CN108291238A - 嵌合转录后调控元件 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及嵌合转录后调控元件（PRE）和可用于在细胞内表达蛋白的载体。所述PRE含有选自不同的天然PRE序列的α、β和任选的γ子元件，并且被发现比它们的天然对应物更有效。

Description

嵌合转录后调控元件
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月27日提交的美国临时申请序列号62/246,841根据35U.S.C.§119(e)的利益，其全文以引用的方式合并入本文中。
背景技术
基因序列的转录(即mRNA的生成)在许多不同的水平受到控制。转录起始位点或启动子具有不同的强度，并且给定基因的转录起始频率也可以通过增强子序列增加。转录过程中的暂停可以影响转录速率，从而影响在给定时间段内产生的转录物的量。前体mRNA剪接、聚腺苷酸化和切割的速率也可以影响由转录单位产生的mRNA的水平。此外，mRNA分子内的序列可以调节其从细胞核到细胞质的转运、以及其转换率(即其细胞质稳定性)。
已经鉴定了调节mRNA的细胞质积累和稳定性的mRNA分子内的某些序列，并将其表示为转录后调控(post-transcriptional regulatory，PRE)元件。已经在人类乙型肝炎病毒(HPRE)的基因组中和在土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的基因组中鉴定出PRE序列。参见例如Donello et al.(1998)J.Virology 72:5085-5092。
体外的多肽(例如治疗性抗体、生长因子)的表达对于制药工业而言是重要的，并且使蛋白表达最大化的方法是有需要的。
概述
本发明提供了嵌合(chimeric)PRE序列，其可用于生成具有改善的稳定性和表达效率的表达构建体。在一个实施方式中，本发明提供了一种多核苷酸，其包括：(a)第一片段，其由SEQ ID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性(sequenceidentity)的核酸序列组成，以及(b)第二片段，其由SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ IDNO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成。
在一些方面，所述第一片段距离所述第二片段不超过20个核苷酸。在一些方面，所述第一片段距离所述第二片段不超过15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。
在一些方面，所述多核苷酸进一步包括第三片段，其由转录后调控元件(PRE)的γ子元件组成。在一些方面，所述γ子元件具有SEQ ID NO:7、12、16或20的核酸序列或与SEQID NO:7、12、16或20具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述γ子元件具有SEQ ID NO:7的核酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述γ子元件具有SEQ ID NO:16的核酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的核酸序列。
在一些方面，所述第一片段位于所述第三片段和所述第二片段之间。在一些方面，所述第三片段距离所述第一片段不超过20个核苷酸、或替代地距离所述第一片段不超过15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。
在一些方面，所述多核苷酸依次包括SEQ ID NO:7、14和3。在一些方面，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:26的核酸序列。在一些方面，所述多核苷酸包括SEQ ID NO:25的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种多核苷酸，其包括：(a)第一片段，其由SEQ ID NO:7的核酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由转录后调控元件(PRE)的α子元件组成，以及(c)第三片段，其由SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成。
在一些方面，所述α子元件具有SEQ ID NO:2、5、9、14或18的核酸序列或与SEQ IDNO:2、5、9、14或18具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述α子元件具有SEQID NO:2的核酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些方面，所述第二片段位于所述第一片段和所述第三片段之间，并且每个片段都距离相邻的片段不超过20个核苷酸、或替代地距离相邻的片段不超过15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种多核苷酸，其包括：(a)第一片段，其由SEQ ID NO:5、9或18的核酸序列或与SEQ ID NO:5、9或18具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(b)第二片段，其由SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成。在一些方面，所述多核苷酸进一步包括：(c)第三片段，其由转录后调控元件(PRE)的γ子元件组成。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种多核苷酸构建体，其包括本发明的多核苷酸以及编码蛋白的序列。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种多核苷酸构建体，其包括：(a)第一片段，其由SEQ ID NO:14的核酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(c)编码蛋白的序列。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种多核苷酸构建体，其包括：(a)第一片段，其由SEQ ID NO:7的核酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由转录后调控元件(PRE)的α子元件组成，(c)第三片段，其由SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(d)编码蛋白的序列。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种多核苷酸构建体，其包括：(a)第一片段，其由SEQ ID NO:5、9或18的核酸序列或与SEQ ID NO:5、9或18具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，(b)第二片段，其由SEQ ID NO:3的核酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸序列组成，以及(c)编码蛋白的序列。
在这些实施方式的任一个的一个方面，所述编码蛋白的序列位于所述第一片段和所述第二片段之间。在一个方面，所述构建体进一步包括3’-UTR。在一个方面，所述3’-UTR位于所述第一片段和所述第二片段之间。在一个方面，所述构建体进一步包括poly(A)序列。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种细胞，其包括本发明的多核苷酸构建体。
附图说明
图1示出了各种α子元件的多重对齐(multi-alignment)。
图2示出了各种β子元件的多重对齐。
图3示出了各种γ子元件的多重对齐。
图4示出了用于测试PRE元件的质粒(pCT2.1)的示意图。不同的PRE被克隆进在编码利妥昔单抗(Rituximab)轻链的序列和BGH聚腺苷酸化信号之间的BamHI位点。
图5示出了在几个PRE构建体的两个测定(第2天和第4天)中的滴度(titer)(μg/ml)。
图6示出了多个PRE构建体的相对表达倍数变化(柱：测试1、测试2、平均值)。
图7A和7B示出了所示的多个PRE构建体的相对表达倍数变化。
图8A和8B比较了在第2天(A)和第4天(B)构建体pCT 2.52相对于WPRE(pCT 2.0)和对照pCT2.1的强度。
图9A和9B示出了每个所示的构建体的相对瞬时表达倍数变化。
详细描述
I.定义
所有的数字标示(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度和分子质量，都是近似值，其通过0.1的增量变化(+)或(-)。应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但术语“约”位于所有的数字标示之前。还应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物是本领域已知的。
如说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文中明确地规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“所述”包含复数形式。例如术语“一种/一个多核苷酸”包括多种多核苷酸，包括其混合物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸还是其类似物。多核苷酸可以包括被修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可以在组装多核苷酸之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。在聚合之后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分偶联。该术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施方式包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
II.嵌合转录后调控元件(PRE)
DNA病毒的嗜肝DNA病毒家族，例如人类乙型肝炎病毒(HBV)，含有RNA输出元件，其被称为转录后调控元件(PRE)，其有助于从无内含子肝炎病毒基因组中积聚表面抗原转录物到细胞质中。在土拨鼠肝炎病毒(WHV)中出现类似的、更有效的三联PRE，称为WHV PRE或WPRE。同样地，人类乙型肝炎病毒PRE被称为HPRE。WPRE增加来自多种病毒载体的转基因表达。通常，PRE序列可用于增强瞬时基因表达。
一些PRE序列(例如HPRE)包含两个单独的和被连接的子元件，α子元件(PREα)和β子元件(PREβ；因此被称为“二联(bipartite)”)，而其他PRE序列(例如WPRE)包含另外的子元件，γ子元件(PREγ；因此被称为“三联(tripartite)”)。这些子元件中的每一个在物种间都很保守。参见在图1-3中的多重序列对齐。
PRE序列如何影响基因表达的机制尚不完全清楚。Donello等人解释道“HPREα和HPREβ的顺序可以被切换，这表明子元件是模块化的，并且因此子元件很可能代表细胞RNA结合蛋白的不同结合位点”(Donello et al.,J Virol.1998 Jun；72(6):5085–5092 at5085)。Donello进一步发现，“三联WPRE显示出比二联HBVPRE显著更强的活性，这证明了转录后效应的强度是由RNA中子元件的数量决定的。”(出处同上)。因此，该研究表明，子元件的数量，而不是任何单个子元件的有效性，是决定PRE序列强度的主要因素。
但是，令人惊讶和意外的是，本发明的实验显示，每个个体的强度在确定PRE序列的整体强度方面起着重要作用。进一步地，子元件的某些特定组合可以比其他更有效。相应地，提供了具有来自不同PRE序列的子元件的某些组合的嵌合PRE，其在提高包含这些组合的构建体的稳定性和/或表达水平方面具有令人惊讶的高活性。
除WPRE和HPRE之外，还从蝙蝠(BPRE)、地松鼠(ground squirrel)(GSPRE)、北极松鼠(arctic squirrel)(ASPRE)、鸭(DPRE)、黑猩猩(chimpanzee)(CPRE)和绒毛猴(woolymonkey)(WMPRE)中发现了其他PRE序列。PRE序列通常高度保守(见表1)。
表1.WPRE的序列同一性
PRE的来源 序列同一性
地松鼠 84％
北极松鼠 82％
蝙蝠 74％
人类 69％
绒毛猴 69％
黑猩猩 67％
鸭 无显著相似性
下面的表2总结了不同的PRE序列(包括天然PRE序列和嵌合PRE序列)的相对活性。
表2.PRE序列的相对活性
从表2可以看出，来自GSPRE的α子元件、来自HPRE的β子元件和来自WPRE的γ子元件是它们的类型中较活跃的子元件。进一步地，以下组合表现出极好的活性：(1)GSPRE的α子元件和来自HPRE的β子元件，任选地与γ子元件一起，(2)来自WPRE的γ子元件和来自HPRE的β子元件，以及(3)WPRE、BPRE或ASPRE的α子元件和来自HPRE的β子元件，任选地与γ子元件一起。
因此，根据本发明的一个实施方式，提供了一种嵌合PRE，其包括GSPRE的α子元件(GSPREα)和来自HPRE的β子元件(HPREβ)，任选地具有γ子元件，其中的每一个都可以被替换为其生物等价物。
如本文所用，参考多核苷酸的“生物等价物(biological equivalent)”是指与该参考多核苷酸具有特定的序列同一性的核酸序列、或者从该参考多核苷酸通过有限的核苷酸添加、删除和/或取代而进行修饰的核酸序列。在一个实施方式中，所述特定的序列同一性是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％。在一个实施方式中，所述生物等效物是从参考多核苷酸通过不多于一、二、三、四、或五个核苷酸添加、删除、取代或它们的组合而进行修饰的。
该组合的任选的γ子元件可以是来自任何PRE或其生物等价物的任何γ子元件。在一个方面，所述γ子元件来自WPRE、GSPRE、BPRE或ASPRE。在一个方面，所述γ子元件来自WPRE或GSPRE。在一个方面，所述γ子元件是WPREγ。
在另一个实施方式中，嵌合PRE包含来自WPRE的γ子元件(WPREγ)、来自任何PRE的α子元件、以及来自HPRE的β子元件(HPREβ)，其中的每一个都可以被其生物等价物取代。在一些方面，所述α子元件来自GSPRE、HPRE、WPRE、BPRE或ASPRE，或者是这样的α子元件的生物等价物。
在另一个实施方式中，嵌合PRE包含WPRE、BPRE或ASPRE的α子元件以及HPRE的β子元件(HPREβ)，任选地具有γ子元件。在一个方面，所述α子元件来自WPRE。在一个方面，所述α子元件来自BPRE。在一个方面，所述α子元件来自ASPRE。在一个方面，所述γ子元件来自WPRE。在一个方面，所述γ子元件来自GSPRE。
当嵌合PRE只具有α子元件和β子元件时，在一些方面，所述α子元件与所述β子元件具有相同的取向并位于其下游。在一些方面，所述α子元件与所述β子元件具有相同的取向并位于其上游。在一些方面，所述α子元件与所述β子元件具有相反的取向并位于其上游。在一些方面，所述α子元件与所述β子元件具有相反的取向并位于其下游。
当嵌合PRE具有全部三个子元件时，在一些方面，全部三个子元件具有相同的取向。在一个方面，子元件从上游到下游的顺序是γ-α-β、γ-β-α、α-β-γ、β-α-γ、α-γ-β、或β-γ-α。在一个方面中，在上述顺序的任何一个中，只有α子元件具有相反的取向。在一个方面，在上述顺序的任何一个中，只有β子元件具有相反的取向。在一个方面，在上述顺序的任何一个中，只有γ子元件具有相反的取向。
在上述实施方式的任何一个中，可以任选地存在其他α子元件、β子元件和/或γ子元件，其可以被置于其自身类型的子元件附近或者被不同类型的子元件分开。
在一些方面，可以在两个相邻的子元件之间插入不同的转录调控元件。例如，5’-UTR或3’-UTR可以被插入在α子元件和β子元件之间、或者γ子元件和α子元件之间。
可以调整在上述配置的每一个中在每个子元件之间或在子元件与相邻的UTR之间的距离。在一个方面，在任何相邻的子元件之间的距离不超过50个核苷酸。在一个方面，在任何相邻的子元件之间的距离不超过40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。在一个方面，在任何相邻的子元件之间的距离至少为1、2、3、4、5或10个核苷酸。
进一步考虑的是，本发明的嵌合PRE的子元件中的每一个不必彼此相邻，而是可以置于表达构建体的其他元件附近。例如，α子元件和β子元件可以位于感兴趣的基因或3’-UTR的侧翼。在一个方面，α子元件位于启动子和感兴趣的基因之间，并且β子元件位于感兴趣的基因和3’-UTR之间或3’-UTR之后。在另一个方面，β子元件位于启动子和感兴趣的基因之间，并且α子元件位于感兴趣的基因和3’-UTR之间或3’-UTR之后。在一个方面，α子元件和β子元件都位于启动子和感兴趣的基因之间或感兴趣的基因和3’-UTR之间。当使用了γ子元件时，可将其置于上述位置中的任一个，可以是启动子之前、启动子和感兴趣的基因之间、感兴趣的基因和3’-UTR、或3’-UTR之后。
下面的表3中提供了HPRE、WPRE、GSPRE、BPRE和ASPRE的序列以及它们各自具有修改版本的子元件。通常，α子元件的核苷酸加下划线，β子元件的核苷酸为粗体，γ子元件的核苷酸为斜体。
表3.天然HPRE、WPRE、GSPRE、BPRE、和ASPRE以及各个天然的或经修饰的子元件的序列
上表中序列的SEQ ID NO总结在下面的表4中。
表4.SEQ ID NO的总结
PRE 全部 γ α β
HPRE 1 - 2 3
WPRE 4 7 5 6
BPRE 8 12 9 11
GSPRE 13 16 14 15
ASPRE 17 20 18 19
下面的表5中提供了一些经测试的嵌合PRE序列的序列。
表5.嵌合PRE的序列
下面的表6显示了一些其他的PRE序列及其子元件的序列，其可被用于生成本发明的嵌合PRE。
表6.其他的天然PRE的序列
III.多核苷酸构建体/载体
还提供了包含本发明的任何嵌合PRE的多核苷酸构建体(或载体)。所述载体可用于在真核细胞(例如哺乳动物细胞)中表达重组多肽。所述载体可以含有编码一种或多种感兴趣的基因(GOI)的序列。对于本公开的目的，感兴趣的基因也被称为转基因。
转录和转录后调节序列和任选的翻译调节序列可以与载体中感兴趣的基因相关联(即可操作地连接)。转录调节序列包括例如启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。转录后调节序列包括例如内含子和PRE。翻译调节序列包括例如核糖体结合位点(例如Kozak序列)。
在某些实施方式中，在载体中存在多克隆位点(MCS)(也被称为“多接头”)，以便于插入异源序列。例如，可以将MCS置于启动子和聚腺苷酸化信号之间，以促进转基因序列的插入。在含有转基因序列的载体中，含有启动子、转基因序列、聚腺苷酸化信号的载体的部分被称为“表达盒(expression cassette)”。
在真核细胞中有活性的启动子是本领域已知的。示例性的真核启动子包括例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒主要立即早期(MIE)启动子、EF1-α(翻译延长因子-1α子单元)启动子、Ubc(泛素C)启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子、肌动蛋白启动子等。还可参见Boshart et al.,GenBank Accession No.K03104；Uetsuki et al.(1989)J.Biol.Chem.264:5791-5798；Schorpp et al.(1996)Nucleic Acids Res.24:1787-1788；Hamaguchi et al.(2000)J.Virology 74:10778-10784；Dreos et al.(2013)Nucleic Acids Res.41(D1):D157-D164以及http://epd.vital-it.ch(在2014年7月16日登入)的真核生物启动子数据库。
载体上还可以包含增强子。非限制性的例子包括在CMV启动子和内含子A序列中的增强子。先前显示五种胚胎干细胞(ESC)转录因子占据了超增强子(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和Esrrb)，并且还有许多额外的转录因子有助于ESC的控制。另外六种转录因子(Nr5a2、Prdm14、Tcfcp2l1、Smad3、Stat3和Tcf3)占据了典型的增强子和超级增强子，并且所有这些都富含超级增强子。这些中的任一种或本领域中进一步已知的都可以在本发明中使用。
在真核细胞中有活性的聚腺苷酸化信号是本领域已知的，包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号指导前体mRNA的3'末端切割、在切割位点处前体mRNA的聚腺苷酸化、和聚腺苷酸化信号下游的转录终止。核心序列AAUAAA通常存在于聚腺苷酸化信号中。还可参见Cole et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5:2104-2113。
可以被用在本发明的载体中的示例性的内含子包括人类/小鼠/大鼠/其他物种巨细胞病毒主要立即早期(MIE)基因的β-珠蛋白(globin)内含子和第一内含子(也称为“内含子A”)。
可以被包括在本发明的载体中的其它转录后调控元件包括但不限于CMV MIE的5'-非翻译区、人Hsp70基因、来自血管内皮生长因子(VEGF)基因的SP163序列、和与腺病毒晚期mRNA相关的三联前导序列。参见例如Mariati et al.(2010)Protein Expression andPurification 69:9-15。
在进一步的实施方式中，本文公开的载体含有基质附着区(matrix attachmentregion，MAR)，也被称为支架附着区(scaffold attachment region，SAR)。MAR(打开染色质或)和SAR序列尤其作用来使相邻序列的染色质结构绝缘(绝缘体或)。因此，在其中异源序列经常被染色体地整合的稳定转化的细胞中，MAR或SAR序列可以阻止已经整合到具有抑制性染色质结构(例如异染色质)的细胞基因组区域的转基因的转录的抑制。相应地，在载体中包含一个或多个MAR或SAR序列可以促进来自载体的转基因在稳定转化的细胞中表达。
示例性的MAR和SAR元件包括来自干扰素β基因、鸡溶菌酶基因、干扰素α-2基因、X29基因MAR和S4MAR的元件。MAR或SAR序列可以位于载体内的任何位置。在某些实施方式中，MAR和/或SAR元件位于感兴趣的基因的上游(在转录意义上)的表达盒内。
在某些实施方式中，本文公开的载体含有编码在真核细胞中起作用的选择标记物(即真核生物选择标记)的核苷酸序列，使得当施加适当的选择时，不含该选择标记物的细胞死亡或者比含有该选择标记的细胞明显慢得多地生长。在真核细胞中起作用的示例性的选择标记物是谷氨酰胺合成酶(GS)基因；通过在缺乏谷氨酰胺的培养基中培养细胞、或者用L-蛋氨酸亚砜亚胺(L-Methioniene Sulfoximine)进行选择、或同时使用上述两者来施加选择。在真核细胞中起作用的另一个示例性的选择标记物是编码对新霉素(neo)的抗性的基因；通过在含有新霉素、遗传霉素或G418的培养基中培养细胞而施加选择。其他选择标记物包括二氢叶酸还原酶(DHFR，赋予对氨甲喋呤的抗性)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(提供对嘌呤霉素的抗性)和潮霉素激酶(提供对潮霉素B的抗性)。在真核细胞中起作用的其他选择标记物是在本领域已知的。
编码上述选择标记物的序列被可操作地连接至启动子和聚腺苷酸化信号。如上所述，在真核细胞中起作用的启动子和聚腺苷酸化信号是在本领域已知的。
在某些实施方式中，本文公开的载体可以含有两个或更多个表达盒。例如，含有两个表达盒(其中一个编码抗体重链，另一个编码抗体轻链)的载体可以被用于产生功能性抗体分子。
本文公开的载体还含有在原核细胞中起作用的复制起点(即原核复制起点)。在原核细胞中起作用的复制起点在本领域中是已知的，并且包括但不限于大肠杆菌的oriC起点；质粒起点，例如pSC101起点、pBR322起点(rep)和pUC起点；以及病毒(即噬菌体)复制起点。用于鉴定原核复制起点的方法被提供在例如Sernova&Gelfand(2008)Brief.Bioinformatics 9(5):376-391。
本文公开的载体还含有在原核细胞中起作用的选择标记物(即原核选择标记物)。在原核细胞中起作用的选择标记物是在本领域中已知的，并且包括例如编码赋予对氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素中的任何一种的抗性的多肽的序列。赋予对氨苄青霉素(和其他β-内酰胺抗生素)的抗性的多肽的例子是β-内酰胺酶(bla)酶。卡那霉素抗性可以由新霉素磷酸转移酶基因的活性产生；而氯霉素抗性是由氯霉素乙酰转移酶介导的。
示例性的转基因包括任何重组蛋白或例如激素(例如生长激素)、促红细胞生成素、抗体、多克隆、单克隆抗体(例如利妥昔单抗)、抗体缀合物、融合蛋白(例如IgG-融合蛋白)、白细胞介素、CD蛋白、MHC蛋白、酶和凝血因子。抗体重链和抗体轻链可以由单独的载体或由含有两个表达盒的相同载体表达。
在一个实施方式中，除了本发明的PRE序列之外，本发明的多核苷酸或载体包括以下元件中的一个、或多个或全部：(a)下游UTR(RC-dUTR)下游序列的反向互补序列(例如来自病毒序列)，(b)启动子(例如病毒启动子)，(c)非翻译区(UTR)上游序列(例如来自病毒序列)，(d)内含子A(例如EFIα内含子、或来自病毒序列)，以及(e)UTR下游序列(例如病毒3’-UTR)。
在一个实施方式中，除了本发明的PRE序列之外，本发明的多核苷酸或载体包括这样的元件中的至少两个，例如(b)和(c)、(b)和(d)、(b)和(e)、(a)和(b)、(c)和(d)、(c)和(e)、或(d)和(e)。
在一个实施方式中，除了本发明的PRE序列之外，本发明的多核苷酸或载体包括这样的元件中的至少三个，例如(b)、(c)和(d)；(b)、(c)和(e)；(b)、(d)和(e)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(b)和(e)；(a)、(c)和(e)；(a)、(c)和(d)；以及(a)、(d)和(e)。
在一个实施方式中，除了本发明的PRE序列之外，本发明的多核苷酸或载体包括这样的元件中的至少四个，例如(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(d)和(e)；(a)、(c)、(d)和(e)；以及(b)、(c)、(d)和(e)。
在上述实施方式中的任一个中，可以任选地包括聚腺苷酸化信号。
PRE序列可以被置于载体中的任何位置，但是优选与感兴趣的基因处于相同的取向。在一个方面，PRE序列位于感兴趣的基因的上游。在另一方面，PRE序列位于感兴趣的基因的下游。在一个方面，PRE序列位于感兴趣的基因和聚腺苷酸化信号之间。在另一方面，PRE序列位于聚腺苷酸化信号的下游。在一个方面，PRE序列位于感兴趣的基因和3’-UTR之间。在另一方面，PRE序列位于3’-UTR的下游。
IV.细胞和细胞培养
本发明提供了用于在细胞中表达重组多肽的方法。所述方法包括将如本文所述的载体导入细胞中，并在其中载体被瞬时地或稳定地保持在细胞中的条件下培养细胞。细胞可以是原核或真核的，例如通过与CRISP/Cas9的靶向整合而产生的稳定细胞系。可以被用于表达重组多肽的经培养的真核细胞是在本领域中已知的。这样的细胞包括真菌细胞(例如酵母)、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。相应地，本发明提供了包含如本文所述的载体的细胞。
示例性的酵母细胞包括但不限于木霉属菌种(Trichoderma sp.)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombae)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。示例性的昆虫细胞系包括但不限于Sf9、Sf21和果蝇(Drosophila)S2细胞。示例性的植物细胞包括但不限于拟南芥(Arabidopsis)细胞和烟草BY2细胞。
可用于表达重组多肽的经培养的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞、病毒转化的HEK细胞(例如HEK293细胞)、NS0细胞、SP20细胞、CV-1细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、3T3细胞、Jurkat细胞、HeLa细胞、COS细胞、PERC.6细胞、细胞和CAP-细胞(后两种细胞系可从德国科隆的Cevec Pharmaceuticals公司商业地获得)。CHO细胞的许多衍生物也是可用的，例如CHO-DXB11、CHO-DG-44、CHO-K1、CHO-S或工程化的CHO细胞，例如CHO-M、CK1 SV CHO和CHOZN。也可以使用哺乳动物原代细胞。
在某些实施方式中，在无血清培养基中培养细胞。例如，为了制造施用于患者的治疗性蛋白，表达细胞必须在无血清培养基中生长。在其他实施方式中，在用于多肽表达之前，细胞已经预先适应无血清培养基中的生长。
可以使用本领域已知的方法将如本文所述的载体引入上述细胞中的任一个中。这样的方法包括但不限于聚乙二醇(PEG)介导的方法、电穿孔、生物射弹输送(即粒子轰击)、原生质体融合、DEAE-葡聚糖介导的方法、以及磷酸钙共沉淀。还可参见Sambrook et al.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第三版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001；以及Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology,”JohnWiley&Sons,New York,1987以及定期的更新。
用于细胞培养的标准方法在本领域中是已知的。参见例如R.I.Freshney“Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique,”第五版,Wiley,New York,2005。.
实施例
通过参考以下实施例进一步理解本发明，这些实施例旨在纯粹是本发明的示例。本发明的范围不受限于示例性的实施例，其仅意图作为本发明的单个方面的说明。任何功能上等同的方法都在本发明的范围内。根据前面的描述和附图，除本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这些修改落入所附权利要求的范围内。
实施例1.用于测试PRE序列的载体
在该实施例中，使用载体(pCT2.1)测试了不同PRE序列对转染细胞中mRNA水平的影响，该载体含有编码抗CD20抗体利妥昔单抗的轻链的序列。
图4中示出了pCT2.1载体的示意图。在轻链基因的上游，载体包含主要立即早期(MIE)启动子、人巨细胞病毒的5'非翻译区和内含子A。在轻链基因的下游，载体含有牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号。所述载体还包含原核生物复制起点(ori)和用于原核细胞(bla)中的选择的标记物以及真核选择盒。真核选择盒含有选择标记物(GS/puro/DHFR/Neo)，其处于SV40早期启动子和SV40早期聚腺苷酸化信号的转录控制之下。
实施例2:用于测试PRE功能的测试系统
通过电穿孔将表达利妥昔单抗轻链、含有PRE的质粒转染进CHO细胞，然后测量轻链水平，从而测试不同的PRE(经修饰的PRES和杂合的PRE)对轻链表达水平的影响。对于每个被测试的PRE，化学合成PRE的序列，然后将其插入pCT2.1载体中的位于轻链序列和BGH聚腺苷酸化信号之间的BamHI位点(见图4)。
对于这些实验，将CHOK1细胞适应无血清的培养基并使用电穿孔进行转染。对于每次转染，使用Gene Pulser II电穿孔仪(BioRad,Hercules,CA)，使用制造商推荐的条件，以每种质粒1:10比例，通过PRE测试载体转染pMax GFP质粒。
在电穿孔之后，将细胞转移至T25烧瓶或6孔板无血清培养基(Gibco/LifeTechnologies,Grand Island,NY)。在37℃培养24小时之后，使用ViCell计数器(BeckmanCoulter,Indianapolis,IN)确定活细胞密度(VCD)和细胞活力。24小时之后，使用AccuriC6读数器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)测量GFP表达，并保存样品以确定利妥昔单抗轻链水平。
在转染之后24和48小时通过夹心ELISA确定利妥昔单抗轻链水平。对于ELISA，将板用多克隆山羊抗人IgG捕获抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)包被。单克隆辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人κ轻链类别号AP502P(Millipore)被用作检测抗体。为了测量过氧化物酶活性，使用邻苯二胺(OPD)作为底物，使用BMG POLARStar酶标仪(MTX Lab Systems,Vienna,VA)在480nm处测量吸光度。
实施例3:PRE序列的对比
如表3所示，使用实施例2中描述的测试系统来测试多个不同的PRE序列。将测试PRE序列在位于利妥昔单抗轻链序列和BGH聚腺苷酸化位点之间的BamHI位点插入pCT2.1载体(上述实施例1)。
如实施例2中所述，通过电穿孔将每种质粒转染进适应了悬浮液和无血清培养基的CHOK1细胞中，并在转染之后24小时和48小时测量利妥昔单抗轻链水平。通过将由ELISA测试获得的抗体水平除以GFP的平均荧光强度，将不同样品中的轻链表达归一化；并测量归一化的轻链表达水平。
表7示出了在实施例中测试的PRE的子元件结构。
表7.在实施例中测试的PRE(“-”表示子元件不存在)
构建体 γ α β
2.1(对照) - - -
2.0(WPRE) WPRE WPRE WPRE
2.10(ASPRE) ASPRE ASPRE ASPRE
2.21 - BPRE HPRE
2.22 - BPRE* HPRE
2.23 GSPRE GSPRE HPRE
2.24 GSPRE* GSPRE* HPRE
2.4 WPRE GSPRE GSPRE
2.5 - WPRE HPRE
2.52 WPRE GSPRE HPRE
2.7 - HPRE WPRE
2.8(GSPRE) GSPRE GSPRE GSPRE
2.9(BPRE) BPRE BPRE BPRE
*突变的子元件
图5显示了在转染之后第2天和第4天对多个PRE构建体进行比较的结果。构建体2.0(WPRE)和2.8(GSPRE)相似地有效。然而，当GSPRE中的γ子元件被WPRE的γ子元件替代时，融合构建体(2.4)比WPRE或GSPRE强33％。这表明WPRE的γ子元件强于GSPRE的，而GSPRE的其他子元件(例如α子元件)可能比WPRE的更强。
BPRE(2.9)包括全部三个元件，但BPRE远弱于WPRE，这表明三联(即具有全部三个子元件)不会使PRE元件强大。相反，它的强度在更大程度上取决于每个单独的子元件的强度。类似地，二联构建体2.5比三联构建体2.8、2.9和2.10更强。
基于上述启示，本实施例进一步设计了构建体2.21(删除BPRE的γ子元件并将其β子元件替换为HPRE的)、2.22(在α子元件中引入点突变)、2.23(GSPRE的β子元件替换为HPRE的)和2.24(在2.23的γ和α子元件的每一个中具有点突变)。
对比显示在图6中。构建体2.21、2.5、2.6和2.7是缺少任何γ子元件的PRE，但与含有γ子元件的WPRE相比都同样好或更好。因此，这个实验进一步证实，PRE元件的强度更多依赖于每个子元件的强度而不是子元件的数量。
这些PRE构建体再次用八次重复进行测试，结果呈现在图7A和图7B中。BPREα和HPREβ(2.21)的组合是我们的最高表达者之一，其表达增加了72％。然而，α中的点突变(2.22)导致构建体仅产生19％的表达增加。进一步地，敲除2.21的α子元件使得该构建体有效26％，这表明BPREα子元件的重要性。
将GSPRE的β子元件替换为HPRE的β子元件(2.23)导致表达增加46.6％，相比之下，WPREγ替换(2.4)导致表达增加33％。因此，HPRE的β是比WPRE的γ子元件更强的子元件。
较早认为“转录后效应的强度是由RNA中子元件的数量决定的。”Donello et al.,J Virol.1998Jun；72(6):5085–5092 at 5085。然而，在这里，实验表明，BPRE的α、HPREβ和WPRE的γ元件每个都是它们各自分子的功能中最重要的部分(2.21 vs 2.22、2.23 vs2.8、2.4 vs 2.8)。因此，与传统理解相反，本研究表明，PRE的强度并不取决于子元件的数量，而是取决于每个子元件的强度。
图8A和8B显示了对构建体2.52与2.0和2.1进行对比的两个实验的概要数据。在第4天，pCT 2.52(WPREγ+GSPREα+HPREβ)比2.0(WPRE)强2倍。还有趣的是，虽然pCT 2.0(WPRE)随着时间的推移而丧失了其相对于对照的优势(将图8B中的第4天与图8A中的第2天进行比较)，因为表达在其达到极限后保持恒定，但是新设计的嵌合pCT2.52PRE与对照一起其表达继续增加。
所有的PRE构建体再次进行8次重复测试，最终数据如上表2所示。
实施例4：天然PRE和其他调控元件之间的相互作用
该实验测试了PRE和其他调控元件之间的关系。下面的表8中列出的构建体含有所示的启动子或其他调控元件。另外，构建体2.52、2.53和2.54包含如表2中2.52所示的PRE子元件，包括WPRE的γ子元件、GSPRE的α子元件和来自HPRE的β子元件。构建体2.0、2.36、2.39和2.50含有天然WPRE(即γ、α和β子元件全部来自WPRE)，构建体2.1、2.22、2.37和2.51不含有任何PRE元件。
表8.在实施例中测试的构建体(“-”表示元件不存在)
图9A显示了当从构建体中移除RC-dUTR、U-UTR、内含子A和/或d-UTR时，构建体2.52的嵌合PRE(即WPRE的γ子元件、GSPRE的α子元件和来自HPRE的β子元件)的有效性降低。令人惊讶的是，这种移除对WPRE没有显示明显的负面影响(对比图9B中的构建体2.0、2.32、2.37和2.50)。作为对照，当不使用PRE元件时，移除这些额外的调控元件确实具有负面影响(参见图9B的左半部分)。
因此，该实验表明，天然WPRE元件不受益于额外的调控元件RC-dUTR、U-UTR、内含子A或d-UTR中的一个或多个的存在。考虑的是，天然WPRE和这些调控元件中的一个或多个可能具有冗余功能。这些调控元件中的一个或多个与天然WPRE元件之间的其他类型的相互作用也是可能的。通过测试的嵌合PRE元件未观察到这种非生产性的相互作用，这进一步强调了这种嵌合PRE元件的意料不到的优点。
应该理解的是，虽然已经结合上述实施方式描述了本发明，但是前面的描述和实施例旨在进行说明而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员来说将是显而易见的。

Claims (26)

1.一种多核苷酸，其包括：
（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 14的核酸序列或与SEQ ID NO: 14具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及
（b）第二片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一片段距离所述第二片段不超过20个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其进一步包括：（c）第三片段，其由转录后调控元件（PRE）的γ子元件组成。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述γ子元件具有SEQ ID NO: 7、12、16或20的核酸序列或与SEQ ID NO: 7、12、16或20具有至少95%序列同一性的核酸序列。
5.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述γ子元件具有SEQ ID NO: 7的核酸序列或与SEQ ID NO: 7具有至少95%序列同一性的核酸序列。
6.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述γ子元件具有SEQ ID NO: 16的核酸序列或与SEQ ID NO: 16具有至少95%序列同一性的核酸序列。
7.根据权利要求3-6的任一项所述的多核苷酸，其中所述第一片段位于所述第三片段和所述第二片段之间。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述第三片段距离所述第一片段不超过20个核苷酸。
9.根据权利要求5所述的多核苷酸，其依次包括SEQ ID NO: 7、14和3。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其包括SEQ ID NO: 26的核酸序列。
11.根据权利要求6所述的多核苷酸，其包括SEQ ID NO: 25的核酸序列。
12.一种多核苷酸，其包括：
（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 7的核酸序列或与SEQ ID NO: 7具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，
（b）第二片段，其由转录后调控元件（PRE）的α子元件组成，以及
（c）第三片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述α子元件具有SEQ ID NO: 2、5、9、14或18的核酸序列或与SEQ ID NO: 2、5、9、14或18具有至少95%序列同一性的核酸序列。
14.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中所述α子元件具有SEQ ID NO: 2的核酸序列或与SEQ ID NO: 2具有至少95%序列同一性的核酸序列。
15.根据权利要求12-14的任一项所述的多核苷酸，其中所述第二片段位于所述第一片段和所述第三片段之间，并且每个片段都距离相邻的片段不超过20个核苷酸。
16.一种多核苷酸，其包括：
（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 5、9或18的核酸序列或与SEQ ID NO: 5、9或18具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及
（b）第二片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其进一步包括：（c）第三片段，其由转录后调控元件（PRE）的γ子元件组成。
18.一种多核苷酸构建体，其包括权利要求1-17的任一项所述的多核苷酸以及编码蛋白的序列。
19.一种多核苷酸构建体，其包括：
（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 14的核酸序列或与SEQ ID NO: 14具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，
（b）第二片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及
（c）编码蛋白的序列。
20.一种多核苷酸构建体，其包括：
（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 7的核酸序列或与SEQ ID NO: 7具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，
（b）第二片段，其由转录后调控元件（PRE）的α子元件组成，
（c）第三片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及
（d）编码蛋白的序列。
21.一种多核苷酸构建体，其包括：
（a）第一片段，其由SEQ ID NO: 5、9或18的核酸序列或与SEQ ID NO: 5、9或18具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，
（b）第二片段，其由SEQ ID NO: 3的核酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少95%序列同一性的核酸序列组成，以及
（c）编码蛋白的序列。
22.根据权利要求19-21的任一项所述的多核苷酸构建体，其中所述编码蛋白的序列位于所述第一片段和所述第二片段之间。
23.根据权利要求19-22的任一项所述的多核苷酸构建体，其进一步包括3’-UTR。
24.根据权利要求23所述的多核苷酸构建体，其中所述3’-UTR位于所述第一片段和所述第二片段之间。
25.根据权利要求18-24的任一项所述的多核苷酸构建体，其进一步包括poly(A)序列。
26.一种细胞，其包括权利要求18-25的任一项所述的多核苷酸构建体。
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