JP2023553773A

JP2023553773A - 抗ｈｍｍｗ抗体、それを含む組成物、及びそれをコードする核酸分子、並びにその使用

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Publication number: JP2023553773A
Application number: JP2023509376A
Authority: JP
Inventors: ハンメイシュ，
Original assignee: Nanjing Anji Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Anji Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-12-26
Also published as: CN114014928A; WO2023071821A1; AU2022291618A1; EP4198054A1; CN114014928B

Abstract

本開示は、抗ＨＭＭＷ抗体、本抗体を含む組成物、及び本抗体をコードする核酸分子、並びに本抗体、本組成物又は本核酸分子の使用に関する。【選択図】図５

Description

本開示は、抗ＨＭＭＷ抗体、本抗体を含む組成物、及び本抗体をコードする核酸分子、並びに本抗体、本組成物又は本核酸分子の使用に関する。

本記載の一部は、本開示に関連する背景情報を提供するに過ぎず、従来技術を必ずしも構成するものではない。

長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、２００ｎｔを超える長さの転写産物を有するＲＮＡ分子のクラスである。一般的に、ｌｎｃＲＮＡはタンパク質をコードせず、ＲＮＡの形でタンパク質、ＤＮＡ、及びＲＮＡと相互作用し、エピジェネティック修飾（クロマチンリモデリング及び修飾、並びにＤＮＡ／ＲＮＡメチル化）、転写レベル（転写因子の結合）、及び転写後レベル（ＲＮＡ切断、ｍＲＮＡ安定化、及び翻訳、並びにｃｅＲＮＡとして）の点で遺伝子発現を制御すると考えられている。２０１１年に、驚くべきことに、ｌｎｃＲＮＡがリボソーム保護フラグメントのディープシークエンスにより、小さな短いペプチドを翻訳している可能性があることが、科学者たちによって発見された。しかし、トランスクリプトームシーケンス技術及び解析手法の深度及び精度に制限され、コーディング能力を持つオープンリーディングフレームを含むノンコーディングＲＮＡについては、国際レベルで大きな議論が行われている。２０１５年、テキサス大学サウスウェスタン医療センターのＥｒｉｃＯｌｓｏｎ教授のチームは、骨格筋に特異的に発現するｌｎｃＲＮＡを発見した。このｌｎｃＲＮＡは、心筋細胞のカルシウムホメオスタシス制御に重要な役割を果たすことが見出されている４６アミノ酸のマイクロペプチドミオレグリン（ＭＬＮ）をコードしている可能性があった。２０１６年には、ＥｒｉｃＯｌｓｏｎの研究室が、ｌｎｃＲＮＡがコードする他のマイクロペプチドＤＷＯＲＦがマウスの心臓で高発現し、筋収縮を制御し得ることをＳｃｉｅｎｃｅ誌に報告した。近年、ｌｎｃＲＮＡがコードするマイクロペプチドが、筋形成、アミノ酸代謝、ｍＲＮＡの転写後修飾、及び粘膜免疫の制御等の重要な生理学的又は病理学的過程に主に関与していることが世界中の研究者によって次々と見出されており、ｌｎｃＲＮＡが実際に新規機能性マイクロペプチドをコードできることが証明されてきている。しかし、腫瘍においてｌｎｃＲＮＡがコードするマイクロペプチドを発見した報告は少ししかない。ヒトゲノムに転写される全ＲＮＡのうち、ノンコーディングＲＮＡは９０％以上を占め、そのうち８５％がｌｎｃＲＮＡであることはよく知られている。したがって、マルチオミクス技術とｉｎ－ｖｉｖｏ及びｉｎ－ｖｉｔｒｏモデルの交差検証を組み合わせることにより、腫瘍においてｌｎｃＲＮＡがコードするマイクロペプチドを見出すこと、腫瘍におけるマイクロペプチドの特異的作用及び機構を明らかにすること、標的化した方法で新薬を開発することは、腫瘍の治療にとって大きな意義がある。

頭頸部腫瘍は、世界で７番目に多い悪性腫瘍で、主に耳鼻科系腫瘍（喉頭癌、上咽頭癌、及び副鼻腔癌）、口腔顎顔面腫瘍（舌癌、歯肉癌、及び頬部癌）を含む。頭頸部腫瘍の９０％超は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に属し、毎年８３万超の新しい症例及び４３万人以上の死亡が発生し、中国における新症例数は全体の約１／５である。現在、臨床診療においては、頭頸部癌は手術と放射線治療、及び化学療法との併用によって治療されるのが未だに一般的であるが、治療効果は満足できるものではない。標的治療薬は、主にＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）阻害剤である。後期においては薬物耐性を生じる可能性が高いため、臨床的な有効性は重度に妨げられており、頭頸部癌の患者の５年生存率は５０％に過ぎない。このため、頭頸部扁平上皮癌の治療効果を改善するためには、薬物開発のための新しいバイオマーカー及び標的の発見が重要な意義を有する。

腎細胞癌（ＲＣＣ）は、腎実質の尿細管上皮に由来する悪性腫瘍で、成人悪性腫瘍の２～３％を占め、腎細胞癌の最も一般的な種類は明細胞癌、次に乳頭状腎細胞癌、及び色素細胞癌であり、稀な種類は集合管癌等である。泌尿器系の三大腫瘍のうちの１つである腎癌の発症率は前立腺癌、及び膀胱癌に次いで高く、その死亡率は三大腫瘍の中で第１位である。現在、世界の腎臓癌の発症率は、全男性悪性腫瘍の中で９位（新規患者数２１４千人）、全女性悪性腫瘍の中で１４位（新規患者数１２４千人）である。２０１８年２月に国立がんセンターが発表した最新の癌データによると、中国における腎癌の発症率は４．９９／１０万人であり、男性の腎癌の発症率は６．０９／１０万人、女性の腎癌の発症率は３．８４／１０万人であることが示されている。腎臓の位置が隠れているため、初期の臨床症状は明らかではなく、認知された診断マーカーがないため、腎臓癌患者のうちの３０％超が初診時に後期まで進行し、手術による根治治療の最適な機会を逃しており、早期臨床診断率を改善させ適時に治療を行うためには、腎癌の特異的診断マーカーの探索は不可欠な要件である。

前立腺癌は、前立腺に発生する上皮性悪性腫瘍を指し、腺癌、管状腺癌、尿路上皮癌、扁平上皮癌、及び腺扁平上皮癌を含む。前立腺腺癌は９５％超を占め、早期には症状がなく、症状がある場合は通常、局所浸潤又は遠隔転移を示し、尿道、膀胱、及び三陰交に病巣が広がり、排尿障害を引き起こす。さらに、遠隔転移時に、腰痛、血尿、やせ、及び衰弱が起こり得る。近年、前立腺癌の発症は急激に増加している。２０２０年には、前立腺癌は肺癌に次いでおり、その発症率は男性悪性腫瘍の２位であった。前立腺癌の臨床診断は、主に直腸デジタル診、血清ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、経直腸的前立腺超音波検査、及び骨盤ＭＲＩ検査によって行われ、確定診断の前は前立腺穿刺生検による病理検査が必要である。早期及び中期の患者は主に手術及び放射線治療によって治療され、後期の患者は主に内分泌療法が行われる。西洋の先進国の患者と比較すると、中国では初診時に後期まで進行している可能性が高く、後期の前立腺癌患者は予後がより不良であり、治療が困難になっている。したがって、前立腺癌の新しい診断マーカー及び治療薬を発見することは、良好な予後を得るために非常に重要である。

大腸癌は、結腸又は直腸の粘膜上皮に生じる悪性腫瘍を指し、結腸癌及び直腸癌を含み、これらは病因及び診断原理が類似していることから、医学的には合わせて大腸癌と称する。現在の臨床治療から、都市化の進展に伴い生活様式及び食生活が変化し、鶏肉、鴨肉、及び魚肉等の高カロリー、及び高脂肪、高タンパク質食品の摂取が増加し、人口の高齢化が加速しており、そのため、大腸腫瘍の高発症率という問題がますます顕著になっている。都市部において大腸癌の発症率は２～３位であり、４０歳未満の若年層が大腸癌を罹患する比率は大腸癌を罹患する全集団の約２０％を占め、増加傾向を示している。中国は大腸癌の発症率が高い国のうちの１つである。大腸癌の高い発症率及び高い死亡率は、日を追うごとに人々の身体的及び心理的な健康を著しく脅かしており、大腸癌の予防及び治療に対する状況は非常に深刻である。

本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＨＭＭＷマイクロペプチドに特異的に結合する抗体であって、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１又は７１に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２又は７２に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３又は７３に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４又は７４に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５又は７５に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６又は７６に記載のアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。

本開示は、本開示の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物をさらに提供する。

本開示は、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子をさらに提供する。

本開示は、大腸癌を治療するための薬物の製造における、本開示の抗体又は医薬組成物又は核酸分子の使用をさらに提供する。

本開示は、頭頸部扁平上皮癌、腎癌、前立腺癌、及び大腸癌を診断するためのキットの製造における、本開示の抗体若しくは医薬組成物又は核酸分子の使用をさらに提供する。

以下は、添付の図面の簡単な説明を提供するが、これらの図面は、本明細書に開示の例示的な実施形態を限定するものではなく、これらの実施形態を説明するために使用されるものである。

ＨＭＭＷマイクロペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す図である。ＨＭＭＷマイクロペプチドのＨＰＬＣの結果を示す図である。抗ＨＭＭＷ－１抗体、抗ＨＭＭＷ－２抗体、抗ＨＭＭＷ－３抗体、抗ＨＭＭＷ－４抗体、抗ＨＭＭＷ－５抗体、抗ＨＭＭＷ－６抗体、抗ＨＭＭＷ－７抗体、及び抗ＨＭＭＷ－８抗体と固定量のＨＭＭＷマイクロペプチドとのウェスタンブロットの結果を示す図である。抗ＨＭＭＷ－１抗体、抗ＨＭＭＷ－２抗体、抗ＨＭＭＷ－３抗体、抗ＨＭＭＷ－４抗体、抗ＨＭＭＷ－５抗体、抗ＨＭＭＷ－６抗体、抗ＨＭＭＷ－７抗体、及び抗ＨＭＭＷ－８抗体と、頭頸部扁平上皮癌のＣＡＬ２７細胞、腎癌の７８６－Ｏ細胞、前立腺癌のＤＵ１４５細胞、及び大腸癌のＨＣＴ１１６細胞で発現させたＨＭＭＷマイクロペプチドとのウェスタンブロッティングの結果を示す図である。抗ＨＭＭＷ－１抗体、抗ＨＭＭＷ－２抗体、抗ＨＭＭＷ－３抗体、抗ＨＭＭＷ－４抗体、抗ＨＭＭＷ－５抗体、抗ＨＭＭＷ－６抗体、抗ＨＭＭＷ－７抗体及び抗ＨＭＭＷ－８抗体の大腸癌のＨＣＴ１１６細胞の増殖抑制効果を示す図であり；抗ＨＭＭＷ－１抗体、抗ＨＭＭＷ－２抗体、抗ＨＭＭＷ－３抗体、抗ＨＭＭＷ－４抗体、抗ＨＭＭＷ－５抗体、抗ＨＭＭＷ－６抗体、抗ＨＭＭＷ－７抗体、及び抗ＨＭＭＷ－８抗体の大腸癌のＨＣＴ１１６細胞の遊走に対する阻害効果を示す図である。

特にことわらない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「Ａ及び／又はＢ」という表現は：（１）Ａ；（２）Ｂ；及び（３）Ａ及びＢという３つの場合を含む。

「同一性」という用語は、一対の配列（ヌクレオチド又はアミノ酸）間の類似性の程度を指す。同一性は、同じ残基の数を残基の総数で割り、商に１００を乗算してパーセンテージを得ることによって決定する。同一性を評価する際には、ギャップは除外される。したがって、完全に同一の配列の２つのコピーは１００％の同一性を有するが、欠失、付加又は置換のある配列は、同一性の程度が低くなることがある。当業者であれば、配列の同一性を決定するために使用できるコンピュータプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムを使用したプログラムがいくつかあることを認識するであろう。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて行われ、ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて行われ、各プログラムのデフォルトパラメータが使用される。

２つの異なる配列は、その配列によってコードされるタンパク質の全体的な機能に影響を与えることなく、互いに異なることが可能である。この点に関して、化学的に類似したアミノ酸は、通常、その機能を変えることなく、互いに置換することができることは、当技術分野では周知されている。関連する特性としては、酸性／アルカリ性、極性／非極性、電荷、疎水性、及び化学構造が挙げられる。例えば、アルカリ性残基であるＬｙｓとＡｒｇは化学的に類似していると考えられ、しばしば互いに置換される。他の例としては、酸性残基であるＡｓｐ及びＧｌｕ、ヒドロキシル残基であるＳｅｒ及びＴｈｒ、芳香族残基であるＴｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐ、並びに非極性残基であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＭｅｔである。これらの置換は「保存的」であると考えられている。同様に、ヌクレオチドコドン及び許容される変化もまた、当技術分野で知られている。例えば、コドンＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、及びＡＣＧは全てアミノ酸スレオニンをコードし、すなわち、得られるアミノ酸を変えることなく第３のヌクレオチドを変更することができる。類似性は、類似する残基の数を残基の総数で割り、商に１００を乗算してパーセンテージを得ることによって決定する。類似性及び同一性の測定値は、異なる特性を示すことに留意すべきである。

本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、本開示の抗体と他の化学成分、例えば担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は賦形剤との混合物を指す。医薬組成物は、生物への抗体の投与を容易にする。当技術分野において抗体を投与するための多くの技術があり、静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼、肺及び局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される材料、組成物又は担体、例えば液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料を含み、対象内で本開示の抗体を運搬又は輸送するか、又は意図する機能を果たすように対象へ本開示の抗体を運搬又は輸送することに関与している。各塩又は担体は、製剤の他の成分との適合性に関して「許容される」ものでなければならず、対象に有害であってはならない。薬学的に許容される担体として使用することができる材料のいくつかの例としては：糖、例えばラクトース、グルコース、及びスクロース；デンプン、例えばコーンスターチ及びポテトスターチ；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；粉末トラガカントゴム；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；ジオール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチル、及びラウリン酸エチル；寒天：緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル液；エタノール；リン酸緩衝液；希釈剤；造粒剤；滑沢剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味料；香味料；芳香剤、保存料；酸化防止剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤；固化剤；懸濁剤；界面活性剤；保湿剤；担体；安定剤；及び医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合性物質、又はその組合せが挙げられる。

「抗体」という用語は、免疫系によって標的抗原を認識するために使用されるタンパク質を指す。抗体の基本的な機能単位は、免疫グロブリンモノマーである。モノマーは、２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖からなり、これはＹ字型のタンパク質を形成する。各軽鎖は、１つの定常ドメインと１つの可変ドメインからなる。軽鎖において、定常ドメインは「定常領域」とも呼ばれ、可変ドメインは「可変領域」とも呼ばれる。重鎖はそれぞれ１つの可変ドメインと３つ又は４つの定常ドメインからなる。重鎖では、定常ドメインを合わせて「定常領域」と呼び、可変ドメインは「可変領域」と呼ぶこともある。Ｙのアームは断片、抗原結合（Ｆａｂ）領域と呼ばれ、各アームはＦａｂ断片と呼ばれる。各Ｆａｂ断片は、重鎖由来の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメイン、並びに軽鎖由来の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインからなる。Ｙの基部はＦｃ領域と呼ばれ、これは、各重鎖由来の２つ又は３つの定常ドメインからなる。Ｆａｂ領域における重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、抗体の抗原（本開示ではＨＭＭＷなど）を結合するための部分である。より具体的には、可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その抗原（例えばＨＭＭＷ）を結合する。各可変ドメインのアミノ酸配列には、３つの不連続なＣＤＲが存在する。本明細書で使用される場合、「完全」という用語は、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域を含む抗体を指す。

本明細書で使用する「抗体重鎖」は、天然のコンフォメーションの抗体分子中で存在する２種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常、抗体の種類を決定するものである。

本明細書で使用する「抗体軽鎖」は、天然のコンフォメーションの抗体分子中で存在する２種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方を指す。κ及びλ軽鎖は、抗体軽鎖の２つの主要なアイソタイプを指す。

現在、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌、及び大腸癌の検出及び治療におけるマイクロペプチドの使用に関する研究は行われていない。本発明者は、トランスクリプトームシーケンシングデータ解析、プロテオミクス、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９遺伝子編集、ｉｎ－ｖｉｖｏ翻訳等を用いて、マイクロペプチド探索技術基盤を確立し、ｌｎｃＲＮＡがコードするマイクロペプチドＨＭＭＷを発見している。ＨＭＭＷの発現差異がある腫瘍スペクトルをスクリーニングし、解析することにより、頭頸部扁平上皮癌、腎癌、及び前立腺癌の組織におけるＨＭＭＷの発現レベルは、癌周辺組織における発現レベルよりも有意に低く、大腸癌組織におけるＨＭＭＷの発現レベルは、癌周辺組織における発現レベルよりも有意に高いことが見出されている。このことから、ＨＭＭＷマイクロペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が開発されており、これは頭頸部扁平上皮癌、腎癌、前立腺癌、及び大腸癌の検出に使用でき、大腸癌の治療に新しい解決策を提供する。本開示の抗ＨＭＭＷ抗体は、異なる腫瘍細胞（頭頸部扁平上皮癌、腎癌、前立腺癌、及び大腸癌細胞を含むがこれらに限定されない）のＨＭＭＷに特異的に結合でき、細胞内のＨＭＭＷマイクロペプチドの発現レベルを感度よく検出するため、種々の癌の診断に有効に利用される。また、本開示の抗ＨＭＭＷ抗体は、大腸癌細胞の増殖を有意に阻害するだけでなく、大腸癌細胞の遊走を有意に阻害する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ヒトＨＭＭＷマイクロペプチドに特異的に結合する抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み：
（ａ）ＣＤＲＨ１が、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１又は７１に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２又は７２に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３又は７３に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４又は７４に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５又は７５に記載のアミノ酸配列を有する；
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６又は７６に記載のアミノ酸配列を有する、抗体に関する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ヒトＨＭＭＷマイクロペプチドに特異的に結合する抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み；
（１）ＣＤＲＨ１が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（２）ＣＤＲＨ１が配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（３）ＣＤＲＨ１が配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（４）ＣＤＲＨ１が配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（５）ＣＤＲＨ１が配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（６）ＣＤＲＨ１が配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（７）ＣＤＲＨ１が配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（８）ＣＤＲＨ１が配列番号７１に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２が配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３が配列番号７３に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ１が配列番号７４に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ２が配列番号７５に記載のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＬ３が配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する、抗体に関する。

いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７若しくは７７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号７、１７、３７、４７、５７、６７若しくは７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７又は７７に記載されている。

いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８若しくは７８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８若しくは７８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８又は７８に記載されている。

いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７又は７７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８又は７８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域は、配列番号７７に記載のアミノ酸配列を含み、抗体軽鎖可変領域は、配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’断片、二価抗体、三価抗体、四価抗体又はモノクローナル抗体の一部である。

ｓｃＦｖは、通常リンカーによって結合された軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。リンカーは、通常、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸の長さである（ただし、この範囲である必要はない）。１つの可変領域のＮ末端は、他の可変ドメインのＣ末端と連結している。ｓｃＦｖは、セルトリズマブペゴールのように、ＰＥＧ化（すなわち、ポリエチレングリコールによる処理）を受けてサイズが増加していることが好ましい。２つのｓｃＦｖを他のリンカーで結合して、タンデムｓｃＦｖを生成することができる。

軽鎖可変領域と重鎖可変領域が短いリンカーによって結合されてｓｃＦｖを形成する場合、２つの可変領域は重複することができず、さもなければｓｃＦｖは二量体化を起こして二価抗体を形成する。さらに短いリンカーであっても、三量体（すなわち三価の抗体）及び四量体（すなわち四価抗体）の形成をもたらし得る。

完全なモノクローナル抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖からなる。また、各軽鎖及び各重鎖は可変ドメインを含む。各軽鎖は重鎖と結合している。２本の重鎖はヒンジ領域で結合している。ヒンジ領域の下部にある重鎖の定常領域を取り除くと、合計４つの可変領域を含むＦ（ａｂ’）_２断片が生成される。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つのＦａｂ’断片に分けることができる。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域由来のスルフヒドリル基を含む。ヒンジ領域の上部の重鎖定常領域を取り除くと、Ｆａｂ断片が形成され、これはヒンジ領域由来のスルフヒドリル基を含まない。しかしながら、これらの断片は全て、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、可変領域／ドメインを含む上記の軽鎖及び重鎖とヒト定常領域とを組み合わせることによって形成される完全なモノクローナル抗体である。重鎖定常領域は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭを含む任意のヒトアイソタイプであり得る。ヒト軽鎖定常領域は、κ又はλアイソタイプであり得る。

本開示における抗体についての上述の種々の実施形態及び嗜好性は、互いに組み合わせることができ（互いに本質的に矛盾しない限り）、その組合せによって形成される種々の実施形態は、本開示の一部と考えられる。

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。担体は、抗体を送達するための媒体として作用する。薬学的に許容される担体の例としては、抗体を溶解又は懸濁することができる液体担体（例えば、水、油、及びアルコール）が挙げられる。

また、医薬組成物は、賦形剤を含んでいてもよい。具体的には、賦形剤としては、緩衝剤、界面活性剤、保存料、充填剤、ポリマー、及び安定剤が挙げられ、これらは抗体と併用することができる。緩衝剤は、組成物のｐＨ値を制御するために使用される。界面活性剤は、タンパク質の安定化、タンパク質凝集の阻害、表面へのタンパク質吸着の抑制、及びタンパク質のリフォールディングの補助のために使用される。界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｒｉｊ３５、ＴｒｉｔｏｎＸ－１０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７、及びドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。保存料は、微生物の増殖を阻害するために用いられる。保存料の例としては、ベンジルアルコール、ｍ－クレゾール、及びフェノールが挙げられる。充填剤は、凍結乾燥時に体積を増加させるために使用される。親水性ポリマー（例えば、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ポリエチレングリコール、及びゼラチン）は、タンパク質を安定化させるために使用することができる。また、非極性部分を有するポリマー（例えば、ポリエチレングリコールポリマー）も、界面活性剤として使用することができる。タンパク質安定化剤としては、ポリオール、糖、アミノ酸、アミン、及び塩が挙げられる。適切な糖としては、スクロース、及びトレハロースが挙げられる。アミノ酸としては、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、プロリン、リジン、グルタミン酸、及びその混合物が挙げられる。また、ヒト血清アルブミン等のタンパク質を表面に競合的に吸着させ、抗体の凝集を減少させてもよい。特定の分子を多くの目的に使用できることは留意すべきである。例えば、ヒスチジンは、緩衝剤及び酸化防止剤として使用することができる。グリシンは、緩衝剤及び充填剤として使用することができる。

本明細書に開示される抗体又は組成物は、以下の投与経路、例えば吸入、経口、鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、粘膜（例えば、舌下、舌、頬／経頬、尿道／経尿道、膣（例えば。経膣及び膣内）、鼻／経鼻及び直腸／経直腸）、膀胱内、肺内、経十二指腸、胃内、髄腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入及び局所投与に適するように適切に開発することができる。適切な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、カシェー、丸剤、ゲルキャップ、頬錠、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、散剤、ペレット、スラリー、トローチ、クリーム剤、ペースト剤、軟膏剤、ローション剤、プレート、坐剤、鼻又は経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥散剤又はエアゾール製剤、及び膀胱内投与用の組成物及び製剤が挙げられる。本開示で使用できる製剤及び組成物は、本明細書に記載される特定の製剤及び組成物に限定されないことは理解されるべきである。

いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子に関する。

いくつかの実施形態において、本開示は、核酸分子であって、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９若しくは７９に記載の重鎖可変領域コード配列又は配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９若しくは７９に記載の重鎖可変領域コード配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び／又は配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは８０に記載の軽鎖可変領域コード配列、又は配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは８０に記載の軽鎖可変領域コード配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子に関する。

いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９若しくは７９に記載の重鎖可変領域コード配列、及び／又は配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは８０に記載の軽鎖可変領域コード配列を含む核酸分子に関する。

いくつかの実施形態において、本開示は、大腸癌を治療するための薬物の製造における、本開示の抗体又は医薬組成物又は核酸分子の使用に関する。

いくつかの実施形態において、本開示は、頭頸部扁平上皮癌、腎癌、前立腺癌、及び大腸癌を診断するためのキットの製造における、本開示の抗体又は医薬組成物又は核酸分子の使用に関する。

本開示における抗体に関する種々の実施形態及び嗜好性は、本開示の組成物、核酸分子、及び用途にも適用可能であり、これらの実施形態及び嗜好性は互いに組み合わせることもでき（互いに本質的に矛盾しない限り）、その組合せによって形成される種々の実施形態は、本出願の一部と考えられる。

本開示の技術的解決策は、実施例と組み合わせた例示によって、より明確かつ明示的に説明される。これらの実施例は、例示のためのものに過ぎず、本開示の保護範囲を限定することを意図していないことは理解されるべきである。本開示の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。

実施例１：ＨＭＭＷマイクロペプチドの組換えベクターの構築及び発現
ＨＭＭＷマイクロペプチド（アミノ酸配列は配列番号８１に記載）に対応するヌクレオチド配列（配列番号８２）は、ＧｅｎｅｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｙｓｔｅｍ（Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ，Ｌｔｄ．（以下、ＧｅｎｅｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌと称する）によって合成された。ＥｃｏＲＩ－－ＢａｍＨＩ二重酵素消化（ＮＥＢ、米国）を通して、合成されたヌクレオチド配列を発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ、米国）に連結し、連結した産物を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５αを形質転換し、これをプレート上に塗布して、いくつかのクローンを拾い、細菌を振盪培養に供し、ＢｅｉｊｉｎｇＴｉａｎｇｅｎ生物プラスミド抽出キットを用いてプラスミドを抽出し、ＧｅｎｅｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌの配列決定によって正しい発現クローン配列を有する組換え発現ベクターを確認した。得られた発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＢｅｉｊｉｎｇＴｒａｎｓＧｅｎＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．）に形質転換した。形質転換は、以下の具体的なステップを含んでいた：１）プラスミド１μＬをコンピテントセルに添加して均一に混合し、混合物を３０分間氷上に静置した；２）混合物を４２℃の水浴に９０秒間供し、直ちに取り出し、２分間氷上に静置した；３）混合物を全てＬＢ培地１ｍＬに接種した；４）培地を３７℃で４５分間、１８０ｒｐｍのシェーカーで培養して耐性を回復させた；５）培養物を５，０００ｒｐｍ×５分間で遠心分離した。上清を廃棄し、１００μＬを残して均一に混合し、混合液をプレート（ＬＢ－Ａｍｐ＋）に塗布し、まずプレートを上向きに置いて２０分間吸収させた後、プレートを１２時間倒置し、単一コロニーを拾ってＬＢ（×２）培地５ｍＬに接種し、３７℃で振盪培養に供した。細菌溶液の吸光度値ＯＤ６００が約０．６になった時点でＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してさらに３時間誘導培養を行った。細菌溶液を５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細菌を回収してＰＢＳで洗浄し、細菌を遠心分離して回収し、４℃で超音波処理により細菌を破砕した。破砕した細菌を１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動のために回収し、その結果を図１に示し、これは、ＨＭＭＷマイクロペプチドの発現を示している。ＨＭＭＷマイクロペプチドをニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィー及びイミダゾール勾配溶出により精製し、ＨＰＬＣ検出結果を図２に示し、これはＨＭＭＷマイクロペプチドの純度が９０％超であることを示している。

実施例２：抗ヒトＨＭＭＷマイクロペプチドのモノクローナル抗体の調製
８～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣｈａｎｇｚｈｏｕＣａｖｅｎｓＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｎｉｍａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．）を購入し、免疫原の量が約５０μｇ／マウス／回となるように精製ＨＭＭＷマイクロペプチドで免疫化した。初回免疫化時には、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で乳化した抗原を頸部背面の複数点に皮下注射した。初回免疫化から３週間後、２回目、及び３回目の免疫化には、同体積のフロイント不完全アジュバント（シグマ・アルドリッチ）で乳化した免疫原を、初回免疫化と同じ免疫用量で約２週間毎に用いた。３回免疫化後、マウス眼の静脈叢から採血し、抗血清のＥＬＩＳＡ力価（タンパク質抗原コートプレート）を検出し、抗血清力価が８Ｋ超のマウスを融合ステージに選択した。

融合の１日前に、８～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス１匹を採取し、７５％エタノール溶液中に２分間静置した。マウスの脾臓を無菌的に取り出し、２００メッシュのステンレス鋼スクリーンに静置した。粉砕することによって単一細胞懸濁液を得た。免疫化マウスの単一細胞懸濁液を同様の方法で得た。よく増殖し指数関数期にあるＳＰ２／０細胞を回収し、脾臓細胞と１：５の比率で５０ｍｌの透明プラスチック遠心管内で混合し、予熱したＲＰＭＩ１６４０基礎培地（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で１回洗浄し（１，４００ｒｐｍ、５分間）、上清を廃棄し、管底を指で優しく叩いて２種の細胞を十分に混合して細胞懸濁液とした。遠心管を予熱のために３７℃の保温水浴カップに入れ、３７℃で予熱した５０％ＰＥＧ溶液１ｍｌを吸収させて１分以内に一定の速度で添加し、添加しながら遠心管を穏やかに振盪した後、３７℃水浴中で６０秒間穏やかに振盪した。３７℃で予熱した１６４０基礎培地１４ｍｌを管壁に沿って穏やかに均一に滴下して反応を終了させた（最初の１分間以内に１ｍｌ、３分間以内に３ｍｌを添加し、最後に１０ｍｌをゆっくり添加した）。３７℃で５分間静置した後、混合物を遠心分離（８００ｒｐｍ、５分間）し、上清を廃棄し（遠心分離管を傾け、上清を吸引した）、沈殿した細胞を３７℃で予熱した１６４０選択培地に穏やかに懸濁し（ピペッティングなし）、均一に混合した後、トロホブラストを含む９６ウェル培養プレートに１００μｌ／ウェルで滴加し、細胞を３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで培養し、３日後に溶液の半量を交換し、１０日後に細胞をＨＴ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で培養し、２週間後に１０％ＦＢＳ含有１６４０培地（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を用いて培養した。この期間の間、９６ウェルプレート内のクローンの成長を毎日観察した。ハイブリドーマ細胞がウェル底面の１／１０の面積を占めた時点で、特異的抗体の検出を開始し、必要なハイブリドーマ細胞株を選別した。ウェル内の細胞株の陽性率が１００％（対応する抗原を認識する）になるまで上記ステップを繰り返し、８つのハイブリドーマ細胞株を得た。

実施例３：抗ヒトＨＭＭＷ抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列決定
８つのハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し（ＲＮＡ抽出キットはＢａｏｒｉｙｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．より購入した）、５’ＲＡＣＥ（ＢａｏｒｉｙｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてｃＤＮＡを逆転写に供し、ＰＣＲによりハイブリドーマ細胞の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）をクローニングした後、配列を決定した。配列決定の結果を以下の表１に示し、ＣＤＲは斜線部に示した。

実施例４：ＥＬＩＳＡによる抗ＨＭＭＷ抗体力価の検出
ＨＭＭＷマイクロペプチドの抗原コーティング濃度は１μｇ／ｍｌであり、シールには５％ミルクＰＢＳ－Ｔを使用した。８つの抗体の希釈倍率は、１：３．１２５Ｋ／６．２５Ｋ／１２．５Ｋ／２５Ｋ／５０Ｋ／１００Ｋであった。一次抗体は３７℃で１時間、二次抗体は３７℃で４５分間インキュベートした。発色溶液を添加し、３７℃で１５分間反応させた後、反応を終了させ、値を読み取った。下記の表２から、８つの抗体の力価はいずれも１：１００Ｋに達しており、その後の抗原検出の条件を満たしていることがわかる。

実施例５：ウェスタンブロットによる抗ＨＭＭＷ抗体の検出における感度の改善
精製したＨＭＭＷマイクロペプチドを全ローディング量１０ｎｇで１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に供し、次いで得られた産物をＮＣ膜に移し、膜を室温で５％スキムミルク粉末を用いて１時間シールし、室温で８倍に希釈した一次抗体と２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、室温で４５分間二次抗体とインキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄し、フィルムを洗浄した。ＥＣＬ試薬を添加して１分間反応させ、保存フィルムでシールし、暗室でＸ線フィルムを露光して現像してスキャンし、結果を図３に示した。図３から、８つの抗ＨＭＭＷ抗体はいずれも１０ｎｇのＨＭＭＷマイクロペプチドを認識することができ、したがって感度が検出要件を満たしていることがわかる。

実施例６：ウェスタンブロットによる、異なる腫瘍細胞におけるＨＭＭＷマイクロペプチドへの結合に対する抗ＨＭＭＷ抗体の能力の検出
頭頸部扁平上皮癌のＣＡＬ２７細胞、腎癌の７８６－Ｏ細胞、前立腺癌のＤＵ１４５細胞、及び大腸癌のＨＣＴ１１６細胞（全てＡｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ由来）を別々に３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで、９０％の密度まで培養した。細胞をトリプシン（Ｂｉｏｓｈａｒｐ、米国）で消化し、回収した。消化した細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、残渣をＰＢＳでリンスし、上清を廃棄した。ＲＩＰＡ溶解緩衝液を添加し、氷上で混合物を２０分間溶解した。溶解溶液を１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。１×ＳＤＳローディング緩衝溶液を添加し、溶液をピペッティングして均一に混合し、混合物を５分間沸騰させて変性させた。全タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分離した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に移した。膜を５％ＢＳＡを用いて室温で２時間シールし、８つの異なる抗ＨＭＭＷ抗体と４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。膜を二次抗体と室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。得られた生成物を高感度化学発光（ＥＣＬ）溶液を用いて現像し、Ｔａｎｏｎイメージングシステムによって画像化した。４種の腫瘍細胞におけるＨＭＭＷマイクロペプチドの発現を検出するための異なる抗ＨＭＭＷ抗体の能力を比較し、結果を図４に示した。

図４から、８つの抗ＨＭＭＷ抗体は、頭頸部扁平上皮癌のＣＡＬ２７細胞、腎癌の７８６－Ｏ細胞、前立腺癌のＤＵ１４５細胞、及び大腸癌のＨＣＴ１１６細胞におけるＨＭＭＷマイクロペプチドの発現を有効に検出することができることがわかる。

実施例７：抗ＨＭＭＷ抗体のヒト大腸癌細胞の増殖に及ぼす影響
ＨＭＭＷマイクロペプチドの発現レベルが高い大腸癌細胞ＨＣＴ１１６を、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで密度９０％まで培養し、細胞をトリプシンで消化し、回収した。細胞を培養溶液に再懸濁し、顕微鏡下で計数した。細胞濃度を３．０×１０^４細胞／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μｌずつ接種した。細胞を３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養した。細胞が壁に完全に接着した後、投与群として８つの抗ＨＭＭＷ抗体のうちの１つをそれぞれ４０ｎＭで添加し、陽性対照群としてパクリタキセルを１０μｇ／ｍｌ添加し、薬物を全く添加していない培養溶液は１ウェル当たり１００μｌで陰性対照であり、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内で４８時間培養した。９６ウェルプレートの各ウェルに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを２０μＬ添加し、細胞を４時間連続培養した。培養培地を吸引し、１ウェルあたり１００μＬのＤＭＳＯを用いて細胞を溶解させた。マイクロプレートリーダーを用いて、検出波長５７０ｎｍ及び参照波長６３０ｎｍにおける吸光度の値を測定した。増殖阻害（ＰＩ）は、ＰＩ（％）＝１－（投与群又は陽性対照群）／陰性群の式を用いて算出した。実験は独立して３回繰り返した。実験によって得られた結果は、平均値±標準偏差で表し、統計的Ｔ検定に供した。図５に示すように、^＊Ｐ＜０．０５を有意差と考え、^＊＊Ｐ＜０．０１を極めて有意な差と考えた。

図５から明らかにわかるように、陰性対照と比較して、４０ｎＭの用量の８つの抗ＨＭＭＷ抗体は、いずれも大腸癌細胞ＨＣＴ１１６の増殖を有意に阻害することができ、その阻害効果は癌の臨床治療に広く用いられている抗癌薬であるパクリタキセルと基本的に同等であり、したがって有効な抗癌薬として使用されることが証明された。

実施例８：抗ＨＭＭＷ抗体のヒト大腸癌細胞の遊走に及ぼす影響
ＨＭＭＷマイクロペプチドの発現レベルが高い大腸癌細胞ＨＣＴ１１６をトランスウェルチャンバー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）に１ウェルあたり１００μＬ接種し、同時に、投与群として４０ｎＭの８つの抗ＨＭＭＷ抗体のうち１つを１００μＬ各チャンバーにそれぞれ添加し、陽性対照群として４０ｎＭのセツキシマブを添加し、薬物を全く添加していない培養溶液が陰性対照群であった。その後、１０％ＦＢＳ含有完全培地０．６ｍＬをトランスウェルチャンバーに添加して細胞の遊走を刺激し、５％ＣＯ_２及び３７℃で２４時間培養した。ウェル内の培養液を廃棄した。細胞を、室温で９０％アルコールを用いて３０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットを用いて１０分間室温で染色した後、水で清潔にリンスした。上層の非遊走細胞を綿スワブで優しく拭き取った。顕微鏡下で細胞を観察し、４つの視野を選んで撮影し、細胞を計数した。細胞の遊走阻害率（ＭＩＲ）は、式：

にしたがって算出し、式中、Ｎ_試験は試験群（抗体投与群又は陽性対照群）の細胞の遊走数であり、Ｎ_対照は陰性対照群の細胞の遊走数である。結果を図６に示した。

図６から明らかにわかるように、陰性対照と比較して、４０ｎＭの用量の８つの抗ＨＭＭＷ抗体は、いずれも大腸癌細胞ＨＣＴ１１６の遊走を有意に阻害することができ、その阻害効果は癌の臨床治療に広く用いられている抗癌薬セツキシマブと基本的に同等であり、したがって、悪性腫瘍細胞の遊走を有効に阻害できる治療薬であることが証明された。

具体的な実施形態を説明しているが、出願人又は当技術分野の当業者にとって、上記実施形態の置換、改変、変更、改善及び実質的な等価物が存在し得るか、又は現在のところ予見することができない。したがって、提出された添付の特許請求の範囲及び改変され得る特許請求の範囲は、そのような置換、改変、変更、改善、及び実質的な等価物を全てカバーすることを意図している。

Claims

ヒトＨＭＭＷマイクロペプチドに特異的に結合する抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
（ａ）前記ＣＤＲＨ１が、配列番号１、１１、２１、３１、４１、５１、６１又は７１に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記ＣＤＲＨ２が、配列番号２、１２、２２、３２、４２、５２、６２又は７２に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記ＣＤＲＨ３が、配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３又は７３に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）前記ＣＤＲＬ１が、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４又は７４に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｅ）前記ＣＤＲＬ２が、配列番号５、１５、２５、３５、４５、５５、６５又は７５に記載のアミノ酸配列を有し；
（ｆ）前記ＣＤＲＬ３が、配列番号６、１６、２６、３６、４６、５６、６６又は７６に記載のアミノ酸配列を有する、抗体。
（１）前記ＣＤＲＨ１が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（２）前記ＣＤＲＨ１が配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（３）前記ＣＤＲＨ１が配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（４）前記ＣＤＲＨ１が配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（５）前記ＣＤＲＨ１が配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（６）前記ＣＤＲＨ１が配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（７）前記ＣＤＲＨ１が配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有する；又は
（８）前記ＣＤＲＨ１が配列番号７１に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ２が配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＨ３が配列番号７３に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１が配列番号７４に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ２が配列番号７５に記載のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ３が配列番号７６に記載のアミノ酸配列を有する、
請求項１に記載の抗体。
前記重鎖可変領域が、配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７若しくは７７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号７、１７、２７、３７、４７、５７、６７若しくは７７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８若しくは７８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８若しくは７８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
前記重鎖可変領域及び／又は前記軽鎖可変領域が、一本鎖可変断片ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’断片、二価抗体、三価抗体、四価抗体又はモノクローナル抗体の一部である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９若しくは７９に記載の重鎖可変領域コード配列、又は配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９若しくは７９に記載の重鎖可変領域コード配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び／又は配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは８０に記載の軽鎖可変領域コード配列、又は配列番号１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは８０に記載の軽鎖可変領域コード配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは少なくとも９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
大腸癌を治療するための薬物の製造における、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６に記載の医薬組成物又は請求項７～８のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
頭頸部扁平上皮癌、腎癌、前立腺癌及び大腸癌を診断するためのキットの製造における、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は請求項６に記載の医薬組成物又は請求項７～８のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。