JP2023553707A - 光学顕微鏡検査用の組織試料を光学的に透明化するための改良された方法 - Google Patents
光学顕微鏡検査用の組織試料を光学的に透明化するための改良された方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023553707A JP2023553707A JP2023536910A JP2023536910A JP2023553707A JP 2023553707 A JP2023553707 A JP 2023553707A JP 2023536910 A JP2023536910 A JP 2023536910A JP 2023536910 A JP2023536910 A JP 2023536910A JP 2023553707 A JP2023553707 A JP 2023553707A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- formula
- tissue sample
- embedding medium
- dehydrating
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N diisononyl phthalate Chemical compound CC(C)CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCC(C)C HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- MIYFJEKZLFWKLZ-UHFFFAOYSA-N Phenylmethyl benzeneacetate Chemical group C=1C=CC=CC=1COC(=O)CC1=CC=CC=C1 MIYFJEKZLFWKLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 13
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 13
- OSORMYZMWHVFOZ-UHFFFAOYSA-N phenethyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCCC1=CC=CC=C1 OSORMYZMWHVFOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VCYWCSZLXMMLLE-UHFFFAOYSA-N 4-Methoxybenzyl phenylacetate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1COC(=O)CC1=CC=CC=C1 VCYWCSZLXMMLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RQIJJMRWUPHQGB-UHFFFAOYSA-N furan-2-ylmethyl 2-phenylacetate Chemical compound C=1C=COC=1COC(=O)CC1=CC=CC=C1 RQIJJMRWUPHQGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 7
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940098888 phenethyl benzoate Drugs 0.000 claims description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 5
- HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N Acrolein Chemical compound C=CC=O HGINCPLSRVDWNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N potassium dichromate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Cr](=O)(=O)O[Cr]([O-])(=O)=O KMUONIBRACKNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- KPWDGTGXUYRARH-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trichloroethanol Chemical compound OCC(Cl)(Cl)Cl KPWDGTGXUYRARH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 claims description 2
- RLJMLMKIBZAXJO-UHFFFAOYSA-N lead nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Pb]O[N+]([O-])=O RLJMLMKIBZAXJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 claims description 2
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N thiodiglycol Chemical compound OCCSCCO YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OIFBSDVPJOWBCH-UHFFFAOYSA-N Diethyl carbonate Chemical compound CCOC(=O)OCC OIFBSDVPJOWBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 claims 1
- MHDVGSVTJDSBDK-UHFFFAOYSA-N dibenzyl ether Chemical class C=1C=CC=CC=1COCC1=CC=CC=C1 MHDVGSVTJDSBDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 26
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 22
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 17
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 abstract description 8
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N benzyl-alpha-carboxylic acid Natural products OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 abstract description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 abstract description 2
- -1 phenylacetic acid ester Chemical class 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 60
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- KBEBGUQPQBELIU-CMDGGOBGSA-N Ethyl cinnamate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 KBEBGUQPQBELIU-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 11
- KBEBGUQPQBELIU-UHFFFAOYSA-N cinnamic acid ethyl ester Natural products CCOC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 KBEBGUQPQBELIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- CYCSDIVVYJWIKD-UHFFFAOYSA-N 1,2-diphenylethyl acetate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OC(=O)C)CC1=CC=CC=C1 CYCSDIVVYJWIKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- ZOZIRNMDEZKZHM-UHFFFAOYSA-N phenyl-acetic acid phenethyl ester Natural products C=1C=CC=CC=1CCOC(=O)CC1=CC=CC=C1 ZOZIRNMDEZKZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxypropane Chemical compound COC(C)(C)OC HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- VHVOLFRBFDOUSH-NSCUHMNNSA-N Isosafrole Chemical compound C\C=C\C1=CC=C2OCOC2=C1 VHVOLFRBFDOUSH-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- VHVOLFRBFDOUSH-UHFFFAOYSA-N Isosafrole Natural products CC=CC1=CC=C2OCOC2=C1 VHVOLFRBFDOUSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010254 Jasminum officinale Nutrition 0.000 description 1
- 240000005385 Jasminum sambac Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZVWXRURMQSFSO-UHFFFAOYSA-N [2-(2-phenylethyl)phenyl] acetate Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1CCC1=CC=CC=C1 UZVWXRURMQSFSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- UXOLDCOJRAMLTQ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-chloro-2-hydroxyiminoacetate Chemical compound CCOC(=O)C(Cl)=NO UXOLDCOJRAMLTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M trans-cinnamate Chemical class [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000009637 wintergreen oil Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、光学顕微鏡検査用の生体組織またはヒト組織の透明な組織サンプルを製造する方法に関し、ａ）脱水溶剤を使用して組織サンプルを脱水するステップと、ｂ）脱水した組織サンプルを芳香族エステルを含む埋込媒体に移すことによって透明化するステップとを含む。芳香族エステルは、フェニル酢酸エステルである。埋込媒体としてこれまで用いられてきた安息香酸ベンジル／ベンジルアルコール混合物やサリチル酸メチル／安息香酸ベンジル混合物と比較して、芳香族エステルは、ジベンジルエーテルと全く同じように純粋な物質として使用できる利点を有する。純粋な物質は、既に所望の屈折率を有するので、埋込媒体を混合して屈折率を設定する必要がない。さらに、芳香族エステルは無毒で、揮発性が低く、透明な組織を低温で保存することができる。
Description
本発明は、請求項１のプリアンブルに係る方法、請求項１０に記載された生体組織試料を調製するためのキット、および請求項１３に記載された使用に関するものである。
組織試料の、例えば光シート顕微鏡による３次元的な画像化の実行を可能にするためには、透明な生体組織試料が必要である。生体試料の透明化を達成するために、特に、血色素であるヘモグロビンのヘム基と脂質とを生体試料から除去する必要がある。「脱水」処理では、組織は、水混和性有機溶媒と水との様々な混合物を用いて処理される。この処理は、組織から水分を完全に除去するために、次第に割合が増加する有機溶媒を用いて実施される。ここでは、例えば、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノールおよびエタノールなどの多くのオプションがある。エタノールは現在、病理組織の透明化に最もよく使われる脱水媒体である。全ての「脱水」処置の最終結果は、無水試料である。
様々な透明化方法の最後のステップは、屈折率を顕微鏡で観察する組織の屈折率に調整することである。Ｓｐａｌｔｅｈｏｌｚ（“Ｕｂｅｒ ｄａｓ Ｄｕｒｃｈｓｉｃｈｔｉｇｍａｃｈｅｎ ｖｏｎ ｍｅｎｓｃｈｌｉｃｈｅｎ ｕｎｄ ｔｉｅｒｉｓｃｈｅｎ Ｐｒａｐａｒａｔｅｎ”、［Ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ］、Ｓ． Ｈｉｒｚｅｌ、１９１１、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｒｅｉｃｈｓ－Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．２２９０４４）によれば、脱水された組織の屈折率は、骨について、ｎ＝１．５４７である。他の組織の屈折率は、彼が経験的に決定した最適な混合物に基づいて、およそ、ｎ＝１．５５１と推定することができる。このような高い屈折率を得るには、一般に水と混和しないか、わずかに混和する程度の芳香族化合物を使用する必要がある。Ｓｐａｌｔｅｈｏｌｚは、研究のために、冬緑油（サリチル酸メチル）と安息香酸ベンジルまたはイソサフロールとの混合物を、種々の組織に適合する混合比で使用した。
Ｓｐａｌｔｅｈｏｌｚの方法の変形例として、Ｄｏｄｔ、Ｌｅｉｓｃｈｎｅｒ、Ｓｃｈｉｅｒｌｏｈ、Ｊａｈｒｌｉｎｇ、Ｍａｕｃｈ、Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ、Ｄｅｕｓｓｉｎｇ、Ｅｄｅｒ、Ｚｉｅｇｌｇａｎｓｂｅｒｇｅｒ、およびＢｅｃｋｅｒの“Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ”、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７；４（４）：３３１－６．）が知られている。ここでは、埋込媒体として「Ｍｕｒｒａｙ’ｓ ｃｌｅａｒ」（安息香酸ベンジルとベンジルアルコールの２：１混合物で屈折率ｎ＝１．５５９）が使用される。他の変形例として、Ｂｅｃｋｅｒ、Ｊａｈｒｌｉｎｇ、Ｓａｇｈａｆｉ、Ｗｅｉｌｅｒ、およびＤｏｄｔ Ｈの“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＦＰ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎｓ”、（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（３）：ｅ３３９１６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３９１６が知られている。Ｓｐａｌｔｅｈｏｌｚの埋込媒体および多くの他の芳香族化合物が試験された。ジベンジルエーテル（ＤＢＥ、屈折率ｎ＝１．５６２）が最も適した化合物であることが判明し、組織透明化における事実上の代表的基準となった。ＤＢＥの利点は、溶液を混合してから屈折率を確認する必要がないので、使い勝手が良いことであり、純粋な物質として直接使用できる。
ＷＯ２０１７／０９３３２３Ａ１は、それまで使用されていた埋込媒体の無毒な代替品として、桂皮酸エチル（ＥＣｉ）および関連する桂皮酸エステルの使用を開示している。それは、ジベンジルエーテル、ベンジルアルコールまたは安息香酸ベンジルなどの組織処理に使用される他の芳香族化合物よりも低毒性を示す。所望の屈折率は、純粋な物質によって達成されるので、混合ステップをなくすことができ、それによって誤差の原因となり得る作業ステップをなくすことができる。
このように、脱水した試料の埋込媒体として適した純粋な液体物質の選択肢は、現在、ジベンジルエーテルと桂皮酸エチルという２つの化合物に限られている。しかし、この２つの物質にはそれぞれ欠点がある。ジベンジルエーテルは毒性がある。桂皮酸エチルは、毒性は低いが、融点が６～９℃なので、桂皮酸エチルで透明化した試料は、埋込媒体が結晶化するため冷蔵庫で保存できない。また、桂皮酸エチルは比較的高い蒸気圧を有する。
本発明の目的は、上記の欠点を克服し、特に、埋込媒体として混合物を調製するよりも少ない労力を伴い、毒性の高い埋込媒体を回避し、脱水した組織試料の冷蔵保存を可能にする、光学顕微鏡による検査用の生体組織の透明な組織試料の調製する方法を提供することである。
この目的は、本発明に従って、請求項１に記載の方法により達成される。この目的は、さらに、請求項１０に記載のキットおよび請求項１３に記載の使用によって達成される。
さらなる実施形態は、従属請求項の主題であり、または、以下に説明される。
さらなる実施形態は、従属請求項の主題であり、または、以下に説明される。
光学顕微鏡による検査のための生体組織の透明な組織試料を調製するための本発明に係る方法は、
ａ）脱水溶媒を用いて組織試料を脱水するステップと、
ｂ）脱水された組織試料を、組織と一致する屈折率を有する液体埋込媒体内に配置することにより、透明化するステップと、
を含む。
埋込媒体は、式Ｉまたは式ＩＶに対応する芳香族エステルを含む。
ここで、
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ３は、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ３または－ＯＣＨ３であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
ｎは、１または２であり、
または、
本発明に係るエステルは、好ましくは、式Ｉに対応する芳香族エステルである。
ａ）脱水溶媒を用いて組織試料を脱水するステップと、
ｂ）脱水された組織試料を、組織と一致する屈折率を有する液体埋込媒体内に配置することにより、透明化するステップと、
を含む。
埋込媒体は、式Ｉまたは式ＩＶに対応する芳香族エステルを含む。
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
ｎは、１または２であり、
または、
本発明に係るエステルは、好ましくは、式Ｉに対応する芳香族エステルである。
本発明に係る方法の目的は、光学顕微鏡のための生体またはヒト組織試料の光学的な透明化を達成することである。生体組織は、例えば、ヒト組織または動物組織である。
透明化方法の透明化ステップは、屈折率を、顕微鏡観察される組織の屈折率に調整することである。この目的のために、組織試料は、屈折率の調整のための溶媒である埋込媒体に移される。埋込媒体は、脱水処理に使用される溶媒と混和性がある必要がある。
一実施形態において、埋込媒体は、１０～１００体積％の芳香族エステルと、０～９０体積％の、約１．３、好ましくは約１．５の屈折率を有する光学的に適した不活性有機溶媒とを含む。例えば、埋込媒体は、９０～１００体積％の式Ｉに対応する芳香族エステルを含む。
他の実施形態において、埋込媒体は、１０～１００体積％の芳香族エステルと、０～９０体積％の、約２．０、好ましくは約１．６５の屈折率を有する光学的に適した不活性有機溶媒とを含む。例えば、埋込媒体は、９０～１００体積％の式Ｉに対応する芳香族エステルを含む。
本発明に係る全ての百分率は、体積％（ｖｏｌ％）で与えられる。
本発明に係る全ての百分率は、体積％（ｖｏｌ％）で与えられる。
好ましい実施形態において、埋込媒体は、式Ｉまたは式ＩＶ、好ましくは式Ｉに対応する芳香族エステルからなり、すなわち、芳香族エステルは純粋な物質として使用される。純粋な物質は、本明細書において、工業的に得られる純度のエステルを意味するものと理解される。
芳香族エステルは、好ましくは、芳香族アルコールを有するフェニル酢酸のエステルである。芳香族エステルは、より好ましくは、ベンジル２－フェニルアセテート、４－メトキシベンジルフェニルアセテート、安息香酸フェネチルまたは２－フリルメチルフェニルアセテートから選ばれ、特に好ましくはベンジル２－フェニルアセテートである。ベンジル２－フェニルアセテート（ＣＡＳ番号１０２－１６－９）は、工業製品として約９８．０％の純度を有する。４－メトキシベンジル－フェニルアセテート（ＣＡＳ番号１０２－１７－０）は、工業製品として約９９．０％の純度を有する。２－フェネチルフェニルアセテート（ＣＡＳ番号１０２－２０－５）は、工業製品として約９９，０％の純度を有する。２－フリルメチルフェニルアセテート（ＣＡＳ番号３６７０７－２８－５）は、工業製品として約９６．０％の純度を有する。安息香酸フェネチル（ＣＡＳ番号９４－４７－３）は、工業製品として約９８％の純度を有する。
脱水ステップａ）の目的は、無水組織試料を得ることである。好ましい実施形態において、組織から水分を完全に除去するために、組織試料は、好ましくは、下降水系列における種々の脱水組成物、すなわち、水混和性の有機溶媒の割合が次第に増加する複数の混合物を用いて、多数回に分けて処理される。脱水媒体として、アルコール類、エーテル類またはケトン類が使用される。適切な脱水溶媒は、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール（ＩＵＰＡＣ：２－メチルプロパン－２－オール）、テトラヒドロフランまたはアセトンである。本発明に係る方法において、脱水ステップａ）は、例えば、
－ エタノール濃度が次第に増加する水性エタノールからなり、脱水組成物のエタノール濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、または、
－ テトラヒドロフランの濃度が次第に増加する水性テトラヒドロフランからなり、脱水組成物のテトラヒドロフラン濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、または、
－ メタノールの濃度が次第に増加する水性メタノールからなり、脱水組成物のメタノール濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、または、
－ その他のアルコール、エーテルまたはケトンの水性混合物からなり、脱水組成物の溶媒濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、
脱水組成物の使用を含む。
－ エタノール濃度が次第に増加する水性エタノールからなり、脱水組成物のエタノール濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、または、
－ テトラヒドロフランの濃度が次第に増加する水性テトラヒドロフランからなり、脱水組成物のテトラヒドロフラン濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、または、
－ メタノールの濃度が次第に増加する水性メタノールからなり、脱水組成物のメタノール濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、または、
－ その他のアルコール、エーテルまたはケトンの水性混合物からなり、脱水組成物の溶媒濃度が３０体積％～１００体積％の範囲である、
脱水組成物の使用を含む。
本明細書において脱水媒体は、以下の特性を有する。
１．水および固定剤を上昇濃度系列によって組織から徐々に除去することができように、水と完全に混合可能である。
２．屈折率を脱水組織の屈折率と一致させる埋込媒体と完全に混和可能である、
１．水および固定剤を上昇濃度系列によって組織から徐々に除去することができように、水と完全に混合可能である。
２．屈折率を脱水組織の屈折率と一致させる埋込媒体と完全に混和可能である、
代替の実施形態において、脱水ステップａ）は、組織に含まれる水分との化学反応によって組織から水分を除去する、２，２－ジメトキシプロパン（ＤＭＰ）を用いて実施される。
本発明に係る方法の一実施形態において、組織試料は、ステップａ）において脱水され、ステップｂ）において光学的に透明化される前に、
・固定され、かつ／または、
・ホルムアルデヒドを用いて固定され、かつ／または、
・洗浄され、かつ／または、
・水を用いて洗浄され、かつ／または、
・非イオン性洗剤を含むアルカリ性水溶液中でインキュベートされ、かつ／または、
・洗剤溶液を用いて脱脂され（脱脂）、かつ／または、
・有機溶媒を用いて脱脂され（脱脂）、かつ／または、
・酸化試薬を用いて漂白され、かつ／または、
・アミノアルコールを用いて脱色される。
・固定され、かつ／または、
・ホルムアルデヒドを用いて固定され、かつ／または、
・洗浄され、かつ／または、
・水を用いて洗浄され、かつ／または、
・非イオン性洗剤を含むアルカリ性水溶液中でインキュベートされ、かつ／または、
・洗剤溶液を用いて脱脂され（脱脂）、かつ／または、
・有機溶媒を用いて脱脂され（脱脂）、かつ／または、
・酸化試薬を用いて漂白され、かつ／または、
・アミノアルコールを用いて脱色される。
本発明に係る方法の一実施形態においては、組織試料は、ステップａ）において脱水され、ステップｂ）において光学的に透明化される前に、固定され、かつ、固定化剤が、
－ ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、カルボジイミド、ピロ炭酸ジエチル、ビスイミドエステルもしくはグリオキサール、またはそれらの混合物などの架橋固定剤、および／または、
－ アルコールおよび他の有機溶媒、酸、重クロム酸カリウム、硝酸鉛、硫酸銅および塩化水銀、ならびにそれらの混合物などの凝固固定剤
から選択される。
－ ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、カルボジイミド、ピロ炭酸ジエチル、ビスイミドエステルもしくはグリオキサール、またはそれらの混合物などの架橋固定剤、および／または、
－ アルコールおよび他の有機溶媒、酸、重クロム酸カリウム、硝酸鉛、硫酸銅および塩化水銀、ならびにそれらの混合物などの凝固固定剤
から選択される。
本発明に係る方法は、好ましくは、組織調製ステップの後、および電気泳動ステップの後に実施される。したがって、本発明に係る方法を用いて処理される組織試料は、好ましくは、既に前処理されている。電気泳動による前処理は、好ましくは、ＤＥ １０ ２０１６ １２３ ４５８ Ｂ３に記載の電気泳動透明化法に従って実施される。電気泳動透明化の性能については、特許明細書ＤＥ １０ ２０１６ １２３ ４５８ Ｂ３を参照し、その内容は本明細書に組み込まれるものとする。
本発明に係る方法において、光学的に透明化された組織試料は、好ましくは、試料の内部構造の画像を得るために、さらなるステップにおいて顕微鏡を用いて検査される。顕微鏡は、光学顕微鏡であり、好ましくは光シート顕微鏡、共焦点顕微鏡、二光子顕微鏡または光投影トモグラフィ顕微鏡（ＯＰＴ）である。
これまで使用された埋込媒体であるジベンジルエーテル（ＤＢＥ）は、ｎ＝１．５６２の屈折率を有する。第２の純粋な物質である桂皮酸エチルは、ｎ＝１．５５９の屈折率を有する。
式Ｉに対応する芳香族エステルのうち、例えば、フェニルメチルベンジルアセテートはｎ＝１．５５５～１．５５８の屈折率、４－メトキシベンジルフェニルアセテートはｎ＝１．５５９の屈折率、２－フェネチルフェニルアセテートはｎ＝１．５５１の屈折率、２－フリルメチルフェニルアセテートはｎ＝１．５４８（計算値）の屈折率を有する。式Ｉに対応する芳香族エステルを脱水組織試料の組織透明化のための埋込媒体として使用することにより、サリチル酸メチル／安息香酸ベンジルおよび桂皮酸エチルを用いて処理した組織試料と同一の透明性が達成された。アルコキシ置換だけでなく、特に、フェニル酢酸エステルの短いアルキル置換もこの範囲の屈折率を提供し、これはＳｐａｌｔｅｈｏｌｚが決定した組織の屈折率と同様である。
Ｓｐａｌｔｅｈｏｌｚの研究は既に、異なる組織の屈折率が互いにわずかに異なることを示唆している。１９１１年に発表された彼の原著には、サリチル酸メチルとＢＢとの最適混合比に基づいて経験的に決定された屈折率が大きい順に、一連のヒト組織が記載されている。若い胚（重量に応じて５：１～３：１）＜成人の脱灰骨（５：３）ｎ＝１．５４７＜古い胚とほぼ同じ成人の筋組織（２：１）＜脳および脊髄（１：１）。このばらつきは、異なる組織の透明度および顕微鏡検査を用いた組織の検査、および、特に、顕微鏡を用いて実施できる定量的な分光判定に直接影響する。本発明に係る方法は、組織の屈折率に近似するように組織に応じて選択可能な種々の純粋な物質を埋込媒体として使用するという利点を提供する。
これまで一般的に埋込媒体として使用されてきた安息香酸ベンジル／ベンジルアルコール混合物（ＢＡＢＢ）およびサリチル酸メチル／安息香酸ベンジル混合物と比較して、式Ｉに対応する芳香族エステルは、ジベンジルエーテルと同様に、純粋な物質として使用できるという利点がある。純粋な物質であることによって既に所望の屈折率が達成されているので、埋込媒体を混合して屈折率を調整する必要がない。これにより、混合ステップが不要となり、したがって、余分な作業ステップおよびエラーの原因の可能性がなくなる。
式Ｉに対応する芳香族エステルは、また、低毒性を有する。これは、顕微鏡内の組織試料が使用者の気道のすぐ下に位置し、使用者が試料から立ち上る蒸気を吸い込む可能性があるため、埋込媒体として使用する場合に有利である。欧州化学品庁ＥＣＨＡによれば、酢酸フェニルメチルベンジルの毒性は、ジベンジルエーテルまたは安息香酸ベンジル／ベンジルアルコール混合物と異なり、毒性的に問題ない。
さらに、式Ｉに対応するフェニル酢酸エステルは、低揮発性であり、既知の埋込媒体よりも著しく低い蒸気圧を有するため、組織試料から上昇する蒸気が少なくなる。これは、式Ｉに対応する芳香族エステルの既に低い毒性をさらに低減する。
これまで埋込媒体として使用されてきた芳香族化合物の欠点は、その腐食性効果である。芳香族化合物はレンズと顕微鏡自体を攻撃し、これらの揮発性化合物の蒸気でさえ、時間の経過とともに顕微鏡の液体に面する表面を腐食させるのに十分であることが知られている。式Ｉに対応する芳香族エステルの揮発性が低いということは、本発明に係る埋込媒体が、腐食を引き起こし得る蒸気が大幅に少ないので、著しく高い材料適合性を提供することを意味する。要約すると、式Ｉに対応する芳香族エステルの低い揮発性は、臭気、呼吸器の刺激／毒性、ならびに顕微鏡に対する蒸気の腐食効果を低減する。
フェニルメチルベンジルアセテートは、さらに、ジャスミンとチョコレートの特徴を有する、心地よい甘さとフローラルの香りを有し、それにより実験室の作業者による埋込媒体の受け入れやすさが高まる。したがって、顕微鏡観察時に、従来使用されてきた埋込媒体のように、ステージから立ち上る不快な臭い（ジベンジルエーテルはプラスチックの不快な臭い、ベンジルアルコールはフェノールの臭いを有する）に悩まされることはない。
また、式Ｉおよび式ＩＶに対応するフェニル酢酸エステルは、透明化した試料を冷蔵庫で保存することを可能にする。例えば、フェニルメチルベンジルアセテートの融点は－１３．５４℃～－９℃の間であり、すなわち、この化合物は冷蔵庫に保存可能であり、氷上またはクールパック内での貯蔵または輸送さえも許容する。
光学顕微鏡用の生体組織試料の調製のための本発明に係るキットは、
－ 組織試料を脱水するための脱水溶媒と、
－ 脱水された組織試料を埋込媒体内に配置することによって当該組織試料を透明化するための埋込媒体と、を備え、
埋込媒体は、上記の式Ｉまたは式ＩＶの芳香族エステルである。好ましくは、本発明に係るキットにおける芳香族エステルは、ベンジル２－フェニルアセテート、４－メトキシベンジルフェニルアセテート、フェネチルベンゾエートまたは２－フリルメチルフェニルアセテート、好ましくはベンジル２－フェニルアセテートである。芳香族エステルは、好ましくは上述した濃度および純度で使用される。
－ 組織試料を脱水するための脱水溶媒と、
－ 脱水された組織試料を埋込媒体内に配置することによって当該組織試料を透明化するための埋込媒体と、を備え、
埋込媒体は、上記の式Ｉまたは式ＩＶの芳香族エステルである。好ましくは、本発明に係るキットにおける芳香族エステルは、ベンジル２－フェニルアセテート、４－メトキシベンジルフェニルアセテート、フェネチルベンゾエートまたは２－フリルメチルフェニルアセテート、好ましくはベンジル２－フェニルアセテートである。芳香族エステルは、好ましくは上述した濃度および純度で使用される。
キットにおける脱水溶媒は、好ましくはエーテル、ケトンまたはアルコールであり、好ましくは、溶媒は、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、２，２’－チオジエタノール、トリクロロエタノール、テトラヒドロフラン、またはアセトンから選択される。
本発明によれば、式Ｉまたは式ＩＶに対応する芳香族エステルは、光学顕微鏡検査のための生体、特にヒトの組織試料の調製のための埋込媒体として使用される。
ここで
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ３は、－Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ３またはＯＣＨ３であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、かつ、
ｎは、１または２であり、
または、
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、かつ、
ｎは、１または２であり、
または、
芳香族エステルは、好ましくは、ベンジル２－フェニルアセテート、４－メトキシベンジルフェニルアセテート、フェネチルベンゾエートまたは２－フリルメチルフェニルアセテート、より好ましくは、ベンジル２－フェニルアセテートである。芳香族エステルは、好ましくは、上述した濃度および純度で使用される。
種々の埋込媒体の蒸気圧は、文献で知られている。
図１は、様々な埋込媒体の蒸気圧を示す。本発明のフェニルメチルベンジルアセテート（ベンジルフェニルアセテート（ＢＰＡ））は、現在の技術水準で使用されている埋込媒体に比べて著しく低い蒸気圧を有する。ＢＰＡは、揮発性が最も低く、比較された埋込媒体の中で蒸気圧が最も低い。ＢＰＡの（２５℃における）蒸気圧は、桂皮酸エチルの蒸気圧よりも約２７５倍低い。また、ＢＡＢＢおよびＢＢＭＳの２つの埋込媒体も同様に、著しく（約１８０倍）高い蒸気圧を有する。
図１は、様々な埋込媒体の蒸気圧を示す。本発明のフェニルメチルベンジルアセテート（ベンジルフェニルアセテート（ＢＰＡ））は、現在の技術水準で使用されている埋込媒体に比べて著しく低い蒸気圧を有する。ＢＰＡは、揮発性が最も低く、比較された埋込媒体の中で蒸気圧が最も低い。ＢＰＡの（２５℃における）蒸気圧は、桂皮酸エチルの蒸気圧よりも約２７５倍低い。また、ＢＡＢＢおよびＢＢＭＳの２つの埋込媒体も同様に、著しく（約１８０倍）高い蒸気圧を有する。
図１の拡大図によれば、ＢＰＡは、ＤＢＥよりもさらに揮発性が（約４倍）低いことが分かる。ＤＢＥは、同様に２つの芳香環基を含み、著しく低い蒸気圧によりＥＣｉよりも揮発性が低く、（ＢＢとの混合物に含まれる）サリチル酸メチルおよびＥＣｉよりも低い値を有する。
約０．２５ｍｌ（０．５×０．５×１ｃｍ３）の体積を有する組織試料（豚肺）を、エタノールを用いて数回に分けて脱水した。最終回では高純度エタノールが使用され、脱水された組織試料が撮影された。その結果を図２の左側に示す。次に、この組織試料を５ｍｌの各埋込媒体内に３時間配置した。使用した埋込媒体は、サリチル酸メチルと安息香酸ベンジルとの混合物、および、本発明のベンジルフェニルアセテートである。透明化ステップの結果も撮影され、図２の右側に示した。
サリチル酸メチル／安息香酸ベンジルは、既に組織試料の透明化が良好であることがわかる。しかし、本発明のベンジルフェニルアセテートを用いて達成された透明性は、さらに良好であった。
本発明は、上述した実施形態のいずれにも限定されず、様々な方法で変更することが可能である。
特許請求の範囲、明細書および図面から明らかであり方法のステップを含む全ての特徴および利点は、個別におよび多種多様な組み合わせのいずれにおいても、本発明において必須であり得る。
特許請求の範囲、明細書および図面から明らかであり方法のステップを含む全ての特徴および利点は、個別におよび多種多様な組み合わせのいずれにおいても、本発明において必須であり得る。
Claims (13)
- 光学顕微鏡による検査のための生体組織の透明な組織試料を調製する方法であって、
ａ）脱水溶媒を用いて前記組織試料を脱水するステップと、
ｂ）脱水された前記組織試料を、式Ｉまたは式ＩＶに対応する芳香族エステルを含む埋込媒体内に配置することによって透明化するステップと、を含む方法。
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、かつ、
ｎは、１または２であり、
または、
- 前記埋込媒体が、１０～１００体積％の芳香族エステルと、０～９０体積％の約１．３、好ましくは１．５の屈折率を有する光学的に適した不活性有機溶媒とを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記埋込媒体が、１０～１００体積％の芳香族エステルと、０～９０体積％の、屈折率が約２．０、好ましくは１．６５の光学的に適した不活性有機溶媒とを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記埋込媒体が、式Ｉまたは式ＩＶに対応する芳香族エステルからなる、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記芳香族エステルが、ベンジル２－フェニルアセテート、４－メトキシベンジルフェニルアセテート、フェネチルベンゾエートまたは２－フリルメチルフェニルアセテート、好ましくはベンジル２－フェニルアセテートである、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記脱水するステップａ）が、水性アルコール、ケトンまたはエーテルの脱水組成物の使用を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ステップａ）において脱水され、前記ステップｂ）において光学的に透明化される前に、前記組織試料が、
・固定され、かつ／または、
・ホルムアルデヒドを用いて固定され、かつ／または、
・洗浄され、かつ／または、
・水を用いて洗浄され、かつ／または、
・アルカリ水溶液内においてインキュベートされ、かつ／または、
・洗剤溶液を用いて脱脂され、かつ／または、
・有機溶媒を用いて脱脂され、かつ／または、
・酸化試薬を用いて漂白され、かつ／または、
・アミノアルコールを用いて脱色される、
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。 - 前記ステップａ）において脱水され、前記ステップｂ）において光学的に透明化される前に、前記組織試料が、固定され、その固定化剤が、好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、カルボジイミド、ピロ炭酸ジエチル、ビスイミドエステルもしくはグリオキサールまたはそれらの混合物などの架橋性固定化剤、および／または、アルコールおよび他の有機溶媒、酸、重クロム酸カリウム、硝酸鉛、硫酸銅および塩化水銀ならびにそれらの混合物などの凝固性固定化剤から選択される、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
- 光学的に透明化された前記組織試料が、さらなるステップにおいて、該試料の内部構造の画像を得るために顕微鏡下で検査され、前記顕微鏡が、光学顕微鏡である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
- 光学顕微鏡用の生体組織試料を調製するためのキットであって、
－ 前記組織試料を脱水するための脱水溶媒と、
－ 脱水された前記組織試料を埋込媒体内に配置することにより透明化するための埋込媒体と、
を備え、
前記脱水溶媒が、アルコール、ケトンまたはエーテルであり、かつ、
前記埋込媒体が、式Ｉまたは式ＩＶの芳香族エステルであるキット。
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、かつ、
ｎは、１または２であり、
または、
- 前記芳香族エステルが、ベンジル２－フェニルアセテート、４－メトキシベンジルフェニルアセテート、フェネチルベンゾエートまたは２－フリルメチルフェニルアセテート、好ましくはベンジル２－フェニルアセテートである、請求項１０に記載のキット。
- 前記脱水溶媒が、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、２，２’－チオジエタノール、トリクロロエタノール、テトラヒドロフランまたはアセトンから選択される、請求項１０または請求項１１に記載のキット。
- 式Ｉに対応する、または式ＩＶに対応する芳香族エステルの、光学顕微鏡による検査のための生体組織試料の調製のための埋込媒体としての使用。
Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ３または－ＣＨ２－ＣＨ３であり、
Ｒ２は、式ＩＩまたは式ＩＩＩの残基であり、
Ｒ４は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、
Ｒ５は、－Ｈまたは－ＣＨ３であり、かつ、
ｎは、１または２であり、
または、
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20215089.2 | 2020-12-17 | ||
| EP20215089.2A EP4016044A1 (de) | 2020-12-17 | 2020-12-17 | Verbessertes verfahren zur optischen klärung einer gewebeprobe zur lichtmikroskopischen untersuchung |
| PCT/EP2021/085981 WO2022129221A1 (de) | 2020-12-17 | 2021-12-15 | Verbessertes verfahren zur optischen klärung einer gewebeprobe zur lichtmikroskopischen untersuchung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023553707A true JP2023553707A (ja) | 2023-12-25 |
Family
ID=73855393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023536910A Pending JP2023553707A (ja) | 2020-12-17 | 2021-12-15 | 光学顕微鏡検査用の組織試料を光学的に透明化するための改良された方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240102898A1 (ja) |
| EP (1) | EP4016044A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023553707A (ja) |
| KR (1) | KR20230124000A (ja) |
| CN (1) | CN116802492A (ja) |
| AU (1) | AU2021404479A1 (ja) |
| CA (1) | CA3204293A1 (ja) |
| MX (1) | MX2023007317A (ja) |
| WO (1) | WO2022129221A1 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD229044A1 (de) | 1984-07-30 | 1985-10-30 | Tech Hochschule C Schorlemmer | Elektrodenanordnung fuer elektroabscheider zur abscheidung hochohmiger staeube |
| WO2017093323A1 (en) | 2015-12-01 | 2017-06-08 | Universität Duisburg-Essen | Non-hazardous optical clearing of biological samples |
| DE102016123458B3 (de) | 2016-12-05 | 2018-03-15 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin | Verfahren zur Herstellung transparenter biologischer Präparate für eine lichtmikroskopische Untersuchung |
-
2020
- 2020-12-17 EP EP20215089.2A patent/EP4016044A1/de active Pending
-
2021
- 2021-12-15 US US18/257,565 patent/US20240102898A1/en active Pending
- 2021-12-15 JP JP2023536910A patent/JP2023553707A/ja active Pending
- 2021-12-15 CN CN202180085429.3A patent/CN116802492A/zh active Pending
- 2021-12-15 AU AU2021404479A patent/AU2021404479A1/en active Pending
- 2021-12-15 KR KR1020237023597A patent/KR20230124000A/ko unknown
- 2021-12-15 WO PCT/EP2021/085981 patent/WO2022129221A1/de active Application Filing
- 2021-12-15 CA CA3204293A patent/CA3204293A1/en active Pending
- 2021-12-15 MX MX2023007317A patent/MX2023007317A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116802492A (zh) | 2023-09-22 |
| MX2023007317A (es) | 2023-07-04 |
| KR20230124000A (ko) | 2023-08-24 |
| WO2022129221A1 (de) | 2022-06-23 |
| US20240102898A1 (en) | 2024-03-28 |
| AU2021404479A9 (en) | 2024-04-18 |
| CA3204293A1 (en) | 2022-06-23 |
| EP4016044A1 (de) | 2022-06-22 |
| AU2021404479A1 (en) | 2023-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5967528B2 (ja) | 生物材料を透明化する方法および生物材料用透明化処理キット | |
| EP3035026A1 (en) | Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof | |
| WO1997042203A1 (fr) | Procede et dispositif de synthese de composes marques | |
| EP3384270A1 (en) | Non-hazardous optical clearing of biological samples | |
| JP2023553707A (ja) | 光学顕微鏡検査用の組織試料を光学的に透明化するための改良された方法 | |
| JP5048215B2 (ja) | 組織学的、解剖学的及び細胞学的サンプルの調製用組成物 | |
| Bencosme | A trichrome staining method for routine use | |
| US20240110853A1 (en) | Method for optically clearing a tissue sample using an embedding medium | |
| JP2008239487A (ja) | 難浸透性組織迅速固定液 | |
| JP2020026975A (ja) | 生体試料の透明化方法及び生体試料脱色剤 | |
| EP3994439A1 (en) | Method for preparing biological material for microscopy analysis | |
| JP2602789B2 (ja) | 組織標本作製用の脱水剤を置換するための脂溶性置換剤及び前記脂溶性置換剤を用いた組織標本作製方法 | |
| Jalufka et al. | Hydrophobic and hydrogel-based methods for passive tissue clearing | |
| JPH0368865A (ja) | 病理組織の検査方法およびそれに用いる脱水処理剤 | |
| Becker et al. | Chemical clearing of brains | |
| Yu et al. | Endogenous fluorescence preservation from solvent-based optical clearing | |
| Kostilenko et al. | A method for making histological preparations equivalent to semithin sections with large examination areas for multipurpose morphological studies | |
| FR2731162A1 (fr) | Procede d'extraction d'au moins un actif a partir de cellules vegetales indifferenciees | |
| Yu et al. | Optical clearing for multiscale tissues and the quantitative evaluation of clearing methods in mouse organs | |
| CN112652222A (zh) | 家蚕雌蛾的卵巢内受精过程及卵巢的模型展示方法 | |
| CN116399674A (zh) | 一种组织样本脱色试剂及处理组织的方法 | |
| HU230296B1 (hu) | Eljárás optikai vizsgálatok célját szolgáló, nagy vastagságú preparátumok előállítására | |
| Bolon et al. | Ultrastructural Evaluation of Developing Mice | |
| Mascaro et al. | Taner Akkin | |
| Thrane | Lars Thrane, Thomas Jørgensen, Jörg Männer |