JP2024024094A - アレルゲンを含む改善されたlamp構築物 - Google Patents
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Abstract
【課題】アレルゲンを含む改善されたLAMP構築物の提供。【解決手段】本発明は、増強されたプロセシングのためにアレルゲンを免疫細胞に送達するために、LAMP内腔ドメインの特定の断片を含む改善されたLAMP構築物を提供する。これらのLAMP構築物は、疾患、特にアレルギー反応および/またはアレルギーの処置に使用され得る。改善されたLAMP構築物は、被験体に投与されると、免疫反応の産生のために適切に構成された三次元エピトープの提示を可能にする。改善されたLAMP構築物は多価分子であり得、および/または2つもしくはそれを超えるLAMP構築物を含む多価ワクチンの一部として提供され得る。【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、アレルゲンを含む改善されたLAMP構築物、ならびにアレルギー反応および/またはアレルギーを患っている被験体の処置におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、DNAワクチンとして使用するための核酸、およびそれらを使用してアレルギー反応を患っているかまたはそれに対して感受性の被験体を処置する方法に関する。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を利用するプライムブーストプロトコールも記載される。
本発明は、アレルゲンを含む改善されたLAMP構築物、ならびにアレルギー反応および/またはアレルギーを患っている被験体の処置におけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、DNAワクチンとして使用するための核酸、およびそれらを使用してアレルギー反応を患っているかまたはそれに対して感受性の被験体を処置する方法に関する。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を利用するプライムブーストプロトコールも記載される。
関連技術の論議
以下の説明では、特定の物品および方法が背景および導入目的で記載される。ここに含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるべきではない。本出願人は、適切な場合には、ここで参照されている物品および方法が、適用可能な法定条項下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
以下の説明では、特定の物品および方法が背景および導入目的で記載される。ここに含まれるものは、先行技術の「承認」と解釈されるべきではない。本出願人は、適切な場合には、ここで参照されている物品および方法が、適用可能な法定条項下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
アレルギー反応は、免疫系がアレルゲンと称される外来物資と反応してそれを無害にする際に起こる。例えば、食物アレルギーは、死に至る可能性のある全身性ショックであるアナフィラキシーの高いリスクにより、重要な公衆衛生課題である(Sampsonら、(1992)N.Engl.J.Med.327:380-384;Bockら、(2001)J.Allergy Clin.Immunol.107:191-193)。幼児は、一般公衆よりも食物アレルギーを発症するリスクが高い(Lackら、(2003)N.Engl.J.Med 348:977-985;Zimmermanら、(1989)J.Allergy Clin.Immunol.83:764-770;Greenら、(2007)Pediatrics 120:1304-1310)。生後3年間に、子供の6~8%が、食物により引き起こされるアレルギー反応を経験する(Bock(1987)Allergy 45:587-596;Burks and Sampson(1993)Curr.Prob.Pediatr.23:230-252;Jansenら、(1994)J.Allergy Clin.Immunol.93;2:446-456;Sampson(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103;5:717-728)。ナッツアレルギー、例えばピーナツおよびナッツアレルギーは人口の最大1~2%に影響を及ぼし、食物アレルギーのこの発生率は一般集団で増加しており、アジア系民族のものに偏って影響を及ぼしていると考えられる。
アレルゲン、例えばナッツまたはピーナツへの曝露により引き起こされるアナフィラキシーは、ヒスタミンの過剰生成を特徴とする深刻な免疫反応をもたらし、米国における年間のアナフィラキシー救急外来受診の半数を占める。例えば、ナッツに対する極端な反応は、米国において毎年30,000件を超えるアナフィラキシーの発生および100~200件の死亡をもたらす。微量のナッツは、ラベルが付されていない個別ブランドの数千の包装食料品において一般に見られる。150万人を超える米国人がナッツアレルギーの症候を患っており、多くの場合、症候は一生続く。多くは、微量の曝露で有害反応を経験する。
ナッツアレルギー症候を軽減するための処置はない。過去10年間で、ナッツアレルギーの有病率は2倍になって、成人米国人の2%に影響を及ぼしている(Sampson(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103;5:717-728;Sichererら、(2003)J.Allergy Clin.Immunol.112:1203-1207)。花粉症およびブタクサ花粉のような多くの他のアレルギーの症候は致命的ではないが、ナッツアレルギー個体については、ナッツの1000分の1ほどの少量の摂取が、アナフィラキシーショックおよび死亡を誘導し得る(Taylorら、(2002)J.Allergy Clin.Immunol.109(1):24-30;Wensingら、(2002)J.Allergy Clin.Immunol.110(6):915-920)。偶発的な摂取がアナフィラキシーをトリガーする事象では、エピネフリンの注射を使用して気道を広げる(Stark and Sullivan(1986)J.Allergy Clin.Immunol.78:76-83;Sampson(2003)Pediatrics 111(6):1601-1608)。
個体が経口免疫寛容の獲得に失敗し、代わりに、その後のアレルゲン曝露に対して感作されると、食物アレルギーが起こる(Tillら、(2004)J.Allergy Clin.Immunol.113(6):1025-1034)。アレルギー患者では、アレルゲンは、ほとんどのアレルギー症候の基礎となる炎症の組織化を助けるアレルギー促進性サイトカインインターロイキンIL-4、IL-5およびIL-13を産生する2型ヘルパーCD4+Tリンパ球(Th2)を優先的に活性化する(Woodfolk(2007)J.Allergy Clin.Immunol.118(2):260-294)。IL-4は、アレルゲン特異的免疫グロブリン(Ig)Eを分泌するように抗体産生B細胞に指令する(Del Preteら、(1988)J.Immunol.140:4193-4198;Swainら、(1990)J.Immunol.145:3796-3806)。中和IgGとは異なり、IgEは、マスト細胞および好酸球により発現されるその高親和性受容体Fc-εR1に結合し(Blankら、(1989)Nature 337:187-190;Benhamouら、(1990)J.Immunol.144:3071-3077)、これらの細胞を感作する。その後の曝露により、IgEは問題のアレルゲンに結合し、架橋し、シグナルを伝達して、脱顆粒してアレルギー反応をトリガーする揮発性化学物質を放出するようにマスト細胞に指令する。
食物アレルギーの他に、他の環境作用物資もまた、個体において上記アレルギー反応を生成し得る。このような環境作用物資の例としては、限定されないが、花粉、イヌのふけ、ネコの唾液またはイエダニが挙げられる。
寛容をもたらすための漸増用量のアレルゲンの投与である免疫療法は、アレルギー疾患の標準的な処置であるが、頻繁なアナフィラキシー反応により、ナッツアレルギーの処置について承認されていない(Nelsonら、(1997)J.Allergy Clin.Immunol 99;6:744-751;Oppenheimerら、(1992)J.Allergy Clin.Immunol 90:256-262)。加えて、免疫療法の有用性は、最大36カ月間の毎週または隔週注射を必要とする処置の長さにより制限され、様々な程度の成功およびコンプライアンスをもたらす(Bousquetら、(1998)J.Allergy Clin.Immunol 102:558-562;Rank and Li(2007)Mayo Clin.Proc.82(9):1119-1123;Ciprandiら、(2007)Allergy Asthma Proc.28:40-43)。
DNAワクチンは、アレルギー疾患の処置として提案されている(Razら、1996;Hartlら、2004;Hsuら、1996;Crameri 2007;Weissら、2006)。基礎となる理論的根拠は、DNAワクチンによりコードされるアレルゲンタンパク質が、特徴的なTh2型応答、例えばIL-4、IL-5およびIL-13の分泌ならびにBリンパ球によるIgEの形成ならびに後期反応における好酸球の成熟および動員ではなく、APC、ナチュラルキラー(NK)およびT細胞によるインターフェロン産生を伴うアレルゲン特異的Th1細胞応答を優先的に活性化するというものである。しかしながら、Th1およびTh2 T細胞表現型のディファレンシャルな誘導の基礎となる機構は、数多くの要因、例えばワクチン調製物の細菌DNAのユニークな特性、例えば非メチル化およびCpG DNA残基、自然免疫により誘発されるサイトカイン環境およびアレルゲンの細胞輸送特性が関与すると思われる(Chenら、2001;Kaechら、2002)。
DNAワクチンは、予防的および治療的ワクチンの両方の開発のための新たな有望な候補である。それらは安全であることが証明されており、臨床的利益を達成するためをワクチン接種の反復サイクルが必要である場合、ベクター骨格に対する免疫反応の欠如が決定的な利点であり得る。しかしながら、従来のDNAワクチンの1つの認められる欠点は、ヒトにおけるそれらの低い免疫原性である。エピトープベースのDNAワクチンの免疫原性における重要な制限工程は、T細胞へのMHC II提示経路に対するエピトープのアクセスであり得、これは、ターゲティング技術を用いないワクチンの場合には確率的プロセスである可能性が高い。
米国特許第5,633,234号には、改変インフルエンザ血球凝集素(HA)の抗原性ドメインと、抗原をその区画に有効にターゲティングする細胞質エンドソーム/リソソームターゲティングシグナルとを含むキメラタンパク質が記載されている。抗原性ドメインがプロセシングされ、それ由来のペプチドが、主要組織適合性(MHC)クラスII分子に関連して細胞表面に提示された。LAMP-1の細胞質尾部を使用して、キメラタンパク質のエンドソーム/リソソームターゲティングドメインが形成された。
米国特許第8,318,173号は、これらの最初の観察結果を拡大して、LAMP-1の全内腔ドメインと膜貫通ドメインとの間に挿入されたHIV-1 Gagタンパク質を含むキメラタンパク質(およびこれらのタンパク質をコードする対応するDNA)が記載されている。この構築物は樹状細胞に導入され、次いで、MHC II経路をターゲティングすることが報告されている。
このアプローチは、いくつかのウイルス抗原、ヒトパピローマウイルスE7、デングウイルス膜タンパク質、HIV-1 gp160膜タンパク質、HIV-1 p55 Gag、西ナイル膜タンパク質、C型肝炎ウイルスNS3タンパク質およびサイトメガロウイルスpp65に対する細胞性および体液性応答の増加に有用であることが証明されている(例えば、Boniniら、J.Immunol.166:5250-5257,2001を参照のこと)。増強された免疫反応は、LAMPおよびMHC IIの共局在化、ならびに抗原ペプチドのより効率的なプロセシングおよび送達に起因し得る。加えて、LAMPターゲティングは、増加した数の免疫原性エピトープの提示をもたらして、非標的抗原と比較して定性的に幅広い免疫反応を誘導することが報告されている。例えばFernandesら、2000,Eur.J.Immunol.30(8):2333-43では、ワクシニアベクターにコードされるLAMP輸送OVA抗原の提示ペプチドの数の増加が実証された。外因供給OVAから生成された12個のペプチドのうち、9個がOVA/LAMPキメラにより提示されたが、それと比較して、LAMPを含まない構築物では2個のみであった。
LAMPの細胞質ドメインが(シグナル配列および膜貫通ドメインと共に)必要であることが決定されているが、すべての抗原のエンドソーム/リソソーム輸送に対して常に十分ではない。代わりに、LAMPの全内腔ドメインもまた、リソソーム小胞経路へのタンパク質の輸送に必要であることが示されている。
しかしながら、LAMPの完全内腔ドメインおよび完全膜貫通/細胞質尾部(「完全LAMP構築物」)が存在する場合であっても、特定の抗原が免疫反応を生じさせる効果は、これらの構造物で使用される特定の配列に高度に依存することがますます見出されている。実際、同じタンパク質の異なる抗原断片は、完全LAMP構築物に挿入された場合、同じ免疫反応を誘発しないこと見出されている。時々、抗原断片は免疫反応を生成するが、他の場合にはそれは生じさせない。これらの観察結果は、完全LAMP構築物で、目的のタンパク質由来のどの特定の抗原配列が免疫反応を生じさせるかを事前に予測する能力を困難にする。
また、完全LAMP構築物の生成では、全内腔ドメインは、抗原を適切に発現およびプロセシングするために必要であることが繰り返し観察されている。例えば、Godinhoら、PLoS ONE 9(6):9(6):e99887.doi:10.1371/journal.pone.0099887では、著者らは、完全およびインタクトな内腔ドメインが、抗原をリソソームにターゲティングするために必要な最小領域であり、内腔ドメインの断片は機能しなかったことを報告した。同6ページを参照のこと。
具体的には、Godinhoらは、第1の内腔ドメインおよびいくつかの第2の内腔ドメインを完全に除去することにより(すなわち、T1-Lum/gag構築物)、タンパク質発現および抗体反応の両方が減少することを示した。同様に、第1の内腔ドメインの25%を除去するが第2の内腔ドメインをインタクトとすることにより(すなわち、T2-lum/gag)、タンパク質発現および抗体反応の両方が比較的増加したが、依然として、完全LAMP構築物で得られた結果未満であった。
また、著者らは、免疫反応を生じさせる能力が、特定の抗原と、これらの完全LAMP構築物で使用されるエピトープとに依存することを確認した。例えば、9ページの2列目では、著者らは、「したがって、以前の研究では、VLPとしてまたは可溶性形態で分泌されるGagを生成するDNAワクチンが、異なるレベルのTおよびB細胞活性化を誘導することが実証され、これは細胞質Gagにより誘導される反応とは異なる」と述べている。また、文献に記載されているようにLAMPの全内腔ドメインとLAMPの全膜貫通/細胞質ドメインとの間への抗原性配列の挿入は、過大なコストにより商業レベルで生産することができないか、または科学的な観点から非現実的になり得る大きなポリヌクレオチド配列をもたらし得る
したがって、例えば、アレルギー反応および/またはアレルギーを有効に処置するためのワクチンとして使用され得る新たな改善されたLAMP構築物を設計する必要がある。また、改善されたら、これらの新たなLAMP構築物は、本明細書に記載されるアレルゲンに対する抗体を生成するために使用され得る。
また、著者らは、免疫反応を生じさせる能力が、特定の抗原と、これらの完全LAMP構築物で使用されるエピトープとに依存することを確認した。例えば、9ページの2列目では、著者らは、「したがって、以前の研究では、VLPとしてまたは可溶性形態で分泌されるGagを生成するDNAワクチンが、異なるレベルのTおよびB細胞活性化を誘導することが実証され、これは細胞質Gagにより誘導される反応とは異なる」と述べている。また、文献に記載されているようにLAMPの全内腔ドメインとLAMPの全膜貫通/細胞質ドメインとの間への抗原性配列の挿入は、過大なコストにより商業レベルで生産することができないか、または科学的な観点から非現実的になり得る大きなポリヌクレオチド配列をもたらし得る
したがって、例えば、アレルギー反応および/またはアレルギーを有効に処置するためのワクチンとして使用され得る新たな改善されたLAMP構築物を設計する必要がある。また、改善されたら、これらの新たなLAMP構築物は、本明細書に記載されるアレルゲンに対する抗体を生成するために使用され得る。
Sampsonら、(1992)N.Engl.J.Med.327:380-384
Bockら、(2001)J.Allergy Clin.Immunol.107:191-193
Lackら、(2003)N.Engl.J.Med 348:977-985
Zimmermanら、(1989)J.Allergy Clin.Immunol.83:764-770
Greenら、(2007)Pediatrics 120:1304-1310
Bock(1987)Allergy 45:587-596
Burks and Sampson(1993)Curr.Prob.Pediatr.23:230-252
Jansenら、(1994)J.Allergy Clin.Immunol.93;2:446-456
Sampson(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103;5:717-728
Sichererら、(2003)J.Allergy Clin.Immunol.112:1203-1207
Taylorら、(2002)J.Allergy Clin.Immunol.109(1):24-30
Wensingら、(2002)J.Allergy Clin.Immunol.110(6):915-920
Stark and Sullivan(1986)J.Allergy Clin.Immunol.78:76-83
Sampson(2003)Pediatrics 111(6):1601-1608
Tillら、(2004)J.Allergy Clin.Immunol.113(6):1025-1034
Woodfolk(2007)J.Allergy Clin.Immunol.118(2):260-294
Del Preteら、(1988)J.Immunol.140:4193-4198
Swainら、(1990)J.Immunol.145:3796-3806
Blankら、(1989)Nature 337:187-190
Benhamouら、(1990)J.Immunol.144:3071-3077
Nelsonら、(1997)J.Allergy Clin.Immunol 99;6:744-751
Oppenheimerら、(1992)J.Allergy Clin.Immunol 90:256-262
Bousquetら、(1998)J.Allergy Clin.Immunol 102:558-562
Rank and Li(2007)Mayo Clin.Proc.82(9):1119-1123
Ciprandiら、(2007)Allergy Asthma Proc.28:40-43
Boniniら、J.Immunol.166:5250-5257,2001
Fernandesら、2000,Eur.J.Immunol.30(8):2333-43
Godinhoら、PLoS ONE 9(6):9(6):e99887.doi:10.1371/journal.pone.0099887
発明の概要
この概要は、詳細な説明で以下にさらに記載される簡易形態の選択された概念を紹介するために提供されている。この概要は、特許請求される主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は添付の図面に例示され、添付の特許請求の範囲で定義される態様を含む以下に記載の詳細な説明から明らかになる。
この概要は、詳細な説明で以下にさらに記載される簡易形態の選択された概念を紹介するために提供されている。この概要は、特許請求される主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性および利点は添付の図面に例示され、添付の特許請求の範囲で定義される態様を含む以下に記載の詳細な説明から明らかになる。
本発明の目的は、本明細書で詳述されるアレルゲンを免疫系に有効に提示して、増強された免疫反応を生成するLAMPドメインの特定の断片および/または変異体を含む新規構築物(「改善されたLAMP構築物」)を提供することである。ヘルパーT細胞が優先的に刺激され、および/または抗体が生成されるように、これらの改善されたLAMP構築物は、アレルゲンを、それらがプロセシングされて主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII分子に提示されるリソソーム/エンドソーム区画に有効に指向させる。
本明細書に記載される改善されたLAMP構築物および方法は、被験体において免疫反応を誘発し得る。免疫反応は、改善されたLAMP構築物(例えば、ワクチン)中のアレルゲンX(配列番号Y)のエピトープに対する免疫反応であり得る。免疫系が、被験体におけるワクチンのアレルゲンX(配列番号Y)を含むものを検出および破壊し得るように、ワクチンは被験体の免疫系を作動可能にする。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物および方法は、被験体においてTh1免疫反応を誘発し得る。Th1免疫反応は、免疫細胞のサブセット(例えば、アレルゲン特異的T細胞)による炎症性サイトカイン(例えば、IFNγ、TNFα)の分泌を含み得る。
いくつかの場合では、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物および方法で使用されるアレルゲンX(配列番号Y)は、被験体の免疫系により認識されてTh1免疫反応を誘発し、タイプIサイトカインを放出し得る。Th1応答は、エピトープとT細胞、より具体的にはT細胞により発現される主要組織適合遺伝子複合体(MHC)との間の相互作用により開始され得る。例えば、エピトープのMHC受容体への高親和性結合は、Th1応答を刺激し得る。MHC受容体は、複数のタイプのMHC受容体のうちの少なくとも1つであり得る。T細胞が係合するMHC受容体は、集団における個体で変動し得る。
いくつかの場合では、免疫反応はタイプ1免疫反応である。いくつかの場合では、免疫反応は、タイプIサイトカイン産生とタイプIIサイトカイン産生との比が1を超えることを特徴とする。いくつかの場合では、免疫反応は、タイプIサイトカイン産生とタイプIIサイトカイン産生との比が1未満であることを特徴とする。いくつかの場合では、免疫反応は、IFNγ産生とIL-10産生との比が1を超えることを特徴とする。いくつかの場合では、免疫反応は、IFNγ産生とIL-10産生との比が1未満であることを特徴とする。
プライムブーストプロトコールも企図される。例えば、本発明はさらに、被験体においてアレルゲンX(配列番号Y)に対する免疫反応を生成するための方法であって、本明細書に記載されるアレルゲンX(配列番号Y)を含む改善されたLAMP構築物で前記被験体をプライミングし、続いて、前記アレルゲンまたは関連アレルゲン(例えば、同じまたは非常に類似のタンパク質配列に由来する第2のアレルゲン)で前記被験体を少なくとも1回ブースティングすることを含む方法を提供する。アレルゲンの混合物は、プライミングおよびブースティング工程のいずれかまたは両方で使用され得る。プライム工程およびそれに続くアレルゲンX(配列番号Y)ブースト工程のための改善されたLAMP構築物の使用は、より高い力価を有意にもたらすことが示されているが、これは、抗体反応の増強におけるLAMPの力を示している。
本発明はさらに、本明細書に記載されるアレルゲンX(配列番号Y)を含む改善されたLAMP構築物のいずれかをコードする核酸分子を提供する。改善されたLAMP構築物は、核酸分子が発現制御配列に作動可能に連結された核酸を含み得る。好ましい一態様では、改善されたLAMP構築物は、患者をワクチン接種するために適切なワクチンベクターである。別の態様では、本発明は、アレルゲンをコードする核酸分子を細胞に導入を容易にするための改善されたLAMP構築物を含む送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、脂質ベース(例えば、リポソーム製剤)、ウイルスベース(例えば、核酸分子をカプセル化するウイルスタンパク質を含む)または細胞ベースであり得る。
好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物においてアレルゲンに対する免疫反応(例えば、抗体の生成)を誘発するための注射用組成物であって、目的のアレルゲンX(配列番号Y)を含む改善されたLAMP構築物を含む注射用組成物を提供する。好ましい実施形態では、このワクチンは、Th2応答に対して優先的なTh1応答を生成する。改善されたLAMP構築物は、本明細書に記載されるアレルゲンX(配列番号Y)の少なくとも1つのエピトープを含む。
本発明はまた、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のいずれかを含む細胞を提供する。一態様では、細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞など)または操作された抗原提示細胞(例えば、抗原提示に必要な分子、例えばMHCクラスII分子を発現するように操作された非プロフェッショナル抗原提示細胞)であり得る。抗原提示に必要な分子は、他の細胞、例えば、天然に存在する細胞に由来し得るか、またはそれ自体が操作されたもの(例えば、所望の特性、例えばアレルゲン性エピトープに対すより高いまたはより低いる親和性を発現するように突然変異または改変されたもの)であり得る。一態様では、抗原提示細胞は、いかなる共刺激シグナルも発現しない。
本発明はさらに、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のいずれかを含む複数の細胞を含むキットを提供する。細胞の少なくとも2つは、異なるMHCクラスII分子を発現し、各細胞は同じLAMP構築物を含む。一態様では、改善されたLAMP構築物と、ベクターを受容するための細胞とを含むキットが提供される。
本発明はまた、本明細書に記載される細胞の少なくとも1つおよび/または改善されたLAMP構築物の少なくとも1つを含むトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載される細胞の少なくとも1つを含むトランスジェニック動物を提供する。
本発明はさらに、動物(例えば、ヒトまたは非ヒト脊椎動物)においてアレルゲンX(配列番号Y)に対する免疫反応を生成するための方法であって、前記動物に上記細胞を投与することを含み、前記細胞が、前記動物において、前記改善されたLAMP構築物を発現するかまたは発現するように誘導され得る方法を提供する。一態様では、動物が、MHCクラスII分子に対する免疫反応を生成しないように、細胞は、動物のMHCタンパク質と適合するMHCクラスII分子を含む。好ましい一態様では、動物はヒトである。
さらなる一態様では、本発明は、アレルゲンX(配列番号Y)に対する免疫反応を誘発するための方法であって、ヒトまたは非ヒト脊椎動物などの動物に、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、改善されたLAMP構築物は、動物の細胞に対して感染性である。例えば、改善されたLAMP構築物は、ワクシニア改善型LAMP構築物などのウイルスベクターであり得る。
例えば、本発明はさらに、動物においてアレルゲンX(配列番号Y)に対する免疫反応を生成するための方法であって、本明細書に記載されるアレルゲンX(配列番号Y)を含む改善されたLAMP構築物で前記動物をプライミングし、続いて、前記動物を少なくとも1回ブースティングすることを含む方法を提供する。プライム工程およびそれに続くアレルゲンX(配列番号Y)のブースト工程のための改善されたLAMP構築物の使用は、より高い力価を有意にもたらすことが示されているが、これは、抗体反応の増強におけるLAMPの力を示している。
さらなる態様では、細胞は患者から得られ、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物が細胞に導入され、細胞または細胞の子孫が患者内に再導入される。一態様では、細胞は、抗原提示細胞に分化し得る幹細胞である。ヒト患者の処置および獣医学的使用が特に企図される。
具体的には、目的のアレルゲンの提示をLAMPと組み合わせることにより、次いで、アレルゲンは、アレルゲンがプロセシングされ得、それ由来のペプチドが、主要組織適合性(MHC)クラスII分子に関連して細胞表面に提示される細胞質エンドソーム/リソソーム区画に効率的に輸送される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
改善されたLAMP構築物であって、
a.LAMPタンパク質のシステイン保存断片;および
b.表1/図14に記載されている少なくとも1つのアレルゲンX(配列番号Y)
を含む、改善されたLAMP構築物。
(項目2)
a.アレルゲンX(配列番号Y)が、前記システイン保存断片のN末端に配置されているか;
b.アレルゲンX(配列番号Y)が、単一のシステイン保存断片のC末端に配置されているか;または
c.アレルゲンX(配列番号Y)が、2つのシステイン保存断片の間に配置されている、項目1に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目3)
表1/図14のアレルゲンX(配列番号Y)の少なくとも1つを含み、好ましくは、ILC-1、ILC-2、ILC-3、ILC-4、ILC-5またはILC-6に示されているように構築されている、項目1または項目2のいずれかに記載の改善されたLAMP構築物。
(項目4)
各アレルゲンX(配列番号Y)がリンカーにより分離されている、項目3に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目5)
前記リンカーがアミノ酸配列GPGPGまたはPMGLPから選択される、項目4に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目6)
1つを超えるシステイン保存断片を含む、前述の項目のいずれかに記載の改善されたLAMP構築物。
(項目7)
前記システイン保存断片がLAMPタンパク質の相同ドメインを含む、項目1~6のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目8)
LAMPタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む、項目1~7のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目9)
シグナル配列をさらに含む、項目1~8のいずれかに記載の改善されたLAMP構築物。
(項目10)
前記シグナル配列がLAMPタンパク質に由来する、項目9に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目11)
前記LAMPタンパク質が、LAMP-1、LAMP2、LAMP-3、LIMP2、Macrosailin、Endolyn、LAMP5またはLIMBICから選択される、項目1~10のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目12)
前記LAMPタンパク質が配列番号1~250のいずれか1つから選択され、および/または前記アレルゲンXが配列番号Yのいずれか1つから選択される、項目11に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目13)
前記LAMPタンパク質が、配列番号1~113と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であり、および/または前記アレルゲンXが、配列番号Yと少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である、項目12に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目14)
項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目15)
項目14に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
(項目16)
項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物、項目14に記載のポリヌクレオチドまたは項目15に記載の宿主細胞を含む、組成物。
(項目17)
アレルギー反応の処置を必要とする被験体におけるアレルギー反応を処置する方法であって、被験体に、前記疾患または障害を軽減または処置するために十分な量で項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物、項目14に記載のポリヌクレオチド、項目15に記載の宿主細胞または項目16に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目18)
プライミング工程および少なくとも1回のブースティング工程を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物、項目14に記載のポリヌクレオチド、項目15に記載の宿主細胞または項目16に記載の組成物を前記プライミング工程で使用する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記ブースティング工程が、アレルゲンX、改善されたLAMP構築物、改善されたLAMP構築物によりコードされるポリペプチド、または改善されたLAMP構築物を含む細胞の投与を含む、項目18または19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
プライミングするために使用されるアレルゲンXが、ブースティングするために使用されるのと同じものである、項目17~20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
プライミングするために使用されるアレルゲンXが、ブースティングするために使用される第2のアレルゲンXと同じタンパク質に由来する、項目17~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
1つを超えるアレルゲンXを使用してプライミングおよび/またはブースティングする、項目17~22のいずれか一項に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
改善されたLAMP構築物であって、
a.LAMPタンパク質のシステイン保存断片;および
b.表1/図14に記載されている少なくとも1つのアレルゲンX(配列番号Y)
を含む、改善されたLAMP構築物。
(項目2)
a.アレルゲンX(配列番号Y)が、前記システイン保存断片のN末端に配置されているか;
b.アレルゲンX(配列番号Y)が、単一のシステイン保存断片のC末端に配置されているか;または
c.アレルゲンX(配列番号Y)が、2つのシステイン保存断片の間に配置されている、項目1に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目3)
表1/図14のアレルゲンX(配列番号Y)の少なくとも1つを含み、好ましくは、ILC-1、ILC-2、ILC-3、ILC-4、ILC-5またはILC-6に示されているように構築されている、項目1または項目2のいずれかに記載の改善されたLAMP構築物。
(項目4)
各アレルゲンX(配列番号Y)がリンカーにより分離されている、項目3に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目5)
前記リンカーがアミノ酸配列GPGPGまたはPMGLPから選択される、項目4に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目6)
1つを超えるシステイン保存断片を含む、前述の項目のいずれかに記載の改善されたLAMP構築物。
(項目7)
前記システイン保存断片がLAMPタンパク質の相同ドメインを含む、項目1~6のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目8)
LAMPタンパク質の膜貫通ドメインをさらに含む、項目1~7のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目9)
シグナル配列をさらに含む、項目1~8のいずれかに記載の改善されたLAMP構築物。
(項目10)
前記シグナル配列がLAMPタンパク質に由来する、項目9に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目11)
前記LAMPタンパク質が、LAMP-1、LAMP2、LAMP-3、LIMP2、Macrosailin、Endolyn、LAMP5またはLIMBICから選択される、項目1~10のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目12)
前記LAMPタンパク質が配列番号1~250のいずれか1つから選択され、および/または前記アレルゲンXが配列番号Yのいずれか1つから選択される、項目11に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目13)
前記LAMPタンパク質が、配列番号1~113と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であり、および/または前記アレルゲンXが、配列番号Yと少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である、項目12に記載の改善されたLAMP構築物。
(項目14)
項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目15)
項目14に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
(項目16)
項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物、項目14に記載のポリヌクレオチドまたは項目15に記載の宿主細胞を含む、組成物。
(項目17)
アレルギー反応の処置を必要とする被験体におけるアレルギー反応を処置する方法であって、被験体に、前記疾患または障害を軽減または処置するために十分な量で項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物、項目14に記載のポリヌクレオチド、項目15に記載の宿主細胞または項目16に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目18)
プライミング工程および少なくとも1回のブースティング工程を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
項目1~13のいずれか一項に記載の改善されたLAMP構築物、項目14に記載のポリヌクレオチド、項目15に記載の宿主細胞または項目16に記載の組成物を前記プライミング工程で使用する、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記ブースティング工程が、アレルゲンX、改善されたLAMP構築物、改善されたLAMP構築物によりコードされるポリペプチド、または改善されたLAMP構築物を含む細胞の投与を含む、項目18または19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
プライミングするために使用されるアレルゲンXが、ブースティングするために使用されるのと同じものである、項目17~20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
プライミングするために使用されるアレルゲンXが、ブースティングするために使用される第2のアレルゲンXと同じタンパク質に由来する、項目17~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
1つを超えるアレルゲンXを使用してプライミングおよび/またはブースティングする、項目17~22のいずれか一項に記載の方法。
これらのおよび他の態様、目的および特徴は、以下により詳細に記載される。
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してよりよく理解され得る。
詳細な説明
本発明は、ワクチンを生成するために使用され得る改善されたLAMP構築物を提供する。改善されたLAMP構築物は、免疫反応をモジュレートまたは増強するために使用され得る。好ましい一態様では、本発明は、本明細書に記載されるアレルゲンX(配列番号Y)の1つまたはそれよりも多くを含む改善されたLAMP構築物を提供することにより、アレルギーおよび/またはアレルギー反応を有する患者を処置するための方法を提供する。
本発明は、ワクチンを生成するために使用され得る改善されたLAMP構築物を提供する。改善されたLAMP構築物は、免疫反応をモジュレートまたは増強するために使用され得る。好ましい一態様では、本発明は、本明細書に記載されるアレルゲンX(配列番号Y)の1つまたはそれよりも多くを含む改善されたLAMP構築物を提供することにより、アレルギーおよび/またはアレルギー反応を有する患者を処置するための方法を提供する。
定義
以下の定義は、以下の説明で使用される特定の用語について提供される。
以下の定義は、以下の説明で使用される特定の用語について提供される。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「a」、「an」および「the」いう単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。「核酸分子」という用語は、複数の核酸分子を含む。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、改善されたLAMP構築物および方法が、記載されているエレメントを含むが、他のエレメントを除外しないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、改善されたLAMP構築物および方法を規定するために使用される場合、組み合わせにとって任意の本質的重要性の他のエレメントを除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義されるエレメントから本質的になる改善されたLAMP構築物は、単離および精製方法からの微量混入物質、ならびに薬学的に許容され得る担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、保存剤などを除外しない。「からなる」は、微量を超える他の成分と、本発明の改善されたLAMP構築物を投与するための実質的な方法工程とを除外することを意味するものとする。これらの各移行用語により定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定された場合に特定の値の許容可能な範囲内であることを意味し、これは、値の測定または決定方法、例えば測定系の限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、所定の値の最大20%、好ましくは最大10%、より好ましくは最大5%、さらにより好ましくは最大1%の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。特に記述がない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内、例えば±1~20%、好ましくは±1~10%、より好ましくは±1~5%を意味する。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各中間値と、その記述されている範囲内の任意の他の記述値または中間値が本発明に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は独立して、より小さな範囲内に含まれ得、また、記述されている範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として本発明内に包含される。記述されている範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる両方の限界のいずれかを除外した範囲も本発明に含まれる。
本明細書で使用される場合、「リソソーム/エンドソーム区画」は、膜にLAMP分子を含む膜結合酸性液胞、抗原プロセシングで機能する加水分解酵素、ならびに抗原認識および提示のためのMHCクラスII分子を指す。この区画は、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスおよびピノサイトーシスを含む様々な機構のいずれかにより細胞表面から内在化された異物、ならびに特殊な自己分解現象によりこの区画に送達される細胞内物質の分解部位として機能する(de Duve,Eur.J.Biochem.137:391,1983)。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「エンドソーム」という用語は、リソソームを包含する。
本明細書で使用される場合、「リソソーム関連オルガネラ」は、リソソームを含む任意のオルガネラを指し、限定されないが、MIIC、CIIV、メラノソーム、分泌顆粒、溶解顆粒、血小板高密度顆粒、好塩基球顆粒、ビルベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌リソソームなどを含む。好ましくは、このようなオルガネラは、マンノース6-リン酸受容体を欠き、LAMPを含むが、MHCクラスII分子を含んでもよいしまたは含まなくてもよい。総説については、例えば、Blott and Griffiths,Nature Reviews,Molecular Cell Biology,2002;Dell’Angelicaら、The FASEB Journal 14:1265-1278,2000を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび/またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を果たし得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、アンチセンス分子、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマーを含む。核酸分子はまた、改変核酸分子(例えば、改変塩基、糖および/またはヌクレオチド間リンカーを含む)を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、2つまたはそれを超えるサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合または他の結合(例えば、エステル、エーテルなど)により連結され得る。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびDまたはL光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および/または非天然もしくは合成アミノ酸を指す。3つまたはそれを超えるアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長い場合(例えば、約10個を超えるアミノ酸)、ペプチドは、一般にポリペプチドまたはタンパク質と称される。「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語を包含するが、「ポリペプチド」は全長未満のタンパク質であり得る。
本明細書で使用される場合、「LAMPポリペプチド」は、本明細書に記載される哺乳動物のリソソーム関連膜タンパク質ヒトLAMP-1、ヒトLAMP-2、ヒトLAMP-3、ヒトLIMP-2、ヒトEndolyn、ヒトLIMBIC、ヒトLAMP-5またはヒトMacrosailin、ならびにオルソログ(例えば、図3~10に示されているLAMPタンパク質など)および対立遺伝子変異体を指す。本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写され、および/またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、ゲノムDNAから転写されるmRNAのスプライシングを含み得る。
本明細書で使用される場合、「転写制御下」または「作動可能に連結された」は、発現制御エレメントおよびコード配列の適切な並置により制御されるポリヌクレオチド配列の発現(例えば、転写または翻訳)を指す。一態様では、発現制御配列がそのDNA配列の転写を制御および調節する場合、DNA配列は発現制御配列に「作動可能に連結されている」。
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、適切な発現制御配列の制御下に配置された場合に転写されてポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシル)末端の翻訳停止コドンにより決定される。コード配列は、限定されないが、原核生物配列、真核生物mRNAからのcDNA、真核生物(例えば、哺乳動物)DNAからのゲノムDNA配列およびさらには合成DNA配列を含み得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の3’に位置する。
本明細書で使用される場合、2つのコード配列は、配列またはそれらの相補配列が同じアミノ酸配列をコードする場合に互いに「対応する」。
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」は、小胞体転座配列を示す。この配列は、細胞と連絡して、(例えば、化学結合を介して)小胞体小胞区画に連結されたポリペプチドがエキソサイトーシス/エンドサイトーシスオルガネラに入り、細胞小胞区画、細胞表面に送達されるか、またはポリペプチドを分泌するように指令するシグナルペプチドをコードする。このシグナル配列は、タンパク質の成熟で細胞により切り取られることがある。シグナル配列は、原核生物および真核生物にネイティブの様々なタンパク質に関連して見られ得る。
本明細書で使用される場合、「輸送」は、改善されたLAMP構築物によりコードされるポリペプチドが、粗面小胞体から、抗原プロセシングおよびMHC IIへの結合が起こるエンドソーム/リソソーム区画または関連オルガネラへの経路において細胞オルガネラまたは区画を通して移動または進行することを意味する。
本明細書に記載されるベクターのいずれかへのクローニングを容易にするために、アミノ酸をコードするポリヌクレオチドの短いストレッチは、アレルゲンXをコードするポリヌクレオチドの末端に含められ得る。例えば、配列番号Yのアミノ酸配列に隣接するクローニング配列、例えば「Leu-Glu」および「Glu-Phe」をコードするポリヌクレオチド(例えば、「CTCGAG」および「GAATTC」)などの使用が構築物設計に含められ得る。
本明細書で使用される場合、「改善されたLAMP構築物」および「アレルゲンX(配列番号Y)を含む改善されたLAMP構築物」および「目的のアレルゲンを含む改善されたLAMP構築物」は互換的に使用される。改善されたLAMP構築物の異なる配置は、ILC1~ILC6として図1に示されている。また、「改善されたLAMP構築物」の使用は、(アレルゲンX(配列番号Y)をコードするポリヌクレオチドを含む)改善されたLAMP構築物のポリヌクレオチド配列、および改善されたLAMP構築物のポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「改善されたLAMP構築物送達ビヒクル」は、改善されたLAMP構築物を宿主細胞(例えば、遺伝子または遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマーなど)に運搬し得、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物に関連して生じる任意の分子または分子群または高分子として定義される。
本明細書で使用される場合、「改善されたLAMP構築物送達」または「改善されたLAMP構築物移入」は、導入に使用される方法にかかわらず、改善されたLAMP構築物を宿主細胞に導入することを指す。導入された改善されたLAMP構築物は、宿主細胞で安定的または一時的に維持され得る。典型的には、安定維持は、導入された改善されたLAMP構築物が、宿主細胞と適合する複製起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン(例えば、プラスミド)もしくは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込まれることを必要とする。
本明細書で使用される場合、「改善されたウイルスLAMP構築物」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで宿主細胞に送達される改善されたLAMP構築物を含むウイルスまたはウイルス粒子を指す。改善されたウイルスLAMP構築物の例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。アデノウイルスベクターにより遺伝子移入が媒介される態様では、改善されたLAMP構築物は、アデノウイルスゲノムまたはその一部、およびアデノウイルスカプシドタンパク質に関連する選択された非アデノウイルス遺伝子を含む。
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス媒介遺伝子移入」または「アデノウイルス形質導入」は、アデノウイルスが細胞に入ることにより、改善されたLAMP構築物が宿主細胞に移入されるプロセスを指す。好ましくは、改善されたLAMP構築物は、細胞内で複製しおよび/または組み込まれることができ、転写されることができる。
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス粒子」は、外部カプシドおよび改善されたLAMP構築物から構成される個々のアデノウイルスビリオンであり、カプシドは、アデノウイルスエンベロープタンパク質からさらに構成される。アデノウイルスエンベロープタンパク質は、例えば、アデノウイルス粒子を特定の細胞および/または組織タイプにターゲティングするために、ウイルスタンパク質に共有結合的に付着したポリペプチドリガンドを含む融合ポリペプチドを含むように改変され得る。
本明細書で使用される場合、改善されたLAMP構築物の「投与」または「免疫化」または「注射」という用語は、改善されたLAMP構築物を細胞に形質導入、トランスフェクト、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは発射することを指す。いくつかの態様では、改善されたLAMP構築物は、標的細胞を送達細胞と接触させることにより(例えば、細胞融合により、または送達細胞が標的細胞に近接する場合には送達細胞を溶解することにより)標的細胞に導入される。
本明細書で使用される場合、「プライムブースト」という語句は、アレルゲンX(配列番号Y)を含む本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を使用してT細胞応答をプライミングし、続いて、アレルゲンX(配列番号Y)、アレルゲンX(配列番号Y)を含むDNAワクチンまたは組換えアレルゲンを含む第2の改善されたLAMP構築物を使用して応答をブーストすること(逆もまた同様)を表す。これらの非相同プライムブースト免疫化は、同じベクターでプライミングおよびブースティングすることにより達成され得るよりも高度かつ幅広い免疫反応を誘発する。アレルゲンX(配列番号Y)を含む改善されたLAMP構築物によるプライミングは記憶細胞を起動させ、ブースト工程は記憶応答を拡大する。好ましくは、互いに対する応答を生じさせず、したがって互いの活性に干渉しない2つの異なる薬剤が使用される。アレルゲンの混合物は、プライムおよび/またはブースト工程で特に企図される。ブースティングは1回または複数回行われ得る。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」は、1つまたはそれを超えるポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン-クリック型塩基対、フーグスティーン結合または任意の他の配列特異的方法により起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する2本の鎖、多重鎖複合体を形成する3つもしくはそれを超える鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスの工程、例えばPCR反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成し得る。
本明細書で使用される場合、別の配列と特定の割合(例えば、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%)の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域(またポリペプチドもしくはポリペプチド領域)は、当技術分野でルーチンなソフトウェアプログラムを使用して最大限にアライメントした場合に、2つの配列の比較において塩基(またはアミノ酸)の割合が同じであることを意味する。
ヌクレオチドの少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90または95%が、DNA配列の規定の長さにわたって一致する場合、2つの配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。同様に、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約66%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90または95%が、ポリペプチド配列の規定の長さにわたって一致する場合、2つのポリペプチド配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを使用して配列を比較することにより識別され得る。実質的に相同な核酸配列もまた、例えば、その特定の系について定義されるストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験で識別され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当技術分野の範囲内である。例えば、ストリンジェントな条件は、42℃で5×SSCおよび50%ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーションならびに60℃で0.1×SSCおよび0.1%ドデシル硫酸ナトリウムにおける洗浄であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、約25℃~約37℃のインキュベーション温度、約6×SSC~約10×SSCのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約0%~約25%のホルムアミド濃度および約6×SSCの洗浄溶液が挙げられる。中ハイブリダイゼーション条件の例としては、約40℃~約50℃のインキュベーション温度、約9×SSC~約2×SSCのバッファー濃度、約30%~約50%のホルムアミド濃度および約5×SSC~約2×SSCの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約55℃~約68℃のインキュベーション温度、約1×SSC~約0.1×SSCのバッファー濃度、約55%~約75%のホルムアミド濃度および約1×SSC、0.1×SSCまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、1回、2回またはそれを超える洗浄工程では5分間~24時間であり、洗浄インキュベーション時間は約1、2または15分間である。SSCは、0.15M NaClと15mMクエン酸バッファーである。他のバッファー系を使用するSSCの同等物が使用され得ることが理解される。類似性はシークエンシングにより検証され得るが、好ましくはさらにまたはあるいは、問題の特定のドメインに適切なアッセイを使用して、機能(例えば、エンドソーム区画への輸送能力など)により検証される。
「配列類似性パーセント(%)」、「配列同一性パーセント(%)」などの用語は、一般に、共通の進化起源を共有してもよいしまたは共有しなくてもよい核酸分子の異なるヌクレオチド配列またはポリペプチドのアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す(Reeckら、前掲を参照のこと)。配列の同一性は、公開されている多くの配列比較アルゴリズムのいずれか、例えばBLAST、FASTA、DNA Strider、GCG(Genetics Computer Group,Program Manual
for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)などを使用して決定され得る。
for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)などを使用して決定され得る。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸分子間の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的でアライメントされる。2つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である(すなわち、同一性パーセント=同一位置の数/位置の総数(例えば、重複位置)×100)。一実施形態では、2つの配列は同じまたはほぼ同じ長さのものである。ギャップの許容にかかわらず、2つの配列間の同一性パーセントは、以下に記載されるものと同様の技術を使用して決定され得る。配列同一性パーセントの計算では、典型的には、完全一致がカウントされる。
2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin
and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990,87:2264、改定版Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら、J.Mol.Biol.1990;215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12でBLASTヌクレオチド検索を実施して、本発明の配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3でBLASTタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップアラインメントを取得するために、Altschulら、Nucleic Acids Res.1997,25:3389に記載されているように、Gapped BLASTが利用され得る。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施し得る。Altschulら(1997)、前掲を参照のこと。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトのパラメータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)が使用され得る。WorldWideWebのncbi.nlm.nih.gov/BLAST/を参照のこと。
and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990,87:2264、改定版Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら、J.Mol.Biol.1990;215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12でBLASTヌクレオチド検索を実施して、本発明の配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3でBLASTタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質配列に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップアラインメントを取得するために、Altschulら、Nucleic Acids Res.1997,25:3389に記載されているように、Gapped BLASTが利用され得る。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施し得る。Altschulら(1997)、前掲を参照のこと。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトのパラメータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)が使用され得る。WorldWideWebのncbi.nlm.nih.gov/BLAST/を参照のこと。
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Myers and Miller,CABIOS 1988;4:1 1-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウェイト残基表、ギャップ長さペナルティ12およびギャップペナルティ4が使用され得る。
好ましい実施形態では、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossum
62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ギャップウェイト16、14、12、10、8、6または4および長さウェイト1、2、3、4、5または6のいずれかを用いて、GCGソフトウェアパッケージ(Accelrys,Burlington,MA、WorldWideWebのaccelrys.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(J.Mol.Biol.1970,48:444-453)のアルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックス、ギャップウェイト40、50、60、70または80、長さウェイト1、2、3、4、5または6を使用するGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット(および分子が本発明の配列同一性または相同性制限であるかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかについて実施者が確信がない場合に使用され得るもの)は、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ拡張ペナルティ4、フレームシフトギャップペナルティ5でBlossum 62スコアリングマトリックスを使用することである。
62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ギャップウェイト16、14、12、10、8、6または4および長さウェイト1、2、3、4、5または6のいずれかを用いて、GCGソフトウェアパッケージ(Accelrys,Burlington,MA、WorldWideWebのaccelrys.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch(J.Mol.Biol.1970,48:444-453)のアルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックス、ギャップウェイト40、50、60、70または80、長さウェイト1、2、3、4、5または6を使用するGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット(および分子が本発明の配列同一性または相同性制限であるかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかについて実施者が確信がない場合に使用され得るもの)は、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ拡張ペナルティ4、フレームシフトギャップペナルティ5でBlossum 62スコアリングマトリックスを使用することである。
同一性パーセントが決定され得る方法の別の非限定的な例は、Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubelら、eds.,1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1に記載されているソフトウェアプログラムを使用することである。好ましくは、デフォルトのパラメータがアラインメントに使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用したBLASTである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用したBLASTNおよびBLASTPである:遺伝コード=標準;フィルタ=なし;鎖=両方;カットオフ=60;予想=10;マトリックス=BLOSUM62;説明=50配列;並べ替え=ハイスコア;データベース=非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+Swissタンパク質+SPupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTで見られ得る。
本明細書に記載される特性の統計分析は、標準的な試験、例えばt検定、ANOVAまたはカイ二乗検定により実施され得る。典型的には、統計的有意性は、p=0.05(5%)、より好ましくはp=0.01、p=0.001、p=0.0001、p=0.000001のレベルまで測定される。
ドメイン配列の「保存的に改変された変異体」も提供され得る。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたはそれを超える選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る(Batzerら、1991,Nucleic Acid Res.19:5081;Ohtsukaら、1985,J.Biol.Chem.260:2605-2608;Rossoliniら、1994,Mol.Cell.Probes 8:91-98)。
野生型タンパク質の「生物学的に活性な断片」、「生物学的に活性な形態」、「生物学的に活性な同等物」および「機能的誘導体」という用語は、活性の検出に適切なアッセイを使用して測定した場合に、野生型タンパク質の生物活性に少なくとも実質的に等しい(例えば、それと有意差がない)生物学的活性を有する。
本明細書で使用される場合、「インビボ」核酸送達、核酸移入、核酸療法」などは、改善されたLAMP構築物を生物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物の体に直接導入することを指し、それにより、改善されたLAMP構築物は、このような生物の細胞にインビボで導入される。
本明細書で使用される場合、「インサイチュー」という用語は、改善されたLAMP構築物を標的細胞に近接させるタイプのインビボ核酸送達を指す(例えば、核酸は全身投与されない)。例えば、インサイチュー送達方法は、限定されないが、改善されたLAMP構築物を部位(例えば、腫瘍または心筋などの組織)に直接注射するか、開いた手術野を通して改善されたLAMP構築物を細胞または組織と接触させるか、またはカテーテルなどの医療用アクセスデバイスを使用して改善されたLAMP構築物を部位に送達することを含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片が、天然で通常付随する細胞および他の構成物から分離されている(またはそれを実質的に含まない)ことを意味する。例えば、改善されたLAMP構築物に関して、単離されたポリヌクレオチドは、それが染色体で通常付随する5’および3’配列から分離されたものである。当業者には明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その天然に存在するカウンターパートと区別するために「単離」を必要としない。実質的に含まないまたは実質的に精製されたは、集団の少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%が、それらが天然で付随する構成要素を含まないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のレシピエントであることが望まれるかまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞を指す。この用語はまた、単一細胞の子孫を含むことを意図し、子孫は、天然、偶発的または意図的突然変異により、(形態またはゲノムまたは全DNA相補体の点で)元の親細胞と必ずしも完全に同一ではなくてもよい。標的細胞は、他の細胞と接触し得るか(例えば、組織内のように)、または生物の体内で循環して見られ得る。
本明細書で使用される場合、「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定されないが、ネズミ、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペットが挙げられる。他の好ましい実施形態では、「被験体」は齧歯類(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ラマ、ラクダ、ウシ、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長類、類人猿(例えば、サルまたはエイプ)、サル(例えば、マーモセット、ヒヒ、アカゲザル)またはエイプ(例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)である。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物(例えば、ネズミ科動物、霊長類、ブタ、イヌ科動物またはウサギ動物)が用いられ得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水およびエマルジョン、例えば油/水または水/油エマルジョン、ならびに様々なタイプの湿潤剤のいずれかを包含する。改善されたLAMP構築物を含む組成物はまた、安定剤および保存剤を含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Martin Remington’s Pharm.Sci.,15th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1975))を参照のこと。
このような核酸が細胞内に導入された場合、細胞は、改善されたLAMP構築物により「形質転換」、「形質導入」または「トランスフェクト」されている。形質転換DNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに組み込まれ(共有結合的に連結され)てもよいしまたはされなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、改善されたLAMP構築物は、プラスミドなどのエピソームエレメント上で維持され得る。真核細胞では、安定形質転換細胞は、改善されたLAMP構築物が、染色体複製を通じて娘細胞により継承されるように染色体に組み込まれているものである。この安定性は、改善されたLAMP構築物を含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力により実証される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代(例えば、少なくとも約10)にわたってインビトロで安定成長することができる初代細胞のクローンである。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、有益なまたは所望の結果に影響を与えるために十分な量、例えば、改善されたLAMP構築物の移入および/または発現および/または所望の治療エンドポイントの達成の有効量などである。有効量は、1回またはそれを超える投与、適用または投与量で投与され得る。一態様では、改善されたLAMP構築物の有効量は、少なくとも2つの細胞を含む細胞の集団における少なくとも1つの細胞を形質転換/形質導入/トランスフェクトするために十分な量である。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、異常な生理学的反応を予防、修正および/または正常化するために十分な量を意味するために本明細書で使用される。一態様では、「治療有効量」は、病状の臨床的に重要な特徴、例えば腫瘍塊のサイズ、抗体産生、サイトカイン産生、発熱または白血球数などを少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも90%減少させるのに十分な量である。
「抗体」は、特定の抗原に結合する抗体およびその断片を含む任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体(例えば、二重特異性抗体)を包含する。「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変および超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。例示的な抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、ならびにパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分(Fab、Fab’、F(ab’)2およびF(v)部分を含む)であり、これらの部分は、本明細書に記載される治療方法における使用に好ましい。したがって、抗体という用語は、抗体分子全体だけではなく、抗体断片ならびに抗体および抗体断片の変異体(融合タンパク質などの誘導体を含む)も包含する。本出願で「抗体」という用語により説明される分子の例としては、限定されないが、単鎖Fv(scFv)、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、FvおよびVLまたはVHドメインのいずれかを含むかあるいはそれからなる断片が挙げられる。本明細書で使用される場合、「単鎖Fv」または「scFv」という用語は、抗体のVHドメインに連結された抗体のVLドメインを含むポリペプチドを指す。Carter(2006)Nature Rev.Immunol.6:243を参照のこと。
加えて、本発明の抗体は、限定されないが、モノクローナル、多重特異性、二重特異性、ヒト、ヒト化、マウスまたはキメラ抗体、単鎖抗体、ラクダ科抗体、Fab断片、F(ab’)断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、ドメイン抗体および上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスのものであり得る。
最も好ましくは、抗体はヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリー、およびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたゼノマウスまたは他の生物から単離された抗体を含む。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物は、例示的なプロトコールに記載されているようにヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するための公知の技術と組み合わせて使用され得る。例えば、国際公開第98/24893号;国際公開第92/01047号;国際公開第96/34096号;国際公開第96/33735号;欧州特許第0598877号;米国特許第5,413,923号;米国特許第5,625,126号;米国特許第5,633,425号;米国特許第5,569,825号;米国特許第5,661,016号;米国特許第5,545,806号;米国特許第5,814,318号;米国特許第5,885,793号;米国特許第5,916,771号;および米国特許第5,939,598号;ならびにLonberg and Huszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)を参照のこと。
ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の技術と組み合わせて、改善されたLAMP構築物を使用して生産され得る。例えば、キメラ抗体を生産するための標準的な方法は当技術分野で公知である。総説については、以下の参考文献Morrison,Science 229:1202(1985);Oiら、BioTechniques 4:214(1986);Cabillyら、米国特許第4,816,567号;Taniguchiら、欧州特許第171496号;Morrisonら、欧州特許第173494号;Neubergerら、国際公開第8601533号;Robinsonら、国際公開第8702671号;Boulianneら、Nature 312:643(1984);Neubergerら、Nature 314:268(1985)を参照のこと。
本発明の抗体は、一価、二価、三価または多価であり得る。例えば、一価scFvは、化学的に、または別のタンパク質もしくは物質との会合により多量体化され得る。ヘキサヒスチジンタグまたはFlagタグに融合されたscFvは、Ni-NTAアガロース(Qiagen)または抗Flag抗体(Stratagene,Inc.)を使用して多量体化され得る。加えて、改善されたLAMP構築物は、改善されたLAMP構築物に含まれるコード化アレルゲンに対して単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより大きな多重特異性を生成するために使用され得る。例えば、国際公開第93/17715号;国際公開第92/08802号;国際公開第91/00360号;国際公開第92/05793号;Tuttら、J.Immunol.147:60-69(1991);米国特許第4,474,893号;米国特許第4,714,681号;米国特許第4,925,648号;米国特許第5,573,920号;米国特許第5,601,819号;Kostelnyら、J.Immunol.148:1547-1553(1992)を参照のこと。
「エピトープ」は、通常、免疫系の構成要素により特異的に認識または特異的に結合される短いペプチド配列またはオリゴ糖から構成される構造である。T細胞エピトープは、一般に線状オリゴペプチドであることが示されている。同じ抗体により特異的に結合され得る場合、2つのエピトープは互いに対応する。両方が、同じB細胞受容体または同じT細胞受容体に結合することができる場合、2つのエピトープは互いに対応し、そのエピトープへの一方の抗体の結合は、他方のエピトープによる結合を実質的に妨げる(例えば、他方のエピトープの約30%未満、好ましくは約20%未満、より好ましくは約10%、5%、1%または約0.1%未満が結合する)。本発明では、複数のエピトープがアレルゲンX(配列番号Y)を構成し得る。
本明細書で使用される場合、「アレルゲン」または「目的のアレルゲン」という用語は、表1/図14に示されているように自然免疫反応または適応免疫反応を誘発するために使用される改善されたLAMP構築物にクローニングされたポリヌクレオチド配列によりコードされる任意のポリペプチド配列をカバーする。「アレルゲン」は、改善されたLAMP構築物にクローニングされた単一のアレルゲンおよび(同じまたは異なるタンパク質に由来する)複数のアレルゲン配列の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子またはその一部あるいは1つまたはそれを超える非古典的MHC分子またはその一部に関連するアレルゲンをその表面に提示する任意の細胞を含む。適切なAPCの例は以下で詳細に記載され、限定されないが、全細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、B細胞、ハイブリッドAPCおよびフォスター抗原提示細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「操作された抗原提示細胞」は、その表面に非天然分子部分を有する抗原提示細胞を指す。例えば、このような細胞は、その表面に共刺激物質を天然に有しなくてもよいし、またはその表面に天然共刺激物質に加えてさらなる人工共刺激物質を有してもよいし、またはその表面に非天然クラスII分子を発現してもよい。好ましい実施形態では、操作された抗原提示細胞は、その表面に、改善されたLAMP構築物から発現されたアレルゲンを有する。
本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」は、アレルゲンに結合することができる細胞であって、免疫反応を媒介する細胞を指す。これらの細胞としては、限定されないが、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞および細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、例えばCTL株、CTLクローンおよび腫瘍、炎症性または他の浸潤からのCTLが挙げられる。
「ベクター」は、プラスミドおよびウイルス、ならびに自己複製するかにかかわらず、細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る任意のDNAまたはRNA分子を含む。
細胞の「単離された」または「精製された」集団は、それが天然で付随する細胞および材料を実質的に含まない。実質的に含まないまたは実質的に精製されたAPCは、集団の少なくとも50%がAPCであり、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%が、それらが天然で付随する非APC細胞を含まないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」は、細胞の通常ヌクレオチドへの任意の付加、欠失または破壊を指す。APCの遺伝的改変が達成し得る任意の方法は、本発明の精神および範囲内である。当技術分野で認められている方法としては、ウイルス媒介遺伝子移入、リポソーム媒介移入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えばウイルス媒介遺伝子移入、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどのDNAウイルスをベースとする改善されたLAMP構築物、ならびにレトロウイルスベースのベクターの使用が挙げられる。
特に指示がない限り、本発明の実施は、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術を用いる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Maniatis,Fritsch&Sambrook,In Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I
and II(D.N.Glover,ed.,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.D.Hames&S.I.Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照のこと。
and II(D.N.Glover,ed.,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.D.Hames&S.I.Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)を参照のこと。
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本明細書に記載される本発明に関連して使用され得るデバイス、製剤および方法論を説明および開示する目的で参照により組み込まれる。
LAMP構築物
LAMP-1は、cDNAクローンから推論されるように(Chenら、J.Biol.Chem.263:8754,1988)、大きな(346残基)内腔アミノ末端ドメイン、続いて24残基の疎水性膜貫通領域および短い(12残基)カルボキシル末端細胞質尾部を有する約382個のアミノ酸のポリペプチドコアからなる。図2Aおよび2Bを参照のこと。内腔ドメインは高度にグリコシル化され、約20個のアスパラギン連結複合型オリゴ糖で置換されており、プロリン/セリンリッチなヒンジ領域により分離された2つの約160残基の「相同ドメイン」からなる。これらの「相同ドメイン」はそれぞれ、4つの均一間隔システイン残基を含み、ジスルフィド結合して、内腔ドメインの2等分内に対称的に配置された4つの36~38残基のループを形成する(Arterburnら、J.Biol.Chem.265:7419,1990;Chenら、J.Biol.Chem.25:263(18):8754-8,1988)も参照のこと)。図2Aは、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3、Endolyn、LIMBIC、LAMP5またはMacrosailin間の保存されたドメインを模式的に示す。
LAMP-1は、cDNAクローンから推論されるように(Chenら、J.Biol.Chem.263:8754,1988)、大きな(346残基)内腔アミノ末端ドメイン、続いて24残基の疎水性膜貫通領域および短い(12残基)カルボキシル末端細胞質尾部を有する約382個のアミノ酸のポリペプチドコアからなる。図2Aおよび2Bを参照のこと。内腔ドメインは高度にグリコシル化され、約20個のアスパラギン連結複合型オリゴ糖で置換されており、プロリン/セリンリッチなヒンジ領域により分離された2つの約160残基の「相同ドメイン」からなる。これらの「相同ドメイン」はそれぞれ、4つの均一間隔システイン残基を含み、ジスルフィド結合して、内腔ドメインの2等分内に対称的に配置された4つの36~38残基のループを形成する(Arterburnら、J.Biol.Chem.265:7419,1990;Chenら、J.Biol.Chem.25:263(18):8754-8,1988)も参照のこと)。図2Aは、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3、Endolyn、LIMBIC、LAMP5またはMacrosailin間の保存されたドメインを模式的に示す。
以前に報告されているLAMP構築物は、この特定の配置で以下のエレメントを含む:(a)LAMP-1タンパク質の全内腔ドメイン、抗原、次いでLAMP-1タンパク質の全膜貫通/細胞質尾部または(b)抗原およびLAMP-1タンパク質の全膜貫通/細胞質尾部。例(a)では、抗原配列は、LAMP-1タンパク質の全内腔ドメインとLAMP-1全膜貫通ドメイン/細胞質尾部との間に挿入される。両構築物は、抗原配列をリソソーム/エンドソームに成功裏にターゲティングすることが示されており、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物ILC1~ILC6と比較して、図1に示されているように「完全LAMP構築物」と称される。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物は、先行技術に記載されている完全LAMP構築物を含まない。
文献では、LAMP-1の全内腔ドメインよりも小さい断片は、ロバストな免疫反応の生成において有効ではないことが広く報告されている(例えば、Godinhoらを参照のこと)。対照的に、本発明者らは、予想外のことに、特定の断片が、特定の配置において、アレルゲンを免疫系に実際に有効に提示して、多くの場合において、抗体の異なるレパートリーの生成を含むよりロバストな免疫反応を生成したことを発見した。例えば、本発明者らは、ロバストな免疫反応を生成するために有効な最小LAMP内腔ドメイン断片が、(文献で広く報告されている)全内腔ドメインではなく、むしろLAMPタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインであることを特定した。
例えば、構築物は、全内腔ドメインではなく、LAMPタンパク質の内腔ドメインの単一の相同ドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「相同ドメイン」は、図3~10に示されている少なくとも4つの均一間隔システイン残基を含む。これらのシステインの存在は、図3~10に示されているように、各相同ドメインで1、2、3および4と表示されており(LIMP-2およびMacrosailinでは5つのシステインが識別され、LIMBICでは6つのシステインが識別され、Endolynでは8つのシステインが識別されている)、本明細書では「システイン保存断片」と定義される。さらなるアミノ酸をシステイン保存断片のN末端および/またはC末端のいずれかに含めて、LAMPタンパク質の全相同ドメインまでを生成し得る。これらのさらなる追加アミノ酸は、システイン保存断片が由来する相同ドメインまたは他のLAMPタンパク質相同ドメインに由来し得る。したがって、本明細書で使用される場合、LAMP相同ドメインは、1つのシステイン保存断片を含み、および/またはそれからなる。少なくとも2つのLAMP相同ドメインは、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3またはEndolynの内腔ドメインを構成する。
具体的には、好ましい一実施形態では、改善されたLAMP構築物は、表1/図14に記載されている少なくとも1つのアレルゲンならびに/または段落[0136~0137]および表2に記載されている組み合わせがLAMPタンパク質の内腔ドメイン、LAMPタンパク質の少なくとも1つの相同ドメインまたはLAMPタンパク質の少なくとも1つのシステイン保存断片のN末端に融合されたものを含む。例えば、図1のILC-2およびILC-6を参照のこと。好ましい実施形態では、これらの構築物はまた、LAMPタンパク質の膜貫通ドメインおよび/またはLAMPタンパク質の細胞質尾部を含む。他の好ましい実施形態では、アレルゲンX(配列番号Y)が膜貫通ドメインを含む場合、LAMPタンパク質の膜貫通ドメインおよび/またはLAMPタンパク質の細胞質尾部は不要である。好ましい実施形態では、2つの相同ドメインが、改善されたLAMP構築物に含まれる(例えば、図1のILC-1)。さらに好ましい実施形態では、2つの相同ドメインは、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3またはEndolynタンパク質に由来する。あるいは、2つの相同ドメインは、異なるLAMPタンパク質に由来する。2つの相同ドメインを含むこれらの構築物では、LAMPヒンジドメインも含まれ得る。抗原は、全LAMP-1内腔ドメインと全LAMP-1膜貫通/細胞質尾部との間に常に配置されており、内腔ドメインの断片は、ロバストな免疫反応の生成において有効ではないと報告されているので、この段落に記載されている改善されたLAMP構築物は、先行技術の観点から予想外である。
別の好ましい実施形態では、改善されたLAMP構築物は、表1/図14に記載されている少なくとも1つのアレルゲンならびに/または段落[0136~0137]および表2に記載されている組み合わせがLAMPタンパク質の単一の相同ドメインまたはLAMPタンパク質の単一のシステイン保存断片のC末端に融合されたものを含む(例えば、図1のILC-5)。好ましい実施形態では、これらの構築物はまた、LAMPタンパク質の膜貫通ドメインおよび/またはLAMPタンパク質の細胞質尾部を含む(例えば、図1のILC-3)。他の好ましい実施形態では、アレルゲンX(配列番号:Y)が膜貫通ドメインを含む場合、LAMPタンパク質の膜貫通ドメインおよび/またはLAMPタンパク質の細胞質尾部は不要である。あるいは、2つの異なるLAMPタンパク質由来の2つの相同ドメインが使用され得る。アレルゲンは、全内腔LAMP-1ドメインと全LAMP-1膜貫通/細胞質尾部との間に常に配置されており、内腔ドメインの断片は、ロバストな免疫反応の生成において有効であると報告されていないので、この段落に記載されている改善されたLAMP構築物は、先行技術の観点から予想外である。
したがって、改善されたLAMP構築物は、表1/図14に記載されている少なくとも1つのアレルゲンならびに/または段落[0136~0137]および表2に記載されている組み合わせがLAMPタンパク質の単一の相同ドメインまたはLAMPタンパク質の単一のシステイン保存断片のC末端に融合されたものを含む。例えば、図1のILC-3およびILC-5を参照のこと。好ましい実施形態では、これらの構築物はまた、LAMPタンパク質の膜貫通ドメインおよび/またはLAMPタンパク質の細胞質尾部を含む。他の好ましい実施形態では、アレルゲンX(配列番号Y)が膜貫通ドメインを含む場合、LAMPタンパク質の膜貫通ドメインおよび/またはLAMPタンパク質の細胞質尾部は不要である。この段落に記載されている改善されたLAMP構築物は、上記のように先行技術の観点から予想外である。
別の好ましい実施形態では、改善されたLAMP構築物は、少なくとも1つの目的のアレルゲンがLAMPタンパク質の第1の相同ドメインとLAMPタンパク質の第2の相同ドメインとの間(または少なくとも2つのシステイン保存断片の間)に融合されたものを含む。例えば、図1のILC-4を参照のこと。好ましい実施形態では、2つの相同ドメインは、LAMP-1、LAMP-2、LAMP-3またはEndolynタンパク質に由来する。これらの構築物では、アレルゲンは、LAMPヒンジ領域に配置され得る。あるいは、2つの異なるLAMPタンパク質由来の2つの相同ドメインが使用され得る。表1/図14に記載されている少なくとも1つのアレルゲンならびに/または段落[0136~0137]および表2に記載されている組み合わせが2つのLAMP相同ドメイン(システイン保存断片を含む)間に融合されたこの構成は、上記のように先行技術の観点からは予想外である。
上記で定義される改善されたLAMP構築物はそれぞれ、図で定義されるドメインを使用して生成され得る。例えば、図1に示されている改善されたLAMP構築物に含まれるドメインは、例えば、オーソログ配列由来の配列に由来し得ることが特に企図される。例えば、図3~10を参照のこと。図2Aおよび2Bで定義される同等のドメインを使用して、オーソログ配列について図1に示されている改善されたLAMP構築物を生成することが明確に企図される。また、図3~10に示されているオーソログ配列は、ドメインを生成するために使用され得る配列の代表的ものである。他のオーソログ配列および/またはアイソタイプを識別し、それらを図3~10に示されているアラインメントと比較することは、十分に当技術分野の技術の範囲内である。したがって、図3~10に示されているアラインメントを有するヒトLAMPタンパク質について、図2Aおよび2Bで定義される同等の境界を識別することにより、図1に示されている改善されたLAMP構築物を生成し得る。
当業者により十分に理解されるように、各ドメインの境界は概算であり、クローニングの検討事項および制限酵素の配置に基づいて、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸調整され得る。したがって、特定のドメイン(例えば、LAMP相同ドメイン)が改善されたLAMP構築物に含まれる場合、ドメインの開始および終了のアミノ酸は、図2Aで定義される境界のように少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個アミノ酸調整され得る。
上記改善されたLAMP構築物はそれぞれ、当技術分野で周知のように、クローニング目的で各ドメイン間にシグナル配列および/またはさらなるアミノ酸をさらに含み得る。加えて、LAMP相同ドメイン、LAMP内腔ドメイン、LAMP膜貫通ドメインおよび/またはLAMP細胞質尾部ドメインは、同じLAMPタンパク質(例えば、ヒトLAMP-1)または異なるLAMPタンパク質(例えば、ヒトLAMP-1由来の内腔ドメインおよびヒトLAMP-2由来の膜貫通ドメインならびに/または同じ遺伝子ファミリー(例えば、LAMP-1)もしくは異なる遺伝子ファミリー(LAMP-1およびLAMP-2)のオーソログドメインの混合に由来し得る。
記載されるLAMP構築物のポリペプチド変異体が企図される。例えば、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のいずれかと少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%または99%同一のポリペプチドおよびこれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが企図される。改善されたLAMP構築物の変異体は、アレルゲン性配列をリソソームにターゲティングすることにより機能する能力を保持する。例えば、改変内腔配列は、元のドメイン配列と比較して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約100%の有効性、すなわち、免疫反応を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で、膜および非膜抗原性材料の両方をエンドソーム区画に輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、オボアルブミンの十分に特徴付けられた抗原性ドメインと、膜貫通ドメインと、推定リソソーム/エンドソームターゲティングシグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインとを含む改善されたLAMP構築物を構築することにより識別され得る。ターゲティングの効率は、改善されたLAMP構築物を発現する抗原提示細胞がHAエピトープ特異的MHCクラスII拘束性T細胞を刺激する能力を決定することにより測定され得る(例えば、米国特許第5,633,234号の実施例5を参照のこと)。
記載される改善されたLAMP構築物のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物ポリヌクレオチドのいずれかと少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%または99%同一のポリヌクレオチドと共に、本発明の好ましい実施形態である。改善されたLAMP構築物の変異体は、アレルゲン性配列をリソソームにターゲティングすることにより機能する能力を保持する。例えば、改変内腔配列は、元のドメイン配列と比較して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約100%の有効性、すなわち、免疫反応を開始するためのキメラ配列を含む細胞による十分な抗原提示をもたらす有効性で、膜および非膜抗原性材料の両方をエンドソーム区画に輸送する能力を保持しなければならない。一態様では、適切な輸送シグナルを含む配列は、オボアルブミンの十分に特徴付けられた抗原性ドメインと、膜貫通ドメインと、推定リソソーム/エンドソームターゲティングシグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインとを含む改善されたLAMP構築物を構築することにより識別され得る。ターゲティングの効率は、改善されたLAMP構築物を発現する抗原提示細胞がHAエピトープ特異的MHCクラスII拘束性T細胞を刺激する能力を決定することにより測定され得る(例えば、米国特許第5,633,234号の実施例5を参照のこと)。
アレルゲン
表1/図14に示されている以下のアレルゲン(例えば、アレルゲンX)は、当業者に周知の技術を使用して、本明細書に記載される各LAMP構築物にクローニングされ得る。また、表1/図14に列挙されているアレルゲンX(配列番号Y)のいずれか1つを、表1/図14に列挙されている任意の他の抗原と組み合わせ、本明細書に記載される、具体的には表2に開示されている改善されたLAMP構築物に挿入し得ることが特に企図される。
表1/図14に示されている以下のアレルゲン(例えば、アレルゲンX)は、当業者に周知の技術を使用して、本明細書に記載される各LAMP構築物にクローニングされ得る。また、表1/図14に列挙されているアレルゲンX(配列番号Y)のいずれか1つを、表1/図14に列挙されている任意の他の抗原と組み合わせ、本明細書に記載される、具体的には表2に開示されている改善されたLAMP構築物に挿入し得ることが特に企図される。
本明細書で使用される場合、「アレルゲンX」という用語は、以下の表1/図14に列挙されている特定の遺伝子/タンパク質、シグナル配列が除去された(例えば、表1の列3に記載されている)その断片(例えば、配列番号Yの断片(例えば、表1の列4に記載されている))、または個体への反復曝露によりアレルギー、すなわちIgE媒介反応を誘導することが公知の列挙されているタンパク質の混合物を指す。一般に、アレルゲンは、アレルギー反応を惹起することができる任意の化合物、物質または材料である。アレルゲンは、通常、免疫反応を惹起することができる化合物、物質または材料である抗原のサブカテゴリとして理解される。本発明を実行するために、アレルゲンXは、とりわけ、天然またはネイティブアレルゲン、改変天然アレルゲン、合成アレルゲン、組換えアレルゲン、アレルゴイドおよびそれらの混合物または組み合わせから選択され得る。特に興味深いものは、IgE媒介即時型過敏症を引き起こすことができるアレルゲンXである。
本明細書で使用される場合、アレルゲンXのアミノ酸配列は、(シグナル配列の有無にかかわらず)配列番号Yのいずれか1つを含む。アレルゲンX(配列番号Y)をコードし得るポリヌクレオチドの代表的な例は、表1/図14に配列番号Zとして示されているか、または表1の列2に記載されているアレルゲンXもしくは列4に記載されている断片をコードする任意のポリヌクレオチド(例えば、コドン最適化配列)として示されている。これらのポリヌクレオチドは、(配列番号Yのシグナル配列の有無にかかわらず)図1に示されているように構築物ILC1~6のいずれか1つに挿入される。挿入は、配列番号Yのアミノ酸配列に隣接するクローニング配列、例えば「Leu-Glu」および「Glu-Phe」をコードするポリヌクレオチド(例えば、「CTCGAG」および「GAATTC」」などの使用により促進され得る。本明細書で使用される場合、「アレルゲンX」はまた、アレルゲンXの変異体(断片を含む)を包含する。例えば、好ましい実施形態は、(表1の列2または列4に記載されているように)配列番号Yと少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアレルゲンXポリペプチド変異体を含む。これらの変異体は、(a)それが由来するアレルゲンXと交差反応する抗体を生じさせる能力および/または(b)アレルゲンX生物学的活性のいずれかを保持する。これらの変異体アレルゲンXポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが特に企図される。
本発明はさらに、表1/図14のアレルゲンXのいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、例えば、アレルゲンX(配列番号Y)、例えば配列番号Zなどをコードする核酸または表1の列2に記載されているアレルゲンXもしくは列4に記載されている断片をコードする任意のポリヌクレオチド(例えば、コドン最適化配列)を含むベクターであって、前記核酸分子が、ILC1~6のいずれか1つにおける発現制御配列に作動可能に連結されているベクターを提供する。好ましい一態様では、ベクターは、アレルゲンXに対して患者をワクチン接種するために適切なワクチンベクターである。別の態様では、本発明は、細胞への核酸分子の導入を容易にするための核酸分子を含む送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、脂質ベース(例えば、リポソーム製剤)、ウイルスベース(例えば、核酸分子をカプセル化するウイルスタンパク質を含む)または細胞ベースのものであり得る。好ましい一態様では、ベクターはワクチンベクターである。当業者により十分に理解されるように、表1の列1および4は、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物にクローニングすべき好ましいアミノ酸を規定する。しかしながら、表1の列1および4に記載されている断片のN末端およびC末端境界は両方とも概算であり、クローニングの検討事項および制限酵素の配置に基づいて、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸調整され得る。したがって、改善されたLAMP構築物にアレルゲンXが含まれる場合、アレルゲンXの開始および終了のアミノ酸は、表1の列1および4で定義されるように少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸調整され得る。
加えて、1つを超えるアレルゲンXを(任意の順序で)組み合わせて、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のいずれか1つのようにワクチンとして投与し得る。アレルゲンXの組み合わせは、単一の改善されたLAMP構築物内にクローニングされ得るか、またはアレルゲンXの複数の改善されたLAMP構築物を含む組成物で送達され得ることが特に想定される。具体的には、表1/図14に記載されているアレルゲンXは、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物に個々に、または表2に記載されている1つの別のアレルゲンXと組み合わせてクローニングされ得る。このリストは、改善されたLAMP構築物が含むものを記載し、特定の構築物内のアレルゲンXの配置を必ずしも記載する必要はないので、特定の改善されたLAMP構築物について表2に記載されているアレルゲンXの組み合わせの順序は変動し得る。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物は、(a)表1/図14に示されている配列番号Zのポリヌクレオチドのいずれか1つ;(b)表1/図14に示されている配列番号Zのポリヌクレオチドのいずれか1つによりコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;(c)表1/図14に示されている配列番号Yの列2もしくは列4のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;または(g)(a)~(c)のポリヌクレオチドのいずれか1つと少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するポリヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、さらなる好ましい実施形態である。
改善されたLAMP構築物をコードする配列のアセンブリ
目的のアレルゲンを含む改善されたLAMP構築物を構築する手順は、当技術分野で周知である(例えば、Williamsら、J.Cell Biol.111:955,1990を参照のこと)。目的のセグメントをコードするDNA配列は、容易に入手可能な組換えDNA材料、例えばAmerican Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Md.20852,U.S.A.からまたは所望のDNAを含むDNAライブラリーから入手可能なものから得られ得る。
目的のアレルゲンを含む改善されたLAMP構築物を構築する手順は、当技術分野で周知である(例えば、Williamsら、J.Cell Biol.111:955,1990を参照のこと)。目的のセグメントをコードするDNA配列は、容易に入手可能な組換えDNA材料、例えばAmerican Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Md.20852,U.S.A.からまたは所望のDNAを含むDNAライブラリーから入手可能なものから得られ得る。
例えば、所望のドメイン配列に対応するDNAセグメントは、組換えDNA方法論のルーチンな手順を使用して、適切な制御およびシグナル配列と共にアセンブリされ得る。例えば、米国特許第4,593,002号およびLangfordら、Molec.Cell.Biol.6:3191,1986における記載を参照のこと。
タンパク質またはポリペプチドをコードするDNA配列は化学的に合成され得るか、またはいくつかのアプローチの1つにより単離され得る。合成されるDNA配列は、所望のアミノ酸配列に適切なコドンを使用して設計され得る。一般に、配列が発現に使用される宿主のための好ましいコドンを選択する。完全配列は、標準的な方法で調製された重複オリゴヌクレオチドからアセンブリされ得、完全コード配列にアセンブリされ得る。例えば、Edge,Nature 292:756,1981;Nambairら、Science 223:1299,1984;Jayら、J.Biol.Chem.259:6311,1984を参照のこと。
一態様では、改善されたLAMP構築物のドメイン配列をコードする1つまたはそれを超える核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して個々に単離される(M.A.Innisら、In PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,1990)。ドメインは、好ましくは、それらを含むことが公知の公的に入手可能なクローンから単離されるが、それらはまた、ゲノムDNAまたはcDNAライブラリーから単離され得る。好ましくは、単離された断片は、アレルゲン配列をコードする改善されたLAMP構築物の構築を可能にする適合制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接する。この技術は当業者に周知である。ドメイン配列は、互いに直接融合され得るか(例えば、介在配列なしで)、または互いに挿入され得るか(例えば、ドメイン配列が不連続である場合)、または介在配列により分離され得る(例えば、リンカー配列など)。
オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよびDNAライブラリーを調製するための基本戦略、ならびに核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは当業者に周知である。例えば、Sambrookら、1989、前掲;Perbal,1984、前掲を参照のこと。適切なゲノムDNAまたはcDNAライブラリーの構築は、当技術分野の範囲内である。例えば、Perbal,1984、前掲を参照のこと。あるいは、適切なDNAライブラリーまたは公的に入手可能なクローンは、生物学的研究材料の供給業者、例えばClontechおよびStratageneから、ならびに公的な寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collectionから入手可能である。
選択は、DNAの発現ライブラリーから配列を発現させ、発現ペプチドを免疫学的に検出することにより達成され得る。MHC II分子および所望の抗体/T細胞受容体に結合するペプチドを発現するクローンが選択される。これらの選択手順は当業者に周知である(例えば、Sambrookら、1989、前掲を参照のこと)。
所望のポリペプチド配列のコード配列を含むクローンが調製または単離されたら、配列は、好ましくは宿主細胞で配列を維持するための複製起点を含む任意の適切なベクターにクローニングされ得る。
核酸送達ビヒクル
一態様では、改善されたLAMP構築物を含むワクチン組成物は、細胞に導入される。細胞は、核酸を複製するための、または改善されたLAMP構築物を発現させるための宿主細胞であり得る。好ましくは、改善されたLAMP構築物を発現させるための宿主細胞は、抗原提示細胞である(以下にさらに記載される)。
一態様では、改善されたLAMP構築物を含むワクチン組成物は、細胞に導入される。細胞は、核酸を複製するための、または改善されたLAMP構築物を発現させるための宿主細胞であり得る。好ましくは、改善されたLAMP構築物を発現させるための宿主細胞は、抗原提示細胞である(以下にさらに記載される)。
好ましい実施形態では、改善されたLAMP構築物は、標的細胞への挿入のためのポリヌクレオチド配列と、細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現(例えば、転写および/または翻訳)を制御するためにそれに作動可能に連結された発現制御配列とをさらに含む。例としては、プラスミド、ファージ、自律複製配列(ARS)、動原体、ならびにインビトロでまたは宿主細胞(例えば、細菌、酵母、昆虫細胞など)および/もしくは標的細胞(例えば、哺乳動物細胞、好ましくは抗原提示細胞など)で複製することができるかまたは複製されることができ、および/または改善されたLAMP構築物をコードする配列を標的細胞内の所望の位置に運搬することができる他の配列が挙げられる。
組換え発現ベクターは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコまたはニワトリを含む動物に容易に感染する微生物に由来し得る。好ましいベクターとしては、生ワクチンとして既に使用されているもの、例えばワクシニアが挙げられる。これらの組換え体は宿主に直接接種され得、微生物ベクターだけではなく外来アレルゲンを発現する免疫も付与する。生組換えワクチンとして本明細書で企図される好ましいベクターとしては、例えば、Flexner,Adv.Pharmacol.21:51,1990に教示されているように、RNAウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ワクシニアおよび他のポックスウイルスが挙げられる。
発現制御配列としては、限定されないが、RNAポリメラーゼに結合するプロモーター配列、それぞれ転写アクチベーターおよびリプレッサーに結合するエンハンサー配列または負の調節エレメントならびに/またはリボソーム結合のための翻訳開始配列が挙げられる。例えば、細菌発現ベクターは、lacプロモーターなどのプロモーター、ならびに転写開始についてはシャイン-ダルガーノ配列および開始コドンAUGを含み得る(Sambrookら、1989、前掲)。同様に、真核生物発現ベクターは、好ましくは、RNAポリメラーゼIIのための非相同、相同またはキメラプロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUGおよびリボソームの分離のための終止コドンを含む。
発現制御配列は、天然に存在する遺伝子から取得され得るか、または設計され得る。設計された発現制御配列としては、限定されないが、突然変異および/またはキメラ発現制御配列、または合成もしくはクローニングされたコンセンサス配列が挙げられる。プロモーターと、ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術分野で周知である。このようなベクターは、インビトロまたはインビボでRNAを転写することができ、Stratagene(La Jolla,Calif.)およびPromega Biotech(Madison,Wis.)などの供給業者から市販されている。
発現および/または転写を最適化するために、ベクターの5’および/または3’非翻訳部分を除去し、追加しまたは変化させて、転写または翻訳のいずれかのレベルで発現に干渉するかまたはそれを減少させ得る追加的または代替的な翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの5’に直接挿入して、発現を増強し得る。多種多様な発現制御配列(それに作動可能に連結されたDNA配列の発現を制御する配列)をこれらのベクターで使用して、本発明のDNA配列を発現させ得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、SV40、CMV、ワクシニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスの初期または後期プロモーターおよび哺乳動物細胞の遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列ならびにそれらの様々な組み合わせが挙げられる。
一態様では、改善されたLAMP構築物は、ベクターを複製するための複製起点を含む。好ましくは、起点は、標的細胞への送達に使用するために十分な数の配列のコピーを生成するために使用され得る少なくとも1つタイプの宿主細胞で機能する。したがって、適切な起点としては、限定されないが、細菌細胞(例えば、Escherichia属、Salmonella属、Proteus属、Clostridium属、Klebsiella属、Bacillus属、Streptomyces属およびPseudomonas属など)、酵母(例えば、Saccharamyces属またはPichia属など)、昆虫細胞および哺乳動物細胞で機能するものが挙げられる。好ましい一態様では、核酸送達ビヒクルが導入される標的細胞(例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞)で機能する複製起点が提供される。別の態様では、少なくとも2つの複製起点が提供され、1つは宿主細胞で機能し、1つは標的細胞で機能する。
あるいはまたは加えて、改善されたLAMP構築物は、標的細胞染色体への核酸送達ベクターの少なくとも一部の組み込みを容易にする配列を含み得る。例えば、改善されたLAMP構築物は、標的細胞染色体DNAと相同の領域を含み得る。一態様では、送達ベクターは、改善されたLAMP構築物をコードする核酸配列に隣接する2つまたはそれを超える組換え部位を含む。
ベクターが標的細胞に成功裏に導入され、および/または標的細胞により発現され得ることを確認するために、ベクターは、検出可能および/または選択可能なマーカーをさらに含み得る。これらのマーカーは、活性、例えば限定されないが、RNA、ペプチドもしくはタンパク質の産生をコードし得るか、またはRNA、ペプチド、タンパク質、無機および有機化合物もしくは組成物などのための結合部位を提供し得る。
検出可能/選択可能なマーカー遺伝子の例としては、限定されないが、毒性化合物に対する耐性を提供する生成物(例えば、抗生物質)をコードするDNAセグメント;レシピエント細胞に存在しない生成物(例えば、tRNA遺伝子、栄養要求性マーカー)をコードするDNAセグメント;遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードするDNAセグメント;容易に識別可能である生成物(例えば、β-ガラクトシダーゼなどの表現型マーカー、蛍光タンパク質(GFP、CFP、YFG、BFP、RFP、EGFP、EYFP、EBFP、dsRed、それらの突然変異型、改変型または増強型など)および細胞表面タンパク質)をコードするDNAセグメント;細胞の生存および/もしくは機能に有害な生成物を結合するDNAセグメント;他の核酸セグメントの活性を阻害するDNAセグメント(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド);基質を改変する生成物(例えば、制限エンドヌクレアーゼ)を結合するDNAセグメント;所望の分子を単離もしくは識別するために使用され得るDNAセグメント(例えば、特定のタンパク質結合部位をコードするセグメント);プライマー配列;存在しない場合、特定の化合物に対する抵抗性もしくは感受性を直接的もしくは間接的に付与するDNAセグメント;ならびに/またはレシピエント細胞で毒性の生成物をコードするDNAセグメントが挙げられる。
マーカー遺伝子は、成功した遺伝子移入の立体構造のマーカーとして、および/または移入された遺伝子を発現する細胞を単離するために、および/または移入された遺伝子を細胞から回収するために使用され得る。例えば、一態様では、マーカー遺伝子は、改善されたLAMP構築物を発現する抗原提示細胞を単離および精製するために使用される。
実質的に類似の遺伝子、例えば、公知の遺伝子と約50%超、約70%超、80%超、約90%超、好ましくは約95%超の同一性を有する遺伝子が提供され得る。実質的に類似のドメイン配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で目的のドメイン配列に特異的にハイブリダイズする配列を選択することにより最初に識別され得る。相同、変異または改変ドメイン配列の適合性を決定するためのアッセイの実施は、適切な活性を発現する配列のスクリーニングの問題にすぎない。このようなスクリーニングは、当技術分野ではルーチンである。
改善されたLAMP構築物は、ネイキッド核酸として、または細胞への核酸の進入を促進するための1つもしくはそれを超える分子に関連する送達ビヒクルで提供され得る。適切な送達ビヒクルとしては、限定されないが、リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、ウイルス製剤(例えば、ウイルス、ウイルス粒子、人工ウイルスエンベロープなどを含む)、細胞送達ビヒクルなどが挙げられる。
脂質ベースの製剤
改善されたLAMP構築物の細胞内送達を容易にするように設計された送達ビヒクルは、(例えば、原形質膜、組織液、細胞内の区画などにおける)非極性および極性環境の両方と相互作用しなければならない。したがって、好ましくは、送達ビヒクルは、極性および非極性ドメインの両方、または改善されたLAMP構築物を細胞に移行させるための移行配列を含むように設計される。
改善されたLAMP構築物の細胞内送達を容易にするように設計された送達ビヒクルは、(例えば、原形質膜、組織液、細胞内の区画などにおける)非極性および極性環境の両方と相互作用しなければならない。したがって、好ましくは、送達ビヒクルは、極性および非極性ドメインの両方、または改善されたLAMP構築物を細胞に移行させるための移行配列を含むように設計される。
極性ドメインおよび非極性ドメインを有する化合物は、両親媒性物質と称される。カチオン性両親媒性物質は、DNAなどの負荷電ポリヌクレオチドと相互作用するために、生理学的pHまたはその付近で正に帯電されることができる極性基を有する。
本明細書に記載される改善されたLAMP構築物は、細胞膜を横断するベクターの移動を容易にするために脂質単層または二重層を含む製剤で提供され得る。リポソームまたは任意の形態の脂質膜、例えば平面脂質膜またはインタクトな細胞、例えば赤血球の細胞膜が使用され得る。リポソーム製剤は、静脈内または経口投与を含む任意の手段により投与され得る。
リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法にしたがって調製され得、当技術分野で周知である。例えば、Remington’s;Akimaru,1995,Cytokines Mol.Ther.1:197-210;Alving,1995,Immunol.Rev.145:5-31;Szoka,1980,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467;米国特許第4,235,871号;米国特許第4,501,728号;および米国特許第4,837,028号を参照のこと。一態様では、リポソームは、リポソーム、すなわち改善されたLAMP構築物複合体を特定の細胞タイプにターゲティングするためのターゲティング分子を含む。特に好ましい態様では、ターゲティング分子は、血管または標的組織に見られる細胞の表面上の生体分子(例えば、受容体またはリガンド)に対する結合パートナー(例えば、リガンドまたは受容体)を含む。
リポソームの電荷は、血液からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、負荷電リポソームは、細網内皮系によってより迅速に取り込まれるので(Juliano,1975,Biochem.Biophys.Res.Commun.63:651)、より短い血流中半減期を有する。ホスファチジルエタノールアミン誘導体の組み込みは、リポソームの凝集を防止することにより、循環時間を増強する。例えば、L-α-ジステアロイルホスファチジルコリンの大きな単ラメラ小胞へのN-(ω-カルボキシ)アシルアミドホスファチジルエタノールアミンの組み込みは、インビボリポソーム循環寿命を劇的に増加させる(例えば、Ahl,1997,Biochim.Biophys.Acta 1329:370-382を参照のこと)。長期の循環半減期を有するリポソームは、典型的には、治療および診断用途に望ましい。薬物動態の一般的な議論については、例えば、Remington’s,Chapters 37-39,Leeら、In Pharmacokinetic Analysis:A Practical Approach(Technomic Publishing AG,Basel,Switzerland 1996)を参照のこと。
典型的には、リポソームは、約5~15モル%の負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールで調製される。追加された負荷電リン脂質、例えばホスファチジルグリセロールはまた、自発的なリポソーム凝集を防止するように機能するので、小型のリポソーム凝集体形成のリスクを最小化する。膜硬化剤、例えば、少なくとも約50モル%の濃度のスフィンゴミエリンまたは飽和中性リン脂質、および5~15モル%のモノシアリルガングリオシドもまた、剛性などの望ましいリポソーム特性を付与し得る(例えば、米国特許第4,837,028号を参照のこと)。
加えて、リポソーム懸濁液は、保存のフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含み得る。親油性フリーラジカルクエンチャー、例えばα-トコフェロールおよび水溶性鉄特異的キレート剤、例えばフェリオキシアニンが好ましい。
本発明の改善されたLAMP構築物は、不均一なサイズの多重ラメラ小胞を含み得る。例えば、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶解し、真空または不活性ガス下で乾燥させて、薄い脂質膜を形成し得る。所望により、膜を第3級ブタノールなどの適切な溶媒に再溶解し、次いで、凍結乾燥して、より容易に水和される粉末形態のより均一な脂質混合物を形成し得る。この膜を、ペプチドまたはポリペプチド複合体の水溶液でカバーし、典型的には撹拌しながら15~60分間水和させる。得られる多重ラメラ小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和させることにより、またはデオキシコール酸などの可溶化界面活性剤を追加することにより、より小さなサイズにシフトさせ得る。水和媒体は、好ましくは、最終リポソーム懸濁液中のリポソームの内部容積で望ましい濃度の核酸を含む。
リポソーム調製後、リポソームは、所望のサイズ範囲およびリポソームサイズの比較的狭い分布を達成するようにサイズ調整され得る。1つの好ましいサイズ範囲は約0.2~0.4ミクロンであり、これは、従来のフィルタ、典型的には0.22ミクロンフィルタを介した濾過によるリポソーム懸濁液の滅菌を可能にする。リポソームが約0.2~0.4ミクロンにサイズダウンされた場合、濾過滅菌はハイスループットで実施され得る。いくつかの技術は、リポソームを所望のサイズにサイジングするために利用可能である(例えば、米国特許第4,737,323号を参照のこと)。
適切な脂質としては、限定されないが、DOTMA(Felgnerら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)、DOGSまたはTransfectain(商標)(Behrら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6982-6986)、DNERIEまたはDORIE(Felgnerら、Methods 5:67-75)、DC-CHOL(Gao
and Huang,1991,BBRC 179:280-285)、DOTAP(商標)(McLachlanら、1995,Gene Therapy 2:674-622)、Lipofectamine(商標)およびグリセロ脂質化合物(例えば、欧州特許第901463号および国際公開第98/37916号を参照のこと)が挙げられる。
and Huang,1991,BBRC 179:280-285)、DOTAP(商標)(McLachlanら、1995,Gene Therapy 2:674-622)、Lipofectamine(商標)およびグリセロ脂質化合物(例えば、欧州特許第901463号および国際公開第98/37916号を参照のこと)が挙げられる。
改善されたLAMP構築物との複合体形成に適切な他の分子としては、カチオン分子、例えば、ポリアミドアミン(Haensler and Szoka,1993,Bioconjugate Chem.4:372-379)、樹枝状ポリシン(国際公開第95/24221号)、ポリエチレンイリニンまたはポリプロピレンh-ナイン(国際公開第96/02655号)、ポリリジン(米国特許第5,595,897号;仏国特許第2719316号)、キトサン(米国特許第5,744,166号)、DNA-ゼラチンコアセルベート(例えば、米国特許第6,207,195号;米国特許第6,025,337号;米国特許第5,972,707号を参照のこと)またはDEAEデキストラン(Lopataら、1984,Nucleic Acid Res.12:5707-5717)が挙げられる。
ウイルスベースの遺伝子送達ビヒクル
一態様では、改善されたLAMP構築物送達ビヒクルは、ウイルスまたはウイルス粒子を含む。この態様では、好ましくは、改善されたLAMP構築物はウイルスベクターを含む。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターは、多くの場合、2つの構成要素、すなわち改変ウイルスゲノムおよびそれを囲むコート構造から構成されるが(例えば、Smithら、1995,Ann.Rev.Microbiol.49:807-838を参照のこと)、ウイルスベクターはネイキッド形態で導入されるか、またはウイルスタンパク質以外のタンパク質でコーティングされることがある。現在のほとんどのベクターは、野生型ウイルスに似たコート構造を有する。この構造は、ウイルス核酸をパッケージングおよび保護し、標的細胞に結合してそれに侵入する手段を提供する。
一態様では、改善されたLAMP構築物送達ビヒクルは、ウイルスまたはウイルス粒子を含む。この態様では、好ましくは、改善されたLAMP構築物はウイルスベクターを含む。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターは、多くの場合、2つの構成要素、すなわち改変ウイルスゲノムおよびそれを囲むコート構造から構成されるが(例えば、Smithら、1995,Ann.Rev.Microbiol.49:807-838を参照のこと)、ウイルスベクターはネイキッド形態で導入されるか、またはウイルスタンパク質以外のタンパク質でコーティングされることがある。現在のほとんどのベクターは、野生型ウイルスに似たコート構造を有する。この構造は、ウイルス核酸をパッケージングおよび保護し、標的細胞に結合してそれに侵入する手段を提供する。
好ましくは、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を含むウイルスベクターは、感染性粒子を調製するために使用される宿主細胞(例えば、パッケージング細胞またはヘルパー細胞など)におけるウイルスの成長を可能にしながら、標的細胞におけるウイルスの成長を無効化するように野生型ウイルスゲノムから改変される。ベクター核酸は、一般に、ヘルパー株における複製およびパッケージングのためのシス作用性ウイルス配列、ならびに標的細胞に送達されるポリヌクレオチドの発現を調節するための発現制御配列に必須である。他のウイルス機能は、当技術分野で公知のように、特定のパッケージングまたはヘルパー細胞株でトランスで発現される。
好ましい改善されたLAMP構築物は、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、セムリキフォレストウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来するウイルスベクターである。このようなウイルスベクターは当技術分野で周知である。
好ましい一態様では、使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルス複製サイクルを完了するために必要な約30個を超える遺伝子を有する約36kbの線状二本鎖DNA分子からなる。初期遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫反応をモジュレートすると考えられるE3領域を除いて、ウイルス複製に必須の4つの領域(E1~E4)に分けられる。E1領域(EIAおよびEIB)は、ウイルスゲノムの転写調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域遺伝子(E2AおよびE2B)の発現は、ウイルス複製に必要なポリペプチドの合成をもたらす。E3領域によりコードされるタンパク質は、細胞傷害性T細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する(Wold and Gooding,1991,Virology 184:1-8)。E4領域によりコードされるタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、スプライシングおよび宿主細胞の遮断に関与する(Halbertら、1985,J.Virol.56:250-257)。後期遺伝子は、一般に、ウイルスカプシドに寄与する構造タンパク質をコードする。加えて、アデノウイルスゲノムは、シス作用性5’および3’ITR(逆方向末端反復)ならびにDNA複製に必須のパッケージング配列を有する。ITRはDNA複製起点を有するが、感染性粒子へのアデノウイルスDNAのパッケージングのために、カプシド形成領域が必要である。
Heise and Kim(2000,J.Clin.Invest.105:847-851)に記載されているように、特定の細胞(例えば、増殖細胞など)で選択的に複製するために、アデノウイルスベクターは、条件付き複製性であるように操作され得る(CRAdベクター)。別の態様では、アデノウイルスベクターは、(例えば、E1の全体的または部分的な欠失または突然変異誘発により)E1機能について複製欠損である。ベクターのアデノウイルス骨格は、さらなる改変(1つまたはそれを超えるウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異)を含み得る。E2改変の例は、DBP(DNA結合タンパク質)コード遺伝子に局在する温度感受性突然変異により例示される(Ensingerら、1972,J.Virol.10:328-339)。アデノウイルス配列はまた、E4領域の全部または一部を欠失され得る(例えば、欧州特許第974 668号;Christら、2000,Human Gene Ther.11:415-427;Luskyら、1999,J.Virol.73:8308-8319を参照のこと)。非必須E3領域内のさらなる欠失は、送達されるポリヌクレオチドのサイズの増加を可能にし得る(Yehら、1997,FASEB Journal 11:615 623)。しかしながら、ウイルスが免疫系(Goodingら、1990,Critical Review of Immunology 10:53-71)または炎症反応(欧州特許出願公開第00440267.3号)から逃れることを可能にするポリペプチド(例えば、gp19kなど)をコードするE3配列の全部または一部を保持することが有利であり得る。
ITRおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残存合成を無効化する実質的な遺伝子改変を含む第2世代のベクターもまた、形質導入細胞における発現遺伝子の長期発現を改善するために使用され得る(例えば、国際公開第94/28152号;Luskyら、1998,J.Virol 72:2022-2032を参照のこと)。
細胞に導入される改善されたLAMP構築物は、シス作用性配列を除いて、ウイルスゲノムの任意の場所に挿入され得る。好ましくは、それは、欠失領域(E1、E3および/またはE4)の置換、好ましくは欠失E1領域内に挿入される。
アデノウイルスは、任意のヒトまたは動物源、特にイヌ科動物(例えば、CAV-1またはCAV-2、それぞれGenbank ref.CAVIGENOMおよびCAV77082)、鳥類(Genbank ref.AAVEDSDNA)、ウシ科動物(例えば、BAV3;Reddyら、1998,J.Virol.72:1394 1402)、ネズミ科動物(Genbank ref.ADRMUSMAVI)、ヒツジ、ネコ科動物、ブタまたは類人猿供給業者に由来し得るか、あるいはハイブリッドウイルスであり得る。任意の血清型が用いられ得る。しかしながら、Cサブグループのヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス2(Ad2)および5(Ad5)が好ましい。このようなウイルスは、例えばATCCから入手可能である。
アデノウイルス粒子または空のアデノウイルスカプシドもまた、米国特許第5,928,944号に記載されているように、ウイルス媒介共内在化プロセスにより、改善されたLAMP構築物を移入するために使用され得る。このプロセスは、カチオン剤、例えば1つまたはそれを超える脂質層を含むポリカルベンまたは脂質小胞の存在下で達成され得る。
アデノウイルス粒子は、ウイルス複製に必要な欠損ウイルス遺伝子をトランスで供給する相補細胞株またはヘルパーウイルスを使用して、当技術分野の任意の従来技術(例えば、国際公開第96/17070号)にしたがって調製および増殖され得る。細胞株293(Grahamら、1977,J.Gen.Virol.36:59-72)およびPERC6(Fallauxら、1998,Human Gene Therapy 9:1909-1917)は、E1欠失を相補するために一般に使用されている。他の細胞株は、欠陥ベクターを相補するように操作されている(Yehら、1996,J.Virol.70:559-565;Kroughak and Graham,1995,Human Gene Ther.6:1575-1586;Wangら、1995,Gene
Ther.2:775-783;Luskyら、1998,J.Virol.72:2022-203;欧州特許第919627号および国際公開第97/04119号)。アデノウイルス粒子は、培養上清からだけではなく溶解後の細胞からも回収され得、必要に応じて標準的な技術(例えば、国際公開第96/27677号、国際公開第98/00524号、国際公開第98/26048号および国際公開第00/50573号に記載されているクロマトグラフィー、超遠心分離)にしたがってさらに精製され得る。
Ther.2:775-783;Luskyら、1998,J.Virol.72:2022-203;欧州特許第919627号および国際公開第97/04119号)。アデノウイルス粒子は、培養上清からだけではなく溶解後の細胞からも回収され得、必要に応じて標準的な技術(例えば、国際公開第96/27677号、国際公開第98/00524号、国際公開第98/26048号および国際公開第00/50573号に記載されているクロマトグラフィー、超遠心分離)にしたがってさらに精製され得る。
細胞タイプ特異的ターゲティングは、ウイルス表面タンパク質の改変により、広範な宿主範囲を有するアデノウイルスに由来するベクターで達成され得る。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面に存在する細胞受容体への付着により決定される。これに関して、アデノウイルスカプシドの表面に存在する繊維およびペントンは、細胞付着において重要な役割を果たす(Deferら、1990,J.Virol.64:3661-3673)。したがって、繊維および/またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝的改変により、アデノウイルスの細胞ターゲティングを行って、ユニークな細胞表面受容体との特異的相互作用が可能な改変繊維および/またはペントンを生成し得る。このような改変の例は、Wickarnら、1997,J.Virol.71:8221-8229;Arribergら、1997,Virol.Chem 268:6866-6869;Rouxら、1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
86:9079-9083;Miller and Vile,1995,FASEB
J.9:190-199;国際公開第93/09221号および国際公開第95/28494号に記載されている。
86:9079-9083;Miller and Vile,1995,FASEB
J.9:190-199;国際公開第93/09221号および国際公開第95/28494号に記載されている。
特に好ましい態様では、アデノ随伴ウイルス配列がベクターとして使用される。ヒトパルボウイルスAAV-2(アデノ随伴ウイルス2型)に由来するベクターは、現在開発されている最も有望な遺伝子送達ビヒクルの1つである。一本鎖DNAをパッケージングするためのこの系のいくつかの特徴は、送達のためのネイキッドDNAの可能な代替物としてそれを示唆する。主な魅力的な特徴は、ワクシニアまたはアデノウイルスなどの他のウイルスベクターとは対照的に、AAVベクターは、いかなるウイルス遺伝子も発現しないことである。ワクチン構築物に含まれる唯一のウイルスDNA配列は、145 bp逆方向末端反復配列(ITR)である。したがって、ネイキッドDNAによる免疫化の場合と同様に、発現される遺伝子は、アレルゲンまたはアレルゲンキメラの遺伝子のみである。加えて、AAVベクターは、ヒト末梢血単球由来樹状細胞などの分裂および非分裂細胞の両方を形質導入し、導入遺伝子発現は持続的であることが公知であり、粘膜免疫の生成のための経口および鼻腔内送達の可能性がある。また、必要なDNAの量は、数桁よりもかなり少ないようであり、50ugまたは約1015コピーのネイキッドDNA用量とは対照的に、1010~1011個の粒子またはコピーのDNA用量で最大応答である。
一態様では、AAVベクターは、構築物をコードするAAV ITRキメラタンパク質に含まれるDNAと、ITRを有しないAAVコード領域(AAV repおよびcap遺伝子)を含むAAVヘルパープラスミドACG2とを適切な細胞株(例えば、ヒト293細胞)にコトランスフェクトすることによりパッケージングされる。続いて、細胞をアデノウイルスAd5に感染させる。ベクターは、当技術分野で公知の方法(例えば、塩化セシウム密度勾配超遠心分離など)を使用して細胞ライセートから精製され、それらが検出可能な複製可能AAVまたはアデノウイルスを確実に含まないことを検証され得る(例えば、細胞変性効果バイオアッセイによる)。AAV力価は、プロテイナーゼKによる消化後に調製されたウイルスDNAサンプルを用いた定量的PCRにより決定され得る。好ましくは、このような方法により生成されるベクター力価は、1ml当たり約5×1012~1×1013個のDNase耐性粒子である。
他の態様では、レトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスは統合型ウイルスのクラスであり、ウイルスにコードされる逆転写酵素を使用して複製し、ウイルスRNAゲノムを、感染細胞(例えば、標的細胞)の染色体DNAに組み込まれる二本鎖DNAに複製する。このようなベクターとしては、マウス白血病ウイルス、特にモロニー(Gilboaら、1988,Adv.Exp.Med.Biol.241:29)またはフレンドのFB29株(国際公開第95/01447号)に由来するものが挙げられる。一般に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子gag、polおよびenvの全部または一部が欠失されており、5’および3’LTRならびにカプシド形成配列を保持する。これらのエレメントは、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増加させるように改変され得る。このような改変としては、VL30などのレトロトランスポゾンの1つによるレトロウイルスカプシド形成配列の置換が挙げられる(例えば、米国特許第5,747,323号を参照のこと)。好ましくは、改善されたLAMP構築物は、カプシド形成配列の下流に、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して反対方向で挿入される。細胞特異的ターゲティングは、当技術分野で公知のように、レトロウイルスエンベロープタンパク質への抗体または抗体断片のコンジュゲーションにより達成され得る。
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下で、またはレトロウイルスベクターが欠損するレトロウイルス遺伝子(例えば、gag/polおよびenv)をそのゲノムに含み組み込んだ適切な相補(パッケージング)細胞株で調製される。このような細胞株は、先行技術に記載されている(Miller and Rosman,1989,BioTechniques 7:980;Danos and Mulligan,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460;Markowitzら、1988,Virol.167:400)。env遺伝子の産物は、標的細胞の表面に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関与するので、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明の文脈では、両指向性エンベロープタンパク質を含むPA317細胞(ATCC CRL 9078)または293EI6(国際公開第97/35996号)などのパッケージング細胞株を使用して、ヒトおよび他の種の標的細胞の感染を可能にすることが有利である。レトロウイルス粒子は、好ましくは、培養上清から回収され、必要に応じて、標準的な技術(例えば、クロマトグラフィー、超遠心分離)にしたがってさらに精製され得る。
他の適切なウイルスとしては、ポックスウイルスが挙げられる。ポックスウイルス科のいくつかのメンバーのゲノムがマッピングされ、シークエンシングされている。ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意のメンバー、特にカナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルスから得られ得る。適切なワクシニアウイルスとしては、限定されないが、コペンハーゲン株(Goebelら、1990,Virol.179:247-266;Johnsonら、1993,Virol.196:381-401)、ワイエス株および改変アンカラ(MVA)株(Antoineら、1998,Virol.244:365-396)が挙げられる。ワクシニアウイルスベクターを構築するための一般的な条件は、当技術分野で公知である(例えば、欧州特許第83 286号および欧州特許第206 920号;Mayrら、1975,Infection 3:6-14;Sutter and Moss,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10847-10851を参照のこと)。好ましくは、目的のポリヌクレオチドは、非必須遺伝子座、例えば非コード遺伝子間領域、または不活化もしくは欠失がウイルス成長および複製を有意に損なわない任意の遺伝子内に挿入される。
ポックスウイルス粒子は、当技術分野で記載されているように調製される(Picciniら、1987,Methods of Enzymology 153:545-563;米国特許第4,769,330号;米国特許第4,772,848号;米国特許第4,603,112号;米国特許第5,100,587号および米国特許第5,179,993号)。一般に、ドナープラスミドを構築し、大腸菌における成長により増幅させ、従来の手順により単離する。次いで、それをポックスウイルスゲノムと共に適切な細胞培養物(例えば、ニワトリ胚線維芽細胞)に導入して、相同組換えによりポックスウイルス粒子を生産する。溶解工程(例えば、化学的溶解、凍結/解凍、浸透圧ショック、超音波処理など)の後、これらを培養上清または培養細胞から回収し得る。連続ラウンドのプラーク精製を使用して、混入野生型ウイルスを除去し得る。次いで、当技術分野で公知の技術(例えば、クロマトグラフィー法または塩化セシウムまたはスクロース勾配における超遠心分離)を使用して、ウイルス粒子を精製し得る。
天然痘を根絶するための世界的なキャンペーンにおける生ウイルスワクチンとしてのワクシニアの使用は、ワクシニアを、生組換えワクチンベクターとしての明白な開発選択肢にした。100個近くの異なる外来タンパク質を発現する生組換えワクシニアウイルスが報告されており、これらの多くは有効な実験用ワクチンである(Moss and Flexner,1987による総説)。ワクシニアは、その大きなゲノムサイズ、少なくとも25,000塩基対の外来DNAを受け入れる能力、および昆虫細胞を含むほとんどの真核細胞タイプに感染する能力(同上)により、発現ベクターとして特に多用途である。他のDNAウイルスとは異なり、ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質でのみ複製し、組換えウイルスDNAと宿主染色体との遺伝的交換の可能性を減少させる。組換えワクシニアベクターは、ヒト、他の哺乳動物、寄生虫、RNAおよびDNAウイルス、バクテリアおよびバクテリオファージを含む様々な供給業者由来のタンパク質を適切にプロセシングおよび発現することが示されている。
外来タンパク質をコードするDNAの発現は、上流プロモーター配列、および必要な場合にはRNAプロセシングシグナルを含む宿主ウイルス調節エレメントにより制御される。ワクシニアウイルスゲノムの非必須領域への外来DNAの挿入は、相同組換えにより行われている(Panicaliら、Proc.Nat’l.Acad.Sci,USA,79:4927,1982;Mackettら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,79:7415,1982)。
挿入部位もしくはその近くの転写調節エレメントにより、またはより正確な遺伝子操作により、改善されたLAMP構築物によるアレルゲンの発現が起こり得る。外来遺伝子の挿入および発現を大幅に容易にするプラスミドベクターが構築されている(Mackettら、J.Virol,49:857,1982)。これらのベクターは、ワクシニア転写プロモーターと、ワクシニアゲノムの非必須領域由来のDNAが隣接する外来コード配列の挿入のための1つまたはそれを超えるユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位とから構成される発現部位を含む。プロモーターの選択は、発現の時期(例えば、初期または後期)および発現のレベルの両方を決定するのに対して、隣接DNA配列は相同組換えの部位を決定する。
この手順で生産された約1000個のウイルス粒子のうちの1個のみが組換え体である。組換えウイルスプラークは、DNAハイブリダイゼーションにより識別され得るが、効率的な選択手順が開発されている。隣接配列として非必須ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子のセグメントを使用することにより、外来遺伝子はTK遺伝子座に組換えられ、挿入によりTK遺伝子を不活性化する。TKウイルスの選択は、5-ブロモデオキシウリジンの存在下でTK細胞でウイルスプラークアッセイを行うことにより達成される。ヌクレオシド類似体のリン酸化およびその結果として起こるウイルスDNAへの致死的取り込みは、TK+親ウイルスが感染した細胞でのみ起こる。トランスフェクションおよび組換えの効率に応じて、最大80個のプラークが所望の組換え体であり、残りは自然発生TK突然変異体である。
大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子と、第2の遺伝子のための発現部位とを含むプラスミドベクターは、親ウイルスと組換え体とを区別する別の方法を可能にする(Chakrabartiら、Mol.Cell.Biol.,5:3403,1985)。このような組換え体により形成されるプラークは、適切な指標の追加により形成される青色により明確に識別され得る。TK選択およびβ-ガラクトシダーゼ発現の両方を組み合わせることにより、組換えウイルスを容易および迅速に単離する。次いで、適切な細胞株における増殖により組換え体を増幅させ、適切な酵素学的、免疫学的または物理的手順により挿入遺伝子の発現をチェックする。
ワクシニアウイルスゲノムに追加され得る遺伝情報の量の上限はまだ不明である。しかしながら、ほぼ25,000塩基対の外来DNAの追加は、ウイルス収量に対する明らかな悪影響がなかった(Smithら、Gene,25:21,1983)。必要な場合には、ワクシニアウイルスゲノムの大きなセグメントを欠失させて、さらなる容量を提供し得る(Mossら、J.Virol.40:387,1981)。
ウイルスカプシド分子は、細胞へのターゲティングおよび/または進入を容易にするターゲティング部分を含み得る。適切なターゲティング分子としては、限定されないが、化学的コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー(例えば、PEG、ポリリジン、PEIなど)、ペプチド、ポリペプチド(例えば、国際公開第94/40958号を参照のこと)、ビタミン、抗原、レクチン、抗体およびその断片が挙げられる。好ましくは、このようなターゲティング分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープまたは腫瘍関連マーカーを認識してそれに結合する。
ウイルス粒子をベースとする改善されたLAMP構築物を含む組成物は、10~1014i.u(感染単位)、好ましくは10~1011i.uの用量の形態で製剤化され得る。力価は、従来の技術により決定され得る。LAMP構築物の用量は、好ましくは0.01~10mg/kg、より具体的には0.1~2mg/kgを占める。
自己複製RNA
自己複製RNAウイルスベクターもまた、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を使用して構築され得る。例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルスおよびラブドウイルスは、自己複製RNAウイルスワクチンを生成するために使用され得る。自己複製RNAウイルスの好ましい株としては、限定されないが、狂犬病ウイルス(RABV)、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、セムリキ森林ウイルス(SFV)、シンドビスウイルス(SIN)および/またはベネズエラ馬脳炎ウイルス(VEE)が挙げられる。
自己複製RNAウイルスベクターもまた、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を使用して構築され得る。例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、麻疹ウイルスおよびラブドウイルスは、自己複製RNAウイルスワクチンを生成するために使用され得る。自己複製RNAウイルスの好ましい株としては、限定されないが、狂犬病ウイルス(RABV)、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、セムリキ森林ウイルス(SFV)、シンドビスウイルス(SIN)および/またはベネズエラ馬脳炎ウイルス(VEE)が挙げられる。
自己複製RNAウイルスは、組織への送達によりネイティブ抗原を発現するので、病原性への復帰のリスクを有しない生弱毒化ワクチンを模倣する。それらはまた、自然免疫系を刺激するので、反応を増強する。例えば、Ljungberg,K.“Self-replicating alphavirus RNA vaccines,”Expert Rev Vaccines(2):177-94(2015);Lundstrom,K.,“Oncolytic Alphaviruses in Cancer Immunotherapy”,Vaccines 5:9(2017);Lundstrom,K.“Replicon RNA Viral Vectors as Vaccines,”Vaccines 4:39(2016)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照のこと。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を含む自己複製ワクチンの使用はまた、プライムブーストプロトコールで使用され得る。
また、自己複製RNAウイルスはまた、送達およびターゲティングを改善するために、本明細書に記載されるようにリポソームよりカプセル化され得る。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を含む自己複製RNAウイルスによる免疫化は、より高い一過性発現レベルのアレルゲンを提供し、中和抗体反応の生成および安全条件下における致死的チャレンジに対する保護をもたらし得る。
細胞ベースの送達ビヒクル
本発明の改善されたLAMP構築物は、構築物を含む他の細胞(「送達細胞」)により標的細胞に送達され得る。構築物を細胞に導入するための方法は当技術分野で公知であり、細胞の核へのDNAのマイクロインジェクション(Capechiら、1980,Cell 22:479-488);CaP04のトランスフェクション(Chen and
Okayama,1987,Mol.Cell Biol.7:2745 2752)、エレクトロポレーション(Chuら、1987,Nucleic Acid Res.15:1311-1326);リポフェクション/リポソーム融合(Feignerら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)および粒子衝撃(Yangら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9568-9572)が挙げられる。適切な細胞としては、自己および非自己細胞が挙げられ、異種細胞が挙げられ得る。送達細胞は、それらの死を誘導することにより(例えば、誘導性自殺遺伝子を細胞に提供することにより)、それらの内容物を標的細胞に送達するように誘導され得る。
本発明の改善されたLAMP構築物は、構築物を含む他の細胞(「送達細胞」)により標的細胞に送達され得る。構築物を細胞に導入するための方法は当技術分野で公知であり、細胞の核へのDNAのマイクロインジェクション(Capechiら、1980,Cell 22:479-488);CaP04のトランスフェクション(Chen and
Okayama,1987,Mol.Cell Biol.7:2745 2752)、エレクトロポレーション(Chuら、1987,Nucleic Acid Res.15:1311-1326);リポフェクション/リポソーム融合(Feignerら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)および粒子衝撃(Yangら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9568-9572)が挙げられる。適切な細胞としては、自己および非自己細胞が挙げられ、異種細胞が挙げられ得る。送達細胞は、それらの死を誘導することにより(例えば、誘導性自殺遺伝子を細胞に提供することにより)、それらの内容物を標的細胞に送達するように誘導され得る。
アクセサリー分子
本発明の改善されたLAMP構築物を含む組成物は、細胞への改善されたLAMP構築物の導入を容易にするための、ならびに/または特定の治療効果を増強し、および/もしくは抗体産生を増強するための1つまたはそれを超えるアクセサリー分子を含み得る。
本発明の改善されたLAMP構築物を含む組成物は、細胞への改善されたLAMP構築物の導入を容易にするための、ならびに/または特定の治療効果を増強し、および/もしくは抗体産生を増強するための1つまたはそれを超えるアクセサリー分子を含み得る。
加えて、本発明の改善されたLAMP構築物を含む組成物は、動物/ヒト体内における分解を阻害するために、および/または標的細胞へのベクターのトランスフェクション/感染を改善するために、1つまたはそれを超える安定化物質、例えば脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ(国際公開第98/53853号)、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート剤(欧州特許第890362号)を含み得る。このような物質は単独で、または組み合わせて使用され得る(例えば、カチオン性および中性脂質)。
また、アデノウイルスタンパク質は、エンドソームを不安定化し、細胞へのDNAの取り込みを増強することができることが示されている。脂質複合DNAベクターを含む溶液へのアデノウイルスの混合、またはタンパク質架橋剤を使用したアデノウイルスに共有結合的に付着されたポリリジンへのDNAの結合は、改善されたLAMP構築物の取り込みおよび発現を大幅に改善し得る(例えば、Curielら、1992,Am.I.Respir.Cell.Mol.Biol.6:247-252を参照のこと)。
宿主細胞
本発明の改善されたLAMP構築物は、限定されないが、原核細胞(例えば、大腸菌、Staphylococcus属、Bacillus属);酵母細胞(例えば、Saccharomyces属);昆虫細胞;線虫細胞;植物細胞;両生類細胞(例えば、アフリカツメガエル);鳥類細胞および哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞株、初代培養哺乳動物細胞、例えば解剖組織由来のもの)を含む様々な宿主細胞で発現され得る。
本発明の改善されたLAMP構築物は、限定されないが、原核細胞(例えば、大腸菌、Staphylococcus属、Bacillus属);酵母細胞(例えば、Saccharomyces属);昆虫細胞;線虫細胞;植物細胞;両生類細胞(例えば、アフリカツメガエル);鳥類細胞および哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞株、初代培養哺乳動物細胞、例えば解剖組織由来のもの)を含む様々な宿主細胞で発現され得る。
分子は、生物から単離された宿主細胞、生物の一部である宿主細胞、または生物に導入される宿主細胞で発現され得る。一態様では、改善されたLAMP構築物は、インビトロで、例えば培養中の宿主細胞で発現される。別の態様では、改善されたLAMP構築物は、改善されたLAMP構築物をコードする核酸を含む体細胞および/または生殖系列細胞を含むトランスジェニック生物(例えば、トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長類など)で発現される。トランスジェニック動物を構築するための方法は当技術分野で周知であり、ルーチンである。
改善されたLAMP構築物はまた、インビトロで細胞に導入され得、細胞(例えば、幹細胞、造血細胞、リンパ球など)を宿主生物に導入し得る。細胞は、宿主生物に関して非相同または自己であり得る。例えば、細胞を宿主生物から得て、改善されたLAMP構築物をインビトロで細胞に導入し、次いで、宿主生物に再導入する。
抗原提示細胞
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物は、天然または操作された抗原提示細胞に導入される。
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物は、天然または操作された抗原提示細胞に導入される。
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」(APC)という用語は、主要組織適合遺伝子複合体分子、好ましくはクラスII分子またはその一部に関連してその表面に抗原(例えば、アレルゲン)を提示する任意の細胞を意図する。適切なAPCの例は以下で詳細に記載され、限定されないが、全細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、B細胞、ハイブリッドAPCおよびフォスター抗原提示細胞が挙げられる。ハイブリッドAPCを作製するための方法は記載されており、当技術分野で公知である。
樹状細胞(DC)は、強力な抗原提示細胞である。DCは、T細胞活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは、2つのタイプに分類され得る。免疫反応に特異性を与える第1のタイプは、T細胞受容体/CD3(「TCR/CD3」)複合体と、APC表面の主要組織適合遺伝子複合体(上記で定義される「MHC」)クラスIまたはIIタンパク質により提示されるアレルゲン性ペプチドとの相互作用により媒介される。この相互作用は、T細胞活性化の発生に必要であるが、十分ではない。実際、第2のタイプのシグナルがなければ、第1のタイプのシグナルは、T細胞アネルギーをもたらし得る。共刺激シグナルと称される第2のタイプのシグナルは、抗原特異的でもMHC拘束性でもなく、第1のタイプのシグナルの存在下でT細胞の全増殖反応およびT細胞エフェクター機能の誘導をもたらし得る。
いくつかの分子は、共刺激活性を増強することが示されている。これらとしては、限定されないが、熱安定抗原(HSA)、コンドロイチン硫酸改変MHC不変鎖(Ii-CS)、細胞内接着分子I(ICAM-1)およびAPC表面のB7共刺激分子ならびにT細胞上のそのカウンター受容体CD28またはCTLA-4が挙げられる。
他の重要な共刺激分子は、CD40、CD54、CD80、CD86である。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」という用語は、T細胞の表面上のTCRにより結合されるペプチド/MHC複合体と一緒に作用すると、ペプチドに結合するT細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する任意の単一分子または分子の組み合わせを包含する。したがって、この用語は、ペプチド/MHC複合体と一緒に同族リガンドに結合し、T細胞表面のTCRがペプチドに特異的に結合するとT細胞の活性化をもたらす(単独の、別の分子と複合体形成した、または融合タンパク質の一部としての)B7またはAPC上の他の共刺激分子、その断片を包含する。共刺激分子は、例えばBeckman Coulterを含む様々な供給業者から市販されている。
本発明の一態様では、Romaniら、J.Immunol.Methods 196:135-151,1996およびBenderら、J.Immunol.Methods 196:121-135,1996に記載されている方法は、哺乳動物、例えばネズミ科動物、類人猿またはヒトの末梢血単核細胞(PBMC)から未成熟および成熟樹状細胞を生成するために使用される。簡潔に言えば、単離されたPBMCを前処理して、免疫磁気技術によりT細胞およびB細胞を枯渇させる。次いで、ヒト血漿(好ましくは自己血漿)およびGM-CSF/IL-4を補充したRPMI培地9中でリンパ球枯渇PBMCを例えば約7日間培養して、樹状細胞を生成する。樹状細胞は、単球前駆細胞と比較して非接着性である。したがって、およそ7日目に、さらなるプロセシングのために、非接着細胞を回収する。
GM-CSFおよびIL-4の存在下におけるPBMC由来樹状細胞は、サイトカイン刺激が培養物から除去されると、それらが非接着特性を喪失し、マクロファージ細胞運命に戻り得るという点で未成熟である。未成熟状態の樹状細胞は、MHCクラスII拘束性経路のネイティブタンパク質抗原のプロセシングに非常に有効である(Romaniら、J.Exp.Med.169:1169,1989)。培養樹状細胞のさらなる成熟は、必要な成熟因子を含むマクロファージ馴化培地(CM)で3日間培養することにより達成される。成熟樹状細胞は、提示のために新たなタンパク質を捕捉する能力が低いが、休止T細胞(CD4およびCD8の両方)を刺激して成長および分化させることにはるかに優れる。
成熟樹状細胞は、それらの形態変化、例えばより運動性の細胞質プロセスの形成により;非接着性により;CD83、CD68、HLA-DRもしくはCD86のマーカーの少なくとも1つの存在により;またはCD 115などのFc受容体の喪失により識別され得る(Steinman,Annu.Rev.Immunol.9:271,1991における総説)。成熟樹状細胞は、典型的な細胞蛍光検査法および細胞選別技術およびデバイス、例えばFACScanおよびFACStarを使用して収集および分析され得る。フローサイトメトリーに使用される一次抗体は、成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的なものであり、市販されている。二次抗体は、ビオチン化Ig、続いてFITCまたはPE結合ストレプトアビジンであり得る。
あるいは、他の者は、樹状細胞をアップレギュレート(活性化)し、単球を活性化樹状細胞表現型に変換するための方法を報告している。この方法は、カルシウムイオノフォアを培養培地に追加して、単球を活性化樹状細胞に変換することを伴う。例えば、24~48時間の培養期間の開始時におけるカルシウム21イオノフォアA23187の追加は、プールされた「単球+DC」画分の均一な活性化および樹状細胞表現型変換をもたらし、特徴的なことに、活性化集団は均一にCD 14(Leu M3)陰性になり、HLA-DR、HLA-DQ、ICAM-1、137.1および137.2をアップレギュレートする。さらに、この活性化バルク集団は、さらに精製されると少数で機能する。サイトカインの特定の組み合わせは、カルシウムイオノフォアで達成される活性化/変換を増幅(または部分的に置換)するために成功裏に使用されている;これらのサイトカインとしては、限定されないが、G-CSF、GM-CSF、IL-2およびIL-4が挙げられる。各サイトカインは、単独で与えられると、最適なアップレギュレートに不十分である。
APCを単離するための第2のアプローチは、血液中に既に循環する比較的多数のプレコミットAPCを収集することである。コミットAPCをヒト末梢血から単離するための以前の技術は、物理的手順の組み合わせ、例えばメトリザミド勾配および付着/非付着工程(Freudenthalら、PNAS 87:7698-7702,1990);パーコール勾配分離(Mehta-Damaniら、J.Immunol.153:996-1003,1994);ならびに蛍光活性化細胞選別技術(Thomasら、J.Immunol.151:6840-52,1993)を伴っていた。
プロフェッショナル抗原提示細胞(またはその前駆体)を単離するための当技術分野でルーチンな多くの他の方法があり、このような方法および開発され得る他の方法は限定されず、本発明の範囲内に包含される。
一実施形態では、APCおよびしたがって1つまたはそれを超える本明細書に記載されるアレルゲンを提示する細胞は自己のものである。別の実施形態では、本明細書に記載されるアレルゲンを提示するAPCは、同種のもの、すなわち異なる被験体に由来する。
本明細書で議論されるように、改善されたLAMP構築物は、限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、マイクロインジェクション、ウイルスベースの送達または細胞ベースの送達を含む上記方法または当技術分野で公知の他の方法を使用してAPCに導入され得る。Arthurら、Cancer Gene Therapy 4(l):17-25,1997には、ヒト樹状細胞における遺伝子導入法の比較が報告されている。
公知の、部分的なおよび推定のヒト白血球抗原(HLA)、ヒトMHCの遺伝子表記、コンセンサス配列を含アミノ酸およびヌクレオチド配列は公開されており(例えば、Zemmour and Parham,Immunogenetics 33:310-320,1991を参照のこと)、HLA変異体を発現する細胞株は公知であり、一般に入手可能であり、多くはAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)から入手可能である。したがって、PCRを使用して、MHCクラスIIをコードするヌクレオチド配列を本発明の発現ベクターに容易に作動可能に連結し、次いで、これを使用して、発現のために適切な細胞を形質転換する。
マクロファージ、B細胞、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞などのプロフェッショナルAPCが使用され得る。これらは、標準的な手順(Coliganら、Current Protocols in Immunology,sections 3 and 14,1994)を使用して、1)自己ドナー、2)処置すべき宿主とは異なるHLA特異性を有する非相同ドナーまたは3)異なる種の異種ドナーの血液または組織から収集される。細胞は、正常宿主、または感染症、癌、自己免疫疾患もしくはアレルギーを有する患者から単離され得る。
プロフェッショナルAPCは、白血球除去および「FICOLL/HYPAQUE」密度勾配遠心分離(フィコールおよび不連続パーコール密度勾配による段階的遠心分離)を使用して、末梢血から得られ得る。APCにより内在化され得るアレルゲンへのAPCの曝露を回避する手順を利用して、目的のアレルゲンX(配列番号Y)に特異的ではないT細胞の活性化をもたらす。
元々抗原提示ではない細胞は、適切な分子をコードする配列を導入することにより、抗原提示になるように操作され得る。例えば、MHCクラスII分子、アクセサリー分子、共刺激分子および抗原プロセシング補助分子をコードする核酸配列は、このような遺伝子を含む細胞由来のDNAの直接合成、クローニング、精製などの後に導入され得る。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物および方法で使用される分子をコードする遺伝子を得るための1つの適切な手段は、選択されたオリゴヌクレオチドプライマー対を有する選択された核酸テンプレートのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅による。例えば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、活性化T細胞、好酸球、ケラチノサイト、アストロサイト、ミクログリア細胞、胸腺皮質上皮細胞、シュワン細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、腸細胞、甲状腺細胞および腎尿細管細胞が使用され得る。これらは、宿主から最近外植された初代細胞であって、樹立細胞株、または多世代にわたってもしくは無限に増殖することができる比較的均一な樹立細胞株を形成するために細胞培養で大規模に継代されていない初代細胞であり得る。
プロフェッショナルAPCではない細胞は、様々な公知の分離方法を使用して、それらが常在する自己ドナー、非相同ドナーまたは異種ドナーの任意の組織から単離される(Darling,Animal Cells:Culture and Media.J.Wiley,New York,1994;Freshney,Culture of Animal Cells.Alan R.Liss,Inc.,New York,1987)。公知のヒトHLA特異性に一致するHLAクラスIおよびクラスII分子を発現するように、非自己細胞、例えば非相同または異種細胞をエクスビボで操作し得る。次いで、これらの細胞を、操作された細胞のHLA特異性に一致するヒト被験体に導入し得る。1つまたはそれを超える本発明のLAMP構築物を発現するように、細胞をエクスビボでさらに操作する。
操作された細胞は、標準的な細胞培養方法により細胞培養液中で維持される(Darling,Animal Cells:Culture and Media”.J.Wiley,New York,1994;Freshney,Culture of Animal Cells”.Alan R.Liss,Inc.,New York,1987)。本発明で使用するための細胞株は、様々な供給業者から得られるか(例えば、ATCC Catalogue of Cell Lines&Hybidomas,American Type Culture Collection,8th edition,1995)、または標準的な方法を使用して生産される(Freshney,Culture of Immortalized Cells,Wiley-Liss,New York,1996)。非形質転換細胞株は、ヒト被験体における使用に好ましい。
一態様では、GM-CSFの影響下で樹状細胞に分化するCD34+前駆体は、被験体の体から得られ、本発明のLAMP構築物をコードする核酸が細胞に導入され、次いで、これが被験体に注射される。本明細書に記載される改善されたLAMP構築物の利用は、特定の抗原に由来するペプチドと、形質導入抗原提示細胞上のMHCクラスII分子との会合を増強して、より強力な全身性T細胞依存性免疫反応および/または抗体産生を有意にもたらす。この戦略でトランスフェクトされる抗原提示細胞は好ましくは自己細胞であるが、宿主で抗原を有効に提示する任意のMHCクラスII細胞が上記のように使用され得る。
ペプチドワクチン
改善されたLAMP構築物によりコードされるペプチドワクチンも本発明の範囲内である。好ましくは、アレルゲンは、区画/オルガネラ(またはそれが送達されるその後の区画/オルガネラ)内でプロセシングされ、免疫反応をモジュレートすることができるMHCクラスII分子に結合したエピトープを生成する。
改善されたLAMP構築物によりコードされるペプチドワクチンも本発明の範囲内である。好ましくは、アレルゲンは、区画/オルガネラ(またはそれが送達されるその後の区画/オルガネラ)内でプロセシングされ、免疫反応をモジュレートすることができるMHCクラスII分子に結合したエピトープを生成する。
改善されたLAMP構築物によりコードされるペプチドワクチンはまた、膜構造に結合されて、生物の体への投与を容易にし得る。例えば、改善されたLAMP構築物によりコードされるペプチドワクチンは、米国特許第4,448,765号に記載されているように、リポソームに組み込まれ得る。
タンパク質またはポリペプチドを免疫原として使用すべき場合、それは、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物のいずれか1つもしくはそれよりも多くを組換え細胞で発現させることにより生産され得るか、またはそれは、化学合成により調製され得る。例えば、メリフィールド技術(Journal of American Chemical Society,vol.85,pp.2149-2154,1968)が使用され得る。
アレルギーの処置
本発明は、アレルゲンXと相関する花粉症の処置に有用な製剤を提供する。アレルゲンのタンパク質コード配列をコードするDNAプラスミドを動物に送達することは、IFN-γ産生を増加させ得、IL-4産生を低下させ得ることが以前に決定されており、これは、特定のアレルゲンに対してアレルギーの動物の処置において有用である。本発明は、アレルゲンXと相関するアレルギーを有する患者を処置するための改善されたLAMP構築物を提供する。改善されたLAMP構築物は、MHCクラスII小胞と交差する特定の細胞内輸送パターンを有し、免疫系に対するアレルゲンXの増強された提示をもたらし、具体的には、抗体反応の増強をもたらす。本発明により提供される核酸および組成物は、アレルギー免疫療法を行うために有用である。
本発明は、アレルゲンXと相関する花粉症の処置に有用な製剤を提供する。アレルゲンのタンパク質コード配列をコードするDNAプラスミドを動物に送達することは、IFN-γ産生を増加させ得、IL-4産生を低下させ得ることが以前に決定されており、これは、特定のアレルゲンに対してアレルギーの動物の処置において有用である。本発明は、アレルゲンXと相関するアレルギーを有する患者を処置するための改善されたLAMP構築物を提供する。改善されたLAMP構築物は、MHCクラスII小胞と交差する特定の細胞内輸送パターンを有し、免疫系に対するアレルゲンXの増強された提示をもたらし、具体的には、抗体反応の増強をもたらす。本発明により提供される核酸および組成物は、アレルギー免疫療法を行うために有用である。
本発明は、細胞に投与された場合に、増加した特異的抗体反応をもたらす製剤を提供する。アレルゲンXに対する増加した抗体反応は、IgE媒介アレルギー疾患を処置するために有用である。IgEは、その細胞拘束および同族アレルゲンへの結合により得られる細胞内シグナル伝達に関する特定の特性を有する。B細胞が、Th2細胞により分泌されるIL-4を受容すると、アレルゲンに対してIgEが生成される。これは、IgEクラス抗体を産生するようにB細胞を指示するのに役立つ。B細胞による分泌により、IgEは、マスト細胞および好酸球により発現されるその高親和性受容体Fc-εRIに結合し、その結果、これらの細胞および動物は、その後のアレルゲン曝露に対して感作される。その結果として、アレルギーの症候は、アレルゲンの摂取、吸入または経粘膜接触によりトリガーされ得る。抗体の結合特性により、アレルギー症候を軽減する1つの方法は、他の抗体クラスとの競合を介して、IgEによる結合に利用可能な遊離アレルゲンをキレート化することであると提案されている。特に、IgGを増加させるアレルギー製剤は、アレルギー疾患を軽減するための経路であると提案されている。本明細書に記載される本発明は、増強されたIgG産生を誘導するので、臨床的に重要な方法でIgEとIgGとの比の減少を引き起こす。
特に好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を使用することにより、アレルゲンXに対するアレルギーを処置または予防する方法を提供する。1つの好ましい方法では、本明細書に記載されるアレルゲンXをコードするポリヌクレオチドを含む改善されたLAMP構築物は、アレルゲンXアレルゲンをエンドソーム/リソソーム区画またはリソソーム関連オルガネラに、前記区画/オルガネラ内における、または抗原が送達される別の区画/オルガネラ内におけるMHCクラスII分子との会合のためにターゲティングする。このようなキメラDNA分子は、上記さらなるドメイン配列をコードし得る(例えば、膜貫通ドメイン、シグナル配列、エンドソーム/リソソーム区画またはリソソーム関連オルガネラをターゲティングするための細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、Tyrモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ser-Val-Valドメインなどをコードする配列)。
宿主細胞
細菌系では、多くの発現ベクターが、意図する用途に応じて有利に選択され得る。例えば、(例えば、改善されたLAMP構築物のコードポリペプチドを発現させるために)大量のタンパク質を生産すべき場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定されないが、融合タンパク質が産生されるようにコード配列がベクターのlac Zコード領域とインフレームで個々にライゲーションされ得る大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO 1.2:1791(1983));pINベクター(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))などが挙げられる。pGEXベクターはまた、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いて、遊離グルタチオンの存在下における溶出により、溶解細胞から容易に精製され得る。クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るように、pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
細菌系では、多くの発現ベクターが、意図する用途に応じて有利に選択され得る。例えば、(例えば、改善されたLAMP構築物のコードポリペプチドを発現させるために)大量のタンパク質を生産すべき場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、限定されないが、融合タンパク質が産生されるようにコード配列がベクターのlac Zコード領域とインフレームで個々にライゲーションされ得る大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら、EMBO 1.2:1791(1983));pINベクター(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989))などが挙げられる。pGEXベクターはまた、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いて、遊離グルタチオンの存在下における溶出により、溶解細胞から容易に精製され得る。クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から放出され得るように、pGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が、改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドを発現させるためにベクターとして使用され得る。ウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞で成長する。コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個々にクローニングされ、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置され得る。
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が、改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドを発現させるために使用され得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的のコード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分割リーダー配列にライゲーションし得る。次いで、インビトロまたはインビボ組換えにより、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入し得る。
ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)への挿入は、感染宿主で改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドを発現することができる生存可能な組換えウイルスをもたらすであろう(例えば、Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359(1984)を参照のこと)。
特定の開始シグナルもまた、挿入されたコード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強され得る(例えば、Bittnerら、Methods in Enzymol.153:51-544(1987)を参照のこと)。
加えて、挿入された配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変(例えば、グリコシル化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的および特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得、この目的で、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されないが、CHO、VERY、BHK、Hela、COS、NSO、MDCK、293、3T3およびW138が挙げられる。
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定発現が好ましい。例えば、改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドを安定発現する細胞株が操作され得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)により制御されるポリヌクレオチドおよび選択可能なマーカーで形質転換され得る。外来ポリヌクレオチドの導入の後、操作された細胞を濃縮培地中で1~2日間成長させ得、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドそれらのを染色体に安定的に組み込み、成長して病巣を形成することを可能にし、そして、これがクローニングされて細胞株に拡大され得る。この方法は、有利には、改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドを発現する細胞株を操作するために使用され得る。
限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら、Cell
11:223(1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、Cell 22:8 17(1980))遺伝子を含む多くの選択系が使用され得、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞で用いられ得る。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る:メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O’Hareら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Goldspielら、Clinical Pharmacy,12:488-505(1993);Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science 260:926-932(1993);およびMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);TIB TECH 11(5):155-2 15(May;1993));およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerreら、Gene 30:147(1984))。組換えDNA技術の分野で一般に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するためにルーチンに適用され得、このような方法は、例えばAusubelら、(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);およびChapters 12 and 13,Dracopoliら、(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapinら、J.Mol.Biol.150:1(1981)に記載されている。
11:223(1977))、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992))およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、Cell 22:8 17(1980))遺伝子を含む多くの選択系が使用され得、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞で用いられ得る。また、代謝拮抗薬耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る:メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wiglerら、Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O’Hareら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981));ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981));アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo(Goldspielら、Clinical Pharmacy,12:488-505(1993);Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);Mulligan,Science 260:926-932(1993);およびMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);TIB TECH 11(5):155-2 15(May;1993));およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro(Santerreら、Gene 30:147(1984))。組換えDNA技術の分野で一般に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するためにルーチンに適用され得、このような方法は、例えばAusubelら、(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990);およびChapters 12 and 13,Dracopoliら、(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapinら、J.Mol.Biol.150:1(1981)に記載されている。
改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅により増加され得る(総説については、Bebbington and Hentschel,The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammalian Cells In DNA Cloning,Vol.3.(Academic Press,New York,1987)を参照のこと)。改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞培養物に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅領域はコード配列に関連するので、改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドの産生も増加するであろう(Crouseら、Mol.Cell.Biol.3:257(1983))。
ベクター配列に含められ得る他のエレメントとしては、非相同シグナルペプチド(分泌シグナル)、膜固定配列、イントロン、代替スプライス部位、翻訳開始および停止シグナル、インテイン、ビオチン化部位および翻訳後修飾を促進する他の部位、精製タグ、他のタンパク質またはペプチドへの融合をコードする配列、内部リボソーム再入部位により分離された別個のコード領域、例えば選択性(例えば、抗生物質耐性)または選別性(例えば、蛍光)、改変ヌクレオチドを付与する「マーカー」タンパク質をコードする配列、ならびに他の公知のポリヌクレオチドシス作用性フィーチャーが挙げられるが、これらの例に限定されない。
改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドが組換え発現により生産されたら、それは、タンパク質の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性(特にプロテインAの親和性と特定のアレルゲンに対する免疫親和性による)およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度の違い、またはタンパク質精製のための他の標準技術により精製され得る。さらに、改善されたLAMP構築物のコード化ポリペプチドは、精製を容易にするために、本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の非相同ポリペプチド配列に融合され得る。
投与
本発明のワクチン材料は、本明細書に記載される免疫刺激性が改善されたLAMP構築物を含み得るか、または組換え微生物、もしくは免疫刺激性が改善されたLAMP構築物を発現する抗原提示細胞であり得る。本発明のワクチン材料を含む改善されたLAMP構築物の調製および個体の免疫化のためのこのような改善されたLAMP構築物の投与は、当業者に周知の免疫化原理にしたがって達成される。
本発明のワクチン材料は、本明細書に記載される免疫刺激性が改善されたLAMP構築物を含み得るか、または組換え微生物、もしくは免疫刺激性が改善されたLAMP構築物を発現する抗原提示細胞であり得る。本発明のワクチン材料を含む改善されたLAMP構築物の調製および個体の免疫化のためのこのような改善されたLAMP構築物の投与は、当業者に周知の免疫化原理にしたがって達成される。
大量のこれらの材料は、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物を発現するレプリコンを含む組換えまたは形質転換細胞を培養することにより得られ得る。培養方法は当業者に周知であり、上記で引用されている文書の1つまたはそれよりも多くに教示されている。改善されたLAMP構築物ワクチンは、一般に、組換えまたは形質転換細胞の培養により産生され、薬理学的に許容され得る溶液もしくは懸濁液(通常、これは生理学的に適合性の水溶液である)、または当技術分野、例えば、米国特許第4,446,128号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているコーティング錠、錠剤、カプセル、坐剤もしくはアンプルで製剤化される。投与は、経口、直腸、鼻腔内または注射による任意の適切な経路であり得、注射は、例えば経皮、皮下、筋肉内または静脈内であり得る。
改善されたLAMP構築物は、哺乳動物において免疫反応を誘導するために十分な量で哺乳動物に投与される。好ましい最小投与量は、投与前に存在したものの少なくとも4倍の濃度まで抗体形成を誘発するために必要な量である。投与のための典型的な初期用量は、静脈内、筋肉内もしくは皮下投与される場合には10~5000マイクログラムまたは組換えベクターの105~1011のプラーク形成単位であるが、この量は、ワクチンおよび免疫反応を誘導する他の薬剤の投与で一般に行われるように、投与を行う臨床医により調整され得る。通常、単回投与は、免疫を誘導するために十分であり得るが、複数回投与を行って、反応を確実にしまたはブースティングし得る。
改善されたLAMP構築物ワクチンは、最初に、非ヒト哺乳動物(例えば、マウスまたは霊長類)で試験され得る。例えば、接種マウスの免疫反応のアッセイは、野生型アレルゲンに対するよりも、改善されたLAMP構築物に対する強い抗体、T細胞増殖および細胞傷害性T細胞応答を実証するために使用され得る。マウスで非常に有効なワクチン製剤が適切なサル免疫反応も誘発するかを決定するために、改善されたLAMP構築物はアカゲザルで評価され得る。一態様では、各サルは、免疫化1回当たり合計5mgのDNAを筋肉内送達で投与され、2つの施設に分けられ、0日目ならびに4、8および20週目に免疫化され、必要に応じたさらなる投与が行われる。抗体反応、ADCC、CD4+およびCD8+T細胞サイトカイン産生、CD4+およびCD8+T細胞抗原特異的サイトカイン染色は、ワクチンに対する免疫反応をモニタリングするために測定され得る。
本発明の製剤化および投与の適切な方法のさらなる説明は、米国特許第4,454,116号(構築物)、米国特許第4,681,762号(組換え細菌)ならびに米国特許第4,592,002号および米国特許第4,920,209号(組換えウイルス)に見られ得る。
キット
本発明はさらに、本明細書に記載される方法の実施を容易にするキットを含む。一態様では、キットは、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物と、改善されたLAMP構築物を受容するための細胞とを含む。キットは、細胞をプロフェッショナルAPCに操作するための1つまたはそれを超える核酸をさらに含み得る。しかしながら、一態様では、細胞はプロフェッショナルAPCである。細胞は、共刺激分子を発現してもよいしまたは発現しなくてもよい。好ましい態様では、細胞が共刺激分子を発現しない場合、改善されたLAMP構築物によりコードされるアレルゲンは自己抗原である。別の態様では、(例えば、ヒトで発現されることが公知の)異なるMHC分子を発現する細胞のパネルが提供される。さらなる態様では、キットは、細胞(例えば、脂質ベースの製剤、ウイルスパッケージング材料、細胞など)への改善されたLAMP構築物の進入を容易にする試薬を含む。なおさらなる態様では、改善されたLAMP構築物が免疫反応を誘発、モジュレートまたは増強する能力を検証するために、改善されたLAMP構築物によりコードされるアレルゲンに特異的な1つまたはそれを超えるT細胞株が提供される。
本発明はさらに、本明細書に記載される方法の実施を容易にするキットを含む。一態様では、キットは、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物と、改善されたLAMP構築物を受容するための細胞とを含む。キットは、細胞をプロフェッショナルAPCに操作するための1つまたはそれを超える核酸をさらに含み得る。しかしながら、一態様では、細胞はプロフェッショナルAPCである。細胞は、共刺激分子を発現してもよいしまたは発現しなくてもよい。好ましい態様では、細胞が共刺激分子を発現しない場合、改善されたLAMP構築物によりコードされるアレルゲンは自己抗原である。別の態様では、(例えば、ヒトで発現されることが公知の)異なるMHC分子を発現する細胞のパネルが提供される。さらなる態様では、キットは、細胞(例えば、脂質ベースの製剤、ウイルスパッケージング材料、細胞など)への改善されたLAMP構築物の進入を容易にする試薬を含む。なおさらなる態様では、改善されたLAMP構築物が免疫反応を誘発、モジュレートまたは増強する能力を検証するために、改善されたLAMP構築物によりコードされるアレルゲンに特異的な1つまたはそれを超えるT細胞株が提供される。
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される。以下のものは単なる例にすぎず、本発明の範囲内である限り、詳細の改変が行われ得ると認識されよう。
実施例1-LAMP構築物の構築
当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して、図1に示されている改善されたLAMP構築物を構築し得る。例えば、ポリヌクレオチドを含むプラスミドを、図1に示されている異なる構造ILC-1~ILC-6を生成するように設計し得る。図1に示されているLAMPドメインは、図3~10に示されているアミノ酸配列に由来し得る。好ましくは、LAMPドメインは、図3~10に示されているヒトLAMPタンパク質に由来する。各ドメインの境界は、図2Aおよび2Bに由来し得る。また、ヒト配列と比較した場合に同等のドメインを識別することにより、オーソログ配列から、対応するドメインをクローニングし得ることが想定される。表1/図14に記載されているように、アレルゲンX(配列番号Y)を個々にまたは組み合わせて、記載されているLAMP構築物にクローニングし得る。
当業者に周知の標準的な分子生物学技術を使用して、図1に示されている改善されたLAMP構築物を構築し得る。例えば、ポリヌクレオチドを含むプラスミドを、図1に示されている異なる構造ILC-1~ILC-6を生成するように設計し得る。図1に示されているLAMPドメインは、図3~10に示されているアミノ酸配列に由来し得る。好ましくは、LAMPドメインは、図3~10に示されているヒトLAMPタンパク質に由来する。各ドメインの境界は、図2Aおよび2Bに由来し得る。また、ヒト配列と比較した場合に同等のドメインを識別することにより、オーソログ配列から、対応するドメインをクローニングし得ることが想定される。表1/図14に記載されているように、アレルゲンX(配列番号Y)を個々にまたは組み合わせて、記載されているLAMP構築物にクローニングし得る。
実施例2-LAMP構築物に対するマウスの免疫反応評価
免疫反応をモジュレートする能力について、実施例1に記載されている改善されたLAMP構築物の能力を試験し得る。例えば、0、7および14日目に、ナノパスを使用して、100ulのPBS中の50ugの改善されたLAMP構築物で雌BALB/cマウスを皮内免疫化し得る。次いで、最終投与の2週間後に実験を終了する。
免疫反応をモジュレートする能力について、実施例1に記載されている改善されたLAMP構築物の能力を試験し得る。例えば、0、7および14日目に、ナノパスを使用して、100ulのPBS中の50ugの改善されたLAMP構築物で雌BALB/cマウスを皮内免疫化し得る。次いで、最終投与の2週間後に実験を終了する。
脾細胞(3×105/ウェル)をT細胞培地(10%熱不活性化FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1X2-MEを含むRPMI)中アレルゲン性タンパク質(10ug/ml)で刺激し、48時間後に上清を収集する。上清を希釈し(400ulの上清+200ulのT細胞培地)、ELISAによりサイトカインを評価する。ELISPOTアッセイにより、IL-10またはIL-4産生を測定し得る。
あるいは、血清サンプルをPBS中1%BSAで1:100(21日目)、1:2000(35日目)または1:5000(56日目)倍希釈し得る。56日目のサンプルを7.1:3連続希釈でさらに希釈して、エンドポイント抗体力価を測定する。IgEを検出するために、血清をアガロース-プロテインG(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)で50分間処理し、次いで、1:20希釈サンプルをELISAプレートにロードする。サンプルをヤギ抗マウスIgG1-HRP、ヤギ抗マウスIgG2a-HRP(Southern Biotech,Birmingham,Al)またはラット抗マウス-IgE-ビオチン(R35-118,BD Pharmingen,San Jose,CA)、続いてPierceストレプトアビジン-HRP(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)で検出する。反応をSureBlue TMB基質で現像し、TMB停止溶液で停止させる。Epoch ELISAリーダー(BioTek,Winooski,VT)を使用することにより、プレートを読み取る(OD450)。バックグラウンド平均(PBS)読み取り値の2倍超を差し引くことにより、エンドポイント力価を決定する。Excel統計関数を使用することにより、群ごとのエンドポイント力価またはOD450値の平均および標準誤差を分析する。スチューデントT検定を使用することにより、IgEデータを分析する。試験は両側であり、0.05以下のp値を有意であるとみなした。ワクチン接種の3回投与後、レシピエントマウスでは、抗原特異的IgG1およびIgG2a抗体が観察されると予想される。免疫反応のTh2からTh1へのスキューが予測されるので、IgG2aレベルは、予想よりもかなり高いと考えられる。
実施例3-プライム/ブーストプロトコール
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14(TNFRSF14)またはCD270としても公知のヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)は、TNF受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。近年、HVEMは、造血細胞および様々な実質細胞、例えば乳房、黒色腫、結腸直腸および卵巣癌細胞ならびに腸上皮で高度に発現されることが見出されている。HVEMは、BTLAまたはLIGHT(TNFSF14)への結合を介して、T細胞を阻害または刺激する双方向タンパク質である。
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14(TNFRSF14)またはCD270としても公知のヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)は、TNF受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。近年、HVEMは、造血細胞および様々な実質細胞、例えば乳房、黒色腫、結腸直腸および卵巣癌細胞ならびに腸上皮で高度に発現されることが見出されている。HVEMは、BTLAまたはLIGHT(TNFSF14)への結合を介して、T細胞を阻害または刺激する双方向タンパク質である。
本発明者らは、HVEM-LAMPをコードするDNAワクチンを生成して、腫瘍治療用途でHVEMの阻害機能を遮断し得る抗体を生成した。本発明者らは、LAMPが、HVEM特異的抗体の親和性を増強し、および/またはHVEMタンパク質のB細胞エピトープのレパートリーを拡大することにより、抗体反応を促進すると仮説した。この研究では、本発明者らは、LAMPを有するおよび有しないHVEMコードプラスミド(配列番号158および配列番号159)の免疫原性を比較した。HVEM-LAMPおよびHVEMおよび組換えHVEMタンパク質をコードするプラスミドを、本明細書に記載されているように設計した。
ヤギ抗マウスIgG-HRPは、Southern Biotechnologies(Birmingham,AL)から購入した。SureBlue TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびTMB停止溶液は、KPL(Gaithersburg,MD)から購入した。ELISPOTプレートは、EMD Millipore(Billerica,MA,Cat.No.MAIPS4510)から注文した。ELISPOTで使用したIFN-γ抗体ペアはBioLegend(San Diego,CA)から購入し、クローンAN18およびR46A2をそれぞれコーティングおよび検出に使用した。ストレプトアビジン-HRPおよびAEC基質は、BD Biosciences(San Jose,CA)から購入した。
6~8週齢の雌Balb/cマウスはHarlan Laboratories(Frederick,MA)から購入し、Immunomic Therapeutics,Inc.(Rockville,MA)の動物施設で飼育した。0、7および14日目に、エレクトロポレーション筋肉内送達により、10μg/用量のHVEM-LAMP、HVEMまたはLAMPベクター対照でマウス(n=6)を処置した。35日目に、ミョウバンの存在下で腹腔内注射により5μgのHVEMタンパク質でマウスをブーストした。28日目および49日目に、マウスから採血し、抗体検出のために血清を単離した。56日目に、マウスを屠殺し、ELISPOTによりIFN-γ産生について脾細胞を試験した。
ELISA手順は、Suら、J of Immunol Res;(10):1-15(2016)に従った。プレートを5μg/ml HVEMタンパク質でコーティングした。Microsoft ExcelおよびPrism 6ソフトウェアを使用して、データを分析した。
この研究の主な目的は、HVEM-LAMPとHVEMとの間の抗体プロファイルを比較することであった。28日目に、HVEM-LAMPワクチン接種マウスは、HVEM群のものよりも有意に高いレベルのHVEM特異的IgG抗体を産生した(図11)。タンパク質ブースト後、HVEM免疫マウスでは、HVEM特異的抗体が約1000倍増加し、平均力価は100から108000に変化した。この結果は、HVEM DNAプラスミドにより免疫記憶が誘導されたことを示している。HVEM DNA単独は最小抗体反応を誘導したにすぎないが、タンパク質ブーストは免疫記憶を迅速に呼び戻した。他方、HVEM-LAMP群は、HVEMおよびLAMP群よりも有意に高い力価を再び示し、平均力価はHVEM群の5倍であるが、これは、抗体反応の増強におけるLAMPの力を示している(図12)。
加えて、HVEM+LAMPまたはHVEM単独免疫化/HVEMタンパク質ブーストマウス由来の血清サンプル(49日目)をプールし、ペプチドマッピングについて試験した。12個のペプチドは、プールした血清に結合したことが見出され(マウスIgG反応)、12個のペプチドのうちの7個は、強い結合親和性を示した。図13に示されているように、HVEM+LAMPは、HVEM単独と比較して、ペプチド17、24、25および28の結合親和性を変化させる。これらの変化は、腫瘍成長の保護において生理学的効果を有し得る。
この実施例は、記載されているアレルゲンと一緒に、本明細書に記載される改善されたLAMP構築物によるプライムブーストプロトコールを使用する能力を示す。
実施例4-Amb a 1-hLAMPの試験
主なアレルギーリスク因子であるブタクサは、北米およびヨーロッパの一部で最も重要な花粉アレルゲンの1つである。疫学研究は、米国人口の23%~32.8%がブタクサに感作されるのに対して、ヨーロッパ諸国における感作の有病率は3.5%(例えば、イタリア)~54%(例えば、ハンガリー)で変動することを示した。ブタクサ花粉の最も豊富なアレルゲンであるAmb a 1は、63%~87%の範囲のアミノ酸配列同一性を有する5つのアイソフォームの混合物から構成される。Amb a 1の臨床的関連性は多数の刊行物に記載されている。DNAワクチン接種は、ブタクサ花粉アレルギーの有効な予防および治療解決策として大きな可能性を有する。本発明者らは、以前、DNAワクチン技術の利点をLAMP-1のMHC II経路ターゲティング特性と統合し、ブタクサアレルギーに対する新規DNAワクチンを設計した。
主なアレルギーリスク因子であるブタクサは、北米およびヨーロッパの一部で最も重要な花粉アレルゲンの1つである。疫学研究は、米国人口の23%~32.8%がブタクサに感作されるのに対して、ヨーロッパ諸国における感作の有病率は3.5%(例えば、イタリア)~54%(例えば、ハンガリー)で変動することを示した。ブタクサ花粉の最も豊富なアレルゲンであるAmb a 1は、63%~87%の範囲のアミノ酸配列同一性を有する5つのアイソフォームの混合物から構成される。Amb a 1の臨床的関連性は多数の刊行物に記載されている。DNAワクチン接種は、ブタクサ花粉アレルギーの有効な予防および治療解決策として大きな可能性を有する。本発明者らは、以前、DNAワクチン技術の利点をLAMP-1のMHC II経路ターゲティング特性と統合し、ブタクサアレルギーに対する新規DNAワクチンを設計した。
ここでは、本発明者らは、LAMPのヒンジ領域を置き換えることにより、本発明者らのLAMPプラットフォームを最適化した(ILC-4)。この研究は、アレルゲンとして配列番号137の配列を使用して、異なるバージョンのAmb a 1-LAMPワクチンのインビボ免疫原性を比較することを目的とする。対照ベクター、Amb a 1-hLAMP(完全LAMP)、Amb a 1-hLAMP前内腔(ILC-1)、Amb a 1-hLAMPヒンジ(ILC-4)およびAmb a 1タンパク質は、NTC(Lincoln,NE)により作製された。ヤギ抗マウスIgG2a-HRPおよびヤギ抗マウスIgG1-HRPは、Southern Biotechnologies(Birmingham,AL)から購入した。SureBlue TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質およびTMB停止溶液は、KPL(Gaithersburg,MD)から購入した。マウスモノクローナル抗hLAMPは、Origene Technologies(Rockville,MD)から購入した。ウサギモノクローナル抗GAPDH抗体は、Abcam(Cambridge,MA)から購入した。ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ二次抗体は、Sino Biological(Wayne,PA)から入手した。
ワクチン、アジュバントおよび免疫化。40μgの対照ベクター、完全LAMP、ILC-1およびILC-4を、皮内/エレクトロポレーション注射のために20μl/マウス/用量の総容量で使用した。0、7および14日目に、皮内送達により、マウスをワクチンで免疫化した。血清収集のために28日目および40日目に、マウスを採血した。血清を収集し、-30℃で保存した。
ウエスタンブロット。リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を使用して、プラスミドを293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をPBSで洗浄し、停止プロテイナーゼ阻害剤(Thermo Scientific,Waltham,MA)を含む200μlのRIPA溶解バッファーに懸濁した。ライセートを遠心分離し(700g、4℃で15分間)、続いて、Pierce BCAタンパク質アッセイキット(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)を使用して、清澄化上清中のタンパク質濃度を測定した。5μgのタンパク質をプレキャスト(4~20%)SDS-PAGEゲル(BioRad,Hercules,California)で電気泳動させ、ニトロセルロース膜(BioRad)に転写した。膜をDetection(商標)ブロックバッファー(KPL)でブロッキングし、抗ヒトLAMP(図15A)または抗GAPDHおよびヤギ抗マウスHRPまたはヤギ抗ウサギ抗体(図15B)でプローブし、続いて、TMB(KPL)で現像した。
ELISAによる血清Amb a 1特異的IgG1およびIgG2aの測定。図16に示されているように、間接ELISAにより、Amb a 1に対するマウス抗体反応を評価した。ELISAプレート(MaxiSorp)をPBSバッファー中5μg/ml Amb a 1で一晩コーティングし、次いで、PBS中2%BSAでブロッキングした。血漿サンプルをブロッキングバッファーで1:300または1:1000希釈した。サンプルをヤギ抗マウスIgG1-HRPまたはIgG2a-HRPで検出した。反応をSureBlue TMB基質で現像し、KPL(Gaithersburg,MD)のTMB停止溶液で停止させた。Epoch ELISAリーダー(BioTek,Winooski,VT)を使用することにより、プレートを読み取った(OD450)。
統計。GraphPad Prism 6.0ソフトウェアを使用して二元配置ANOVA検定を実施して、統計的有意性を評価した。データは、抗体力価の平均±SEMを表す(n=9)。二元配置ANOVAを統計分析に使用した。*p<0.05;**p<0.01、***p<0.001****p<0.0001。
結果。この研究では、本発明者らは、Amb a 1-LAMPワクチンの異なる構築物を試験した。DNAワクチンの3回投与後(1週間間隔)、本発明者らは、ILC-1およびILC-4が、40日目に完全LAMP Amb a 1ワクチンよりも予想外に高いAmb a 1特異的IgG2a応答を誘導したことを見出した。
実施例5-Bet v 1-hLAMPの試験
主なカバノキ花粉アレルゲンであるBet v 1は、呼吸器アレルギーを引き起こすPR-10タンパク質ファミリーのプロトタイプと考えられる。カバノキアレルギー患者の大多数(>90%)はBet v 1に反応し、その結果として、カバノキ花粉アレルギーのマーカーとして使用される。DNAワクチン接種は、早春におけるカバノキ花粉アレルギーの有効な予防および治療解決策として大きな可能性を有する。
主なカバノキ花粉アレルゲンであるBet v 1は、呼吸器アレルギーを引き起こすPR-10タンパク質ファミリーのプロトタイプと考えられる。カバノキアレルギー患者の大多数(>90%)はBet v 1に反応し、その結果として、カバノキ花粉アレルギーのマーカーとして使用される。DNAワクチン接種は、早春におけるカバノキ花粉アレルギーの有効な予防および治療解決策として大きな可能性を有する。
ここでは、本発明者らは、実施例4に記載されているように、対照ベクターBet v
1-hLAMP(完全LAMP)、Bet v 1-hLAMP前内腔(ILC-1)、Bet v 1-hLAMPヒンジ(ILC-4)およびBet v 1タンパク質から発現されたタンパク質を試験した。この実施例では、配列番号141の配列がアレルゲンである。図15Aおよび図15Bは、発現を実証する。図17に示されているように、DNAワクチンの3回投与後(1週間間隔)、本発明者らは、ILC-4が、28日目および41日目に完全LAMP Bet v 1およびILC-1ワクチンよりも予想外に有意に強いBet v 1特異的IgG2a応答を誘導したことを見出したが、これは、この新たなバージョンのBet v 1-LAMP構築物が非常に免疫原性であることを示唆している。
1-hLAMP(完全LAMP)、Bet v 1-hLAMP前内腔(ILC-1)、Bet v 1-hLAMPヒンジ(ILC-4)およびBet v 1タンパク質から発現されたタンパク質を試験した。この実施例では、配列番号141の配列がアレルゲンである。図15Aおよび図15Bは、発現を実証する。図17に示されているように、DNAワクチンの3回投与後(1週間間隔)、本発明者らは、ILC-4が、28日目および41日目に完全LAMP Bet v 1およびILC-1ワクチンよりも予想外に有意に強いBet v 1特異的IgG2a応答を誘導したことを見出したが、これは、この新たなバージョンのBet v 1-LAMP構築物が非常に免疫原性であることを示唆している。
実施例6-Fel d 4-hLAMPの試験
ネコは人気の家庭用ペットであり、一般にアレルギーを引き起こす。ネコアレルギーは、主なアレルゲンFel d 1がリポカリンではなくウテログロビン様タンパク質であるという点で、哺乳動物に対するアレルギーの中でもユニークである。しかしながら、ネコ感受性個体では、ネコにより産生されるリポカリンアレルゲンとして識別されているFel d 4が比較的高い頻度でIgEに結合する。したがって、ネコアレルゲンの生化学的スペクトルは、特に、ネコリポカリンタンパク質がアレルギー個体のネコに対する感作において果たし得る役割に関して不確実である。最近、ペットアレルギーを有する患者において、Fel d 1およびFel d 4特異的IgEが評価された。ネコアレルギーを有する者のうち、94%が増加したFel d 1レベルを有しており(>0.35kU/L)、49%が増加したFel d 4レベルを有していた。
ネコは人気の家庭用ペットであり、一般にアレルギーを引き起こす。ネコアレルギーは、主なアレルゲンFel d 1がリポカリンではなくウテログロビン様タンパク質であるという点で、哺乳動物に対するアレルギーの中でもユニークである。しかしながら、ネコ感受性個体では、ネコにより産生されるリポカリンアレルゲンとして識別されているFel d 4が比較的高い頻度でIgEに結合する。したがって、ネコアレルゲンの生化学的スペクトルは、特に、ネコリポカリンタンパク質がアレルギー個体のネコに対する感作において果たし得る役割に関して不確実である。最近、ペットアレルギーを有する患者において、Fel d 1およびFel d 4特異的IgEが評価された。ネコアレルギーを有する者のうち、94%が増加したFel d 1レベルを有しており(>0.35kU/L)、49%が増加したFel d 4レベルを有していた。
ここでは、本発明者らは、実施例4に記載されているように、対照ベクターFel d
4-hLAMP(完全LAMP)、Fel d 4-hLAMP前内腔(ILC-1)、Fel d 4-hLAMPヒンジ(ILC-4)およびFel d 4タンパク質から発現されたタンパク質を試験した。図15Aおよび図15Bは、発現を実証する。この実施例では、配列番号182の配列がアレルゲンである。図18に示されているように、DNAワクチンの3回投与後(1週間間隔)、本発明者らは、ILC-1が、28日目および41日目に他の群よりもわずかに高いFel d 4特異的IgG2a応答を誘導したことを見出した。しかしながら、ILC-1とILC-4との間に統計的差異はない。
4-hLAMP(完全LAMP)、Fel d 4-hLAMP前内腔(ILC-1)、Fel d 4-hLAMPヒンジ(ILC-4)およびFel d 4タンパク質から発現されたタンパク質を試験した。図15Aおよび図15Bは、発現を実証する。この実施例では、配列番号182の配列がアレルゲンである。図18に示されているように、DNAワクチンの3回投与後(1週間間隔)、本発明者らは、ILC-1が、28日目および41日目に他の群よりもわずかに高いFel d 4特異的IgG2a応答を誘導したことを見出した。しかしながら、ILC-1とILC-4との間に統計的差異はない。
実施例7-Cry J 1の試験
日本アカスギの木は、日本における文化的シンボルであるが、その花粉は国民的災難である。日本の人口の推定25%である2500万人超の者が、日本アカスギ花粉に対してアレルギーがある。
日本アカスギの木は、日本における文化的シンボルであるが、その花粉は国民的災難である。日本の人口の推定25%である2500万人超の者が、日本アカスギ花粉に対してアレルギーがある。
本発明者らは、ELISAにより、Cry J 1およびCry J 2特異的抗体反応を試験した。図15C。この実施例では、配列番号224の配列がアレルゲンである。0、7および14日目に、雌BALB/cマウスを、耳を介して20ulのPBS中40ugの対照ベクター、CryJ1+CryJ2+完全LAMPまたはCry J1+J2+ILC-4 DNAで皮内免疫化した。最終投与の26日後に、研究を終了した。28日目および40日目に、血清サンプルを収集した。間接ELISAにより、Cry J 1とCry J 2特異的IgG1およびIgG2aを測定した。データは、抗体力価の平均±SEMを表す。N=6/群。二元配置ANOVAを統計分析に使用した。*p<0.05、**p<0.01。
完全およびILC-4単一Cry J 1+J2+LAMP構築物を比較した。Cry
J 1およびCry J 2特異的IgG1およびIgG2a応答は図19に要約されている。Cry J 1では、ILC-4構築物はより高い力価の傾向を示したが、これらは統計的に有意ではなかった。しかしながら、Cry J 2特異的応答では、力価は、完全LAMP構築物よりも統計的に(statically)高かった。
J 1およびCry J 2特異的IgG1およびIgG2a応答は図19に要約されている。Cry J 1では、ILC-4構築物はより高い力価の傾向を示したが、これらは統計的に有意ではなかった。しかしながら、Cry J 2特異的応答では、力価は、完全LAMP構築物よりも統計的に(statically)高かった。
結論として、この研究からのデータは、2つの構築物がインビボで発現され、LAMPが体液性免疫反応を有意に改善したことを示唆している。
本明細書に記載されるものの変形、改変および他の実施は、本発明および特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱せずに、当業者に想到するであろう。特定されているすべての特許、特許出願、国際出願および参考文献は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
Claims (46)
- リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)構築物であって、LAMPタンパク質の内腔ドメインの2つの相同ドメインとアレルゲンとを含み、
前記アレルゲンが、CryJ1及び/又はCryJ2を含み、前記アレルゲンが、前記2つの相同ドメインの間に配置されており、
前記LAMP構築物が、LAMPタンパク質の膜貫通ドメイン、LAMPタンパク質の細胞質尾部、及びシグナル配列をさらに含み、
前記LAMPタンパク質が、ヒトLAMP-1又はLAMP-2から選択される、LAMP構築物。 - 前記シグナル配列が、LAMPタンパク質に由来する、請求項1に記載のLAMP構築物。
- 前記アレルゲンが、リンカーにより、前記相同ドメインの一方又は両方から分離されている、請求項1又は2に記載のLAMP構築物。
- 前記リンカーが、アミノ酸配列GPGPG又はPMGLPから選択される、請求項3に記載のLAMP構築物。
- 前記LAMPタンパク質が、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記LAMPタンパク質が、配列番号1又は配列番号2と少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記LAMPタンパク質が、ヒトLAMP-1である、請求項1~6のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記2つの相同ドメインが、ヒトLAMP-1相同ドメイン1及びヒトLAMP-1相同ドメイン2を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記ヒトLAMP-1相同ドメイン1が、
(a)配列番号1の残基29~194のアミノ酸配列;又は
(b)(a)のアミノ酸配列と少なくとも95%又は少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含む(a)のバリアント
を含み、及び/あるいは、
前記ヒトLAMP-1相同ドメイン2が、配列番号1の残基228~381又は残基228~382のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のLAMP構築物。 - 前記膜貫通ドメインが配列番号1の残基383~405を含み、及び/又は、前記細胞質尾部が配列番号1の残基406~417を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記アレルゲンが、配列番号222の残基22~374のアミノ酸配列、配列番号223の残基23~514のアミノ酸配列、及び/又は、配列番号224のアミノ酸配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記アレルゲンが、配列番号222の残基22~374のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記アレルゲンが、配列番号223の残基23~514のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~10、12のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記アレルゲンが、配列番号224のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~10、12、13のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記アレルゲンが、
(a)配列番号222の残基22~374、配列番号223の残基23~514のアミノ酸配列、又は、
(b)配列番号224のアミノ酸配列
を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のLAMP構築物。 - 前記アレルゲンが、前記LAMPタンパク質の前記内腔ドメインのヒンジ領域を置換する、請求項1~15のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- 前記LAMP構築物は、前記アレルゲンをリソソームに対して標的化し、前記LAMPタンパク質の全内腔ドメインと全膜貫通ドメインとの間において挿入されている前記アレルゲンを含むLAMP構築物と比較して、より高い免疫応答を誘発する、請求項1~16のいずれか一項に記載のLAMP構築物。
- リソソーム関連膜タンパク質(LAMP)構築物をコードするポリヌクレオチドであって、前記LAMP構築物が、LAMPタンパク質の内腔ドメインの2つの相同ドメインとアレルゲンとを含み、
前記アレルゲンが、CryJ1及び/又はCryJ2を含み、前記アレルゲンが、前記2つの相同ドメインの間に配置されており、
前記LAMP構築物が、LAMPタンパク質の膜貫通ドメイン、LAMPタンパク質の細胞質尾部、及びシグナル配列をさらに含み、
前記LAMPタンパク質が、ヒトLAMP-1又はLAMP-2から選択される、ポリヌクレオチド。 - 前記シグナル配列が、LAMPタンパク質に由来する、請求項18に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アレルゲンが、リンカーにより、前記相同ドメインの一方又は両方から分離されている、請求項18又は19に記載のポリヌクレオチド。
- 前記リンカーが、アミノ酸配列GPGPG又はPMGLPから選択される、請求項20に記載のポリヌクレオチド。
- 前記LAMPタンパク質が、配列番号1又は配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項18~21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記LAMPタンパク質が、配列番号1又は配列番号2と少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項18~21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記LAMPタンパク質が、ヒトLAMP-1である、請求項18~23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記2つの相同ドメインが、ヒトLAMP-1相同ドメイン1及びヒトLAMP-1相同ドメイン2を含む、請求項18~24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ヒトLAMP-1相同ドメイン1が、
(a)配列番号1の残基29~194のアミノ酸配列;又は
(b)(a)のアミノ酸配列と少なくとも95%又は少なくとも97%同一であるアミノ酸配列を含む(a)のバリアント
を含み、及び/あるいは、
前記ヒトLAMP-1相同ドメイン2が、配列番号1の残基228~381又は残基228~382のアミノ酸配列を含む、請求項25に記載のポリヌクレオチド。 - 前記膜貫通ドメインが配列番号1の残基383~405を含み、及び/又は、前記細胞質尾部が配列番号1の残基406~417を含む、請求項18~26のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アレルゲンが、配列番号222の残基22~374のアミノ酸配列、配列番号223の残基23~514のアミノ酸配列、及び/又は、配列番号224のアミノ酸配列を含む、請求項18~27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アレルゲンが、配列番号222の残基22~374のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項18~27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アレルゲンが、配列番号223の残基23~514のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項18~27、29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アレルゲンが、配列番号224のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項18~27、29、30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記アレルゲンが、
(a)配列番号222の残基22~374、配列番号223の残基23~514のアミノ酸配列、又は、
(b)配列番号224のアミノ酸配列
を含む、請求項18~27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 - 前記アレルゲンが、前記LAMPタンパク質の内腔ドメインのヒンジ領域を置換する、請求項18~32のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記LAMP構築物は、前記アレルゲンをリソソームに対して標的化し、前記LAMPタンパク質の全内腔ドメインと全膜貫通ドメインとの間において挿入されている前記アレルゲンを含むLAMP構築物と比較して、より高い免疫応答を誘発する、請求項18~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項18~34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項18~34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがウイルスベクターである、請求項18~34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが自己複製RNAウイルスベクターである、請求項18~34のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項18~38のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項18~38のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む抗原提示細胞。
- 前記細胞が樹状細胞である、請求項40に記載の抗原提示細胞。
- 請求項1~17のいずれか一項に記載のLAMP構築物、請求項18~38のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項39に記載の宿主細胞、又は請求項40もしくは41に記載の抗原提示細胞を含む、組成物。
- アレルギー反応に対して被験体をワクチン接種するための、又は、アレルギー反応を処置するための、請求項42に記載の組成物。
- 前記ワクチン接種又は処置が、プライミング工程及び少なくとも1回のブースティング工程を含む、請求項43に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記プライミング工程に使用される、請求項44に記載の組成物。
- 前記組成物が、前記ブースティング工程に使用される、請求項44又は45に記載の組成物。
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