胞的三天时程中KCNQ1-SupRep的激活动力学。与使用shCT处理相比，KCNQ1-SupRep引起被KCNQ1-shIMM置换的KCNQ1-WT的减少，但总KCNQ1在三天开始期间的任何时间没有发生改变，从而避免过度表达或表达不足(图9)。
实例4–在KCNQ1中具有LQT1致病性变体的患者的选择
选择具有LQT1寄宿独特变体KCNQ1-Y171X、KCNQ1-V254M、KCNQ1-I567S和KCNQ1-A344A/spl的四名患者用于此研究。通过现行的美国医学遗传学学院指南(AmericanCollege of Medical Genetics guidelines)将所有四种KCNQ1变体分类为病原性(LQT1致病性)(Richards等人,《遗传医学》,17:405-424(2015))。因此，此基因疗法初步研究包含在具有轻度表型的患者中产生单倍体不足的无义、过早截短变体(KCNQ1-Y171X)，以及在具有强LQT1表型的三名患者中的两个显性阴性错义变体(KCNQ1-V254M和KCNQ1-I567S)和引起外显子7的跳读的同义剪接变体(KCNQ1-A344A/spl)(Tsuji等人,《分子与细胞心脏病学杂志(J.Mol.Cell Cardiol.)》,24:662-669(2007))，所述强LQT1表型包含所记录的大于500毫秒的QTc、LQTS相关症状(晕厥、癫痫发作、近乎溺死、心脏骤停)的阳性史和LQTS相关症状的阳性家族史(表2)。
所有四个变体已经描述于别处，尽管仅KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl已经在功能上被表征为显性-阴性突变(Tsjui等人,同上；Piippo等人,《美国心脏病学会杂志》,37:562-568(2001)；Wang等人,《心血管电生理学杂志》,10:817-826(1999)；以及Choi等人,《循环》,110:2119-2124(2004))。使用定点诱变来将四个LQT1患者变体中的三个变体(KCNQ1-Y171X、-V254M和-I567S)引入到KCNQ1-WT中，以评估KCNQ1-SupRep以突变独立性方式抑制和置换KCNQ1变体的能力。对于在TSA201细胞中的异源表达研究，不包含KCNQ1-A344A/spl，因为KCNQ1-WT是全长cDNA并且不含有评估如KCNQ1-A344A/spl等剪接变体所必需的内含子。
实例5-KCNQ1-shIMM和KCNQ1病原性变体的功能的验证
将KCNQ1-WT和KCNQ1-shIMM以及LQT1致病性变体KCNQ1-Y171X、-V254M和-I567S与Kv7.1通道β-亚基KCNE1共转染到TSA201细胞中。通过标准全细胞膜片钳测量所得IKs电流。图10A示出了代表性迹线。重要的是，KCNQ1-shIMM产生了与KCNQ1-WT没有显著差异的稳健的IKs电流(p＝0.28，图10B和10C)。所有三个LQT1变体(KCNQ1-Y171X、-V254M和-I567S)使得功能性IKs电流不超过TSA201细胞的最小背景离子通道活性，与功能的完全丧失一致(图10A-10C)。对于如KCNQ1-Y171X等无义变体并且另外对于KCNQ1-V254M，预期空电流，所述空电流的空状态与别处描述的数据一致(Wang等人,同上)。来自KCNQ1-I567S的电流的完全缺乏是一个新发现，但与患者的临床上确定的LQT1以及大多数LQT1致病性变体是错义变体的事实一致。
为了评估KCNQ1向细胞膜的运输，使用KCNQ1抗体通过免疫荧光显微术评估经转染的TSA201细胞。KCNQ1-WT和KCNQ1-shIMM两者沿着细胞膜产生明亮的染色，这表明KCNQ1-shIMM中的同义变体不会干扰正确的运输(图11)。在LQT1变体中，KCNQ1-Y171X由于过早截短而不产生可检测的蛋白质，而KCNQ1-V254M和KCNQ1-I567S表现出正常的细胞膜运输，尽管KCNQ1-I567S的总体表达似乎有所降低。总之，这些结果表明KCNQ1-shIMM具有WT功能，并且KCNQ1-Y171X、-V254M和-I567S是具有总功能丧失的LQT1致病性变体。
实例6–KCNQ1-SupRep基因疗法以突变独立性方式抑制和置换KCNQ1变体
为了证实用KCNQ1-SupRep基因疗法治疗可以以突变独立性方式抑制和置换LQT1致病性变体，将TSA201细胞用三个KCNQ1变体和shKCNQ1、KCNQ1-SupRep或shCT对照共转染。所有三个LQT1致病性变体被shKCNQ1抑制，其范围相对于KCNQ1-WT为87％至93％ KD，如通过等位基因特异性qRT-PCR测量的(图12，上图)。虽然可见地标记了针对三个变体中的每个变体的抑制，但针对KCNQ1-Y171X和KCNQ1-I567S，shKCNQ1的抑制未达到统计显著性，推测是由于这些变体的较低的基线表达。尽管未达到统计显著性，但值得注意的是，可在用shKCNQ1处理的任何样品(WT或变体)中检测到非常少的mRNA转录物。值得注意的是，KCNQ1-Y171X在基线处具有显著降低的表达，可能是由于其过早的终止密码子和预测的mRNA转录物的后续无义介导的衰变(Hug等人,《核酸研究》,44:1483-1495(2016))。
通过蛋白质印迹确认通过qRT-PCR获得的结果。KCNQ1-Y171X由于其过早截短而不产生可检测的蛋白质，而KCNQ1-V254M被shKCNQ1抑制，并且KCNQ1-I567S具有也被shKCNQ1抑制的微弱基线表达(图12，底部)。总体而言，KCNQ1-SupRep引起三个LQT1致病性KCNQ1变体的抑制和置换，从而验证其以突变独立性方式抑制和置换KCNQ1的能力。
实例7-从患有LQT1的四名患者产生iPSC-CM
从iPSC生物库中患有LQT1的236名患者中，选择具有不同LQT1突变的四名患者使其iPSC分化为iPSC-CM，以便测试此KCNQ1-SupRep基因疗法的APD缩短潜力。包含健康的不相关个体作为对照，并且分别通过对KCNQ1-V254M和KCNQ1-I567S的CRISPR-Cas9校正来产生两个等基因对照。这些等基因对照充当用于可能的治疗性治愈的黄金标准，由此为延长的APD的“理想”挽救/归一化提供标志物并且指示用KCNQ1-SupRep基因疗法进行的治疗与这一理想的接近程度。
从每名患者收集真皮成纤维细胞或外周血单核细胞(PBMC)，并且用于产生iPSC。在每个iPSC系上进行标准质量控制测定，包含LQT1致病性变体的桑格测序、核型分型、明场形态和多能标志物的免疫荧光显微术，所述多能标志物包含Tra-1-60、Nanog、SSEA-4和Oct4(图13A-13D)。iPSC的分化通过别处描述的方法诱导以产生自发搏动的iPSC-CM(Burridge等人,《自然方法(Nat.Methods)》,11:855-860(2014)；以及Mummery等人,《循环研究》,111:344-358(2012))。由于已知心脏APD随着iPSC-CM随时间推移成熟而缩短，因此所有实验都在诱导分化后至少30天进行(Shaheen等人,《干细胞报告(Stem CellReports)》,10:1879-1894(2018))。
实例8-KCNQ1-SupRep基因疗法使LQT1iPSC-CM中的KCNQ1增加
为了评估慢病毒KCNQ1-SupRep转导iPSC-CM并且使WT KCNQ1表达增加的能力，用慢病毒KCNQ1-SupRep或shCT转导不相关对照和LQT1iPSC-CM并且使用免疫荧光显微术进行评估。心脏肌钙蛋白T(cTnT)用作心肌细胞的标志物。使用靶向慢病毒报告基因的抗体(针对shCT的turboGFP或针对KCNQ1-SupRep的CFP)来鉴定经转导的细胞，并且对KCNQ1进行染色以使KCNQ1-SupRep对KCNQ1的总体表达的影响可视化。KCNQ1-V254M iPSC-CM(图14)以及剩余的不相关对照和LQT1 iPSC-CM(图15A-15D)的结果显示在已经用慢病毒KCNQ1-SupRep或shCT均匀转导的iPSC-CM培养物内的高纯度心肌细胞。在用shCT处理的iPSC-CM的基线处，KCNQ1仅可通过共聚焦显微术模糊地检测到，而用KCNQ1-SupRep处理的iPSC-CM显示出针对KCNQ1的强染色(图14和15A-15D)。这表明在iPSC-CM中，用KCNQ1-SupRep基因疗法进行的治疗驱动KCNQ1-shIMM的显著过表达。
实例9-KCNQ1-SupRep基因疗法缩短了如通过FluoVoltTM电压染料测量的LQT1
iPSC-CM中的心脏APD
进行进一步研究以测试用KCNQ1-SupRep基因疗法进行的治疗是否能够通过缩短病理学上延长的APD来挽救LQT1的病征性特征。使用FluoVoltTM电压染料来测量源自用慢病毒shCT对照或KCNQ1-SupRep基因疗法治疗的患有LQT1(源于KCNQ1-Y171X、-V254M、-I567S或-A344A/spl)的四名患者的iPSC-CM中的光学动作电位。在没有任何治疗的情况下测量不相关对照，作为对健康APD的量度。在记录期间，以1Hz起搏所有iPSC-CM，以消除APD的搏动速率依赖性变化。图16A示出了代表性光学动作电位。当用shCT处理时，与未处理的不相关的健康对照iPSC-CM相比，所有LQT1 iPSC-CM在90％复极化(APD90)时具有显著更长的APD，并且四个中的三个在50％复极化(APD50)时也具有显著更长的APD，从而验证LQT1 iPSC-CM作为LQT1的体外模型。
表5示出了由于KCNQ1-SupRep导致的APD90和APD50值以及APD缩短的完整概述。APD90和APD50值是通过单向ANOVA和事后邓尼特检验来评估的，从而将用shCT或KCNQ1-SupRep处理的每个KCNQ1变体与未处理的、不相关对照(表5中的括号)进行比较。用shCT处理的所有四个LQT1iPSC-CM具有比不相关对照显著更长的APD90，并且三个中的两个也具有显著更长的APD50，从而确认这些LQT1系显示出延长的APD—LQT1的标志特征。然后，对于每个变体，分别在APD90和APD50水平下，通过未配对的双尾学生t检验评估与用shCT处理相比由于KCNQ1-SupRep导致的APD缩短。KCNQ1-SupRep在所有四个LQT1 iPSC-CM中导致APD90和APD50两者的统计学上显著的衰减(表5和图16B)。当用KCNQ1-SupRep处理时，两个LQT1系的APD90和APD50显著缩短。具体地，APD90在KCNQ1-Y171X中缩短了117毫秒、在KCNQ1-V254M中缩短了111毫秒、在KCNQ1-I567S中缩短了85毫秒并且在KCNQ1-A344A/spl中缩短了210毫秒(表5和图16B)。
为了确定观察到的由于KCNQ1-SupRep导致的APD缩短是否表示对WT的完全挽救，或者如果较短的APD值不完全或过度校正，从KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl亲本LQT1iPSC细胞系产生两个CRISPR-Cas9校正的等基因对照。当通过FluoVoltTM测量并且针对来自图16B的shCT和KCNQ1-SupRep处理数据作图时，与其经shCT处理的对应物相比，两个等基因对照具有显著更短的APD90和APD50(图17A和17B)。
KCNQ1-V254M的等基因校正使APD90缩短200毫秒至380±112毫秒(n＝58，p<0.0001)，并且KCNQ1-A344A/spl的等基因校正使APD90缩短176毫秒(n＝57，p<0.001)。表6示出了KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl与等基因对照的APD90和APD50值的全部概述。将用KCNQ1-SupRep基因疗法处理的KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl iPSC-CM的缩短的APD值与等基因对照的APD值进行比较，在实际挽救程度上存在明显的变异性。在KCNQ1-V254M中，存在统计学上显著的APD90的不完全缩短和伴随的APD50的过度校正，而在KCNQ1-A344A/spl中，APD90具有完全挽救而没有显著差异，但确实显示出APD50的过度校正。尽管存在这种变异性，但用KCNQ1-SupRep基因疗法进行的治疗证明在LQT1iPSC-CM中完全挽救延长的动作电位的能力。
实例10-KCNQ1-SupRep基因疗法缩短了LQT1 iPSC-CM的3D-类器官培养物中的心
脏APD
为了确定KCNQ1-SupRep的APD缩短能力是否可从2D合胞体单层iPSC-CM培养物转移到三维环境中，使用KCNQ1-Y171X iPSC-CM从四个LQT1变体之一产生LQT1 iPSC-CM 3D-类器官。将KCNQ1-Y171X iPSC-CM解离并且包埋在球状体模具中，并且使其在胶原细胞外结构上天然地重组以产生3D-心脏类器官(图18A)。将类器官用shCT或KCNQ1-SupRep处理，冷冻切片，并且使用心脏肌钙蛋白T(cTnT)标记心肌细胞并且使用慢病毒报告基因(针对shCT的turboGFP和针对KCNQ1-SupRep的CFP)标记受感染细胞来染色以进行免疫荧光。免疫荧光揭示了心肌细胞的网络以及turboGFP和CFP的显著染色，表明shCT和KCNQ1-SupRep的均匀转导(图18B)。通过FluoVoltTM评估未处理的和经KCNQ1-SupRep处理的类器官的APD，揭示了KCNQ1-SupRep导致APD90和APD50的统计学上显著的缩短(图18C和18D)并且表明KCNQ1-SupRep在简单的3D类器官环境中保留了APD-缩短能力。
总之，上述研究使用两种体外模型系统来工程化和验证用于LQTS(并且具体地LQT1)的杂合抑制和置换基因疗法构建体的APD衰减效应。这些研究的结果表明，抑制-置换基因疗法可以用于直接靶向病原性底物，并且不仅特异性地针对LQT1，而且一般地针对LQTS，并且可能针对几乎任何诱发猝死的常染色体显性遗传心脏病，改善所得疾病。
表2
选择用于产生iPSC-CM研究的iPSC的受试者的概述
KCNQ1变体作为蛋白质水平随着括号中的cDNA变化的所得变化列出。(QTc)Bazett校正的QT间期；(ECG)心电图；(JLNS)耶韦尔和朗格-尼尔森综合征；(BB)β-阻断剂；(ICD)植入式心脏复律除颤器；(PBMC)外周血单核细胞。
表3A
KCNQ1 shRNA序列
*shCT＝SEQ ID NO:11
KCNQ1 sh#1(DNA)＝SEQ ID NO:12；KCNQ1 sh#1(RNA)＝SEQ ID NO:16
KCNQ1 sh#2(DNA)＝SEQ ID NO:13；KCNQ1 sh#2(RNA)＝SEQ ID NO:17
KCNQ1 sh#3(DNA)＝SEQ ID NO:14；KCNQ1 sh#3(RNA)＝SEQ ID NO:18
KCNQ1 sh#4(DNA)＝SEQ ID NO:15；KCNQ1 sh#4(RNA)＝SEQ ID NO:19
表3B
KCNQ1 shRNA序列
/>
*KCNQ1 sh#5(DNA)＝SEQ ID NO:36；KCNQ1 sh#5(RNA)＝SEQ ID NO:40
KCNQ1 sh#6(DNA)＝SEQ ID NO:37；KCNQ1 sh#6(RNA)＝SEQ ID NO:41
KCNQ1 sh#7(DNA)＝SEQ ID NO:38；KCNQ1 sh#7(RNA)＝SEQ ID NO:42
KCNQ1 sh#8(DNA)＝SEQ ID NO:39；KCNQ1 sh#8(RNA)＝SEQ ID NO:43
表4
qRT-PCR引物
表5
图16A和16B的FluoVoltTM光学动作电位数据的概述
APD90和APD50值是通过单向ANOVA和事后邓尼特检验来评估的，以将用shCT或KCNQ1-SupRep处理的每个KCNQ1变体与未处理的不相关对照(除了在SupRep对shCT柱中列出的那些值之外的所有p值)进行比较。用shCT处理的所有四个LQT1 iPSC-CM具有比不相关对照显著更长的APD90，并且四个中的三个也具有显著更长的APD50。对于每个变体，分别在APD90和APD50水平下，通过未配对的双尾学生t检验评估与用shCT处理相比由于KCNQ1-SupRep导致的APD缩短。KCNQ1-SupRep在所有四个LQT1iPSC-CM中导致APD90和APD50两者的统计学上显著的衰减。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，(n.s.)不显著。
表6
图17A和17B的FluoVoltTM光学动作电位数据的概述
通过单向ANOVA和事后图基检验将KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl的APD90和APD50值与其相应的等基因对照进行比较(除了在SupRep对shCT柱中列出的那些值之外的所有p值)。等基因对照的APD值充当两个变体KCNQ1-V254M和KCNQ1-A344A/spl中的每个变体的APD的“理想”挽救的基准。用KCNQ1-SupRep处理LQT1 iPSC-CM导致所测试的每组LQT1iPSC-CM的APD缩短，从而使APD更接近每个变体的相应的等基因对照。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，(n.s.)不显著。
实例11–在转基因LQT1兔模型中恢复正常细胞电生理学
进行实验以评估KCNQ1-SupRep基因疗法的基于AAV9的基因递送在具有引起LQT1的人病原性KCNQ1-p.Y315S变体的LQT1的已建立的人源化兔模型中逆转QT/APD延长和心律失常易感性的作用。将动物用AAV9-KCNQ1-SupRep处理以用于在急性分离的兔心室CM中进行全动物心律失常表型分型和分子/细胞电生理学表型分型，以确定AAV9介导的KCNQ1-SupRep载体的递送对恢复正常分子、细胞、全心脏和全动物电生理学表型和预防室性心律失常的作用。兔和人在心脏复极化下共享类似的K+电流(Nerbonne,《生理学杂志(J.Physiol.)》,525(2):285-298(2000))，使得转基因兔模型可用于研究复极化受损的人致心律失常性疾病。用于这些研究的转基因LQT1和LQT2兔模型选择性地在心脏中分别过表达人KCNQ1(LQT1、KCNQ1-Y315S、IKs的丧失)或KCNH2(LQT2、KCNH2-G628S、IKr的丧失)的功能丧失、显性阴性孔定位变体。这些LQT1和LQT2兔模仿具有QT延长、自发性尖端扭转型(TdP)室性心动过速和SCD的人LQTS表型(图19A-19F)(Brunner等人,《临床研究杂志》,118:2246-2259(2008)；以及Odening等人,《心律学》,9:823-832(2012))。在兔β-肌球蛋白重链(β-MyHC)启动子的控制下，在兔心脏中表达KCNQ1-Y315S和KCNH2-G628S突变(图19A)，以分别在兔模型中产生LQT1和LQT2表型。兔分别由于IKs或IKr电流的消除而表现出QT的显著延长(图19B和19C)、在用ostradiol处理之后发展成自发性尖端扭转型室性心动过速的倾向(TdP)(图19D)和动作电位时程(图19E)(图19F)。用于产生和表型评估兔的详细方法描述于别处(Brunner等人,同上)。考虑到与人LQTS表型的类似性，这些模型对于在体内以及在整个心脏水平上研究新型LQTS疗法具有独特的优点。
为了集中于LQT1转基因兔模型的处理，在LQT1兔中在体内、离体(全心脏)和在体外(兔心肌细胞)详细研究了AAV9-KCNQ1-SupRep的QTc/APD衰减作用。在Langendorff灌注的LQT1兔心脏中离体评估AAV9-KCNQ1-SupRep的抗心律失常性质，在所述兔心脏中通过AV结消融和低钾血症促进心律失常，以评估KCNQ1SupRep基因疗法递送逆转KCNQ1-Y315S转基因兔中的病原性LQT1表型的能力。根据别处描述的方案(Odening等人,《欧洲心脏杂志》,40:842-853(2019))，所有实验都在雌性(f)和雄性(m)成年兔(年龄为4-7个月)中进行。对于体内实验(外科手术，表面ECG)，用S-氯胺酮和甲苯噻嗪(12.5mg/kg/3.5mg/kg IM，随后IV输注)麻醉兔。外科手术后，用丁丙诺啡进行镇痛疗法维持3天。在另外注射肝素(500IEIV)和硫喷妥钠(40mg/kg IV)后，进行心脏跳动切除术(用于在Langendorff灌注的心脏中进行动作电位记录和心律失常评估，以及细胞膜片钳术)。在AAV9递送KCNQ1-SupRep或AAV9-sham载体后，使用KCNQ1-Y315S转基因兔上的表面ECG35(Odening等人2019,同上)进行体内心脏表型分型。类似地，如别处所述进行AAV9-KCNQ1-SupRep和AAV9-shCT处理的兔的分子和细胞电生理学表征(Brunner等人,同上；以及Odening等人2019,同上)。
转基因LQT1兔表达两个内源性野生型兔KCNQ1等位基因和单个转基因人KCNQ1突变体(p.Y315S)等位基因。人和兔KCNQ1 cDNA总体上是73％同源的。设计并测试在兔与人KCNQ1之间具有100％同源性的shRNA(使得在LQT1兔模型中兔和人等位基因两者被同时抑制)，并且产生病毒颗粒。
在LQT2兔模型中，使用一种或多种KCNH2-SupRep构建体进行类似实验。
经分离的LQT1 CM中的AAV9-KCNQ1-SupRep基因转移：在LQT1兔体内测试构建体之前，在来自LQT1兔的经分离的心室CM中测试AAV9-KCNQ1-SupRep基因转移的功能性。具体地，通过标准胶原酶消化从转基因LQT1兔(n＝5)的心脏获得左心室CM(Brunner等人,同上；以及Odening等人2019,同上)。将CM在培养物中维持48小时，并且将一半细胞培养物与AAV9-KCNQ1-SupRep一起温育。然后使用标准电压和电流模式膜片钳术(参见下文)分析对细胞APD和IKs电流密度的功能结果(与假处理的LQT1 CM相比)。
通过外侧胸廓切开术进行的体内AAV9-KCNQ1-SupRep基因转移：对于体内基因转移，进行外侧胸廓切开术，并且将AAV9-KCNQ1-SupRep或AAV9-shCT构建体涂在两个心室和两个心房的心外膜表面上。将两种性别的成年LQT1兔(LQT1-KCNQ1-SupRep和LQT1-AAV9-shCT对照，分成组并且用于体内和离体全心脏实验或细胞电生理学)用S-氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。对兔子进行插管，以确保在开胸外科手术期间的适当通气，并且进行左侧胸廓切开术。在全心脏的表面上彻底涂抹AAV9-KCNQ1-SupRep或AAV9-shCT后，将胸部闭合并且唤醒兔。在外科手术后恢复至少1-2周后，进行实验以研究KCNQ1-SupRep基因疗法在LQT1兔中的电生理学后果。
体内12导联ECG记录：对成年LQT1-KCNQ1-SupRep(雌性和雄性)和LQT1-AAV9-shCT假对照(雌性和雄性)兔进行常规12导联表面ECG记录，以确定KCNQ1-SupRep基因疗法对恢复正常QT持续时间和减少促心律失常标志物的作用。用S-氯胺酮和甲苯噻嗪在全身麻醉下进行ECG，因为此麻醉方案不会影响心脏复极化(Odening等人,《美国生理学杂志：心脏与循环生理学(Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.)》,295:H2264-2272(2008))。计算KCNQ1基因转移介导的QT变化、心率校正的QT变化和Tpeak-Tend(Tp-e)的变化以及QT的逐搏变异性(QT间期的短期变异性；STVQT)，以评估复极化的空间和时间异质性的变化。
离体Langendorff灌注的心脏中的单相动作电位(MAP)测量：如别处所述进行MAP(Odening等人2019,同上)。简言之，如上所述，麻醉成年LQT1-KCNQ1-SupRep(雌性和雄性)和LQT1-AAV9-shCT假对照(雌性和雄性)兔。在用硫喷妥钠(40mg/kg)IV进行安乐死之后，快速切除心脏，安装在Langendorff灌注装置(IH5，雨果萨克斯电子装置-哈佛设备公司(HugoSachs Electronic-Harvard Apparatus))上，用温热的(37℃)、预充氧的(95％ O2和5％CO2)、改性克雷布斯-亨斯莱特溶液(Krebs-Henseleit solution)以50毫升/分钟的恒定流速通过插管升主动脉进行逆行灌注。评估在90％、75％和30％的复极化(APD90、75、30)下的动作电位时程，并且针对每个LV区域计算AP三角测量(APD90-APD30)和APD恢复(基于在2Hz和4Hz刺激下的APD90值)。
离体Langendorff灌注的心脏中的心律失常实验：在AV结消融的Langendorff灌注的LQT1-KCNQ1-SupRep(雌性和雄性)和LQT1-AAV9-shCT(雌性和雄性)心脏中离体评估KCNQ1-SupRep基因疗法的抗心律失常作用，所述心脏以约60-80个搏动/分钟的恒定速率以稳定的室性逸搏心律(VER)自发搏动(Hornyik等人,《英国药理杂志(Br.J.Pharmacol.)》,177:3744-3759(2020))。基线(无心律失常)记录10分钟后，用2mM的含低K+的KH溶液灌注心脏(10分钟)以引发心律失常。在第二步骤中，将10μM的IK1-阻断剂BaCl2添加到2mM的含低K+的KH溶液中并灌注(10分钟)，以减少复极化储备并进一步增加对心律失常形成的易感性。连续记录ECG，并且离线测量心律失常的持续时间(％)和发生率(平均事件数)。心律失常被定义为室性额外搏动(VEB)、二联律、室性心动过速(VT)和室性纤维性颤动(VF)。在LQT1心脏中，心律失常率非常高(在60-80％的范围内)，而即使在低K+KH与BaCl2组合的情况下，在正常野生型心脏中也没有发生严重的室性心律失常(Hornyik等人,同上)。
兔CM中的电生理学记录：通过标准胶原酶消化从经KCNQ1SupRep处理的转基因LQT1兔和假对照转基因LQT1兔的心脏获得左心室CM(Brunner等人,同上；以及Odening等人2019,同上)。使用Axopatch 200B膜片钳放大器(分子装置公司(Molecular Devices))记录全细胞电流(IKs、IKr、Ito和IK1)和动作电位，用Digidata 1440A接口在10kHz的采样频率下数字化并且用pCLAMP软件获取，如在别处所述(Odening等人,2019,同上)。
数据解释：对于正态分布的值，使用学生t检验(未配对)来比较2个组的平均值，并且对于非正态分布的值，使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)和威尔科克森(Wilcoxon)匹配对检验。费希尔精确检验(Fisher's exact test)用于分类变量，如心律失常发生率。在I-V曲线中，使用重复测量ANOVA评估差异，辅以邦弗朗尼事后检验分析。使用pClamp 9.0和Origin 7.0软件评估细胞电生理学数据，并且将结果给出为平均值±SEM。用Windows的Prism 5.01(Graph-Pad)进行所有其它分析，并且其数据表示为平均值±SD，其中n指示实验/动物的数量，测试是双尾的，并且p<0.05被认为是显著的。以盲法进行并分析兔中的所有实验。
实例12–用于LQT2 SupRep的材料和方法
KCNH2-SupRep的克隆：将WT KCNH2 cDNA(NM_000238.3)亚克隆到pIRES2-EGFP(加利福尼亚州山景城的克隆技术公司(Clontech；Mountain View,CA))中，以产生pIRES2-EGFP-KCNH2-WT。pIRES2-EGFP-KCNH2-WT中的p.G604S和p.N633S变体由金思特科技公司(新泽西州皮斯卡塔韦)生产。使用DNA桑格测序来确认载体完整性。pGFP-C-shLenti主链中的五个定制设计的KCNH2 shRNA(sh#1-5)连同非靶向加扰shRNA对照(shCT)是从傲锐基因公司(马里兰州罗克维尔市)订购的。对于最终的KCNH2-SupRep基因疗法载体，选择KCNH2 sh#4作为前导候选物并且被称为shKCNH2。合成在KCNH2-WT cDNA的KCNH2 sh#4(shKCNQ2)靶序列内含有十个同义变体的DNA片段：c.2694C>T、c.2697G>C、c.2700G>A、c.2703G>A、c.2706A>T、c.2709G>C、c.2712G>A、c.2715G>C、c.2718G>C和c.2721C>G(分别为KCNH2：p.D898D、p.T899T、p.E900E、p.Q901Q、p.P902P、p.G903G、p.E904E、p.V905V、p.S906S和p.A907A)，并且将其克隆到pIRES2-EGFP-KCNH2-WT中，以产生KCNH2-shIMM(pIRES2-EGFP-KCNH2-shIMM)(新泽西州皮斯卡塔韦的金思特科技公司)。将KCNH2-shIMM亚克隆到含有shKCNH2的pGFP-C-shLenti主链中，以产生最终的KCNH2-SupRep。
用于膜片钳实验的KCNH2哺乳动物表达载体：将野生型KCNH2 cDNA亚克隆到pIRES2-EGFP(加利福尼亚州山景城的克隆技术公司)和AAV-P2ACTnC-EGFP(新泽西州皮斯卡塔韦的金思特科技公司)中，以产生KCNH2-pIRES2-EGFP和KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP。
用于膜片钳实验的TSA 201和H9C2细胞培养和转染：在37℃下，在5％CO2温育箱中，将TSA 201和H9C2细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、1.0％L-谷氨酰胺和1.2％青霉素/链霉素溶液的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中培养。通过使用5μl或3μl的Lipofectamine(英杰公司)在OPTI-MEM培养基中转染1.0μg的pIRES2-KCNH2-EGFP连同1.0μg的KCNE2-pIRES2-dsRed2或1.0μg的KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP来完成KCNH2的异源表达。在电生理学实验之前，将经转染的细胞温育48小时。
电生理学测量：使用Axopatch 200B放大器、Digidata 1440A和pclamp版本10.4软件(加利福尼亚州森尼维耳市的Axon仪器公司)，使用标准全细胞膜片钳技术在室温(RT)下用KCNE2-pIRES2-dsRed2和KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP电流测量pIRES2-KCNH2-WT-EGFP。细胞外(浴)溶液含有(mmol/L)：150NaCl、5.4KCl、1.8CaCl2、1MgCl2、1丙酮酸钠和15HEPES。用NaOH将pH调节至7.4。细胞内(移液管)溶液含有(mmol/L)：150KCl、5NaCl、2CaCl2、5EGTA、5MgATP、10HEPES，用KOH将pH调节至7.2。在使用P-97牵引器(加利福尼亚州诺瓦托的Sutter仪器公司)进行牵引之后，将微电极火焰抛光至2-3MΩ的最终电阻。串联电阻补偿80-85％。用八极贝塞尔滤波器以1kHz对电流进行滤波，并且以5kHz进行数字化。使用针对图30A和31A所描述的电压钳方案来确定激活的电压依赖性。使用Clampfit(加利福尼亚州森尼维耳市的Axon仪器公司)、Excel(华盛顿州雷德蒙德的微软公司)分析数据并且用GraphPadPrism 8.3(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司(GraphPad Software,San Diego,CA))作图。
用于iPSC产生的LQT2患者选择：所有患者由一名遗传心脏病专家和LQTS专家进行评估。分别通过4mm皮肤穿孔活检和血液样品收集真皮成纤维细胞和外周血单核细胞(PBMC)。从患有LQT2的212名患者获得样品。对于此研究，基于被定义为具有大于500毫秒的QTc的至少一个ECG的强LQT2表型、LQTS相关症状(晕厥、癫痫发作、心脏骤停)的阳性史和LQTS相关症状的阳性家族史，选择具有两个不同的LQT2致病性错义变体的两名LQT2患者(13岁男性和12岁女性)(表7)。使用Cytotune 2.0重编程试剂盒，通过仙台病毒转导将PBMC或成纤维细胞重编程到诱导性多能干细胞(iPSC)中。在用山中因子感染后21天内挑取集落。对于每个变体系，产生、表征并分析两个代表性克隆用于质量控制，如别处所述(O'Hare等人,《循环：基因组与精准医学》13:466-475(2020))。通过梅奥诊所细胞遗传学实验室(Mayo Clinic Cytogenetics Laboratory)完成患者特异性iPSC克隆中的每个克隆的核型分型，并且测试的所有突变iPSC克隆都显示正常的核型(图20A)。从每个iPSC克隆分离基因组DNA(图20B)，并且通过桑格测序确认KCNH2序列的剩余部分的变体的存在和完整性(图20C)。确认所有iPSC克隆表达Nanog(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher)，PA1-097X)和SSEA-4(赛默飞世尔科技公司，MA1-021)多能标志物(图21)。在37℃下，在5％CO2温育箱中，将所有iPSC在包被的(纽约州康宁的康宁公司)6cm培养皿上，在补充有1％抗生素/抗真菌剂溶液的mTeSR-Plus培养基/>中培养。在85％汇合时，使用ReLeSR/>传代iPSC。
iPSC-CM培养、分化和解离：在达到约85％汇合后，使用别处所述的方案将iPSC分化为心肌细胞(CM)(Burridge等人,同上；以及Mummery等人,同上)。在第0天，通过将培养基从mTeSR-Plus更换为含有5μMCHIR99021(密苏里州圣路易斯的密理博西格玛公司)的补充有B27-去除胰岛素的RPMI 1640GlutaMAX加上25mM HEPES(RPMI/B27-ins；赛默飞世尔公司)来开始分化。在48小时(2天)后，将培养基更换为含有5μM IWP-2(密理博西格玛公司)的RPMI/B27-ins。在第4天，将培养基更换回RPMI/B27-ins维持培养基。在第6-7天开始自发性搏动。从第10-16天开始，将iPSC-CM在含有500μg/ml的重组人白蛋白、217μg/ml的L-抗坏血酸2-磷酸盐和5mM的DL-乳酸盐的选择培养基中在RPMI 1640培养基(不含葡萄糖)中培养。选择后，使用如别处所述的STEMdiff心肌细胞解离试剂盒酶促解离iPSC-CM(Dotzler等人,《循环》143:1411-1425(2021))。24小时后，将细胞维持在RPMI/B27-ins培养基中。对于所有实验，在分化后至少30天后使用细胞。
CRISPR-Cas9校正的等基因对照iPSC的产生：iPSC细胞系的基因组编辑通过应用干细胞(加利福尼亚州苗必达)来收缩。使用CRISPR-Cas9技术，针对两个LQT2患者细胞系(p.G604S和p.N633S)，产生等基因“变体校正的”对照iPSC细胞系。简言之，为每个变体系设计两个向导RNA(gRNA)并且在体内进行验证。基于特异性分数、切割效率和脱靶谱，选择一个候选gRNA用于每个患者iPSC系上的基因组编辑。单链寡脱氧核苷酸(ssODN)被设计成用作修复模板，并且将gRNA结合位点中的沉默突变引入到ssODN中以防止重新切割。使用Neon系统用gRNA构建体和ssODN转染LQT2患者iPSC系，并且对经转染的iPSC进行嘌呤霉素选择。挑取单细胞菌落用于基因分型，并且扩增具有变体校正的两个克隆以供进一步研究。
用于蛋白质印迹和qRT-PCR的TSA201细胞培养和转染：在5％ CO2温育箱中，使用补充有10％胎牛血清、1％ L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(康宁公司)，将TSA201细胞维持在37℃下。对于等位基因特异性qRT-PCR和蛋白质印迹实验，将每孔5x105个细胞铺板在6孔板中。24小时后，使用10μL Effectene(德国希尔登的凯杰公司)与100fmol(0.3-0.7μg)等摩尔量的每种质粒(pIRES2-EGFP-KCNH2-WT或-变体、pGFP-C-shLenti-shKCNH2(#1-#5)或-shCT、KCNH2-shIMM或pGFP-C-shLenti-KCNH2-SupRep)将细胞在维持培养基中共转染。
蛋白质印迹：将TSA201细胞用如上所述的KCNH2-WT、-shIMM或-变体和shKCNH2(#1-5)、-shCT或KCNH2-SupRep共转染。48小时后，使用具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1X RIPA缓冲液裂解细胞。将裂解液在冰上冷却10分钟，并且然后在50％振幅下超声处理10秒，并且将细胞碎片在4℃下以21,000rcf沉淀15分钟。将上清液转移到新管中，并且在与上样缓冲液(具有1:20β-巯基乙醇的2X Laemmli缓冲液)以1:1混合之前，使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测量蛋白质浓度。在4-15％ TGX凝胶(加利福尼亚州赫拉克勒斯市的Bio-Rad公司)上运行蛋白质(10μg/泳道)，并且使用Trans-Blot Turbo转移系统(Bio-Rad公司)将蛋白质转移到PVDF膜。在具有0.1％ Tween-20/3％牛血清白蛋白的三缓冲盐水(TBS)中封闭1小时后，将膜与针对KCNH2(Alomone公司(Alomone))和GAPDH管家对照(圣克鲁兹公司，sc-376476)的初级抗体在封闭溶液中分别以1:500和1:5000稀释度在4℃下温育过夜。然后，将膜在TBS-T中洗涤3x15分钟，并且在次级抗体HRP缀合的山羊抗兔(英杰公司)中在封闭溶液中以1:5000稀释度温育。1小时后，将膜在TBS-T中洗涤3x15分钟。最后，将膜在SuperSignalTMWest Pico PLUS化学发光ECL底物(赛默飞世尔科技公司)中温育并且暴露于HyBlot CL放射自显影膜(登维尔科学公司(Denville Scientific Inc.)，E3012)。使用自由可用的ImageJ软件定量像素密度。
等位基因特异性qRT-PCR：等位基因特异性引物被设计用于qRT-PCR，以通过调整别处描述的等位基因特异性基因分型方法来特异性扩增总KCNH2、内源性KCNH2(包含KCNH2-WT和-变体，但不包含KCNH2-shIMM)和KCNH2-shIMM(Rohatgi等人,《美国心脏病学会杂志》2017,70:453-462；以及Priori等人,《心律学》2013,10:1932-1963)。对于总KCNH2，引物购自IDT公司(爱荷华州克拉尔维尔)。对于等位基因特异性引物，使用跨shKCNH2靶位点的两个反向引物，其中一个反向引物与内源性KCNH2互补(对KCNH2-WT和-变体具有等位基因特异性)，并且另一个反向引物与KCNH2-shIMM互补(对KCNH2-shIMM具有等位基因特异性)。共同的正向引物用于两种等位基因特异性正向引物。GAPDH引物(IDT)用作管家对照。使用标准曲线来校正PCR扩增偏差。如上所述共转染TSA201细胞。48小时后，使用RNeasy试剂盒(凯杰公司)收获RNA并使用NanoDrop ND-1000分光光度计(赛默飞世尔公司)进行测量。通过将500ng RNA加载到SuperScript IV VILO Master Mix逆转录试剂盒(赛默飞世尔公司)中来产生互补DNA(cDNA)。使用SYBR Green Master Mix试剂盒(凯杰公司)，用上述四组引物，每个样品运行四个qRT-PCR反应。使用ΔΔCT方法，通过首先将KCNH2归一化为GAPDH并且然后比较KCNH2-WT和shCT处理组的相对变化倍数来分析数据。
iPSC-CM的慢病毒产生和转导：慢病毒用于将KCNH2-SupRep或shCT(处理对照)应用于iPSC-CM。慢病毒颗粒是使用pPACKH1 HIV慢病毒包装试剂盒(加利福尼亚州帕洛阿尔托的SBI系统生物科学公司)由pGFP-C-shLenti-shKCNH2-shIMM(KCNH2-SupRep)和pGFP-C-shLenti-shCT(shCT)产生的。在分化诱导后超过30天后，将源自患有LQT2的两名患者和其相应的等基因对照的iPSC-CM解离并铺板到具有如上所述用于FluoVolt(马萨诸塞州亚什兰的MatTek公司)的玻璃底部插入物的包被的35mm培养皿中。在恢复48小时后，用含有KCNH2-SupRep或shCT的慢病毒颗粒转导iPSC-CM。添加聚凝胺(8μg/mL)感染试剂(密理博西格玛公司)以提高转导效率，并且将iPSC-CM在室温下在35mm培养皿中以250rcf离心1.5小时。转导后24小时后，将培养基更换为新鲜维持培养基RPMI/B27-ins。
iPSC-CM中的电压染料光学动作电位：用含有KCNH2-SupRep或shCT的慢病毒颗粒转导iPSC-CM后3-7天进行电压染料实验。在成像当天，将iPSC-CM用预热的(37℃)HEPES缓冲的台氏液(马萨诸塞州黑弗里尔的阿法埃莎公司)洗涤。将每个35mm玻璃底部培养皿与0.125μL FluoVolt染料、1.25μL PowerLoad和0.5mL台氏液(FluoVolt膜电位试剂盒，赛默飞世尔公司)在37℃下一起温育20分钟。将过量的染料用台氏液冲洗三次，并且将最终的2mL的台氏液添加到iPSC-CM中进行成像。在成像期间，将培养皿保存在具有5％ CO2的经加热的37℃载物台顶室(韩国首尔的活细胞仪器公司)中。在40X-水物镜放大率下，使用NikonEclipse Ti光学显微镜(日本东京的尼康公司)，在20秒快速延时视频中以50帧/秒(fps，20毫秒曝光时间)的速率以5％功率的LED照明记录光学动作电位。使用MyoPacer场刺激器(马萨诸塞州韦斯特伍德的Ion Optix公司)以1Hz(9毫秒脉冲持续时间，25V)起搏iPSC-CM来消除对APD的搏动速率依赖性影响。将所关注矩形区域绘制在细胞的闪光区域上方以供分析。使用NIS-Elements软件(尼康公司)来测量每个所关注区域内随时间推移变化的荧光强度，从而得到光学动作电位迹线。使用定制的Excel程序，针对光漂白校正迹线，并且将振幅归一化为荧光变化除以基线最小荧光(ΔF/Fmin)。以半自动的方式，针对每个单独的光学动作电位检测共同的动作电位参数(包含APD90、APD50、振幅、上升时间、上冲程速度等)，并且跨20秒迹线内的所有搏动取平均值。20秒迹线内的所有搏动的平均值表示单个数据点。对于代表性迹线，将最大振幅进一步归一化为1.0，以允许APD差异的准确可视化。
统计：使用GraphPad Prism 9进行所有统计分析。在适用的情况下，显示单个数据点和平均值。使用单向方差分析(ANOVA)评估正态分布参数的组平均值之间的差异，用于在≥3个组之间的比较。对于多次事后ANOVA分析，使用图基检验。P≤0.05的值被认为是统计学上显著的。对于膜片钳实验，数据点显示为平均值，并且条表示平均值的标准误差。GraphPad Prism8.3(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司)用于t检验。进行学生t检验以确定两组之间的统计显著性。进行配对的t检验以确定在E-4031之前和之后的统计显著性。P<0.05被认为是显著的。
表7
选择用于产生iPSC-CM研究的iPSC的受试者的概述
KCNH2变体作为蛋白质水平随着括号中的cDNA变化的所得变化列出。
QTc，Bazett校正的QT间期；ICD，植入式心脏复律除颤器；LCSD，左心脏交感去神经；PBMC，外周血单核细胞；SCD，心脏猝死。
实例13–KCNH2的shRNA敲低
测试了靶向KCNH2的十七(17)个独特shRNA，并且鉴定了一个候选shRNA(命名为Rab_sh4)，其以约80％的敲低效率抑制TSA201细胞中的内源性KCNH2等位基因(突变和野生型两者)(图22)。shRNA(5'-CACGGAGCAGCCAGGGGAGGTGTCGGCCT-3'；SEQ ID NO:27)(RNA序列5'-CACGGAGCAGCCAGGGGAGGUGUCGG CCU-3'；SEQ ID NO:28)与兔序列和人序列完全同源。在慢病毒主链(pGFP-C-shLenti)和AAV9主链(pGFP-A-shAAV)中设计shRNA。一旦鉴定出此shRNA，就产生了含有shRNA(SEQ ID NO:28)和KCNH2 cDNA的“shRNA-免疫”(5'-TACCGAACAACCTGGCGAAGTCTCCGCGT-3'；SEQ ID NO:29)版本的SupRep构建体(用于敲低内源性KCNH2等位基因的shRNA，以及用于同时提供置换野生型KCNH2等位基因的shRNA-免疫)。与KCNQ1一样，shIMM序列在shRNA靶序列内的每个密码子的摆动碱基处发生改变，这防止被shRNA敲低，但并不改变经编码的氨基酸序列。在慢病毒主链(pGFP-C-shLenti)和AAV9主链(pGFP-A-shAAV)两者中设计SupRep构建体，其中在慢病毒主链中产生五个SupRep构建体并且在AAV9主链中产生五个SupRep构建体。这些构建体在其所含有的报告基因序列(P2A、融合-GFP、IRES、HA-标签和无报告基因)方面有所不同。总共10种构建体如下：
shLenti-SupRep-P2A
shLenti-SupRep-融合-GFP
shLenti-SupRep-IRES
shLenti-SupRep-HA标签
shLenti-SupRep-无报告基因
shAAV-SupRep-P2A
shAAV-SupRep-融合-GFP
shAAV-SupRep-IRES
shAAV-SupRep-HA标签
shAAV-SupRep-无报告基因
SupRep构建体含有CMV启动子和人生长激素(HGH)聚腺苷酸化信号，但可以被修饰以包含其它启动子/增强子。例如，CMV启动子可以用cTnC启动子置换，所述cTnC启动子小于CMV启动子且更具心脏特异性。另外，HGH聚腺苷酸化信号可以用较小的SV40终止子序列置换。这些修饰减小了SupRep构建体的大小并且允许所述构建体以更高的效率包装到AAV9中。
实例14–KCNH2的体外SupRep校正
将CRISPR-Cas9校正的等基因对照用作用于心脏APD的“理想”校正的标志物。使用FluoVoltTM电压染料来测量N633S iPSC-CM和由LQT2 iPSC(N633S)产生的等基因对照iPSC-CM中的心脏APD。用shCT处理的等基因对照和用shCT或KCNH2-SupRep处理的KCNH2-N633S变体的APD90B和APD50B值绘制于图23中。等基因对照iPSC-CM具有比用shCT处理的LQT2 iPSC-CM显著更短的APD90B和APD50B，这表明KCNH2中的单个病原性LQT2变体的校正能够在体外挽救疾病表型。用KCNH2-SupRep处理LQT2 iPSC-CM导致与用shCT处理的等基因对照的APD90B没有显著不同的APD90B缩短。对于KCNH2-N633S，KCNH2-SupRep实现了对延长的APD90B的“理想”校正并且对APD50B过度校正。
在进一步研究中，CRISPR-Cas9校正的等基因对照再次充当用于校正心脏APD的标志物。在N633S iPSC-CM和由LQT2 iPSC(N633S)产生的等基因对照iPSC-CM中的心脏APD的FluoVoltTM电压染料测量的结果绘制于图24中。绘制了未处理(UT)KCNH2-N633S变体、经SupRep处理的等基因对照和未处理(UT)等基因对照的APD90B和APD50B值。经处理和未处理的等基因对照iPSC-CM具有比未处理的LQT2 iPSC-CM显著更短的APD90B和APD50B，这再次表明KCNH2中的单个病原性LQT2变体的校正能够在体外挽救疾病表型。与未处理的等基因对照相比，用KCNH2-SupRep处理等基因对照iPSC-CM导致APD90B和APD50B缩短过度校正。
来自G604S iPSC-CM中的心脏APD的FluoVoltTM电压染料测量的结果绘制于图25中。绘制了用shCT或SupRep处理的KCNH2-G604S变体的APD90和APD50值。与用shCT处理的LQT2 iPSC-CM相比，用SupRep处理LQT2 iPSC-CM引起显著的APD90和APD50缩短。
在进一步研究中，CRISPR-Cas9校正的等基因对照充当用于心脏APD的“理想”校正的标志物。G604S iPSC-CM和由LQT2 iPSC(G604S)产生的等基因对照iPSC-CM中的心脏APD的FluoVolt荧光电压染料测量示出于图26中。示出了用shCT(3)处理的等基因对照和用shCT(1)或KCNH2-SupRep(2)处理的KCNH2-G604S变体的APD90和APD50值。等基因对照iPSC-CM具有比用shCT处理的LQT2 iPSC-CM显著更短的APD90和APD50，这表明KCNH2中的单个病原性LQT2变体的校正能够在体外挽救疾病表型。用KCNH2-SupRep处理LQT2 iPSC-CM导致APD90缩短。对于KCNH2-G604S，与用shCT处理的等基因对照相比，KCNH2-SupRep过度校正了延长的APD90和APD50。
CRISPR-Cas9还用于将KCNH2-G628S插入到充当等基因对照的野生型细胞中，所述等基因对照提供用于“理想”心脏APD的标志物。G628SiPSC-CM和等基因对照iPSC-CM中的心脏APD的FluoVolt电压染料测量示出于图27中。示出了用shCT(3)处理的等基因对照和用shCT(1)或KCNH2-SupRep(2)处理的KCNH2-G628S变体的APD90值。等基因对照iPSC-CM具有比用shCT处理的LQT2 iPSC-CM显著更短的APD90，这表明KCNH2中的单个病原性LQT2变体的插入能够在体外显示出疾病表型。用KCNH2-SupRep处理LQT2 iPSC-CM导致APD90缩短。对于KCNH2-G628S，与用shCT处理的等基因对照相比，KCNH2-SupRep过度校正了延长的APD90。
实例15-KCNH2-SupRep基因疗法抑制和置换KCNH2-WT
为了测试KCNH2-shIMM是否确实对由shKCNH2(sh#4)产生的KD免疫，将TSA201细胞用KCNH2-WT或KCNH2-shIMM和shKCNH2共转染。使用等位基因特异性qRT-PCR定量KCNH2-WT对KCNH2-shIMM的表达。使用一组独特的等位基因特异性引物，将每个样品在四个单独的反应中运行，以定量(1)总KCNH2、(2)内源性KCNH2，其包含WT和含有变体的等位基因但不包含KCNH2-shIMM、(3)KCNH2-shIMM和(4)作为管家对照的GAPDH。使用商业引物来扩增总KCNH2。对于内源性KCNH2或KCNH2-shIMM的排他扩增，在shKCNH2靶位点内设计两个反向引物，一个反向引物与WT序列互补并且另一个反向引物与工程化以产生KCNH2-shIMM的独特的经修饰的序列互补。两种反应均使用共同的正向引物，并且使用标准曲线来校正PCR扩增偏差。结果显示在用KCNH2-WT或KCNH2-shIMM和shCT、shKCNH2或KCNH2-SupRep共转染的TSA201细胞中，shKCNH2敲低KCNH2-WT但不敲低KCNH2-shIMM(图28A)。通过等位基因特异性qRT-PCR定量KCNH2-WT(白色)和KCNH2-shIMM(灰色)来测量相对于GAPDH归一化的相对KCNH2表达。通过用GAPDH作为管家对照的蛋白质印迹确认针对KCNH2的结果(图28B)。
实例16-使用KCNH2-SupRep验证变体非依赖性抑制和置换
为了测试KCNH2-SupRep基因疗法是否以变体独立性方式敲低和置换KCNH2，将TSA201细胞用KCNH2-WT或KCNH2-变体以及shCT、shKCNH2或KCNH2-SupRep共转染。结果显示KCNH2-SupRep敲低引起LQT2疾病的KCNH2错义变体，并用KCNH2-shIMM置换所述变体。shKCNH2以变体独立性方式敲低KCNH2。KCNH2-SupRep通过shKCNH2敲低KCNH2变体并且表达KCNH2-shIMM，其是敲低免疫的。图29A中的图示出了使用等位基因特异性qRT-PCR检测到的KCNH2-WT/变体和KCNH2-shIMM的比例表达，以测量KCNH2-WT/变体(白色)和KCNH2-shIMM(灰色)。图29B显示通过用GAPDH作为管家对照的蛋白质印迹验证的总体KCNH2表达(非等位基因特异性)。
实例17-KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP在H9C2细胞中产生E-4031敏感外向电流
为了确定心脏特异性KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP是否仅在心肌细胞中表达而不在非心肌细胞中表达，在TSA201细胞中对KCNH2-pIRES2-EGFP与KCNE2-pIRES2-dsRed2和KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP进行异源表达和膜片钳研究。KCNH2-pIRES2-EGFP与KCNE2-pIRES2-dsRed2的共表达揭示了稳健的Ikr电流。然而，KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP的表达仅展现出来自TSA201细胞的内源性外向电流，而不是典型的KCNH2电流(图30A和30B)，表明KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP在TSA201细胞中不表达。对于KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP表达，-10mV至+20mV的电压范围越低，峰值电流密度显著更小(图30C)。在+10mV下，峰值电流密度为41.4±3.4pA/pF(KCNH2-pIRES2-EGFP，n＝9)和23.2±3.0pA/pF(KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP，n＝8，p<0.05对KCNH2-pIRES2-EGFP)(图30D)。
为了确定心脏特异性KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP是否在心肌细胞中表达并且是否可以产生KCNH2电流，在作为大鼠新生儿心肌细胞的H9C2细胞中进行异源表达和膜片钳研究。空的H9C2细胞仅展现出小的外向电流(图31A，上图)，而在KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP表达的情况下，揭示了稳健的外向电流(图31A，中图)。此外向电流被特定的KCNH2通道阻断剂(500nM E-4031)抑制(图31A，下图)。对于KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP表达，峰值电流密度在-20mV至+60mV的电压范围内显著增加(P<0.05对空的H9C2)(图31B)。在+60mV下，峰值电流密度为17.3±3.8pA/pF(空的H9C2，n＝9)和29.8±3.6pA/pF(KCNH2-AAV-P2ACTnC-EGFP，n＝9，p<0.05对空的H9C2)(图31C)。500nM E-4031显著抑制KCNH2-AAV-P2A CTnC-EGFP在+10mV至+60mV的电压范围内表达的外向电流(P<0.05对在E-4031之前)(图31D)。在+60mV下，峰值电流密度为29.8±5.4pA/pF(在E-4031之前，n＝6)和19.1±3.2pA/pF(在E-4031之后，n＝6，p<0.05对在E-4031之前)(图31E)。
实例18-KCNH2-SupRep延长了如通过FluoVolt电压染料测量的SQT1iPSC-CM中的
病理学缩短的心脏APD
为了显示KCNH2-SupRep可以挽救LQT2和1型短QT(SQT1)疾病表型两者，CRISPR-Cas9用于将KCNH2-N588K(一种已知的SQT1变体)插入到充当等基因对照的野生型细胞中(图32)。等基因对照充当用于“理想”心脏APD的标志物。N588K iPSC-CM和等基因对照iPSC-CM中的心脏APD的FluoVolt电压染料测量绘制于图32中。示出了用shCT处理的等基因对照和用shCT(1)或KCNH2-SupRep(2)处理的KCNH2-N588K变体的APD90和APD50值。等基因对照iPSC-CM(3)具有比用shCT处理的SQT1 iPSC-CM显著更长的APD90和APD50，这表明KCNH2中的单个病原性1型短QT(SQT1)变体的插入能够在体外显示出疾病表型。用KCNH2-SupRep处理SQT1 iPSC-CM导致APD90延长。对于KCNH2-N588K，与用shCT处理的等基因对照相比，KCNH2-SupRep校正了缩短的APD90和APD50。
实例19–用于LQT3 SupRep的材料和方法
用于iPSC产生的LQT3患者选择：患者由遗传心脏病专家和LQTS专家进行评估。分别通过4mm皮肤穿孔活检和血液样品收集真皮成纤维细胞和PBMC。从诊断患有多种遗传性心脏离子通道病及其受影响或未受影响的家族成员的近1200名患者，包含80名患有LQT3的患者获得样品。为了产生iPSC，选择四名携带导致以下蛋白质水平变化的突变的LQT3患者：P1332L、R1623Q和F1760C(表8)。
成纤维细胞/PBMC重编程为iPSC和质量控制：使用CytoTune-iPS 2.0重编程试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司)通过仙台病毒转导或使用含有山中因子的四种游离型DNA质粒的电穿孔来重编程成纤维细胞或PBMC：pCXLE-hUL、pCXLE-hSK、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F和pCXWB-EBNA1(马萨诸塞州沃特敦的Addgene公司)。在诱导后21天内挑取至少两个集落并且克隆地扩增。在37℃下，在5％ CO2温育箱中，将所有iPSC在补充有1％青霉素/链霉素的mTeSRTM1中在/>包被的(康宁公司)6cm培养皿上培养。在85％汇合时，使用ReLeSR/>传代iPSC。然后对每个克隆进行核型分析。
所有系具有正常的核型。SCN5A变体确认是通过来自基因组DNA的PCR扩增子的桑格测序进行的。使用针对Oct4(赛默飞世尔公司，PA5-27438)、Nanog(赛默飞世尔公司，PA1-097)、Tra-1-60(得克萨斯州达拉斯的圣克鲁兹公司；sc-21705)和SSEA-4(赛默飞世尔公司，MA1-021)的初级抗体以1:250稀释度通过共聚焦免疫荧光显微术证实了多能标志物在所有iPSC克隆中的表达。次级抗体是ALEXA488山羊抗小鼠(赛默飞世尔公司，A-11001)和ALEXA/>594山羊抗兔(赛默飞世尔公司，A-11037)。用DAPI(赛默飞世尔公司)以1:2000稀释度从5mg/mL的储备液中进行复染。在Zeiss LSM 980共聚焦显微镜上获取图像。
对于iPSC的质量对照：在SCN5A-F1760C iPSC系上进行标准质量控制测定，包含LQT3致病性变体的桑格测序、核型分型、明场形态和多能标志物的免疫荧光显微术，所述多能标志物包含Tra-1-60、Nanog、SSEA-4和Oct4(图33A-33D)。iPSC的分化通过别处所述的方法诱导以产生自发搏动的iPSC-CM(Burridge等人,同上；以及Mummery等人,同上)。由于已知心脏APD随着iPSC-CM随时间推移成熟而缩短，因此所有实验在诱导分化后至少30天进行(Shaheen等人,同上)。
iPSC-CM培养、分化和分解：当iPSC达到85％汇合时，如别处所述诱导分化为心肌细胞(CM)(Schwartz 2009,同上；以及Schwartz 2013,同上)。通过将培养基更换为含有5μMCHIR99021(密苏里州圣路易斯的密理博西格玛公司)的补充有B27-去除胰岛素的RPMI1640GlutaMAXTM加上25mM HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))(RPMI/B27-ins)(赛默飞世尔公司)来开始分化(第0天)。在第2天，将培养基更换为含有5μM IWP-2(密理博西格玛公司)的RPMI/B27-ins。在第4天，将培养基更换回维持培养基RPMI/B27-ins。自发性搏动通常开始于第6-7天，到第10-12天扩增至剩余细胞。允许iPSC-CM成熟直到至少第30天，每周更换两次培养基。在第30天后，使用STEMdiffTM心肌细胞解离试剂盒酶促解离iPSC-CM。简言之，将细胞用PBS(无Ca2+/Mg2+)冲洗并且在37℃下置于解离培养基中10分钟，并且然后通过添加STEMdiffTM心肌细胞支持培养基/>来失活。将细胞研磨，转移到15mL锥形管中，并且通过以300rcf离心3分钟进行沉淀。在转移到适当的包被的培养器皿中之前，抽吸上清液，并且将细胞悬浮于心肌细胞支持培养基中。24小时后，将培养基更换回RPMI/B27-ins。解离产生单细胞和小至中等大小的iPSC-CM簇的混合物，这取决于铺板之前和之后的细胞密度。自发性搏动通常在解离后24小时恢复，在第3-7天之间具有强电耦合和合胞体形成。/>
CRISPR-Cas9校正的等基因对照iPSC：针对携带SCN5A-R1623Q、SCN5A-P1332L或SCN5A-F1760C突变的三种患者特异性LQT3细胞系，在商业上产生了等基因的“变体校正的”对照iPSC细胞系。这些等基因对照充当用于可能的治疗性治愈的黄金标准，由此为延长的APD的“理想”挽救/归一化提供标志物并且指示用SCN5A-SupRep基因疗法进行的治疗与这一理想的接近程度。
iPSC-CM的慢病毒产生和转导：慢病毒用于将SCN5A-SupRep应用于iPSC-CM(或作为处理对照的shCT)。慢病毒颗粒是使用pPACKH1 HIV慢病毒包装试剂盒(加利福尼亚州帕洛阿尔托的SBI系统生物科学公司)由shLenti-shSCN5A-shIMM-P2A-GFP(SCN5A-GFP-SupRep)和shLenti-shSCN5A-shIMM-HA(SCN5A-HA-SupRep)产生的。在分化诱导后至少达到第30天之后，将患有LQT3的iPSC-CM患者解离并铺板到具有用于FLUOVOLTTM(MatTek公司)的玻璃底部插入物或用于如上所述的免疫荧光(Marienfeld SUPERIORTM)的10孔培养反应载玻片的包被的35mm培养皿中。在恢复24-48小时后，使iPSC-CM保持不处理或用含有SCN5A-SupRep的慢病毒颗粒转导。为了提高转导效率，在转导期间添加聚凝胺感染试剂(密理博西格玛公司)至8μg/mL的最终浓度，并且将iPSC-CM在室温下在35mm培养皿中以250rcf离心1.5小时。在转导后24小时，将培养基更换为新鲜维持培养基RPMI/B27-ins。
iPSC-CM中的电压染料光学动作电位：用含有SCN5A-SupRep的慢病毒颗粒转导iPSC-CM后3-7天进行电压染料实验。在成像当天，将iPSC-CM用预热的(37℃)HEPES缓冲的台氏液(阿法埃莎公司)冲洗。使用FLUOVOLTTM膜电位试剂盒(赛默飞世尔公司)，将0.125μLFLUOVOLTTM染料和1.25μL PowerLoad添加到每个35mm玻璃底部培养皿的0.5mL台氏液中并且在37℃下温育20分钟。用预热的台氏液在三次冲洗中去除过量的染料，并且将最终的2mL台氏液添加到iPSC-CM中进行成像。在成像期间，将培养皿保存在具有5％ CO2的经加热的37℃载物台顶室(活细胞仪器公司)中。使用Nikon Eclipse Ti光学显微镜(尼康公司)，在40X-水物镜放大率下，在20秒快速延时视频中以50帧/秒(fps，20毫秒曝光时间)的速率以5％功率的LED照明记录光学动作电位。使用MyoPacer场刺激器(马萨诸塞州韦斯特伍德的Ion Optix公司)以1Hz(9毫秒脉冲持续时间，25V)起搏iPSC-CM来消除对APD的搏动速率依赖性影响。视频集中于iPSC-CM(簇和单层)的电耦合的合胞体区域，因为这些细胞区域最好跟随起搏刺激并且产生由荧光强度的较大变化(通常约8-12％)表示的最大信噪比。为了分析，将所关注矩形区域绘制在细胞的闪光区域上方，并且使用NIS-Elements软件(尼康公司)来定量在每个所关注区域内随时间推移的荧光强度，从而产生光学动作电位迹线。使用定制的基于Excel的程序，针对光漂白校正迹线，并且将振幅归一化为荧光变化除以基线最小荧光(ΔF/Fmin)。以半自动的方式，针对每个单独的光学动作电位检测共同的动作电位参数(包含APD90、APD50、振幅、上升时间、上冲程速度等)，并且跨20秒迹线内的所有搏动取平均值。20秒迹线内的所有搏动的平均值表示单个数据点。对于代表性迹线，将最大振幅进一步归一化为1.0，以允许APD差异的准确可视化。
统计：GraphPad Prism 9用于所有统计分析并且用于拟合附图的所有数据。在可行的情况下，显示单个数据点和平均值。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。进行未配对的双尾学生t检验以确定在指示时两组之间的统计显著性。p<0.05被认为是显著的。
表8选择用于产生iPSC-CM研究的iPSC的受试者的概述
SCN5A变体作为蛋白质水平随着括号中的cDNA变化的所得变化列出。
QTc，Bazett校正的QT间期；ICD，植入式心脏复律除颤器；PBMC，外周血单核细胞；LCSD，左心脏交感去神经；LCSD，右心脏交感去神经；SCD，心脏猝死。
实例20–SCN5A的shRNA敲低
为了制备SCN5A-SupRep，测试pGFP-C-shLenti慢病毒主链中的六个候选SCN5AshRNA(sh#1-6)。通过将TSA201细胞用SCN5A-WT和sh#1-6共转染来确定每个SCN5A shRNA的KD效率。SCN5A的表达通过定量逆转录PCR(qRT-PCR，图34)测量。在所测试的六个shRNA中，sh#1、sh#3、sh#4和sh#5全都导致SCN5A的显著KD(mRNA：78-91％KD)。因此，这些shRNA中的任何shRNA都可以用作最终的SCN5A-SupRep基因疗法载体的一部分。然而，通过原始KD，SCN5A sh#1(5'-GGTTCACTCGCTCTTCAACATGCTCATCA-3'；SEQ ID NO:30)(RNA序列5'-GGUUCACUCGCUCUUCAACAUGCUCAUCA-3'；SEQ ID NO:31)提供了SCN5A的最强KD，从而以约91％敲低效率抑制TSA201细胞中的内源性SCN5A等位基因(突变和野生型两者)(图34)。另外，在选择时，使用基因组聚集数据库(gnomAD)和ClinVar评估SCN5A sh#1靶序列，并且发现所述SCN5Ash#1靶序列缺乏共同的遗传多态性和所有已知的可能干扰KD效率的病原性LQT3致病性突变两者。因此，SCN5A sh#1被选择用于最终的SCN5A-SupRep，并且被称为“shSCN5A”。
在慢病毒主链(pGFP-C-shLenti)中设计shRNA。一旦鉴定出此shRNA，就产生了含有shRNA(SEQ ID NO:31)和SCN5A cDNA的“shRNA-免疫”(5'-CGTACATTCCCTGTTTAATATGCTGATTA-3'；SEQ ID NO:32)版本的SupRep构建体(用于敲低内源性SCN5A等位基因的shRNA，以及用于同时提供置换野生型SCN5A等位基因的shRNA-免疫)。与KCNQ1一样，shIMM序列在shRNA靶序列内的每个密码子的摆动碱基处发生改变，这防止被shRNA敲低，但并不改变经编码的氨基酸序列。在慢病毒主链(pGFP-C-shLenti)中设计SupRep构建体，其中在慢病毒主链中产生三个SupRep构建体。这些构建体在其所含有的报告基因序列(P2A、HA-标签和无报告基因)方面有所不同。总共3种构建体如下：
shLenti-SupRep-P2A
shLenti-SupRep-HA标签
shLenti-SupRep-无报告基因
图35展示了在此体外研究中使用的最终的SCN5A-SupRep基因疗法载体。。SupRep构建体含有CMV启动子和人生长激素(HGH)聚腺苷酸化信号，但可以被修饰以包含其它启动子/增强子。例如，CMV启动子可以用cTnC启动子置换，所述cTnC启动子小于CMV启动子且更具心脏特异性。另外，HGH聚腺苷酸化信号可以用较小的SV40终止子序列置换。这些修饰减小了SupRep构建体的大小并且允许所述构建体以更高的效率包装到AAV9中。
实例21-SCN5A-SupRep基因疗法缩短了如通过FLUOVOLTTM电压染料测量的LQT3
iPSC-CM中的心脏APD
进行动作电位分析以测试用SCN5A-SupRep基因疗法进行的治疗是否能够通过缩短病理学上延长的APD来挽救LQT3的病征性特征。使用FLUOVOLTTM电压染料来测量源自具有用SCN5A-SupRep基因疗法处理的引起LQT3的SCN5A-F1760C的患者的iPSC-CM中的光学作用电位。在记录期间，以1Hz起搏所有iPSC-CM，以消除APD的搏动速率依赖性变化。图36A示出了代表性光学动作电位。当未处理时，与未处理的不相关的健康对照iPSC-CM相比，SCN5A-F1760C iPSC-CM在90％复极化(APD90)时具有显著更长的APD并且在50％复极化(APD50)时具有显著更长的APD，从而验证SCN5A-F1760C iPSC-CM作为LQT3的体外模型。然后，对于每个变体，分别在APD90和APD50水平下，通过未配对的双尾学生t检验评估与未处理的SCN5A-F1760C iPSC-CM相比由于SCN5A-SupRep导致的APD缩短。SCN5A-SupRep在SCN5A-F1760CiPSC-CM中导致APD90和APD50两者的统计学上显著的衰减(图36B)。当用SCN5A-SupRep处理时，SCN5A-F1760C系的APD90和APD50显著缩短。这些结果表明，对于LQT3，抑制-置换基因疗法是直接靶向病原性底物并且改善所得疾病的有希望的策略。
实例22–MYH7的shRNA敲低
测试了靶向MYH7的六(6)个独特shRNA，并且鉴定了一个候选shRNA(命名为sh2)，其以约85％的敲低效率抑制TSA201细胞中的内源性MYH7等位基因(突变和野生型两者)(图37)。shRNA(5'-GCTGAAAGCAGAGAGAGATTATCACATTT-3'；SEQ ID NO:33)(RNA序列5'-GCUGAAAGCAGAGAGAGAUUAUCACAUUU-3'；SEQ ID NO:34)与人序列完全同源。在慢病毒主链(pGFP-C-shLenti)中设计shRNA。一旦鉴定出此shRNA，就产生了含有shRNA(SEQ ID NO:34)和MYH7 cDNA的“shRNA-免疫”(5'-ACTCAAGGCTGAAAGGGACTACCATATAT-3'；SEQ ID NO:35)版本的SupRep构建体(用于敲低内源性MYH7等位基因的shRNA，以及用于同时提供置换野生型MYH7等位基因的shRNA-免疫)。与KCNQ1一样，shIMM序列在shRNA靶序列内的每个密码子的摆动碱基处发生改变，这防止被shRNA敲低，但并不改变经编码的氨基酸序列。在慢病毒主链(pGFP-C-shLenti)中设计SupRep构建体，其中在慢病毒主链中产生三个SupRep构建体。这些构建体在其所含有的报告基因序列(P2A、HA-标签和无报告基因)方面有所不同。总共3种构建体如下：
shLenti-SupRep-P2A
shLenti-SupRep-HA标签
shLenti-SupRep-无报告基因
SupRep构建体含有CMV启动子和人生长激素(HGH)聚腺苷酸化信号，但可以被修饰以包含其它启动子/增强子。例如，CMV启动子可以用cTnC启动子置换，所述cTnC启动子小于CMV启动子且更具心脏特异性。另外，HGH聚腺苷酸化信号可以用较小的SV40终止子序列置换。这些修饰减小了SupRep构建体的大小并且允许所述构建体以更高的效率包装到AAV9中。
实例23–用于PKP2 SupRep的材料和方法
PKP2-SupRep基因疗法构建体的产生：为了制备PKP2-SupRep，测试pGFP-C-shLenti慢病毒主链中的八个候选PKP2 shRNA(sh#1-8)。通过将TSA201细胞用PKP2-WT和sh#1-8共转染来确定每个PKP2 shRNA的KD效率。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的PKP2表达(图38)。在所测试的八个shRNA中，sh#2、sh#4、sh#6和sh#7全都导致PKP2的显著KD(mRNA：75-90％ KD)。从理论上说，这些shRNA中的任何shRNA都可以用作最终的PKP2-SupRep基因疗法载体的一部分。为了通过原始KD从四种潜在候选物中选择最终的shRNA，PKP2 sh#7(5'-GCAGAGCTCCCAGAGAAATAT-3'；SEQ ID NO:52)(RNA序列5'–GCAGAGCUCCCAGAGAAAUAU-3'；SEQ ID NO:53)在两个mRNA(90％)水平下提供了PKP2的最强KD。另外，在选择时，使用基因组聚集数据库(gnomAD)和ClinVar评估PKP2 sh#7靶序列，并且发现所述PKP2 sh#7靶序列缺乏共同的遗传多态性和所有已知的可能干扰KD效率的病原性ACM致病性突变两者。因此，PKP2 sh#7被选择用于最终的PKP2-SupRep，并且被称为“shPKP2”。
为了产生PKP2的置换shRNA-免疫版本，称为PKP2-shIMM，在shPKP2靶位点(5'-GCTGAACTGCCTGAAAAGTAC-3'；SEQ ID NO:990)内的每个密码子的摆动碱基处将十个同义变体引入到WT PKP2 cDNA(NM_004572.4)中。然后，将PKP2-shIMM克隆到位于CMV启动子下游的含有shPKP2的载体pGFP-C-shLenti中。制备构建体的三种变型：shLenti-SupRep-P2A-GFP、shLenti-SupRep-HA标签、shLenti-SupRep-无报告基因。
用于iPSC产生的PKP2患者选择：患者由遗传心脏病专家进行评估。分别通过4mm皮肤穿孔活检和血液样品收集真皮成纤维细胞和PBMC。从诊断患有多种遗传性心脏离子通道病及其受影响或未受影响的家族成员的近1200名患者，包含29名具有PKP2变体的患者获得样品。选择具有PKP2变体的四名患者用于产生iPSC：R79X、E149X、Q457X、c.2146-1G>C。
成纤维细胞/PBMC重编程为iPSC和质量控制：使用CytoTune-iPS 2.0重编程试剂盒(赛默飞世尔公司)通过仙台病毒转导或使用含有山中因子的四种游离型DNA质粒的电穿孔来重编程成纤维细胞或PBMC：pCXLE-hUL、pCXLE-hSK、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F和pCXWB-EBNA1(马萨诸塞州沃特敦的Addgene公司)。在诱导后21天内挑取至少两个集落并且克隆地扩增。在37℃下，在5％ CO2温育箱中，将所有iPSC在补充有1％青霉素/链霉素的mTeSRTM1中在/>包被的(康宁公司)6cm培养皿上培养。在85％汇合时，使用ReLeSR/>传代iPSC。然后对每个克隆进行核型分析。
所有系具有正常的核型。PKP2变体确认是通过来自基因组DNA的PCR扩增子的桑格测序进行的。使用针对Oct4(赛默飞世尔公司，PA5-27438)、Nanog(赛默飞世尔公司，PA1-097)、Tra-1-60(得克萨斯州达拉斯的圣克鲁兹公司；sc-21705)和SSEA-4(赛默飞世尔公司，MA1-021)的初级抗体以1:250稀释度通过共聚焦免疫荧光显微术证实了多能标志物在所有iPSC克隆中的表达。次级抗体是ALEXA488山羊抗小鼠(赛默飞世尔公司，A-11001)和ALEXA/>594山羊抗兔(赛默飞世尔公司，A-11037)。用DAPI(赛默飞世尔公司)以1:2000稀释度从5mg/mL的储备液中进行复染。在Zeiss LSM 980共聚焦显微镜上获取图像。
对于iPSC的质量对照：在c.2146-1G>C iPSC系上进行标准质量控制测定，包含ACM致病性变体的桑格测序、核型分型、明场形态和多能标志物的免疫荧光显微术，所述多能标志物包含Tra-1-60、Nanog、SSEA-4和Oct4(图39A-39D)。iPSC的分化通过别处所述的方法诱导以产生自发搏动的iPSC-CM(Burridge等人,同上；以及Mummery等人,同上)。由于已知心脏APD随着iPSC-CM随时间推移成熟而缩短，因此所有实验在诱导分化后至少30天进行(Shaheen等人,同上)。
iPSC-CM培养、分化和分解：当iPSC达到85％汇合时，如别处所述诱导分化为心肌细胞(CM)(Schwartz 2009,同上；以及Schwartz 2013,同上)。通过将培养基更换为含有5μMCHIR99021(密理博西格玛公司)的补充有B27-去除胰岛素的RPMI 1640GLUTAMAXTM加上25mMHEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))(RPMI/B27-ins)(赛默飞世尔公司)来开始分化(第0天)。在第2天，将培养基更换为含有5μM IWP-2(密理博西格玛公司)的RPMI/B27-ins。在第4天，将培养基更换回维持培养基RPMI/B27-ins。自发性搏动通常开始于第6-7天，到第10-12天扩增至剩余细胞。允许iPSC-CM成熟直到至少第30天，每周更换两次培养基。在第30天后，使用STEMDIFFTM心肌细胞解离试剂盒酶促解离iPSC-CM。简言之，将细胞用PBS(无Ca2+/Mg2+)冲洗并且在37℃下置于解离培养基中10分钟，并且然后通过添加STEMDIFFTM心肌细胞支持培养基/>来失活。将细胞研磨，转移到15mL锥形管中，并且通过以300rcf离心3分钟进行沉淀。在转移到适当的/>包被的培养器皿中之前，抽吸上清液，并且将细胞悬浮于心肌细胞支持培养基中。24小时后，将培养基更换回RPMI/B27-ins。解离产生单细胞和小至中等大小的iPSC-CM簇的混合物，这取决于铺板之前和之后的细胞密度。自发性搏动通常在解离后24小时恢复，在第3-7天之间具有强电耦合和合胞体形成。
iPSC-CM的慢病毒产生和转导：慢病毒用于将PKP2-SupRep应用于iPSC-CM。慢病毒颗粒是使用pPACKH1 HIV慢病毒包装试剂盒(加利福尼亚州帕洛阿尔托的SBI系统生物科学公司)由shLenti-shPKP2-shIMM-P2A-GFP(PKP2-GFP-SupRep)和shLenti-shPKP2-shIMM-HA(PKP2-HA-SupRep)产生的。在分化诱导后至少达到第30天之后，将来自患有ACM的患者的iPSC-CM解离并铺板到具有如上所述用于Fluo-4 AM(英杰公司；目录编号F14201)的玻璃底部插入物或用于免疫荧光(Marienfeld SUPERIORTM)的10孔培养反应载玻片的包被的35mm培养皿中。在恢复24-48小时后，使iPSC-CM保持不处理或用含有PKP2-SupRep的慢病毒颗粒转导。为了提高转导效率，在转导期间添加聚凝胺感染试剂(密理博西格玛公司)至8μg/mL的最终浓度，并且将iPSC-CM在室温下在35mm培养皿中以250rcf离心1.5小时。转导后24小时后，将培养基更换为新鲜维持培养基RPMI/B27-ins。
iPSC-CM中的细胞内钙测定：用含有PKP2-SupRep的慢病毒颗粒转导iPSC-CM后3-7天进行细胞内钙测定实验。在成像当天，将iPSC-CM用预热的(37℃)HEPES缓冲的台氏液(阿法埃莎公司)冲洗。将Fluo-4 AM染料(英杰公司)溶解于50μL DMSO中，然后将5μL Fluo-4AM和2μLPLURONICTM F-127(英杰公司)添加到每个35mm玻璃底部培养皿的1mL台氏液中并且在37℃下温育30分钟。在一次冲洗和用预热的台氏液洗涤两次5分钟中去除过量的染料，并且将最终的1.5mL台氏液添加到iPSC-CM中进行成像。在成像期间，将培养皿保存在具有5％CO2的经加热的37℃载物台顶室(活细胞仪器公司)中。使用Nikon Eclipse Ti光学显微镜(尼康公司)，在40X-水物镜放大率下，在20秒快速延时视频中以50帧/秒(fps，20毫秒曝光时间)的速率以5％功率的LED照明记录钙瞬变。使用MyoPacer场刺激器(马萨诸塞州韦斯特伍德的Ion Optix公司)以0.5Hz(9毫秒脉冲持续时间，25V)起搏iPSC-CM来消除对钙瞬变的搏动速率依赖性影响。视频集中于iPSC-CM(簇和单层)的电耦合的合胞体区域，因为这些细胞区域最好跟随起搏刺激并且产生由荧光强度的较大变化表示的最大信噪比。为了分析，将所关注矩形区域绘制在细胞的闪光区域上方，并且使用NIS-Elements软件(尼康公司)来定量在每个所关注区域内随时间推移的荧光强度，从而产生钙瞬变迹线。使用定制的基于Excel的程序，针对光漂白校正迹线，并且将振幅归一化为荧光变化除以基线最小荧光(ΔF/Fmin)。以半自动的方式，检测到每个单独的钙瞬变的常见钙瞬变参数，包含Ca2+振幅、50％和90％ Ca2++瞬变持续时间(CTD)、峰值至50％和峰值至90％衰变、上冲程时间、上冲程速度、Vmax等，并且跨20秒迹线内的所有搏动取平均值，除了在Ca2+振幅的情况下，其中仅针对第一搏动取值。对于所有参数，除了Ca2+振幅之外，20秒迹线内的所有搏动的平均值表示单个数据点。在记录基线测量时，将0.5ml 400nM的异丙肾上腺素添加到细胞中以制备100nM的最终浓度，并且每一分钟进行一次钙瞬变记录，持续总共10分钟。以与上文针对基线测量所描述的方式相同的方式分析迹线。
统计：GraphPad Prism 9用于所有统计分析并且用于拟合附图的所有数据。在可行的情况下，显示单个数据点和平均值。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。还使用双向ANOVA和事后图基检验进行多重比较。p<0.05被认为是显著的。
实例24-PKP2-SupRep基因疗法缩短了如通过Fluo-4AM测量的ACMiPSC-CM中瞬变
持续时间和衰变时间
进行钙瞬变分析以测试用PKP2-SupRep基因疗法进行的处理是否能够挽救ACM的异常钙处理特征。使用Fluo-4 AM染料来测量源自具有用PKP2-SupRep基因疗法处理的c.2146-1G>C PKP2变体的患者的iPSC-CM中的钙瞬变。在记录期间，以0.5Hz起搏所有iPSC-CM，以消除对钙瞬变的搏动速率依赖性变化。延长的Ca2+衰变时间是ARVC的关键病理生理学，并且可能导致心脏组织重塑为肌病状态，如纤维化升高和无菌炎症介导的细胞桥粒改变加剧。另外，Ca2+衰变时间的延长可以通过引发DAD和EAD的如NCX1、LTCC和Na+通道等肌纤维膜通道功能的适应不良来加速心律失常电位。这些研究证明，SupRep利用一次递送治疗方案成功地挽救了心律失常电位(图40)。
实例25–DSP的shRNA敲低
将TSA201细胞用DSP-WT和六个定制的DSP shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的DSP表达。sh5(5'-GCACTACTGCATGATTGACATAG AGAAGA-3'；SEQ ID NO:44)(RNA序列5'-GCACUACUGCAUGAUUGACAUAGAGAAGA-3'；SEQ ID NO:45)具有相对于原始值最强的敲低(图41)，其中敲低效率为约88％。
实例26-MYBPC3的shRNA敲低
将TSA201细胞用MYBPC3-WT和六个定制的MYBPC3 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的MYBPC3表达。sh4(5'-GGAGGAGACCTTCAAATACCGGTTCAAGA-3'；SEQ ID NO:46)(RNA序列5'-GGAGGAGACCUUCAAAUACCGGUUCAAGA-3'；SEQ ID NO:47)具有相对于原始值最强的敲低(图42)，其中敲低效率为约82％。
实例27–RMB20的shRNA敲低
将TSA201细胞用RBM20-WT和六个定制的RBM20 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的RBM20表达。sh5(5'-GGTCATTCACTCAGTC AAGCCCCACATTT-3'；SEQ ID NO:48)(RNA序列5'-GGUCAUUCACUCAGUCAAGCCCCACAUUU-3'；SEQ ID NO:49)具有相对于原始值最强的敲低(图43)，其中敲低效率为约82％。
实例28-CACNA1C的shRNA敲低
将TSA201细胞用CACNA1C-WT和六个定制的CACNA1C shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的CACNA1C表达。sh1(5'-GGAACGAGTGGAATATCTCTTTCTCATAA-3'；SEQ ID NO:50)(RNA序列5'-GGAACGAGUGGAAUAUCUCUUUCUCAUAA-3'；SEQ ID NO:51)具有相对于原始值最强的敲低(图44)，其中敲低效率为约92％。
实例29–测试CALM1 shRNA
将TSA201细胞用CALM1-WT和六个定制的CALM1 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的CALM1表达。Sh2(5'-GAAAGATACAGATAGTGAAGAAGAA-3'；SEQ ID NO:2738)(RNA序列5'–GAAAGAUACAGAUAGUGAAGAAGAA-3'；SEQ ID NO:2739)具有相对于原始值最强的敲低(图45)，其中敲低效率为约89％。
实例30–测试CALM2 shRNA
将TSA201细胞用CALM2-WT和六个定制的CALM2 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的CALM2表达。Sh3(5'-GCTGATGGTAATGGCACAATTGACT-3'；SEQ ID NO:2740)(RNA序列5'–GCUGAUGGUAAUGGCACAAUUGACU-3'；SEQ ID NO:2741)具有相对于原始值最强的敲低(图46)，其中敲低效率为约70％。
实例31–测试CALM3 shRNA
将TSA201细胞用CALM3-WT和六个定制的CALM3 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的CALM3表达。Sh6(5'-GATGAGGAGGTGGATGAGATGATCA-3'；SEQ ID NO:2742)(RNA序列5'–GAUGAGGAGGUGGAUGAGAUGAUCA-3'；SEQ ID NO:2743)具有相对于原始值最强的敲低(图47)，其中敲低效率为约87％。
实例32–测试KCNJ2 shRNA
将TSA201细胞用KCNJ2-WT和六个定制的KCNJ2 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的KCNJ2表达。Sh5(5'-GTGCCGTAGCTCTTATCTAGCAAATGAAA-3'；SEQ ID NO:2744)(RNA序列5'–GUGCCGUAGCUCUUAUCUAGCAAAUGAAA-3'；SEQ ID NO:2745)具有相对于原始值最强的敲低(图48)，其中敲低效率为约74％。
实例33–测试CASQ2 shRNA
将TSA201细胞用CASQ2-WT和六个定制的CASQ2 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的CASQ2表达。Sh2(5'-AAGGAAGCCTGTATATTCTTA-3'；SEQ ID NO:2746)(RNA序列5'–AAGGAAGCCUGUAUAUUCUUA-3'；SEQ ID NO:2747)具有相对于原始值最强的敲低(图49)，其中敲低效率为约89％。
实例34–测试DSG2 shRNA
将TSA201细胞用DSG2-WT和六个定制的DSG2 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的DSG2表达。Sh5(5'-GCAGTCTAGTAGGAAGAAATGGAGTAGGA-3'；SEQ ID NO:2748)(RNA序列5'–GCAGUCUAGUAGGAAGAAAUGGAGUAGGA-3'；SEQ ID NO:2749)具有相对于原始值最强的敲低(图50)，其中敲低效率为约70％。
实例35–测试TNNT2 shRNA
将TSA201细胞用TNNT2-WT和七个定制的TNNT2 shRNA(sh1-7)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的TNNT2表达。Sh4(5′-GAAGAAGAAGAGGAAGCAAAG-3'；SEQ ID NO:2750)(RNA序列5'–GAAGAAGAAGAGGAAGCAAAG-3'；SEQ ID NO:2750)具有相对于原始值最强的敲低(图51)，其中敲低效率为约90％。
实例36–测试TPM1 shRNA
将TSA201细胞用TPM1-WT和六个定制的TPM1 shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的TPM1表达。Sh2(5'-AAGCTGAGAAGGCAGCAGATG-3'；SEQ ID NO:2751)(RNA序列5'–AAGCUGAGAAGGCAGCAGAUG-3'；SEQ ID NO:2752)具有相对于原始值最强的敲低(图52)，其中敲低效率为约85％。
实例37–测试LMNAshRNA
将TSA201细胞用LMNA-WT和六个定制的LMNA shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的LMNA表达。Sh5(5'-GGCAGATCAAGCGCCAGAATGGAGATGA-3'；SEQ ID NO:2753)(RNA序列5'–GGCAGAUCAAGCGCCAGAAUGGAGAUGA-3'；SEQ ID NO:2754)具有相对于原始值最强的敲低(图53)，其中敲低效率为约75％。
实例38–测试PLN shRNA
将TSA201细胞用LMNA-WT和六个定制的PLN shRNA(sh1-6)或非靶向加扰shRNA对照(shCT)共转染。通过qRT-PCR测量相对于GAPDH归一化的PLN表达。Sh5(5'-TGTCTCTTGCTGATCTGTATC-3'；SEQ ID NO:2755)(RNA序列5'–UGUCUCUUGCUGAUCUGUAUC-3'；SEQ ID NO:2756)具有相对于原始值最强的敲低(图54)，其中敲低效率为约80％。
其它实施例
应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改都处于以下权利要求的范围内。
Claims (127)
1.一种核酸构建体，其包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
6.根据权利要求4所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸构建体，其进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中所述报告基因是荧光多肽。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的核酸构建体，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过内部核酶进入序列(IRES)或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的核酸构建体，其中所述细胞是心肌细胞。
15.一种病毒颗粒，其包括根据权利要求1至14中任一项所述的核酸构建体。
16.一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述先天性心脏病是长QT综合征(LQTS)或短QT综合征(SQTS)。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述先天性心脏病是LQT1。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ IDNO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述报告基因是荧光多肽。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
31.根据权利要求16至30中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。
32.一种用于减少哺乳动物体内的心脏细胞中的动作电位时程(APD)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的心脏细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述心脏细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
42.一种用于减轻哺乳动物的LQTS的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNQ1多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNQ1多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNQ1多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNQ1多肽在所述细胞内的表达。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述LQTS是LQT1。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:36中所示的序列，并且其中所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
45.根据权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ IDNO:36中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:9中所示的序列。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
50.根据权利要求42至49中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
53.根据权利要求42至52中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。
54.一种核酸构建体，其包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。
55.根据权利要求54所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:27中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:29中所示的序列。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
57.根据权利要求56所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
58.根据权利要求56所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
59.根据权利要求58所述的核酸构建体，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
60.根据权利要求54至59中任一项所述的核酸构建体，其进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。
61.根据权利要求60所述的核酸构建体，其中所述报告基因是荧光多肽。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的核酸构建体，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过IRES或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。
63.根据权利要求54至62中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
64.根据权利要求63所述的核酸构建体，其中所述病毒载体是AAV载体。
65.根据权利要求64所述的核酸构建体，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
66.根据权利要求54至65中任一项所述的核酸构建体，其中所述细胞是心肌细胞。
67.一种病毒颗粒，其包括根据权利要求54至66中任一项所述的核酸构建体。
68.一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述先天性心脏病是LQTS或SQTS。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述先天性心脏病是LQT2。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ IDNO:27中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:29中所示的序列。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
74.根据权利要求72所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
76.根据权利要求68至75中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述报告基因是荧光多肽。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。
79.根据权利要求68至78中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
82.根据权利要求68至81中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。
83.一种用于减少哺乳动物体内的心脏细胞中的APD的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的心脏细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述心脏细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ ID NO:27中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:29中所示的序列。
85.根据权利要求83或权利要求84所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
89.根据权利要求83至88中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
92.一种用于减轻哺乳动物的LQTS的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码所述哺乳动物的细胞内的内源性KCNH2多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性KCNH2多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码KCNH2多肽，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的所述KCNH2多肽在所述细胞内的表达。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述LQTS是LQT2。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中所述第一核苷酸序列包括SEQ IDNO:27中所示的序列，并且所述第二核苷酸序列包括SEQ ID NO:29中所示的序列。
95.根据权利要求92至94中任一项所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
99.根据权利要求92至98中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
102.根据权利要求92至101中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。
103.一种用于治疗由内源性心脏多肽引起的先天性心脏病的核酸构建体，所述内源性心脏多肽含有引起所述先天性心脏病的一个或多个突变，其中所述构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的所述内源性心脏多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性心脏多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源性心脏多肽的置换形式，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源性心脏多肽的所述置换形式在所述细胞内的表达。
104.根据权利要求103所述的核酸构建体，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
105.根据权利要求104所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
106.根据权利要求104所述的核酸构建体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
107.根据权利要求106所述的核酸构建体，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
108.根据权利要求103至107中任一项所述的核酸构建体，其进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。
109.根据权利要求108所述的核酸构建体，其中所述报告基因是荧光多肽。
110.根据权利要求108或权利要求109所述的核酸构建体，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过内部核酶进入序列(IRES)或P2A自切割肽序列与所述第二核苷酸序列分离。
111.根据权利要求103至110中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
112.根据权利要求111所述的核酸构建体，其中所述病毒载体是AAV载体。
113.根据权利要求112所述的核酸构建体，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
114.根据权利要求103至113中任一项所述的核酸构建体，其中所述细胞是心肌细胞。
115.一种病毒颗粒，其包括根据权利要求103至114中任一项所述的核酸构建体。
116.一种用于治疗患有先天性心脏病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用核酸构建体，所述核酸构建体包括：
(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码RNAi分子，所述RNAi分子能够与编码细胞内的所述内源性心脏多肽的靶序列杂交并且抑制所述细胞内的所述内源性心脏多肽的表达，以及
(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源性心脏多肽的置换形式，其中所述第二核苷酸序列包括与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相同的靶序列，不同的是所述第二核苷酸序列的所述靶序列与所述第一核苷酸序列的所述靶序列相比包括1至13个摆动位置变体，并且其中所述RNAi分子不抑制来自所述第二核苷酸序列的缺乏引起所述先天性心脏病的所述一个或多个突变的所述内源性心脏多肽的所述置换形式在所述细胞内的表达。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与第一启动子可操作地连接，并且所述第二核苷酸序列与第二启动子可操作地连接。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
119.根据权利要求117所述的方法，其中所述第一启动子和所述第二启动子是不同的。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述第一启动子是U6启动子，并且所述第二启动子是CMV启动子。
121.根据权利要求116至120中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体进一步包括编码报告基因的核苷酸序列。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述报告基因是荧光多肽。
123.根据权利要求121或权利要求122所述的方法，其中编码所述报告基因的所述核苷酸序列位于编码所述cDNA的所述第二核苷酸序列的下游，并且通过IRES与所述第二核苷酸序列分离。
124.根据权利要求116至123中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体在病毒载体内。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述AAV载体是AAV血清型9载体或AAV2/9载体。
127.根据权利要求116至126中任一项所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。
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