JP2023551134A - Ｃｄｃ７阻害剤としての塩及びその結晶形 - Google Patents
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Abstract
Ｃｄｃ７阻害剤としての塩及びその結晶形を開示し、具体的には、式（ＩＩ）化合物及びその結晶形、及びそれらの製造方法並びに腫瘍を予防又は治療するための薬物の製造におけるその使用を開示する。TIFF2023551134000042.tif36170
Description
関連出願の相互参照
本開示は、２０２０年１１月３０日に中国国家知識産権局に提出された中国特許出願第２０２０１１３８３４１８．７号の優先権と利益を主張し、前記特許出願の開示内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、２０２０年１１月３０日に中国国家知識産権局に提出された中国特許出願第２０２０１１３８３４１８．７号の優先権と利益を主張し、前記特許出願の開示内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本開示は、医薬品化学の分野に属し、具体的には、Ｃｄｃ７阻害剤としての塩及びその結晶形に関し、より具体的には、式（ＩＩ）化合物及びその結晶形に関し、さらに、前記塩及び結晶形の製造方法並びに腫瘍を予防又は治療するための薬物の製造におけるそれらの使用に関する。
本開示は、医薬品化学の分野に属し、具体的には、Ｃｄｃ７阻害剤としての塩及びその結晶形に関し、より具体的には、式（ＩＩ）化合物及びその結晶形に関し、さらに、前記塩及び結晶形の製造方法並びに腫瘍を予防又は治療するための薬物の製造におけるそれらの使用に関する。
Ｃｄｃ７はセリン／トレオニンキナーゼであり、核内ではＡＳＫ（ａｃｔｉｖａｔｏｒ
ｏｆ Ｓ ｐｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ、別称ＤＢＦ４）と結合し、ＤＮＡ複製開始複合物の重要な要素であるミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭタンパク質）をリン酸化することにより、ＭＣＭを活性化させて複製開始複合体の形成を促進するとともに、ＡＴＲ／Ｃｈｋ１経路に関与することで細胞周期のＳ期チェックポイントの重要な調節因子として細胞周期の停止及びＤＮＡの修復を促進する。Ｃｄｃ７はヒトの様々な腫瘍細胞で異常に高発現され、このような異常な高発現は腫瘍の増殖、転移及び化学療法薬耐性のいずれとも高い相関性を示すことから、現在Ｃｄｃ７は腫瘍研究において重要なマーカーとターゲットになっている。
ｏｆ Ｓ ｐｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ、別称ＤＢＦ４）と結合し、ＤＮＡ複製開始複合物の重要な要素であるミニ染色体維持タンパク質（ＭＣＭタンパク質）をリン酸化することにより、ＭＣＭを活性化させて複製開始複合体の形成を促進するとともに、ＡＴＲ／Ｃｈｋ１経路に関与することで細胞周期のＳ期チェックポイントの重要な調節因子として細胞周期の停止及びＤＮＡの修復を促進する。Ｃｄｃ７はヒトの様々な腫瘍細胞で異常に高発現され、このような異常な高発現は腫瘍の増殖、転移及び化学療法薬耐性のいずれとも高い相関性を示すことから、現在Ｃｄｃ７は腫瘍研究において重要なマーカーとターゲットになっている。
本開示の一態様において、式（ＩＩ）化合物を提供する。
本開示の別の態様において、さらに、式（ＩＩ）化合物の結晶形を提供する。
本開示の一部の実施形態において、前記式（ＩＩ）化合物の結晶形は、
Ｘ線粉末回折パターンが２θ値１１．４６±０．２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ、
Ｘ線粉末回折パターンが２θ値５．８６±０．２０°、１７．６４±０．２０°及び２４．８９±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂ、
Ｘ線粉末回折パターンが２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°及び２２．１８±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃから選ばれる。
Ｘ線粉末回折パターンが２θ値１１．４６±０．２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ、
Ｘ線粉末回折パターンが２θ値５．８６±０．２０°、１７．６４±０．２０°及び２４．８９±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂ、
Ｘ線粉末回折パターンが２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°及び２２．１８±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃから選ばれる。
本開示の別の態様において、さらに、Ｘ線粉末回折パターンが２θ値１１．４６±０．
２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａを提供する。
２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａを提供する。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、Ｃｕ Ｋα照射が用いられるそのＸ線粉末回折パターンにおいて２θ値１１．４６±０．２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°に回折ピークがある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値１１．４６±０．２０°、１２．０６±０．２０°、１６．９６±０．２０°、１７．６０±０．２０°、１８．４８±０．２０°、１９．５５±０．２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値６．４６°±０．２０°、９．３６°±０．２０°、１１．４６°±０．２０°、１２．０６°±０．２０°、１２．３９°±０．２０°、１２．８９°±０．２０°、１３．３７°±０．２０°、１３．８７°±０．２０°、１４．０９°±０．２０°、１６．１０°±０．２０°、１６．９６°±０．２０°、１７．１９°±０．２０°、１７．６０°±０．２０°、１８．４８°±０．２０°、１８．７５°±０．２０°、１９．３７°±０．２０°、１９．５５°±０．２０°、２１．２１°±０．２０°、２１．６５°±０．２０°、２２．３６°±０．２０°、２３．０６°±０．２０°、２３．４２°±０．２０°、２３．７４°±０．２０°、２４．０３°±０．２０°、２５．１６°±０．２０°、２５．４７°±０．２０°、２６．５９°±０．２０°、２７．３２°±０．２０°、２８．１１°±０．２０°、２８．７７°±０．２０°、２９．７３°±０．２０°、３１．８１°±０．２０°、３３．０９°±０．２０°、３３．８０°±０．２０°、３４．１９°±０．２０°、３５．４９°±０．２０°、３５．９９°±０．２０°、３７．６６°±０．２０°、３８．１４°±０．２０°、３８．７７°±０．２０°及び３９．３８°±０．２０°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値６．４６°、９．３６°、１１．４６°、１２．０６°、１２．３９°、１２．８９°、１３．３７°、１３．８７°、１４．０９°、１６．１０°、１６．９６°、１７．１９°、１７．６０°、１８．４８°、１８．７５°、１９．３７°、１９．５５°、２１．２１°、２１．６５°、２２．３６°、２３．０６°、２３．４２°、２３．７４°、２４．０３°、２５．１６°、２５．４７°、２６．５９°、２７．３２°、２８．１１°、２８．７７°、２９．７３°、３１．８１°、３３．０９°、３３．８０°、３４．１９°、３５．４９°、３５．９９°、３７．６６°、３８．１４°、３８．７７°及び３９．３８°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＸ線粉末回折パターンが図１に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、式（ＩＩ）化合物の結晶形ＡのＸ線粉末回折パターンは表１に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＤＳＣ曲線が２３０．７℃±３℃で１つの吸熱ピークの開始点がある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＤＳＣ曲線が図４に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＴＧＡ曲線における２００．０℃±３℃時の重量損失が０．９４±０．２％である。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、そのＴＧＡ曲線が図５に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、その赤外スペクトルが３０３３．
８８ｃｍ－１±５ｃｍ－１、３２２５．６９ｃｍ－１±５ｃｍ－１、３０８７．８８ｃｍ－１±５ｃｍ－１、２９４５．００ｃｍ－１±５ｃｍ－１、２９２５．６２ｃｍ－１±５ｃｍ－１、２８３７．８５ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１６８０．２０ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１６６２．７５ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１５８２．３８ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１５５１．７７ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１４７５．４７ｃｍ－１±５ｃｍ－１及び１４３８．４３ｃｍ－１±５ｃｍ－１における特徴的な吸収ピークを含む。
８８ｃｍ－１±５ｃｍ－１、３２２５．６９ｃｍ－１±５ｃｍ－１、３０８７．８８ｃｍ－１±５ｃｍ－１、２９４５．００ｃｍ－１±５ｃｍ－１、２９２５．６２ｃｍ－１±５ｃｍ－１、２８３７．８５ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１６８０．２０ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１６６２．７５ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１５８２．３８ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１５５１．７７ｃｍ－１±５ｃｍ－１、１４７５．４７ｃｍ－１±５ｃｍ－１及び１４３８．４３ｃｍ－１±５ｃｍ－１における特徴的な吸収ピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、その赤外吸収スペクトルが図６に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、その紫外吸収スペクトルが２５９．０ｎｍ±３ｎｍ、２１４．４ｎｍ±３ｎｍ及び３２２．６ｎｍ±３ｎｍに特徴的な吸収ピークがある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ａは、その紫外吸収スペクトルが図１１に示すとおりである。
本開示の別の態様において、さらに、Ｘ線粉末回折パターンが２θ値５．８６±０．２０°、１７．６４±０．２０°及び２４．８９±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂを提供する。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、Ｃｕ Ｋα照射が用いられるそのＸ線粉末回折パターンにおいて２θ値５．８６±０．２０°、１７．６４±０．２０°及び２４．８９±０．２０°に回折ピークがある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値５．８６±０．２０°、１０．１７±０．２０°、１１．７３±０．２０°、１５．８３±０．２０°、１７．６４±０．２０°、２３．５９±０．２０°、２４．８９±０．２０°及び２５．８０±０．２０°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値５．８６°±０．２０°、１０．１７°±０．２０°、１１．７３°±０．２０°、１２．５７°±０．２０°、１４．１５°±０．２０°、１４．４０°±０．２０°、１５．２３°±０．２０°、１５．８３°±０．２０°、１６．２６°±０．２０°、１６．７１°±０．２０°、１７．６４°±０．２０°、１８．０４°±０．２０°、１８．７３°±０．２０°、１９．９９°±０．２０°、２０．５７°±０．２０°、２１．０８°±０．２０°、２３．５９°±０．２０°、２４．３６°±０．２０°、２４．８９°±０．２０°、２５．４１°±０．２０°、２５．８０°±０．２０°、２７．２０°±０．２０°、２７．９０°±０．２０°、２８．９０°±０．２０°、２９．３９°±０．２０°、２９．７０°±０．２０°、３０．５２°±０．２０°、３０．８１°±０．２０°、３１．９９°±０．２０°、３４．２９°±０．２０°、３５．８３°±０．２０°、３９．６４°±０．２０°、２８．９０°±０．２０°、２９．３９°±０．２０°、２９．７０°±０．２０°、３０．５２°±０．２０°、３０．８１°±０．２０°、３１．９９°±０．２０°、３４．２９°±０．２０°、３５．８３°±０．２０°及び３９．６４°±０．２０°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値５．８６°、１０．１７°、１１．７３°、１２．５７°、１４．１５°、１４．４０°、１５．２３°、１５．８３°、１６．２６°、１６．７１°、１７．６４°、１８．０４°、１８．７３°、１９．９９°、２０．５７°、２１．０８°、２３．５９°、２
４．３６°、２４．８９°、２５．４１°、２５．８０°、２７．２０°、２７．９０°、２８．９０°、２９．３９°、２９．７０°、３０．５２°、３０．８１°、３１．９９°、３４．２９°、３５．８３°、３９．６４°、２８．９０°、２９．３９°、２９．７０°、３０．５２°、３０．８１°、３１．９９°、３４．２９°、３５．８３°及び３９．６４°における特徴的なピークを含む。
４．３６°、２４．８９°、２５．４１°、２５．８０°、２７．２０°、２７．９０°、２８．９０°、２９．３９°、２９．７０°、３０．５２°、３０．８１°、３１．９９°、３４．２９°、３５．８３°、３９．６４°、２８．９０°、２９．３９°、２９．７０°、３０．５２°、３０．８１°、３１．９９°、３４．２９°、３５．８３°及び３９．６４°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＸ線粉末回折パターンが図２に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、式（ＩＩ）化合物の結晶形ＢのＸ線粉末回折パターンは表２に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＤＳＣ曲線が６５．１℃±３
℃、１１３．７℃±３℃、２０８．８℃±３℃及び２２１．１℃±３℃で吸熱ピークの開始点がある。
℃、１１３．７℃±３℃、２０８．８℃±３℃及び２２１．１℃±３℃で吸熱ピークの開始点がある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＤＳＣ曲線が図７に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＴＧＡ曲線における１５０．０℃±３℃時の重量損失が３．５８±０．２％である。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｂは、そのＴＧＡ曲線が図８に示すとおりである。
本開示の別の態様において、Ｘ線粉末回折パターンが２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°及び２２．１８±０．２０°における特徴的なピークを含む式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃを提供する。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、Ｃｕ Ｋα照射が用いられるそのＸ線粉末回折パターンにおいて２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°及び２２．１８±０．２０°に回折ピークがある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°、１３．９５±０．２０°、１５．０１±０．２０°、１５．７２±０．２０°、２０．６１±０．２０°、２２．１８±０．２０°及び２３．８２±０．２０°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値７．４０°±０．２０°、１０．５０°±０．２０°、１１．２１°±０．２０°、１１．８１°±０．２０°、１３．０５°±０．２０°、１３．９５°±０．２０°、１５．０１°±０．２０°、１５．７２°±０．２０°、１６．２８°±０．２０°、１７．６４°±０．２０°、１８．３５°±０．２０°、１８．７３°±０．２０°、１９．５３°±０．２０°、２０．１４°±０．２０°、２０．６１°±０．２０°、２２．１８°±０．２０°、２２．５１°±０．２０°、２３．８２°±０．２０°、２４．３７°±０．２０°、２５．４９°±０．２０°、２６．３６°±０．２０°、２７．１９°±０．２０°、２８．９３°±０．２０°、３０．７０°±０．２０°、３１．６０°±０．２０°、３２．５０°±０．２０°及び３４．３３°±０．２０°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＸ線粉末回折パターンが２θ値７．４０°、１０．５０°、１１．２１°、１１．８１°、１３．０５°、１３．９５°、１５．０１°、１５．７２°、１６．２８°、１７．６４°、１８．３５°、１８．７３°、１９．５３°、２０．１４°、２０．６１°、２２．１８°、２２．５１°、２３．８２°、２４．３７°、２５．４９°、２６．３６°、２７．１９°、２８．９３°、３０．７０°、３１．６０°、３２．５０°及び３４．３３°における特徴的なピークを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＸ線粉末回折パターンが図３に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、式（ＩＩ）化合物の結晶形ＣのＸ線粉末回折パターンは表３に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＤＳＣ曲線が２１９．９℃±３℃で１つの吸熱ピークの開始点がある。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＤＳＣ曲線が図９に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＴＧＡ曲線における１７０．０℃±３℃時の重量損失が０．７２±０．２％である。
本開示の一部の実施形態において、前記結晶形Ｃは、そのＴＧＡ曲線が図１０に示すとおりである。
本開示の一部の実施形態において、前記Ｘ線粉末回折パターンは、Ｃｕ Ｋα照射によるＸ線粉末回折パターンである。
本開示において、式（Ｉ）化合物は以下に示される構造を有する。
本開示のもう一つの態様において、前記式（ＩＩ）化合物の結晶形の製造方法として、
（１）以下に示される式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）ステップ（１）の混合物にマレイン酸を加えるステップと、
（３）濾過し、乾燥して前記結晶形Ａ又は結晶形Ｃを得るステップと、
（４）前記結晶形Ａとアセトニトリル及び水を混合し、固体が溶解した後、溶媒を揮発して乾固させて、前記結晶形Ｂを得るステップと、
を含む方法を提供する。
（１）以下に示される式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）ステップ（１）の混合物にマレイン酸を加えるステップと、
（３）濾過し、乾燥して前記結晶形Ａ又は結晶形Ｃを得るステップと、
（４）前記結晶形Ａとアセトニトリル及び水を混合し、固体が溶解した後、溶媒を揮発して乾固させて、前記結晶形Ｂを得るステップと、
を含む方法を提供する。
本開示の一部の実施形態において、前記式（ＩＩ）化合物の結晶形の製造方法は、前記結晶形Ａの製造方法であり、
（１）２０～３０℃で、前記式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）撹拌しながら５℃に冷却した後、ステップ（１）の混合物にマレイン酸を加えて、５～１３℃で６時間撹拌するステップと、
（３）濾過し、乾燥して前記結晶形Ａを得るステップとを含む。
（１）２０～３０℃で、前記式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）撹拌しながら５℃に冷却した後、ステップ（１）の混合物にマレイン酸を加えて、５～１３℃で６時間撹拌するステップと、
（３）濾過し、乾燥して前記結晶形Ａを得るステップとを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記式（ＩＩ）化合物の結晶形の製造方法は、前記結晶形Ｂの製造方法であり、前記結晶形Ａとアセトニトリル及び水を混合し、固体が溶解した後、４０℃で溶媒を揮発して乾固させて、前記結晶形Ｂを得るステップを含む。
本開示の一部の実施形態において、前記式（ＩＩ）化合物の結晶形の製造方法は、前記結晶形Ｃの製造方法であり、
（１）２０～３０℃で、前記式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）７５℃で撹拌しながらステップ（１）の混合物にマレイン酸を加え、７５℃で３０分間撹拌し、４０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却して、引き続き２時間撹拌するステップと、
（３）濾過し、乾燥して前記結晶形Ｃを得るステップとを含む。
（１）２０～３０℃で、前記式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）７５℃で撹拌しながらステップ（１）の混合物にマレイン酸を加え、７５℃で３０分間撹拌し、４０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却して、引き続き２時間撹拌するステップと、
（３）濾過し、乾燥して前記結晶形Ｃを得るステップとを含む。
本開示のもう一つの態様において、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂ又は式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃを含む結晶組成物を提供し、前記式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂ又は式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃは前記結晶組成物の重量の５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める。前記各結晶組成物には、式（ＩＩ）化合物の他の結晶又
は非結晶形態がそれぞれ少量で含有されてもよい。
は非結晶形態がそれぞれ少量で含有されてもよい。
本開示のもう一つの態様において、前記化合物又は前記結晶形と、任意に、薬学的に許容される添加物とを含む医薬組成物を提供する。
本開示のもう一つの態様において、さらに、Ｃｄｃ７阻害剤の製造における前記化合物又は前記結晶形又は前記医薬組成物の使用を提供する。
本開示は、さらに、Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患（例えば、腫瘍）を予防又は治療するための薬物の製造における前記化合物又は前記結晶形又は前記結晶組成物又は前記医薬組成物の使用を提供する。
本開示は、さらに、必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに治療有効量の前記化合物又は前記結晶形又は前記結晶組成物又は前記医薬組成物を与えることを含むＣｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患を予防又は治療する方法を提供する。
本開示は、さらに、Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患の予防又は治療における前記化合物又は前記結晶形又は前記結晶組成物又は前記医薬組成物の使用を提供する。
本開示は、さらに、Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患を予防又は治療するための前記化合物又は前記結晶形又は前記結晶組成物又は前記医薬組成物を提供する。
本開示は、さらに、Ｃｄｃ７阻害剤として使用される前記化合物又は前記結晶形又は前記結晶組成物又は前記医薬組成物を提供する。
本開示は、さらに、Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患を予防又は治療する薬物として使用される前記化合物又は前記結晶形又は前記結晶組成物又は前記医薬組成物を提供する。
本開示の一部の実施形態において、前記Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患は、腫瘍であり、例えば、結腸・直腸がん又は膵臓がんである。
本開示の一部の実施形態において、前記Ｃｄｃ７阻害剤は、腫瘍を治療する薬物であり、例えば、結腸・直腸がん又は膵臓がんを治療する薬物である。
本開示の化合物及び結晶形は製造プロセスがシンプルで、且つ結晶形が安定的であり、熱と湿度の影響が小さいため、製剤化しやすい。本開示の化合物及びその結晶形は良好なＣｄｃ７阻害活性を有し、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４酵素に対して強い阻害効果があり、且つＣｄｃ７が高発現される結腸直腸細胞ＣＯＬＯ２０５の増殖に対して阻害効果がある。したがって、本開示の化合物及び結晶形は腫瘍の臨床治療への使用が有望な効果的な新規薬物である。
本開示の結晶形は、薬物活性、吸湿性、安定性、純度、製造しやすさなどにおいて優位性を有するため、薬物の生産、保管、輸送、製剤化などにおける要件を満たすことができる。
「定義と説明」
特に説明がない限り、本明細書で用いられる下記の用語及び表現は以下の意味を有する。特定の表現又は用語は、特別に定義されない場合、確定していない又は不明瞭なもので
はなく、通常の意味で理解される。本明細書で商品名が記載される場合に、対応する製品又はその有効成分を意味する。
特に説明がない限り、本明細書で用いられる下記の用語及び表現は以下の意味を有する。特定の表現又は用語は、特別に定義されない場合、確定していない又は不明瞭なもので
はなく、通常の意味で理解される。本明細書で商品名が記載される場合に、対応する製品又はその有効成分を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、類似の用語及び英語の同等な表現、例えば、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ又は同等な用語は、「…を含み、ただしそれらに限定されない」と開放的で非排他的な表現として理解され、列挙されている要素、成分又はステップの他に、明記していない要素、成分又はステップを含んでもよいということを意味する。
本発明の化合物には特定の幾何異性体又は立体異性体の形態が存在してもよい。本発明において想定されるこのような化合物には、シス及びトランス異性体、（－）－及び（＋）－エナンチオマー、（Ｒ）－及び（Ｓ）－エナンチオマー、ジアステレオマー、（Ｄ）－異性体、（Ｌ）－異性体、並びにラセミ混合物及びその他の混合物、例えば、エナンチオマー又はジアステレオマーを豊富に含有する混合物を含み、これらの混合物がいずれも本発明の範囲に含まれる。アルキル基などの置換基には別の不斉炭素原子が存在してもよい。これらの異性体及びそれらの混合物は全て本発明の範囲に含まれる。
特に説明がない限り、「（Ｄ）」又は「（＋）」は右旋性を、「（Ｌ）」又は「（－）」は左旋性を、「（ＤＬ）」又は「（±）」はラセミ体を表す。
特に説明がない限り、くさび形の実線結合（
）とくさび形の破線結合（
）でキラル中心の絶対配置を表し、直線形の実線結合（
）と直線形の破線結合（
）でキラル中心の相対配置を表し、波線（
）でくさび形の実線結合（
）若しくはくさび形の破線結合（
）を表し、又は波線（
）で直線形の実線結合（
）と直線形の破線結合（
）を表す。
）とくさび形の破線結合（
）でキラル中心の絶対配置を表し、直線形の実線結合（
）と直線形の破線結合（
）でキラル中心の相対配置を表し、波線（
）でくさび形の実線結合（
）若しくはくさび形の破線結合（
）を表し、又は波線（
）で直線形の実線結合（
）と直線形の破線結合（
）を表す。
用語「薬学的に許容される」とは、ヒト又は動物の組織に接触して使用するのに適し、毒性又は刺激性はなく、アレルギー反応、その他の問題や合併症を引き起こさないと医学的に判断され、利益対リスクが合理的である化合物、材料、組成物及び／又は剤形に対して使用される。「薬学的に許容される添加物」とは有効成分と共に投与され、有効成分を投与しやすくする不活性物質であり、中国国家食品薬品監督管理局がヒト又は動物（例えば家畜）への使用を認める流動促進剤、甘味料、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、矯味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、崩壊剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒又は乳化剤のいずれかを含み、ただしそれらに限定されない。前記添加物の非限定的な例は炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類と様々なデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコールを含む。
用語「医薬組成物」とは１種又は複数種の本開示の化合物又はその結晶形と薬学的に許容される添加物からなる混合物を指す。医薬組成物は、生体に本開示の化合物を投与しやすいようにするためのものである。
本開示の医薬組成物は、本開示の化合物又はその結晶形と薬学的に許容される適切な添加物を組み合わせて製造することができ、例えば、固体、半固体、液体剤又は気体の製剤として製造することができ、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、粉剤、顆粒剤、軟膏、エマルジョン、懸濁剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア、エアロゾルなどである。
本開示に記載の化合物又はその結晶形又はその医薬組成物の典型的な投与経路は、経口、経直腸、局所、吸入、非経口、舌下、膣内、鼻腔内、眼内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内を含み、ただしそれらに限定されない。
本開示の医薬組成物は、本分野で周知される手法、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠法、粉砕、乳化、凍結乾燥などの通常の方法で製造することができる。
一部の実施形態において、医薬組成物は、経口投与用である。経口投与の場合、活性化合物と本分野で熟知される薬学的に許容される添加物を混合して、当該医薬組成物を製造することができる。これら添加物により本開示の化合物は、患者に経口投与するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体剤、ゲル剤、シロップ、懸濁剤などとして製剤化される。
本開示の化合物又はその結晶形の治療用量は、治療の目的、化合物の投与方式、患者の健康状態、処方を下す医師の判断などから決定されてもよい。医薬組成物における本開示の化合物又はその結晶形の割合又は濃度は必ずしも一定とは限らず、用量、化学的特性（例えば、疎水性）、投与経路など様々な要因によって決定される。
用語「治療」とは、疾患又は前記疾患に関連する１つ又は複数の症状を改善又は解消するために、本開示の化合物又はその結晶形又はその医薬組成物を投与することを意味し、且つ以下の事項を含む。
（ｉ）疾患又は疾患の状態を抑え、即ちその進行を抑えること、
（ｉｉ）疾患又は疾患の状態を緩和し、即ち当該疾患又は疾患の状態を解消させること。
（ｉ）疾患又は疾患の状態を抑え、即ちその進行を抑えること、
（ｉｉ）疾患又は疾患の状態を緩和し、即ち当該疾患又は疾患の状態を解消させること。
用語「予防」とは、疾患又は前記疾患に関連する１つ又は複数の症状を予防するために、本開示の化合物又はその結晶形又はその医薬組成物を投与することを意味し、且つ、哺乳動物における疾患又は疾患の状態の出現を予防することであって、特に当該疾患の状態になりやすい哺乳動物が、当該疾患の状態と診断されていない時の予防を含む。
「哺乳動物」は、ヒト、実験室用哺乳動物や愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）などの飼育動物、野生哺乳動物などの非飼育哺乳動物を含む。
薬物又は薬理学的に活性な薬剤に対して使用される場合、用語「治療有効量」とは、毒性を持たず所望の効果を得られる薬物又はその製剤の十分な用量を指す。当該有効量は、投与対象の年齢、一般状況で決定され、有効物質種によって異なる。実際の投与では、当業者が通常の試験を行って適切な有効量を决定することができる。
本明細書では、文脈で明確な断りがない限り、単数形の用語は複数の指示対象の場合をカバーしており、逆の場合も同様である。
本明細書では、特に説明がない限り、各パラメータ（２θ角、反応条件を含む）はいずれも、測定などによる値の誤差を含むように用語「約」で修飾されたものと見なされ、例えば、記載された値に対して、±５％の誤差がある。
本明細書では説明と開示の目的で、全ての特許、特許出願及び他のすでに確定した刊行物を参照して明確に組み込む。それらの刊行物は本開示の出願日前に公開されているため提供できる。それらの書類の開示日に関する声明又はその内容の記載は出願人の知り得た情報に基づくもので、それらの書類の開示日又はその内容が正しいと承諾するものではない。しかも全ての対象国において、本明細書へのそれらの刊行物の参照で当該刊行物は本分野で周知される常識になると認めるものではない。
本開示の中間体化合物は当業者の熟知する様々な合成方法で調製することができ、前記方法は、以下に列挙される特定の実施形態、他の化学的合成方法と組み合わせてなる実施形態及び当業者の熟知する同等な代替形態を含み、好ましい実施形態は本開示の実施例を含み、ただしそれらに限定されない。
本開示の化合物は、当業者の熟知する通常の方法でその構造を確認することができ、本開示が化合物の絶対配置に係る場合、当該絶対配置を本分野の通常の技術的手段で検証することができる。例えば、単結晶Ｘ線回折（ＳＸＲＤ）の場合、培養した単結晶に対してＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ ｖｅｎｔｕｒｅ回折計を用いて回折強度データを収集し、光源はＣｕ Ｋα照射であり、走査方式はφ／走査である。関連データを収集した後、さらに直接法（Ｓｈｅｌｘｓ９７）で結晶構造を解析すれば、絶対配置を検証することができる。
本開示の特定の実施形態の化学反応は適切な溶媒において行われ、前記溶媒は本開示の化学的変化及び使用する試薬と原料に適合するものでなければならない。本開示の化合物を得るために、場合によって当業者が既存の実施形態に基づいて合成ステップ又は反応プロセスを選択し又は変更する必要がある。
次に、実施例を用いて本開示の具体的な説明を行う。これらの実施例は本開示に何らかの限定を加えるものではない。
本開示で使用する溶媒は全て市販品で、精製しなくても使用できる。
本開示で使用する溶媒として、市販品を利用できる。
本開示で次の略語を使用する。ＤＭＦ－ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ＤＨＰ：３，４－ジヒドロピラン、ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン。
なお、Ｘ線粉末回折パターンにおいて、ピークの位置又はピークの相対強度が測定装置、測定方法／条件などの要因によって異なる可能性がある。いかなる特定の結晶形でも、ピークの位置に誤差がある可能性があり、２θ値の測定誤差は±０．２°であってもよい。そのため、１つの結晶形を確定する時には、当該誤差を考慮すべきであり、誤差内にあるものは本開示の範囲に含まれる。
なお、同じ結晶形でも、ＤＳＣにおける吸熱ピークの出現位置は測定装置、測定方法／条件などの要因によって異なる可能性がある。いかなる特定の結晶形でも、吸熱ピークの位置に誤差がある可能性があり、誤差は±５℃でもよいし、±３℃でもよい。そのため、１つの結晶形を確定する時には、当該誤差を考慮すべきであり、誤差内にあるものは本開示の範囲に含まれる。
なお、同じ結晶でも、ＴＧＡ曲線における重量損失温度の出現位置と重量損失値は測定装置、測定方法／条件などの要因によって異なる可能性がある。いかなる特定の結晶でも、重量損失温度の位置と重量損失値に誤差がある可能性があり、重量損失温度の誤差は±５℃であってもよく、重量損失値の誤差は±０．２％であってもよい。そのため、１つの結晶を確定する時には、当該誤差を考慮すべきであり、誤差内にあるものは本開示の範囲に含まれる。
なお、赤外スペクトルにおいて、ピークの位置が測定装置、測定方法／条件などの要因によって異なる可能性がある。いかなる特定の結晶形でも、ピークの位置に誤差がある可能性があり、ピークの位置の測定誤差は±５ｃｍ－１であってもよい。そのため、１つの結晶形を確定する時には、当該誤差を考慮すべきであり、誤差内にあるものは本開示の範囲に含まれる。
なお、紫外吸収スペクトルにおいて、ピークの位置が測定装置、測定方法／条件などの
要因によって異なる可能性がある。いかなる特定の結晶形でも、ピークの位置に誤差がある可能性があり、波長の測定誤差は±５ｎｍであってもよいし、±３ｎｍであってもよい。そのため、１つの結晶形を確定する時には、当該誤差を考慮すべきであり、誤差内にあるものは本開示の範囲に含まれる。
要因によって異なる可能性がある。いかなる特定の結晶形でも、ピークの位置に誤差がある可能性があり、波長の測定誤差は±５ｎｍであってもよいし、±３ｎｍであってもよい。そのため、１つの結晶形を確定する時には、当該誤差を考慮すべきであり、誤差内にあるものは本開示の範囲に含まれる。
本明細書では、特に説明がない限り、本開示で「室温」とは常温を指し、一般に２０～３０℃である。
装置及び分析方法：
１．１ Ｘ線粉末回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
装置モデル：ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ社のＸ’Ｐｅｒｔ３型Ｘ線回折計
試験方法：約１０ｍｇのサンプルでＸＲＰＤを測定する。
１．１ Ｘ線粉末回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
装置モデル：ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ社のＸ’Ｐｅｒｔ３型Ｘ線回折計
試験方法：約１０ｍｇのサンプルでＸＲＰＤを測定する。
詳細なＸＲＰＤパラメータは次のとおりである。
線源：Ｃｕ Ｋα（λ＝１．５４０６０Å）
管電圧：４５ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
発散制限スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：３～４０°
ステップ長：０．０２６３°
ステップ毎の測定時間：０．１２秒
試料トレイの回転数：１５ｒｐｍ
線源：Ｃｕ Ｋα（λ＝１．５４０６０Å）
管電圧：４５ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
発散制限スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：３～４０°
ステップ長：０．０２６３°
ステップ毎の測定時間：０．１２秒
試料トレイの回転数：１５ｒｐｍ
１．２ 示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）
装置モデル：ＴＡ ２５００示差走査熱量計
装置モデル：ＴＡ ２５００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（０．５～１ｍｇ）をＤＳＣ用アルミパンに入れて試験を行い、５０ｍＬ／分のＮ２の条件下、１０℃／分の昇温速度で、サンプルを室温（２５℃）から３００℃又は３５０℃に加熱する。
１．３ 熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）
装置モデル：ＴＡ Ｑ５５００／Ｑ５０００熱重量分析計
装置モデル：ＴＡ Ｑ５５００／Ｑ５０００熱重量分析計
試験方法：サンプル（２～５ｍｇ）をＴＧＡ用白金パンに入れて試験を行い、２５ｍＬ／分のＮ２の条件下、１０℃／分の昇温速度で、サンプルを室温（２５℃）から３００℃又は３５０℃に加熱し、重量損失は２０％である。
１．４ 引湿性の判断基準：
１．５ 高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、ＨＰＬＣ）
装置モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフ
分析方法は次のとおりである。
装置モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高速液体クロマトグラフ
分析方法は次のとおりである。
以下、実施例を用いて本開示を詳細に説明し、ただしこれは本開示に何らかの限定を加えることにならない。本明細書では特定の実施形態を含め本開示が詳細に説明されている。当業者にとって、本開示の趣旨と範囲を逸脱することなく本開示の特定の実施形態に様々な変形と改良を行うことができることは自明である。
実施例１：式（Ｉ）化合物
ステップ１：中間体１－Ｂの合成
室温で、３０Ｌの高温・低温反応釜にＤＭＦ－ＤＭＡ（１９．０５ｍｏｌ、１．０ｅｑ、２．５３Ｌ）を加え、撹拌しながら数回に分けて原料１－Ａ（２４０３．５２ｇ、１９．０５ｍｏｌ、１．０ｅｑ）を加え、反応はわずかなだけ発熱し、反応液内部の温度が３５℃を超えないよう滴加の速度を制御した。原料を加え終えると８５～９０℃に上げて撹拌しながら３時間反応させた。反応液を５０～５５℃に冷却して、溶媒メタノール（２．４Ｌ）を加え、続いてヒドラジン水和物（１７．１５ｍｏｌ、純度９８％、０．９ｅｑ、８５０ｍＬ）をゆっくりと滴加し、反応は発熱し、原料があふれ出さないよう原料を加える速度を制御し、滴加が完了すると５０～６０℃で３０分間反応させた。室温に冷却し、反応液を５０℃、－０．０８ＭＰａで減圧下濃縮し、濃縮後にできた固体に酢酸エチル（２．４Ｌ）を加えてパルプ化し、３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、濾液を減圧下濃縮して粗生成物を得て、粗生成物に酢酸エチル（１．２Ｌ）を加えてパルプ化し、室温で３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、２回分の濾過ケーキを合わせて４５～５０℃、－０．０８ＭＰａにおいて重量が一定になるまで真空乾燥して１－Ｂを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１５１（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ １３．０２（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），２．９１～２．９６（ｍ，２Ｈ），２．５６～２．６１（ｍ，２Ｈ），１．８５～１．９１（ｍ，２Ｈ），１．７８～１．８４（ｍ，２Ｈ）。
室温で、３０Ｌの高温・低温反応釜にＤＭＦ－ＤＭＡ（１９．０５ｍｏｌ、１．０ｅｑ、２．５３Ｌ）を加え、撹拌しながら数回に分けて原料１－Ａ（２４０３．５２ｇ、１９．０５ｍｏｌ、１．０ｅｑ）を加え、反応はわずかなだけ発熱し、反応液内部の温度が３５℃を超えないよう滴加の速度を制御した。原料を加え終えると８５～９０℃に上げて撹拌しながら３時間反応させた。反応液を５０～５５℃に冷却して、溶媒メタノール（２．４Ｌ）を加え、続いてヒドラジン水和物（１７．１５ｍｏｌ、純度９８％、０．９ｅｑ、８５０ｍＬ）をゆっくりと滴加し、反応は発熱し、原料があふれ出さないよう原料を加える速度を制御し、滴加が完了すると５０～６０℃で３０分間反応させた。室温に冷却し、反応液を５０℃、－０．０８ＭＰａで減圧下濃縮し、濃縮後にできた固体に酢酸エチル（２．４Ｌ）を加えてパルプ化し、３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、濾液を減圧下濃縮して粗生成物を得て、粗生成物に酢酸エチル（１．２Ｌ）を加えてパルプ化し、室温で３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、２回分の濾過ケーキを合わせて４５～５０℃、－０．０８ＭＰａにおいて重量が一定になるまで真空乾燥して１－Ｂを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１５１（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ １３．０２（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），２．９１～２．９６（ｍ，２Ｈ），２．５６～２．６１（ｍ，２Ｈ），１．８５～１．９１（ｍ，２Ｈ），１．７８～１．８４（ｍ，２Ｈ）。
ステップ２：中間体１－Ｃの合成
室温で、５０Ｌの高温・低温反応釜に溶媒ジクロロメタン（１１．０７Ｌ）を加え、撹拌しながら数回に分けて中間体１－Ｂ（２２１４．９０ｇ、１４．７４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．４０Ｌ、４４．２３ｍｏｌ、３．０ｅｑ）を加え、次に塩化オキサリル（３．８７Ｌ、４４．２３ｍｏｌ、３．０ｅｑ）をゆっくりと滴加し、反応液内部の温度が３０℃を超えないよう滴加速度を制御した。反応液を２０～３０℃で撹拌して１２時間反応させた。反応液を４０℃、－０．０８ＭＰａで減圧下濃縮して乾固させた。室温で撹拌しながら減圧下濃縮後の粗生成物を数回に分けて氷水（２２．１４Ｌ）に加え、３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（２Ｌ×３）で洗浄した。濾過ケーキを３５～４０℃、－０．０８ＭＰａにおいて真空乾燥して１－Ｃを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９７（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ １０．２（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），２．９～３．０（ｍ，２Ｈ），２．６～２．６（ｍ，２Ｈ），１．８～１．８（ｍ，２Ｈ）。
室温で、５０Ｌの高温・低温反応釜に溶媒ジクロロメタン（１１．０７Ｌ）を加え、撹拌しながら数回に分けて中間体１－Ｂ（２２１４．９０ｇ、１４．７４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．４０Ｌ、４４．２３ｍｏｌ、３．０ｅｑ）を加え、次に塩化オキサリル（３．８７Ｌ、４４．２３ｍｏｌ、３．０ｅｑ）をゆっくりと滴加し、反応液内部の温度が３０℃を超えないよう滴加速度を制御した。反応液を２０～３０℃で撹拌して１２時間反応させた。反応液を４０℃、－０．０８ＭＰａで減圧下濃縮して乾固させた。室温で撹拌しながら減圧下濃縮後の粗生成物を数回に分けて氷水（２２．１４Ｌ）に加え、３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（２Ｌ×３）で洗浄した。濾過ケーキを３５～４０℃、－０．０８ＭＰａにおいて真空乾燥して１－Ｃを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９７（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ １０．２（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｓ，１Ｈ），２．９～３．０（ｍ，２Ｈ），２．６～２．６（ｍ，２Ｈ），１．８～１．８（ｍ，２Ｈ）。
ステップ３：中間体１－Ｄの合成
室温で、５０Ｌの高温・低温反応釜に溶媒ＴＨＦ（１４．６５Ｌ）を加え、撹拌しながら数回に分けて中間体１－Ｃ（２９２９．３４ｇ、１４．８４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）、濃アンモニア水（４．５７Ｌ、２９．６９ｍｏｌ、２．０ｅｑ）を加え、数回に分けてヨウ素単体（７５４０．２３ｇ、２９．６９ｍｏｌ、２．０ｅｑ）をゆっくりと加え、反応液の内部温度が３５℃を超えないようヨウ素を加える速度を制御した。反応液を２０～３５℃で撹拌して１２時間反応させた。撹拌しながら前記反応液を１２０Ｌの飽和亜硫酸ナトリウム水溶液に加え、３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（３Ｌ×３）で洗浄し、４５～５０℃、－０．０８ＭＰａにおいて重量が一定になるまで真空乾燥して１－Ｄを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９４（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ １３．０６～１３．２７（ｍ，１Ｈ），７．７１～８．１１（ｍ，１Ｈ），２．９０～２．９６（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｍ，２Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ）。
室温で、５０Ｌの高温・低温反応釜に溶媒ＴＨＦ（１４．６５Ｌ）を加え、撹拌しながら数回に分けて中間体１－Ｃ（２９２９．３４ｇ、１４．８４ｍｏｌ、１．０ｅｑ）、濃アンモニア水（４．５７Ｌ、２９．６９ｍｏｌ、２．０ｅｑ）を加え、数回に分けてヨウ素単体（７５４０．２３ｇ、２９．６９ｍｏｌ、２．０ｅｑ）をゆっくりと加え、反応液の内部温度が３５℃を超えないようヨウ素を加える速度を制御した。反応液を２０～３５℃で撹拌して１２時間反応させた。撹拌しながら前記反応液を１２０Ｌの飽和亜硫酸ナトリウム水溶液に加え、３０分間撹拌してから濾過し、濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（３Ｌ×３）で洗浄し、４５～５０℃、－０．０８ＭＰａにおいて重量が一定になるまで真空乾燥して１－Ｄを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９４（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ １３．０６～１３．２７（ｍ，１Ｈ），７．７１～８．１１（ｍ，１Ｈ），２．９０～２．９６（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｍ，２Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ）。
ステップ４：中間体１－Ｅの合成
室温で、ＴＨＦ（９．７０Ｌ）を５０Ｌの高温・低温反応釜に加え、続いて中間体１－Ｄ（１．９４ｋｇ、９．８２ｍｏｌ、純度９８．０６１％、１ｅｑ）、ＤＨＰ（２．４８
ｋｇ、２９．４７ｍｏｌ、２．６９Ｌ、３．０ｅｑ、１０００ｍＬ／分）をこの順に反応釜に加えた。反応液を７５～８０℃で撹拌して６５時間反応させた。反応液を５０℃、－０．０８ＭＰａで減圧下濃縮して油状物を得た。室温で、溶媒ＤＭＦ（１５．９０Ｌ）を５０Ｌの高温・低温反応釜に加え、続いて原料から得た前記油状物（３１８０．２６ｇ、１１．４５ｍｏｌ、１ｅｑ）、メルカプトアセトアミド（１２５２．１４ｇ、１３．７４ｍｏｌ、１．２ｅｑ）及び炭酸カリウム（３３２３．２８ｋｇ、２４．０５ｍｏｌ、２．１ｅｑ）をこの順に数回に分けて反応釜に加え、発熱しなかった。反応液を７５～８０℃で１時間反応させ（反応系が流動しわずかなだけ窒素が通るよう持続的に撹拌し、排ガスに対し次亜塩素酸ナトリウム溶液で吸収する必要があり、且つ排ガス吸収装置と反応釜の間にバッファーボトルがある）。反応液を室温に冷却して、酢酸エチル（１５．９０Ｌ）を加えた。撹拌しながら前記反応液を１６０Ｌの水にゆっくりと注ぎ、原料を加え終えたら懸濁液として反応液を得て、室温で１２時間撹拌してから濾過し（固体の析出が遅い）、濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（３Ｌ×３）で洗浄した。濾過ケーキに１５．９０Ｌのメタノールを加えて６５～７０℃で１時間撹拌し、室温に冷却して濾過し、濾過ケーキを収集し（純度が不十分であれば前記精製プロセスを繰り返してもよい）、４５～５０℃、－０．０８ＭＰａで真空乾燥して１－Ｅを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３３３（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ ７．５２～７．９２（ｍ，１Ｈ），６．６２～６．８９（ｍ，２Ｈ），６．２９～６．５０（ｍ，２Ｈ），５．２２～５．５２（ｍ，１Ｈ），３．８３～３．９９（ｍ，１Ｈ），３．５５～３．７０（ｍ，１Ｈ），２．８４～３．１８（ｍ，２Ｈ），２．６０～２．７１（ｍ，２Ｈ），１．８６～２．３５（ｍ，５Ｈ），１．４３～１．７５（ｍ，３Ｈ）。
室温で、ＴＨＦ（９．７０Ｌ）を５０Ｌの高温・低温反応釜に加え、続いて中間体１－Ｄ（１．９４ｋｇ、９．８２ｍｏｌ、純度９８．０６１％、１ｅｑ）、ＤＨＰ（２．４８
ｋｇ、２９．４７ｍｏｌ、２．６９Ｌ、３．０ｅｑ、１０００ｍＬ／分）をこの順に反応釜に加えた。反応液を７５～８０℃で撹拌して６５時間反応させた。反応液を５０℃、－０．０８ＭＰａで減圧下濃縮して油状物を得た。室温で、溶媒ＤＭＦ（１５．９０Ｌ）を５０Ｌの高温・低温反応釜に加え、続いて原料から得た前記油状物（３１８０．２６ｇ、１１．４５ｍｏｌ、１ｅｑ）、メルカプトアセトアミド（１２５２．１４ｇ、１３．７４ｍｏｌ、１．２ｅｑ）及び炭酸カリウム（３３２３．２８ｋｇ、２４．０５ｍｏｌ、２．１ｅｑ）をこの順に数回に分けて反応釜に加え、発熱しなかった。反応液を７５～８０℃で１時間反応させ（反応系が流動しわずかなだけ窒素が通るよう持続的に撹拌し、排ガスに対し次亜塩素酸ナトリウム溶液で吸収する必要があり、且つ排ガス吸収装置と反応釜の間にバッファーボトルがある）。反応液を室温に冷却して、酢酸エチル（１５．９０Ｌ）を加えた。撹拌しながら前記反応液を１６０Ｌの水にゆっくりと注ぎ、原料を加え終えたら懸濁液として反応液を得て、室温で１２時間撹拌してから濾過し（固体の析出が遅い）、濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（３Ｌ×３）で洗浄した。濾過ケーキに１５．９０Ｌのメタノールを加えて６５～７０℃で１時間撹拌し、室温に冷却して濾過し、濾過ケーキを収集し（純度が不十分であれば前記精製プロセスを繰り返してもよい）、４５～５０℃、－０．０８ＭＰａで真空乾燥して１－Ｅを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３３３（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ ７．５２～７．９２（ｍ，１Ｈ），６．６２～６．８９（ｍ，２Ｈ），６．２９～６．５０（ｍ，２Ｈ），５．２２～５．５２（ｍ，１Ｈ），３．８３～３．９９（ｍ，１Ｈ），３．５５～３．７０（ｍ，１Ｈ），２．８４～３．１８（ｍ，２Ｈ），２．６０～２．７１（ｍ，２Ｈ），１．８６～２．３５（ｍ，５Ｈ），１．４３～１．７５（ｍ，３Ｈ）。
ステップ５：中間体１－Ｇの合成
室温で、原料１－Ｆ（９０６．５０ｇ、４．７３ｍｏｌ、１ｅｑ、ＨＣｌ）をジクロロメタン（９．６Ｌ）に加え、１０～１５℃で塩化オキサリル（３３１．１３ｇ、２．６１ｍｏｌ、２２８．３７ｍＬ、５ｅｑ）を滴加した後、７２時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮して乾固させ、５ＬのＤＣＭを加えて減圧下濃縮して残りの塩化オキサリルを除去し、１回繰り返して、１－Ｇを得てそのまま次のステップの反応に使用した。
室温で、原料１－Ｆ（９０６．５０ｇ、４．７３ｍｏｌ、１ｅｑ、ＨＣｌ）をジクロロメタン（９．６Ｌ）に加え、１０～１５℃で塩化オキサリル（３３１．１３ｇ、２．６１ｍｏｌ、２２８．３７ｍＬ、５ｅｑ）を滴加した後、７２時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮して乾固させ、５ＬのＤＣＭを加えて減圧下濃縮して残りの塩化オキサリルを除去し、１回繰り返して、１－Ｇを得てそのまま次のステップの反応に使用した。
ステップ６：中間体１－Ｈの合成
室温で９．２Ｌのジクロロメタンを３０Ｌの高温・低温反応釜に加え、撹拌しながら１－Ｇ（９８３．２８ｇ、４．６８ｍｏｌ、１．７ｅｑ、ＨＣｌ）を反応釜に加え、－２０～－１５℃に冷却して、１－Ｅ（９２０．１９ｇ、２．７７ｍｏｌ、１ｅｑ）を数回に分けて反応釜にゆっくりと加え、内部温度が－１０℃を超えないよう制御した。－２０～－１０℃で撹拌して３０分間反応させた。ＨＰＬＣにより１－Ｅの含有量＜５％と検出し、－２０～－１０℃でトリエチルアミン（１９２ｍＬ、１．３９ｍｏｌ、０．５ｅｑ）を反応釜に滴加し、続いてサンプルを採取して検出し、ＨＰＬＣは１－Ｅの含有量＜１％と示し、残りのトリエチルアミン（９６０ｍＬ、６．９３ｍｏｌ、２．５ｅｑ）を反応釜に滴加した。減圧下濃縮し、固体は約３ｋｇで、１５Ｌのｎ－ヘプタンを加え撹拌してパルプ化よりジクロロメタンを除去し、濾過し、固体を収集し減圧下ベーク（４５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｈ－Ｍを得た。
室温で９．２Ｌのジクロロメタンを３０Ｌの高温・低温反応釜に加え、撹拌しながら１－Ｇ（９８３．２８ｇ、４．６８ｍｏｌ、１．７ｅｑ、ＨＣｌ）を反応釜に加え、－２０～－１５℃に冷却して、１－Ｅ（９２０．１９ｇ、２．７７ｍｏｌ、１ｅｑ）を数回に分けて反応釜にゆっくりと加え、内部温度が－１０℃を超えないよう制御した。－２０～－１０℃で撹拌して３０分間反応させた。ＨＰＬＣにより１－Ｅの含有量＜５％と検出し、－２０～－１０℃でトリエチルアミン（１９２ｍＬ、１．３９ｍｏｌ、０．５ｅｑ）を反応釜に滴加し、続いてサンプルを採取して検出し、ＨＰＬＣは１－Ｅの含有量＜１％と示し、残りのトリエチルアミン（９６０ｍＬ、６．９３ｍｏｌ、２．５ｅｑ）を反応釜に滴加した。減圧下濃縮し、固体は約３ｋｇで、１５Ｌのｎ－ヘプタンを加え撹拌してパルプ化よりジクロロメタンを除去し、濾過し、固体を収集し減圧下ベーク（４５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｈ－Ｍを得た。
８．７Ｌのメタノール、４．３Ｌの水（メタノール：水＝２：１）を高温・低温反応釜に加え、水酸化ナトリウム（１１０７．２７ｇ、２７．７ｍｏｌ、１０ｅｑ）を加えた後、５０℃に上げた。ベークした前記１－Ｈ－Ｍを数回に分けて反応釜に加え、撹拌して３０分間反応させた後、ＨＰＬＣで反応の完了を検出し、０℃に冷却して、１３Ｌの水を加え、０～５℃で３０分間撹拌し、濾過し、固体を収集した。濾液に対して６Ｎ 塩酸でｐＨを７～８に調整し、減圧下濃縮して殆どのメタノールを除去し、１０～１５℃で２Ｎ 水酸化ナトリウムでｐＨを１０～１１に調整して、大量の固体が析出し、引き続き３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、２回分の濾過ケーキを合わせて水（４Ｌ×２）
で洗浄し、濾過した後、濾過ケーキを減圧下ベーク（５５℃、－０．０８ＭＰａ）して１－Ｈを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４５２（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ ７．６６～８．０８（ｍ，１Ｈ），５．３０～５．４３（ｍ，１Ｈ），３．８５～４．００（ｍ，１Ｈ），３．５５～３．７６（ｍ，３Ｈ），２．８９～３．１２（ｍ，６Ｈ），２．７４～２．８７（ｍ，１Ｈ），２．３７～２．４５（ｍ，１Ｈ），２．０５～２．２２（ｍ，１Ｈ），１．８６～２．０５（ｍ，４Ｈ），１．７６～１．８４（ｍ，１Ｈ），１．６１～１．７５（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｂｒ ｓ，５Ｈ），１．２８～１．４１（ｍ，１Ｈ）。
で洗浄し、濾過した後、濾過ケーキを減圧下ベーク（５５℃、－０．０８ＭＰａ）して１－Ｈを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４５２（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）δ ｐｐｍ ７．６６～８．０８（ｍ，１Ｈ），５．３０～５．４３（ｍ，１Ｈ），３．８５～４．００（ｍ，１Ｈ），３．５５～３．７６（ｍ，３Ｈ），２．８９～３．１２（ｍ，６Ｈ），２．７４～２．８７（ｍ，１Ｈ），２．３７～２．４５（ｍ，１Ｈ），２．０５～２．２２（ｍ，１Ｈ），１．８６～２．０５（ｍ，４Ｈ），１．７６～１．８４（ｍ，１Ｈ），１．６１～１．７５（ｍ，２Ｈ），１．６０（ｂｒ ｓ，５Ｈ），１．２８～１．４１（ｍ，１Ｈ）。
ステップ７：中間体１－Ｉの合成
２０～２５℃で撹拌しながら、１－Ｈ（１１９７．２１ｇ、２．６５ｍｏｌ、１ｅｑ）を数回に分けて４Ｎ 塩化水素・酢酸エチル溶液（１１．９７Ｌ、４７．８８ｍｏｌ、１８．１ｅｑ）に加え、原料を加え終えたら１０～１５℃で３０分間撹拌して濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（１Ｌ×２）で洗浄し、１６時間減圧下乾燥（４０～４５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｉ－Ｍを得た。１－Ｉ－Ｍを水（９．６Ｌ）とメタノール（１．２Ｌ）の混合溶媒に加え、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（５Ｌ×２）で洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集し、減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｉを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）δ
ｐｐｍ ７．４６（ｓ，１Ｈ），３．６４～３．７８（ｍ，１Ｈ），２．８９～３．０３（ｍ，５Ｈ），２．７２～２．８９（ｍ，３Ｈ），２．３０～２．３６（ｍ，１Ｈ），１．７３～１．８８（ｍ，４Ｈ），１．３５～１．５４（ｍ，４Ｈ）。
２０～２５℃で撹拌しながら、１－Ｈ（１１９７．２１ｇ、２．６５ｍｏｌ、１ｅｑ）を数回に分けて４Ｎ 塩化水素・酢酸エチル溶液（１１．９７Ｌ、４７．８８ｍｏｌ、１８．１ｅｑ）に加え、原料を加え終えたら１０～１５℃で３０分間撹拌して濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（１Ｌ×２）で洗浄し、１６時間減圧下乾燥（４０～４５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｉ－Ｍを得た。１－Ｉ－Ｍを水（９．６Ｌ）とメタノール（１．２Ｌ）の混合溶媒に加え、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水（５Ｌ×２）で洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集し、減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｉを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）δ
ｐｐｍ ７．４６（ｓ，１Ｈ），３．６４～３．７８（ｍ，１Ｈ），２．８９～３．０３（ｍ，５Ｈ），２．７２～２．８９（ｍ，３Ｈ），２．３０～２．３６（ｍ，１Ｈ），１．７３～１．８８（ｍ，４Ｈ），１．３５～１．５４（ｍ，４Ｈ）。
ステップ８：式（Ｉ）化合物の合成
１回目の分割：
室温で、３０Ｌの高温・低温反応釜に１０．１Ｌのメタノールを加え、１－Ｉ（８０７．８９ｇ、２．２０ｍｏｌ、１ｅｑ）を反応釜に加え、撹拌しながら氷酢酸（４Ｌ）、水（４０４ｍＬ）をこの順に加えた。釜内温度が６０℃に上がる時に、（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸（３７４．５９ｇ、０．９７ｍｍｏｌ、０．４４ｅｑ）を溶解している３．７Ｌのメタノールを数回に分けて加え、６０～６５℃で１２時間撹拌した。１０℃／３０分の速度で２０℃に段階的に冷却した後、濾過し、濾過ケーキをメタノール（４．６Ｌ）で洗浄し、濾過した後、濾過ケーキを水（８Ｌ）とメタノール（１Ｌ）の混合溶媒に分散させ、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水でパルプ化して２回洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集し、減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｊ－Ｍ１を得た（ｅｅ：８９．１１６％）。
１回目の分割：
室温で、３０Ｌの高温・低温反応釜に１０．１Ｌのメタノールを加え、１－Ｉ（８０７．８９ｇ、２．２０ｍｏｌ、１ｅｑ）を反応釜に加え、撹拌しながら氷酢酸（４Ｌ）、水（４０４ｍＬ）をこの順に加えた。釜内温度が６０℃に上がる時に、（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸（３７４．５９ｇ、０．９７ｍｍｏｌ、０．４４ｅｑ）を溶解している３．７Ｌのメタノールを数回に分けて加え、６０～６５℃で１２時間撹拌した。１０℃／３０分の速度で２０℃に段階的に冷却した後、濾過し、濾過ケーキをメタノール（４．６Ｌ）で洗浄し、濾過した後、濾過ケーキを水（８Ｌ）とメタノール（１Ｌ）の混合溶媒に分散させ、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水でパルプ化して２回洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集し、減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｊ－Ｍ１を得た（ｅｅ：８９．１１６％）。
２回目の分割：
室温で、１０Ｌの高温・低温反応釜に３．７８Ｌのメタノール、１－Ｊ－Ｍ１（３０２．６７ｇ、０．８２４ｍｏｌ、１ｅｑ）を加えた。撹拌しながら氷酢酸（１．５Ｌ）、水（１５１ｍＬ）を加え、釜内温度が６０℃に上がる時に、（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸（２７３．６７ｇ、０．７０８ｍｍｏｌ、０．８６ｅｑ）を溶解している２．７４Ｌのメタノールを一度に加え、反応液を６０～６５℃で、わずかなだけ窒素が通る中で１２時間撹拌した。１０℃／３０分の速度で室温に段階的に冷却した後、濾過して、濾過ケーキをメタノール（３．２Ｌ）でパルプ化し、濾過して水（８．５２Ｌ）とメタノール（１．０７Ｌ）の混合溶媒に分散させ、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌した後、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水で２回洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集した。濾過ケーキを減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｊ－Ｍ２を得た（ｅｅ：９８．０４０％）。
室温で、１０Ｌの高温・低温反応釜に３．７８Ｌのメタノール、１－Ｊ－Ｍ１（３０２．６７ｇ、０．８２４ｍｏｌ、１ｅｑ）を加えた。撹拌しながら氷酢酸（１．５Ｌ）、水（１５１ｍＬ）を加え、釜内温度が６０℃に上がる時に、（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸（２７３．６７ｇ、０．７０８ｍｍｏｌ、０．８６ｅｑ）を溶解している２．７４Ｌのメタノールを一度に加え、反応液を６０～６５℃で、わずかなだけ窒素が通る中で１２時間撹拌した。１０℃／３０分の速度で室温に段階的に冷却した後、濾過して、濾過ケーキをメタノール（３．２Ｌ）でパルプ化し、濾過して水（８．５２Ｌ）とメタノール（１．０７Ｌ）の混合溶媒に分散させ、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌した後、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水で２回洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集した。濾過ケーキを減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して１－Ｊ－Ｍ２を得た（ｅｅ：９８．０４０％）。
３回目の分割：
室温で、１０Ｌの高温・低温反応釜に３．１４Ｌのメタノール、１－Ｊ－Ｍ２（２５１．３６ｇ、０．６８ｍｏｌ、１ｅｑ）を加え、撹拌しながら氷酢酸（１．２５Ｌ）、水（１２５ｍＬ）をこの順に加えた。釜内温度が６０℃に上がる時に、（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸（２３９．２２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ、０．９１ｅｑ）を溶解している２．３９Ｌのメタノールを一度に加えた。反応液を６０～６５℃で、わずかなだけ窒素が通る中で１２時間撹拌した。１０℃／３０分の速度で室温に段階的に冷却した後、濾過して、濾過ケーキをメタノール（３Ｌ）でパルプ化し、濾過してから水（４．８Ｌ）とメタノール（０．６Ｌ）の混合溶媒に分散させ、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水でパルプ化して２回洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集した。濾過ケーキを減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して式（Ｉ）化合物を得た（ｅｅ：９９．７６％）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．９２（ｍ，１Ｈ），３．８６～３．９２（ｍ，１Ｈ），３．０３～３．１３（ｍ，５Ｈ），２．８２～２．９２（ｍ，１Ｈ），２．５５～２．６７（ｍ，２Ｈ），２．２９～２．３９（ｍ，１Ｈ），１．９３～２．０５（ｍ，２Ｈ），１．８３～１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７０～１．８１（ｍ，１Ｈ），１．５０～１．６２（ｍ，２Ｈ），１．３７～１．４９（ｍ，２Ｈ）。
室温で、１０Ｌの高温・低温反応釜に３．１４Ｌのメタノール、１－Ｊ－Ｍ２（２５１．３６ｇ、０．６８ｍｏｌ、１ｅｑ）を加え、撹拌しながら氷酢酸（１．２５Ｌ）、水（１２５ｍＬ）をこの順に加えた。釜内温度が６０℃に上がる時に、（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸（２３９．２２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ、０．９１ｅｑ）を溶解している２．３９Ｌのメタノールを一度に加えた。反応液を６０～６５℃で、わずかなだけ窒素が通る中で１２時間撹拌した。１０℃／３０分の速度で室温に段階的に冷却した後、濾過して、濾過ケーキをメタノール（３Ｌ）でパルプ化し、濾過してから水（４．８Ｌ）とメタノール（０．６Ｌ）の混合溶媒に分散させ、濃アンモニア水でｐＨを８～９に調整して、３０分間撹拌し、濾過して濾過ケーキを収集し、濾過ケーキを水でパルプ化して２回洗浄し、濾過して濾過ケーキを収集した。濾過ケーキを減圧下乾燥（５５℃、－０．１ＭＰａ）して式（Ｉ）化合物を得た（ｅｅ：９９．７６％）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）７．９２（ｍ，１Ｈ），３．８６～３．９２（ｍ，１Ｈ），３．０３～３．１３（ｍ，５Ｈ），２．８２～２．９２（ｍ，１Ｈ），２．５５～２．６７（ｍ，２Ｈ），２．２９～２．３９（ｍ，１Ｈ），１．９３～２．０５（ｍ，２Ｈ），１．８３～１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７０～１．８１（ｍ，１Ｈ），１．５０～１．６２（ｍ，２Ｈ），１．３７～１．４９（ｍ，２Ｈ）。
実施例２：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ
室温で、メタノール（１０４２ｍＬ）を３Ｌの反応フラスコに加え、続いて式（Ｉ）化合物（４５．００ｇ、１２２．４６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を前記反応フラスコに加え、撹拌して５℃に冷却し、マレイン酸（２１．３２ｇ、１８３．６９ｍｏｌ、１．５ｅｑ）を加えて、５～１３℃で６時間撹拌した。濾過して、濾過ケーキを収集した。濾過ケーキをメタノール（５００ｍＬ×２）で洗浄してから減圧下ベーク（４５℃、－０．１ＭＰａ）して式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．４６（ｓ，１Ｈ），６．１６（ｓ，２Ｈ），４．４５～４．５５（ｍ，１Ｈ），３．６４～３．８１（ｍ，１Ｈ），３．４８～３．５９（ｍ，１Ｈ），３．３４～３．４７（ｍ，２Ｈ），２．７６～２．８７（ｍ，２Ｈ），２．６５～２．７６（ｍ，２Ｈ），２．４１～２．５３（ｍ，１Ｈ），２．２６～２．３７（ｍ，１Ｈ），１．９５～２．０９（ｍ，３Ｈ），１．８５～１．９５（ｍ，２Ｈ），１．６３～１．８４（ｍ，２Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲは、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの塩形成数は１であることを示す。
実施例３：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂ
式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ（６０．９１ｍｇ）を秤量して、アセトニトリル（１ｍＬ）と水（１ｍＬ）の混合液を加え、撹拌しながら固体を溶解し、４０℃で溶媒を揮発して乾固させると、固体が析出し、固体を収集し、減圧下ベーク（５５℃、－０．１ＭＰａ）して式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．８５（ｓ
，１Ｈ），６．１０（ｓ，２Ｈ），４．６０～４．６４（ｍ，１Ｈ），３．７４～３．８６（ｍ，１Ｈ），３．３８～３．５２（ｍ，１Ｈ），３．２１～３．３７（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．３７～２．４７（ｍ，１Ｈ），２．１６～２．２４（ｍ，１Ｈ），２．０２～２．１２（ｍ，１Ｈ），１．９１～２．０１（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。
式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ（６０．９１ｍｇ）を秤量して、アセトニトリル（１ｍＬ）と水（１ｍＬ）の混合液を加え、撹拌しながら固体を溶解し、４０℃で溶媒を揮発して乾固させると、固体が析出し、固体を収集し、減圧下ベーク（５５℃、－０．１ＭＰａ）して式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．８５（ｓ
，１Ｈ），６．１０（ｓ，２Ｈ），４．６０～４．６４（ｍ，１Ｈ），３．７４～３．８６（ｍ，１Ｈ），３．３８～３．５２（ｍ，１Ｈ），３．２１～３．３７（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．３７～２．４７（ｍ，１Ｈ），２．１６～２．２４（ｍ，１Ｈ），２．０２～２．１２（ｍ，１Ｈ），１．９１～２．０１（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲは、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｂの塩形成数は１であることを示す。
実施例４：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃ
室温で、メタノール（５６ｍＬ）を式（Ｉ）化合物（０．８０１３７ｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）に加え、７５℃で撹拌しながらマレイン酸（５０５．２９ｍｇ、４．３５ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を加え、７５℃で３０分間撹拌し、４０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却して、引き続き２時間撹拌した。濾過して、固体を収集し、メタノール（１０ｍＬ×２）で洗浄し、固体を減圧下ベーク（５５℃、－０．１ＭＰａ）して式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．９２（ｓ，１Ｈ），６．０９（ｓ，２Ｈ），４．６２～４．６４（ｍ，１Ｈ），３．６２～３．７５（ｍ，１Ｈ），３．３９～３．５４（ｍ，１Ｈ），３．２３～３．３７（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．３７～２．４８（ｍ，１Ｈ），２．１５～２．２８（ｍ，１Ｈ），２．０２～２．１４（ｍ，１Ｈ），１．９２～２．０１（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。
室温で、メタノール（５６ｍＬ）を式（Ｉ）化合物（０．８０１３７ｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）に加え、７５℃で撹拌しながらマレイン酸（５０５．２９ｍｇ、４．３５ｍｍｏｌ、２ｅｑ）を加え、７５℃で３０分間撹拌し、４０℃で１時間撹拌し、２５℃に冷却して、引き続き２時間撹拌した。濾過して、固体を収集し、メタノール（１０ｍＬ×２）で洗浄し、固体を減圧下ベーク（５５℃、－０．１ＭＰａ）して式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃを得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６８（Ｍ＋１）。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６＋Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．９２（ｓ，１Ｈ），６．０９（ｓ，２Ｈ），４．６２～４．６４（ｍ，１Ｈ），３．６２～３．７５（ｍ，１Ｈ），３．３９～３．５４（ｍ，１Ｈ），３．２３～３．３７（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．３７～２．４８（ｍ，１Ｈ），２．１５～２．２８（ｍ，１Ｈ），２．０２～２．１４（ｍ，１Ｈ），１．９２～２．０１（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）。
１Ｈ ＮＭＲは、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ｃの塩形成数は１であることを示す。
実施例５：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの安定性試験
実験手順：
５０ｍｇの式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａを秤量して、乾燥した清潔なガラス瓶に入れ、薄く敷き詰めて、加速試験条件（６０℃、２５／９２．５％ＲＨ、４０℃／７５％ＲＨ及び６０℃／７５％ＲＨ）で静置し、サンプルを完全に曝露させ、アルミホイルをかけて、小さな穴を開けた。５日、１０日、１か月、２か月及び３か月でサンプルを採取して分析した。結果は表６に示す。
実験手順：
５０ｍｇの式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａを秤量して、乾燥した清潔なガラス瓶に入れ、薄く敷き詰めて、加速試験条件（６０℃、２５／９２．５％ＲＨ、４０℃／７５％ＲＨ及び６０℃／７５％ＲＨ）で静置し、サンプルを完全に曝露させ、アルミホイルをかけて、小さな穴を開けた。５日、１０日、１か月、２か月及び３か月でサンプルを採取して分析した。結果は表６に示す。
結論：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａは、高温と高湿の条件で、不純物含有量がほぼ変わらず、安定性に優れる。
実施例６：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの引湿性試験
試験方法：
乾燥した栓付きガラス製の秤量瓶を、下部に塩化アンモニウム飽和溶液を設けたデシケータに入れ、秤量瓶を開放状態で置き、デシケータに蓋をして、次にデシケータを２５℃の恒温ボックスに入れて、一晩静置する。秤量瓶を一晩置いた後、取り出して正確に重量を量り、ｍ１と記す。
試験方法：
乾燥した栓付きガラス製の秤量瓶を、下部に塩化アンモニウム飽和溶液を設けたデシケータに入れ、秤量瓶を開放状態で置き、デシケータに蓋をして、次にデシケータを２５℃の恒温ボックスに入れて、一晩静置する。秤量瓶を一晩置いた後、取り出して正確に重量を量り、ｍ１と記す。
適量の式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａを、重量を量った秤量瓶に敷き詰め（サンプルの厚さは約１ｍｍ）、次に正確に重量を量り、ｍ２と記す。
秤量瓶を開放状態で置き、蓋ごとに下部に塩化アンモニウム飽和溶液を設けたデシケータに入れ、秤量瓶を開放状態で置き、デシケータに蓋をして、次にデシケータを２５℃の恒温ボックスに入れて、２４時間置く。２４時間置いた後、秤量瓶に蓋をして、次に取り出して正確に重量を量り、ｍ３と記す。
引湿性による重量増加を計算し、算式は、パーセンテージ重量増加＝１００％×（ｍ３－ｍ２）／（ｍ２－ｍ１）である。
実験結果：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａのパーセンテージ重量増加（平均）は０．１８％であった。
結論：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの引湿は平均０．２％未満であるため、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａは引湿性がないか又はほぼない。
実施例７：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの赤外吸収試験
装置：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５
方法：ＡＴＲ減衰全反射法
装置：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５
方法：ＡＴＲ減衰全反射法
実験結果：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの赤外吸収スペクトルの測定結果は表７に示す。式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの赤外吸収スペクトルは図６に示す。
結論：被験化合物の構造に－ＮＨ、－ＯＨ、ベンゼン環、－ＣＨ２、－ＣＨ３、Ｃ－Ｏ
、－Ｃ＝Ｏ、－Ｃ＝Ｎなどの基が存在し、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの構造に合致する。
、－Ｃ＝Ｏ、－Ｃ＝Ｎなどの基が存在し、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの構造に合致する。
実施例８：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの紫外吸収試験
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ６８６０Ａ紫外可視分光光度計
実験結果：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの紫外測定結果は表８に示す。式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの紫外吸収スペクトルは図１１に示す。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ６８６０Ａ紫外可視分光光度計
実験結果：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの紫外測定結果は表８に示す。式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの紫外吸収スペクトルは図１１に示す。
解析結論：被験化合物は水中、λ＝２５９．０ｎｍ、λ＝２１４．４ｎｍ、λ＝３２２．６ｎｍに紫外吸収があり、芳香環のＢバンド及びＲバンドの吸収ピークであることから、構造は芳香環を含有することが示され、式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの構造に合致する。
実施例９：式（ＩＩ）化合物の結晶形ＡのＡＫＴ酵素活性試験
ＣＤＣ７キナーゼはＤＮＡの複製開始とＤＮＡの損傷応答において重要な役割を果たす。ＣＤＣ７が異常に高発現される時に、ＣＤＣ７－ＭＣＭ２シグナル伝達経路の異常な活性化はＤＮＡの異常な複製を引き起こし、且つＤＮＡの損傷修復の重要なチェックポイントタンパク質ＣＨＫ２及びＭＫ２の活性が阻害されることで、アポトーシスが阻害され、増殖が促進されて腫瘍が発生する。
ＣＤＣ７キナーゼはＤＮＡの複製開始とＤＮＡの損傷応答において重要な役割を果たす。ＣＤＣ７が異常に高発現される時に、ＣＤＣ７－ＭＣＭ２シグナル伝達経路の異常な活性化はＤＮＡの異常な複製を引き起こし、且つＤＮＡの損傷修復の重要なチェックポイントタンパク質ＣＨＫ２及びＭＫ２の活性が阻害されることで、アポトーシスが阻害され、増殖が促進されて腫瘍が発生する。
実験原理：
ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）キナーゼ実験は化学発光キナーゼアッセイであり、キナーゼが基質と反応する時にはＡＴＰからのエネルギー提供が必要で、これによってＡＴＰはＡＤＰに変換され、反応で生じるＡＤＰの数を検出することで酵素の活性を反映する。本実験ではＡＤＰをＡＴＰに変換させて、ＡＴＰがＵｌｔｒａ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼと結合して発光し、発光強度はＡＤＰの数に比例する。
ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）キナーゼ実験は化学発光キナーゼアッセイであり、キナーゼが基質と反応する時にはＡＴＰからのエネルギー提供が必要で、これによってＡＴＰはＡＤＰに変換され、反応で生じるＡＤＰの数を検出することで酵素の活性を反映する。本実験ではＡＤＰをＡＴＰに変換させて、ＡＴＰがＵｌｔｒａ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼと結合して発光し、発光強度はＡＤＰの数に比例する。
当該実験はＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）法を用いて被験化合物の式（ＩＩ）化合物の結晶形ＡのＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼの活性に対する阻害効果を研究する。化合物検出の最大濃度は１０μＭで、５倍の段階希釈であり、８つの濃度ポイントである。日を改めて再び試験し、いずれも２回の試験とする。
試薬及び材料：
主な装置：
実験方法：
１．溶液及び緩衝液の調製
１）１０ｍＭ ＤＴＴの調製（用時調製）
１μＬの０．１Ｍ ＤＴＴに９μＬの脱イオン水を加える。
２）２×分析緩衝液（用時調製）
１６８μＬのキナーゼ分析緩衝液ＩＩＩを２４８μＬの脱イオン水で２．５倍希釈し、４．２μＬの１０ｍＭ ＤＴＴを加え、使用に備え氷の上に置く。
３）１×分析緩衝液（用時調製）
２５０μＬの２×分析緩衝液に２５０μＬの脱イオン水を加えて１×分析緩衝液に希釈し、使用に備え氷の上に置く。
４）ＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイ
キットはＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬、キナーゼ検出液、キナーゼ検出液基質、１０ｍＭ ＡＴＰストック溶液を含有する。
１．溶液及び緩衝液の調製
１）１０ｍＭ ＤＴＴの調製（用時調製）
１μＬの０．１Ｍ ＤＴＴに９μＬの脱イオン水を加える。
２）２×分析緩衝液（用時調製）
１６８μＬのキナーゼ分析緩衝液ＩＩＩを２４８μＬの脱イオン水で２．５倍希釈し、４．２μＬの１０ｍＭ ＤＴＴを加え、使用に備え氷の上に置く。
３）１×分析緩衝液（用時調製）
２５０μＬの２×分析緩衝液に２５０μＬの脱イオン水を加えて１×分析緩衝液に希釈し、使用に備え氷の上に置く。
４）ＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイ
キットはＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬、キナーゼ検出液、キナーゼ検出液基質、１０ｍＭ ＡＴＰストック溶液を含有する。
キナーゼ検出液の調製：キナーゼ検出液及びキナーゼ検出液基質が室温で平衡化した後、両者を混合し、完全に溶解した後使用し、未使用の溶液は分注し、－２０℃で保存する。
ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬：１回目の使用時に室温で平衡化し、未使用の溶液は分注し、－２０℃で保存する。
２．化合物作業溶液の濃度の設定
１）１０ｍＭ 被験化合物を１００％ＤＭＳＯで１ｍＭに希釈し、５μＬの１０ｍＭ 化合物に４５μＬの１００％ＤＭＳＯを加え、化合物の希釈後の濃度は１ｍＭであり、最大濃度として３８４ウェルプレートの行Ａに入れる。
１）１０ｍＭ 被験化合物を１００％ＤＭＳＯで１ｍＭに希釈し、５μＬの１０ｍＭ 化合物に４５μＬの１００％ＤＭＳＯを加え、化合物の希釈後の濃度は１ｍＭであり、最大濃度として３８４ウェルプレートの行Ａに入れる。
２）３８４ウェルプレートの行Ｂから行Ｈまで２０μＬの１００％ＤＭＳＯを加える。
３）行Ａから５μＬの化合物を行Ｂに移して均一に混合し、また行Ｂから５μＬの化合物を行Ｃに移して均一に混合し、行Ｈまで前記ステップを繰り返して、化合物の段階希釈を完了する。
４）化合物作業溶液の調製：プレートの各ウェルから０．５μＬの化合物を新しい３８４ウェルプレートに移し、９．５μＬの１×分析緩衝液を加え、陽性対照ウェルは０．５μＬの１００％ＤＭＳＯに、９．５μＬの１×分析緩衝液を加える。
５）ブランク対照ウェルはＣＤＣ７／ＤＢＦ４酵素を加えないウェルで、陽性対照は１％ＤＭＳＯである。
３．反応手順
１）ＣＤＣ７／ＤＢＦ４酵素ストック溶液、基質ＰＤＫｔｉｄｅ、ＡＴＰストック溶液を氷の上で溶解し、実験中には前記試薬を始終氷の上に置く必要があり、未使用のストック溶液は、凍結と溶解の繰り返しを避けるために、分注して保存する必要がある。
１）ＣＤＣ７／ＤＢＦ４酵素ストック溶液、基質ＰＤＫｔｉｄｅ、ＡＴＰストック溶液を氷の上で溶解し、実験中には前記試薬を始終氷の上に置く必要があり、未使用のストック溶液は、凍結と溶解の繰り返しを避けるために、分注して保存する必要がある。
２）各ウェルから１μＬの化合物作業溶液を、３８４ウェルマイクロプレートに加え、陽性対照（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は各ウェルに１μＬの５％ＤＭＳＯを含有する１×分析緩衝液を加え、ブランク対照（Ｂｌａｎｋ）は各ウェルに１μＬの１×分析緩衝液を加える。
３）酵素が完全に溶解した後、１×分析緩衝液で酵素ストック溶液を３．１２５ｎｇ／μＬに希釈し、即ち、７μＬの酵素ストック溶液（１００ｎｇ／μＬ）を２１７μＬの１×分析緩衝液で希釈する。
４）各ウェルから２μＬの酵素溶液をマイクロプレートに加え、ブランク対照ウェルは各ウェルに２μＬの１×分析緩衝液を加え、この時に酵素量は１ウェル当たり６．２５ｎｇである。なお、当該ステップは氷の上で操作する必要がある。
５）１２２μＬの２×分析緩衝液と３．２μＬのＡＴＰ（２ｍＭ）の混合液を用いて、１２５μＬの基質ＰＤＫｔｉｄｅストック溶液を２倍希釈し、基質とＡＴＰの混合液を得てＡＴＰの濃度は２５μＭで、ＰＤＫｔｉｄｅの濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、基質とＡＴＰの混合溶液を、使用に備え氷の上に置く。
６）各ウェルから２μＬの基質とＡＴＰの混合溶液をマイクロプレートに移し、この時に基質の濃度は０．２ｍｇ／ｍＬで、ＡＴＰの濃度は１０μＭで、ＤＭＳＯの濃度は１％である。
７）フィルムでマイクロプレートを密封して、２５℃で、６０分間インキュベートする。
８）ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬及びキナーゼ検出液は、使用前に室温で平衡化する必要がある。
９）インキュベーションが終了した後、各ウェルから５μＬのＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）試薬をマイクロプレートに加え、フィルムでマイクロプレートを密封して、２５℃で４０分間インキュベートする。
１０）インキュベーションが終了した後、各ウェルから１０μＬのキナーゼ検出液をマイクロプレートに加え、フィルムでマイクロプレートを密封して、２５℃で３０分間イン
キュベートする。
キュベートする。
１１）インキュベーションが終了した後、Ｎｉｖｏを用いて発光を検出し、発光値（ＲＬＵ）を読み取る。
１２）酵素活性率の計算：
％酵素活性＝［（ＲＬＵ（化合物）－ＲＬＵ（ブランク））／（ＲＬＵ（陽性）－ＲＬＵ（ブランク））］×１００％。
％酵素活性＝［（ＲＬＵ（化合物）－ＲＬＵ（ブランク））／（ＲＬＵ（陽性）－ＲＬＵ（ブランク））］×１００％。
実験結果：
オリジナルデータから算式でパーセンテージ酵素活性率を計算し、次にＰｒｉｓｍで製図、統計し、化合物のＩＣ５０を計算し、結果は下表に示すとおりであった。
オリジナルデータから算式でパーセンテージ酵素活性率を計算し、次にＰｒｉｓｍで製図、統計し、化合物のＩＣ５０を計算し、結果は下表に示すとおりであった。
結論：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａは、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４酵素に対して強い阻害効果がある。
実施例１０：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａの細胞活性試験
本実験は、式（ＩＩ）化合物の結晶形ＡのＣｄｃ７が高発現される結腸直腸細胞ＣＯＬＯ２０５の増殖に対する阻害効果を研究する。
本実験は、式（ＩＩ）化合物の結晶形ＡのＣｄｃ７が高発現される結腸直腸細胞ＣＯＬＯ２０５の増殖に対する阻害効果を研究する。
試薬及び材料：
１）化合物情報
式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ
１）化合物情報
式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａ
２）主な装置
３）細胞情報
４）主な試薬及び材料
１６４０培地：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ペニシリン－ストレプトマイシン：普諾賽、０．２５％トリプシン：Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａ、ウシ胎児血清：Ｂ
ｉｏｓｅｒａ、ＤＭＳＯ：中国医薬グループ、９６ウェル細胞培養プレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ、９６ウェルプレート：上海晶饒生物科技有限公司、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ：Ｐｒｏｍｅｇａ、細胞ペトリ皿：耐思。
１６４０培地：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ペニシリン－ストレプトマイシン：普諾賽、０．２５％トリプシン：Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａ、ウシ胎児血清：Ｂ
ｉｏｓｅｒａ、ＤＭＳＯ：中国医薬グループ、９６ウェル細胞培養プレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ、９６ウェルプレート：上海晶饒生物科技有限公司、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ：Ｐｒｏｍｅｇａ、細胞ペトリ皿：耐思。
実験原理：
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光法細胞生存率検出キット）は、ＡＴＰの定量的な測定で培養物中の生細胞の生存率を検出する均一かつ速やかな検出方法である。ＡＴＰは生細胞の代謝の１つの指標である。細胞の溶解と生成する発光シグナルは、ＡＴＰの存在量に比例し、ＡＴＰの量は培養物中の生細胞数に比例する。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光法細胞生存率検出キット）は、ＡＴＰの定量的な測定で培養物中の生細胞の生存率を検出する均一かつ速やかな検出方法である。ＡＴＰは生細胞の代謝の１つの指標である。細胞の溶解と生成する発光シグナルは、ＡＴＰの存在量に比例し、ＡＴＰの量は培養物中の生細胞数に比例する。
実験方法：
１）細胞の継代
トリプシンを用いて８０～９０％融合している細胞を消化し、１ｍＬの培地で消化を停止した後、適切な比率で新しいペトリ皿に移し替え、ペトリ皿に１０ｍＬの新鮮な細胞培地を加え、細胞ペトリ皿を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて引き続き培養する。
１）細胞の継代
トリプシンを用いて８０～９０％融合している細胞を消化し、１ｍＬの培地で消化を停止した後、適切な比率で新しいペトリ皿に移し替え、ペトリ皿に１０ｍＬの新鮮な細胞培地を加え、細胞ペトリ皿を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて引き続き培養する。
２）化合物作業溶液の濃度の設定
化合物を１００％ＤＭＳＯで２ｍＭに希釈し、即ち、５μＬの１０ｍＭ 化合物ストック溶液を９６ウェルプレートの列１に入れ、また２０μＬの１００％ＤＭＳＯを加えて均一に混合し、９６ウェルプレートの列２から列９まで２０μＬの１００％ＤＭＳＯを加え、列１から１０μＬの化合物を列２に移して均一に混合し、また列２から１０μＬの化合物を列３に移して均一に混合し、列９まで前記ステップを繰り返して、化合物の段階希釈を完了する。化合物作業溶液の調製：プレートの各ウェルから２μＬの化合物を新しい９６ウェルプレートに移し、各ウェルに７８μＬの細胞培地を加える。陰性対照ウェルは２μＬの１００％ＤＭＳＯに、７８μＬの細胞培地を加え、化合物濃度は最終濃度で、ブランク対照ウェルは細胞のない培地ウェルで、陰性対照は０．５％ＤＭＳＯである。
化合物を１００％ＤＭＳＯで２ｍＭに希釈し、即ち、５μＬの１０ｍＭ 化合物ストック溶液を９６ウェルプレートの列１に入れ、また２０μＬの１００％ＤＭＳＯを加えて均一に混合し、９６ウェルプレートの列２から列９まで２０μＬの１００％ＤＭＳＯを加え、列１から１０μＬの化合物を列２に移して均一に混合し、また列２から１０μＬの化合物を列３に移して均一に混合し、列９まで前記ステップを繰り返して、化合物の段階希釈を完了する。化合物作業溶液の調製：プレートの各ウェルから２μＬの化合物を新しい９６ウェルプレートに移し、各ウェルに７８μＬの細胞培地を加える。陰性対照ウェルは２μＬの１００％ＤＭＳＯに、７８μＬの細胞培地を加え、化合物濃度は最終濃度で、ブランク対照ウェルは細胞のない培地ウェルで、陰性対照は０．５％ＤＭＳＯである。
３）細胞接種及び薬物処理
トリプシンを用いて８０～９０％融合しているＣＯＬＯ２０５細胞を消化し、消化された細胞をカウントし、カウント後、細胞培地を用いて細胞懸濁液を所定の密度に希釈し、細胞密度は下表に示すとおりである。各ウェルから８０μＬの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、一晩インキュベートする。実験日に、各ウェルから２０μＬの化合物作業溶液を細胞プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、引き続きインキュベートする。細胞播種密度及びインキュベーション日数の詳細は下表に示すとおりである。
トリプシンを用いて８０～９０％融合しているＣＯＬＯ２０５細胞を消化し、消化された細胞をカウントし、カウント後、細胞培地を用いて細胞懸濁液を所定の密度に希釈し、細胞密度は下表に示すとおりである。各ウェルから８０μＬの細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、一晩インキュベートする。実験日に、各ウェルから２０μＬの化合物作業溶液を細胞プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、引き続きインキュベートする。細胞播種密度及びインキュベーション日数の詳細は下表に示すとおりである。
インキュベーションが終了した後、細胞プレートの各ウェルに１００μＬのＣＴＧ検出試薬を加え、２５℃で１０分間インキュベートする。インキュベーションが終了した後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎを用いて発光シグナルを検出する。
実験結果：
測定した各群のシグナル値はいずれもバックグラウンドとしてのブランク対照ウェルのシグナル値を差し引いて正規化する。正規化後のデータは式：％阻害率＝［１－（ＲＦＵ化合物－ＲＦＵブランク対照）／（ＲＦＵ陽性対照－ＲＦＵブランク対照）］×１００％から化合物処理後の細胞生存率を計算する。ブランク対照：培地のみで細胞の処理はない。陽性対照：０．５％ＤＭＳＯで細胞を処理し、次にＰｒｉｓｍで製図して化合物のＩＣ５０値を計算する。
測定した各群のシグナル値はいずれもバックグラウンドとしてのブランク対照ウェルのシグナル値を差し引いて正規化する。正規化後のデータは式：％阻害率＝［１－（ＲＦＵ化合物－ＲＦＵブランク対照）／（ＲＦＵ陽性対照－ＲＦＵブランク対照）］×１００％から化合物処理後の細胞生存率を計算する。ブランク対照：培地のみで細胞の処理はない。陽性対照：０．５％ＤＭＳＯで細胞を処理し、次にＰｒｉｓｍで製図して化合物のＩＣ５０値を計算する。
オリジナルデータから算式でパーセンテージ阻害率を計算し、次にＰｒｉｓｍで製図、統計し、化合物のＩＣ５０を計算する。
式（ＩＩ）化合物の結晶形ＡのＣＯＬＯ２０５細胞の増殖に対する阻害効果のＩＣ５０は下表に示すとおりであった。
結論：式（ＩＩ）化合物の結晶形Ａは細胞ＣＯＬＯ２０５に対して強い阻害効果がある。
実施例１１：式（Ｉ）化合物の立体配置の検証
式（Ｉ）化合物の立体配置の検証はＸ線単結晶回折によって行われる。
式（Ｉ）化合物の立体配置の検証はＸ線単結晶回折によって行われる。
式（Ｉ）化合物の単結晶の製造：
２０ｍｇの式（Ｉ）化合物のサンプルを秤量して室温で１ｍＬのメタノール／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１：１）に溶解し、サンプル溶液を４ｍＬの半密閉サンプル瓶に入れて、室温でゆっくりと揮発させる。３日目に無色の柱状結晶を得て、Ｘ線単結晶構造解析に使用する。
２０ｍｇの式（Ｉ）化合物のサンプルを秤量して室温で１ｍＬのメタノール／メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１：１）に溶解し、サンプル溶液を４ｍＬの半密閉サンプル瓶に入れて、室温でゆっくりと揮発させる。３日目に無色の柱状結晶を得て、Ｘ線単結晶構造解析に使用する。
実験結果：式（Ｉ）化合物の立体的な分子モデルは図１２を参照し、Ｓ配置であった。式（Ｉ）化合物の結晶構造データ及びパラメータは表９、表１０、表１１及び表１２に示す。
Claims (14)
- 式（ＩＩ）化合物又はその結晶形。
- Ｘ線粉末回折パターンが２θ値１１．４６±０．２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含む請求項１に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。
- Ｘ線粉末回折パターンが２θ値１１．４６±０．２０°、１２．０６±０．２０°、１６．９６±０．２０°、１７．６０±０．２０°、１８．４８±０．２０°、１９．５５±０．２０°、２４．０３±０．２０°及び２５．１６±０．２０°における特徴的なピークを含み、又は、Ｘ線粉末回折パターンが２θ値６．４６°±０．２０°、９．３６°±０．２０°、１１．４６°±０．２０°、１２．０６°±０．２０°、１２．３９°±０．２０°、１２．８９°±０．２０°、１３．３７°±０．２０°、１３．８７°±０．２０°、１４．０９°±０．２０°、１６．１０°±０．２０°、１６．９６°±０．２０°、１７．１９°±０．２０°、１７．６０°±０．２０°、１８．４８°±０．２０°、１８．７５°±０．２０°、１９．３７°±０．２０°、１９．５５°±０．２０°、２１．２１°±０．２０°、２１．６５°±０．２０°、２２．３６°±０．２０°、２３．０６°±０．２０°、２３．４２°±０．２０°、２３．７４°±０．２０°、２４．０３°±０．２０°、２５．１６°±０．２０°、２５．４７°±０．２０°、２６．５９°±０．２０°、２７．３２°±０．２０°、２８．１１°±０．２０°、２８．７７°±０．２０°、２９．７３°±０．２０°、３１．８１°±０．２０°、３３．０９°±０．２０°、３３．８０°±０．２０°、３４．１９°±０．２０°、３５．４９°±０．２０°、３５．９９°±０．２０°、３７．６６°±０．２０°、３８．１４°±０．２０°、３８．７７°±０．２０°及び３９．３８°±０．２０°における特徴的なピークを含み、又は、下記のＸ線粉末回折パターンデータを有し、
典型的には、Ｘ線粉末回折パターンが図１に示すとおりである請求項２に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。 - ＤＳＣ曲線は２３０．７℃±３℃で１つの吸熱ピークの開始点があり、典型的には、ＤＳＣ曲線が図４に示すとおりである請求項２又は３に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。
- Ｘ線粉末回折パターンが２θ値５．８６±０．２０°、１７．６４±０．２０°及び２４．８９±０．２０°における特徴的なピークを含む請求項１に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。
- Ｘ線粉末回折パターンが２θ値５．８６±０．２０°、１０．１７±０．２０°、１１．７３±０．２０°、１５．８３±０．２０°、１７．６４±０．２０°、２３．５９±０．２０°、２４．８９±０．２０°及び２５．８０±０．２０°における特徴的なピークを含み、又は、Ｘ線粉末回折パターンが２θ値５．８６°±０．２０°、１０．１７°
±０．２０°、１１．７３°±０．２０°、１２．５７°±０．２０°、１４．１５°±０．２０°、１４．４０°±０．２０°、１５．２３°±０．２０°、１５．８３°±０．２０°、１６．２６°±０．２０°、１６．７１°±０．２０°、１７．６４°±０．２０°、１８．０４°±０．２０°、１８．７３°±０．２０°、１９．９９°±０．２０°、２０．５７°±０．２０°、２１．０８°±０．２０°、２３．５９°±０．２０°、２４．３６°±０．２０°、２４．８９°±０．２０°、２５．４１°±０．２０°、２５．８０°±０．２０°、２７．２０°±０．２０°、２７．９０°±０．２０°、２８．９０°±０．２０°、２９．３９°±０．２０°、２９．７０°±０．２０°、３０．５２°±０．２０°、３０．８１°±０．２０°、３１．９９°±０．２０°、３４．２９°±０．２０°、３５．８３°±０．２０°、３９．６４°±０．２０°、２８．９０°±０．２０°、２９．３９°±０．２０°、２９．７０°±０．２０°、３０．５２°±０．２０°、３０．８１°±０．２０°、３１．９９°±０．２０°、３４．２９°±０．２０°、３５．８３°±０．２０°及び３９．６４°±０．２０°における特徴的なピークを含み、又は、下記のＸ線粉末回折パターンデータを有し、
典型的には、Ｘ線粉末回折パターンが図２に示すとおりである請求項５に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。 - ＤＳＣ曲線は６５．１℃±３℃、１１３．７℃±３℃、２０８．８℃±３℃及び２２１．１℃±３℃で吸熱ピークの開始点があり、典型的には、ＤＳＣ曲線が図７に示すとおりである請求項５又は６に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。
- Ｘ線粉末回折パターンが２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°及び２２．１８±０．２０°における特徴的なピークを含む請求項１に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。
- Ｘ線粉末回折パターンが２θ値７．４０±０．２０°、１１．２１±０．２０°、１３．９５±０．２０°、１５．０１±０．２０°、１５．７２±０．２０°、２０．６１±０．２０°、２２．１８±０．２０°及び２３．８２±０．２０°における特徴的なピークを含み、又は、Ｘ線粉末回折パターンが２θ値７．４０°±０．２０°、１０．５０°±０．２０°、１１．２１°±０．２０°、１１．８１°±０．２０°、１３．０５°±０．２０°、１３．９５°±０．２０°、１５．０１°±０．２０°、１５．７２°、１６．２８°、１７．６４°、１８．３５°、１８．７３°、１９．５３°、２０．１４°、２０．６１°、２２．１８°、２２．５１°、２３．８２°、２４．３７°、２５．４９°、２６．３６°±０．２０°、２７．１９°±０．２０°、２８．９３°±０．２０°、３０．７０°±０．２０°、３１．６０°±０．２０°、３２．５０°±０．２０°及び３４．３３°±０．２０°における特徴的なピークを含み、又は、下記のＸ線粉末回折パターンデータを有し、
典型的には、Ｘ線粉末回折パターンが図３に示すとおりである請求項８に記載の式（ＩＩ
）化合物の結晶形。 - ＤＳＣ曲線は２１９．９℃±３℃で１つの吸熱ピークの開始点があり、典型的には、ＤＳＣ曲線が図９に示すとおりである請求項８又は９に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形。
- （１）以下に示される式（Ｉ）化合物とメタノールを混合するステップと、
（２）ステップ（１）の混合物にマレイン酸を加えるステップと、
（３）濾過し、乾燥して請求項２に記載の結晶形又は請求項８に記載の結晶形を得るステップと、
（４）請求項２に記載の結晶形とアセトニトリル及び水を混合し、固体が溶解した後、溶媒を揮発して乾固させて、請求項５に記載の結晶形を得るステップとを含む請求項１～１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形の製造方法。 - 請求項１～１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形を含み、前記請求項１～１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）化合物の結晶形は重量の５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める結晶組成物。
- 請求項１～１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）化合物又はその結晶形又は請求項１２に記載の結晶組成物と、任意に、薬学的に許容される添加物とを含む医薬組成物。
- Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患の予防又は治療における、又は、Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患を予防又は治療するための薬物の製造における請求項１～１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）化合物又はその結晶形、請求項１２に記載の結晶組成物又は請求項１３に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、前記Ｃｄｃ７キナーゼによって媒介される疾患は、腫瘍であり、より好ましくは、前記腫瘍は、結腸・直腸がん又は膵臓がんである使用。
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