JP2024052928A - ヌクレアーゼ媒介リピート伸長 - Google Patents

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シャオ チア－ジェン
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Abstract

【課題】ヌクレアーゼ媒介リピート伸長の提供。【解決手段】ゲノム遺伝子座の既存のリピートを伸長させるためのヌクレアーゼ媒介方法が提供される。内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびに、ヌクレアーゼ媒介リピート伸長を通してそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を作製する方法も提供される。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座でのリピート伸長と関連した１つまたは複数の神経変性障害を予防、遅延または処置するために使用することができる治療薬候補を識別するために、非ヒト動物細胞または非ヒト動物を使用する方法も提供される。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月２０日に出願の米国特許出願第６２／７８２，４６１号および２０１９年４月５日に出願の米国特許出願第６２／８２９，９９５号に基づく利益を主張している。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５４０５７８ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載された配列表は６０．０キロバイトであり、２０１９年１２月１２日に作成され、本明細書に参照により組み込まれる。
背景
そのほとんどは主に神経系を侵す４０を超える疾患は、ヒトゲノム全体に分散する単純な配列リピートの伸長によって引き起こされる。伸長したトリヌクレオチドリピートの疾患が最初に発見され、今でも頻度が最も高い。より最近では、テトラ－、ペンタ－、ヘキサ－およびドデカヌクレオチドリピート伸長さえ、最も一般的な神経学的遺伝的障害のいくつかを含むヒト疾患の原因として識別されている。リピート伸長疾患には、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１およびＤＭ２）の両方の原因、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の最も一般的な遺伝的原因／前頭側頭骨認知症（ＦＴＤ）（Ｃ９ＯＲＦ７２）、ハンチントン舞踏病、ならびに優性遺伝した運動失調の最も一般的な形、最も一般的な劣性運動失調（フリートライヒ運動失調）および最も一般的な遺伝性の精神発達遅滞（脆弱Ｘ症候群）を含む８つの他のポリグルタミン障害が含まれる。例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の非コード領域内の、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）ヘキサヌクレオチドの拡張リピートも、ＡＬＳおよびＦＴＤの両方と関係付けられている。現在のところ、いずれの疾患にも治癒は存在しない。
大半の治療剤の開発では、多様な実験動物モデルが広範にわたり使用されているが、同定された遺伝子構成要素が疾患を引き起こす、正確な分子機構の解明をもたらすようにリピート伸長疾患、例えば、神経変性疾患および炎症性疾患に取り組む動物モデルは、非常に少数のモデルしか存在しない。理想的な動物モデルは、同じ遺伝子構成要素を含有し、ヒト疾患の特徴と同様の特徴を表すことになる。種間の遺伝子の差違を踏まえると、リピート伸長疾患、例えば、ヒト神経変性疾患および／または炎症性疾患を緊密に再現する改善された動物モデルの開発に対する必要は、ほとんど満たされていない。このような改善された動物モデルは、有効な治療用薬剤および／または予防用薬剤の開発において、多大な価値をもたらす。
要旨
細胞内の標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を伸長させる方法、ならびに、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列をそれらのゲノムに含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物が提供される。
一態様では、細胞内の標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を伸長させる方法、または標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を生成するための方法が提供される。一部のそのような方法は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断するヌクレアーゼ剤をリピート伸長配列を含む細胞の集団の中に導入することを含み、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞の集団を生成する。一部のそのような方法は、リピート伸長配列を含む細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入することを含み、ここで、ヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞の集団を生成する。一部のそのような方法は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成するヌクレアーゼ剤をリピート伸長配列を含む細胞の集団の中に導入することを含み、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞の集団を生成する。一部のそのような方法は、リピート伸長配列を含む細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入することを含み、ここで、ヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞の集団を生成する。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、改変された細胞の集団を生成するヌクレアーゼ剤を細胞の集団の中に導入するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。
一部のそのような方法では、外因性の修復鋳型は細胞の集団に導入されない。
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１０００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ
Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ
Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）結合（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである。必要に応じて、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡである。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端の近傍にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の３’末端の近傍にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の外側にある。
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を生成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１０００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を生成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。必要に応じて、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を生成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を生成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端の近傍にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の３’末端の近傍にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の外側にある。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、細胞による二本鎖切断または一本鎖切断の修復の後にも保持される。一部のそのような方法では、二本鎖切断または一本鎖切断の修復は、リピート伸長配列の外側に挿入も欠失ももたらさない。
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で二本鎖切断を形成する。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で一本鎖切断を形成するニッカーゼである。
一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤および第２のヌクレアーゼ剤が細胞に導入され、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断する。一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤または第１のヌクレアーゼ剤をコードする核酸および第２のヌクレアーゼ剤または第２のヌクレアーゼ剤をコードする核酸が細胞に導入され、第１のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断し、第２のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断する。一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤および第２のヌクレアーゼ剤が細胞に導入され、第１のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する。第１のヌクレアーゼ剤または第１のヌクレアーゼ剤をコードする核酸および第２のヌクレアーゼ剤または第２のヌクレアーゼ剤をコードする核酸が細胞に導入され、第１のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する。一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する。一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する。
一部のそのような方法では、リピート伸長配列が異種のリピート伸長配列である。
一部のそのような方法では、リピート伸長配列は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０コピーのリピート配列を含む。
一部のそのような方法では、リピート配列のコピーがリピート伸長配列の中で連続している。
一部のそのような方法では、リピート配列は、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート、ヘキサヌクレオチドリピートまたはドデカヌクレオチドリピートである。
一部のそのような方法では、リピート配列が配列番号１～１２のいずれか１つを含む。必要に応じて、（ｉ）リピート配列が配列番号２を含み、標的ゲノム遺伝子座がＨＴＴ、ＡＲ、ＡＴＮ１、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＰＰＰ２Ｒ２ＢまたはＴＢＰ遺伝子座であるか；（ｉｉ）リピート配列が配列番号３を含み、標的ゲノム遺伝子座がＦＭＲ１遺伝子座であるか；（ｉｉｉ）リピート配列が配列番号４を含み、標的ゲノム遺伝子座がＤＭＰＫ、ＪＰＨ３、ＡＴＸＮ８またはＴＣＦ４遺伝子座であるか；（ｉｖ）リピート配列が配列番号５を含み、標的ゲノム遺伝子座がＦＸＮ遺伝子座であるか；（ｖ）リピート配列が配列番号６を含み、標的ゲノム遺伝子座がＡＦＦ２遺伝子座であるか；（ｖｉ）リピート配列が配列番号７を含み、標的ゲノム遺伝子座がＰＡＢＰＮ１遺伝子座であるか；（ｖｉｉ）リピート配列が配列番号８を含み、標的ゲノム遺伝子座がＣＮＢＰ遺伝子座であるか；（ｖｉｉｉ）リピート配列が配列番号９を含み、標的ゲノム遺伝子座がＡＴＸＮ１０遺伝子座であるか；（ｉｘ）リピート配列が配列番号１０を含み、標的ゲノム遺伝子座がＴＫ２またはＢＥＡＮ１遺伝子座であるか；（ｘ）リピート配列が配列番号１１を含み、標的ゲノム遺伝子座がＮＯＰ５６遺伝子座であるか；（ｘｉ）リピート配列が配列番号１を含み、標的ゲノム遺伝子座がＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座であるか；または（ｘｉｉ）リピート配列が配列番号１２を含み、標的ゲノム遺伝子座がＣＳＴＢ遺伝子座である。必要に応じて、リピート配列が配列番号１を含み、標的ゲノム遺伝子座がＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座である。必要に応じて、ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡであり、ヌクレアーゼ標的部位が配列番号２８または３３を含む。
一部のそのような方法では、細胞が非ヒト動物細胞である。一部のそのような方法では、細胞は、非ヒト動物の胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞、心臓細胞または胚細胞である。一部のそのような方法では、細胞は、非ヒト動物１細胞期の胚である。一部のそのような方法では、細胞はげっ歯動物細胞である。一部のそのような方法では、細胞はマウス細胞またはラット細胞である。必要に応じて、細胞はマウス細胞である。必要に応じて、細胞はマウス胚性幹細胞またはマウス１細胞期の胚である。一部のそのような方法では、細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。一部のそのような方法では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにある。一部のそのような方法では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏにある。
一部のそのような方法では、方法は、複数回のステップ（ａ）～（ｃ）を含み、第１回の後の各回のステップ（ａ）における細胞の集団は、前回のステップ（ｃ）で選択される改変された細胞から増大した細胞のクローン集団である。必要に応じて、方法は、少なくとも３回または少なくとも４回を含む。必要に応じて、方法は、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。必要に応じて、本方法は、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、本方法は、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。
一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ標的部位は、第２のヌクレアーゼ標的部位と同じである。
一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ標的部位がリピート伸長配列の外側にあり、ヌクレアーゼ標的部位がリピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあり、ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。一部のそのような方法では、ヌクレアーゼ剤がリピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で一本鎖切断を形成するニッカーゼであり、ヌクレアーゼ標的部位は、細胞による一本鎖切断の修復の後にも保持され、一本鎖切断の修復がリピート伸長配列の外側に挿入も欠失ももたらさない。
別の態様では、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列をそのゲノムに含む非ヒト動物、これをそのゲノムに含む非ヒト動物細胞またはこれをそのゲノムに含む非ヒト動物ゲノムが提供され、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む。別の態様では、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子が提供され、ここで、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約３００リピートまたは少なくとも６００リピートを含む。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約３００リピート、少なくとも約５００リピート、または少なくとも６００リピートを含む。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、リピートが異種リピート伸長配列の中で連続している。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の第１の非コード内因性エクソンと第２エクソンの間に位置する。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座がヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列を含む。必要に応じて、ヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列が配列番号４６および／または配列番号４７を含む。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物がげっ歯動物であるかまたは非ヒト動物細胞がげっ歯動物細胞である。必要に応じて、げっ歯動物がラットもしくはマウスであるかまたは非ヒト動物細胞がラット細胞もしくはマウス細胞である。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムは、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてホモ接合性である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムは、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてヘテロ接合性である。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、（ａ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したイントロン配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２転写物の発現の増加；および／または（ｂ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したＲＮＡ病巣の数の増加；および／または（ｃ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したジペプチドリピートタンパク質のレベルの増加を示す。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物細胞は、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞、心臓細胞または胚細胞である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物細胞は、１細胞期の胚である。必要に応じて、非ヒト動物細胞またはゲノムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにある。必要に応じて、非ヒト動物細胞はｉｎ ｖｉｖｏにある。
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、その生殖細胞系列ゲノムに、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む。
別の態様では、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列のコピー数が増加した改変された細胞を生成するための方法で使用するためのヌクレアーゼ剤が提供され、ここで、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成するように設計される。別の態様では、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列のコピー数が増加した改変された細胞を生成するための方法で使用するためのヌクレアーゼ剤をコードする核酸が提供され、ここで、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成するように設計される。
別の態様では、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列と関連した疾患または状態の処置のための治療薬候補を評価する方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）任意の上記非ヒト動物または非ヒト動物細胞に候補薬剤を投与するステップと；（ｂ）候補薬剤が疾患または状態と関連した１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼすかどうか決定するために１つまたは複数のアッセイを実行するステップと；（ｃ）疾患または状態と関連した１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼす候補薬剤を治療薬候補として識別するステップとを含む。
一部のそのような方法では、候補薬剤が非ヒト動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与され、候補薬剤の投与の後に非ヒト動物から単離される細胞において１つまたは複数のアッセイがｉｎ
ｖｉｔｒｏで実行される。一部のそのような方法では、候補薬剤が非ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンにｉｎ ｖｉｔｒｏ投与される。
一部のそのような方法では、１つまたは複数のアッセイは、イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ転写物を検出するための定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を含む。一部のそのような方法では、１つまたは複数のアッセイがＣ９ｏｒｆ７２センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物を含むＲＮＡ病巣を測定することを含み、必要に応じてＲＮＡ病巣は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって測定される。一部のそのような方法では、１つまたは複数のアッセイがジペプチドリピートタンパク質の蓄積を測定することを含み、必要に応じてジペプチドリピートタンパク質はｐｏｌｙＧＡジペプチドリピートタンパク質またはｐｏｌｙＧＰジペプチドリピートタンパク質であり、必要に応じてジペプチドリピートタンパク質の蓄積は免疫組織化学によって測定される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を生成するための方法であって、
（ａ）前記標的ゲノム遺伝子座において前記リピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；
（ｂ）細胞の前記集団の中にヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、前記ヌクレアーゼ剤は、前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；
（ｃ）改変された細胞の前記集団の中の前記リピート配列のコピー数を定量化し、前記リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップと
を含む方法。
（項目２）
外因性の修復鋳型が細胞の前記集団に導入されない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヌクレアーゼ標的部位が、前記リピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０もしくは約１０ヌクレオチド以内にあるか、または前記リピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ヌクレアーゼ標的部位が、前記リピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３もしくは約２ヌクレオチド以内にあるか、または前記リピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ヌクレアーゼ標的部位が前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端と重なる、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ヌクレアーゼ標的部位が前記リピート伸長配列の５’末端の近傍にある、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記ヌクレアーゼ標的部位が前記リピート伸長配列の３’末端の近傍にある、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ヌクレアーゼ標的部位が前記リピート伸長配列の外側にある、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位が、前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にある、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位が、前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３または約２ヌクレオチド以内にある、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位が、前記リピート伸長配列の５’末端の近傍にある、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位が、前記リピート伸長配列の３’末端の近傍にある、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位が、前記リピート伸長配列の外側にある、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記ヌクレアーゼ標的部位が、前記細胞による前記二本鎖切断または前記一本鎖切断の修復の後にも保持される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記二本鎖切断または前記一本鎖切断の修復が、前記リピート伸長配列の外側に挿入も欠失ももたらさない、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記ヌクレアーゼ剤が、前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で二本鎖切断を形成する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記ヌクレアーゼ剤が、前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で一本鎖切断を形成するニッカーゼである、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
第１のヌクレアーゼ剤または前記第１のヌクレアーゼ剤をコードする核酸および第２のヌクレアーゼ剤または前記第２のヌクレアーゼ剤をコードする核酸が前記細胞に導入され、前記第１のヌクレアーゼ剤は、前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成し、前記第２のヌクレアーゼ剤は、前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記第１のヌクレアーゼ剤が、前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成し、前記第２のヌクレアーゼ剤が、前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第１のヌクレアーゼ剤が、前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成し、前記第２のヌクレアーゼ剤が、前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）結合（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓタンパク質および前記ガイドＲＮＡである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記リピート伸長配列が異種のリピート伸長配列である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記リピート伸長配列が、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０コピーの前記リピート配列を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記リピート配列のコピーが前記リピート伸長配列の中で連続している、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記リピート配列が、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート、ヘキサヌクレオチドリピートまたはドデカヌクレオチドリピートである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
前記リピート配列が配列番号１～１２のいずれか１つを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
（ｉ）前記リピート配列が配列番号２を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＨＴＴ、ＡＲ、ＡＴＮ１、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＰＰＰ２Ｒ２ＢまたはＴＢＰ遺伝子座であるか；
（ｉｉ）前記リピート配列が配列番号３を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＦＭＲ１遺伝子座であるか；
（ｉｉｉ）前記リピート配列が配列番号４を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＤＭＰＫ、ＪＰＨ３、ＡＴＸＮ８またはＴＣＦ４遺伝子座であるか；
（ｉｖ）前記リピート配列が配列番号５を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＦＸＮ遺伝子座であるか；
（ｖ）前記リピート配列が配列番号６を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＡＦＦ２遺伝子座であるか；
（ｖｉ）前記リピート配列が配列番号７を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＰＡＢＰＮ１遺伝子座であるか；
（ｖｉｉ）前記リピート配列が配列番号８を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＣＮＢＰ遺伝子座であるか；
（ｖｉｉｉ）前記リピート配列が配列番号９を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＡＴＸＮ１０遺伝子座であるか；
（ｉｘ）前記リピート配列が配列番号１０を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＴＫ２またはＢＥＡＮ１遺伝子座であるか；
（ｘ）前記リピート配列が配列番号１１を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＮＯＰ５６遺伝子座であるか；
（ｘｉ）前記リピート配列が配列番号１を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座であるか；または
（ｘｉｉ）前記リピート配列が配列番号１２を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＣＳＴＢ遺伝子座である、
項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記リピート配列が配列番号１を含み、前記標的ゲノム遺伝子座がＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡであり、前記ヌクレアーゼ標的部位が配列番号２８または３３を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞が非ヒト動物細胞である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が、非ヒト動物の胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞、心臓細胞または胚細胞である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記細胞が非ヒト動物の１細胞期胚である、項目１から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞がげっ歯動物細胞である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記細胞がマウス細胞またはラット細胞である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞がマウス細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞がマウス胚性幹細胞またはマウス１細胞期の胚である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏにある、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏにある、項目１から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
複数回のステップ（ａ）～（ｃ）を含み、第１回の後の各回のステップ（ａ）における細胞の前記集団が、前回のステップ（ｃ）で選択される前記改変された細胞から増大した細胞のクローン集団である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
少なくとも３回または少なくとも４回を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
１回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
１回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４６）
１回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４７）
１回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４８）
１回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４９）
１回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５０）
１回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５１）
１回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５２）
１回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５３）
１回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５４）
１回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５５）
１回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目に前記リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で前記第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５６）
前記第１のヌクレアーゼ標的部位が前記第２のヌクレアーゼ標的部位と同じである、項目４６、４７、５０、５１、５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ヌクレアーゼ標的部位が前記リピート伸長配列の外側にあり、前記ヌクレアーゼ標的部位が前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあり、前記ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記ヌクレアーゼ剤が前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で一本鎖切断を形成するニッカーゼであり、前記ヌクレアーゼ標的部位が、前記細胞による前記一本鎖切断の修復の後にも保持され、前記一本鎖切断の修復が前記リピート伸長配列の外側に挿入も欠失ももたらさない、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列をそのゲノムに含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞であって、前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６０）
前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約３００リピートを含む、項目５９に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６１）
前記ヘキサヌクレオチドリピート伸長が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約５００リピートを含む、項目６０に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６２）
前記ヘキサヌクレオチドリピート伸長が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約６００リピートを含む、項目６１に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６３）
前記リピートが前記異種リピート伸長配列の中で連続している、項目５９から６２のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６４）
前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の第１の非コード内因性エクソンと第２エクソンの間に位置する、項目５９から６３のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６５）
前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座がヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列を含む、項目５９から６４のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６６）
前記ヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列が配列番号４６および／または配列番号４７を含む、項目６５に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６７）
前記非ヒト動物がげっ歯動物であるかまたは前記非ヒト動物細胞がげっ歯動物細胞である、項目５９から６６のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６８）
前記げっ歯動物がラットもしくはマウスであるかまたは前記非ヒト動物細胞がラット細胞もしくはマウス細胞である、項目６７に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目６９）
前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてヘテロ接合性である、項目５９から６８のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目７０）
（ａ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したイントロン配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２転写物の発現の増加；および／または
（ｂ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したＲＮＡ病巣の数の増加；および／または
（ｃ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したジペプチドリピートタンパク質のレベルの増加
を示す、項目５９から６９のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
（項目７１）
胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞、心臓細胞または胚細胞である、項目５９から７０のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
（項目７２）
１細胞期の胚である、項目５９から７０のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
（項目７３）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、項目５９から７２のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
（項目７４）
ｉｎ ｖｉｖｏにある、項目５９から７２のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
（項目７５）
その生殖細胞系列ゲノムに、前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む、項目５９から７０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目７６）
内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、非ヒト動物ゲノム。
（項目７７）
異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子であって、前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子。
（項目７８）
標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む、前記標的ゲノム遺伝子座において前記リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を生成するための方法で使用するためのヌクレアーゼ剤であって、前記リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成するように設計されるヌクレアーゼ剤。
（項目７９）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列と関連した疾患または状態の処置のための治療薬候補を評価する方法であって、
（ａ）項目５９から７０および７５のいずれか一項に記載の非ヒト動物または項目５９から７４のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞に候補薬剤を投与するステップと；
（ｂ）前記候補薬剤が前記疾患または状態と関連した１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼすかどうか決定するために１つまたは複数のアッセイを実行するステップと；
（ｃ）前記疾患または状態と関連した前記１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼす前記候補薬剤を治療薬候補として識別するステップと
を含む方法。
（項目８０）
前記候補薬剤が前記非ヒト動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与され、前記候補薬剤の投与の後に前記非ヒト動物から単離される細胞において前記１つまたは複数のアッセイがｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記候補薬剤が非ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンにｉｎ ｖｉｔｒｏ投与される、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
前記１つまたは複数のアッセイが、イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ転写物を検出するための定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を含む、項目７９から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記１つまたは複数のアッセイがＣ９ｏｒｆ７２センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物を含むＲＮＡ病巣を測定することを含み、必要に応じて前記ＲＮＡ病巣は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって測定される、項目７９から８２のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記１つまたは複数のアッセイがジペプチドリピートタンパク質の蓄積を測定することを含み、必要に応じて前記ジペプチドリピートタンパク質はｐｏｌｙＧＡジペプチドリピートタンパク質またはｐｏｌｙＧＰジペプチドリピートタンパク質であり、必要に応じてジペプチドリピートタンパク質の前記蓄積は免疫組織化学によって測定される、項目７９から８３のいずれか一項に記載の方法。
図１（スケール通りでない）は、野生型マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座、野生型ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座、および配列番号１に示すヘキサヌクレオチド配列（ＧＧＧＧＣＣ）の９２リピートを含むヒト化マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の概略図を示す（ＭＡＩＤ８０２９ａ）。マウス配列は破線およびダッシュ付きのボックスで示され、ヒト配列は黒色の実線によって示される。エクソンは、ボックスで表される。ヘキサヌクレオチドリピート配列の位置が示される。
図２（スケール通りでない）は、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列（例えば、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列）を伸長させる組換え機構を使用するために、リピート配列の近傍に二本鎖切断を導入するためにヌクレアーゼ剤を使用する概念の概略図を示す。
図３（スケール通りでない）は、Ｃ９ｏｒｆ７２ヒト化９２×リピート含有ＥＳ細胞（ＭＡＩＤ８０２９ａ）の中のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列の末端の近傍に位置する８つのガイドＲＮＡ標的配列の位置による概略図を示す。
図４は、ヒト化９２×リピート含有対立遺伝子（ＭＡＩＤ８０２９ａ）と同じ配列を含有するプラスミド（８０２８ Ｓｔｖｅｃ）を使用した無細胞系で評価された８つのガイドＲＮＡの切断効率を示す。
図５（スケール通りでない）は、３０×リピート伸長配列の５’末端の近傍または３’末端の近傍に二本鎖切断を導入することによってマウス胚性幹（ＥＳ）細胞において３０×リピートを伸長させるためのスキームの概略図を示す。ヒト化された領域は標識および白色ボックスによって示す。５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの位置を、ＰＣＲによる検出のためのプライマーの位置と一緒に示す。５’ＤＳＢとリピート配列の５’端の間、および３’ＤＳＢとリピート配列の３’端の間の距離が示される。
図６Ａは、３０×リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、マウスＥＳ細胞におけるＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。親のクローンおよびさらに分析した伸長クローンは、矢印によってマークされる。
図６Ｂ（スケール通りでない）は、親の３０×リピートクローンを図６Ａからの伸長クローンと比較する概略図を示す。
図６Ｃは、リピート領域の直ぐ上流から開始してリピート領域の末端まで続く、親の３０×リピートマウスＥＳ細胞クローンおよび図６Ａからの伸長クローンの配列のアラインメントを示す。
図７Ａは、マウスＥＳ細胞における３０×リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。親のクローンおよびさらに分析した部分的収縮クローンは、矢印によってマークされる。
図７Ｂ（スケール通りでない）は、親の３０×リピートクローンを図７Ａからの部分的収縮クローンと比較する概略図を示す。
図８Ａは、マウスＥＳ細胞における３０×リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。親のクローンおよびさらに分析した３０×リピート配列を保持するクローンは、矢印によってマークされる。
図８Ｂ（スケール通りでない）は、親の３０×リピートクローンを図８Ａからの３０×リピート配列を保持するクローンと比較する概略図を示す。
図９Ａは、マウスＥＳ細胞における３０×リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。親のクローンおよびさらに分析した２つの収縮クローンは、矢印によってマークされる。
図９Ｂ（スケール通りでない）は、親の３０×リピートクローンを図９Ａからの収縮クローンと比較する概略図を示す。
図１０（スケール通りでない）は、マウスＥＳ細胞における、９２×リピート伸長配列の５’末端（ボックス２）、３’末端（ボックス３）または５’末端および３’末端の両方（ボックス１）の近傍に二本鎖切断を導入することによって９２×リピートを伸長させるためのスキームの概略図を示す。黒色のボックスは、内因性マウス配列を示し、白色のボックスは、ヒト化領域を示す。
図１１Ａ（スケール通りでない）は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２ＥＳ細胞クローンにおける配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の事例の数を評価するために使用した、従来型の２プライマーＰＣＲの概略図を示す。
図１１Ｂ（スケール通りでない）は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２ＥＳ細胞クローンにおける配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の事例の数を評価するために３つのプライマーを使用するプライムＰＣＲの概略図を示す。
図１２Ａは、マウスＥＳ細胞における９２×リピート伸長配列の５’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。伸長したリピートは、アスタリスクによってマークされる。
図１２Ｂは、マウスＥＳ細胞における９２×リピート伸長配列の３’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。伸長したリピートは、アスタリスクによってマークされる。
図１３は、図１２Ａからのクローンの１つおよび図１２Ｂからのクローンの１つにおけるリピートの数を確認するためのプライムＰＣＲの結果を示す。親の８０２９ａ（９２×リピート）クローンは、対照として使用した。図は、細管電気泳動からの結果を示す。シグナル強度はＹ軸上にあり、ＰＣＲ生成物のサイズはＸ軸上にある。リードアウトは、ピークの数である。
図１４は、図１２Ａからのクローンの１つおよび図１２Ｂからのクローンの１つにおけるリピートの数を確認するためのプライムＰＣＲの結果を示す。
図１５は、マウスＥＳ細胞における９２×リピート伸長配列の５’末端の近傍の切断、９２×リピート伸長配列の３’末端の近傍の切断、または９２×リピート伸長配列の５’および３’の両末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。伸長したリピートは、矢印によってマークされる。
図１６Ａ（スケール通りでない）は、９２×リピート伸長配列の５’末端の近傍に二本鎖切断を最初に導入して第１の伸長クローンを生成し、次に第１の伸長クローンの中のリピート伸長配列の３’末端の近傍に二本鎖切断を導入して第２の伸長クローンを生成することによってマウスＥＳ細胞において９２×リピートを伸長させるためのスキームの概略図を示す。ヒト化された領域は標識および白色ボックスによって示す。５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの位置を、ＰＣＲによる検出のためのプライマーの位置と一緒に示す。
図１６Ｂは、マウスＥＳ細胞における２５０×リピート伸長配列の３’末端の近傍の２５０×リピート伸長配列クローンの切断後の第２の伸長に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。伸長したリピートおよび親のリピートは、標識矢印によってマークされる。
図１７Ａ（スケール通りでない）は、マウスＥＳ細胞における９２×リピート伸長配列の３’末端の近傍に一本鎖切断を導入することによって９２×リピートを伸長させるためのスキームの概略図を示す。ヒト化された領域は標識および白色ボックスによって示す。３’ＤＳＢの位置を、ＰＣＲによる検出またはシークエンシングのためのプライマーの位置と一緒に示す。
図１７Ｂは、マウスＥＳ細胞における９２×リピート伸長配列の３’末端の近傍の９２×リピート伸長配列クローンの切断またはニッキング後の伸長に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。
図１７Ｃは、９２×リピート伸長配列の３’末端の近傍の９２×リピート伸長配列クローンの切断またはニッキングの後の、いくつかの伸長したマウスＥＳ細胞クローンのシークエンシングの結果によるアラインメントを示す。
図１８Ａ（スケール通りでない）は、９２×リピート伸長配列の５’末端の近傍に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって、マウス１細胞期胚において９２×リピートを伸長させるためのスキームの概略図を示す。ヒト化された領域は標識および白色ボックスによって示す。５’ＤＳＢの位置を、ＰＣＲによる検出のためのプライマーの位置と一緒に示す。
図１８Ｂは、９２×リピート伸長配列の５’末端の近傍のマウス１細胞期胚の中の９２×リピート伸長配列の切断後の１細胞期胚における伸長およびマウスの生成に続くリピートエリアのサイズを評価するための、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。
図１９は、６０×リピート伸長配列の５’末端の近傍の６０×リピート伸長配列の切断後のマウスＥＳ細胞における伸長に続くトリヌクレオチドリピートエリアのサイズを評価するための、標的遺伝子の遺伝子座の従来型ＰＣＲの結果を示す。
図２０Ａ～２０Ｄは、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、２５０または３００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、エクソン１Ａ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ａ）である、エクソン１Ｂ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ｂ）である、エクソン１Ａの近傍にイントロン配列を含有する（図２０Ｃ）、およびエクソン１Ｂの近傍にイントロン配列を保持する（図２０Ｄ）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。 図２０Ａ～２０Ｄは、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、２５０または３００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、エクソン１Ａ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ａ）である、エクソン１Ｂ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ｂ）である、エクソン１Ａの近傍にイントロン配列を含有する（図２０Ｃ）、およびエクソン１Ｂの近傍にイントロン配列を保持する（図２０Ｄ）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。
図２０Ｅ～２０Ｈは、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、エクソン１Ａ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ｅ）である、エクソン１Ｂ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ｆ）である、エクソン１Ａの近傍にイントロン配列を含有する（図２０Ｇ）、およびエクソン１Ｂの近傍にイントロン配列を保持する（図２０Ｈ）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。 図２０Ｅ～２０Ｈは、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、エクソン１Ａ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ｅ）である、エクソン１Ｂ～エクソン２スプライス転写物（図２０Ｆ）である、エクソン１Ａの近傍にイントロン配列を含有する（図２０Ｇ）、およびエクソン１Ｂの近傍にイントロン配列を保持する（図２０Ｈ）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。
図２１（上）は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、３００、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）からの溶解物のウエスタンスロットブロット像を示す。０μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇまたは２０μｇの全タンパク質を含有する溶解物を、抗ポリ－ＧｌｙＰｒｏ抗体または抗ポリ－ＧｌｙＡｌａ抗体でブロットした。図２１（下）は、図の上部分のウエスタンスロットブロットの定量化を示す。
図２２Ａ～２２Ｂは、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、３００、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における（図２２Ａ）、または、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むマウスからの脳幹および脊髄試料と比較して、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３または３００リピートを含む改変された（ヒト化）Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性であるマウスからの脳幹および脊髄試料における（図２２Ｂ）、エクソン１Ａの近傍のイントロン配列を含有するＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。
図２３Ａ～２３Ｄは、軸下様運動ニューロンまたは四肢様運動ニューロンであり、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、３００、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、エクソン１Ａ～エクソン２スプライス転写物（図２３Ａ）である、エクソン１Ｂ～エクソン２スプライス転写物（図２３Ｂ）である、エクソン１Ａの近傍にイントロン配列を含有する（図２３Ｃ）、およびエクソン１Ｂの近傍にイントロン配列を保持する（図２３Ｄ）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。 図２３Ａ～２３Ｄは、軸下様運動ニューロンまたは四肢様運動ニューロンであり、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、３００、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、エクソン１Ａ～エクソン２スプライス転写物（図２３Ａ）である、エクソン１Ｂ～エクソン２スプライス転写物（図２３Ｂ）である、エクソン１Ａの近傍にイントロン配列を含有する（図２３Ｃ）、およびエクソン１Ｂの近傍にイントロン配列を保持する（図２３Ｄ）、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。
図２３Ｅ～２３Ｆは、軸下様運動ニューロンまたは四肢様運動ニューロンであり、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３リピートを含むＥＳＭＮと比較して配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の３、９２、３００、５００または６００リピートを含む改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座についてヘテロ接合性である胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）における、スプライスされていない前駆体転写物（図２３Ｅ）またはスプライスされたＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ（図２３Ｆ）である、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（ｙ軸）からの転写物の発現レベル（各図の上部のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の描写に示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）定量逆転写結合ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイで決定した）を示す棒グラフを示す。
定義
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含めた、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を含む。この用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーも含む。用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言える。「Ｎ末端」という用語は、遊離のアミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端とする、タンパク質またはポリペプチドの出発点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を末端とする、アミノ酸の鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終了点に関する。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含めた、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを含む。これらの用語は、プリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにポリマーを含む。
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその近くの３’酸素にリン酸ジエステル連結によって一方向に付着するように反応してオリゴヌクレオチドが生じるので、「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と連結していなければ、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と連結していなければ、「３’末端」と称される。核酸配列も、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われ得る。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれでも、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’側にあると称される。
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム中に組み込まれるように、細胞中に導入された核酸を指す。細胞のゲノム中への核酸の安定な組込みのために任意のプロトコールを使用することができる。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入することができる組換え核酸を指す。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングにとって十分な、またはそれを許容するエレメントを含む組換え核酸を指す。ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に移動させる目的で、ベクターおよび／または粒子を使用することができる。いくつかの形態のウイルスベクターが公知である。
タンパク質、核酸、および細胞に関して「単離された」という用語は、タンパク質、核酸、または細胞の実質的に純粋な調製物に至るまで、およびそれを含めた、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて通常存在し得る他の細胞性または生物性構成成分に関して比較的精製されたタンパク質、核酸、および細胞を含む。「単離された」という用語は、天然に存在する対応物を有しないタンパク質および核酸または化学的に合成された、かくして、他のタンパク質もしくは核酸が実質的に混入していないタンパク質もしくは核酸を含み得る。「単離された」という用語は、それらが天然では付随する多くの他の細胞性構成成分または生物性構成成分（例えば、これらに限定されないが、他の細胞タンパク質、核酸、または細胞性もしくは細胞外構成成分）から分離または精製されたタンパク質、核酸、または細胞を含み得る。
「野生型」という用語は、正常な状態または状況（変異体、疾患にかかっている、変更された状態または状況などとは対照的に）において見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、多数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物中に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、動物の内因性Ｃ９ｏｒｆ７２配列は、非ヒト動物中のＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座に天然に存在する天然のＣ９ｏｒｆ７２配列を指す。
「外因性」分子または配列は、通常は細胞内にその形態では存在しない分子または配列を含む。通常存在するとは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して存在することを含む。外因性分子または配列は、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンを含んでもよく、または細胞内の内因性配列に対応するが、形態が異なる（すなわち、染色体内にない）配列を含んでもよい。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、同じ分子内で天然には一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関連して使用される場合、その核酸またはタンパク質が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列と関連しては見出されない配列に挟まれたコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連しては見出されない、別のペプチド分子内にあるかまたはそれに付着したアミノ酸のセグメント（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）である。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌もしくは局在化配列を含み得る。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組合せの多重性によって示される通り、コドンの縮重を活用し、一般に、特定の宿主細胞における発現の増強のために、ネイティブなアミノ酸配列を維持しながらネイティブな配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含めた所与の原核細胞または真核細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。コドン使用表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。これらの表は、いくつかのやり方で適合させることができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８巻：２９２頁を参照されたい。特定の宿主において発現させるための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
用語「遺伝子座」は、生物体のゲノムの遺伝子（または、重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または染色体上の位置の特異的場所を指す。例えば、「Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座」は、そのような配列が存在する場所に関して同定された生物体のゲノムのＣ９ｏｒｆ７２遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＤＮＡ配列、Ｃ９ＯＲＦ７２コード配列または染色体上のＣ９ｏｒｆ７２位置の特異的場所を指すことができる。「Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはその組合せを含む、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の調節エレメントを含むことができる。
用語「遺伝子」は、天然に存在する場合、少なくとも１つのコード領域および少なくとも１つの非コード領域を含有することができる染色体中のＤＮＡ配列を指す。生成物（例えば、これらに限定されないが、ＲＮＡ生成物および／またはポリペプチド生成物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されるコード領域および遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように５’および３’の両末端のコード領域に隣接して位置する配列を含み得る。さらに、調節配列（例えば、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合性部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、遮断配列（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびマトリックス付着領域を含む、他の非コード配列が遺伝子に存在し得る。これらの配列は遺伝子のコード領域の近くに（例えば、これに限定されないが、１０ｋｂ以内に）、または遠隔部位にあることができ、それらは遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは率に影響する。
用語「対立遺伝子」は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は様々な異なる形態を有し、それらは染色体上の同じ位置または遺伝子座に位置する。二倍体生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各組は、特異的遺伝子座の遺伝子型を表す。特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合は、遺伝子型はホモ接合性と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性と記載される。
「プロモーター」は、ＤＮＡの制御領域であり、通常、特定のポリヌクレオチド配列に対して妥当な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターは、転写開始率に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であってよい。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生制御型プロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であってよい。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）が、どちらの構成成分も正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得る可能性が許容されるように近位にあることを含む。例えば、プロモーターがコード配列の転写のレベルを１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答して調節する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結している可能性がある。作動可能な連結は、互いと連続しているまたはトランスに作用する配列を含み得る（例えば、制御配列は、コード配列の転写を調節するための距離で作用し得る）。
本明細書において提示される方法および組成物では、種々の異なる構成成分を使用する。説明全体を通して、一部の構成成分は、活性なバリアントおよび断片を有し得る。そのような構成成分としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれについての生物活性は本明細書の他の箇所に記載されている。「機能的」という用語は、生物活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片もしくはバリアント）の固有の能力を指す。そのような生物活性または機能は、例えば、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合するＣａｓタンパク質の能力を含んでもよい。機能的断片またはバリアントの生物機能は、元の分子であるが、その分子の基本的な生物機能を保持するものと比較して、同じであってよいか、または実際には、変化していてもよい（例えば、その特異性もしくは選択性もしくは効能に関して）。
「バリアント」という用語は、集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のヌクレオチドが）異なるヌクレオチド配列または集団中で最も優勢である配列と（例えば、１個のアミノ酸が）異なるタンパク質配列を指す。
タンパク質を言う場合の「断片」という用語は、完全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸を言う場合の「断片」という用語は、完全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、タンパク質断片を指す場合、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質の内部部分の一部の除去）であってもよい。
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関しては、２つの配列内の、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである残基を指す。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なっており、その場合、アミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されるため、分子の機能的性質は変化しない。配列が保存的置換によって異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行う方法は周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、パーセンテージ配列同一性を増大させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸にはスコア１を付し、非保存的置換にはスコアゼロを付す場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアを付す。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行される通り算出される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較ウインドウにわたって比較することによって決定される値を含み、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。別段の指定がない限り（例えば、短い方の配列は連結した異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列の短い方の全長である。
別段の指定のない限り、配列同一性／類似性値は、ＧＡＰバージョン１０を以下のパラメーターを使用して得られる値を含む：ギャップ重みづけ５０および長さ重みづけ３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；ギャップ重みづけ８および長さ重みづけ２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用したアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはその任意の等価のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生じた対応するアラインメントと比較して同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生じさせる任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、サイズ、電荷、または極性が同様の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基による別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基による別の極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリシンの間の置換、グルタミンとアスパラギンの間の置換、またはグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基による別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基による別の酸性残基の置換が保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基によるシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基の置換および／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を以下で表１に要約する。
Figure 2024052928000001
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、公知の参照配列と同一であるかまたは実質的に類似しているかのいずれかの配列を含み、そのため、それは、例えば、公知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラログ配列を含むことができる。相同遺伝子は、例えば、種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子複製事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを通して、共通先祖のＤＮＡ配列に一般的に由来する。「オルソロガス」遺伝子は、種分化によって共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を含む。オルソログは、進化の過程で同じ機能を一般的に保持する。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内の複製に関連した遺伝子を含む。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境（例えば、試験管または単離された細胞または細胞株）内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、細胞または生物体または体）および天然の環境内で起こるプロセスまたは反応を包含する。「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、個体の体から取り出された細胞およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を包含する。
「リポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたリポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化にとって必要な因子を含有する（または含有するようにすることができる）細胞に導入された場合、容易かつ定量可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には、酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。リポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、ベータ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子、ベータ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「リポータータンパク質」は、リポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「蛍光リポータータンパク質」という用語は、リポータータンパク質に直接由来する、蛍光性基質上のリポータータンパク質の活性に由来する、または蛍光タグ付き化合物への結合に対する親和性を示すタンパク質に由来するものであってよい、蛍光に基づいて検出可能であるリポータータンパク質を意味する。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、ならびに細胞中での存在をフローサイトメトリー法によって検出することができる任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存的ＤＮＡ修復経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって起こる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＫａｓｐａｒｅｋおよびＨｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１年）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２２巻：８８６～８９７頁を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含んでもよい。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こってもよい。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）によって起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断が生じた分子）を修復するための鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移行を導く核酸修復の形態を含む。いかなる特定の理論にも制約されることなく、そのような移行には、切断された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される、合成に依存する鎖アニーリング、および／または関連するプロセスが伴い得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇら（２０１３年）Ｃｅｌｌ、１５３巻：９１０～９１８頁；Ｍａｎｄａｌｏｓら（２０１２年）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、７巻：ｅ４５７６８：１～９頁；およびＷａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１巻：５３０～５３２頁を参照されたい。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、切断末端を互いとまたは外因性配列と、相同な鋳型を必要とせずに直接ライゲーションすることによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。連続していない配列のＮＨＥＪによるライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位付近に欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、切断末端と外因性ドナー核酸の末端の直接ライゲーションによる外因性ドナー核酸の標的化組込みももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）に外因性ドナー核酸を挿入するために好ましい可能性がある。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知見は必要なく、これは、ゲノム配列に関する知見が限られているゲノムを有する生物体への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションによって、または、切断されるゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されるものと適合する突出部に挟まれた外因性ドナー核酸を使用した粘着末端（すなわち、５’または３’突出部を有する）のライゲーションによって進行し得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａら（２０１３年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、２３巻（３号）：５３９～５４６頁を参照されたい。平滑末端をライゲーションする場合、断片接合に必要なマイクロホモロジーの生成領域に標的および／またはドナー切除が必要な場合があり、これにより、標的配列に望ましくない変更が生じる可能性がある。
１つまたは複数の記載されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句は、特許請求の範囲が、請求項に記載されている指定の要素ならびに特許請求された発明の基本および新規の特性（単数または複数単数または複数）に実質的に影響を及ぼさない要素を包含するものと解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、本発明の請求項において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
「必要に応じた」または「必要に応じて」とは、その後に記載されている事象または状況が生じる場合と生じない場合があること、ならびに、当該説明が、事象または状況が生じる例および事象または状況が生じない例を含むことを意味する。
値の範囲の明示は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、および範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、記載値の±５の値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙されている項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに代替（「または」）として解釈される場合には組合せがないことを指し、それを包含する。
「または（ｏｒ）」という用語は、特定の一覧のうちの任意の１メンバーを指し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の冠詞は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「１つの（ａ）タンパク質」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）タンパク質」という用語は、それらの混合物を含めた複数のタンパク質を含み得る。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５であることを意味する。
詳細な説明
Ｉ．概要
ゲノム遺伝子座の既存のリピートを伸長させるためのヌクレアーゼ媒介方法が本明細書で開示される。リピート伸長疾患は、リピート長と疾患重症度の間で著しい遺伝子型－表現型相関を示す傾向がある。リピートが長いほど、疾患はより重度であり、症状の発症がより早い。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰａｕｌｓｏｎ （２０１８） Ｈａｎｄｂ． Ｃｌｉｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １４７：１０５－１２３， （２０１８）を参照。しかし、リピート伸長疾患と関連付けられたリピートにおける高いＧＣ含有量は、リピートの多数のコピーを有するＤＮＡ断片を合成することを困難にし、および微生物でそのようなリピートを維持することを困難にする。したがって、リピートの多数のコピーを有する標的化ベクターを生成するための材料、および最終的にリピートの複数のコピーを含むトランスジェニック動物を調製することは難しい。これは、リピート伸長疾患のための有益な動物モデルがわずかしか存在しない主要な理由の１つである。本明細書に開示される方法は、新規の標的化ベクター生成およびＥＳ細胞標的化よりも、ゲノム中の正しい位置に既に挿入されている比較的より短いリピート（すなわち、より少ないリピート）を伸長させることによって、この問題を克服する。
内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む、非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびに、ヌクレアーゼ媒介リピート伸長を通してそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を作製する方法も本明細書で開示される。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座でのリピート伸長と関連した１つまたは複数の神経変性障害を予防、遅延または処置するために使用することができる治療薬候補を識別するために、非ヒト動物細胞または非ヒト動物を使用する方法も提供される。
ＩＩ．リピートを伸長させるヌクレアーゼ媒介の方法
標的ゲノム遺伝子座においてリピート伸長配列を含む細胞においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を伸長させる様々な方法が提供される。伸長したリピート伸長配列を有する細胞を得るための様々な方法が提供される。そのような方法によって生成される細胞も、提供される。
リピート伸長配列を伸長させるためのそのような方法は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断するヌクレアーゼ剤をリピート伸長配列を含む細胞または細胞の集団の中に導入することを含み得、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞または改変された細胞の集団を生成する。リピート伸長配列を伸長させるためのそのような方法は、リピート伸長配列を含む細胞または細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入することを含み、ここで、ヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞または改変された細胞の集団を生成する。リピート伸長配列を伸長させるためのそのような方法は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成するヌクレアーゼ剤をリピート伸長配列を含む細胞または細胞の集団の中に導入することを含み、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞または改変された細胞の集団を生成する。リピート伸長配列を伸長させるためのそのような方法は、リピート伸長配列を含む細胞または細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入することを含み、ここで、ヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、伸長したリピート伸長配列を有する改変された細胞または改変された細胞の集団を生成する。リピート伸長配列は、特定の遺伝子座のリピート配列のコピーの全て（例えば、連続したリピート）である。リピート伸長配列の５’末端は、リピート伸長配列の中の第１のリピートの第１のヌクレオチド（すなわち、５’ヌクレオチド）である。リピート伸長配列の３’末端は、リピート伸長配列の中の最後のリピートの最後のヌクレオチド（すなわち、３’ヌクレオチド）である。リピート伸長配列の５’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端の上流にあるか、リピート伸長配列の５’末端の下流にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端と重なってもよい。リピート伸長配列の３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の３’末端の上流にあるか、リピート伸長配列の３’末端の下流にあるか、またはリピート伸長配列の３’末端と重なってもよい。一部の方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の外側にある。一部の方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端と重なる。一部の方法では、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の内側にある。
そのような方法は、改変された細胞中のリピート配列のコピー数を定量化すること、または改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化すること、およびリピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択することをさらに含むことができる。一部の方法では、リピート伸長配列の平均パーセント伸長（すなわち、リピート伸長配列に加えられたリピート配列の長さを出発サイズで割り算して１００を掛ける）は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％であるかまたはそれより高い。
一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、改変された細胞の集団を生成するヌクレアーゼ剤を細胞の集団の中に導入するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含む。細胞の集団がスクリーニングされる一部の方法では、伸長頻度（スクリーニングしたクローンの総数のうちのリピート伸長を有する細胞クローンのパーセンテージ）は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％であるかまたはそれより高い。
実施のために機構の理解は必要とされないが、露出した５’鎖が反復配列だけを含有するようにリピート伸長配列の近傍の標的ゲノム遺伝子座を切断することは、Ｒａｄ５１フィラメントが間違った位置に入り、それによってＲａｄ５１フィラメントによる相同性検索をミスリードし、リピートの伸長または収縮につながる可能性があると考えられている。図２を参照。したがって、一部の方法では、傷害を受けた染色分体は、その修復のための鋳型として傷害を受けていない姉妹染色分体を利用する。同様に、一部の方法では、外因性修復鋳型（外因性ドナー配列）は、細胞にも細胞の集団にも導入されない。
ヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の近傍で切断する（例えば、二本鎖切断を形成する）。例えば、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１０００、約９００、約８００、約７００、約６００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。別の例として、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。例えば、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。別の例として、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１ヌクレオチド以内にあってもよい。あるいは、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端と重なってもよい。同様に、ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である場合、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１０００、約９００、約８００、約７００、約６００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列があってもよい。別の例として、ＰＡＭは、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。例えば、ＰＡＭは、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なってもよい。別の例として、ＰＡＭは、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１ヌクレオチド以内にあるか、またはリピート伸長配列の５’末端もしくは３’末端と重なってもよい。
ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の近傍にある。例えば、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１０００、約９００、約８００、約７００、約６００、約５００、約４００、約３００、約２００、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。別の例として、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１００、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。一例として、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあってもよい。別の例として、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２５、約２４、約２３、約２２、約２１、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２または約１ヌクレオチド以内にあってもよい（例えば、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２０ヌクレオチド以内、約１６ヌクレオチド以内、約１５ヌクレオチド以内、約１１ヌクレオチド以内、約１０ヌクレオチド以内、約７ヌクレオチド以内、約５ヌクレオチド以内または約２ヌクレオチド以内）。一例では、リピート伸長配列はヘキサヌクレオチドリピート伸長配列（例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座の）であり、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１０ヌクレオチド以内、約７ヌクレオチド以内、約５ヌクレオチド以内、または約２ヌクレオチド以内にある（例えば、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約７ヌクレオチド以内、リピート伸長配列の３’末端から約７ヌクレオチド以内、またはリピート伸長配列の５’末端から約２ヌクレオチド以内）。別の例では、リピート伸長配列はトリヌクレオチドリピート伸長配列であり、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約２０ヌクレオチド以内、約１６ヌクレオチド以内、約１５ヌクレオチド以内、約１１ヌクレオチド以内、または約１０ヌクレオチド以内である（例えば、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約１６ヌクレオチド以内、リピート伸長配列の５’末端から約１６ヌクレオチド以内、またはリピート伸長配列の３’末端から約１１ヌクレオチド以内）。一部の方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の５’末端の近傍にある。一部の方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の３’末端の近傍にある。一部の方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の内側にある。一部の方法では、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は、リピート伸長配列の外側にある。細胞による二本鎖切断または一本鎖切断の修復の後に、ヌクレアーゼ剤が二本鎖切断または一本鎖切断を形成する部位は破壊されてもよいか、ヌクレアーゼ標的部位は保持されてもよい。ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長の以降の回に次に再利用することができる。一部の方法では、二本鎖切断または一本鎖切断の修復は、ヌクレアーゼ標的部位の中で挿入も欠失ももたらさない。例えば、一部の方法では、二本鎖切断または一本鎖切断の修復は、リピート伸長配列の外側に挿入も欠失ももたらさない。
任意の好適なヌクレアーゼ剤を使用することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）結合（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ）であり得る。各々の例および記載は、本明細書の他の場所でさらに詳細に開示される。
一部の方法では、２つのヌクレアーゼ剤を細胞に導入することができる。一部の方法では、２つのヌクレアーゼ剤または２つのヌクレアーゼ剤をコードする核酸を細胞に導入することができる。例えば、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断でき、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断できる。一例では、第１のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する。あるいは、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する。あるいは、１のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する。別の例では、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する。別の例では、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する。別の例では、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する。別の例では、第１のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤はリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で一本鎖切断を形成する。第１のヌクレアーゼ標的部位および第２のヌクレアーゼ標的部位は、任意の組合せで各々リピート伸長配列の５’末端または３’末端にあることができ、第１のヌクレアーゼ剤および第２のヌクレアーゼ剤は、二本鎖切断または一本鎖切断を任意の組合せで各々形成することができる。
ヌクレアーゼ剤の細胞への導入は、任意の公知の手段で実現できる。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の細胞への導入は、任意の公知の手段で実現できる。導入することは、細胞に対して、それが細胞の内部に接近するように、分子（例えば、核酸またはタンパク質）を提示することを含む。導入は、任意の手段によって実現することができる。複数の構成成分を導入する場合、それらは、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に導入することができる。また、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ送達方法または異なる送達方法によって、細胞に導入することができる。同様に、細胞がｉｎ ｖｉｖｏにある（例えば、非ヒト動物）場合、２つまたはそれより多い構成成分を、同じ投与経路または異なる投与経路によって、非ヒト動物に導入することができる。
細胞に導入される分子は、導入される分子の安定性を増加させる（例えば、所与の保存条件（例えば、－２０℃、４℃または周囲温度）の下で分解生成物が閾値未満のままである、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満である期間を延長する；または、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加させる）担体を含む組成物の形で提供することができる。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）が挙げられる。
ヌクレアーゼ剤の細胞への導入を可能にするための様々な方法および組成物が本明細書で提供される。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の細胞への導入を可能にするための様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸を種々の細胞型に導入するための方法は公知であり、それらとして、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
トランスフェクションプロトコールならびに核酸配列を細胞に導入するためのプロトコールは変動し得る。非限定的なトランスフェクション方法として、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍら（１９７３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻（２号）：４５６～６７頁、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉら（１９７７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７４巻（４号）：１５９０～４頁、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ， Ｍ（１９９１年）、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、９６～９７頁）；デンドリマー；またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する、化学に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、および光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子銃の使用、または磁石補助トランスフェクションが挙げられる（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７巻、２７７～２８頁）。ウイルスによる方法をトランスフェクションのために使用することもできる。
細胞へのヌクレアーゼ剤の導入は、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクションまたはヌクレオフェクションによって媒介することもできる。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の細胞への導入は、エレクトロポレーションによって、細胞質内注射によって、ウイルス感染によって、アデノウイルスによって、アデノ随伴ウイルスによって、レンチウイルスによって、レトロウイルスによって、トランスフェクションによって、脂質媒介性トランスフェクションによって、またはヌクレオフェクションによって媒介することもできる。ヌクレオフェクションは、核酸基体を細胞質だけでなく核膜を通って、および核内にも送達することを可能にする、改善されたエレクトロポレーション技術である。さらに、本明細書に開示される方法におけるヌクレオフェクションの使用は、一般には、通常のエレクトロポレーションよりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常のエレクトロポレーションでは７百万個であるのと比較してたった約２百万個）。一例では、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用してヌクレオフェクションを実施する。
ヌクレアーゼ剤の細胞（例えば、接合体）への導入は、微量注射によって実現することもできる。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の細胞（例えば、接合体）への導入は、微量注射によって実現することもできる。受精卵（すなわち、１細胞期胚）中で、微量注射は、母系および／もしくは父系前核または細胞質へのものであってよい。微量注射が一方だけの前核へのものである場合、父系前核は、そのサイズがより大きいため、好ましい。ｍＲＮＡの微量注射は、細胞質内へのものであることが好ましいが（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するため）、タンパク質またはタンパク質をコードする、もしくはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの微量注射は核／前核へのものであることが好ましい。あるいは、核／前核と細胞質の両方への注射によって、微量注射を実行することができる：針を最初に核／前核に導入し、第１の量を注入することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、第２の量を細胞質に注入することができる。タンパク質を細胞質内に注射し、核を標的化する必要がある場合、これは、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含み得る。微量注射を実行するための方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙら（Ｎａｇｙ Ａ、Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ、Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．、２００３年、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい；Ｍｅｙｅｒら（２０１０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０７巻：１５０２２～１５０２６頁およびＭｅｙｅｒら（２０１２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０９巻：９３５４～９３５９頁も参照されたい。
細胞にヌクレアーゼ剤を導入する他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質－ナノ粒子媒介送達、細胞透過ペプチド媒介送達または植込み装置媒介送達を含めることができる。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸を細胞に導入するための他の方法としては、例えば、ベクター送達、粒子媒介性送達、エキソソーム媒介性送達、脂質ナノ粒子媒介性送達、細胞透過性ペプチド媒介性送達、または埋込み型デバイス媒介性送達を挙げることができる。特定の例として、核酸またはタンパク質をポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、または脂質微小管などの担体に入れて細胞または非ヒト動物に導入することができる。非ヒト動物への送達の一部の特定例としては、流体力学的送達、ウイルス媒介性送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達）、および脂質ナノ粒子媒介性送達が挙げられる。
ヌクレアーゼ剤の細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｖｏで流体力学的送達（ＨＤＤ）によって実現することができる。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｖｏで流体力学的送達（ＨＤＤ）によって実現することができる。流体力学的送達は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内ＤＮＡ送達のための方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達のためには、必須のＤＮＡ配列のみを、選択された血管を介して注射し、現行のウイルスおよび合成ベクターに付随する安全性の懸念を排除する必要がある。血流中に注射されると、ＤＮＡは血液が到達可能な種々の組織中の細胞に到達することが可能である。流体力学的送達では、大きく膜不浸透性の化合物が実質細胞に進入することを妨げる内皮および細胞膜の物理的関門を克服するために大きな体積の溶液を循環中の非圧縮性血液中に急速注射することによって生じる力を使用する。この方法は、ＤＮＡ送達に加えて、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＮＡ、タンパク質、および他の小さな化合物の効率的な細胞内送達に有用である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｍａｓｓａら（２０１１年）Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．、２８巻（４号）：６９４～７０１頁を参照されたい。
ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などのウイルス媒介性送達によって、ヌクレアーゼ剤の導入を達成することもできる。ＡＡＶ媒介性送達またはレンチウイルス媒介性送達などのウイルス媒介性送達によって、ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の導入を達成することもできる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは宿主ゲノムに統合することができるか、あるいは、宿主ゲノムに統合しない。そのようなウイルスを、免疫原性が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製能力を有してもよいか、または複製欠損性であってもよい（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングのさらなるラウンドにとって必要な１つまたは複数の遺伝子の欠損）。ウイルスは、一過的発現、長期的に続く発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、もしくは３ヶ月間）、または永続的発現を引き起こすことができる。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの反転末端リピートによって挟まれた、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐからなる。ＡＡＶ導入プラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２個のＩＴＲの間に置かれ、ＲｅｐおよびＣａｐはｉｎ ｔｒａｎｓに供給することができる。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶは、アデノウイルスに由来する遺伝子を含有するヘルパープラスミドを必要としてもよい。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）は、ＡＡＶ複製を媒介した。例えば、導入プラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドを、アデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含有するＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を産生することができる。あるいは、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を、単一のプラスミド中で組み合わせることができる。同様のパッケージング細胞および方法を、レトロウイルスなどの他のウイルスのために使用することができる。
ＡＡＶの複数の血清型が同定されている。これらの血清型は、それらが感染する細胞型（すなわち、その向性）において異なり、特定の細胞型の選択的形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。心臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。腎臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ２が挙げられる。肺組織のための血清型としては、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が挙げられる。膵臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ８が挙げられる。光受容体細胞のための血清型としては、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。網膜色素上皮組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が挙げられる。骨格筋組織のための血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が挙げられる。肝臓組織のための血清型としては、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特に、ＡＡＶ８が挙げられる。
向性は、異なるウイルス血清型に由来するキャプシドとゲノムとの混合物である、偽型化によってさらに精緻化することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５に由来するキャプシド中にパッケージングされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示す。偽型化されたウイルスの使用は、形質導入効率を改善する、ならびに向性を変更することができる。異なる血清型から誘導されるハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルス向性を変更することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪは、８つの血清型に由来するハイブリッドキャプシドを含有し、ｉｎ ｖｉｖｏで広範囲の細胞型にわたって高い感染性を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳による取込みが増強されている別の例である。ＡＡＶ血清型を、変異によって改変することもできる。ＡＡＶ２の変異による改変の例としては、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ３の変異による改変の例としては、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが挙げられる。ＡＡＶ６の変異による改変の例としては、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが挙げられる。他の偽型化／改変されたＡＡＶバリアントとしては、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが挙げられる。
導入遺伝子発現を促進するために、自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するための細胞のＤＮＡ複製機構に依存するため、導入遺伝子発現は遅延し得る。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補配列を含有するｓｃＡＡＶを使用して、宿主細胞のＤＮＡ合成に関する要件を除去することができる。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを使用することもできる。
パッケージング能力を増大させるために、より長い導入遺伝子を、第１は３’スプライスドナーを有し、第２は５’スプライスアクセプターを有する、２つのＡＡＶ導入プラスミドの間に分裂させてもよい。細胞の同時感染の際に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これはより長い導入遺伝子発現を可能にするが、発現はあまり効率的ではない。能力を増大させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子を、２つの導入プラスミド間に分割することができるが、同時発現が相同組換えおよび完全長導入遺伝子の発現を誘導するように実質的な配列が重複する。
ヌクレアーゼ剤の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。ヌクレアーゼ剤をコードする核酸の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって達成することもできる。例えば、ＬＮＰ媒介性送達を使用して、Ｃａｓ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの組合せまたはＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの組合せを送達することができる。そのような方法による送達は、一過的なＣａｓ発現をもたらし得、生分解性脂質は、クリアランスを改善し、許容性を改善し、免疫原性を低下させ得る。脂質製剤は、その細胞取込みを改善しながら、生体分子を分解から保護することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に会合する複数の脂質分子を含む粒子である。これらのものは、ミクロスフェア（単層および多層小胞、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン、ミセル中の分散相、または懸濁液中の内部相を含む。そのような脂質ナノ粒子を使用して、送達のための１つまたは複数の核酸またはタンパク質を封入することができる。陽イオン脂質を含有する製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含有させることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを増加させるステルス脂質である。好適な陽イオン脂質、中性脂質、陰イオン脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例を、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、陽イオン脂質および１つまたは複数の他の構成成分を含んでもよい。一例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含んでもよい。別の例では、他の構成成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意選択の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含んでもよい。
ＬＮＰは、下記：（ｉ）封入およびエンドソーム脱出のための脂質；（ｉｉ）安定化のための中性脂質；（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質；ならびに（ｉｖ）ステルス脂質のうちの１つもしくは複数または全部を含有してもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎら（２０１８年）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２２巻（９）：２２２７～２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含んでもよい。ある特定のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。
封入およびエンドソーム脱出のための脂質は、陽イオン脂質であってもよい。脂質は、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であってもよい。好適な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートである、リピドＡまたはＬＰ０１である。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎら（２０１８年）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２２巻（９）：２２２７～２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ）ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノエート）である、リピドＢである。好適な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）である、リピドＣである。好適な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノエートである、リピドＤである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）としても公知である）が挙げられる。
本明細書に記載のＬＮＰ中での使用にとって好適な一部のそのような脂質は、ｉｎ ｖｉｖｏで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰとしては、少なくとも７５％の脂質が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが挙げられる。別の例として、少なくとも５０％のＬＮＰが、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から消失する。
そのような脂質は、それらが中にある培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地中では、脂質はプロトン化され、かくして、正電荷を担持し得る。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などの、わずかに塩基性の培地中では、脂質はプロトン化されず、かくして、電荷を担持しなくてもよい。一部の実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。電荷を担持するそのような脂質の能力は、その固有のｐＫａと関連する。例えば、脂質は、独立に、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有してもよい。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、そのプロセシングを改善するように機能する。好適な中性脂質の例としては、様々な中性非荷電または両性イオン性脂質が挙げられる。本開示における使用にとって好適な中性リン脂質の例としては、限定されるものではないが、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミン、およびその組合せが挙げられる。例えば、中性リン脂質を、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択することができる。
ヘルパー脂質としては、トランスフェクションを増強する脂質が挙げられる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性の増強を含んでもよい。ある特定の場合、ヘルパー脂質は、膜融合性を増強することができる。ヘルパー脂質としては、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが挙げられる。好適なヘルパー脂質の例としては、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。一例では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはコレステロールヘミスクシネートであってもよい。
ステルス脂質としては、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る時間の長さを変更する脂質が挙げられる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減させること、および粒径を制御することによって製剤プロセスを補助することができる。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性をモジュレートすることができる。好適なステルス脂質としては、脂質部分に親水性頭部基が連結された脂質が挙げられる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。ある特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、ＰＥＧ２０００とも呼ばれる、ＰＥＧ－２Ｋである。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分を、例えば、鎖が、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含んでもよい、約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立に含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものなどの、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから誘導することができる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含んでもよい。
一例として、ステルス脂質を、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール））、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ）、および１，２－ジステアリールオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択することができる。１つの特定例では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。
ＬＮＰは、製剤中に異なるそれぞれのモル比の構成成分脂質を含んでもよい。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってもよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってもよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってもよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってもよい。
ＬＮＰは、封入しようとする核酸の生分解性脂質の正荷電アミノ基（Ｎ）と、負荷電リン酸基（Ｐ）との異なる比を有してもよい。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってもよい。Ｎ／Ｐ比は、約４から約７、または約４．５から約６であってもよい。具体例では、Ｎ／Ｐ比は、４．５であってもよいか、６であってもよい。
一部のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含んでもよい。Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、異なる比であってもよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ
ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含んでもよい。あるいは、ＬＮＰ製剤は、約１：１から約１：２のＣａｓ ｍＲＮＡのｇＲＮＡ核酸に対する比を含むことができる。具体例では、Ｃａｓ ｍＲＮＡのｇＲＮＡに対する比は、約１：１または約１：２であってよい。
好適なＬＮＰの特定例は、４．５の窒素のリン酸に対する（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性陽イオン脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含有する。生分解性陽イオン脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートであってもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｉｎｎら（２０１８年）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２２巻（９）：２２２７～２２３５を参照されたい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して１：１の重量比であってよい。好適なＬＮＰの別の特定例は、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含有する。
適するＬＮＰの別の具体例は、６の窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有し、生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを５０：３８：９：３のモル比で含有する。生分解性カチオン性脂質は、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエートであってよく、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートとも呼ばれる。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して１：２の重量比であってよい。
送達様式は、免疫原性を低下させるように選択することができる。例えば、複数の構成成分を送達する場合、それらを、異なる様式（例えば、二様式送達）によって送達することができる。これらの異なる様式は、対象に送達される分子に対して異なる薬力学的特性または薬物動態特性を提供することができる。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらすことができる。一部の送達様式（例えば、自己複製またはゲノム組込みによって細胞の中で持続する核酸ベクターの送達）は、この分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過的であり、あまり持続的ではない（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、より一過的な様式でのＣａｓタンパク質の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が唯一存在し、短期間にわたって活性であることを確保することができ、ＭＨＣ分子によって細胞の表面上に示される細菌由来Ｃａｓ酵素に由来するペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。そのような一過的送達はまた、オフターゲット改変の可能性を低減することもできる。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含めた任意の適切な経路によるものであってよい。全身性投与様式としては、例えば、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路の例としては、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。特定例は、静脈内輸注である。点鼻および硝子体内注射は、他の特定例である。局部投与様式としては、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状もしくは果核中）、大脳皮質、中心前回、海馬（例えば、歯状回もしくはＣＡ３領域中）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床下部、蓋、被蓋、または黒質への局部実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および経強膜的経路が挙げられる。有意により少量の構成成分（全身的手法と比較して）は、全身的に（例えば、静脈内）投与される場合と比較して、局部的に（例えば、実質内または硝子体内）投与される場合に効果を発揮し得る。局部投与様式はまた、治療有効量の構成成分が全身的に投与される場合に起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生を低減するか、または除去することもできる。
リピート伸長配列は、異種のリピート伸長配列であってよい。核酸との関連で使用される場合の用語異種は、その核酸が同じ分子の中に一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、異種という用語は、核酸に関して使用される場合、その核酸が、同じ分子内で天然には一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、異種という用語は、核酸のセグメントに関連して使用される場合、その核酸が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸の異種領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸の異種領域は、天然ではＣ９ＯＲＦ７２配列と関連しては見出されない配列に挟まれたＣ９ＯＲＦ７２配列を含み得る。あるいは、核酸の異種領域は、内因性の非ヒト核酸配列によって挟まれたヒト核酸配列を含むことができる。例えば、リピート伸長配列は、内因性の非ヒト（例えば、マウス）核酸配列によって挟まれたヒト核酸配列であってよい。他の方法では、リピート伸長配列は内因性であってよい。例えば、細胞はヒト細胞（例えば、ヒト誘導多能性幹細胞）であってよく、リピート伸長配列および隣接配列の両方はヒト核酸配列を含むことができる。
リピート伸長配列は、複数のリピートを含む。例えば、伸長されるリピート伸長配列は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約１００コピーのリピート配列を含むことができる。一部のリピート伸長配列では、リピートは連続していることができる（介在配列なしで互いに隣接している）。
本方法からもたらされる伸長したリピート伸長配列は、任意の数のリピートを有することができる。例えば、伸長したリピート伸長配列は、約９５より多くのリピート、約９６より多くのリピート、約９７より多くのリピート、約９８より多くのリピート、約９９より多くのリピート、約１００より多くのリピート、約１０１より多くのリピート、約１０２より多くのリピート、約１０３より多くのリピート、約１０４より多くのリピート、約１０５より多くのリピート、約１５０より多くのリピート、約２００より多くのリピート、約２５０より多くのリピート、約２９５より多くのリピート、約２９６より多くのリピート、約２９７より多くのリピート、約２９８より多くのリピート、約２９９より多くのリピート、約３００より多くのリピート、約３０１より多くのリピート、約３０２より多くのリピート、約３０３より多くのリピート、約３０４より多くのリピート、約３０５より多くのリピート、約３５０より多くのリピート、約４００より多くのリピート、約４５０より多くのリピート、約５００より多くのリピート、約５５０より多くのリピート、約５９５より多くのリピート、約５９６より多くのリピート、約５９７より多くのリピート、約５９８より多くのリピート、約５９９より多くのリピート、約６００より多くのリピート、約６０１より多くのリピート、約６０２より多くのリピート、約６０３より多くのリピート、約６０４より多くのリピート、または約６０５より多くのリピートを含み得る。あるいは、伸長したリピート伸長配列は、少なくとも約９５リピート、少なくとも約９６リピート、少なくとも約９７リピート、少なくとも約９８リピート、少なくとも約９９リピート、少なくとも約１００リピート、少なくとも約１０１リピート、少なくとも約１０２リピート、少なくとも約１０３リピート、少なくとも約１０４リピート、少なくとも約１０５リピート、少なくとも約１５０リピート、少なくとも約２００リピート、少なくとも約２５０リピート、少なくとも約２９５リピート、少なくとも約２９６リピート、少なくとも約２９７リピート、少なくとも約２９８リピート、少なくとも約２９９リピート、少なくとも約３００リピート、少なくとも約３０１リピート、少なくとも約３０２リピート、少なくとも約３０３リピート、少なくとも約３０４リピート、少なくとも約３０５リピート、少なくとも約３５０リピート、少なくとも約４００リピート、少なくとも約４５０リピート、少なくとも約５００リピート、少なくとも約５５０リピート、少なくとも約５９５リピート、少なくとも約５９６リピート、少なくとも約５９７リピート、少なくとも約５９８リピート、少なくとも約５９９リピート、少なくとも約６００リピート、少なくとも約６０１リピート、少なくとも約６０２リピート、少なくとも約６０３リピート、少なくとも約６０４リピート、または少なくとも約６０５リピートを含み得る。具体的な例では、伸長したリピート伸長配列は、約１００より多くのリピート、約３００より多くのリピート、約６００より多くのリピート、少なくとも約１００リピート、少なくとも約３００リピート、または少なくとも約６００リピートを含む。
リピート配列（例えば、各リピート）は、任意の数のヌクレオチドを含むことができる。例として、リピート配列はトリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート、ヘキサヌクレオチドリピートまたはドデカヌクレオチドリピートであってよい。リピート配列は、神経系疾患などの疾患に関連したリピート伸長であってよい。一例として、リピート配列は、配列番号１～１２のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。例えば、リピート配列は、表２に示すリピート配列のうちの１つであってよく、および／または表２に示す遺伝子の１つを含む標的ゲノム遺伝子座の中にあることができ、および／または表２に示す疾患の１つと関連していてもよい。
そのほとんどは主に神経系を侵す４０を超える疾患は、ヒトゲノム全体に分散する単純な配列リピートの伸長によって引き起こされる。伸長したトリヌクレオチドリピート疾患が最初に発見され、今でも頻度が最も高い。より最近では、テトラ－、ペンタ－、ヘキサ－およびドデカヌクレオチドリピート伸長さえも、最も一般的な神経系遺伝的障害のいくつかを含むヒト疾患の原因として識別されている。リピート伸長疾患には、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１およびＤＭ２）の両方の原因、筋萎縮性側索硬化症の最も一般的な遺伝的原因／前頭側頭骨認知症（Ｃ９ＯＲＦ７２）、ハンチントン舞踏病、ならびに優性遺伝した運動失調の最も一般的な形、最も一般的な劣性運動失調（フリートライヒ運動失調）および最も一般的な遺伝性の精神発達遅滞（脆弱Ｘ症候群）を含む８つの他のポリグルタミン障害が含まれる。
リピート、それらが存在する遺伝子およびそれらと関連する疾患の例は、表２に示す。
リピート伸長疾患の一般的特徴には、以下が含まれる：（１）リピート伸長は、通常既存の多形性リピートから生じる；（２）伸長は不安定（動的）であり、次世代に伝えられるとき、しばしばサイズが変化する；（３）より長いリピートは、より重度の早期発症疾患を引き起こす傾向がある；（４）臨床予想は共通する：続く世代でより早期の発症、より重度の疾患；および（５）高度に可変性の表現型、主にリピートサイズの差を反映している。しかし、リピート伸長疾患と関連付けられたリピートにおける高いＧＣ含有量は、リピートの数コピーを有するＤＮＡ断片を合成すること、ならびに微生物でリピートを維持することを困難にする。したがって、リピートの複数のコピーを含む標的化ベクターおよび最終的にトランスジェニック動物を生成するための材料を調製することは困難である。これは、リピート伸長疾患のための有益な動物モデルがわずかしか存在しない主要な理由の１つである。本明細書に開示される方法は、新規の標的化ベクター生成およびＥＳ細胞標的化よりも、ゲノム中の正しい位置に既に挿入されている比較的より短いリピート（すなわち、より少ないリピート）を伸長させることによって、この問題を克服する。
具体例では、リピート配列はＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）を含むか、それから本質的になるか、それからなることができ、標的ゲノム遺伝子座は、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子座であってよい。具体例では、ヌクレアーゼ標的部位は、配列番号２８～３５のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、それからなることができ、または配列番号２８もしくは３３を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。具体例として、ヌクレアーゼ剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ガイドＲＮＡを含む）である。ガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントまたはガイド配列）は、配列番号８４～９１のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、それからなることができ、または配列番号８４もしくは８９を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。同様に、ガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分）は、配列番号５６、５７および７６～８１のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、それからなることができ、または配列番号５６もしくは７９を含むか、それから本質的になるか、それからなることができる。
細胞は、任意のタイプの細胞であってよい。必要に応じて、細胞はヒト細胞であってよい。例えば、細胞はヒト誘導多能性幹細胞であってよい。あるいは、本明細書の他の場所でさらに詳細に開示される非ヒト動物細胞のいずれも、使用することができる。一部の具体例として、細胞は、非ヒト動物の１細胞期胚、非ヒト動物の胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞、心臓細胞または胚細胞であってよい。一例では、細胞はマウス細胞またはラット細胞などのげっ歯動物細胞であってよい。例えば、細胞はマウス胚性幹細胞またはマウス１細胞期の胚であってよい。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにあってよい。
リピート配列のコピー数を定量化することは、任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、サザンブロット法またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）遺伝子タイピング方法を使用することができる。具体例として、従来の２プライマーＰＣＲを使用することができるか、または例に記載した通り３プライマーを使用するプライムＰＣＲを使用することができる。プライムＰＣＲは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ３３（１２）：１０２２－１０２６によって開発されたトリプレットリピートプライムドＰＣＲの改変バージョンである。この方法は、リピートの中でポリメラーゼ連鎖反応をプライミングすることができるプライマーを、蛍光標識遺伝子座特異的プライマーと一緒に使用してリピートの数を数える。
一部の方法では、本方法は、複数回の伸長を達成するために、複数回（例えば、２回または３回）繰り返される。例えば、方法は、複数回の（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、改変された細胞の集団を生成するヌクレアーゼ剤を細胞の集団の中に導入するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含み得る。例えば、方法は、複数回の（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位を切断して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含み得る。例えば、方法は、複数回の（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含み得る。例えば、方法は、複数回の（ａ）標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む細胞の集団を提供するステップと；（ｂ）細胞の集団の中にヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を導入するステップであって、ヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成して、改変された細胞の集団を生成するステップと；（ｃ）改変された細胞の集団の中のリピート配列のコピー数を定量化し、リピート配列のコピー数が増加している改変された細胞を選択するステップとを含み得る。第１回の後の各回のステップ（ａ）における細胞の集団は、前回のステップ（ｃ）で選択される改変された細胞から増大した細胞のクローン集団であってよい。本方法は、ヌクレアーゼ剤が標的にするためにリピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍にヌクレアーゼ標的部位が残っている限り、任意の回数（例えば、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約６回、少なくとも約７回、少なくとも約８回、少なくとも約９回、または少なくとも約１０回）繰り返すことができる。
例えば、方法は、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断する第１のヌクレアーゼ剤で実行でき、第１の改変された細胞を生成し、方法は、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断する第２のヌクレアーゼ剤で実行でき、第２の改変された細胞を生成する。あるいは、本方法は、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位を切断する第１のヌクレアーゼ剤で実行でき、第１の改変された細胞を生成し、本方法は、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位を切断する第２のヌクレアーゼ剤で実行でき、第２の改変された細胞を生成する。
別の例として、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行でき、第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。あるいは、方法は、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行でき、第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。あるいは、方法は、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行でき、第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、第１および第２のヌクレアーゼ標的部位は同じであり得る。他の方法では、それらは異なり得る。あるいは、方法は、１回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行でき、第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、１回目にリピート伸長配列の３’末端の近傍の第１のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第１のヌクレアーゼ剤で実行されて第１の改変された細胞を生成し、２回目にリピート伸長配列の５’末端の近傍の第２のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断を形成する第２のヌクレアーゼ剤で第１の改変された細胞に対して実行されて第２の改変された細胞を生成する。一部のそのような方法では、第１および第２のヌクレアーゼ標的部位は同じであってよい。他の方法では、それらは異なってもよい。一部のそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤および第２のヌクレアーゼ剤の両方は二本鎖切断を形成する。他の方法では、第１のヌクレアーゼ剤および第２のヌクレアーゼ剤の両方は一本鎖切断を形成する。他の方法では第１のヌクレアーゼ剤は二本鎖切断を形成し、第２のヌクレアーゼ剤は一本鎖切断を形成するか、またはその逆もある。任意の組合せを使用することができる。
一つの例示的な方法では、ヌクレアーゼ標的部位がリピート伸長配列の外側にあり、ヌクレアーゼ標的部位がリピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあり、ヌクレアーゼ剤がＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡである。別の例示的な方法では、ヌクレアーゼ標的部位はリピート伸長配列の外側にあり、ヌクレアーゼ標的部位は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端から約５０、約４０、約３０、約２０または約１０ヌクレオチド以内にあり、ヌクレアーゼ剤はＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡであり、Ｃａｓ９は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍で一本鎖切断を形成するニッカーゼであり、ヌクレアーゼ標的部位は、細胞による一本鎖切断の修復の後にも保持され、一本鎖切断の修復はリピート伸長配列の外側に挿入も欠失ももたらさない。
一部の方法は、標的ゲノム遺伝子座において伸長させるリピート伸長配列を既に含んでいる細胞から開始する。既存のリピート伸長配列は、細胞に天然に存在したリピート伸長配列、または外因性修復鋳型を使用して前に挿入されたリピート伸長配列であってよい。同様に、既存のリピート伸長配列は、本明細書に開示される第１回のヌクレアーゼ媒介方法で前に伸長されたリピート伸長配列であってよい。他の方法は、標的ゲノム遺伝子座において伸長させるリピート伸長配列を含んでいる細胞を生成する最初のステップを含むことができる。各々あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００９４２６７号およびＷＯ２０１８／０６４６００を参照。伸長させる最初のリピート伸長配列は、例えばリピート伸長配列を含む外因性修復鋳型（例えば、標的化ベクターなどの外因性ドナー配列）を使用して、標的遺伝子座に挿入することができる。一例として、標的化ベクターは、内因性標的遺伝子座に５’標的配列を標的にする５’相同アームおよび内因性標的遺伝子座に３’標的配列を標的にする３’相同アームを含むことができる。外因性修復鋳型は、標的遺伝子座に組み入れるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入断片（例えば、リピート伸長配列）を含むこともできる。標的遺伝子座における核酸挿入断片の組入れは、標的遺伝子座における目的の核酸配列の付加、標的遺伝子座における目的の核酸配列の欠失、または標的遺伝子座における目的の核酸配列の置き換え（すなわち、欠失および挿入）をもたらすことができる。リピート伸長配列を含む最初の標的遺伝子座を生成するために（例えば、既存のリピート伸長配列のヌクレアーゼ媒介伸長の方法で使用するために）、相同アームは、リピート伸長配列を含む挿入断片核酸を挟み得る。
外因性修復鋳型は、非相同末端結合媒介の挿入または相同組換えのためであってよい。外因性修復鋳型はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であってよく、それらは線形または環状形であってもよい。例えば、修復鋳型は、一本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってよい。
外因性修復鋳型は、非標的化内因性標的遺伝子座に存在しない異種配列を含むこともできる。例えば、外因性修復鋳型は、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれた選択カセットなどの選択カセットを含むことができる。
一部の外因性修復鋳型は、相同アームを含む。外因性修復鋳型酸が核酸挿入断片も含む場合、相同アームは核酸挿入断片を挟むことができる。参照の容易さのために、本明細書において相同アームは５’および３’（すなわち、上流および下流）相同アームと呼ぶ。この用語は、外因性修復鋳型の中の核酸挿入断片に対する相同アームの相対的位置に関する。５’および３’相同アームは、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と本明細書で呼ばれる、標的遺伝子座の中の領域に対応する。
２つの領域が相同組換え反応のための基質として作用するために十分であるお互いとの配列同一性のレベルを共有する場合、相同アームおよび標的配列はお互いに「対応する」か「対応している」。用語「相同性」は、同一であるかまたは対応する配列と配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性修復鋳型に見出される対応する相同アームの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性修復鋳型（またはその断片）の相同アームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを経るように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってよい。さらに、相同アームと対応する標的配列の間の相同性の対応する領域は、相同組換えを促進するのに十分である任意の長さであってよい。一部の標的化ベクターでは、標的遺伝子座の中の意図される突然変異は、相同アームによって挟まれた挿入断片核酸の中に含まれる。
１細胞期胚以外の細胞では、外因性修復鋳型は「大きな標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であってよく、それは、細胞の中で相同組換えを実行することを意図する他のアプローチによって一般的に使用されるものより大きな核酸配列に対応し、それに由来する相同アームを含む標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣは、細胞の中で相同組換えを実行することを意図する他のアプローチによって一般的に使用されるものより大きな核酸配列を有する核酸挿入断片を含む標的化ベクターも含む。例えば、ＬＴＶＥＣは、それらのサイズ制限のために伝統的なプラスミドベースの標的化ベクターが収容することができない大きな遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的化遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化することができないか、または、ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックも二本鎖切断もない場合に間違ってかもしくは有意に低い効率で標的化することができるだけである細胞の遺伝子座であってよい（すなわち、５’および３’相同アームはそれに対応することができる）。ＬＴＶＥＣは任意の長さであってよく、長さは一般的に少なくとも１０ｋｂである。ＬＴＶＥＣの５’相同アームおよび３’相同アームの合計は、一般的に少なくとも１０ｋｂである。
スクリーニング工程は、例えば、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲでは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的化参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅した配列を認識する蛍光プローブを含み得る。
好適な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（単数または複数単数または複数）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
例えば、改変された細胞（例えば、改変された多能性細胞または胚性幹（ＥＳ）細胞、例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）は、例えば、（ａ）例えば、５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入断片核酸を含む１つまたは複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を細胞に導入するステップであって、挿入断片核酸はリピート伸長配列を含み、リピート伸長配列を含む標的遺伝子座を生成するステップ；および（ｂ）標的遺伝子座に組み入れられる挿入断片核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を識別するステップ（すなわち、標的遺伝子座にリピート伸長配列を含む少なくとも１つの細胞を識別するステップ）による組換えを通して生成することができる。
あるいは、改変された細胞は、（ａ）細胞の中に以下のものを導入するステップ：（ｉ）標的遺伝子座の中の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤；および（ｉｉ）例えば、ヌクレアーゼ標的部位に十分近接して位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入断片核酸を必要に応じて含む、１つまたは複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、挿入断片核酸はリピート伸長配列を含み、リピート伸長配列を含む標的遺伝子座を生成する１つまたは複数の外因性ドナー核酸；ならびに（ｃ）内因性標的遺伝子座に組み入れられる挿入断片核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を識別するステップ（すなわち、標的遺伝子座にリピート伸長配列を含む少なくとも１つの細胞を識別するステップ）によって生成することができる。あるいは、改変された細胞は、（ａ）細胞の中に以下のものを導入するステップ：（ｉ）標的遺伝子座の中の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸；および（ｉｉ）例えば、ヌクレアーゼ標的部位に十分近接して位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームによって挟まれた挿入断片核酸を必要に応じて含む、１つまたは複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、挿入断片核酸はリピート伸長配列を含み、リピート伸長配列を含む標的遺伝子座を生成する１つまたは複数の外因性ドナー核酸；ならびに（ｃ）内因性標的遺伝子座に組み入れられる挿入断片核酸をそのゲノムに含む少なくとも１つの細胞を識別するステップ（すなわち、標的遺伝子座にリピート伸長配列を含む少なくとも１つの細胞を識別するステップ）によって生成することができる。ニックまたは二本鎖切断を所望の認識部位に誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。好適なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）またはそのような系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。
Ａ．ヌクレアーゼ剤およびヌクレアーゼ剤の標的部位
標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列のコピー数が増加した改変された細胞を生成するための方法で使用するためのヌクレアーゼ剤が本明細書で提供される。標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列の複数のコピーを含むリピート伸長配列を含む、標的ゲノム遺伝子座においてリピート配列のコピー数が増加した改変された細胞を生成するための方法で使用するためのヌクレアーゼ剤をコードする核酸も本明細書で提供される。そのようなヌクレアーゼ剤は、リピート伸長配列の５’末端または３’末端の近傍のヌクレアーゼ標的部位で二本鎖切断または一本鎖切断（例えば、ニッカーゼ）を形成するように設計され得る。
「ヌクレアーゼ剤の標的部位」という用語は、ヌクレアーゼ剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤のための標的部位は細胞にとって内因性（または、天然）であってよいか、または標的部位は細胞にとって外因性であってもよい。細胞にとって外因性である標的部位は、細胞のゲノムに天然に存在しない。標的部位は、標的遺伝子座に配置されることが望まれる目的のポリヌクレオチドに外因性であってもよい。一部の場合には、標的部位は、宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。
標的部位の長さは異なってよく、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対の場合約３０～３６ｂｐである（すなわち、各ＺＦＮにつき約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合約３６ｂｐである、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合約２０ｂｐである標的部位を含む。
本明細書に開示される方法および組成物において、所望の標的部位でニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。そのヌクレアーゼ剤が所望の標的部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するか天然のヌクレアーゼ剤を用いることができる。あるいは、改変されたか操作されたヌクレアーゼ剤を用いることができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」には、所望の標的部位を特異的に標的化してニックまたは二本鎖切断を誘導するように、その天然形態から操作される（改変または誘導される）ヌクレアーゼが含まれる。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の、天然に存在するヌクレアーゼ剤から生じることができるか、またはそれは人工的に作製もしくは合成することができる。例えば、操作されたヌクレアーゼは標的部位においてニックまたは二本鎖切断を誘導することができ、ここで、標的部位は天然の（非操作のまたは非改変の）ヌクレアーゼ剤によって標的化されただろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤におけるわずか１つのアミノ酸または核酸分解剤における１つのヌクレオチドであり得る。標的部位または他のＤＮＡにおいてニックまたは二本鎖切断を生成することは、標的部位または他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と本明細書で呼ぶことができる。
例示される標的部位の活性バリアントおよび断片も、提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的部位と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を含むことができ、ここで、活性バリアントは生物活性を保持し、したがって、ヌクレアーゼ剤によって配列特異的に標的化され切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的部位の二本鎖切断を測定するアッセイは公知である（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＴａｑＭａｎ（登録商標）
ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ（２０１０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７）。
ヌクレアーゼ剤の標的部位は、標的遺伝子座またはその近くの任意の場所に配置することができる。標的部位は遺伝子のコード領域内に、または遺伝子の発現に影響する調節領域内に位置することができる。ヌクレアーゼ剤の標的部位は、イントロン、エクソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域または任意の非タンパク質コード領域に位置することができる。
１つのタイプのヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物の生物体のゲノム内の特異的標的配列で二本鎖切断を形成するために使用することができる、配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターまたはその機能的部分を、エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩなどの触媒性ドメインに融合させることによって作製される。特異な、モジュール式のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的にいかなる所与のＤＮＡ標的化特異性を有するタンパク質の設計も可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的ＤＮＡ標的部位を標的化するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を形成するために使用することができる。その各々は全ての目的のために参照により本明細書にその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７９４３０；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１０） ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７；Ｓｃｈｏｌｚｅ
＆ Ｂｏｃｈ （２０１０） Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７－７６１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （２０１０） ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４；およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照。
適するＴＡＬヌクレアーゼの例および適するＴＡＬヌクレアーゼを調製する方法は、例えば、その各々は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示される。
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各単量体は、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５個のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されているＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、ここで、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々はＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結されており、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離される標的ＤＮＡ配列の各鎖の中の２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ここで、ＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。
本明細書に開示される様々な方法および組成物において用いられるヌクレアーゼ剤は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むことができる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各単量体は３つまたはそれより多くの亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、ここで、各亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されている亜鉛フィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、ここで、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮの各々はＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットに作動可能に連結されており、第１および第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーによって分離される標的ＤＮＡ配列の各鎖の中の２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ここで、ＦｏｋＩヌクレアーゼのサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、その各々は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６０２４６５６７；ＵＳ２００８０１８２３３２；ＵＳ２００２００８１６１４；ＵＳ２００３００２１７７６；ＷＯ２００２／０５７３０８Ａ２；ＵＳ２０１３０１２３４８４；ＵＳ２０１００２９１０４８；ＷＯ２０１１／０１７２９３Ａ２；およびＧａｊ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３１（７）：３９７－４０５を参照。
別のタイプのヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、これらのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈ－Ｎ－ＨおよびＨｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼはそれらの長い標的部位について、およびそれらのＤＮＡ基質における一部の配列多型への寛容性について注目すべきである。メガヌクレアーゼのドメイン、構造および機能は公知である、例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ （２００３） Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８（３）：１９９－２４８；Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９（４）：９６０－９６９；Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ， （１９９９） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４－１３２６；Ｓｔｏｄｄａｒｄ， （２００６） Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９－９５；およびＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９（１０）：７６４－７７０を参照。一部の例では、天然に存在するバリアントおよび／または操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。カイネティクス、補因子相互作用、発現、最適な条件および／または標的部位特異性を改変するための、ならびに活性についてスクリーニングするための方法は公知である。例えば、その各々は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２－６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３－１００８；Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０－９；Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１－４１；Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１－８００；Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９；Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ， （２００５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４；ＷＯ２００５１０５９８９；ＷＯ２００３０７８６１９；ＷＯ２００６０９７８５４；ＷＯ２００６０９７８５３；ＷＯ２００６０９７７８４；およびＷＯ２００４０３１３４６を参照。
例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩまたはそれらの任意の活性バリアントもしくは断片を含む任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。
メガヌクレアーゼは、例えば、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を標的化することができる。一部の場合には、メガヌクレアーゼは、ゲノムの中の１つの完全に一致した標的配列を標的化する。
一部のメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。１つのタイプのホーミングヌクレアーゼは、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－Ｄｍｏｌを含む、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。
ヌクレアーゼ剤は制限エンドヌクレアーゼをさらに含むことができ、それはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む。Ｉ型およびＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは特異的標的部位を標的にするが、ヌクレアーゼ結合部位から異なる位置で一般的に切断し、それは切断部位（標的部位）から数百塩基対離れることがある。ＩＩ型系では、制限活性はいかなるメチラーゼ活性からも独立し、切断は結合部位の中かまたはその近傍の特異的部位で一般的に起こる。ほとんどのＩＩ型酵素はパリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は非パリンドローム標的部位を標的にし、標的部位の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は標的部位の外側に両部位を有する配列を２回切断し、ＩＩｓ型酵素は非対称の標的部位を標的にし、一方の側の標的部位から約１～２０ヌクレオチドの規定の距離で切断する。ＩＶ型制限酵素はメチル化ＤＮＡを標的にする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１（１）：４１８－４２０）；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１（７）：１８０５－１８１２；およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ． （２００２） ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ， ｐｐ． ７６１－７８３， Ｅｄｓ． Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ）にさらに記載され、分類され、各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼ剤の活性バリアントおよび断片（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を含むことができ、ここで、活性バリアントは、所望の標的部位で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断を誘導する活性を保持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のいずれも、天然のエンドヌクレアーゼ配列から改変することができ、天然のヌクレアーゼ剤によって標的化されなかった標的部位を標的化し、そこでニックまたは二本鎖切断を誘導するように設計することができる。したがって、一部の操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的部位と異なる標的部位において、ニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断を誘導する活性のためのアッセイは公知であり、標的部位を含有するＤＮＡ基質の上でエンドヌクレアーゼの全体的活性および特異性を一般的に測定する。
ヌクレアーゼ剤は、当該技術分野において任意の公知の手段によって細胞に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接的に導入することができる。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細胞に導入することができる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される場合、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一時的に、条件つきでまたは構成的に発現させることができる。したがって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含有させることができ、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターに作動可能に連結することができる。そのようなプロモーターは、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載される。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入することができる。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み入れること、および細胞内で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクターの中（例えば、挿入断片ポリヌクレオチドを含んでいる標的化ベクターの中、または挿入断片ポリヌクレオチドを含んでいる標的化ベクターと別であるベクターもしくはプラスミドの中）にあることができる。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通してヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞または目的の任意の他の宿主細胞を含む、所与の目的の原核または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変することができる。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
本明細書に開示される方法および組成物は、細胞の中のゲノムを改変するために、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成要素を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、転写物、およびＣａｓ遺伝子の発現に関与する、またはＣａｓ遺伝子の活性を方向付ける他のエレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型系またはＶ型系（例えば、Ｖ－Ａ亜型またはＶ－Ｂ亜型）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物は、核酸の位置指定結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成しているガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることができる。
本明細書に開示される組成物および方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないものであり得る。「天然に存在しない」系は、それらの天然に存在する状態から変更もしくは変異させたか、自然には天然に付随する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないか、または、天然には付随しない少なくとも１つの他の構成成分が付随する系の１つまたは複数の構成成分などの、人間の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然には一緒に存在しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してもよいし、天然には存在しないＣａｓタンパク質を使用してもよいし、天然には存在しないｇＲＮＡを使用してもよい。
Ｃａｓタンパク質。 Ｃａｓタンパク質は、一般に、ガイドＲＮＡと相互作用し得る少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体形成ドメイン、および他のドメインも含み得る。一部のそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来するものであってもよい。他のそのようなドメインを付加して、改変Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む核酸切断に対する触媒活性を有する。切断により、平滑末端または付着末端が生じ得、これは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般には平滑切断生成物を創出させる。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は５ヌクレオチド５’突出部を有する切断生成物を生じさせることができ、切断は非標的化鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後ろおよび標的化鎖の２３番目の塩基の後ろで起こる。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座に二本鎖切断（例えば、平滑末端を伴う二本鎖切断）を創出させる完全な切断活性を有してもよいか、またはそれは標的ゲノム遺伝子座において一本鎖切断を創出するニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、一般には、保存的アーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーのさらなる例は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられる）は例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられる）は別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来するＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられる）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｉｍら（２０１７年）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８巻：１４５００頁を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９より小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）からのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ（ＦｎＣａｓ９）からのＣａｓ９または代わりのＰＡＭ（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）を認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９変異体は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ （２０１７） Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１でレビューされる。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の特有のアルギニンリッチクラスターに対する対応物と一緒に、Ｃａｓ９の対応するドメインと相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠き、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列では連続しており、それとは対照的に、Ｃａｓ９ではＨＮＨドメインを含む長い挿入断片を含有する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅら（２０１５年）Ｃｅｌｌ、１６３巻（３号）：７５９～７７１頁を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ． ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ０Ｑ７Ｑ２に割り当てられる）は例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、改変Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の断片であってよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片であってもよい。触媒活性に関して活性なバリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きな配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位をカットする能力を保持し、したがって、ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導活性または二本鎖切断誘導活性についてのアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含有するＤＮＡ基質に対するＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
改変Ｃａｓタンパク質の一例は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された変更（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を担持するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の高忠実度バリアントである改変ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（２０１６年）Ｎａｔｕｒｅ ５２９巻（７５８７号）：４９０～４９５頁を参照されたい。改変Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｌａｙｍａｋｅｒら（２０１６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１巻（６２６８号）：８４～８８頁を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントとしては、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。これらおよび他の改変されたＣａｓタンパク質は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ
（２０１７） Ｍａｍｍ． Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１でレビューされる。改変されたＣａｓ９タンパク質の別の例はｘＣａｓ９であり、それはＰＡＭ配列の伸長した範囲を認識することができるＳｐＣａｓ９変異体である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照。
Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つまたは複数が増大または低減するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、安定性などの、タンパク質の任意の他の活性または性質が変化するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメインを改変するか、欠失させるか、または不活化することもでき、Ｃａｓタンパク質を、タンパク質の機能に必須ではないドメインを取り除くため、またはＣａｓタンパク質の活性または性質を最適化する（例えば、増強するか、または低下させる）ために短縮することもできる。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配置にある標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインも含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、それぞれ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖をカットして、ＤＮＡにおける二本鎖切断を生じさせることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＪｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻：８１６～８２１頁を参照されたい。
ヌクレアーゼドメインの１つもしくは複数またはすべてを欠失させるかまたは変異させ、その結果、もはや機能的でなくなるかまたは低下したヌクレアーゼ活性を有するようにすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼドメインの１つを欠失させるかまたは変異させる場合、得られるＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼと称することができ、二本鎖標的ＤＮＡ内に一本鎖切断を生じさせることができるが、二本鎖切断を生じさせることはできない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方は切断できない）。ヌクレアーゼドメインの両方とも欠失するか変異する場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低減する（例えば、ヌクレアーゼが存在しない（ｎｕｌｌ）もしくはヌクレアーゼ不活性のＣａｓタンパク質、または触媒的に不活発なＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位におけるアスパラギン酸からアラニンへの）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位においてヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位においてヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位においてアスパラギンからアラニンへ）により、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９に対応する変異が挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓら（２０１１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３９巻：９２７５～９２８２頁およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。そのような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介性変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生じさせることができる。ニッカーゼを創出させる他の変異の例は、例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができる。Ｃａｓタンパク質においてヌクレアーゼドメインの全てが欠失するか変異する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質においてヌクレアーゼドメインの両方とも欠失するか変異する）、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低減する（例えば、ヌクレアーゼが存在しないまたはヌクレアーゼ不活性のＣａｓタンパク質）。１つの具体例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適に整列させたときの別の種からのＣａｓ９における、対応する二重変異体である。別の具体例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適に整列させたときの別の種からのＣａｓ９における、対応する二重変異体である。
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化突然変異の例は、ＳｐＣａｓ９に関して上に記載されるものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメイン中の不活化変異の例も公知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質を生成するためのＮ５８０位における置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位における置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化突然変異の例も公知である（例えば、Ｄ１６ＡおよびＨ５８８Ａの組合せ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化突然変異の例も公知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９ＡおよびＮ６２２Ａの組合せ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化突然変異の例も公知である（例えば、Ｄ１０ＡおよびＮ８７０Ａの組合せ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化突然変異の例も公知である（例えば、Ｄ８ＡおよびＨ５５９Ａの組合せ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化突然変異の例も公知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメイン中の不活化変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１、Ｃｐｆ１）に由来するＣｐｆ１タンパク質を参照すると、そのような変異は、ＡｓＣｐｆ１の９０８位、９９３位、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２位、９２５位、９４７位、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置に変異を含んでもよい。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログ中の対応する変異のうちの１つまたは複数を含んでもよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。
Ｃａｓタンパク質を異種ポリペプチドに作動可能に連結して融合タンパク質とすることもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質を切断ドメイと融合することができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質を、安定性の増大または低減をもたらす異種ポリペプチドと融合することもできる。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。
一例として、Ｃａｓタンパク質を、細胞内局在化をもたらす１つまたは複数の異種ポリペプチドと融合することができる。そのような異種ポリペプチドとしては、例えば、核へのターゲティングのための単節型ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または双節型アルファ－インポーチンＮＬＳなどの１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへのターゲティングのためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを挙げることができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＬａｎｇｅら（２００７年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８２巻：５１０１～５１０５頁を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のひと続きを含んでよく、また、一分配列であっても二分配列であってもよい。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む、２つまたはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳおよび／またはＣ末端の２つもしくはそれより多いＮＬＳを含んでもよい。
Ｃａｓタンパク質を細胞透過性ドメインまたはタンパク質形質導入ドメインと作動可能に連結することもできる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質を蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの追跡または精製をしやすくするための異種ポリペプチドに作動可能に連結することもできる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ
Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質を標識された核酸に係留することもできる。そのような係留（すなわち、物理的連結）は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用によって実現することができ、係留は直接的であってもよく（例えば、直接融合またはタンパク質上のシステインもしくはリシン残基の修飾またはインテイン修飾によって実現することができる化学的なコンジュゲーションによる）、ストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つまたは複数の介在するリンカーまたはアダプター分子を通じて実現することもできる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅら（２００５年）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、５巻（１号）：４１～５５頁；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら（２００７年）Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．、４６巻（４６号）：８８１９～８８２２頁；ＳｃｈａｅｆｆｅｒおよびＤｉｘｏｎ（２００９年）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ．、６２巻（１０号）：１３２８～１３３２頁；Ｇｏｏｄｍａｎら（２００９年）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．、１０巻（９号）：１５５１～１５５７頁；ならびにＫｈａｔｗａｎｉら（２０１２年）Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、２０巻（１４号）：４５３２～４５３９頁を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有結合性戦略としては、ビオチン－ストレプトアビジン法およびニッケル－ヒスチジン法が挙げられる。共有結合性タンパク質－核酸コンジュゲートを、適切に官能性をもたせた核酸およびタンパク質を多種多様な化学を使用して接続することによって合成することができる。これらの化学の一部は、オリゴヌクレオチドをタンパク質表面上のアミノ酸残基に直接付着させることを伴い（例えば、リシンアミンまたはシステインチオール）、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質を核酸に共有結合により付着させるための方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドとタンパク質のリシンまたはシステイン残基の化学的架橋、発現タンパク質ライゲーション、化学酵素法、および光アプタマーの使用を挙げることができる。標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部の領域に係留することができる。一例において、標識された核酸をＣａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留する。同様に、Ｃａｓタンパク質を標識された核酸の５’末端、３’末端、または内部の領域に係留することができる。すなわち、識された核酸を任意の配向および極性で係留することができる。例えば、、Ｃａｓタンパク質を標識された核酸の５’末端または３’末端に係留することができる。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。必要に応じて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、特定の細胞または生物体におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞において使用の頻度が高いコドンに置換されるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質を、安定性および／または免疫原性特性の改善のために修飾することができる。修飾を、ｍＲＮＡ内の１つまたは複数のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基に対する化学修飾の例としては、プソイドウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルプソイドウリジンを含有するキャップ付およびポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡを、同義コドンを使用するウリジンの枯渇によって修飾することができる。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み入れること、および細胞の中で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物の中のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、目的の遺伝子または他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を導くことができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に移行させることができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターの中にあってよい。あるいは、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターと別個のベクターまたはプラスミドの中にあってよい。発現構築物において使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つまたは複数において活性であるプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。必要に応じて、プロモーターは、Ｃａｓタンパク質の一方向の発現およびガイドＲＮＡの他方向の発現の両方を駆動する双方向プロモーターであってよい。そのような双方向プロモーターは、（１）３つの外部制御エレメント：遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスを含有する完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに（２）ＰＳＥおよびＤＳＥの５’末端と逆配向で融合したＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターからなり得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスと隣接しており、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによってプロモーターを双方向性にすることができる。例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させるために双方向プロモーターを使用することにより、送達を容易にするための緻密な発現カセットの生成が可能になる。
ガイドＲＮＡ。 「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の場所にターゲティングするＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」および「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したひと続きなどの、分子の区画または領域を含む。Ｃａｓ９に対するものなどの一部のｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子：「活性化因子－ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「標的化因子－ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ
ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ，」または「ｓｇＲＮＡ」とも称され得る。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。Ｃａｓ９に関しては、例えば、単一ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと融合したｃｒＲＮＡ（例えば、リンカーを介して）を含み得る。Ｃｐｆ１に関しては、例えば、標的配列への結合を実現するためにはｃｒＲＮＡのみが必要である。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、２重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「標的化因子－ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子－ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）およびｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ ２重鎖の片方を形成するヌクレオチドのひと続きの両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’側）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１９）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’側）に位置するｃｒＲＮＡ尾部の他の例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号８３）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）のいずれか（例えば、配列番号８４～９１のいずれか）を配列番号１９または配列番号８３の５’末端に接合してｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ ２重鎖のあとの半分を形成するヌクレオチドのひと続きを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのひと続きと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ ２重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言うことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号２０）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の他の例は、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８２）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の他の例は、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１１６）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１１７）．を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡがｇＲＮＡになることができる。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをさらにもたらす。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子を使用する種に特異的になるように設計することができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｉら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻：８２３～８２６頁；Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７巻：８１６～８２１頁；Ｈｗａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１巻：２２７～２２９頁；Ｊｉａｎｇら（２０１３年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１巻：２３３～２３９頁；およびＣｏｎｇら（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９巻：８１９～８２３頁を参照されたい。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下でさらに詳述される標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡと配列特異的にハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）によって相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変動させることができ、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。主題のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントを、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列とハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物体に応じて異なるが、多くの場合、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）に挟まれた２１～７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントを含有する（例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合では、ＤＲは３６ヌクレオチドの長さであり、標的化セグメントは３０ヌクレオチドの長さである。３’側に位置するＤＲが対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、ハイブリダイズし、それが今度はＣａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２から約１００まで、約１２から約８０まで、約１２から約５０まで、約１２から約４０まで、約１２から約３０まで、約１２から約２５まで、または約１２から約２０ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５から約２５ヌクレオチドまで（例えば、約１７から約２０ヌクレオチドまで、または約１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６から２０ヌクレオチドの間の長さまたは１７から２０ヌクレオチドの間の長さである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１から２３ヌクレオチドの間の長さである。Ｃｐｆ１に関しては、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチドの長さまたは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）および様々な長さであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、一次転写産物またはプロセシングされた形態を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部としてかまたは２分子ｇＲＮＡの一部としての別々の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約２６ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約３２ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約４８ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約５４ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６３ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約６７ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、約８５ヌクレオチドもしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）の全部または一部を含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ、４７１巻：６０２～６０７頁；ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョンに見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、最大＋ｎヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖の間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖の間のパーセント相補性は、約２０個連続したヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖の相補鎖の５’末端では１４個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さであり得る。そのような場合では、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチドの長さとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖の間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖の相補鎖の５’末端では７個連続したヌクレオチドにわたって１００％であり、残りにわたっては０％の低さであり得る。そのような場合では、ＤＮＡ標的化セグメントは、７ヌクレオチドの長さとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドが標的ＤＮＡの相補鎖と相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは２０ヌクレオチドの長さであり得、標的ＤＮＡの相補鎖とのミスマッチを１つ、２つ、または３つ含み得る。一つの例では、ミスマッチはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖の領域（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補）に隣接しない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチはＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いと相補的な２つのヌクレオチドのひと続きを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ ２重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。主題のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に方向付ける。
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に連結された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有し得る。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号２１）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号２２）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号２３）；ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号２４）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５；配列番号１１８）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６；配列番号１１９）；またはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７；配列番号１２０）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本明細書に開示される任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡとしては、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端上の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかと融合したガイドＲＮＡの５’末端上のＤＮＡ標的化セグメントを挙げることができる。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれかを上記の足場配列のいずれか１つの５’末端と接合して、単一のガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。
ガイドＲＮＡは、追加的な望ましい特徴（例えば、改変または制御された安定性；細胞内標的化；蛍光標識を用いた追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）をもたらす改変または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、安定性の制御ならびに／またはタンパク質および／もしくはタンパク質複合体による接近可能性の制御を可能にするため）；安定性調節配列；ｄｓＲＮＡ ２重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にターゲティングする改変または配列；追跡をもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子との直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素などを含めたＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位をもたらす改変または配列；およびこれらの組合せが挙げられる。改変の他の例としては、操作されたステムループ２重鎖構造、操作されたバルジ領域、ステムループ２重鎖構造の操作されたヘアピン３’、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域および最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される２重鎖内の対合していないヌクレオチドの領域であり得る。バルジは、２重鎖の片側に対合していない５’－ＸＸＸＹ－３’（配列中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは逆の鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る）、および、他方の側の２重鎖に対合していないヌクレオチド領域を含み得る。
非改変核酸は、分解されやすくてもよい。外因性核酸は、先天性免疫応答を誘導することもできる。改変は、安定性を導入し、免疫原性を低減させるのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、下記：（１）ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素および／または１つもしくは複数の連結リン酸酸素の一方または両方の変更または置換え；（２）リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更または置換えなどのリボース糖の構成要素の変更または置換え；（３）脱ホスホリンカーとのリン酸部分の置換え；（４）天然に存在する核酸塩基の改変または置換え；（５）リボース－リン酸骨格の置換えまたは改変；（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変（例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは置換えまたは部分のコンジュゲーション）；ならびに（７）糖の改変のうちの１つまたは複数を含む、改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドを含んでもよい。他の可能なガイドＲＮＡ改変としては、ウラシルまたはポリ－ウラシルトラクトの改変または置換えが挙げられる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に対して行うことができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用したウリジンの消去によって改変することができる。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含んでもよい（例えば、塩基はホスホロチオエート基である改変リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４個の末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を含んでもよい。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル改変を有してもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４個の末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル改変を含んでもよい。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎら（２０１８年）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２２巻（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。他の可能な改変は、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載される。特定例では、ガイドＲＮＡは、最初の３個の５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。そのような化学的改変は、例えば、エキソヌクレアーゼからのより大きな安定性および保護をガイドＲＮＡに提供することができ、それらが未改変のガイドＲＮＡより長く細胞の中で持続することを可能にする。そのような化学的改変は、例えば、ＲＮＡを活発に分解することまたは細胞死につながる免疫カスケードを誘発することができる先天性細胞内免疫応答から保護することもできる。
ガイドＲＮＡは、任意の形態でもたらすことができる。例えば、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）としてかまたは１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかでもたらすことができ、必要に応じて、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態でもたらすことができる。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態でもたらすこともできる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）をコードしていてもよく、別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしていてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子としてもたらすこともでき、それぞれｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子としてもたらすこともできる。
ｇＲＮＡをＤＮＡの形態でもたらす場合、ｇＲＮＡを細胞において一過性に、条件付きで、または構成的に発現させることができる。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定して組み入れること、および細胞の中で活性であるプロモーターに作動可能に連結することができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを発現構築物中でプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの、異種核酸を含むベクター内に入れることができる。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミド内に入れることができる。そのような発現構築物に使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生的に制限された前駆細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚の１つまたは複数において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってもよい。適切なプロモーターの特定の例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
あるいは、ｇＲＮＡを、他の様々な方法によって調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された合成的に産生された分子であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基で２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むように化学的に合成することができる。
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、ガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４またはそれより多くのガイドＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所与の保存条件（例えば、－２０℃、４℃または周囲温度）の下で分解生成物が閾値未満のままである、例えば出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満である期間を延長する；または、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増加させる）担体とを含む組成物中に存在し得る。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸・ポリグリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コクリエート、および脂質微小管（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含むことができる。
ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合のための十分な条件が存在する場合にｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系での条件）は、当技術分野で公知である（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照）。ｇＲＮＡに相補的でそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質にもｇＲＮＡにも相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「鋳型鎖」と呼ぶことができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖の上の配列および非相補鎖（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している）の上の対応する配列の両方を含む。本明細書で使用される用語「ガイドＲＮＡ標的配列」は、相補鎖の上でガイドＲＮＡがハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖の上の配列を具体的に指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接している（例えば、Ｃａｓ９の場合にはＰＡＭの上流または５’側）非相補鎖の上の配列を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ウラシルの代わりにチミンを有すること以外、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等である。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のためのガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖の上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指すことができる。ガイドＲＮＡは標的ＤＮＡの相補鎖への相補性を有するように設計され、ここで、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖の間のハイブリダイゼーションはＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性がある場合は、完全な相補性は必ずしも必要とされない。ガイドＲＮＡが本明細書においてガイドＲＮＡ標的配列を標的にすると言及される場合、ガイドＲＮＡは、非相補鎖の上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列とハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核もしくは細胞質に、または細胞のオルガネラ、例えばミトコンドリアもしくはクロロプラストに位置することができる。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に内因性または外因性である任意の核酸配列であってよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子生成物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節配列）であってよいか、両方とも含むことができる。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖の間の塩基対合相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖の中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こることができる。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列を挟むことができる。必要に応じて、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭ（例えば、Ｃａｓ９の場合）によって挟まれ得る。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭ（例えば、Ｃｐｆ１の場合）によって挟まれ得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の約１から約１０または約２から約５塩基対（例えば、３塩基対）上流または下流であってよい（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列の中）。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖の上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であってよく、ここで、Ｎ１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖の上のガイドＲＮＡ標的配列の直ぐ３’側にある。このように、相補鎖の上のＰＡＭに対応する配列（すなわち、逆相補体）は、５’－ＣＣＮ２－３’になるだろうが、ここでＮ２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖の上でガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントがハイブリダイズする配列の直ぐ５’側にある。一部のそのような場合、Ｎ１およびＮ２は相補的であってよく、Ｎ１－Ｎ２塩基対は任意の塩基対であってよい（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ；またはＮ１＝ＴおよびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであってよく、ここでＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであってよく、ＲはＧまたはＡであってよい。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉからのＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えばＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであってよく、ここでＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであってよく、ＲはＧまたはＡであってよい。一部の場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は５’末端の上流にあってよく、配列５’－ＴＴＮ－３’を有することができる。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号２５）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号２６）である。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照。５’末端のグアニンは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭの他の例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含むことができる（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ；配列番号２７）。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照。他のガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、長さが４～２２ヌクレオチドの配列番号２５～２７を有することができる。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列プラスＰＡＭは、長さが１４～２０ヌクレオチドの配列番号２５～２７を有することができる。
標的ＤＮＡとハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列に対応する領域の中またはその近傍の標的ＤＮＡの片方または両方の鎖の切断をもたらすことができる（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖の上のガイドＲＮＡ標的配列およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖の上の逆相補体）。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列の中（例えば、ＰＡＭ配列に対して規定の位置）にあることができる。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質により一本鎖切断または二本鎖切断が生じる、標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖上のみにあってもよく（例えば、ニッカーゼを使用する場合）、両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端が生じる、例えば、Ｃａｓ９）、各鎖上の異なる部位にあってもよい（付着末端（すなわち、突出部）が生じる、例えば、Ｃｐｆ１）。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生じさせる２つのＣａｓタンパク質を使用し、それにより、二本鎖切断を生じさせることによって生じさせることができる。例えば、第１のニッカーゼにより、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、第２のニッカーゼにより、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を創出することができ、その結果、突出部配列が創出される。一部の場合では、第１の鎖上のガイドＲＮＡ標的配列またはニッカーゼの切断部位は、第２の鎖上のガイドＲＮＡ標的配列またはニッカーゼの切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。
ＩＩＩ．内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物、非ヒト動物細胞および非ヒト動物ゲノム
本明細書に開示される非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むことができる。異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子も開示される。内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された伸長したヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むゲノム、細胞（例えば、ヒト誘導多能性幹細胞）および動物も本明細書で開示される。伸長したヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子も開示される。例として、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の１００より多いリピートを含むことができる。
Ａ．Ｃ９ＯＲＦ７２、ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列および関連する疾患
ルー・ゲーリック病ともまた称する、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）とは、上位運動ニューロンおよび／または下位運動ニューロンの喪失によって特徴付けられる、最も高頻度な成人発症型麻痺性障害である。ＡＬＳは、米国全体で、２０，０００人もの個体において生じ、毎年約５，０００例の新たな症例が生じている。前頭側頭型認知症（ＦＴＤ；ピック病、前頭側頭葉変性症またはＦＴＬＤとも称される）とは、脳の前頭葉または側頭葉における、進行性の細胞変性により引き起こされる障害群である。ＦＴＤは、全ての認知症例の１０％～１５％を占めると報告されている。ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン１Ａおよび１Ｂ、２つの非コードエクソンの間の（および、必要に応じてそれらにわたる）ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、ＡＬＳおよびＦＴＤの両方と関連付けられている。ＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）ヘキサヌクレオチドリピート伸長は、家族性および多くの非家族性ＡＬＳ症例の約５０％を占めると推定される。それは、家族性ＦＴＤ症例の約２５％に、および散発性のＦＴＤ症例の約８％に存在する。
Ｃ９ＯＲＦ７２の中のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列に関係した多くの病理学的な態様、例えば、ＲＮＡ病巣のリピート長依存性形成、特異的ＲＮＡ結合タンパク質の隔離、ならびにリピート関連の非ＡＵＧ（ＡＵＧ）翻訳から生じるジペプチドリピートタンパク質（例えば、ポリ（グリシン－アラニン）、ポリ（グリシン－プロリン）、ポリ（グリシン－アルギニン）、ポリ（アラニン－プロリン）またはポリ（プロリン－アルギニン）ジペプチドリピートタンパク質）の蓄積および凝集が報告されている。ヘキサヌクレオチド配列（ＧＧＧＧＣＣ；配列番号１）の６６リピートを含む異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含有するマウスは、アデノ随伴ウイルスによって媒介される体性脳トランス生成によって生成され、それらのニューロンにおけるリピート関連の非ＡＵＧ（ＡＵＧ）翻訳から生じるＲＮＡ病巣およびジペプチドタンパク質凝集体を示す。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３９）：１１５１－１１５４を参照。
Ｃ９ＯＲＦ７２は、エンドソームへの輸送を調節することが報告されているが、Ｃ９ＯＲＦ７２の細胞内機能の多くは、依然として未知のままである。実際、Ｃ９ＯＲＦ７２は、機能が未知の、特徴付けされていないタンパク質をコードする遺伝子である。
マウスＣ９ｏｒｆ７２転写物変異体が報告されている。例えば、各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｐｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７８：４２６－４３８およびＡｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３：５９を参照。３つの報告されたマウスＣ９ｏｒｆ７２転写物変異体のゲノム情報は、ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０８１２７（Ｖ１）、ＥＮＳＭＵＳＴ０００００１０８１２６（Ｖ２）およびＥＮＳＭＵＳＴ００００００８４７２４（Ｖ３）の名称の下でＥｎｓｅｍｂｌウェブサイトでも利用可能である。例示的な非ヒト（例えば、げっ歯動物）Ｃ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡおよびアミノ酸配列は、配列番号４０～４３に示す。マウスＣ９ｏｒｆ７２のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０８１３４３およびＮＰ＿００１０７４８１２に見出すことができ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＮＭ＿００１０８１３４３．１およびＮＰ＿００１０７４８１２．１の配列は、配列番号４０および４１にそれぞれ示す。ラットＣ９ｏｒｆ７２のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００７７０２およびＮＰ＿００１００７７０３に見出すことができ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＮＭ＿００１００７７０２．１およびＮＰ＿００１００７７０３．１の配列は、配列番号４２および４３にそれぞれ示す。
ヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアントも公知である。１つのヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアントは、中央および３’側コード領域の複数のエクソンを欠き、その３’末端エクソンは、バリアント３で使用されるスプライス部位（下記を参照されたい）を越えて伸長する結果として、バリアント３と比較した、新規の３’側非翻訳領域（ＵＴＲ）をもたらす。このバリアントは、有意に短いポリペプチドをコードし、そのＣ末端アミノ酸は、他の２つのバリアントによりコードされるＣ末端アミノ酸と比較して識別可能である。このバリアントのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿１４５００５．６およびＮＰ＿６５９４４２．２において見出すことができ、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ＮＭ＿１４５００５．６およびＮＰ＿６５９４４２．２の配列は、それぞれ配列番号１３および配列番号１４で示される。第２のヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアント（２）は、５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）が、バリアント３と比較して異なる。このバリアントのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０１８３２５．４およびＮＰ＿０６０７９５．１において見出すことができ、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ＮＭ＿０１８３２５．４およびＮＰ＿０６０７９５．１の配列は、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で示される。第３のヒトＣ９ＯＲＦ７２転写物バリアント（３）は、報告された３つのバリアントの中で最も長い配列を含有し、より長いアイソフォームをコードする。このバリアントのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２５６０５４．２およびＮＰ＿００１２４２９８３．１において見出すことができ、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。ＮＭ＿００１２５６０５４．２およびＮＰ＿００１２４２９８３の配列は、それぞれ配列番号１７および配列番号１８で示される。バリアント２とバリアント３とは、同じタンパク質をコードする。
Ｂ．内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列
内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（例えば、内因性非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座）に挿入されたヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むゲノム、細胞または動物（例えば、非ヒト動物ゲノム、細胞または動物）が本明細書に記載される。細胞または動物は、本明細書の他の場所に記載される任意のタイプの細胞または動物であってよい。一部のゲノム、細胞または動物では、ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、異種の配列であってよい。あるいは、それは、本明細書に開示される方法を使用してその後さらに伸長される内因性の配列であってよい。異種という用語は、核酸に関して使用される場合、その核酸が、同じ分子内で天然には一緒に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、異種という用語は、核酸のセグメントに関連して使用される場合、その核酸が、天然では同じ互いとの関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多くの部分配列を含むことを示す。一例として、核酸の異種領域は、天然では他の分子と関連しては見出されない、別の核酸分子内にあるかまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸の異種領域は、天然ではＣ９ｏｒｆ７２配列と関連しては見出されないリピート伸長配列に挟まれたＣ９ｏｒｆ７２配列を含み得る。あるいは、核酸の異種領域は、内因性の非ヒト核酸配列によって挟まれたヒト核酸配列を含むことができる。
Ｃ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、一般的に、配列番号１で示されるヘキサヌクレオチド配列ＧＧＧＧＣＣの少なくとも２つの事例（すなわち、２つのリピート）を含むヌクレオチド配列である。内因性非ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座への挿入のために、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１に示すヘキサヌクレオチド配列の複数（すなわち、少なくとも２つの事例（リピート））を含む。
一部の異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列では、リピートは連続している（介在配列なしで互いに隣接している）。
異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、任意の数のリピートを有することができる。例えば、リピート伸長配列は、約９５より多くのリピート、約９６より多くのリピート、約９７より多くのリピート、約９８より多くのリピート、約９９より多くのリピート、約１００より多くのリピート、約１０１より多くのリピート、約１０２より多くのリピート、約１０３より多くのリピート、約１０４より多くのリピート、約１０５より多くのリピート、約１５０より多くのリピート、約２００より多くのリピート、約２５０より多くのリピート、約２９５より多くのリピート、約２９６より多くのリピート、約２９７より多くのリピート、約２９８より多くのリピート、約２９９より多くのリピート、約３００より多くのリピート、約３０１より多くのリピート、約３０２より多くのリピート、約３０３より多くのリピート、約３０４より多くのリピート、約３０５より多くのリピート、約３５０より多くのリピート、約４００より多くのリピート、約４５０より多くのリピート、約５００より多くのリピート、約５５０より多くのリピート、約５９５より多くのリピート、約５９６より多くのリピート、約５９７より多くのリピート、約５９８より多くのリピート、約５９９より多くのリピート、約６００より多くのリピート、約６０１より多くのリピート、約６０２より多くのリピート、約６０３より多くのリピート、約６０４より多くのリピート、または約６０５より多くのリピートを含み得る。あるいは、リピート伸長配列は、少なくとも約９５リピート、少なくとも約９６リピート、少なくとも約９７リピート、少なくとも約９８リピート、少なくとも約９９リピート、少なくとも約１００リピート、少なくとも約１０１リピート、少なくとも約１０２リピート、少なくとも約１０３リピート、少なくとも約１０４リピート、少なくとも約１０５リピート、少なくとも約１５０リピート、少なくとも約２００リピート、少なくとも約２５０リピート、少なくとも約２９５リピート、少なくとも約２９６リピート、少なくとも約２９７リピート、少なくとも約２９８リピート、少なくとも約２９９リピート、少なくとも約３００リピート、少なくとも約３０１リピート、少なくとも約３０２リピート、少なくとも約３０３リピート、少なくとも約３０４リピート、少なくとも約３０５リピート、少なくとも約３５０リピート、少なくとも約４００リピート、少なくとも約４５０リピート、少なくとも約５００リピート、少なくとも約５５０リピート、少なくとも約５９５リピート、少なくとも約５９６リピート、少なくとも約５９７リピート、少なくとも約５９８リピート、少なくとも約５９９リピート、少なくとも約６００リピート、少なくとも約６０１リピート、少なくとも約６０２リピート、少なくとも約６０３リピート、少なくとも約６０４リピート、または少なくとも約６０５リピートを含み得る。具体的な例では、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、約１００より多くのリピート、約３００より多くのリピート、約６００より多くのリピート、少なくとも約１００リピート、少なくとも約３００リピート、または少なくとも約６００リピートを含む。
リピート伸長配列は、例えば、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の第１の非コード内因性エクソンと第２エクソンの間に位置することができる。
一部の例では、改変された内因性非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座は、追加のオルソログのＣ９ｏｒｆ７２配列を含むこともできる。一例として、非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座は、ヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の５’非翻訳および／または非コード内因性非ヒト配列の、ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列および隣接オルソログヒトＣ９ＯＲＦ７２配列（すなわち、配列番号１に示すヘキサヌクレオチド配列のリピートを挟む異種の（例えば、ヒト）配列）による置き換えを含むことができる。異種のリピート伸長配列および／または隣接配列は、天然に存在するゲノム配列（例えば、天然に存在するヒトゲノム配列）であってよい。具体例として、内因性第１エクソン（例えば、エクソン１Ａおよび／または１Ｂ）および内因性非ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座またはその一部のＡＴＧ開始コドンの間にわたる（および必要に応じてその少なくとも一部を包含する）非翻訳および／または非コード配列は、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列で、および必要に応じて隣接オルソログヒトＣ９ＯＲＦ７２配列と一緒に置き換えることができる。例えば、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される配列は、５’から３’にかけて、第１の異種のヘキサヌクレオチド隣接配列、配列番号１に示すヘキサヌクレオチドの複数のリピート、および第２の異種のヘキサヌクレオチド隣接配列を含むことができる。
一例では、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン１Ａおよび／またはエクソン１Ｂの全てまたは一部にわたる（および、必要に応じて包含する）異種のヒトＣ９ＯＲＦ７２配列が、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される。例えば、第１の異種のヘキサヌクレオチド隣接配列は、配列番号４６に示す配列またはその一部を含むことができ、および／または、第２の異種のヘキサヌクレオチド隣接配列は、配列番号４７に示す配列またはその一部を含むことができる。したがって、一部の例では、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が挿入される内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座は、配列番号４６および／または配列番号４７に示す配列を含むヒト配列を含むことができる。
具体例では、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座は、マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の非コード配列の一部の、マウスＣ９ｏｒｆ７２プロモーターおよび／またはヒト調節エレメント（例えば、ヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子のエクソン１Ａおよび／または１Ｂに見出すことができるもの）と作動可能に連結される異種のヒトヘキサヌクレオチドリピート伸長配列による置き換えを含む。各々あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００９４２６７号およびＷＯ２０１８／０６４６００を参照。内因性非ヒトＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座への挿入のために、異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１に示すヘキサヌクレオチド配列の複数（すなわち、少なくとも２つの事例（リピート））を含むことができ、ヒト第９染色体の読取り枠７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）またはその一部の非コードエクソン１Ａおよび１Ｂにわたる（および必要に応じて含む）ゲノム核酸配列と同一であるかまたは実質的に同一であってよい。
必要に応じて、ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座は、他のエレメントを含むことができる。そのようなエレメントの例は、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位または他のエレメントを含むことができる。あるいは、遺伝子座は、他のエレメントが欠失してもよい（例えば、選択マーカーまたは選択カセットが欠失してもよい）。適するレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書の他の場所で開示される。適する選択マーカーの例には、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）が含まれる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、ＦｌｐおよびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の１つの例はＣｒｅｉであり、そこでは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンは、イントロンによって分離されており、原核細胞におけるその発現を防止する。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するために、核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象のための基質としての役割をすることができるヌクレオチド配列を含む。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘならびにｌｏｘ部位、例えばｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２およびｌｏｘ５１７１が含まれる。
レポーター遺伝子または選択カセットなどの他のエレメントは、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれた自己欠失カセットであってよい。例えば、その各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照。一例として、自己欠失カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されているＣｒｅｉ遺伝子（Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含み、それらはイントロンによって分離される）、およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されているネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。Ｐｒｍ１プロモーターを用いることによって、自己欠失カセットは、Ｆ０動物の雄生殖細胞において特異的に欠失させることができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされている細胞において活性であるプロモーターに作動可能に連結させることができる。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。別の具体例として、自己欠失選択カセットは、１つまたは複数のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンプロモーターおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結されているハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、続いてポリアデニル化シグナル、続いて１つまたは複数のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結されているＣｒｅｉコード配列、続いて別のポリアデニル化シグナルを含むことができ、ここで、カセット全体は、ｌｏｘＰ部位によって挟まれている。
遺伝子座は、条件的対立遺伝子であってもよい。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載の通り、条件的対立遺伝子は多官能性対立遺伝子であってよい。例えば、条件的対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の作動配列；（ｂ）センスまたはアンチセンス配向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）；（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）；および（ｄ）逆配向の反転モジュールによる条件付き（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび可逆遺伝子トラップ様モジュールを利用する）。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照。条件的対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼに曝露されると組み換えられて、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠いている；および（ｉｉ）センス配向のＮＳＩおよびアンチセンス配向のＣＯＩＮを含有する、条件的対立遺伝子を形成する組換え可能な単位をさらに含むことができる。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照。
Ｃ．内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物
本明細書の他の場所に記載される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入されたヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む動物ゲノム、動物細胞および動物が提供される。一部のゲノム、細胞または動物では、ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、異種の配列であってよい。あるいは、それは、本明細書に開示される方法を使用してその後さらに伸長される内因性の配列であってよい。例えば、本明細書の他の場所に記載される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞および非ヒト動物が提供される。あるいは、ゲノムまたは細胞は、ヒトであってよい（例えば、ヒト誘導多能性幹細胞）。ゲノム、細胞または非ヒト動物は、雄であっても雌であってもよい。ゲノム、細胞または非ヒト動物は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてヘテロ接合性またはホモ接合性であってよい。二倍体生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各組は、特異的遺伝子座の遺伝子型を表す。特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合は、遺伝子型はホモ接合性と記載され、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合性と記載される。非ヒト動物は、その生殖細胞系列ゲノムに、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むことができる。
本明細書で提供される非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、例えば、以下の特徴のうちの１つまたは複数または全てを呈し得る：（ａ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したイントロン配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２転写物の発現の増加；および／または（ｂ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したＲＮＡ病巣の数の増加；および／または（ｃ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したジペプチドリピートタンパク質のレベルの増加を示す。そのようなジペプチドリピートタンパク質は、例えば、ポリ（グリシン－アラニン）、ポリ（グリシン－プロリン）、ポリ（グリシン－アルギニン）、ポリ（アラニン－プロリン）またはポリ（プロリン－アルギニン）ジペプチドリピートタンパク質（例えば、ｐｏｌｙＧＡまたはｐｏｌｙＧＰジペプチドリピートタンパク質）であってよい。
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、任意の非ヒト動物ゲノム、またはヒトＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座に相同またはオルソロガスであるＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座またはゲノム遺伝子座を含む細胞であってよい。ゲノムは、真核細胞に由来することができるか、または細胞は真核細胞であってよく、それは、例えば、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物の細胞およびヒト細胞を含む。用語「動物」は、動物界の任意のメンバー、例えば、哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類および虫を含む。哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物の細胞、齧歯動物細胞、ラット細胞、マウス細胞またはハムスター細胞であってよい。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、家畜（例えば、雌ウシ、去勢ウシなどのウシ属の種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジの種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタの種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、カモなどが含まれる。飼い慣らされた動物および農業動物も含まれる。用語「非ヒト」は、ヒトを除外する。
また、細胞は、任意の型の未分化または分化状態であってもよい。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞もしくはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってもよい。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせ得る未分化細胞を含み、多能性細胞は、１種よりも多くの分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ細胞またはＥＳ様細胞であってよい。ＥＳ細胞は、胚に導入されると発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な胚由来全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から引き出すことができ、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれの細胞にも分化させることができる。
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってもよい。細胞は、有糸分裂性細胞または有糸分裂不活性細胞、減数分裂性細胞または減数分裂不活性細胞であってもよい。同様に、細胞はまた、初代体細胞であってもよく、または初代体細胞ではない細胞であってもよい。体細胞は、配偶子、生殖細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞を含む。例えば、細胞はニューロン細胞（例えば、ＥＳ細胞由来の運動ニューロン）、脳細胞、皮質細胞または心臓細胞であってよい。
本明細書で提供される好適な細胞は、初代細胞も含む。初代細胞は、生物体、器官、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されておらず不死でもない細胞を含む。初代細胞は、以前に組織培養物中で継代されていないかまたは以前に組織培養物中で継代されているが、組織培養物中で無制限に継代することはできない、生物体、器官、または組織から得られる任意の細胞を含む。
本明細書で提供される他の好適な細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常無制限には増殖しないが、変異または変更に起因して、正常な細胞の老化を逃れ、その代わりに分裂し続け得る多細胞生物に由来する細胞を含む。そのような変異または変更は、天然に起こり得るか、または意図的に誘導され得る。多数の型の不死化細胞が周知である。不死化細胞または初代細胞は、組換え遺伝子またはタンパク質の培養または発現のために一般に使用される細胞を含む。
本明細書で提供される細胞はまた、１細胞期胚（すなわち、受精した卵母細胞または受精卵）も含む。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景（例えば、マウスについては、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはその組合せ）に由来するものであってもよく、新鮮であるか、または凍結されていてもよく、自然交配またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精から誘導されたものであってもよい。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってもよく、または疾患を有するか、もしくは変異体を担持する細胞であってもよい。
本明細書に記載される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載される方法で作製することができる。用語「動物」には、例えば哺乳動物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類およびワームを含む、動物界の任意のメンバーが含まれる。具体例では、非ヒト動物は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、雄牛、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）および家畜（例えば、雌ウシおよび去勢ウシなどのウシ属の種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジの種；ならびにブタおよびイノシシなどのブタの種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、七面鳥、ダチョウ、ガチョウ、およびカモが含まれる。飼い慣らされた動物および農業動物も含まれる。用語「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。好ましい非ヒト動物には、例えば、齧歯動物、例えばマウスおよびラットが含まれる。
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景に由来するものであってもよい。例えば、好適なマウスは、１２９株、Ｃ５７ＢＬ／６株、１２９とＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ株、またはＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ株に由来するものであってもよい。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９年）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ、１０巻：８３６頁を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ，Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。適切なマウスはまた、上述の１２９系統および上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）に由来してよい。同様に、適切なマウスは、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来してよい。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含めた任意のラット系統に由来してよい。ラットはまた、上記の２種またはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統から得ることもできる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来してよい。ＡＣＩラット系統は、黒色アグーチを有し、腹部および足が白色であり、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた種々の供給源から入手可能である。いくつかの適切なラットは、近交系ラット系統に由来してよい。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
ＩＶ．内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列をそれらのゲノムに含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞を作製する方法
本明細書の他の場所に開示される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入されたヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む動物ゲノム、動物細胞または動物を作製する様々な方法が提供される。同様に、本明細書の他の場所に開示される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞または非ヒト動物を作製する様々な方法が提供される。
遺伝子改変生物を産生するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変非ヒト動物を作製するのに好適である。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｏら（２００９年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ４２巻：１９．１１：１９．１１．１～１９．１１．２２頁およびＧａｍａ Ｓｏｓａら（２０１０年）Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ． ２１４巻（２～３号）：９１～１０９頁を参照されたい。例えば、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および（４）宿主胚を代理母に埋め込み、懐胎させるステップを含んでもよい。例えば、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物を作製する方法は、（１）内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むように多能性細胞のゲノムを改変するステップ；（２）内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；（３）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および（４）宿主胚を代理母を懐胎させるステップを含んでもよい。ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの任意の期に宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を通して遺伝子改変を伝えることが可能である子孫を次に生成することができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，７５４号を参照。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を、胚盤胞期までインキュベートした後、代理母に埋め込み、懐胎させて、Ｆ０非ヒト動物を作製することができる。次いで、代理母は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むＦ０世代の非ヒト動物を産むことができる。
この方法は、改変された標的ゲノムＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含んでもよい。種々の方法を使用して、標的化遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むように１細胞期胚のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変された胚を選択すること；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母に埋め込み、懐胎させることを含んでもよい。あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作製する方法は、（１）多能性細胞を改変するための上記の方法を使用して内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むように１細胞期胚のゲノムを改変すること；（２）遺伝子改変された胚を選択すること；および（３）遺伝子改変された胚を、代理母において懐胎させることを含んでもよい。生殖細胞系列を介して遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
核移植技術を使用して、非ヒト哺乳動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するか、または除核された卵母細胞を提供するステップ；（２）除核された卵母細胞と混合しようとするドナー細胞または核を単離または提供するステップ；（３）この細胞または核を、除核された卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成させるステップ；（４）再構成された細胞を、動物の子宮に埋め込んで、胚を形成させるステップ；および（５）胚を発生させるステップを含んでもよい。そのような方法では、卵母細胞は、一般には死んだ動物から回収されるが、それらを生きている動物の卵管および／または卵巣から単離することもできる。卵母細胞を、除核前に様々な周知の媒体中で成熟させることができる。卵母細胞の除核を、いくつかの周知の様式で実施することができる。再構成された細胞を形成するための除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射によるものであってもよい。接触／融合平面をわたるＤＣ電気パルスの適用（電気融合）によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスを用いて、融合を誘導することができる。核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、間、および／または後の電気的および／または非電気的手段によって、再構成された細胞を活性化することができる。活性化法としては、電気パルス、化学誘導性ショック、精子による貫通、卵母細胞中の二価陽イオンレベルの増大、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の低減（キナーゼ阻害剤を手段とする）が挙げられる。活性化された再構成された細胞、または胚を、周知の培地中で培養した後、動物の子宮に移すことができる。例えば、それぞれが、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
本明細書に提供される様々な方法は、遺伝子改変されたＦ０動物の細胞が内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成を可能にする。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を有するＦ０動物内の細胞数は変化することが認識される。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による、対応する生物に由来する桑実胚前期胚（例えば、８細胞期マウス胚）へのドナーＥＳ細胞の導入により、Ｆ０動物のより高いパーセンテージの細胞集団が標的化遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を含む細胞を含むようになる。例えば、非ヒトＦ０動物の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の細胞寄与が、標的化改変を有する細胞集団を含んでもよい。
遺伝子改変Ｆ０動物の細胞は、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてヘテロ接合性であってよいか、または内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入される異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてホモ接合性であってもよい。
Ｖ．内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列をそれらのゲノムに含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞を使用する方法
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列と関連した疾患または状態の処置のための治療薬候補を識別または評価するための、本明細書の他の場所に開示される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入されたヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む動物細胞または動物を使用した様々な方法が提供される。同様に、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列と関連した疾患または状態の処置のための治療薬候補を識別または評価するための、本明細書の他の場所に開示される、内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物を使用した様々な方法が提供される。
そのような方法は、例えば、非ヒト動物細胞または非ヒト動物に候補薬剤を投与すること、候補薬剤が疾患または状態と関連した１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼすかどうか決定するために１つまたは複数のアッセイを実行すること、および候補薬剤が疾患または状態と関連した１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼす場合、それを治療薬候補として識別することを含むことができる。
疾患または状態は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のリピート伸長に関連した神経変性障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または前頭側頭骨認知症（ＦＴＤ）であってよい。
任意の候補薬剤を試験することができる。そのような候補は、例えば、ｓｉＲＮＡ、抗体もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｇＲＮＡなどの大きな分子、または小さい分子を含むことができた。候補薬剤は、任意の好適な経路で任意の手段によって非ヒト動物または非ヒト動物細胞に投与することができる。
疾患または状態に関連した徴候または症状を測定する任意のアッセイを使用することができる。第１の例として、徴候または症状は、イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ転写物の発現であってよい。イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ転写物の発現を測定するアッセイの例は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のエクソン１Ａと１Ｂまたはエクソン１Ｂと２の間のイントロン領域の中でハイブリダイズするプライマーおよびプローブを使用した定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）である。イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２転写物の発現の増加は疾患病状（例えば、ＡＬＳ患者で）と関連し、本明細書に記載される細胞で観察されるので、イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２転写物の発現を減少させる候補薬剤は治療薬候補である可能性がある。
第２の例として、徴候または症状は、Ｃ９ｏｒｆ７２センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物を含むＲＮＡ病巣（例えば、核小体病巣）の存在であってよい。そのようなＲＮＡ病巣は、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって測定することができる。センスまたはアンチセンスＣ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡを含む細胞質および／または核病巣（例えば、核小体）の増加は疾患病状（例えば、ＡＬＳ患者で）と関連し、本明細書に記載される細胞で観察されるので、ＲＮＡ病巣の存在を減少させる候補薬剤は治療薬候補である可能性がある。
さらなる別の例として、徴候または症状は、ジペプチドリピートタンパク質、例えば、ポリ（グリシン－アラニン）、ポリ（グリシン－プロリン）、ポリ（グリシン－アルギニン）、ポリ（アラニン－プロリン）またはポリ（プロリン－アルギニン）ジペプチドリピートタンパク質の存在または蓄積であってよい。例えば、そのようなジペプチドリピートタンパク質は、ｐｏｌｙＧＡジペプチドリピートタンパク質またはｐｏｌｙＧＰジペプチドリピートタンパク質であってよい。ジペプチドリピートタンパク質の存在または蓄積は、例えば、免疫組織化学、免疫蛍光法またはウエスタンスロットブロットによって測定することができる。ＲＡＮ翻訳生成物（例えば、ジペプチドリピートタンパク質）の蓄積は疾患病状（例えば、ＡＬＳ患者で）と関連し、本明細書に記載される細胞で観察されるので、ジペプチドリピートの存在を減少させる候補薬剤は治療薬候補である可能性がある。
候補薬剤は非ヒト動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することができ、１つまたは複数のアッセイを非ヒト動物で実行することができる。あるいは、候補薬剤は非ヒト動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与することができ、候補薬剤の投与の後に非ヒト動物から単離される細胞において１つまたは複数のアッセイをｉｎ ｖｉｔｒｏで実行することができる。あるいは、候補薬剤は細胞（例えば、非ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロン）にｉｎ ｖｉｔｒｏ投与することができ、細胞においてアッセイをｉｎ ｖｉｔｒｏで実行することができる。そのような細胞は、例えば、胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞または心臓細胞であってよい。
上文または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。違う時間に受託番号に異なるバージョンの配列が関連付けられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関して実際の出願日または優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り本出願の有効な出願日時点で直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明を明瞭さおよび理解のために図表および例によって少し詳細に記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲内で実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）３’末端まで進む標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいかなる言及にも相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に（すなわち、各線の左から右に）カルボキシ末端まで進む標準の慣習に従う。
（実施例１）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロン死を引き起こして麻痺につながる、進行性の神経変性障害である。米国では毎年５，０００人がＡＬＳと診断される。疾患の１０パーセントは家族性であり、このカテゴリーの中で最も一般的な原因はＣ９ＯＲＦ７２遺伝子座におけるＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）ヘキサヌクレオチドリピート伸長である。健康な個人は３０未満のリピートを一般的に有し、罹患した患者は１０００より多いコピー数のリピートをしばしば有する。この長いひと続きのリピートがどのように疾患を引き起こすかという正確な機構は、有益な動物モデルがないためにまだ解明されていない。ヘキサヌクレオチドリピート配列中の高いＧＣ含有量は、リピートを有するＤＮＡ断片を合成すること、ならびに微生物でリピートを維持することを困難にする。したがって、トランスジェニック動物を生成するために標的化ベクターなどの材料を調製することは、非常に難しい。これは、Ｃ９ＯＲＦ７２リピート伸長型のＡＬＳのための有益な動物モデルが今日までわずかしか利用できない主要な理由の１つであり、より優れた動物モデルへの強い要求がこの分野にある。
標的化ベクターの構築のためのこれらの困難な中間ステップを迂回するために、新規の標的化ベクター生成およびＥＳ細胞標的化よりも、ゲノム中の正しい位置に既に挿入されている比較的より短いヘキサヌクレオチドリピートを伸長させるアプローチをとった。リピート伸長のための出発材料として、マウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の遺伝子座の一部がＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）ヘキサヌクレオチドの９２×リピートを含有するヒト対応物で置き換えられたヘテロ接合ＥＳ細胞クローンを使用した。図１を参照。我々は、この対立遺伝子を以前に開発した。各々あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００９４２６７号およびＷＯ２０１８／０６４６００を参照。
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が哺乳動物細胞染色体に存在する場合、細胞は、相同組換え（ＨＲ）または非相同組換え経路、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または単鎖アニーリング（ＳＳＡ）のいずれかを通してＤＳＢを認識して傷害を修復する。ＨＲでは、傷害を受けた染色分体は、その修復のための鋳型として傷害を受けていない染色分体を利用する。この経路では、ＤＳＢが生じると、ＤＳＢの端は３’鎖切除を含む多くのプロセスを通して改変される。露出した５’一本鎖はＲａｄ５１の複数の分子によってコーティングされ、次に、Ｒａｄ５１フィラメントはゲノム中の相同配列の検索を開始する。Ｒａｄ５１フィラメントは、露出した５’一本鎖が相同性を有する二本鎖ＤＮＡの中にそれ自身を挿入することができる。侵入を受けた５’鎖は、Ｒａｄ５１フィラメントが入るまさしくその配列を使用して修復を開始する。Ｒａｄ５１フィラメントが相同配列を見出す精度は、正しいＤＮＡ配列を保存する鍵である。リピートを伸長させるための我々のアプローチは、露出した５’鎖が反復配列だけを含有するようにヘキサヌクレオチドリピートの近傍にＤＳＢを導入することによって、Ｒａｄ５１フィラメントが間違った位置に入ることができ、Ｒａｄ５１フィラメントによる相同性検索をミスリードすることができ、リピートの伸長または収縮につながるという仮説に基づいた。図２を参照。
具体的には、本明細書で使用したアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用してヘキサヌクレオチドリピートの末端の近傍にＤＳＢを導入することによって、ヒト化マウス胚性幹細胞においてＣ９ｏｒｆ７２のイントロン１で既存のＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）ヘキサヌクレオチドリピートを伸長させることであった。切除の後に５’一本鎖で反復配列を露出させるように、ヘキサヌクレオチドリピートの近傍にできるだけ接近していくつかのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した。図３および表４を参照。
目標は、リピートのできるだけ近傍で、および高い切断効率で切断するｇＲＮＡを得ることであった。ヒト化９２×リピート含有対立遺伝子と同じ配列を含有するプラスミド（８０２８ Ｓｔｖｅｃ）を使用して、ＤＮＡ切断効率をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。最も高い切断効率を有するｇＲＮＡを、リピートの５’側および３’側から選択した。これらは、５’ｇＲＮＡ－１および３’ｇＲＮＡ－２であった。図４を参照。
第１の実験では、ＳｐＣａｓ９（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびｇＲＮＡを、ＲＮＡおよびタンパク質複合体（ＲＮＰ）としてエレクトロポレーションによりＣ９ｏｒｆ７２ヒト化３０×リピート含有ＥＳ細胞の中に導入した。プライマー－ＰＣＲは正確な配列情報を与えず、約９０×より多いリピートはサンガーシークエンシングによって配列決定するには長すぎるので、３０×リピートを伸長させることによってリピート領域周囲のＤＮＡ配列およびリピートの正確な数を特徴付けるために、３０×リピート対立遺伝子を使用したこの実験を実行した。
５’ｇＲＮＡ－１および３’ｇＲＮＡ－２をそれぞれ使用して、リピートの５’側に単一のＤＳＢを、またはリピートの３’側に単一のＤＳＢを導入する試験をした。図５を参照。Ｃ９ｏｒｆ７２が部分的にヒト化され、３０×ＧＧＧＧＣＣリピートが挿入されたマウスＥＳ細胞を、ＶＧ ＥＳ培地で増殖させた。細胞は、エレクトロポレーションによってＣａｓ９およびｇＲＮＡ ＲＮＰを受け取った。ＥＳ細胞コロニーを選び出し、コロニーを９６ウェル培養プレートで増殖させ、ゲノムＤＮＡを分析のために精製した。３０×リピート伸長配列の５’末端の近傍の切断または３０×リピート伸長配列の３’末端の近傍の切断に続くリピートエリアのサイズを評価するために、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の従来型の２プライマーＰＣＲを次に実行した。リピートサイズは、主に２プライマーＰＣＲを使用し、アガロースゲルの上でアンプリコンを流すことによって評価した。伸長したもの（＞３０×）、保持されたもの（約３０×）、収縮したもの（＜３０×）および崩壊したもの（約３×）の各々について２、３のクローンを選び出し、ＧＧＧＧＣＣリピート領域を持つＰＣＲアンプリコンの配列決定をした。アガロースゲル分析から予想された通り、リピート数が変化したことが確認された。クローンのほとんどでは、アガロースゲルの上でリピートサイズが元の３０×と同じであったとしても、Ｃａｓ９処理は１～１５ｂｐの欠失をもたらすことも見出した。結果は、図６Ａ～９Ｂに示す。図６Ａに示すように、５’ｇＲＮＡ－１を使用した５’末端リピートの上流（５’）の二本鎖切断は、３０×から４２×の選択されたクローンにおいてリピート伸長を誘発した。図６Ｂを参照。親の３０×クローンの配列と比較した伸長クローンの配列は、図６Ｃに示す。この実験は、Ｃａｓ９による二本鎖切断が間断なく単純なリピート配列を伸長させることができることを示した。これは、ガイドＲＮＡ標的配列を破壊する可能性がある、二本鎖切断部位での小さな欠失の有無にかかわらず起こり得る。一部のクローンでは、小さな欠失（例えば、１～１６ｂｐ）が観察された。
図７Ａおよび７Ｂに示すように、リピート配列の５’末端の上流の二本鎖切断は、リピート中で間断なく部分的リピート収縮を誘発することもある。同じく、これは、二本鎖切断部位での小さな欠失の有無にかかわらず起こり得る。図７Ａおよび７Ｂに示すクローンは、３０リピートから２０リピートに収縮した。
図８Ａおよび８Ｂに示すように、一部のクローンは、リピート配列の５’末端の上流での切断の後に同じリピート数を保持する。同じく、これは、二本鎖切断部位での小さな欠失の有無にかかわらず起こり得る。
３’ｇＲＮＡ－２を使用してリピートの３’末端の下流（３’）に二本鎖切断を導入したとき、大きな欠失が頻繁に観察された。そのような２つのクローンを、図９Ａおよび９Ｂに示す。１つのクローンでは、１０～２０ｂｐの欠失がリピートの下流に観察され、リピートは３０×から１～３×に収縮した。別のクローンでは、リピートは３０×から１０～２０×に収縮し、リピートの一部および下流の配列（リピートの３’）を含む、＞５００ｂｐの大きな欠失が観察された。
全体として、リピート伸長効率は二本鎖切断の部位に依存することが観察された。リピート配列の５’末端の上流（５’）の二本鎖切断は、リピート配列の３’末端の下流（３’）の二本鎖切断より頻繁にリピート伸長を誘導した。３０×親クローンからのデータの要約を、表５に示す。
次に、９２×リピート含有ＥＳ細胞で同じ物を試験した。ＥＳ細胞でＤＮＡを改変するために、ＳｐＣａｓ９（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびｇＲＮＡを、ＲＮＡおよびタンパク質複合体（ＲＮＰ）としてエレクトロポレーションによりＣ９ｏｒｆ７２ヒト化９２×リピート含有ＥＳ細胞（ＭＡＩＤ８０２９ａ）の中に導入した。ＥＳ細胞コロニーを選び出し、コロニーを９６ウェル培養プレートで増殖させ、ゲノムＤＮＡを分析のために精製した。３つの実験を実行した：（１）リピートの５’側に単一のＤＳＢを導入する；（２）リピートの３’側に単一のＤＳＢを導入する；および（３）リピートの５’および３’側にＤＳＢを導入する。図１０を参照。分析は、従来の２プライマーＰＣＲ（図１１Ａ）、およびＡｍｐｌｉｄｅＸ ＰＣＲ／ＣＥ Ｃ９ｏｒｆ７２キットを使用して、３つのプライマーを使用したプライムＰＣＲを使用して実行した（図１１Ｂ）。プライムＰＣＲの場合、ＥＳ細胞からのゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。３つのプライマーを使用した：リピートの５’外側に位置するプライマー、リピートの３’外側に位置するプライマー、および図１１Ｂに示すようにリピートの内側の反復配列にアニールする第３のプライマー。このＰＣＲ反応は、図１１Ｂに示すように多くの異なるサイズのＰＣＲ生成物を生成する。第３のプライマーはリピートの任意の所与の単位でポリメラーゼ反応をプライミングすることができるので、得られるＰＣＲ生成物の数は基本的にクローンが有するリピートの数である。我々はこれらのＰＣＲ生成物を、蛍光シグナル（プライマーの１つは蛍光標識される）を検出する細管電気泳動にかけた。
内因性Ｃ９ｏｒｆ７２ＥＳ細胞クローンにおける配列番号１に示すヘキサヌクレオチド配列の事例の数を確認するために、ＡｍｐｌｉｄｅＸ ＰＣＲ／ＣＥ Ｃ９ＯＲＦ７２キット（Ａｓｕｒａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って使用した。３×リピートクローン、９２×リピートクローンおよび３０×リピートクローンからの精製されたｍＥＳＣゲノム全ＤＮＡを、対照として使用した。表６のプライマーおよびＡｍｐｌｉｄｅＸ ＰＣＲ／ＣＥ Ｃ９ＯＲＦ７２キットからのリピート特異的プライマーを使用したＰＣＲを、ＡＢＩ ９７００サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で実行した。ＰＯＰ－７ポリマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル（Ｌｏｎｚａ）を使用したＡＢＩ ３５００ｘＬ ＧｅｎｅＳｃａｎで、細管電気泳動によってアンプリコンの大きさを決定した。比較のために２ｌｏｇ ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）分子量マーカーをアガロースゲルにロードし、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でバンドを可視化した。
従来の２プライマーＰＣＲを使用して実証されるように、リピートのいずれかの側にＤＳＢを導入することは、リピートエリアでサイズ変更をもたらした。図１２Ａおよび１２Ｂを参照。各条件についての８８コロニーのうちの１６の結果は、図１２Ａおよび１２Ｂに示す。リピート伸長を確認するためにプライムＰＣＲを使用したさらなる分析のために、最大の伸長を有する５’単一ＤＳＢクローンおよび３’単一ＤＳＢクローンを選択した。プライムＰＣＲは、クローン９２５３Ｄ－Ｂ２（５’単一ＤＳＢ）が１４５のリピートを有すること、およびクローン９２５３Ａ－Ｂ１（３’単一ＤＳＢ）が１３０のリピートおよび９２のリピートを有することを確認した。図１３および１４を参照。図１３は、細管電気泳動からの結果を示す。シグナル強度はＹ軸上にあり、ＰＣＲ生成物のサイズはＸ軸上にある。リードアウトは、ピークの数である。上のパネルは９２×親クローンからのものであり、９２個のピークがある。中央のパネルで１５０個のピークを、下のパネルで１３０個のピークを数えた。下のパネルでは２つの高いピークが観察された。これはおそらく、選び出したＥＳ細胞コロニーが均一なクローンでなかったからである。
同じ実験を再び繰り返し、類似の結果が得られた。図１５を参照。各条件（単一５’ＤＳＢ、単一３’ＤＳＢまたは５’および３’ＤＳＢの両方）について、８８クローンを試験した。リピートでのＤＳＢは、リピートの不安定性を引き起こした。リピートの片側または両側のＤＳＢは、リピート伸長（９２×から約３００×まで）につながった。異なるクローンにおける伸長または収縮の完全な分析は、表７に提供する。ＴＡＱＭＡＮアッセイまたはＡｓｕｒａｇｅｎ ＡｍｐｌｉｄｅＸ ＰＣＲ／ＣＥ Ｃ９ＯＲＦ７２キットによって、完全な収縮が判定された。全体として、リピート伸長効率は親クローンにおける出発リピート長に依存することが観察された。二本鎖切断がリピート配列の５’側の上流かまたはリピート配列の３’側の下流で誘導されたかを問わず、より大きな出発リピート長を有する親クローンでリピート伸長がより頻繁に観察された。
表６を参照。
最大のリピートは、５’および３’ＤＳＢを一緒に導入することによって得られた。単一のＤＳＢを導入することによって得られた最大のリピートは概ね２５０×であり、ここでは３’ｇＲＮＡ部位はなお無傷であって、リピートは伸長可能であった。リピートをさらに伸長させるために、２５０×リピートクローン（ＭＡＩＤ９２５３Ｄ－Ｃ５）で開始し、前記のようにＣａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰの導入を通して３’末端にＤＳＢを導入した。２５０×対立遺伝子を使用して、概ね約６００×のサイズまでリピートをさらに伸長させることができた。図１６Ａおよび１６Ｂと表８を参照。
要約すると、Ｃ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピート配列の端に二本鎖切断を誘導することは、マウスＥＳ細胞でリピート伸長を誘発した。リピート伸長は、二本鎖切断が５’側または３’側に導入されたときに異なる効率で起こった。さらに、出発リピートサイズがより大きかったとき、二本鎖切断によって誘導されたリピート伸長はより頻繁に起こった。ｇＲＮＡ標的配列が無傷である限り、リピートは少なくとも２回伸長させることができ、我々はこの方法でＣ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピート配列を９２×から概ね６００×まで伸長させることができた。
一本鎖切断がリピート伸長を促進するのに十分かどうか、次に評価した。ＥＳ細胞でＤＮＡを改変するために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＳｐＣａｓ９ Ｄ１０ＡおよびｇＲＮＡ（３’ｇＲＮＡ－２）を、ＲＮＡおよびタンパク質複合体（ＲＮＰ）としてエレクトロポレーションによりＣ９ｏｒｆ７２ヒト化９２×リピート含有ＥＳ細胞（ＭＡＩＤ８０２９ａ）の中に導入した。ＥＳ細胞コロニーを選び出し、コロニーを９６ウェル培養プレートで増殖させ、ゲノムＤＮＡを分析のために精製した。分析は、上記のように従来の２プライマーＰＣＲを使用して実行した。実験セットアップは図１７Ａに示し、ＰＣＲ結果は図１７Ｂに示す。二本鎖切断と同様に、リピート領域の３’末端の下流（３’）の一本鎖切断は、リピート伸長を誘発することができた。さらに、二本鎖切断と異なり、一本鎖切断はいかなる大きな欠失も引き起こさなかった（データ示さず）。次に、一本鎖切断の下流（３’）のプライマー（配列番号３６に示すプライマーまたは配列番号１２１に示すプライマーのいずれか）を使用したシークエンシングＰＣＲを実行した。図１７Ｃに示すように、二本鎖切断を形成するためにＣａｓ９ヌクレアーゼを使用して生成された５つのリピート伸長クローンのうちの４つは、ガイドＲＮＡ標的配列および／またはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の中に欠失を有した。これとは対照的に、一本鎖切断を形成するためにＣａｓ９ニッカーゼを使用して生成された８つのリピート伸長クローンのいずれも、ガイドＲＮＡ標的配列にもＰＡＭにも欠失を有していなかった。したがって、ガイドＲＮＡ標的配列は、リピート伸長の第２回に再利用することができた。
二本鎖切断がマウスの１細胞期胚においてリピート伸長を促進することができるかどうか、次に評価した。ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡ（５’ｇＲＮＡ－１）を、ＲＮＡおよびタンパク質複合体（ＲＮＰ）として前核注射によりＣ９ｏｒｆ７２ヒト化９２×リピート含有マウス１細胞期胚の中に導入した。マウスは１細胞期胚から生成し、テールゲノムＤＮＡを収集した。分析は、上記のように従来の２プライマーＰＣＲを使用して実行した。実験セットアップは図１８Ａに示し、ＰＣＲ結果は図１８Ｂに示す。マウスＥＳ細胞と同様に、リピート領域の５’末端の上流（５’）の二本鎖切断は、リピート伸長を誘発することができた。図１８Ｂに示す１つのクローンでは、リピート領域は９２のリピートから概ね１５０のリピートまで伸長した。
（実施例２）
トリヌクレオチドリピート伸長
Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子の遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長は、神経疾患で起こるまさに１つのタイプのリピート伸長である。リピート伸長は他の神経疾患で他の遺伝子で起こることが知られている。これらには、例えば、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート、他のヘキサヌクレオチドリピートおよびドデカヌクレオチドリピートが含まれる。
二本鎖切断によって誘導されるリピート伸長が異なる遺伝子座において異なるリピート配列で起こることができるかどうか、次に試験した。具体的には、Ｃ９ＯＲＦ７２でない第２の標的遺伝子においてトリヌクレオチドリピート配列の伸長を試験した。親のマウスＥＳ細胞クローンは、標的遺伝子にトリヌクレオチド配列の６０リピートを含有した。リピート配列の５’末端の１６塩基対上流（５’）の位置で切断するようにＣａｓ９タンパク質を導くためのガイドＲＮＡを設計し、リピート配列の３’末端の１１塩基対下流（３’）の位置で切断するようにＣａｓ９タンパク質を導くためのガイドＲＮＡを設計した。ＳｐＣａｓ９および５’ｇＲＮＡを、ＲＮＡおよびタンパク質複合体（ＲＮＰ）としてエレクトロポレーションにより６０×リピート含有ＥＳ細胞の中に導入した。分析は、上記のように従来の２プライマーＰＣＲを使用して実行した。ＰＣＲ結果は、図１９に示す。Ｃ９ＯＲＦ７２ヘキサヌクレオチドリピート伸長と同様に、６０×トリヌクレオチドリピート領域の５’末端の上流（５’）の二本鎖切断は、リピート伸長を誘発することができた。図１９に示す１つのクローンでは、リピート領域は６０のリピートから８５のリピートまで伸長した。このことは、二本鎖切断によって誘導されるリピート伸長が、複数の遺伝子の遺伝子座において複数の異なるタイプのリピートで起こり得ることを実証した。
異なる細胞における異なる遺伝子座での、異なる出発リピート数による、異なるＣａｓ９タンパク質（ヌクレアーゼ対ニッカーゼ）を使用した、異なる鎖を標的にする異なるガイドＲＮＡを使用した、異なるＣａｓ９切断部位を使用した、およびリピートからの異なる切断部位距離を使用した、複数の実験からの全ての結果の要約を、表９に示す。
（実施例３）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長を含む運動ニューロンまたは脳組織の分析
マウスにおけるヘキサヌクレオチドリピートのサイズの安定性を、前記の通りＡｍｐｌｉｄｅＸ ＰＣＲ／ＣＥ Ｃ９ＯＲＦ７２キット（Ａｓｕｒａｇｅｎ）を使用して確認する。
野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（対照）または実施例１および２からの遺伝子改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含むマウス胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の中のＲＮＡ転写物を、各々あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００９４２６７号およびＷＯ２０１８／０６４６００に記載される通りに検査した。ＲＮＡ病巣およびジペプチドリピートタンパク質のレベルを、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（対照）または実施例１および２からの遺伝子改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む親の胚性幹細胞に由来するＥＳＭＮにおいて評価した。材料および方法は、下に記載される。
さらに、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（対照）または実施例１および２からの遺伝子改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含むマウス脳組織および親の胚性幹細胞の中のＲＮＡ転写物を、各々あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／００９４２６７号およびＷＯ２０１８／０６４６００に記載される通りに検査する。ＲＮＡ病巣およびジペプチドリピートタンパク質のレベルを、野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（対照）または実施例１および２からの遺伝子改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む親の胚性幹細胞に由来するＥＳＭＮにおいて評価する。材料および方法は、下に記載される。
胚性幹細胞由来の運動ニューロン
実施例１からの胚性幹細胞（ＥＳＣ）を、胚性幹細胞培地（ＥＳＭ；ＤＭＥＭ＋１５％ウシ胎児血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋非必須アミノ酸＋ヌクレオシド＋β－メルカプトエタノール＋ピルビン酸ナトリウム＋ＬＩＦ）で２日間培養し、その間、培地は毎日交換された。トリプシン処理の１時間前に、ＥＳ培地を７ｍＬのＡＤＦＮＫ培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋１０％ノックアウト血清＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋グルタミン＋β－メルカプトエタノール）で置き換えた。ＡＤＦＮＫ培地を吸引し、ＥＳＣを０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡでトリプシン処理をした。ペレット化細胞を１２ｍＬのＡＤＦＮＫに再懸濁し、懸濁液の形で２日間増殖させた。四肢様運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を得るために、レチノイン酸（ＲＡ）、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄアゴニストおよびプルモルファミンを補ったＡＤＦＮＫで、細胞をさらなる４日間培養した。胚性幹細胞由来の運動ニューロン培地（ＥＳＭＮ；Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地＋２％ウマ血清＋Ｂ２７＋グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋β－メルカプトエタノール＋１０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ）で解離した運動ニューロンをプレーティングし、成熟させた。
定量ポリメラーゼ連鎖反応
各試料からの全ＲＮＡを抽出し、様々な領域を挟むプライマーおよび改変されたＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座の領域を検出するプローブを使用して逆転写した。検出可能な領域には、マウスとヒト配列の接合部にわたるもの、ヒト配列だけ、またはマウス配列だけが含まれる。即時利用可能なキットのプローブおよびプライマーを使用して、ＧＡＰＤＨ、ＤＲＯＳＨＡまたはβ２－ミクログロブリンのｑＰＣＲを実行した。
具体的には、野生型（ＷＴ）Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（対照）または遺伝子改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）からＲＮＡを単離した。他の実験では、野生型（ＷＴ）Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座（対照）または遺伝子改変Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含むマウスから単離した親の胚性幹（ＥＳ）細胞または全脳からもＲＮＡを単離する。
製造業者のプロトコール（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡミニプレッププラスキットを使用して、全ＲＮＡを単離した。製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＴｕｒｂｏ ＤＮＡフリーキットを使用して全ＲＮＡをＤＮアーゼで処理し、２０ｎｇ／μＬに希釈した。ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプローブＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）による一段階反応で、逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲを実行した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、２μＬのＲＮＡならびにＲＴ－ＰＣＲＭａｓｔｅｒミックス、ＲＯＸ色素、ＲＴミックスおよび２０×遺伝子特異的プライマー－プローブミックスを含有する８μＬ混合物を含有して、最終容量を１０μＬにした。
特に明記しない限り、最終のプライマーおよびプローブ濃度はそれぞれ０．５μＭおよび０．２５μＭであった。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実行した。ＰＣＲ反応は、光学３８４ウェルプレートにおいて、４５℃で１０分間、続いて９５℃で１０分間、および９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間の２段階サイクルを４５サイクルのＲＴステップにより４リピートで実行した。各分析（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ）で使用したプライマーおよびプローブの配列および配列番号を、表１０に提供する。
ウエスタンブロット分析
分化した胚様体（ＥＢ）を収集し、ＳＤＳ試料緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール、６０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８、ブロモフェノールブルー）中でホモジナイズした。ＲＣ ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、タンパク質抽出物を定量化した。抽出物（１０μｇ）を４～２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にかけ、ｉＢＬＯＴトランスファーユニット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してニトロセルロース膜に移した。イムノブロットは、Ｃ９ＯＲＦ７２およびＧＡＰＤＨに対する一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で探索した。結合した抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｂｃａｍ）とコンジュゲートさせた二次抗体とのインキュベーションと、続くＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した化学発光によって検出した。シグナルは、Ｆｕｌｌ Ｓｐｅｅｄ Ｂｌｕｅ感受性医用Ｘ線フィルム（Ｅｗｅｎ Ｐａｒｋｅｒ ＸＲａｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用したオートラジオグラフィーによって検出した。相対的タンパク質レベルは、ＩｍａｇｅＪを使用して計算した。データ示さず。
センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写生成物の検出のための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
前記のように生成される胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）の中の、配列番号１に示すヘキサヌクレオチドリピート配列から転写されるＲＮＡの位置を決定するために、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用した。簡潔には、ＥＳＭＮを４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライドシステム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させ、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。次に、ＲＮＡ転写生成物の検出のために、下記のように細胞をジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）ＰＢＳ／０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃ＢＰ１５１）で透過性化し、ＤＥＰＣ－ＰＢＳで洗浄し、ブロックし、ＬＮＡオリゴヌクレオチドで染色した。染色の後、スライドを適当な蛍光色素でその後インキュベートし、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でマウントし、共焦顕微鏡検査を使用して可視化した。
ＬＮＡプローブのために、５０％ホルムアミド（ＩＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃ＩＢ７２０２０）、ＤＥＰＣ ２×ＳＳＣ［３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］、１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｄ８９６０）およびＤＥＰＣ ５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）からなる緩衝液でスライドを６６℃で３０分間前ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション緩衝液を次に排水し、ハイブリダイゼーション緩衝液中の４０ｎＭ ＬＮＡプローブミックスの４００μＬをスライドの各々に加え、６６℃の暗所で３時間インキュベートした（ＬＮＡプローブのために）。ＬＮＡプローブとインキュベートしたスライドは、室温のＤＥＰＣ ２×ＳＳＣ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＢＰ３３７）で一度、および６５℃のＤＥＰＣ ０．１×ＳＳＣで３回洗い落とした。スライドは、その後１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）とインキュベートした。
別の実験では、５０％ホルムアミド（ＩＢＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃ＩＢ７２０２０）、ＤＥＰＣ ２×ＳＳＣ［３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］、１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃Ｄ８９６０）およびＤＥＰＣ ５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）からなる緩衝液で、スライドを６６℃（ＬＮＡプローブの場合）または５５℃（ＤＮＡプローブの場合）で３０分間前ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション緩衝液を次に排水し、ハイブリダイゼーション緩衝液中の２００ｎｇ／ｍＬのＤＮＡプローブミックスの４００μＬをスライドの各々に加え、５５℃の暗所で３時間インキュベートする。ＤＮＡプローブとインキュベートしたスライドは、２×ＳＳＣ中の４０％ホルムアミドで３回洗浄し、ＰＢＳ中で短時間１回洗浄する。スライドは、その後１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）とインキュベートする。
この実施例で使用したＬＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの配列および配列番号、ならびにプローブのハイブリダイゼーション条件は、下の表１１で提供される。ロック核酸（ＬＮＡ）は、リボース部分が２’酸素および４’炭素を接続する追加の橋で改変される核酸類似体である。
ジペプチドリピートタンパク質生成物の検出（免疫蛍光法およびウエスタンスロットブロット）
前記のように生成される胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）におけるジペプチドリピートタンパク質生成を評価するために、免疫蛍光法を使用した。簡潔には、ＥＳＭＮを４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩチャンバースライドシステム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させ、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。次に、ＲＡＮ翻訳生成物の検出のために、下記のように細胞をジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）ＰＢＳ／０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃ＢＰ１５１）で透過性化し、ＤＥＰＣ－ＰＢＳで洗浄し、ブロックし、抗ｐｏｌｙＧＡ抗体で染色した。染色の後、スライドを適当な蛍光色素でその後インキュベートし、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でマウントし、共焦顕微鏡検査を使用して可視化した。
透過性化の後、スライドを０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を有するトリス緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（ＴＢＳ－Ｔ）に希釈した５％正常ロバ血清でブロックした。５％正常ロバを有するＴＢＳ－Ｔに希釈したポリＧＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対する一次抗体と、スライドを４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、スライドはＡｌｅｘａ４８８または５５５（ＴＢＳ－Ｔ中に１：１０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）に結合させた種特異的二次抗体と室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でマウントし、共焦顕微鏡検査を使用して可視化した。
スロットブロットアッセイのために、分化した胚様体（ＥＢ）を収集し、ＳＤＳ試料緩衝液（２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％β－メルカプトエタノール、６０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８、ブロモフェノールブルー）中でホモジナイズした。ＲＣ ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、タンパク質抽出物を定量化した。０μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇまたは２０μｇを含有する溶解物を、真空下でＢｉｏ－スロット４８ウェル微量濾過システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によりニトロセルロース膜の上に固定化した。膜をＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ポリ（ＧＰ）（１：５，０００、Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）およびポリＧＡ（１：５０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対する抗体でブロットした。膜をＨＲＰコンジュゲート二次抗体とインキュベートした後、ＥＣＬプラスウエスタンブロット検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ）によってバンドを可視化した。
結果
Ｇ４Ｃ２ヘキサヌクレオチド配列の３リピート、９２リピート、２５０リピート、３００リピート、５００リピートまたは６００リピートを有するヒト化Ｃ９ｏｒｆ７２対立遺伝子の対立遺伝子系列を含む胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を試験した。図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｇおよび図２０Ｈに示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座にヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むＥＳＭＮは、イントロン１配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ転写物の発現の増加を示した。さらに、より大きなＧ４Ｃ２リピート伸長は、エクソン１Ａの使用が増加し、エクソン１Ｂの使用が減少した。それぞれ図２０Ａと２０Ｂ、およびそれぞれ図２０Ｅと２０Ｆを参照。Ｇ４Ｃ２リピート伸長を含有するＥＳＭＮは、核および細胞質センスおよびアンチセンスＣ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ病巣も含有した（データ示さず）。センスＧ４Ｃ２病巣はより大きく、核仁に分布していた（データ示さず）。３００を超えるリピート伸長を有するＥＳＭＮにおける核小体でのＲＮＡ病巣の局在は、ＡＬＳ患者由来の細胞において病理所見を再生させる。さらに、Ｇ４Ｃ２ヘキサヌクレオチド配列のリピート数の増加は、ヘキサヌクレオチドリピート配列の転写物から翻訳された（ＲＡＮ翻訳、非ＡＵＧ機構を通した）ジペプチドリピートタンパク質（ｐｏｌｙＧＡおよびｐｏｌｙＧＰ）の増加の存在と直接的に相関した。例えば、図２１を参照。要約すると、対立遺伝子系列ＥＳ細胞に由来する運動ニューロンは、ＡＬＳ疾患の分子的特質（センスおよびアンチセンスリピートＲＮＡ病巣、核小体に局在化するリピートＲＮＡ病巣、ジペプチドリピートタンパク質の５つの形のうちの少なくとも２つ、ならびにイントロン含有転写物の蓄積の増加）を再現し、神経変性疾患の疾患モデルとしての本明細書に開示される非ヒト動物の使用を支持する。
表１０のアッセイＣ、Ｂ、Ｆ、Ｈ、ＥおよびＤのための定量ＰＣＲ反応は、２種類のＥＳＭＮで繰り返された：軸下様運動ニューロン（ＭＮ）および四肢様運動ニューロン（ＭＮ）。軸下様ＭＮは、モデルで軸下ＭＮに神経を分布する。軸下ＭＮによって神経が分布する筋肉の例には、内肋間筋、横隔膜および腹壁の筋肉が含まれる。四肢様ＭＮは、運動側柱から現れ、前肢および後肢におけるそれら（前脛骨筋、腓腹筋および臀筋）などの遠位四肢筋肉に神経を分布するものである。主に軸下ＭＮは、レチノイン酸（ＲＡ）およびソニックヘッジホッグアゴニスト（ＳＡＧ）を加えるプロトコールによって生成される。四肢様ＭＮは、我々が四肢様ＭＮを生成することができるＲＡおよびＳＡＧに加えて、１μＭプルモルファミンを加えることによって生成することができる。
Ｇ４Ｃ２ヘキサヌクレオチド配列の３リピート、９２リピート、３００リピート、５００リピートまたは６００リピートを有するヒト化Ｃ９ｏｒｆ７２対立遺伝子の対立遺伝子系列を含む運動ニューロンを試験した。図２３Ａおよび図２３Ｂに示すように、より大きなＧ４Ｃ２リピート伸長は、エクソン１Ａの使用が増加し、エクソン１Ｂの使用が減少した。図２３Ｃおよび図２３Ｄに示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座にヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むＥＳＭＮは、イントロン１配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ転写物の発現の増加を示した。図２３Ｅに示すように、より大きなＧ４Ｃ２リピート伸長は、スプライスされていない前駆体の発現が増加した。図２３Ｆに示すように、スプライシングされたＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡの発現は、リピートのサイズによりあまり変化しなかった。
（実施例４）
Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長を含むマウスの作製
実施例１に記載される３００×リピートＥＳ細胞クローンを使用したＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を使用して、Ｆ０マウスを作製した。例えば、各々はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５７６，２５９号；米国特許第７，６５９，４４２号；米国特許第７，２９４，７５４号；米国特許出願公開第２００８／００７８０００号；およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２５（１）：９１－９９を参照。ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法では、標的化マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、前桑実胚期胚、例えば８細胞期胚の中へのレーザー支援注射を通して注射され、それは完全にＥＳ細胞に由来するＦ０世代マウスを効率的にもたらす。
Ｃ９ｏｒｆ７２ ３００×リピートマウス（すなわち、Ｇ４Ｃ２ヘキサヌクレオチド配列の３００リピートを有するヒト化Ｃ９ｏｒｆ７２対立遺伝子）および対照Ｃ９ｏｒｆ７２ ３×リピートマウス（すなわち、Ｇ４Ｃ２ヘキサヌクレオチド配列の３リピートを有するヒト化Ｃ９ｏｒｆ７２対立遺伝子）からの脳幹および脊髄試料からのＲＮＡ転写物を、実施例３の通りに試験した。ＲＮＡ病巣およびジペプチドリピートタンパク質レベルは、実施例３の通りＣ９ｏｒｆ７２ ３００×リピートマウスからの脳幹および脊髄試料で評価した。図２２Ｂに示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２ ３００×リピートマウスからの脳幹および脊髄試料は、イントロン１配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ転写物の発現の増加を示した。さらに、脊髄試料（すなわち、Ｌ４／Ｌ５腰髄運動ニューロン）は、核および細胞質センスおよびアンチセンスＣ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ病巣について試験され、それを含有することが示された（データ示さず）。同様に、これらの試料では、ヘキサヌクレオチドリピート配列の転写物から翻訳された（ＲＡＮ翻訳、非ＡＵＧ機構を通して）ジペプチドリピートタンパク質（ｐｏｌｙＧＡ）の存在が増加した（データ示さず）。
同様に、Ｇ４Ｃ２ヘキサヌクレオチド配列の３リピート、９２リピート、３００リピート、５００リピートまたは６００リピートを有するヒト化Ｃ９ｏｒｆ７２対立遺伝子の対立遺伝子系列を含む胚性幹細胞由来の運動ニューロン（ＥＳＭＮ）を試験した。図２２Ａに示すように、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座にヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むＥＳＭＮは、イントロン１配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２ ｍＲＮＡ転写物の発現の増加を示した。Ｇ４Ｃ２リピート伸長を含有するＥＳＭＮは、核および細胞質センスおよびアンチセンスＣ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ病巣も含有し、ヘキサヌクレオチドリピート配列の転写物から翻訳された（ＲＡＮ翻訳、非ＡＵＧ機構を通して）ジペプチドリピートタンパク質（ｐｏｌｙＧＡ）の存在が増加した（データ示さず）。
公知の方法を使用して、ＧＧＧＧＣＣ（配列番号１）ヘキサヌクレオチドの概ね５００リピートまたは概ね６００リピートを含有するヒト対応物で置き換えられたマウスＣ９ｏｒｆ７２遺伝子座を有するＦ０マウスも、生成された。

Claims (25)

  1. 内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列をそのゲノムに含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞であって、前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  2. 前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約３００リピートを含む、請求項１に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  3. 前記ヘキサヌクレオチドリピート伸長が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約５００リピートを含む、請求項２に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  4. 前記ヘキサヌクレオチドリピート伸長が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の少なくとも約６００リピートを含む、請求項３に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  5. 前記リピートが前記異種リピート伸長配列の中で連続している、請求項１から４のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  6. 前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座の第１の非コード内因性エクソンと第２エクソンの間に位置する、請求項１から５のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  7. 前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座がヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  8. 前記ヒトＣ９ＯＲＦ７２ヌクレオチド配列が配列番号４６および／または配列番号４７を含む、請求項７に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  9. 前記非ヒト動物がげっ歯動物であるかまたは前記非ヒト動物細胞がげっ歯動物細胞であ
    る、請求項１から８のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  10. 前記げっ歯動物がラットもしくはマウスであるかまたは前記非ヒト動物細胞がラット細胞もしくはマウス細胞である、請求項９に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  11. 前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列についてヘテロ接合性である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  12. （ａ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したイントロン配列を保持するＣ９ｏｒｆ７２転写物の発現の増加；および／または
    （ｂ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したＲＮＡ病巣の数の増加；および／または
    （ｃ）野生型Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座を含む対照非ヒト動物または対照非ヒト動物細胞と比較したジペプチドリピートタンパク質のレベルの増加
    を示す、請求項１から１１のいずれか一項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  13. 胚性幹細胞、胚性幹細胞由来の運動ニューロン、脳細胞、皮質細胞、ニューロン細胞、筋細胞、心臓細胞または胚細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
  14. １細胞期の胚である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
  15. ｉｎ ｖｉｔｒｏにある、請求項１から１４のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
  16. ｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項１から１４のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。
  17. その生殖細胞系列ゲノムに、前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  18. 異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む非ヒト動物Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子を含む核酸であって、前記異種のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列は配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、核酸。
  19. Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座のヘキサヌクレオチドリピート伸長配列と関連した疾患または状態の処置のための治療薬候補を評価する方法であって、
    （ａ）請求項１から１２および１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物または請求項
    １から１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞に候補薬剤を投与するステップと；
    （ｂ）前記候補薬剤が前記疾患または状態と関連した１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼすかどうか決定するために１つまたは複数のアッセイを実行するステップと；
    （ｃ）前記疾患または状態と関連した前記１つまたは複数の徴候または症状に影響を及ぼす前記候補薬剤を治療薬候補として識別するステップと
    を含む方法。
  20. 前記候補薬剤が前記非ヒト動物にｉｎ ｖｉｖｏ投与され、前記候補薬剤の投与の後に前記非ヒト動物から単離される細胞において前記１つまたは複数のアッセイがｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記候補薬剤が非ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンにｉｎ ｖｉｔｒｏ投与される、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記１つまたは複数のアッセイが、イントロン含有Ｃ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡ転写物を検出するための定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記１つまたは複数のアッセイがＣ９ｏｒｆ７２センスまたはアンチセンスＲＮＡ転写物を含むＲＮＡ病巣を測定することを含み、必要に応じて前記ＲＮＡ病巣は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって測定される、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記１つまたは複数のアッセイがジペプチドリピートタンパク質の蓄積を測定することを含み、必要に応じて前記ジペプチドリピートタンパク質はｐｏｌｙＧＡジペプチドリピートタンパク質またはｐｏｌｙＧＰジペプチドリピートタンパク質であり、必要に応じてジペプチドリピートタンパク質の前記蓄積は免疫組織化学によって測定される、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 請求項１から１２および１７のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、前記方法が、
    （Ｉ）（ａ）内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むように非ヒト動物多能性細胞のゲノムを改変するステップであって、前記異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、ステップ；
    （ｂ）前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された前記異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物多能性細胞を同定または選択するステップ；
    （ｃ）前記遺伝子改変された非ヒト動物多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および
    （ｄ）前記非ヒト動物宿主胚を非ヒト動物代理母に懐胎させるステップ
    を含むか、または
    （ＩＩ）（ａ）内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含むように非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを改変するステップであって、前記異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列が、配列番号１で示すヘキサヌクレオチド配列の約１００より多いリピートを含む、ステップ；
    （ｂ）前記内因性Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座に挿入された前記異種ヘキサヌクレオチドリピート伸長配列を含む遺伝子改変された胚を選択するステップ；および
    （ｃ）前記非ヒト動物宿主胚を、非ヒト動物代理母に懐胎させるステップ
    を含む、方法。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3732291A1 (en) 2018-12-20 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
CN117561334A (zh) 2021-06-04 2024-02-13 阿尔尼拉姆医药品有限公司 人染色体9开放阅读框72（C9ORF72）iRNA药剂组合物和其使用方法
CN114736931A (zh) * 2022-01-18 2022-07-12 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠Abhd12基因的方法和应用
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
CN114958852A (zh) * 2022-06-09 2022-08-30 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AU2002228841C1 (en) 2000-12-07 2006-11-23 Sangamo Biosciences, Inc Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
US7273923B2 (en) 2001-01-22 2007-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
WO2002057308A2 (en) 2001-01-22 2002-07-25 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
CA2474486C (en) 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
WO2003078619A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Cellectis Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
AU2003290518A1 (en) 2002-09-06 2004-04-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
US20060063231A1 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP2767161B1 (en) 2004-10-19 2018-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an non-human animal homozygous for a genetic modification
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
AU2006224248B2 (en) 2005-03-15 2011-01-06 Cellectis I-Crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
HUE029238T2 (en) 2006-12-14 2017-02-28 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
DK3064599T3 (en) 2008-02-15 2019-04-08 Synthetic Genomics Inc METHODS IN VITRO FOR COMBINING AND COMBINATORY CONSTRUCTION OF NUCLEIC ACID MOLECULES
JP2011517838A (ja) 2008-04-11 2011-06-16 ユーティーシー パワー コーポレイション マニホルド・サンプを備えたバイポーラプレートおよび燃料電池
US8470594B2 (en) 2008-04-15 2013-06-25 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying agents that affect the survival of motor neurons
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
EP2408921B1 (en) 2009-03-20 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
WO2011017293A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
KR20120050485A (ko) 2009-08-14 2012-05-18 레비비코르 인코포레이션 당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지
WO2011020014A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
TR201903376T4 (tr) 2009-10-29 2019-04-22 Regeneron Pharma Çok fonksiyonlu alleller.
PT2816112T (pt) 2009-12-10 2018-11-20 Univ Iowa State Res Found Inc Modificação do adn modificada pelo efector tal
WO2013030588A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 The University Of Manchester Method for diagnosing a neurodegenerative disease
WO2013041577A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Vib Vzw Methods for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
ES2960803T3 (es) 2012-05-25 2024-03-06 Univ California Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
FI2906696T4 (fi) 2012-10-15 2023-03-18 Menetelmiä c9orf72:n ilmentymisen moduloimiseksi
WO2014062736A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for monitoring c9orf72 expression
ES2926021T3 (es) 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
EP3617309A3 (en) 2012-12-06 2020-05-06 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
SG10201912328UA (en) 2012-12-12 2020-02-27 Broad Inst Inc Delivery, Engineering and Optimization of Systems, Methods and Compositions for Sequence Manipulation and Therapeutic Applications
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
IL308158A (en) 2012-12-17 2023-12-01 Harvard College RNA-guided human genome engineering
MX2015010841A (es) 2013-02-20 2016-05-09 Regeneron Pharma Modificacion genetica de ratas.
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
US10119133B2 (en) 2013-03-15 2018-11-06 The General Hospital Corporation Using truncated guide RNAs (tru-gRNAs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
EP2981617B1 (en) 2013-04-04 2023-07-05 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
DK2986729T3 (en) 2013-04-16 2018-10-29 Regeneron Pharma TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
CA2927965A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Cellectis Design of rare-cutting endonucleases for efficient and specific targeting dna sequences comprising highly repetitive motives
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
CA2932472A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
AU2015231294B2 (en) 2014-03-18 2020-10-29 University Of Massachusetts rAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
JP6930834B2 (ja) 2014-06-16 2021-09-01 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー Ｈ１プロモーターを用いるｃｒｉｓｐｒガイドｒｎａの発現のための組成物および方法
EP3155099B1 (en) 2014-06-23 2018-03-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
US20150376586A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
ES2901074T3 (es) 2014-06-26 2022-03-21 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso
EP3169309B1 (en) 2014-07-16 2023-05-10 Novartis AG Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
NZ731962A (en) 2014-11-21 2022-07-01 Regeneron Pharma Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas
LT3086637T (lt) 2014-12-05 2019-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gyvūnai, išskyrus žmogų, turintys humanizuota diferenciacijos klasterio 47 geną
MX2017008190A (es) 2014-12-19 2018-03-23 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la modificacion genetica dirigida a traves de direccionamiento multiple de una sola etapa.
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
US10793855B2 (en) 2015-01-06 2020-10-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016174056A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 Genethon Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders
EP3289076B1 (en) 2015-05-01 2021-11-17 Precision Biosciences, Inc. Precise deletion of chromoscomal sequences in vivo
WO2016196185A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
EP3344756A4 (en) 2015-09-02 2019-09-04 University of Massachusetts DETECTION OF LOCI OF GENES COMPRISING MATRIX REPETITIONS OF CRISPR AND / OR POLYCHROMATIC MONO-GUIDE RIBONUCLEIC ACIDS
AU2016376191A1 (en) * 2015-12-23 2018-07-12 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
KR102617874B1 (ko) 2016-03-30 2023-12-22 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. Crispr/cas 성분을 위한 지질 나노입자 제제
EP3442596A1 (en) 2016-04-14 2019-02-20 Université de Lausanne Treatment and/or prevention of dna-triplet repeat diseases or disorders
EP3488001A1 (en) 2016-07-25 2019-05-29 Mayo Foundation for Medical Education and Research Treating cancer
JP7026678B2 (ja) 2016-09-30 2022-02-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ９ｏｒｆ７２座位中にヘキサヌクレオチドリピート伸長を有する非ヒト動物
WO2018078131A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 Genethon Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophy
JP7157052B2 (ja) 2016-10-28 2022-10-19 ジェネトン 筋緊張性ジストロフィーの治療のための組成物および方法
EP3592365A4 (en) 2017-03-10 2021-01-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System TREATMENT OF ENDOTHELIAL CORNEAL DYSTROPHY OF FUCHS
EP3622073A4 (en) 2017-05-09 2021-01-06 University of Massachusetts METHOD FOR TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CN111526720B (zh) 2017-10-24 2023-01-31 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗罕见病的方法和组合物
EP3732291A1 (en) 2018-12-20 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
TW202104249A (zh) 2019-04-23 2021-02-01 美商聖加莫治療股份有限公司 染色體9開放讀框72基因表現之調節子及其用途

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