JP2023554066A - 血漿カリクレインの制御不全によって媒介される疾患の処置のための抗体のアデノ随伴ウイルスベクター送達 - Google Patents
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Abstract
本開示は、とりわけ、血漿カリクレインのタンパク質分解活性を阻害する薬剤をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。本開示はまた、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国仮出願番号６３／１２６，３００の優先権及び利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国仮出願番号６３／１２６，３００の優先権及び利益を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる。２０２１年１２月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＳＨＲ－２０２０ＵＳ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズが６３，２５０バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、本明細書によりその全体が参照により組み込まれる。２０２１年１２月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＳＨＲ－２０２０ＵＳ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズが６３，２５０バイトである。
血漿カリクレイン活性の制御不全は、炎症性及び血管作用性ペプチドであるブラジキニンの過剰生成をもたらし得る。そのような疾患の例は、皮下及び粘膜下血管性浮腫として現れる血管拡張の予測不可能な及び再発性の発作によって特性化される、稀であるが潜在的に生命を脅かす障害である遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）である。いくつかの場合では、ＨＡＥは、Ｃ１－阻害因子（Ｉ型）の低い血漿レベルに関連するが、他の場合では、そのタンパク質は、正常なまたは上昇した量で循環するが、それは機能不全である（ＩＩ型）。Ｃ１阻害因子は、血漿カリクレイン活性の主要な調節因子である。ＨＡＥ発作の症状には、自発的に生じるまたは軽度の外傷によって誘発される顔、口及び／または気道の腫れが含まれる。気道に影響を及ぼす浮腫発作は、致命的であり得る。急性炎症性発作に加えて、余剰の血漿カリクレイン活性はまた、慢性病態、例えば、エリテマトーデスを含む自己免疫疾患に関連している。
例えば、接触システムのメンバーを阻害することを含む、Ｃ１－ＩＮＨ欠損症または機能不全の処置のための様々なストラテジーが企図され、開発されている。例えば、ラナデルマブは、ＨＡＥの処置のために承認された血漿カリクレインの完全ヒトモノクローナル抗体阻害剤である。
ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を含むタンパク質を生成するベクターの使用は、疾患の処置のために所望であるが、対象への送達後の不十分な抗体生成を含む様々な要因によって制限される。
本発明は、抗血漿カリクレイン抗体をコードする効率的で頑強な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。本発明は、部分的に、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む特定の組換えＡＡＶベクターが、機能的抗血漿カリクレイン抗体の高レベルのｉｎ ｖｉｖｏ生成をもたらすという驚くべき発見に基づく。いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトは、ＣｐＧ含有量及びリピート配列を低減するようにコドン最適化された。いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトは、ネイティブの修飾されていないＡＡＶ８に見られるものに対してＧＣ含有量パーセンテージを正規化するように操作された。いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトの各々は、ＣｐＧ含有量、コドン適応指標（ＣＡＩ）、コドン状況（ＣＣ）、ＧＣ含有量、及びリピートモチーフについて評価された。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトは、ＣｐＧ含有量について評価された。いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトは、コドン適応指標（ＣＡＩ）について評価された。いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトは、ＧＣ含有量について評価された。いくつかの実施形態では、ベクターコンストラクトは、リピートモチーフの量について評価された。具体的には、ｒＡＡＶは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗血漿カリクレインｍＡｂの頑強で持続した生成をもたらし、ベクターで媒介された発現した抗血漿カリクレイン抗体は、従来の組換え発現方法（例えば、ＣＨＯ細胞）によって生成される抗体タンパク質と同等の標的化活性を保持する。本発明に先行して、所望のペイロードを保有するｒＡＡＶベクターの投与を介する抗血漿カリクレイン抗体の送達は、未知の量の活性抗体生成をもたらした。そのため、本発明に先行して、例えば、遺伝性血管性浮腫を含むＣ１－ＩＮＨ欠損症または障害の処置のための抗血漿カリクレインをコードするｒＡＡＶベクターを使用することは予測可能でも実行可能でもなかった。
いくつかの態様では、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、ｒＡＡＶベクターは、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を含む全長抗体をコードし、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超える同一性を有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。したがって、いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと９５％を超える同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと同一である。配列番号２３～３６には、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６のうちのいずれか１つが含まれる。配列番号２３～３６の各々は、表３において列挙されている。
いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つから選択される。したがって、いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２３である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２４である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２５である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２６である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２７である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２８である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号２９である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３０である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３１である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３２である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３３である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３４である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３５である。いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列は、配列番号３６である。
いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５０個未満のＣｐＧ部位、約４０個未満のＣｐＧ部位、約３５個未満のＣｐＧ部位、約３０個未満のＣｐＧ部位、約２５個未満のＣｐＧ部位、約２０個未満のＣｐＧ部位、約１５個未満のＣｐＧ部位または約１０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。したがって、いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約４５個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約４０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約３５個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約３０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約２５個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約２０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約１５個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約１０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５個のＣｐＧ部位を有する。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、リンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能ではないリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能ではないリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、単一のプロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別々のプロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、単一のプロモーターまたは別々のプロモーターは、ユビキタスプロモーター、組織特異的プロモーター、または制御可能なプロモーターから選択される。したがって、いくつかの実施形態では、単一のプロモーターまたは別々のプロモーターは、ユビキタスプロモーターである。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターまたは別々のプロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターまたは別々のプロモーターは、制御可能なプロモーターである。
いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、修飾されたｈＴＴＲ（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）、α－アンチトリプシンプロモーター、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）、ＴＲＭプロモーター、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝臓転写因子反応性オリゴマー、ＬＳＰ、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター（１．１ｋｂ）、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｍＴＴＲ、修飾されたｍＴＴＲ、ｍＴＴＲ ｐｒｏ、ｍＴＴＲエンハンサー、または塩基性アルブミンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。したがって、いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、修飾されたｈＴＴＲ（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）を含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、α－アンチトリプシンプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）を含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＴＲＭプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝臓転写因子－反応性オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＬＳＰを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター（１．１ｋｂ）を含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）を含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ｍＴＴＲを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ｍＴＴＲ ｐｒｏを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ｍＴＴＲエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、塩基性アルブミンプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）である。
いくつかの実施形態では、制御可能なプロモーターは、誘導性または抑制可能なプロモーターである。したがって、いくつかの実施形態では、制御可能なプロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、制御可能なプロモーターは、抑制可能なプロモーターである。
いくつかの実施形態では、ベクターは、以下のうちの１つ以上：５’及び３’末端逆位反復、その配列の上流のイントロン、及びシス作用性制御性モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、５’及び３’末端逆位反復をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、その配列の上流のイントロンをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、シス作用性制御性モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＷＰＲＥ配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、修飾されている。
いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、ｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧ修飾を含有する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＭは、肝臓特異的ＣＲＭである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＭは、ＣＲＭ８である。
いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも３つのＣＲＭを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、３つのＣＲＭを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、４つのＣＲＭを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも５つのＣＲＭを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、５つを超えるＣＲＭを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、３つのＣＲＭ８を含む。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＩＲＥＳ配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体軽鎖及び／または重鎖は、半減期を延ばす及び／または抗体のエフェクター機能を低減する１つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）及び／またはＮＨａｎｃｅ変異（Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、ＮＨａｎｃｅ変異（Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）を含む。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶｒｈ．１０から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ４である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ７である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１０である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１１である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０である。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、天然に存在するＡＡＶとほぼ同じＣＣ含有量を有するように操作されたＧＣ含有量を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、天然に存在するＡＡＶ８とほぼ同じＣＣ含有量を有するように操作されたＧＣ含有量を有する。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドは、操作される。
いくつかの実施形態では、操作されたｒＡＡＶベクターは、修飾されたアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、アミノ酸配列の挿入、欠失または置換を含む。したがって、いくつかの実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、１つ以上の挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶカプシドは、天然に由来する。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターカプシドは、ＡＡＶ８である。
いくつかの実施形態では、切断可能な配列は、フーリンで切断可能な配列である。
いくつかの実施形態では、フーリンで切断可能な配列の後にリンカー及び２Ａ配列が続く。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳＧリンカーである。
いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列である。したがって、いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａ配列である。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｐ２Ａ配列である。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｅ２Ａ配列である。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｆ２Ａ配列である。
いくつかの実施形態では、ベクターは、分泌シグナルをさらにコードする。
いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、天然に存在するシグナルペプチドである。
いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、人工シグナルペプチドである。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、血漿カリクレインに結合することが可能な機能的抗血漿カリクレイン抗体を生成する。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、血漿カリクレインのタンパク質分解活性を阻害する。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、血漿カリクレイン活性部位に結合する。
いくつかの実施形態では、結合は、血漿カリクレインの活性部位を閉塞する。
いくつかの実施形態では、結合は、血漿カリクレインの活性を阻害する。
いくつかの実施形態では、抗体は、プレカリクレインに結合しない。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、同じベクターから発現する。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別個のｒＡＡＶベクターから発現する。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別々のｒＡＡＶベクターから発現する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、５’及び３’末端逆位反復（ＩＴＲ）、１つ以上のエンハンサー要素、及び／またはポリ（Ａ）テールをさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、５’及び３’末端逆位反復（ＩＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のエンハンサー要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリ（Ａ）テールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のエンハンサー要素は、転写因子結合部位のクラスター及び／またはＷＰＲＥ配列から選択される。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のエンハンサー要素は、転写因子結合部位のクラスターである。いくつかの実施形態では、１つ以上のエンハンサー要素は、ＷＰＲＥ配列である。
いくつかの態様では、ＡＡＶ８カプシド及び配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超える同一性を有するコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供され、前記ベクターは、ａ．５’末端逆位反復（ＩＴＲ）；ｂ．シス作用性制御性モジュール（ＣＲＭ）；ｃ．肝臓特異的プロモーター；ｅ．コドン最適化された抗血漿カリクレイン抗体重鎖配列及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖配列；ｆ．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）；及びｇ．３’ＩＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、修飾されたｈＴＴＲ（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）、α－アンチトリプシンプロモーター、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）、ＴＲＭプロモーター、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝臓転写因子反応性オリゴマー、ＬＳＰ、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター（１．１ｋｂ）、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｍＴＴＲ、修飾されたｍＴＴＲ、ｍＴＴＲ ｐｒｏ、ｍＴＴＲエンハンサー、または塩基性アルブミンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ｈＴＴＲ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＭは、肝臓特異的ＣＲＭである。
いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも３つのＣＲＭを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、３つのＣＲＭ８を含む。
いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、修飾されている。
いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、ＷＰＲＥ ｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧである。
いくつかの態様では、活性化カリクレイン－キニン経路の欠損症または制御不全に関連する疾患または障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、方法は、本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を投与することを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、活性化カリクレイン－キニン経路の欠損症または制御不全は、Ｃ１エステラーゼ阻害因子の欠損症に関連する疾患または障害である。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、静脈内、皮下、または経皮投与によって投与される。したがって、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、静脈内投与によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、経皮投与によって投与される。
いくつかの実施形態では、経皮投与は、遺伝子銃によって投与される。
いくつかの実施形態では、活性化カリクレイン－キニン経路の欠損症もしくは制御不全またはＣ１エステラーゼ阻害因子の欠損症に関連する障害は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、後天性血管性浮腫（ＡＡＥ）、正常なＣ１阻害因子を有する血管性浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、片頭痛、腫瘍、神経変性疾患、関節リウマチ、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、脊柱狭窄－変性脊椎疾患、動脈もしくは静脈血栓症、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、血管炎、浮腫、脳浮腫、肺塞栓症、脳卒中、心室補助デバイスもしくはステントによって誘発された血栓形成、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈動脈（ＭＣＡ）虚血性事象、再狭窄、全身性エリテマトーデス腎炎／血管炎、または熱傷である。
いくつかの実施形態では、Ｃ１エステラーゼ阻害因子の欠損症に関連する障害は、ＨＡＥである。
いくつかの実施形態では、ＨＡＥは、Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型である。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＡＥは、Ｉ型ＨＡＥである。いくつかの実施形態では、ＨＡＥは、ＩＩ型ＨＡＥである。いくつかの実施形態では、ＨＡＥは、ＩＩＩ型ＨＡＥである。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、投与後にエピソーマルである。
いくつかの実施形態では、投与後に、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び軽鎖は、機能的抗体へと構築する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧである。
いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約２～６週後に対象の血漿において検出可能である。例えば、いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約２週後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約３週後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約４週後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約５週後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約６週後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約６週超後に対象の血漿において検出可能である。
いくつかの態様では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を含む全長抗体をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現カセットであって、ＤＮＡ発現カセットは、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超える同一性を有する配列を含む、ＤＮＡ発現カセットが提供される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ発現カセットは、送達ビヒクル内に含まれる。
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ウイルスベクター、脂質ナノ粒子または細胞外ベシクルから選択される。したがって、いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子から選択される。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、細胞外ベシクルから選択される。
定義
本発明がより容易に理解されるために、所定の用語を以下に最初に定義する。以下の用語及び他の用語のための追加の定義が本明細書を通して示されている。
本発明がより容易に理解されるために、所定の用語を以下に最初に定義する。以下の用語及び他の用語のための追加の定義が本明細書を通して示されている。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈が別途示さない限り、複数の指示対象が含まれる。例えば、用語「細胞」には、それらの混合物を含む複数の細胞が含まれる。
２Ａ配列：本明細書で使用される場合、「２Ａ」または「２Ａ配列」または「２Ａペプチド」は、自己切断可能なペプチドのクラスを指す。２Ａペプチドの例には、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａが含まれる。Ｔ２Ａは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３）の配列を有し；Ｐ２Ａは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１４）の配列を有し；Ｅ２Ａは、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１５）の配列を有し；Ｆ２Ａは、ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１６）の配列を有する。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターに好適な切断効率的２Ａペプチドは、Ｃｈｎｇ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｂｓ．２０１５；７（２）：４０３－４１２、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１１；６（４）に記載されており、その各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」または組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）には、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが含まれるがこれらに限定されない（Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１－６３８８（２００４）；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３０：３７５－３８３（２００４）を参照されたい）。典型的には、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく染色体外の状態で存在し得る。ＡＡＶベクターは、遺伝子療法において一般的に使用されている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、操作される。ＡＡＶは、当該技術分野で知られている任意の方法を介して操作され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、タンパク質操作方法を介して操作される。
投与すること：本明細書で使用される場合、用語「投与すること」、または「導入すること」は、ｒＡＡＶベクターの効率的な送達をもたらす方法または経路によって、対象に抗体をコードするｒＡＡＶベクターを送達することの文脈で互換的に使用される。例えば、静脈内、皮下または経皮を含む、ｒＡＡＶベクターを投与するための様々な方法が当該技術分野で知られている。ｒＡＡＶベクターの経皮投与は、「遺伝子銃」またはバイオリステック粒子送達システムの使用によって実施され得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、非ウイルス脂質ナノ粒子を介して投与される。
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にある非ヒト動物を指す。所定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚、昆虫、及び／またはワームが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子的に操作された動物、及び／またはクローンであり得る。
抗体：本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「Ａｂ」または「Ａｂｓ」または「ｍＡｂｓ」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を指す。「特異的に結合する」または「と免疫反応する」は、抗体が所望の抗原の所望の抗原の１つ以上の領域と反応することを意味する。抗体には、抗体断片が含まれる。抗体にはまた、ポリクローナル、モノクローナル、キメラｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖｓ、及びＦａｂ発現ライブラリが含まれるがこれらに限定されない。抗体は、完全抗体、または免疫グロブリン、または抗体断片であり得る。
認識される免疫グロブリンポリペプチドには、カッパ及びラムダ軽鎖及びアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖または他の種における同等物が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸のもの）は、ＮＨ２末端における約１１０アミノ酸の可変領域及びＣＯＯＨ末端におけるカッパまたはラムダ定常領域を含む。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸のもの）は、同様に、可変領域（約１１６アミノ酸のもの）及び前述した重鎖定常領域の１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸のもの）を含む。
抗原結合部位：本明細書で使用される場合、用語「抗原結合部位」、または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐にわたる伸長部は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接伸長部間に挿入されている。よって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンにおける超可変領域間、及びそれに隣接して天然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合される抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」、または「ＣＤＲ」と称される。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、用語「およそ」または「約」は、対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値に類似する値を指す。所定の実施形態では、用語「およそ」または「約」用語は、特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、言及された参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下のいずれかの方向（よりより大きいまたはより小さい）の範囲内の値の範囲を指す。
生物学的に活性：本明細書で使用される場合、語句「生物学的に活性」は、生物学的システム、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対する生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性と考えられる。特定の実施形態では、ペプチドが生物学的に活性である場合、ペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのペプチドの部分は、典型的には、「生物学的に活性な」部分と称される。
Ｃ１－エステラーゼ欠損症またはＣ１－エステラーゼ障害：本明細書で使用される場合、「Ｃ１－エステラーゼ欠損症」または「Ｃ１－エステラーゼ障害」は、健康な個体と比較して対象に存在する機能的Ｃ１－エステラーゼ阻害因子の低減した量を意味する。
ＧＣ含有量：ＧＣ含有量（またはグアニン－シトシン含有量）は、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであるＤＮＡまたはＲＮＡ分子における窒素塩基のパーセンテージである。
コドン適応指標（ＣＡＩ）：ＣＡＩは、コドン使用頻度バイアスを分析するための最も汎用されている技術である。コドン使用頻度バイアスは、コードＤＮＡにおける同義コドンの存在の頻度の差を指す。
コドン最適化：本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」は、アミノ酸配列を改変することなく様々な基準に基づいて組換え遺伝子のコドン組成を改善する方法を指す。コドン最適化の様々な手法が当該技術分野で知られており、例えば、合成遺伝子設計のためのウェブベースの多目的最適化プラットフォーム（例えば、ＣＯＯＬ（コドン最適化オンライン（Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｏｎｌｉｎｅ））と呼ばれる）を含む。様々な刊行物、例えば、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１４ Ａｕｇ １；３０（１５）２２１０－２；ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．，２０１２ Ｏｃｔ ２０；６：１３４；Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１６ Ｊｕｎ １；１０２：２６－３５；及びＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｊｕｌ－Ａｕｇ ２０１５；７５－７６：５７－６３などは、コドン最適化ストラテジーに関する。これらの刊行物の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
切断可能なリンカー：本明細書で使用される場合、用語「切断可能なリンカー」には、化合物によって切断することが可能な任意のポリペプチドリンカーが含まれる。例えば、切断可能なリンカーは、酵素的に切断可能であるポリペプチドリンカーであり得る。例えば、フーリンで切断可能なリンカーまたはトロンビンで切断可能なリンカーを含む様々な酵素的に切断可能なリンカーが本発明に好適である。
ＣｐＧ部位：ＣｐＧ部位またはＣＧ部位は、その５’→３’方向に沿って塩基の線状配列においてシトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続くＤＮＡの領域である。
結合した、連結した、接続した、または融合した：本明細書で使用される場合、用語「結合した」、「連結した」、「接続した」、「融合した」、及び「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含む、あらゆる手段によって２つ以上の要素または成分を互いに接続することを指す。
エピトープ：本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」には、免疫グロブリン、または断片への特異的結合が可能な任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は通常、分子、例えば、アミノ酸または糖側鎖の化学的に活性な表面群からなり、通常は、特定の三次元の構造的特徴、及び特定の電荷的特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ペプチドに対して樹立され得る。
機能的同等物または派生物：本明細書で使用される場合、用語「機能的同等物」または「機能的派生物」は、アミノ酸配列の機能的派生物の文脈において、元の配列のものに実質的に類似する生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持する分子を意味する。機能的派生物または同等物は、天然の派生物であってもよいし、合成的に調製されたものであってもよい。例示的な機能的派生物には、タンパク質の生物学的活性が保存されているという条件で、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が含まれる。置換アミノ酸は、置換アミノ酸と同様の化学物理特性を有することが望ましい。望ましい類似の化学物理特性には、電荷、かさ高さ、疎水性、親水性などの類似性が含まれる。
遺伝性血管性浮腫またはＨＡＥ：本明細書で使用される場合、用語「遺伝性血管性浮腫」または「ＨＡＥ」は、炎症の予測不可能な及び再発性の発作によって特性化される血液障害を指す。ＨＡＥは、典型的には、Ｃ１－ＩＮＨの低いレベルまたは無効化したまたは低下した活性を有するＣ１－ＩＮＨの結果であり得るＣ１－ＩＮＨ欠損症に関連する。ＨＡＥはまた、とりわけ、ＦＸＩＩにおける変異などの他の遺伝子変異に関連する。症状には、身体の任意の部分、例えば、顔、四肢、生殖器、消化管、及び上気道において生じ得る腫れが含まれるがこれらに限定されない。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物の内ではなく人工的な環境、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養などにおいてで生じる事象を指す。
ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、ヒト及びヒト以外の動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈では、この用語は、生細胞内で生じる事象を指すために使用され得る（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムとは対照的に）。
ＩＲＥＳ：本明細書で使用される場合、用語「ＩＲＥＳ」は、任意の好適な内部リボソーム進入部位配列を指す。
単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）最初に生成された時にそれが関連していた成分の少なくとも一部から分離された（天然において及び／または実験環境においてにかかわらない）、及び／または（２）人の手によって生成、調製、及び／または製造された物質及び／または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に関連していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％超、実質的に１００％、または１００％純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される場合、用語「単離された細胞」は、多細胞生物に含まれない細胞を指す。
免疫学的結合：用語「免疫学的結合」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有結合性相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度、または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表され得、より小さなＫｄは、より高い親和性を表す。選択されるポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知である方法を使用して定量され得る。
リンカーまたはペプチドリンカー：用語「リンカー」または「ペプチドリンカー」は、本明細書で使用される場合、２つのポリペプチドドメインを接続させるアミノ酸配列を指す。例えば、「リンカー」または「ペプチドリンカー」は、抗体重鎖アミノ酸配列及び抗体軽鎖アミノ酸配列を分離し得る。例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＧＳＧ）モチーフを有するリンカーを含む、様々な種類のリンカーが本発明に好適である。
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、この用語が、長い鎖に限定されないこと、及びペプチド結合を介して互いに連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指し得ることを理解するであろう。当業者に知られているように、ポリペプチドは、処理及び／または修飾され得る。
予防する：本明細書で使用される場合、用語「予防する」または「予防」は、疾患、障害、及び／または病態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害及び／または病態を発症するリスクを低減することを指す。
タンパク質：用語「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、別個の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的会合を必要としない場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され得る。別個の機能単位が、互いに物理的に会合する複数のポリペプチドから構成される場合、用語「タンパク質」は、物理的に結合され、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
リピート配列：リピート配列は、ゲノムにわたって複数のコピーで生じる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のパターンである。
対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得、患者は、疾患の診断または処置のために医療提供者を訪れるヒトを指す。用語「対象」は、本明細書で「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に苦しんでいる可能性があるかまたはそれらにかかりやすいが、疾患または障害の症状を表してもまたは表さなくてもよい。
実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、対象となる特徴もしくは性質のすべてまたはほぼすべての範囲もしくは程度を表す定性的状態を指す。生物学分野における当業者には、生物学的及び化学的な現象が、あるとしてもめったに完全にまで至らないか及び／または完全性まで進まないかあるいは確かな結果に達しないまたはそれを回避しないものと理解されよう。用語「実質的に」は、したがって、多くの生物学的及び化学的な現象に内在する潜在的な完全性の欠如を表現するために使用される。
実質的相同性：語句「実質的相同性」は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者によって理解されるように、２つの配列は通常、対応する位置において相同な残基を含有する場合、「実質的に相同」とみなされる。相同な残基は、同一の残基であり得る。代替的に、相同な残基は、適切に同様の構造的及び／または機能的特徴を有する非同一の残基であり得る。例えば、当業者によく知られているように、所定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」側鎖を有するものとして分類される。あるアミノ酸を、同一タイプの別のアミノ酸と置換することはしばしば、「相同」置換とみなされ得る。
当該技術分野においてよく知られているように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの、商業コンピュータープログラムにおいて利用可能なものを含む、多様なアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同な配列を同定することに加えて、上述したプログラムは典型的には、相同性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、残基の関連する伸長部にわたって相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連する伸長部は、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連する伸長部は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。
実質的同一性：語句「実質的同一性」は、アミノ酸または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者によって理解されるように、２つの配列は通常、対応する位置において同一の残基を含有する場合、「実質的に同一」とみなされる。当該技術分野においてよく知られているように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの、商業コンピュータープログラムにおいて利用可能なものを含む、多様なアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述したプログラムは典型的には、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、残基の関連する伸長部にわたって同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態では、関連する伸長部は、完全配列である。いくつかの実施形態では、関連する伸長部は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。
罹患している：疾患、障害、及び／または病態に「罹患している」個体は、疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状があると診断されているか、またはそれを呈する。
治療的有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療的有効量」という用語は、疾患、障害及び／または状態に罹患しているかまたはそれらにかかりやすい対象へ投与する場合に、疾患、障害及び／または状態の症状の発症を処置、診断、予防及び／または遅延させるために十分な量を意味する。治療的有効量は、典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投薬レジメンを介して投与されることが当業者によって理解される。
処置すること：本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」または「処置すること」は、特定の疾患、傷害、及び／または病態の１つ以上の症状または特徴を部分的にまたは完全に軽減、改善、緩和、阻害、予防するために、その開始を遅らせるために、その重症度を低減するために、及び／またはその発生率を低減するために使用される任意の方法を指す。処置は、疾患に関連する病状の発症リスクを低下させる目的で、疾患の兆候を示さない及び／または疾患の初期兆候のみを示す対象へ投与され得る。
本明細書での端点による数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれるすべての数値及び分数が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９、４、及び５が含まれる）。すべての数字及びその分数は、「約」という用語によって修飾されることが推定されることも理解されたい。
本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいて詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。
本発明は、抗血漿カリクレイン抗体をコードするベクター及びこれらの治療的抗体での処置のための示された疾患または病態を有すると診断された対象へのそのようなベクターの送達のための方法を提供する。そのようなベクターの送達は、遺伝子療法を介して、例えば、治療的抗体またはその抗原結合断片をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを、そのような治療的抗体での処置が適応される病態を有すると診断された対象に投与して、抗体または治療的抗体の抗原結合断片を、抗体またはその抗原結合断片がその治療効果を発揮する標的組織に連続的に供給する対象の組織または器官におけるデポを生成することによって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、血漿カリクレイン媒介障害、例えば、ＨＡＥ関連Ｃ１ ＩＮＨ欠損症の処置のための抗血漿カリクレイン抗体をコードするコドン最適化された核酸配列を含む効率的で頑強な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを記載する。ヒトＣ１－ＩＮＨは、広範囲の阻害性及び非阻害性生物学的活性を有する重要な抗炎症血漿タンパク質である。配列相同性、そのＣ末端ドメインの構造、及びプロテアーゼ阻害のメカニズムによれば、それは、血漿プロテアーゼ阻害因子の最も大きなクラスであるセルピンスーパーファミリーに属し、それにはまた、抗トロンビン、α１－プロテイナーゼ阻害因子、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子、及び多様な生理的システムを制御する多くの他の構造的に同様のタンパク質が含まれる。Ｃ１－ＩＮＨは、補体系、キニン生成の接触システム、及び固有の凝固経路におけるプロテアーゼの阻害因子である。
Ｃ１－ＩＮＨの低い血漿含有量またはその機能不全は、補体及び接触血漿カスケードの両方の活性化をもたらし、他のシステムにも影響を及ぼし得る。Ｃ１－ＩＮＨ血漿含有量が５５μｇ／ｍＬ（正常の約２５％）よりも低いレベルまで低下すると、Ｃ１の自発的活性化を誘導することが示されている。カリクレインキニンシステムが正常なＣ１－ＩＮＨ活性の存在下でさえも過剰に活性化され得る他の様式が存在する。例えば、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）における既知の変異が存在し、その変異によりそれは容易に活性化され、よって、後にプレカリクレインを血漿カリクレインに活性化する傾向がより高くなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、過剰な血漿カリクレイン活性によって媒介される疾患または機能不全を有する対象を処置するために使用される。
血漿カリクレインに結合する抗体の送達のためのｒＡＡＶベクターアプローチを示す概略図が図１に示されている。図１に示されているように、組換え抗血漿カリクレイン抗体配列を含むｒＡＡＶベクターは、対象に投与され、融合した重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡ転写産物の生成をもたらす。この転写産物の翻訳中に、別個の重鎖及び軽鎖ポリペプチドが作製され、循環に分泌される機能的抗血漿カリクレイン抗体の生成をもたらす。図２は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターの実施形態を示している。
したがって、本開示は、とりわけ、疾患、例えば、カリクレイン－キニンシステム不調に関連する疾患の処置に有用な抗体をコードするコドン最適化された核酸配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。ｒＡＡＶベクターは、例えば、血漿カリクレインなどの、カリクレイン－キニンシステムの選択されたタンパク質メンバーを標的とする抗体をコードするように構築され得る。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、抗血漿カリクレイン抗体をコードする。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードする。
本開示は、とりわけ、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを使用して疾患を処置する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、カリクレイン－キニンカスケードの過剰な活性に関連する疾患、例えば、Ｃ１－ＩＮＨ欠損症または障害である。
いくつかの実施形態では、Ｃ１－ＩＮＨ欠損症または障害は、ＨＡＥである。
ベクター設計
抗血漿カリクレイン抗体またはその抗原結合断片をコードするベクターが本明細書で提供される。抗血漿カリクレイン抗体または抗原結合断片をコードするベクターには、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターが含まれる。本明細書で提供されるウイルスベクター及び他のＤＮＡ発現ベクターには、標的細胞への導入遺伝子の送達のための任意の好適な方法、例えば、ウイルスベクター及び／または細胞外ベシクルなどが含まれる。導入遺伝子の送達の手段には、ウイルスベクター、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む他の脂質含有複合体、他の巨大分子複合体、無機ナノ粒子、合成の修飾されたｍＲＮＡ、修飾されていないｍＲＮＡ、小分子、生物学的に活性ではない分子（例えば、金粒子）、重合した分子（例えば、デンドリマー）、むき出しのＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはエピソームが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的化ベクター、例えば、網膜色素上皮細胞、ＣＮＳ細胞、筋肉細胞、または肝臓細胞に標的化されたベクターである。
抗血漿カリクレイン抗体またはその抗原結合断片をコードするベクターが本明細書で提供される。抗血漿カリクレイン抗体または抗原結合断片をコードするベクターには、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターが含まれる。本明細書で提供されるウイルスベクター及び他のＤＮＡ発現ベクターには、標的細胞への導入遺伝子の送達のための任意の好適な方法、例えば、ウイルスベクター及び／または細胞外ベシクルなどが含まれる。導入遺伝子の送達の手段には、ウイルスベクター、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む他の脂質含有複合体、他の巨大分子複合体、無機ナノ粒子、合成の修飾されたｍＲＮＡ、修飾されていないｍＲＮＡ、小分子、生物学的に活性ではない分子（例えば、金粒子）、重合した分子（例えば、デンドリマー）、むき出しのＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはエピソームが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的化ベクター、例えば、網膜色素上皮細胞、ＣＮＳ細胞、筋肉細胞、または肝臓細胞に標的化されたベクターである。
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８）、レンチウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、日本ヘマグルチニンウイルス（ＨＶＪ）、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターには、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターが含まれる。アルファウイルスベクターには、セムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルス（ＳＩＮ）が含まれる。所定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。所定の実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、それらがヒトにおいて複製欠損性となるように改変される。所定の実施形態では、ウイルスベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、「ヘルプレス」アデノウイルスベクター内に配置されたＡＡＶベクターである。所定の実施形態では、本明細書では、第１のウイルスからのウイルスカプシド及び第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターが提供される。特定の実施形態では、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。いくつかの実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質である。
所定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＩＶベースのウイルスベクターである。所定の実施形態では、ＨＩＶベースのベクターは、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は、ＨＩＶゲノムからのものであり、ｅｎｖ遺伝子は、別のウイルスからのものである。
所定の実施形態では、ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスベースのウイルスベクターである。所定の実施形態では、単純ヘルペスウイルスベースのベクターは、１つ以上の最初期（ＩＥ）遺伝子を含まないように修飾され、それらを非細胞傷害性とする。
所定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＭＬＶベースのウイルスベクターである。所定の実施形態では、ＭＬＶベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最大で８ｋｂの異種ＤＮＡを含む。
所定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。所定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスに由来する。所定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、非ヒトレンチウイルスに由来する。所定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチウイルスカプシドにパッケージングされる。所定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、以下の要素のうちの１つ以上：長い末端反復、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位、及びカプシド形成部位を含む。
所定の実施形態では、ウイルスベクターは、アルファウイルスベースのウイルスベクターである。所定の実施形態では、アルファウイルスベクターは、組換え複製欠損性アルファウイルスである。所定の実施形態では、アルファウイルスベクターにおけるアルファウイルスレプリコンは、それらのビリオン表面上で機能的異種リガンドを提示することによって特定の細胞タイプに標的化される。
所定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベースのウイルスベクターである。所定の実施形態では、ＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子（複製のために必要とされる）及び／またはＡＡＶのｃａｐ遺伝子（カプシドタンパク質の合成のために必要とされる）をコードしない（ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスでパッケージング細胞によって提供され得る）。複数のＡＡＶ血清型が同定されている。所定の実施形態では、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１つ以上の血清型からの成分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。
いくつかの態様では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードするコドン最適化された核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡ転写産物における融合した抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を生成する。融合した重鎖及び軽鎖転写産物は、その後、切断されて機能的抗血漿カリクレイン抗体を生成し、循環に分泌される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖配列の両方を含む１つの遺伝子カセットを提供する。いくつかの実施形態では、肝臓は、ｒＡＡＶベクターの投与後にデポとして作用する。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡ連結によって互いに連結された１つ以上のｍＲＮＡ転写産物を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡ連結によって互いに連結された重鎖及び軽鎖ヌクレオチドを含む１つのｍＲＮＡ転写産物を生成する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡ連結によって互いに連結された重鎖及び軽鎖ヌクレオチドを含む複数のｍＲＮＡ転写産物を生成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ連結は、その後切断され、重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、翻訳中に別個の実体として発現する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ連結は、インタクトなままであり、重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、翻訳中に別個の実体として発現する。
いくつかの実施形態では、リンカーは、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を連結させる。様々な種類のリンカーがｒＡＡＶベクターにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン／セリンリンカー、すなわち、本質的にグリシン及びセリンからなるペプチドリンカーである。例示的な実施形態では、リンカーは、ＧＳまたはＧＳＧを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＳＧである。別の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＧＳＧ）モチーフ、例えば、ＧＧＳＧ（配列番号７）、（ＧＳ）ｘ３（配列番号１２）、（ＧＧＳＧ）ｘ２（配列番号８）、ＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号９）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１０）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ３（配列番号１１）を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。多数の種類の切断可能なリンカー、例えば、酵素によって切断可能なものが当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、リンカーは、フーリンまたはトロンビンで切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、フーリンで切断可能なリンカーである。
いくつかの実施形態では、フーリンで切断可能なリンカーの後に２Ａ配列が続く。様々な種類の２Ａ配列が当該技術分野で知られており、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａを含む。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｔ２Ａである。いくつかの実施形態では、２Ａ配列は、Ｐ２Ａである。いくつかの実施形態では、２Ａは、Ｅ２Ａである。いくつかの実施形態では、２Ａは、Ｆ２Ａである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＩＲＥＳ配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩＲＥＳ配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、単一のプロモーターによって制御される。そのような構成は、１つの融合した重鎖及び軽鎖を含む転写産物の生成をもたらすであろうし、融合した重鎖及び軽鎖配列の切断後、２つのポリペプチド生成物をもたらす。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別々のプロモーターによって制御される。
様々な種類のプロモーターが、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターにおいて使用され得る。これらは、例えば、ユビキタス、組織特異的な、及び制御可能な（例えば、誘導性または抑制可能な）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、修飾されている。様々な種類の修飾されたプロモーターが当該技術分野で知られており、例えば、とりわけ、短縮化最小プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ユビキタスプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。好適な肝臓特異的プロモーターの例には、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、修飾されたｈＴＴＲ（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）、α－アンチトリプシンプロモーター、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）、ＴＲＭプロモーター、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝臓転写因子反応性オリゴマー、ＬＳＰ、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター（１．１ｋｂ）、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｍＴＴＲ、修飾されたｍＴＴＲ、ｍＴＴＲ ｐｒｏ、ｍＴＴＲエンハンサー、及び塩基性アルブミンプロモーターが含まれる。肝臓特異的プロモーターは、例えば、Ｚｈｉｊｉａｎ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１６，ｎｏ ２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡの転写及び／または翻訳を促進するために追加のエンハンサーまたは制御要素（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳなど）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、５’及び３’末端逆位反復（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のエンハンサー要素を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリ（Ａ）テールを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的制御要素／領域（ＨＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡｐｏＥエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的核酸制御要素、例えば、シス制御要素（ＣＲＥ）などを含む。ＣＲＥは、ＥＰ１８２０２８８８に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣＲＥには、例えば、ＣＲＥ４及びＣＲＥ６が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＲＥ４は、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ遺伝子と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＣＲＥ６は、アポリポタンパク質Ｃ－Ｉ遺伝子と組み合わせて使用される。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。ＷＰＲＥの様々な最適化されたまたはバリアント形態が本明細書に記載のベクターと共に使用され得、例えば、とりわけ、ＷＰＲＥ野生型、ＷＰＲＥ３、及びＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧを含む。ＷＰＲＥ及び関連するＷＰＲＥバリアントは、米国特許番号１０，１７９，９１８；米国特許番号７，４１９，８２９；米国特許番号９，７３１，０３３；米国特許番号８，７４８，１６９；米国特許番号７，８１６，１３１；米国特許番号８，８６５，８８１；米国特許番号６，２８７，８１４；米国特許公開番号２０１６／０１９９４１２；米国特許公開番号２０１７／０１１４３６３；米国特許公開番号２０１７／０３６０９６１；米国特許公開番号２０１９／００３２０７８；米国特許公開番号２０１８／０３５３６２１；国際公開番号ＷＯ２０１７２０１５２７；国際公開番号ＷＯ２０１８１５２４５１；国際公開番号ＷＯ２０１３１５３３６１；国際公開番号ＷＯ２０１４１４４７５６；欧州特許番号ＥＰ１０１７７８５；及び欧州特許公開番号３４４０１９１に記載されている。前述の刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＷＰＲＥ要素、及び／または転写因子結合部位のクラスターを含む。よって、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、転写因子結合部位のクラスターを含む。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、シス制御性モジュール（ＣＲＭ）を含む。様々な種類のＣＲＭが本明細書に記載のベクターにおいて使用するのに好適であり、例えば、肝臓特異的ＣＲＭ、ニューロン特異的ＣＲＭ及び／またはＣＲＭ８を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＲＭは、肝臓特異的ＣＲＭである。いくつかの実施形態では、ＣＲＭは、ニューロン特異的ＣＦＭである。いくつかの実施形態では、ＣＲＭは、ＣＲＭ８である。いくつかの実施形態では、ベクターには、複数のＣＲＭが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、ベクターは、２、３、４、５または６つのＣＲＭを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、３つのＣＲＭ、例えば、３つのＣＲＭ８を含む。
ｒＡＡＶベクターは、天然に存在する及び／または人工のシグナルペプチド（例えば、組換え的に操作されている）である分泌シグナルを含む。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、天然に存在するシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、人工シグナルペプチド（例えば、組換え的に操作されている）である。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ヒト分泌シグナルである。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ネズミ分泌シグナルである。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、転写産物安定性を増加させるために、より効率的な翻訳のために、及び免疫原性を低減するために最適化された配列である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン重鎖及び軽鎖を含むｒＡＡＶベクターは、転写産物安定性を増加させるために、より効率的な翻訳のために、及び免疫原性を低減するために最適化された配列である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン重鎖及び軽鎖は、コドン最適化される。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶ１１ベクターである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ４である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ７である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１０である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１１である。
いくつかの態様では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの組み合わせである。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーターに機能可能に連結される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。肝臓特異的プロモーターの例には、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）及び修飾されたｈＴＴＲ、（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）が含まれる。様々な実施形態において使用され得る様々な好適なプロモーターは、上述されている。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、シスアクチン制御性モジュール（ＣＲＭ）に機能可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＲＭには、肝臓特異的ＣＲＭが含まれる。いくつかの実施形態には、３つのＣＲＭ、例えば、３つのＣＲＭ８が含まれる。様々な実施形態において使用され得る様々な種類の好適なＣＲＭは、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）に機能可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥｍｕｔ６である。ＷＰＲＥの様々な最適化されたまたはバリアント形態が当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、天然に存在するまたは人工のシグナルペプチド（例えば、組換え的に操作されている）である分泌シグナルに機能可能に連結される。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、天然に存在するシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、人工シグナルペプチド（例えば、組換え的に操作されている）である。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ヒト分泌シグナルである。いくつかの実施形態では、分泌シグナルは、ネズミ分泌シグナルである。
抗血漿カリクレイン抗体
ｒＡＡＶベクターによってコードされる例示的な重鎖及び軽鎖抗血漿カリクレインアミノ酸配列が以下の表１～２に示されている。
ｒＡＡＶベクターによってコードされる例示的な重鎖及び軽鎖抗血漿カリクレインアミノ酸配列が以下の表１～２に示されている。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、延長した半減期を有するように操作される。この目的のため、いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ＮＨａｎｃｅ変異（すなわち、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）を含む。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ＹＴＥ変異（すなわち、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）を含む。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、Ｆｃ受容体との低減した相互作用を有するように操作される。この目的のため、いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ＬＡＬＡ変異（すなわち、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、低減したＣｐＧ及びリピート配列を有するように操作される。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ネイティブＡＡＶ８のＧＣ含有量パーセンテージに対して正規化するように操作される。この目的のため、いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、２９３０－ＬＡＬＡ変異を含む。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、アルブミンまたはＦｃＲｎ相互作用ペプチドに融合される。
いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、以下の表に記載される配列と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約５０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約５５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約６０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約６５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約７０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約７５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約８０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約８５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約９０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約９５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と約１００％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表１～２に記載される配列と同一である。
抗血漿カリクレイン抗体をコードする例示的なコドン最適化されたヌクレオチド配列が以下の表３に示されている。
いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、以下の表に記載される配列と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約５０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約５５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約６０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約６５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約７０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約７５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約８０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約８５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約９０％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約９５％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と約１００％同一である。いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖配列は、表３に記載される配列と同一である。
いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＦＴＦＳＨＹＩＭＭ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＧＩＹＳＳＧＧＩＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ（配列番号１８）を含む重鎖ＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＲＲＩＧＶＰＲＲＤＥＦＤＩ（配列番号１９）を含む重鎖ＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＦＴＦＳＨＹＩＭＭ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＧＩＹＳＳＧＧＩＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ（配列番号１８）を含むＣＤＲ２、及びＲＲＩＧＶＰＲＲＤＥＦＤＩ（配列番号１９）を含むＣＤＲ３を有する。
いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖ＣＤＲ１を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＹＫＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号２１）を含む軽鎖ＣＤＲ２を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＱＱＹＮＴＹＷＴ（配列番号２２）を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖ＣＤＲ１、（配列番号２１）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＹＮＴＹＷＴ（配列番号２２）を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＦＴＦＳＨＹＩＭＭ（配列番号１７）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＧＩＹＳＳＧＧＩＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ（配列番号１８）を含むＣＤＲ２、及びＲＲＩＧＶＰＲＲＤＥＦＤＩ（配列番号１９）を含むＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、例示的な抗血漿カリクレイン抗体は、ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ（配列番号２０）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＹＫＡＳＴＬＥＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号２１）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＹＮＴＹＷＴ（配列番号２２）を含む軽鎖ＣＤＲ３を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＤＲは、本明細書に記述されるＣＤＲに関して１、２、３、または４つのアミノ酸置換、欠失または挿入を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＤＲは、記述されたＣＤＲ配列と比較して３、２または１つ以下のアミノ酸置換、欠失または挿入を含有する。いくつかの実施形態では、親和性成熟バリアントは、所望の結合特性を伴って得られる。様々な親和性成熟ＣＤＲ配列がＷＯ２０１４１５２２３２で提供されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の例示的な抗血漿カリクレイン抗体には、限定されないが、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′２、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及びＳＭＩＰ結合部位が含まれる。所定の実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体は、ラナデルマブの重鎖及び軽鎖配列をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片ではない。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂではない。
所定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖには、例えば、抗原結合を可能とするようにｓｃＦｖを異なる方向で配向させるフレキシブルリンカーが含まれ得る。様々な実施形態では、抗体は、サイトゾル安定ｓｃＦｖまたはイントラボディであり得、それは、細胞内の還元環境においてその構造及び機能を保持する（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ ＤｅＬｉｓａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８５（１）：２９９－３１１，２００９（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、本明細書に記載の方法に従ってＩｇＧまたはキメラ抗原受容体に変換される。実施形態では、抗体は、変性したタンパク質及びネイティブタンパク質標的の両方に結合する。実施形態では、抗体は、変性したタンパク質またはネイティブタンパク質のいずれかに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、補体系の選抜メンバーに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、血漿カリクレインに結合する。
ヒトを含むほとんどの哺乳動物では、完全抗体は、ジスルフィド結合によって接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）及びＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域と共に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。
抗体には、すべての既知の形態の抗体及び抗体様特性を有する他のタンパク質骨格が含まれる。例えば、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、一価抗体、キメラ抗体、または抗体様特性を有するタンパク質骨格、例えば、フィブロネクチンまたはアンキリンリピートであり得る。抗体は、以下のアイソタイプのいずれかを有し得る：ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＡｓｅｃ）、ＩｇＤ、またはＩｇＥ。
抗体断片には、抗体に由来する１つ以上のセグメントが含まれ得る。抗体に由来するセグメントは、特定の抗原に特異的に結合する能力を保持し得る。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′２、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、またはＳＭＩＰであり得る。抗体断片は、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ、ナノボディ、アプタマー、ドメイン抗体、線状抗体、一本鎖抗体、または抗体断片から形成され得る多様な多重特異的抗体のいずれかであり得る。
抗体断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）２断片：ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片：ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片：抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる断片；（ｖ）ｄＡｂ断片：ＶＨ及びＶＬドメインを含む断片；（ｖｉ）ｄＡｂ断片：ＶＨドメインである断片；（ｖｉｉ）ｄＡｂ断片：ＶＬドメインである断片；（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｉｘ）１つ以上の合成リンカーによって任意に接続され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、例えば、ＶＬ及びＶＨ領域が対となって一価結合部位（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質として発現することを可能とする合成リンカーによって接続され得る。抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ得、いくつかの例では、インタクトな抗体と同じ手法で使用され得る。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によってまたはインタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって生成され得る。抗体断片には、追加的なＣ末端アミノ酸、Ｎ末端アミノ酸、または個々の断片を分離するアミノ酸の付加を伴う上述した抗体断片のいずれかがさらに含まれ得る。
抗体は、第１の種に由来する１つ以上の抗原決定領域または定常領域及び第２の種に由来する１つ以上の抗原決定領域または定常領域を含む場合、キメラと称され得る。キメラ抗体は、例えば、遺伝子修飾によって構築され得る。キメラ抗体には、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、マウス及びヒトからのもの）が含まれ得る。
疾患の処置のための抗血漿カリクレイン抗体をコードするｒＡＡＶベクターの使用
本明細書には、制御されない血漿カリクレイン活性に関連する疾患、例えば、Ｃ１エステラーゼ阻害因子の欠損症または障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードするＡＡＶベクターを投与することを含む、方法が記載される。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターの投与後、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び軽鎖は、機能的抗体へと構築する。機能的抗体は、循環に分泌され、血漿カリクレインに結合する。
本明細書には、制御されない血漿カリクレイン活性に関連する疾患、例えば、Ｃ１エステラーゼ阻害因子の欠損症または障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖をコードするＡＡＶベクターを投与することを含む、方法が記載される。本明細書に記載のｒＡＡＶベクターの投与後、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び軽鎖は、機能的抗体へと構築する。機能的抗体は、循環に分泌され、血漿カリクレインに結合する。
本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、任意のＣ１エステラーゼ阻害因子欠損症または障害及び／または血漿カリクレイン活性の制御不全によって媒介される障害を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、障害は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、後天性血管性浮腫（ＡＡＥ）、関節リウマチ、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、脊柱狭窄－変性脊椎疾患、動脈もしくは静脈血栓症、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、血管炎、浮腫、脳浮腫、肺塞栓症、脳卒中、心室補助デバイスもしくはステントによって誘発された血栓形成、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈動脈（ＭＣＡ）虚血性事象、再狭窄、全身性エリテマトーデス腎炎／血管炎、糖尿病性黄斑浮腫、または熱傷である。いくつかの実施形態では、Ｃ１エステラーゼ阻害因子欠損症または障害は、ＨＡＥである。ＨＡＥは、ＨＡＥ Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型を含む任意の種類のＨＡＥであり得る。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、それを必要とする対象への投与後にエピソーマルを保持する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、それを必要とする対象への投与後にエピソーマルを保持しない。例えば、いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、対象のゲノムに組み込まれる。そのような組み込みは、例えば、様々な遺伝子編集技術、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、ＡＲＣＵＳゲノム編集、及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用することによって達成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターを含む薬学的組成物は、それを必要とする対象を処置するために使用される。本発明のｒＡＡＶベクターまたは粒子を含有する薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含有する。好適な薬学的担体の例は、当該技術分野でよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。そのような担体は、慣例の方法によって製剤化され得、対象に治療的有効量で投与される。
ｒＡＡＶベクターは、好適な経路を介してそれを必要とする対象に投与される。実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、静脈内、腹腔内、皮下、または皮内投与によって投与される。実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、静脈内に投与される。実施形態では、皮内投与は、「遺伝子銃」またはバイオリステック粒子送達システムの使用による投与を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、非ウイルス脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、ｒＡＡＶベクターを含む組成物は、１つ以上の希釈剤、緩衝液、リポソーム、脂質、脂質複合体を含み得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、マイクロスフィアまたはナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子内に含まれる。
いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約２～６週後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、約２週で対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、約３週で対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、約４週で対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、約５週で対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、約６週で対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から約２～６週後に対象の肝細胞において検出可能である。
いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または１０年後に対象の血漿において検出可能である。したがって、いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも３ヶ月後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも６ヶ月後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも１２ヶ月後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも２年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも３年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも４年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも５年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも６年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも７年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも８年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも９年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも１０年後に対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的抗血漿カリクレイン抗体は、ｒＡＡＶベクターの投与後に対象の人生の残りの間、対象の血漿において検出可能である。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、静脈内に送達された精製された抗ＰＫａ ＩｇＧの投与後に見られるものと同じ程度まで活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、静脈内に送達された精製された抗ＰＫａ ＩｇＧの投与と比較してより多くの量の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。
いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも６０％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも６５％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも７０％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも７５％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも８０％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも８５％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも９０％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも９５％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖抗体を含む投与されたｒＡＡＶは、少なくとも９９％の活性抗ＰＫａ抗体の生成をもたらす。
いくつかの実施形態では、対象へのＡＡＶベクターの投与後、循環において検出可能な血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、対象への精製された血漿カリクレイン抗体の直接的投与後に検出可能なＩｇＧよりも約４～１０倍高い。いくつかの実施形態では、対象へのＡＡＶベクターの投与後、検出可能な活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルを満たし、またはそれを超える。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターの投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約２～３５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約２倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約３倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約４倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約６倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約６倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約７倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約８倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約９倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約１０倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約１５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約２０倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約２５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約３０倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性血漿カリクレインＩｇＧのレベルは、ヒト治療的レベルの約３５倍である。
よって、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を含むｒＡＡＶベクターの投与は、必要とする対象への精製された抗血漿カリクレイン抗体の単一投与と比較して持続した頑強な発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約５０～９５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。よって、いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約５０％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約５５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約６０％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約６５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約７０％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約７５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約７５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約８０％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約８５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約９０％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。いくつかの実施形態では、投与されたｒＡＡＶベクターは、血漿カリクレイン活性を約９５％阻害することが可能な抗血漿カリクレイン抗体を生成する。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の実施例において明らかである。しかし、本発明の実施形態を示しながら、実施例が、限定ではなく、例示としてのみ、与えられることを理解するべきである。実施例から、本発明の範囲内での様々な変更及び修正が、当業者に明らかになるであろう。
実施例１．ベクター設計
抗カリクレイン抗体及びそのバリエーションをコードするコドン最適化された核酸配列を含むｒＡＡＶ発現コンストラクト（ｒＡＡＶベクター）を精製する例示的な方法及び設計が本実施例で提供される。この研究では、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ８）を使用した。ｒＡＡＶベクターの基本的設計は、末端逆位反復（ＩＴＲ）：５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲによって挟まれた発現カセットを含む。これらのＩＴＲは、ベクタープロデューサー細胞においてＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ及び関連する因子によってベクターゲノムの複製及びパッケージングを媒介する。典型的には発現カセットは、プロモーター、コード配列、ポリＡテール及び／またはタグを含有する。遺伝子コドンが最適化されたベクター化抗血漿カリクレイン（ＰＫａ）－ＩｇＧ抗体をコードする発現コンストラクトを標準的な分子生物学技術を使用して設計し、調製した。抗ＰＫａ抗体重鎖（ＨＣ）のためのコード配列及び抗ＰＫａ抗体軽鎖（ＬＣ）のためのコード配列を、プロモーターであるニワトリＢ－アクチンプロモーター（ＣＢ）の下流に挿入した。別の例示的な方法及び設計では、プロモーター（＋／－エンハンサー）は、３ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲを含む肝臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、発現カセットにはまた、ＷＰＲＥ要素及びヒト分泌シグナル（ＳＳ）が含まれる。いくつかの実施形態では、発現カセットにはまた、イントロンが含まれる。フーリンで切断可能な部位（Ｆ／２Ａ）をコードするオリゴヌクレオチドを含む短いリンカーをＨＣとＬＣとの間に挿入した。１６８ｂｐのＳＶ４０ ｐｏｌ Ａ配列及びＤＮＡタイター配列をＩｇＧ ＬＣの下流に挿入した。図２は、発現コンストラクトの概略図を例示している。次いで発現コンストラクトをＡＡＶベクターにライゲーションし、シーケンシングによって試験した。ベクターをウイルス粒子にパッケージングし、保存した。
抗カリクレイン抗体及びそのバリエーションをコードするコドン最適化された核酸配列を含むｒＡＡＶ発現コンストラクト（ｒＡＡＶベクター）を精製する例示的な方法及び設計が本実施例で提供される。この研究では、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ８）を使用した。ｒＡＡＶベクターの基本的設計は、末端逆位反復（ＩＴＲ）：５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲによって挟まれた発現カセットを含む。これらのＩＴＲは、ベクタープロデューサー細胞においてＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ及び関連する因子によってベクターゲノムの複製及びパッケージングを媒介する。典型的には発現カセットは、プロモーター、コード配列、ポリＡテール及び／またはタグを含有する。遺伝子コドンが最適化されたベクター化抗血漿カリクレイン（ＰＫａ）－ＩｇＧ抗体をコードする発現コンストラクトを標準的な分子生物学技術を使用して設計し、調製した。抗ＰＫａ抗体重鎖（ＨＣ）のためのコード配列及び抗ＰＫａ抗体軽鎖（ＬＣ）のためのコード配列を、プロモーターであるニワトリＢ－アクチンプロモーター（ＣＢ）の下流に挿入した。別の例示的な方法及び設計では、プロモーター（＋／－エンハンサー）は、３ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲを含む肝臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、発現カセットにはまた、ＷＰＲＥ要素及びヒト分泌シグナル（ＳＳ）が含まれる。いくつかの実施形態では、発現カセットにはまた、イントロンが含まれる。フーリンで切断可能な部位（Ｆ／２Ａ）をコードするオリゴヌクレオチドを含む短いリンカーをＨＣとＬＣとの間に挿入した。１６８ｂｐのＳＶ４０ ｐｏｌ Ａ配列及びＤＮＡタイター配列をＩｇＧ ＬＣの下流に挿入した。図２は、発現コンストラクトの概略図を例示している。次いで発現コンストラクトをＡＡＶベクターにライゲーションし、シーケンシングによって試験した。ベクターをウイルス粒子にパッケージングし、保存した。
上記スキームの任意の数のバリエーションが実施され得る。代替的コンストラクトは、ＨＣ及びＬＣのためのコード配列を断片抗原結合（Ｆａｂ）のためのコード配列に置き換えることによって；抗ＰＫａコード配列を、Ｆｃ受容体との相互作用を防止するロイシンからアラニンへの変異（ＬＡＬＡ）を有するバリアントに置き換えることによって得られ得る。別の代替的コンストラクトは、抗ＰＫａコード配列を、ＣｐＧジヌクレオチド及びリピート配列を低減し、かつネイティブＡＡＶ８のグアニン－シトシン含有量（ＧＣ含有量）パーセンテージに対して正規化する特定のロイシンからアラニンへの変異である２９３０－ＬＡＬＡを有するバリアントに置き換えることによって得られ得る。また、複数のプロモーターが使用され得、及び／またはＩＲＥＳ配列がＬＣの上流に導入され得る。
さらに、ベクターコンストラクトを、ＣｐＧ含有量及びリピート配列を低減する目的で設計した。ベクターコンストラクトをまた、ネイティブの修飾されていないＡＡＶ８に見られるものに対してＧＣ含有量パーセンテージを正規化するように操作した。設計されたベクターコンストラクトの各々を、ＣｐＧ含有量、コドン適応指標（ＣＡＩ）、コドン状況（ＣＣ）、ＧＣ含有量、及びリピートモチーフについて評価した。これらの研究から得られたデータが以下の表４及び５に示されている。
実施例２．ｒＡＡＶ誘導ＰＯＯＲコドン最適化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性ＩｇＧ抗体の発現
図３は、４８及び７２時間のＰＯＯＲコドン最適化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトを含むプラスミドでのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞培地における活性ＩｇＧレベルの発現を示している。コンストラクトＡ０１０及びＡ０１３は、コンストラクトＢ０２１のものと同じコドン最適化を含む。コンストラクトＢ０２１は、ＧＯベクター化抗ＰＫａ ＩｇＧ＋ＬＡＬＡコンストラクトバリアントである。
図３は、４８及び７２時間のＰＯＯＲコドン最適化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトを含むプラスミドでのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞培地における活性ＩｇＧレベルの発現を示している。コンストラクトＡ０１０及びＡ０１３は、コンストラクトＢ０２１のものと同じコドン最適化を含む。コンストラクトＢ０２１は、ＧＯベクター化抗ＰＫａ ＩｇＧ＋ＬＡＬＡコンストラクトバリアントである。
Ａ０１３コンストラクトでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞は、大きなＣｐＧリピートを有するにもかかわらず高レベルの活性ＩｇＧを発現した。対照的に、低減したＣｐＧリピートを有するＡ０１７コンストラクトは、ＨｅｐＧ２細胞においていかなる活性ＩｇＧレベルも発現しない。ＰＯＯＲコドン最適化コンストラクトのすべての中で、Ａ０１６コンストラクトのみがＨｅｐＧ２細胞において活性ＩｇＧレベルを発現した。しかしながら、Ａ０１６コンストラクトにおける活性ＩｇＧ発現のレベルは、Ａ０１３コンストラクトのものの約１０分の１に過ぎなかった。Ａ０１０コンストラクトは、Ａ０１３コンストラクトのものと同様の活性ＩｇＧを発現した。図３及び表４は、ＣｐＧ量と活性ＩｇＧ発現との間に直接的な相関関係はないことを示している。
実施例３．ｒＡＡＶ誘導ＧＯベクター化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性ＩｇＧ抗体の発現
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＯベクター化コンストラクトの発現を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（１．６ｘ１０６細胞／ウェル；１２ウェルプレート）を、ＧＯベクター化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ）でトランスフェクションした。緑色蛍軽タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドを対照として使用した。７２及び９６時間トランスフェクションした後に培地を採取し、ＭＳＤアッセイを、以下に記載されるように実施して、活性抗ＰＫａ抗体のレベルを決定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＯベクター化コンストラクトの発現を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（１．６ｘ１０６細胞／ウェル；１２ウェルプレート）を、ＧＯベクター化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトをコードするプラスミド（ｐＡＡＶ）でトランスフェクションした。緑色蛍軽タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドを対照として使用した。７２及び９６時間トランスフェクションした後に培地を採取し、ＭＳＤアッセイを、以下に記載されるように実施して、活性抗ＰＫａ抗体のレベルを決定した。
ＭＳＤアッセイのため、ＭＳＤ標準９６ウェルプレートを、ｐＨ９．４の炭酸－重炭酸緩衝液に３０μｌ／ウェルの最終体積まで希釈された４μｇ／ｍｌの血漿カリクレイン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ＃ＨＰＫａ１３０３）でコーティングした。次いでプレートを一晩４℃でインキュベートした。翌日、プレートを３００μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）で５回洗浄し、１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１時間ブロッキングした。抗ＰＫａ－ＬＡＬＡ－ＩｇＧ（＃Ｗ２８５９３、インハウス）のタイトレーションを、１００ｎｇ／ｍｌの最高濃度から開始して２％ＢＳＡ中で調製した。７点の３倍タイトレーションを作製した。８番目の点については、血漿のみを抗ＰＫａ－ＬＡＬＡなし対照として添加した。細胞培養上清を２％ＢＳＡに１：３０で希釈し、続いて１：３で段階希釈した。５回の洗浄後、３０μｌの０．５ｕｇ／ｍｌのスルホタグロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ７０９－００６－１４９）をすべてのウェルに添加した。プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした。最後の洗浄後、１５０μｌの０．５ｘＭＳＤ読み取り緩衝液をウェルに添加し、次いで５分以内にＭＳＤ Ｒｅａｄｅｒで読み取った。
処置群として、Ｂ０１１コンストラクトを除き、図４に示されているようにいくらかのレベルの活性ＩｇＧを発現した。しかしながら、Ｂ０４１、Ｂ０４４、Ｂ０４８、Ｂ０５０、Ｂ０６３、及びＢ０２１（新たなコンストラクト）でトランスフェクションされた細胞は、他のコンストラクトと比較してより高いレベルの活性ＩｇＧを発現した。Ｂ０５０コンストラクトは、最も高い量の活性ＩｇＧレベルを発現した。しかしながら、表５に示されるように、Ｂ０５０コンストラクトはまた、より多い量のＣｐＧ含有量を含有する。ＣｐＧ含有量の多い量は、増加した免疫原性に関連し得る。他のコンストラクトＢ０４１、Ｂ０４４、Ｂ０４８、Ｂ０６３、及びＢ０２１（新）は、活性ＩｇＧのより高い発現を示し、それらはまた、低いＣｐＧ含有量を含有する。Ｂ０１１は、陰性対照プラスミドであり、いかなるタンパク質も発現しない。
実施例４．ｒＡＡＶ誘導ＧＯベクター化抗ＰＫａ２９３０－ＬＡＬＡコンストラクトによるｉｎ ｖｉｖｏでの活性ＩｇＧ抗体の発現
以下に記載される例示的な研究は、抗ＰＫＡ抗体のｒＡＡＶ誘導発現を試験することに仕向けられる。表６に記載されるように（ａ）抗ＰＫａ Ｂ０４１コンストラクト、（ｂ）抗ＰＫａ Ｂ０４８コンストラクト、及び（ｃ）抗ＰＫａ Ｂ０２１を発現するｒＡＡＶベクターをＣ５７Ｂ６マウスに注射した。
以下に記載される例示的な研究は、抗ＰＫＡ抗体のｒＡＡＶ誘導発現を試験することに仕向けられる。表６に記載されるように（ａ）抗ＰＫａ Ｂ０４１コンストラクト、（ｂ）抗ＰＫａ Ｂ０４８コンストラクト、及び（ｃ）抗ＰＫａ Ｂ０２１を発現するｒＡＡＶベクターをＣ５７Ｂ６マウスに注射した。
Ｃ５７Ｂ６マウスにＡＡＶベクターを０日目に注射し（５ｘ１０１１または５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ）、血漿をｒＡＡＶの静脈内注射後１４日目（２週）に採取し、血漿における活性抗ＰＫａ抗体をＭＳＤアッセイによって決定した。簡潔には、ＰＫａタンパク質をＭＳＤプレートにコーティングして、血漿に存在する抗ＰＫａ ｍＡｂを捕捉した。次いで抗ヒトＩｇＧ検出抗体を使用して、血漿における発現した活性ＩｇＧを定量した。
ｒＡＡＶ８－ＰＫａ－Ｂ０４１コンストラクトが５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量で注射されたマウスは、図５に示されているように高レベルの活性ＩｇＧを発現した。５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶ８－ＰＫａ－Ｂ０２１コンストラクトで同様の結果が得られたが、活性ＩｇＧ発現のレベルは、ｒＡＡＶ８－ＰＫａ－Ｂ０４１コンストラクトのものと比較して再現性が低かった。
実施例５：ｒＡＡＶ８で処置されたマウス血漿において生成された抗ＰＫａ抗体のｅｘ ｖｉｖｏ効力の評価
この研究は、ｒＡＡＶ８コンストラクトの静脈内投与から２８日後に採取されたｒＡＡＶ８で処置されたマウスの血漿サンプルにおいて生成された抗ＰＫａ抗体のｅｘ ｖｉｖｏ生物活性を示す。この研究では、外因性阻害剤であるＴａｋｈｚｙｒｏ（商標）の段階的な増加（タイトレーション）の存在下でエラグ酸の添加によって対照未処置マウス血漿サンプルにおいてカリクレイン－キニン経路を活性化した。Ｔａｋｈｚｙｒｏ（商標）（ラナデルマブ－フリオ）は、１２歳以上の患者における遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）発作のためのＦＤＡで承認された完全ヒトモノクローナル抗体薬である。血漿におけるＰＫａ活性は、ＰＫａ特異的蛍光性基質（ＰＦＲ－ＡＭＣ）の添加及びその後の経時的に行われる蛍光測定を介してモニタリングされる。ｒＡＡＶ８で処置されたマウス血漿サンプルにおいて生成された抗ＰＫａ抗体の生物活性を試験するために、カリクレイン－キニン経路を、これらのマウスからの血漿へのエラグ酸の添加によって同様に活性化し、ＰＫａ活性を測定した。具体的には、個々のｒＡＡＶ８で処置されたマウスにおける投薬後血漿を、用量反応を測定するためにエラグ酸及びＰＦＲ－ＡＭＣの添加前に同じマウスからの投薬前血漿サンプルに順次希釈した。
この研究は、ｒＡＡＶ８コンストラクトの静脈内投与から２８日後に採取されたｒＡＡＶ８で処置されたマウスの血漿サンプルにおいて生成された抗ＰＫａ抗体のｅｘ ｖｉｖｏ生物活性を示す。この研究では、外因性阻害剤であるＴａｋｈｚｙｒｏ（商標）の段階的な増加（タイトレーション）の存在下でエラグ酸の添加によって対照未処置マウス血漿サンプルにおいてカリクレイン－キニン経路を活性化した。Ｔａｋｈｚｙｒｏ（商標）（ラナデルマブ－フリオ）は、１２歳以上の患者における遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）発作のためのＦＤＡで承認された完全ヒトモノクローナル抗体薬である。血漿におけるＰＫａ活性は、ＰＫａ特異的蛍光性基質（ＰＦＲ－ＡＭＣ）の添加及びその後の経時的に行われる蛍光測定を介してモニタリングされる。ｒＡＡＶ８で処置されたマウス血漿サンプルにおいて生成された抗ＰＫａ抗体の生物活性を試験するために、カリクレイン－キニン経路を、これらのマウスからの血漿へのエラグ酸の添加によって同様に活性化し、ＰＫａ活性を測定した。具体的には、個々のｒＡＡＶ８で処置されたマウスにおける投薬後血漿を、用量反応を測定するためにエラグ酸及びＰＦＲ－ＡＭＣの添加前に同じマウスからの投薬前血漿サンプルに順次希釈した。
これらの希釈系統からの抗ＰＫａ抗体濃度に応じた血漿カリクレイン活性の阻害率の観点から生物活性を測定し、その場合、より高い抗体レベルは、より低い％ＰＫａ活性をもたらす。図６～７は、この研究の結果を示している。図６～７は、ｒＡＡＶ８ Ｂ０４１及びｒＡＡＶ８ Ｂ０４８コンストラクトのそれぞれの静脈内投与から１４日後に採取されたｒＡＡＶ８で処置されたマウス血漿サンプルにおいて生成された抗ＰＫａ抗体のｅｘ ｖｉｖｏ生物活性を示している。個々のマウスからの１４日目の血漿サンプルを、同様のレベルのカリクレイン－キニン経路成分を維持するが、抗ＰＫａ ｍＡｂ導入遺伝子タンパク質を希釈除去するために同じマウスの０日目の血漿にタイトレーションした。結果は、ｒＡＡＶ８で処置されたマウスにおいて生成された抗ＰＫａ抗体の用量反応が、ＦＤＡで承認された薬物であるＴａｋｈｚｙｒｏ（商標）の用量反応と同一であることを実証している。これは、ｒＡＡＶ８で処置されたマウスの血漿において生成された抗ＰＫａ抗体が、Ｔａｋｈｚｙｒｏ（商標）薬物製品と区別することができない極めて高い全体性を有することを実証している。
均等物及び範囲
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
Claims (75)
- コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、前記ｒＡＡＶベクターは、抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を含む全長抗体をコードし、前記コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超える同一性を有する、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
- 前記コドン最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号２３～３６のいずれか１つから選択される、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５０個未満のＣｐＧ部位、約４０個未満のＣｐＧ部位、約３５個未満のＣｐＧ部位、約３０個未満のＣｐＧ部位、約２５個未満のＣｐＧ部位、約２０個未満のＣｐＧ部位、約１５個未満のＣｐＧ部位または約１０個未満のＣｐＧ部位のＣｐＧ含有量を有する、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記コドン最適化されたヌクレオチド配列は、約５個のＣｐＧ部位を有する、請求項２に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記コドン最適化されたヌクレオチド配列は、リンカーを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記リンカーは、切断可能なリンカーを含む、請求項５に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記リンカーは、切断可能ではないリンカーを含む、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、単一のプロモーターによって制御される、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別々のプロモーターによって制御される、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。前記単一のプロモーターまたは前記別々のプロモーターは、ユビキタスプロモーター、組織特異的プロモーター、または制御可能なプロモーターから選択される、請求項５または６に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記組織特異的プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである、請求項９に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、修飾されたｈＴＴＲ（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）、α－アンチトリプシンプロモーター、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）、ＴＲＭプロモーター、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝臓転写因子反応性オリゴマー、ＬＳＰ、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター（１．１ｋｂ）、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｍＴＴＲ、修飾されたｍＴＴＲ、ｍＴＴＲ ｐｒｏ、ｍＴＴＲエンハンサー、または塩基性アルブミンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）である、請求項１１に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記制御可能なプロモーターは、誘導性または抑制可能なプロモーターである、請求項９に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ベクターは、以下のうちの１つ以上：５’及び３’末端逆位反復、その配列の上流のイントロン、及びシス作用性制御性モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ベクターは、ＷＰＲＥ配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＷＰＲＥ配列は、修飾されている、請求項１５に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＷＰＲＥは、ｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧ修飾を含有する、請求項１６に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＣＲＭは、肝臓特異的ＣＲＭである、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＣＲＭは、ＣＲＭ８である、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ベクターは、少なくとも３つのＣＲＭを含む、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ベクターは、３つのＣＲＭ８を含む、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ｒＡＡＶベクターは、ＩＲＥＳ配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖及び／または重鎖は、半減期を延ばす及び／または前記抗体のエフェクター機能を低減する１つ以上の変異を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記１つ以上の変異は、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）及び／またはＮＨａｎｃｅ変異（Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）を含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記１つ以上の変異は、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）を含む、請求項２３または２４に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶｒｈ．１０から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８である、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ｒＡＡＶベクターは、天然に存在するＡＡＶ８とほぼ同じＣＣ含有量を有するように操作されたＧＣ含有量を有する、請求項２７に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ｒＡＡＶベクターカプシドは、操作されている、請求項２６または２７に記載のｒＡＡＶ。
- 前記操作されたｒＡＡＶベクターは、修飾されたアミノ酸配列を有するＡＡＶカプシド配列を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶ。
- 前記修飾されたアミノ酸配列は、アミノ酸配列の挿入、欠失または置換を含む、請求項３０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ｒＡＡＶカプシドは、天然に由来する、請求項２６に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ｒＡＡＶベクターカプシドは、ＡＡＶ８である、請求項２８に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記切断可能な配列は、フーリンで切断可能な配列である、請求項６に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記フーリンで切断可能な配列の後にリンカー及び２Ａ配列が続く、請求項３４に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記リンカーは、ＧＳＧリンカーである、請求項３５に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記２Ａ配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ配列である、請求項３５または３６に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記２Ａ配列は、Ｐ２Ａ配列である、請求項３７に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ベクターは、分泌シグナルをさらにコードする、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記分泌シグナルは、天然に存在するシグナルペプチドである、請求項３９に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記分泌シグナルは、人工シグナルペプチドである、請求項３９に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、血漿カリクレインに結合することが可能な機能的抗血漿カリクレイン抗体を生成する、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体は、血漿カリクレインのタンパク質分解活性を阻害する、請求項４２に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体は、血漿カリクレイン活性部位に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記結合は、血漿カリクレインの活性部位を閉塞する、請求項４２～４４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記結合は、血漿カリクレインの活性を阻害する、請求項４２～４５のうちの１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記抗体は、プレカリクレインに結合しない、請求項４２～４６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、同じベクターから発現する、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別個のｒＡＡＶベクターから発現する、請求項１～４７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び前記抗血漿カリクレイン抗体軽鎖は、別々のｒＡＡＶベクターから発現する、請求項１～４７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ベクターは、５’及び３’末端逆位反復（ＩＴＲ）、１つ以上のエンハンサー要素、及び／またはポリ（Ａ）テールをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記１つ以上のエンハンサー要素は、転写因子結合部位のクラスター及び／またはＷＰＲＥ配列から選択される、請求項５１に記載のｒＡＡＶベクター。
- ＡＡＶ８カプシド及び配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超える同一性を有するコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターは、
ａ．５’末端逆位反復（ＩＴＲ）；
ｂ．シス作用性制御性モジュール（ＣＲＭ）；
ｃ．肝臓特異的プロモーター；
ｅ．コドン最適化された抗血漿カリクレイン抗体重鎖配列及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖配列；
ｆ．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）；及び
ｇ．３’ＩＴＲ
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。 - 前記肝臓特異的プロモーターは、ヒトトランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）、修飾されたｈＴＴＲ（ｈＴＴＲ ｍｏｄ．）、α－アンチトリプシンプロモーター、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）、ＴＲＭプロモーター、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝臓転写因子反応性オリゴマー、ＬＳＰ、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーター（１．１ｋｂ）、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｍＴＴＲ、修飾されたｍＴＴＲ、ｍＴＴＲ ｐｒｏ、ｍＴＴＲエンハンサー、または塩基性アルブミンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項５３に記載の組換えベクター。
- 前記肝臓特異的プロモーターは、前記ヒトトランスチレチンプロモーターを含む、請求項５４に記載の組換えベクター。
- 前記ＣＲＭは、肝臓特異的ＣＲＭである、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターは、少なくとも３つのＣＲＭを含む、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターは、３つのＣＲＭ８を含む、請求項５３～５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＷＰＲＥ配列は、修飾されている、請求項５３～５８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 前記ＷＰＲＥ配列は、ＷＰＲＥ ｍｕｔ６ｄｅｌＡＴｇである、請求項５３～５９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
- 活性化カリクレイン－キニン経路の欠損症または制御不全に関連する疾患または障害の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、先行請求項のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を投与することを含む、前記方法。
- 前記活性化カリクレイン－キニン経路の欠損症または制御不全は、Ｃ１エステラーゼ阻害因子の欠損症に関連する疾患または障害である、請求項６１に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶベクターは、静脈内、皮下、または経皮投与によって投与される、請求項６１～６２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記経皮投与は、遺伝子銃による、請求項６３に記載の方法。
- 活性化カリクレイン－キニン経路の欠損症もしくは制御不全またはＣ１エステラーゼ阻害因子の欠損症に関連する前記障害は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、後天性血管性浮腫（ＡＡＥ）、正常なＣ１阻害因子を有する血管性浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、片頭痛、腫瘍、神経変性疾患、関節リウマチ、痛風、腸疾患、口腔粘膜炎、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、脊柱狭窄－変性脊椎疾患、動脈もしくは静脈血栓症、術後イレウス、大動脈瘤、変形性関節症、血管炎、浮腫、脳浮腫、肺塞栓症、脳卒中、心室補助デバイスもしくはステントによって誘発された血栓形成、頭部外傷もしくは腫瘍周囲脳浮腫、敗血症、急性中大脳動脈動脈（ＭＣＡ）虚血性事象、再狭窄、全身性エリテマトーデス腎炎／血管炎、または熱傷である、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記Ｃ１エステラーゼ阻害因子の欠損症に関連する障害は、ＨＡＥである、請求項６５に記載の方法。
- 前記ＨＡＥは、Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型である、請求項６６に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶベクターは、投与後にエピソーマルである、請求項６１～６７のいずれか１項に記載の方法。
- 投与後に、前記抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び軽鎖は、機能的抗体へと構築する、請求項６１～６８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記抗体は、ＩｇＧである、請求項６９に記載の方法。
- 前記機能的抗血漿カリクレイン抗体は、前記ｒＡＡＶベクターの投与から約２～６週後に前記対象の血漿において検出可能である、請求項６１～７０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記機能的抗血漿カリクレイン抗体は、前記ｒＡＡＶベクターの投与から約４週後に前記対象の血漿において検出可能である、請求項７１に記載の方法。
- 抗血漿カリクレイン抗体重鎖及び抗血漿カリクレイン抗体軽鎖を含む全長抗体をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含むＤＮＡ発現カセットであって、前記ＤＮＡ発現カセットは、配列番号２３～３６のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超える同一性を有する配列を含む、前記ＤＮＡ発現カセット。
- 請求項７３に記載のＤＮＡ発現カセットを含む送達ビヒクル。
- ウイルスベクター、脂質ナノ粒子または細胞外ベシクルから選択される、請求項７４に記載の送達ビヒクル。
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