KR20230116005A - Cdc7 억제제로 사용되는 염 형태 및 이의 결정 형태 - Google Patents

Cdc7 억제제로 사용되는 염 형태 및 이의 결정 형태 Download PDF

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Abstract

CDC7 억제제로 사용되는 염 형태 및 그 결정 형태가 개시되며, 구체적으로는 하기 화학식 II로 표시되는 화합물, 그 결정 형태, 이의 제조 방법 및 종양의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에 있어서의 적용이 개시됩니다.
[화학식 II]

Description

CDC7 억제제로 사용되는 염 형태 및 이의 결정 형태
본 개시 내용은 2020.11.30 출원된 PRC 국가지식재산국에 제출된 중국 특허 출원 번호 202011383418.7에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 전체적으로 참조로 여기에 포함된다.
본 발명은 약학 화학 분야에 관한 것으로, 특히 CDC7 억제제로서의 염 형태 및 이의 결정 형태에 관한 것이며, 보다 구체적으로 화학식 II의 화합물 및 이의 결정 형태, 상기 염 형태 및 결정 형태의 제조방법 및 종양 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
CDC7은 핵에서 ASK(DBF4로도 알려진 S기 키나제의 활성제)에 결합하는 세린/트레오닌 키나제이다. 한 측면에서, DNA 복제 개시제의 중요한 요소인 미니염색체 유지 단백질(MCM 단백질)을 인산화하여 복제 기점 복합체의 형성을 촉진하기 위해 MCM을 활성화한다. 또 다른 측면에서, 이는 또한 ATR/Chk1 경로에 참여하고 세포 주기 정지 및 DNA 복구를 촉진하기 위해 세포 주기의 S-기 체크포인트의 중요한 조절 인자로 작용한다. CDC7은 다양한 인간 종양 세포에서 비정상적으로 높게 발현되며, 이러한 비정상적으로 높은 발현은 종양 증식 및 전이뿐만 아니라 화학요법 약물에 대한 내성과 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 그러므로, CDC7은 이제 종양 연구에서 중요한 마커이자 표적이 되었다.
일 양상에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물을 제공한다.
[화학식 II]
또 다른 양상에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물의 결정 형태를 제공한다.
일 실시예에서, 화학식 II의 화합물의 결정 형태는 하기로 이루어진 군으로 부터 선택된다:
X선 분말 회절 패턴이 11.46 ± 0.20°, 24.03 ± 0.20° 및 25.16 ± 0.20 °의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A;
X선 분말 회절 패턴이 5.86 ± 0.20°, 17.64 ± 0.20° 및 24.89 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B; 및
X선 분말 회절 패턴이 7.40 ± 0.20°, 11.21 ± 0.20° 및 22.18 ± 0.20° 의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 X선 분말 회절 패턴이 11.46 ± 0.20°, 24.03 ± 0.20° 및 25.16 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A를 제공한다.
일 실시예에서, Cu Kα 방사선을 사용한 상기 결정 형태 A의 X선 분말 회절 패턴은 11.46 ± 0.20°, 24.03 ± 0.20° 및 25.16 ± 0.20°의 2θ 값에서 회절 피크를 갖는다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 X선 분말 회절 패턴은 11.46 ± 0.20°, 12.06 ± 0.20°, 16.96 ± 0.20°, 17.60 ± 0.20°, 18.48 ± 0.20°, 19.55 ± 0.20°, 24.03 ± 0.20° 및 25.16 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 X선 분말 회절 패턴은 6.46° ± 0.20 °, 9.36° ± 0.20°, 11.46° ± 0.20°, 12.06° ± 0.20°, 12.39° ± 0.20 °, 12.89° ± 0.20°, 13.37° ± 0.20°, 13.87° ± 0.20°, 14.09° ± 0.20 °, 16.10° ± 0.20°, 16.96° ± 0.20°, 17.19° ± 0.20°, 17.60° ± 0.20 °, 18.48° ± 0.20°, 18.75° ± 0.20°, 19.37° ± 0.20°, 19.55° ± 0.20 °, 21.21° ± 0.20°, 21.65° ± 0.20°, 22.36° ± 0.20°, 23.06° ± 0.20 °, 23.42° ± 0.20°, 23.74° ± 0.20°, 24.03° ± 0.20°, 25.16° ± 0.20 °, 25.47° ± 0.20°, 26.59° ± 0.20°, 27.32° ± 0.20°, 28.11° ± 0.20 °, 28.77° ± 0.20°, 29.73° ± 0.20°, 31.81° ± 0.20°, 33.09° ± 0.20 °, 33.80° ± 0.20°, 34.19° ± 0.20°, 35.49° ± 0.20°, 35.99° ± 0.20 °, 37.66° ± 0.20°, 38.14° ± 0.20°, 38.77° ± 0.20° 및 39.38° ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 X선 분말 회절 패턴은 6.46°, 9.36°, 11.46°, 12.06°, 12.39°, 12.89°, 13.37° , 13.87°, 14.09°, 16.10°, 16.96°, 17.19°, 17.60°, 18.48° , 18.75°, 19.37°, 19.55°, 21.21°, 21.65°, 22.36°, 23.06° , 23.42°, 23.74°, 24.03°, 25.16°, 25.47°, 26.59°, 27.32° , 28.11°, 28.77°, 29.73°, 31.81°, 33.09°, 33.80°, 34.19°, 35.49°, 35.99°, 37.66°, 38.14°, 38.77°및 39.38°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 X선 분말 회절 패턴은 도 1에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 X선 분말 회절 패턴은 하기 표 1에 개시되어 있다.
화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 XRPD 패턴 분석 데이터
번호 2θ 각도
(±0.2°)		 면간 간격 () 상대 강도 (%) 번호 2θ 각도
(±0.2°)		 면간 간격 () 상대 강도 (%)
1 6.46 13.69 4.02 22 23.42 3.80 6.95
2 9.36 9.45 11.84 23 23.74 3.75 10.34
3 11.46 7.72 50.71 24 24.03 3.70 100.00
4 12.06 7.34 22.16 25 25.16 3.54 29.42
5 12.39 7.14 4.33 26 25.47 3.50 5.01
6 12.89 6.87 3.05 27 26.59 3.35 1.75
7 13.37 6.62 7.19 28 27.32 3.26 6.12
8 13.87 6.39 6.58 29 28.11 3.17 5.99
9 14.09 6.29 6.09 30 28.77 3.10 2.43
10 16.10 5.51 5.75 31 29.73 3.01 2.79
11 16.96 5.23 15.15 32 31.81 2.81 2.39
12 17.19 5.16 14.98 33 33.09 2.71 1.82
13 17.60 5.04 15.82 34 33.80 2.65 1.63
14 18.48 4.80 18.58 35 34.19 2.62 2.12
15 18.75 4.73 5.85 36 35.49 2.53 1.08
16 19.37 4.58 11.94 37 35.99 2.50 1.06
17 19.55 4.54 13.94 38 37.66 2.39 1.81
18 21.21 4.19 9.40 39 38.14 2.36 0.74
19 21.65 4.11 6.66 40 38.77 2.32 1.55
20 22.36 3.98 6.35 41 39.38 2.29 1.41
21 23.06 3.86 6.57
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 DSC 곡선은 230.7℃ ± 3℃에서 흡열 피크 시작점을 갖는다.
일 실시예에서 , 상기 결정 형태 A의 DSC 프로파일은 도 4에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 TGA 곡선은 200.0℃ ± 3℃에서 0.94 ± 0.2%의 중량 손실을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 TGA 프로파일은 도 5에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 적외선 스펙트럼은 3033.88 cm-1 ± 5 cm-1, 3225.69 cm-1 ± 5 cm-1, 3087.88 cm-1 ± 5 cm-1, 2945.00 cm-1 ± 5 cm-1, 2925.62 cm-1 ± 5 cm-1, 2837.85 cm-1 ± 5 cm-1 , 1680.20 cm-1 ± 5 cm-1, 1662.75 cm-1 ± 5 cm-1, 1582.38 cm-1 ± 5 cm-1, 1551.77 cm-1 ± 5 cm-1, 1475.47 cm-1 ± 5 cm-1 및 1438.43 cm-1 ± 5 cm-1의 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 적외선 스펙트럼은 도 6에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 자외선 흡수 스펙트럼은 259.0 nm ± 3 nm, 214.4 nm ± 3 nm 및 322.6 nm ± 3 nm에서 특징적인 흡수 피크를 갖는다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 A의 자외선 흡수 스펙트럼은 도 11에 도시되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 5.86 ± 0.20°, 17.64 ± 0.20° 및 24.89 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 X선 분말 회절 패턴을 갖는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B를 제공한다.
일 실시예에서, Cu Kα 방사선을 사용한 상기 결정 형태 B의 X선 분말 회절 패턴은 5.86 ± 0.20°, 17.64 ± 0.20° 및 24.89 ± 0.20°의 2θ 값에서 회절 피크를 갖는다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 X선 분말 회절 패턴은 5.86 ± 0.20°, 10.17 ± 0.2 0°, 11.73 ± 0.20°, 15.83 ± 0.20°, 17.64 ± 0.20°, 23.59 ± 0.20°, 24.89 ± 0.20° 및 25.80 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함 한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 X선 분말 회절 패턴은 5.86° ± 0.20 °, 10.17° ± 0.20°, 11.73° ± 0.20°, 12.57° ± 0.20°, 14.15° ± 0.20 °, 14.40° ± 0.20°, 15.23° ± 0.20°, 15.83° ± 0.20°, 16.26° ± 0.20 °, 16.71° ± 0.20°, 17.64° ± 0.20°, 18.04° ± 0.20°, 18.73° ± 0.20 °, 19.99° ± 0.20°, 20.57° ± 0.20°, 21.08° ± 0.20°, 23.59° ± 0.20 °, 24.36° ± 0.20°, 24.89° ± 0.20°, 25.41° ± 0.20°, 25.80° ± 0.20 °, 27.20° ± 0.20°, 27.90° ± 0.20°, 28.90° ± 0.20°, 29.39° ± 0.20 °, 29.70° ± 0.20°, 30.52° ± 0.20°, 30.81° ± 0.20°, 31.99° ± 0.20 °, 34.29° ± 0.20°, 35.83° ± 0.20°, 39.64° ± 0.20°, 28.90° ± 0.20 °, 29.39° ± 0.20°, 29.70° ± 0.20°, 30.52° ± 0.20°, 30.81° ± 0.20 °, 31.99° ± 0.20°, 34.29° ± 0.20°, 35.83° ± 0.20° 및 39.64° ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 X선 분말 회절 패턴은 5.86°, 10.17°, 11.73°, 12.57°, 14.15°, 14.40°, 15.23 °, 15.83°, 16.26°, 16.71°, 17.64°, 18.04°, 18.73°, 19.99 °, 20.57°, 21.08°, 23.59°, 24.36°, 24.89°, 25.41°, 25.80 °, 27.20°, 27.90°, 28.90°, 29.39°, 29.70°, 30.52°, 30.81 °, 31.99°, 34.29°, 35.83°, 39.64°, 28.90°, 29.39°, 29.70°, 30.52°, 30.81°, 31.99°, 34.29°, 35.83° 및 39.64°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 X선 분말 회절 패턴은 도 2에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B의 X선 분말 회절 패턴은 하기 표 2에 개시되어 있다.
화학식 II의 화합물의 결정 형태 B의 XRPD 패턴 분석 데이터
번호 2θ 각도
(±0.2°)		 면간 각도 () 상대 강도 (%) 번호 2θ 각도
(±0.2°)		 면간 간격 () 상대 강도 (%)
1 5.86 15.09 91.11 22 27.20 3.28 5.62
2 10.17 8.70 45.62 23 27.90 3.20 5.66
3 11.73 7.55 22.38 24 28.90 3.09 7.73
4 12.57 7.04 4.09 25 29.39 3.04 4.33
5 14.15 6.26 13.40 26 29.70 3.01 7.45
6 14.40 6.15 16.28 27 30.52 2.93 4.19
7 15.23 5.82 4.48 28 30.81 2.90 4.70
8 15.83 5.60 16.95 29 31.99 2.80 2.25
9 16.26 5.45 5.96 30 34.29 2.61 3.87
10 16.71 5.30 9.51 31 35.83 2.51 4.54
11 17.64 5.03 100.00 32 39.64 2.27 4.83
12 18.04 4.92 10.69 33 28.90 3.09 7.73
13 18.73 4.74 8.44 34 29.39 3.04 4.33
14 19.99 4.44 5.96 35 29.70 3.01 7.45
15 20.57 4.32 2.74 36 30.52 2.93 4.19
16 21.08 4.21 4.51 37 30.81 2.90 4.70
17 23.59 3.77 45.03 38 31.99 2.80 2.25
18 24.36 3.65 4.48 39 34.29 2.61 3.87
19 24.89 3.58 55.05 40 35.83 2.51 4.54
20 25.41 3.51 26.82 41 39.64 2.27 4.83
21 25.80 3.45 22.73
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 DSC 곡선은 65.1℃ ± 3℃, 113.7℃ ± 3℃, 208.8℃ ± 3℃ 및 221.1℃ ± 3℃에서 흡열 피크 시작점을 갖는다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 프로파일은 도 7에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 TGA 곡선은 150.0℃ ± 3℃에서 3.58 ± 0.2%의 중량 손실을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 B의 TGA 프로파일은 도 8에 도시되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 7.40 ± 0.20 °, 11.21 ± 0.20° 및 22.18 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 X선 분말 회절 패턴을 갖는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C를 제공한다.
일 실시예에서, Cu Kα 방사선을 사용한 상기 결정 형태 C의 X선 분말 회절 패턴은 7.40 ± 0.20°, 11.21 ± 0.20° 및 22.18 ± 0.20°의 2θ 값에서 회절 피크를 갖는다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 X선 분말 회절 패턴은 7.40 ± 0.20°, 11.21 ± 0.20°, 13.95 ± 0.20°, 1 5.01 ± 0.20°, 15.72 ± 0.20°, 20.61 ± 0.20°, 22.18 ± 0.20 ° 및 23.82 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 X선 분말 회절 패턴은 7.40° ± 0.20 °, 10.50° ± 0.20°, 11.21° ± 0.20°, 11.81° ± 0.20°, 13.05° ± 0.20 °, 13.95° ± 0.20°, 15.01° ± 0.20°, 15.72° ± 0.20°, 16.28° ± 0.20 °, 17.64° ± 0.20°, 18.35° ± 0.20°, 18.73° ± 0.20°, 19.53° ± 0.20 °, 20.14° ± 0.20°, 20.61° ± 0.20°, 22.18° ± 0.20°, 22.51° ± 0.20 °, 23.82° ± 0.20°, 24.37° ± 0.20°, 25.49° ± 0.20°, 26.36° ± 0.20 °, 27.19° ± 0.20°, 28.93° ± 0.20°, 30.70° ± 0.20°, 31.60° ± 0.20 °, 32.50° ± 0.20° 및 34.33° ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함 한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 X선 분말 회절 패턴은 7.40°, 10.50°, 11.21°, 11.81°, 13.05°, 13.95°, 15.01°, 15.72°, 16.28°, 17.64°, 18.35 °, 18.73°, 19.53°, 20.14°, 20.61°, 22.18°, 22.51°, 23.82°, 24.37°, 25.49°, 26.36°, 27.19°, 28.93°, 30.70°, 31.60°, 32.50° 및 34.33°의 2 θ 값에서 특징적인 피크를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 X선 분말 회절 패턴은 도 3에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C의 X선 분말 회절 패턴은 하기 표 3에 개시되어 있다.
화학식 II의 화합물의 결정 형태 C의 XRPD 패턴 분석 데이터
번호 2θ 각도 (±0.2°) 면간 간격 () 상대 강도 (%) 번호 2θ 각도 (±0.2°) 면간 간격 () 상대 강도 (%)
1 7.40 11.94 57.67 15 20.61 4.31 29.68
2 10.50 8.43 9.35 16 22.18 4.01 80.86
3 11.21 7.90 100.00 17 22.51 3.95 20.92
4 11.81 7.49 8.63 18 23.82 3.74 39.44
5 13.05 6.79 3.42 19 24.37 3.65 4.57
6 13.95 6.35 46.42 20 25.49 3.49 17.03
7 15.01 5.90 31.30 21 26.36 3.38 3.79
8 15.72 5.64 38.00 22 27.19 3.28 17.79
9 16.28 5.45 13.70 23 28.93 3.09 11.30
10 17.64 5.03 19.39 24 30.70 2.91 3.90
11 18.35 4.84 12.39 25 31.60 2.83 2.44
12 18.73 4.74 18.09 26 32.50 2.75 3.43
13 19.53 4.55 7.13 27 34.33 2.61 3.67
14 20.14 4.41 2.40
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 DSC 곡선은 219.9℃ ± 3℃에서 흡열 피크 시작점을 갖는다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 DSC 프로파일은 도 9에 도시되어 있다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 TGA 곡선은 170.0℃ ± 3℃에서 0.72 ± 0.2%의 중량 손실을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 결정 형태 C의 TGA 프로파일은 도 10에 도시되어 있 다.
일 실시예에서, X선 분말 회절 패턴은 Cu Kα 방사선의 X선 분말 회절 패턴 이다.
본 명세서에서, 화학식 I의 화합물은 하기 나타낸 구조를 갖는다:
[화학식 I]
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 상기 기재된 화학식 II의 화합물의 결정 형태를 제조하는 방법을 제공한다:
(1) 하기 화학식 I의 화합물을 메탄올과 혼합하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 혼합물에 말레산을 첨가하는 단계;
(3) 여과 및 건조를 수행하여 상기 결정 형태 A 또는 결정 형태 C를 얻는 단계; 및
(4) 상기 결정 형태 A에 아세토니트릴 및 물과 혼합하고, 고체를 용해시킨 후 용매를 완전히 휘발시켜 결정 형태 B를 얻는 단계.
[화학식 I]
일 실시예에서, 상기 화학식 II의 화합물의 결정 형태의 제조 방법은 상기 결정 형태 A의 제조 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 상기 기재된 화학식 I의 화합물을 20-30℃에서 메탄올과 혼합하는 단계;
(2) 단계 (1)의 혼합물을 교반하면서 5℃로 냉각한 다음, 혼합물에 말레산을 첨가하고, 혼합물을 5-13℃에서 6시간 동안 교반하는 단계; 및
(3) 여과 및 건조를 수행하여 상기 결정 형태 A를 얻는 단계.
일 실시예에서, 상기 화학식 II의 화합물의 결정 형태의 제조 방법은 상기 결정 형태 B의 제조방법이고, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함한다: 상기 결정 형태 A에 아세토니트릴 및 물을 혼합하고, 고체를 용해시킨 후 용매를 40℃에서 완전히 휘발시켜 상기 결정 형태 B를 얻는 단계.
일 실시예에서, 상기 화학식 II의 화합물의 결정 형태의 제조 방법은 상기 결정 형태 C의 제조 방법이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 상기 화학식 I의 화합물을 20-30℃에서 메탄올과 혼합하는 단계;
(2) 75℃에서 교반하면서 단계 (1)의 혼합물에 말레산을 첨가하고, 혼합물을 75℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반하고, 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 혼합물을 2시간 동안 교반하는 단계;
(3) 여과 및 건조를 수행하여 상기 결정 형태 C를 얻는 단계.
또 다른 양상에서, 본 발명은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A, 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B 또는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C를 포함하는 결정성 조성물을 제공하며, 상기 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A, 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B 또는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C는 결정성 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 75 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상이다. 결정성 조성물은 또한 다른 결정 형태 또는 무정형 형태의 소량의 화학식 II의 화합물을 함유할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 및 임의로 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 CDC7 억제제를 제조하기 위한 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 CDC7 키나제 매개 질환 (예를 들어, 종양)을 예방 또는 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 또는 상기 결정성 조성물 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 CDC7 키나제 매개 질환을 예방 또는 치료하는데 있어서 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 또는 상기 결정성 조성물 또는 상기 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 CDC7 키나제 매개 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 또는 상기 결정성 조성물 또는 상기 기재된 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 CDC7 억제제로서 사용하기 위한 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 또는 상기 결정성 조성물 또는 상기 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 CDC7 키나제 매개 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제로 사용하기 위한 상기 화합물 또는 상기 결정 형태 또는 상기 결정성 조성물 또는 상기 약학 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, CDC7 키나제 매개 질환은 종양, 예를 들어 결장직장암 또는 췌장암이다.
일 실시예에서, CDC7 억제제는 종양 치료용 의약, 예를 들어 결장직장암 또는 췌장암 치료용 의약이다.
달리 명시되지 않는 한, 여기에서 사용되는 다음 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다. 특정 용어는 달리 구체적으로 정의되지 않는 한 불확실하거나 불분명한 것으로 간주되어서는 안 되며 해당 분야의 일반적인 의미에 따라 해석되어야 한다. 상표명을 언급할 때, 이는 해당 상업 제품 또는 활성 성분을 언급하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 용어 "포함하다(comprise)"라는 단어 및 "포함하 다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)" 또는 등가물과 같은 이의 변형은 개방적이고 비배타적인 의미로 이해되어야 한다. 나열된 요소, 구성 요소 및 절차, 기타 지정되지 않은 요소, 구성 요소 및 절차도 포함될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물은 특정 기하 이성질체 또는 입체 이성질체를 나타낼 수 있다. 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)-거울상 이성질체, (R)- 및 (S)-거울상 이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 및 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체가 풍부한 혼합물과 같은 라세미 혼합물 및 이들의 다른 혼합물, 이들 모두는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 알킬과 같은 치환체는 추가적인 비대칭 탄소 원자를 가질 수 있다. 이들 모든 이성질체 및 이들의 혼합물 은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
별도의 언급이 없는 한, "(D)" 또는 "(+)"는 우회전을, "(L)" 또는 "(-)"는 좌회전을, "(DL)" 또는 "(±)"는 라세미화를 나타낸다.
별도의 언급이 없는 한, 입체 중심의 절대 형태는 쐐기형 실선 결합( )과 쐐기형 파선 결합()으로 나타내고, 입체 중심의 상대적 배치 는 직선 실선 결합()과 직선 파선 결합으로 나타낸다(). 물결선()은 쐐기형 실선 결 합() 또는 쐐기형 파선 결합( )을 나타내고 물결선( )은 직선 실선 결합()과 직선 파선 결합()을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 용어 "약학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태로 허용됨을 의미한다. 본 명세서에 기재된 용어 "약학적으로 허용되는 첨가제"는 활성 성분의 투여를 용이하게 하기 위해 활성 성분과 함께 투여되는 불활성 물질을 말하며, 중화인민공화국 국가의약품관리국(PRC)의 허가를 받은 인간 또는 동물(예: 가축)에 사용할 수 있는 임의의 활택제, 감미료, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 향미증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 분해제, 현탁제, 안정제, 동위원소화제, 용제 또는 유화제를 의미한다. 첨가제의 제한없는 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 명세서에 기재된 용어 "약학 조성물"은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 화합물 또는 이의 결정 형태 및 약학적으로 허용되는 첨가제로 구성된 혼합물을 의미한다. 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 하기 위한 것이다.
본 명세서에 개시된 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 화합물 또는 이의 결정 형태를 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 조합하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 에멀젼, 현탁액, 좌약, 주사, 흡입제, 젤, 마이크로스피어 및 에어로졸과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물 또는 그의 결정 형태 또는 그의 약학 조성물의 전형적인 투여 경로는 경구, 직장, 국소, 흡입, 비경구, 설하, 질내, 비강내, 안구내, 복강내, 근육내, 피하 및 정맥내 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 약학 조성물은 종래의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분말화, 유화 및 동결건조와 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
일 실시예에서, 약학 조성물은 경구 형태이다. 경구 투여를 위해, 약학 조성물은 활성 화합물을 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 첨가제와 혼합하여 제형화될 수 있다. 첨가제는 본 명세서에 개시된 화합물이 환자에게 경구 투여하기 위한 정제, 알약, 향정, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화 될 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물 또는 그 결정 형태의 치료용 용량은, 예를 들어, 치료제의 구체적인 사용, 화합물의 투여 경로, 환자의 건강 및 상태 및 처방 의사의 판단에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물 또는 결정 형태의 비율 또는 농도는 용량, 화학적 특성(예: 소수성) 및 투여 경로를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에 개시된 용어 "치료"는 질병 또는 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선 또는 제거하기 위해 본 명세서에 개시된 화합물 또는 이의 결정 형태 또는 이의 약학 조성물을 투여하는 것을 의미하며, 다음을 포함한다:
(i) 질병 또는 질병 상태를 억제하는 것, 즉 발병을 억제하는 것; 및
(ii) 질병 또는 질병 상태를 완화하는 것, 즉 퇴행을 유발하는 것.
본 명세서에 개시된 용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 질병 또는 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하기 위해 본 명세서에 개시된 화합물 또는 그의 결정 형태 또는 그의 약학 조성물을 투여하는 것을 지칭하며, 포유류에서 질병 또는 질병 상태의 발생을 방지하는 것, 특히 그러한 포유류가 질병 상태에 걸리기 쉽지만 아직 그것을 가지고 있다고 진단되지 않았을 때를 포함한다.
포유류는 인간, 실험실 포유류 및 애완동물과 같은 가축(예: 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼)과 야생 포유류와 같이 길들여지지 않은 포유류가 포함된다.
약제 및 약학적으로 활성화된 약제에 대하여 "치료적 유효량"이라 함은 원하는 효과를 제공하기에 충분하고 독성이 없는 약제 또는 약제의 양을 의미한다. 유효량의 결정은 사람마다 다르다. 그것은 사용된 특정 활성 물질뿐만 아니라 대상의 나이와 일반적인 상태에 따라 다르다. 경우에 따라 적절한 유효량은 통상의 시험에 비추어 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 명확하게 명시되지 않은 한, 단수 용어는 복수의 용어를 포함하며, 그 반대도 마찬가지입니다.
본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 파라미터 값(2θ 값 및 반응 조건 포함)은 그 값에 존재하는 측정 오차 등을 반영하기 위해 "약"이라는 용어로 수식된 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 주어진 값에 ±5%의 오차가 있다.
모든 특허, 특허 출원 및 기타 확인된 출판물은 설명 및 공개를 목적으로 참조에 의해 본 문서에 명시적으로 포함된다. 이러한 간행물은 오직 본 발명의 출원일 이전에 공개되었기 때문에 제공된다. 이 문서의 날짜에 관한 모든 진술 또는 이 문서의 내용에 대한 설명은 신청자가 사용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 날짜 또는 이 문서의 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하지 않는다. 또한, 어떤 국가 또는 지역에서도 본 문서에 대한 언급은 해당 문서가 당 업계에서 일반적으로 인정 되는 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 중간 화합물은 하기에 열거된 특정 실시양태, 이들과 다른 화학적 합성 방법의 조합 에 의해 형성된 실시양태 및 당업자에게 공지된 그의 등가물을 포함 하여 당업자에게 잘 알려진 다양한 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 실시예들은 본 발명의 예들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 개시된 화합물은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 구조적으로 확인될 수 있다; 본 발명이 화합물의 절대 배열에 관한 것이라면, 이 절대 배열은 당업계의 통상적인 기술에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 단결정 X선 회절(SXRD) 방법에서, 성장된 단결정의 회절 강도 데이터는 Bruker D8 벤처 회절계로 수집되고, 광원은 Cu Kα 방사선이고, 스캔 모드는 Φ/스캔이고; 관련 데이터를 수집한 후 직접법(Shelxs97)을 추가로 사용하여 결정 구조를 분석하여 절대 구성을 확인할 수 있다.
본 발명의 실시예의 화학 반응은 본 발명의 화학 변화에 적합해야 하는 적절한 용매와 요구되는 시약 및 물질에서 수행된다. 본 명세서에 개시된 화합물을 얻기 위해서는, 당업자가 기존의 실시예에 기초하여 합성 절차 또는 반응 공정을 수정하거나 선택할 필요가 있는 경우가 있다.
본 발명은 어떤 식으로든 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌 실시예에 의해 아래에서 상세히 설명된다.
본 발명에 사용된 모든 용매는 상업적으로 이용 가능하며 추가 정제 없이 사용할 수 있다 .
본 발명에 사용된 용매는 상업적으로 입수가능하다.
본 발명은 하기 약어를 사용한다: DMF-DMA: N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈; DHP: 3,4-디하이드로피란; DMF: N,N-디메틸포름아미드; MeOH: 메탄올; THF: 테트라히드로푸란.
X선 분말 회절 패턴에서 피크의 위치 및 상대 강도는 측정 장비, 측정 방법/조건 및 기타 요인에 따라 달라질 수 있음을 유의해야 한다. 특정 결정 형태에 대해 피크의 위치는 오차가 있을 수 있으며 2θ의 측정은 ±0.2°의 오차가 있을 수 있다. 따라서 이러한 오차는 각각의 결정 형태를 결정할 때 고려되어야 하며, 이 오차 범위 내의 결정 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
단, 동일한 결정 형태라도 DSC(시차 주사 열량계) 패턴의 흡열 피크 위치는 측정기기, 측정 방법/조건 및 기타 요인에 따라 다를 수 있다. 특정 결정 형태에 대해 흡열 피크의 위치는 ±5 ℃ 또는 ±3 ℃의 오차를 가질 수 있다. 따라서 이러한 오차는 각각의 결정 형태를 결정할 때 고려되어야 하며, 이 오차 범위 내의 결정 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
단, 동일한 결정형이라도 측정기기, 측정방법/조건 등에 따라 TGA 패턴의 무게감소량과 온도가 다를 수 있음을 유의해야 한다. 특정 결정 형태의 경우 온도와 무게 손실 값에 오류가 있을 수 있다. 무게 손실 온도는 ±5 ℃의 오류가 있을 수 있고 무게 손실 값은 ±0.2%의 오류가 있을 수 있다. 따라서 이러한 오차는 각각의 결정 형태를 결정할 때 고려되어야 하며, 이 오차 범위 내의 결정 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
적외선 스펙트럼에서 피크의 위치는 측정 장비, 측정 방법/조건 및 기타 요인에 따라 다를 수 있다. 특정 결정 형태의 경우 피크 위치에 오차가 있을 수 있다. 피크 위치의 측정 오차는 ±5 cm-1일 수 있다. 따라서 이러한 오차는 각각의 결정 형태를 결정할 때 고려되어야 하며, 이 오차 범위 내의 결정 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
자외선 흡수 스펙트럼에서 피크의 위치는 측정기기, 측정 방법/조건 및 기타 요인에 따라 달라질 수 있음을 유의해야 한다. 임의의 특정 결정 형태에 대해 피크의 위치는 오차를 가질 수 있으며 파장은 ±5 nm 또는 ±3 nm의 측정 오차를 가질 수 있다. 따라서 이러한 오차는 각각의 결정 형태를 결정할 때 고려되어야 하며, 이 오차 범위 내의 결정 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 "실온"은 정상 온도, 일반적으로 20-30℃를 의미한다.
기기 및 분석 방법
1.1. X선 분말 회절(X-ray powder diffracto meter, XRPD)
기기 모델: PANalytical Inc.의 X'Pert3 X선 회절계
방법: XRPD 분석을 위해 약 10mg 샘플을 취한다.
XRPD 매개변수는 아래에 자세히 설명되어 있다.
X선관: Cu, kα(λ=1.54060Å)
X선관 전압: 45kV, X선관 전류: 40mA
발산 슬릿: 0.60mm
검출기 슬릿: 10.50mm
산란 방지 슬릿 : 7.10mm
스캔 범위: 3-40도
단계 크기: 0.0263도
단계 시간: 0.12초
샘플 트레이의 회전 속도: 15rpm
1.2. 시차 주사 열량계(시차 주사 열량계, DSC)
기기 모델: TA 2500 시차 주사 열량계
방법: 샘플(0.5-1 mg)을 취하여 분석을 위해 DSC 알루미늄 팬에 넣는다: 50 mL/min N2 하에서 샘플을 실온(25 ℃)에서 300 ℃ 또는 350 ℃로 10 ℃/분의 속도.
1.3 . 열중량 분석(열중량 분석기, TGA)
기기 모델: TA Q5500/Q5000 열중량 분석기
방법: 샘플(2-5 mg)을 취하여 분석을 위해 TGA 백금 팬에 넣는다: 25 mL/min N2 하에서 샘플을 10 ℃/분의 속도로 실온(25 ℃)에서 300 ℃ 또는 350 ℃로 가열하여 20%의 중량 손실을 만든다.
1.4. 흡습성의 판단 기준:
흡습성의 판단 기준
흡습성의 카테고리 흡습성 중량 증가*
조해 용액을 형성하기에 충분 한 물을 흡수
매우 흡습성 흡습성 체중 증가 ≥ 15 %
적당히 흡습성 2% ≤ 흡습성 중량 증가 < 15%
약간 흡습성 0.2% ≤ 흡습성 중량 증가 < 2%
비흡습성 또는 거의 흡습성 흡습성 중 량 증가 < 0.2%
*25 ℃/80% RH에서 흡습성 중량 증가.
1.5. 고성능 액체 크로마토그래피(고성능 액체 크로마토그래피 , HPLC)
기기 모델: Agilent 1200 고성능 액체 크로마토그래프
분석 방법은 다음과 같다.
유연물질의 함량을 결정하는 HPLC 분석방법
크로마토그래피 컬럼 Waters XBridge Shield RP1 8, 4.6Х150mm, 3.5μm
컬럼 온도 40 ℃
유량 1.0 mL/분
탐지기 DAD
검출 파장 220 nm
주 입량 5 μL
MPA 0.1%TFA in H2O, V/V
MPB 0.05%TFA in ACN, V/V
바늘 세척액 ACN:H2O=1:1, V/V
희석제 아세토니트릴 :0.1% 수성 트리플루오로아세트산 = 20:80, V/V
용출 프로그램 시간 (분) A (%) B (%)
0 100 0
5 100 0
25 20 80
30 20 80
31 100 0
40 100 0
본 명세서의 화합물 및 결정 형태의 제조 방법은 간단하며, 결정 형태가 비교적 안정하고 열 및 습도의 영향을 덜 받아 제제의 제조에 유리하다. 본 명세서에 개시된 화합물 및 이의 결정 형태는 CDC7에 대해 우수한 억제 활성을 갖는다: 이들은 효소 CDC7/DBF4에 대해 비교적 강한 억제 효과를 가지며, CDC7을 고발현하는 대장 세포 COLO205의 증식에 대한 억제 효과를 갖는다. 그러므로, 본 명세서에 개시된 화합물 및 결정 형태는 임상적으로 종양을 치료하는데 사용될 수 있는 가능성을 갖는 효과적인 신규 약물이다.
본 명세서에 개시된 결정 형태는 약제학적 활성, 흡습성, 안정성, 순도 및 제조 용이성 등의 측면에서 장점을 가지므로 의약품의 제조, 보관, 운반, 제조 등의 요건을 만족 시킬 수 있다.
도 1은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 XRPD 패턴을 나타낸다.
도 2는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B의 XRPD 패턴을 나타낸다.
도 3은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C의 XRPD 패턴을 나타낸다.
도 4는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 DSC 프로파일을 나타낸다.
도 5는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 TGA 프로파일을 나타낸다.
도 6은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B의 DSC 프로필을 나타낸다.
도 8은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B의 TGA 프로필을 나타낸다.
도 9는 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C의 DSC 프로파일을 나타낸다.
도 10은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C의 TGA 프로파일을 나타낸다.
도 11은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 화학식 I의 화합물의 3차원 구조의 타원체 플롯을 나타낸다.
본 개시내용은 실시예에 의해 하기에 상세히 기술된다. 그러나 이것이 본 발명의 범위를 불리하게 제한하는 것은 결코 아니다. 이상 본 명세서에서 본 발명을 상세하게 설명하고 특정 실시예를 개시하였지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위에서 특정 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 화학식 I의 화합물
단계 1: 중간체 1-B의 합성
DMF-DMA(19.05 mol, 1.0 eq, 2.53 L)를 실온에서 30 L 고온-저온 반응 케틀에 첨가하고, 출발 물질 1-A(2403.52 g, 19.05 mol, 1.0 eq)를 참가하였다. 반응은 약간 발열성이어서 반응 혼합물의 내부 온도가 35℃를 초과하지 않도록 적가 속도를 조절하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 85-90℃로 가열하고, 그 온도에서 3시간 동안 교반하고, 50-55℃로 냉각시켰다. 메탄올(2.4L)을 용매로 첨가한 후 히드라진 수화물(17.15mol, 순도 98%, 0.9 eq, 850mL)을 천천히 적가하였다. 반응은 발열 반응이므로 첨가 속도를 제어하여 범핑을 방지했다. 적가 후, 혼합물을 0.5시간 동안 50-60℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 -0.08MPa의 감압 하에 50℃에서 농축시켰다. 생성된 고체를 에틸 아세테이트(2.4L)로 분쇄하였다. 0.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 수집하였다. 여액을 감압하에 농축하여 조 생성물을 얻었다. 상기 조 생성물을 에틸 아세테이트(1.2L)로 분쇄하였다. 0.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고 필터 케이크를 수집하였다. 필터 케이크를 합하고 진공에서 -0.08MPa 하에 45-50℃에서 일정한 중량으로 건조시켜 1-B를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 151 (M+1); 1HNMR(DMSO-d 6,400MHz)δppm13.02(s,1H),7.82(s,1H),2.91-2.96(m,2H),2.56-2.61(m,2H),1.85-1.91(m,2H),1.78-1.84(m,2H).
단계 2: 중간체 1-C의 합성
디클로로메탄(11.07L)을 실온에서 50L 고온-저온 반응 케틀에 용매로 첨가하고, 중간체 1-B(2214.90g, 14.74mol, 1.0 eq) 및 N,N-디메틸포름아미드(3.40L, 44.23 mol, 3.0 eq)를 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 이어서 옥살릴 클로라이드(3.87 L, 44.23 mol, 3.0 eq)를 천천히 적가하고 반응 혼합물의 내부 온도가 30℃를 초과하지 않도록 첨가 속도를 조절하였다. 반응 혼합물을 20-30℃에서 12시간 동안 교반하고 -0.08 MPa의 감압 하에 40℃에서 농축 건조시켰다. 생성된 조 생성물을 실온에서 교반하면서 얼음물(22.14L)에 조금씩 첨가하였다. 0.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고, 물(2L × 3)로 세척하고, -0.08MPa 하에서 35-40℃에서 진공 건조하여 1-C를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 197 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6,400 MHz)δppm10.2(s,1H),8.03(s,1H),2.9-3.0(m,2H),2.6-2.6(m,2H),1.8-1.8(m,2H).
단계 3: 중간체 1-D의 합성
THF(14.65L)를 실온에서 50L 고온-저온 반응 케틀에 용매로 첨가하고, 중간체 1-C(2929.34g, 14.84mol, 1.0 eq) 및 진한 수산화암모늄(4.57L, 29.69mol, 2.0 eq)을 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 원소 요오드(7540.23 g, 29.69 mol, 2.0 eq)를 조금씩 천천히 첨가하고 반응 혼합물의 내부 온도가 35℃를 초과하지 않도록 적가 속도를 조절하였다. 반응 혼합물을 20-35℃에서 12시간 동안 교반하고 교반하면서 120L의 포화 아황산나트륨 수용액에 첨가하였다. 0.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 필터 케이크를 수집하고, 물(3L × 3)로 세척하고, 진공에서 -0.08MPa 하에 45-50℃에서 진공 건조하여 1-D를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 194 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6,400 MHz)δppm13.06-13.27(m,1H),7.71-8.11(m,1H),2.90-2.96(m,2H),2.67(m,2H),1.90(m,2H).
단계 4: 중간체 1-E의 합성
실온에서 THF(9.70L)를 50L 고온-저온 반응 케틀에 넣고 중간체 1-D(1.94kg, 9.82mol, 98.061% 순도, 1 eq)와 DHP(2.48kg, 29.47mol, 2.69 L, 3.0 eq, 1000 mL/min)을 순차적으로 반응 케틀에 첨가하였다. 반응 혼합물을 75-80℃에서 65시간 동안 교반하고 -0.08MPa의 감압 하에 50℃에서 농축하여 오일을 얻었다. DMF(15.90L)를 실온에서 50L 고온-저온 반응 케틀에 용매로 첨가하고 위에서 얻은 오일(3180.26g, 11.45mol, 1 eq), 머캅토아세트아미드(1252.14g, 13.74mol, 1.2 eq) 및 탄산칼륨(3323.28 kg, 24.05 mol, 2.1 eq)을 출발 물질로서 반응 케틀에 조금씩 순차적으로 첨가하였다. 반응은 발열적이지 않았다. 혼합물을 75-80℃에서 1시간 동안 반응시키고(시스템의 통로를 깨끗하게 유지하고 소량의 질소 흐름을 유지하고 일정한 교반을 보장했다. 기체 폐기물은 차아염소산나트륨 용액으로 흡수해야 하고 완충액은 기체 폐기물 흡수 설비와 반응 케틀 사이에 안전 병을 배치하였다) 실온으로 냉각하고 에틸 아세테이트(15.90L)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 160L의 물에 천천히 부었다. 첨가 후 현탁액을 얻었다. 현탁액을 실온에서 12시간 동안 교반한 다음 여과하고(고체 침전이 느림), 필터 케이크를 수집하고, 물(3L × 3)로 세척하고, 15.90L의 메탄올에 첨가하였다. 혼합물을 65-70℃에서 1시간 동안 교반하고 실온으로 냉각한 다음 여과하고 필터 케이크를 수집하고(순도가 충분하지 않으면 위의 정제 과정을 반복할 수 있음)진공에서 -0.08 MPa 하에 45-50 ℃에서 1-E를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 333 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6,400 MHz)δppm7.52-7.92(m,1H),6.62-6.89(m,2H),6.29-6.50(m,2H),5.22-5.52(m,1H),3.83-3.99(m,1H),3.55-3.70(m,1H),2.84-3.18(m,2H),2.60-2.71(m,2H),1.86-2.35(m,5H),1.43-1.75(m,3H).
단계 5: 중간체 1-G의 합성
출발 물질 1-F(906.50g, 4.73mol, 1 eq, HCl)를 실온에서 디클로로메탄(9.6L)에 첨가하고 옥살릴 클로라이드(331.13g, 2.61mol, 228.37mL, 5 eq)를 10℃ 내지 5℃에서 적가하였다. 이어서 혼합물을 72시간 동안 교반하고 감압하에 농축 건조시켰다. 5 L의 DCM을 첨가하고 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류 옥살릴 클로라이드를 제거하였다; 상기 과정을 한 번 반복했다. 생성된 1-G는 다음 단계에서 직접 사용되었다.
단계 6: 중간체 1-H의 합성
9.2 L의 디클로로메탄을 실온에서 30 L 고온-저온 반응 케틀에 첨가하고, 1-G(983.28 g, 4.68 mol, 1.7 eq, HCl)를 교반하면서 반응 케틀에 첨가하였다. 혼합물을 -20 내지 -15℃로 냉각시켰다. 1-E(920.19g, 2.77mol, 1 eq)를 반응 케틀에 조금씩 첨가하고 내부 온도를 -10℃ 미만으로 조절하였다. 혼합물을 -20 내지 -10℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 1-E 함량이 5% 미만인 것으로 나타났다. 트리에틸아민(192mL, 1.39mol, 0.5 eq)을 -20 내지 -10℃에서 반응 케틀에 적가하였다. 그런 다음 샘플을 채취하고 HPLC 분석에서 1-E 함량이 1% 미만인 것으로 나타났다. 나머지 트리에틸아민(960mL, 6.93mol, 2.5 eq)을 반응 케틀에 적가하였다. 혼합물을 감압하에 농축하고 생성된 고체(약 3kg)를 15L의 n-헵탄으로 분쇄하여 디클로로메탄을 제거하였다. 혼합물을 여과하고 고체를 수집하고 감압 하에 건조(45℃, -0.1 MPa)하여 1-H-M을 얻었다.
8.7L의 메탄올과 4.3L의 물(메탄올:물 = 2:1)을 고온-저온 반응 케틀에 넣고 수산화나트륨(1107.27g, 27.7mol, 10 eq)을 가한 후 50℃까지 온도를 올렸다. 건조된 1-H-M을 반응 케틀에 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 0.5시간 동안 교반한 후, HPLC 분석은 반응이 완료된 것으로 나타났다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 13L의 물을 첨가하였다. 혼합물을 0-5℃에서 0.5시간 동안 교반하고 여과하고 고체를 수집하였다. 여액을 6 N 염산으로 pH 7-8로 조정하고 감압하에 농축하여 대부분의 메탄올을 제거하였다. 10~15℃에서 2N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 10~11로 맞추니 많은 양의 고체가 침전되었다. 혼합물을 추가로 0.5시간 동안 교반하고 여과하고 필터 케이크를 수집하였다. 필터 케이크를 합치고 물(4L × 2)로 세척하였다. 여과 후, 필터 케이크를 감압(55℃ 및 -0.08MPa) 하에 건조시켜 1-H를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 452 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6+D2O, 400 MHz)δppm7.66-8.08(m,1H),5.30-5.43(m,1H),3.85-4.00(m,1H),3.55-3.76(m,3H),2.89-3.12(m,6H),2.74-2.87(m,1H),2.37-2.45(m,1H),2.05-2.22(m,1H),1.86-2.05(m,4H),1.76-1.84(m,1H),1.61-1.75(m,2H),1.60(brs,5H),1.28-1.41(m,1H).
단계 7: 중간체 1-I의 합성
1-H(1197.21g, 2.65mol, 1 eq)를 20-25℃에서 교반하면서 에틸 아세테이트(11.97L, 47.88mol, 18.1 eq) 중 염화수소의 4N 용액에 조금씩 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 10-15℃에서 0.5시간 동안 교반한 다음 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(1 L × 2)로 세척하고 감압 하에 건조시켰다(40-45℃, -0.1 MPa) 16시간 동안 1-I-M을 얻었다. 물(9.6L)과 메탄올(1.2L)의 혼합용매에 1-I-M을 가하고 진한 수산화암모늄으로 pH를 8-9로 조절하였다. 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고 여과하고 필터 케이크를 수집하고 물(5 L × 2)로 세척하였다. 여과 후, 필터 케이크를 수집하고 감압(55℃, -0.1 MPa) 하에 건조시켜 1-I를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 368 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6+D2O, 400 MHz)δppm7.46(s,1H),3.64-3.78(m,1H),2.89-3.03(m,5H),2.72-2.89(m,3H),2.30-2.36(m,1H),1.73-1.88(m,4H),1.35-1.54(m,4H).
단계 8: 화학식 I의 화합물 합성
첫 번째 해결 방법:
실온에서 30L 고온-저온 반응 케틀에 10.1L의 메탄올을 넣고 1-I(807.89g, 2.20mol, 1 eq)를 반응 케틀에 넣었다. 빙초산(4L) 및 물(404mL)을 교반하면서 차례로 첨가하였다. 반응기의 온도가 60℃에 도달하면 (+)-di-p-toluoyl-D-tartaric acid(374.59g, 0.97mmol, 0.44 eq)가 용해된 3.7L의 메탄올을 반응기에 나누어 투입하였다. 혼합물을 60-65℃에서 12시간 동안 교반하고, 10℃/30분의 속도로 20℃로 냉각한 다음, 여과하고, 필터 케이크를 메탄올(4.6L)로 세척하였다. 여과 후, 필터 케이크를 물(8L)과 메탄올(1L)의 혼합 용매에 분산시켰다. 혼합물을 진한 수산화암모늄으로 pH 8-9로 조정하고 0.5시간 동안 교반하고 여과하였다. 필터 케이크를 수집하고 분쇄에 의해 물로 2회 세척하였다. 여과 후, 필터 케이크를 수집하고 감압(55℃, -0.1 MPa) 하에 건조시켜 1-J-M1(89.116% ee)을 얻었다.
두 번째 해결 방법:
3.78 L의 메탄올 및 1-J-M1(302.67 g, 0.824 mol, 1 eq)을 실온에서 10 L 고온-저온 반응 케틀에 첨가하였다. 빙초산(1.5L) 및 물(151mL)을 교반하면서 첨가하였다. 반응기의 온도가 60℃에 도달하면 (+)-di-p-toluoyl-D-tartaric acid(273.67g, 0.708mmol, 0.86 eq)가 용해된 2.74L의 메탄올을 반응기에 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 소량의 질소 흐름 하에 60-65℃에서 12시간 동안 교반하고, 10℃/30분의 속도로 실온으로 냉각시킨 다음, 여과하고, 필터 케이크를 메탄올(3.2 L)로 분쇄화 하였다. 여과 후, 필터 케이크를 물(8.52L)과 메탄올(1.07L)의 혼합 용매에 분산시켰다. 혼합물을 진한 수산화암모늄으로 pH 8-9로 조정하고 0.5시간 동안 교반한 다음 여과하였다. 필터 케이크를 수집하고 물로 2회 세척하였다. 여과 후, 필터 케이크를 수집하고 감압 하에 건조(55℃, -0.1 MPa)하여 1-J-M2(98.040% ee)를 얻었다.
세 번째 해결 방법:
실온에서 10L 고온-저온 반응 케틀에 3.14L의 메탄올을 첨가하고, 반응 케틀에 1-J-M2(251.36g, 0.68mol, 1 eq)를 첨가하였다. 빙초산(1.25L) 및 물(125mL)을 교반하면서 차례로 첨가하였다. 반응기의 온도가 60℃에 도달하면 (+)-di-p-toluoyl-D-tartaric acid(239.22g, 0.62mmol, 0.91 eq)가 용해된 메탄올 2.39L를 한 번에 투입하였다. 반응 혼합물을 소량의 질소 흐름 하에 60-65℃에서 12시간 동안 교반하고, 10℃/30분의 속도로 실온으로 냉각시킨 다음, 여과하고, 필터 케이크를 메탄올(3 L)로 분쇄화 하였다. 여과 후, 필터 케이크를 물(4.8L)과 메탄올(0.6L)의 혼합 용매에 분산시켰다. 혼합물을 진한 수산화암모늄으로 pH 8-9로 조정하고 0.5시간 동안 교반하고 여과하였다. 필터 케이크를 수집하고 마쇄에 의해 물로 2회 세척하였다. 여과 후, 필터 케이크를 수집하고 감압 하에 건조(55℃, -0.1MPa)하여 화학식 I의 화합물(99.76% ee)을 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 368 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6, 400 MHz):δ(ppm)7.92(m,1H),3.86-3.92(m,1H),3.03-3.13(m,5H),2.82-2.92(m,1H),2.55-2.67(m,2H),2.29-2.39(m,1H),1.93-2.05(m,2H),1.83-1.92(m,1H),1.70-1.81(m,1H),1.50-1.62(m,2H),1.37-1.49(m,2H).
실시예 2: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A
실온에서 3L 반응 플라스크에 메탄올(1042mL)을 첨가한 후 화학식 I의 화합물(45.00g, 122.46mmol, 1 eq)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 5℃로 냉각시키고, 여기에 말레산(maleic acid)(21.32g, 183.69mol, 1.5 eq)을 첨가하였다. 혼합물을 5-13℃에서 6시간 동안 교반하고 여과하고 필터 케이크를 수집하고 메탄올(500 mL × 2)로 세척한 다음 감압 건조(45 ℃, -0.1 MPa)하여 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 368 (M+1); 1H NMR(중수, 400 MHz):δppm7.46(s,1H),6.16(s,2H),4.45-4.55(m,1H),3.64-3.81(m,1H),3.48-3.59(m,1H),3.34-3.47(m,2H),2.76-2.87(m,2H),2.65-2.76(m,2H),2.41-2.53(m,1H),2.26-2.37(m,1H),1.95-2.09(m,3H),1.85-1.95(m,2H),1.63-1.84(m,2H).
1H NMR 분석은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 염 형성수가 1임을 보여준다.
실시예 3: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B
화학식 II의 화합물 A의 결정형(60.91mg)을 칭량하고, 아세토니트릴(1mL)과 물(1mL)의 혼합물에 첨가하고, 고체를 교반하여 용해시켰다. 용매는 40℃에서 완전히 휘발되었고, 고체가 침전되었다. 고체를 수집하고 감압 하에 건조(55℃, -0.1MPa)하여 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 368 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6+D2O, 400 MHz):δppm7.85(s,1H),6.10(s,2H),4.60-4.64(m,1H),3.74-3.86(m,1H),3.38-3.52(m,1H),3.21-3.37(m,2H),3.04(brs,4H),2.37-2.47(m,1H),2.16-2.24(m,1H),2.02-2.12(m,1H),1.91-2.01(m,2H),1.87(brs,4H).
1H NMR 분석은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 B의 염 형성수가 1임을 보여준다.
실시예 4: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C
실온에서 화학식 I의 화합물(0.80137g, 2.18mmol, 1 eq)에 메탄올(56mL)을 첨가하고, 75℃에서 교반하면서 말레산(505.29mg, 4.35mmol, 2 eq)을 첨가했다. 혼합물을 75℃에서 0.5시간, 40℃에서 1시간 동안 교반하고, 25℃로 냉각하고, 추가로 2시간 동안 교반하고, 여과하였다. 고체를 모아 메탄올(10 mL × 2)로 세척하고 감압 건조(55 ℃, -0.1 MPa)하여 화학식 II의 화합물의 결정형 C를 얻었다. LCMS (ESI) m/z: 368 (M+1); 1H NMR(DMSO-d 6+D2O, 400 MHz):δppm7.92(s,1H),6.09(s,2H),4.62-4.64(m,1H),3.62-3.75(m,1H),3.39-3.54(m,1H),3.23-3.37(m,2H),3.04(brs,4H),2.37-2.48(m,1H),2.15-2.28(m,1H),2.02-2.14(m,1H),1.92-2.01(m,2H),1.87(brs,4H).
1H NMR 분석은 화학식 II의 화합물의 결정 형태 C의 염 형성수가 1임을 보여준다.
실시예 5: 화학식 II 화합물의 결정형 A에 대한 안정성 시험
순서
화학식 II의 화합물 A 결정형 50 mg을 측정하여 건조하고 깨끗한 유리병에 넣고 얇게 펴서 가속 조건(60℃, 25/92.5% RH, 40℃/75%RH 및 60℃/75%RH). 샘플을 완전히 노출시키고 구멍을 뚫은 알루미늄 호일로 병을 덮었다. 5일, 10일, 1개월, 2개월, 3개월에 샘플을 채취하여 분석하였다. 결과는 표 6에 나와 있다.
화학식 II 화합물의 결정형 A에 대한 안정성 시험
RRT 0.23 0.31 0.91 0.98 0.99 1.08 1.40 TRS(%) 모습 결정 형태 ee%
0 일 / 0.02 / / / / / / 하얀 고체 결정 형태A 99.028
60 ℃-5 일 0.03 0.03 / / / / / 0.06 하얀 고체 결정 형태A 98.632
60 ℃-10 일 0.02 0.03 / / / 0.05 / 0.10 하얀 고체 결정 형태A 98.900
25/92.5% RH-5 일 / 0.03 / / / / / 0.03 하얀 고체 결정 형태A 98.77
25/92.5% RH-10 일 / 0.03 / / / / 0.03 0.06 하얀 고체 결정 형태A 98.958
40 ℃/75% RH-10 일 0.02 0.02 / / / / / 0.04 하얀 고체 결정 형태 A 99.164
40 ℃/75% RH-1 달 / 0.02 / / / / / 0.02 하얀 고체 결정 형태 A 99.380
40 ℃/75% RH-2 달 / / 0.02 / / / / 0.02 하얀 고체 결정 형태A 100
40 ℃/75% RH-3 달 / / / / / / / 0 하얀 고체 결정 형태A 100
60 ℃/75% RH-10 일 0.03 / / / / / 0.03 하얀 고체 결정 형태 A 98.872
60 ℃/75% RH-1 달 0.02 / / 0.03 0.03 / 0.08 하얀 고체 결정 형태A 100
RRT: 상대 주요 피크 보유 시간; TRS: 총 불순물 함량; RH: 상대 습도; "/"는 감지할 수 없음을 나타낸다.
결론: 화학식 II의 화합물 결정형 A의 불순물 함량은 고온 및 고습 조건 하에서 실질적으로 변하지 않았으며 안정성이 양호하다.
실시예 6: 화학식 II 화합물의 결정 형태 A에 대한 흡습성 시험
방법:
뚜껑이 있는 건조 유리 칭량병을 하부에 포화 염화암모늄 용액을 넣은 건조기에 넣고 칭량병을 덮지 않은 상태로 두었다. 건조기에 뚜껑을 덮고 건조기를 25℃ 상자에 넣고 밤새 방치하였다. 하룻밤 방치한 후 칭량병을 꺼내어 정밀하게 칭량하여 m1로 하였다.
화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 적당량을 칭량하고 칭량된 측정 병(시료 두께 약 1mm)에 펼쳤다. 그런 다음 계량 병의 무게를 정밀하게 측정하고 그 무게를 m2로 표시했다.
칭량병을 뚜껑과 함께 포화 염화암모늄 용액이 있는 건조기에 넣고 하부에 놓고 뚜껑을 덮지 않은 상태로 두었습니다. 건조기에 뚜껑을 덮고 건조기를 25℃ 상자에 넣고 24시간 동안 방치하였다. 24시간 동안 방치한 후 칭량 병의 뚜껑을 닫고 병을 꺼내 정확히 무게를 m3로 한다.
흡습성 중량 증가는 다음 공식을 사용하여 계산되었다: 중량 증가 백분율 = 100% × (m3 - m2)/(m2 - m1).
실험 결과: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A는 0.18%(평균)의 중량 증가를 나타냈다.
결론: 화학식 II의 화합물 결정형 A의 평균 흡습성 값은 0.2% 미만이므로, 화학식 II의 화합물 결정형 A는 비흡습성 또는 난흡습성이다.
실시예 7: 화학식 II 화합물의 결정 형태 A에 대한 적외선 흡수 시험
기기: Thermo Fisher Nicolet iS5
방법: 감쇠전반사(ATR)
실험 결과: 화학식 II의 화합물 A 결정의 적외선 흡수 분광 분석 결과를 표 7에 나타내었다. 화학식 II의 화합물 A 결정의 적외선 흡수 스펙트럼을 도 6에 나타내었다.
화학식 II 화합물의 결정 형태 A의 적외선 흡수 분광 분석 결과
흡수 피크 파수(cm-1) 진동 종류 그룹 흡수 피크 강도
3225.69, 3033.88
2945.00, 2837.85		 NH, OH 신축 -NH, -OH s
2925.62, 3087.88 C-H 신축 -CH, -CH2,-CH3 s
1680.20, 1662.75 C-O 신축 C-O, -C=O s
1582.38 C=C 신축 벤젠고리 C=C s
1551.77 C=N 신축 C=N s
1475.47, 1438.43 CH2 신축 -CH2 s
결론: 테스트 화합물의 구조는 화학식 II 화합물의 결정 형태 A의 구조와 일치하는 -NH, -OH, 벤젠 고리, -CH2, -CH3, C-O, -C=O 및 -C=N과 같은 그룹을 포함한다.
실시예 8: 화학식 II 화합물의 결정형 A에 대한 자외선 흡수 시험
기기: Agilent G6860A 자외선-가시광선 분광광도계
실험 결과: 화학식 II 화합물의 결정 형태 A의 자외선 결과를 표 8에 나타내었다. 화학식 II 화합물의 결정 형태 A의 자외선 흡수 스펙트럼을 도 11에 나타내었다.
자외선 결과
용제 흡수 파장(nm) 흡광도(Abs)
H2O 259.0 1.158
214.4 1.356
322.6 0.983
분석적 결론: 시험 화합물은 방향족 고리의 B 밴드 및 R 밴드 흡수 피크인 λ = 259.0 nm, λ = 214.4 nm 및 λ = 322.6 nm에서 수중 자외선 흡수를 나타내어 구조에 방향족 고리가 포함되어 있음을 나타내고, 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 구조와 일치한다.실시예 9: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A에 대한 AKT 효소 활성 검정
CDC7 키나제는 DNA 복제 및 DNA 손상 반응의 개시에 중요한 역할을 한다. CDC7이 비정상적으로 많이 발현되면 CDC7-MCM2 신호경로 축의 비정상적 활성화로 인해 DNA가 비정상적으로 복제되고, DNA 손상 복구의 핵심 체크포인트 단백질인 CHK2와 MK2의 활성이 억제되어 아팝토시스가 억제되고 증식이 촉진되어 종양이 발생하게 된다.
원리:
ADP-Glo™ 키나제 분석은 화학발광 키나제 분석이다. 키나제와 기질의 반응은 에너지를 제공하기 위해 ATP를 필요로 하여 ATP를 ADP로 전환시킨다. 효소 활성은 반응에서 생성된 ADP의 양에 의해 반영된다. 분석에서 ADP는 ATP로 전환된 다음 ATP는 방출된 빛과 함께 Ultra-Glo™ Luciferase에 결합한다. 발광 강도는 ADP의 양에 정비례한다.
ADP-Glo™ 분석을 사용하여 CDC7/DBF4 키나제의 활성에 대한 화학식 II의 시험 화합물의 결정형 A의 억제 효과를 조사하였다. 시험 화합물의 최고 농도는 10μM이었고, 5배 연속 희석을 수행하여 8개의 농도 포인트를 얻었다. 화합물은 다른 날에 다시 테스트되었으며 각 테스트는 두 번 수행되었다.
시약 및 소모품:
주요 계기:
방법:
1. 솔루션 및 버퍼 준비
1) 10mM DTT의 조제(사용시 즉시 조제)
1μL의 0.1M DTT를 측정하고 9μL의 탈이온수를 첨가했다.
2) 2X 분석 버퍼(사용 시 즉시 준비)
168μL의 키나제 분석 완충액 III을 측정하고 248μL의 탈이온수로 2.5배 희석하고 4.2μL의 10mM DTT를 첨가했다. 버퍼는 사용하기 전에 얼음에 보관했다.
3) 1X 분석 버퍼(사용 시 즉시 준비)
250 μL의 2X 분석 완충액을 측정하고 250 μL의 탈이온수를 첨가하여 1X 분석 완충액으로 희석했다. 버퍼는 사용하기 전에 얼음에 보관했다.
4) ADP-Glo 키나제 분석
상기 키트에는 ADP-GloTM 시약, 키나제 분석 용액, 키나제 분석 용액 매트릭스 및 10mM ATP 저장 용액이 포함되어 있다.
키나제 분석 용액의 제조: 키나제 분석 완충액과 키나제 분석 용액 매트릭스를 실온으로 평형화한 다음 혼합하였다. 완전히 용해된 후 용액이 준비되었다. 사용하지 않은 용액은 분주하여 -20℃에서 보관해야 한다.
ADP-GloTM 시약: 처음 사용할 때 시약을 실온으로 평형화했다. 사용하지 않은 용액은 분주하여 -20°C에서 보관해야 한다.
2. 복합작동액 농도의 조제
1) 10mM 시험 화합물을 100% DMSO로 1mM로 희석하였다: 5μL의 10mM 시험 화합물을 45μL의 100% DMSO에 첨가하였다; 화합물 희석액의 농도는 1mM이었고, 희석액을 최고 농도로 384-웰 화합물 플레이트의 A행에 넣었다.
2) 384-웰 화합물 플레이트의 B행 내지 H행에 100% DMSO 20μL를 첨가하였다.
3) A행에서 5μL의 화합물을 B행으로 옮기고 잘 섞는다. 그런 다음 5 μL의 화합물을 행 B에서 행 C로 옮기고 혼합물을 잘 혼합했다. 이 절차를 행 H까지 반복하여 화합물의 연속 희석을 완료했다.
4) 복합 작업 용액의 준비: 0.5 μL/웰의 화합물을 새로운 384-웰 복합 플레이트로 옮기고 9.5 μL의 1X 분석 완충액을 첨가하였다. 양성 대조군 웰에 0.5μL의 100% DMSO를 첨가한 후 9.5μL의 1X 분석 완충액을 첨가했다.
5) 블랭크 대조군 웰은 CDC7/DBF4 효소가 첨가되지 않은 웰이었고, 양성 대조군은 1% DMSO였다
3. 반응 단계
1) CDC7/DBF4 효소 원액, 기질 PDKtide 및 ATP 원액은 얼음 위에서 해동시켰으며 실험 동안 얼음에 보관해야 한다. 사용하지 않은 원액은 분주하여 냉동과 해동을 반복하지 않도록 보관해야 합니다.
2) 384 마이크로플레이트에 1 μL/웰의 복합 작업 용액을 첨가하였다. 양성 대조군 웰에 5% DMSO를 함유하는 1X 검정 완충액 1 μL/웰을 첨가하였다. 블랭크 대조군 웰에 1× 검정 완충액 1 μL/웰을 첨가하였다.
3) 효소가 완전히 용해된 후 효소 원액을 1X 분석 완충액으로 3.125 ng/μL로 희석했습니다. 즉, 7 μL의 효소 원액(100 ng/μL)을 217 μL 1X 분석 버퍼로 희석하였다.
4) 마이크로플레이트에 2 μL/웰의 효소 용액을 첨가하였다. 블랭크 대조군 웰에 2 μL/웰의 1X 검정 완충액을 첨가하였다. 지금까지 효소 양은 6.25ng/웰이었다. 참고: 이 단계는 얼음 위에서 수행해야 한다.
5) 125μL의 기질 PDKtide 원액을 122μL의 2X 분석 완충액과 3.2μL의 ATP(2mM)의 혼합물로 2배 희석했다. 생성된 기질과 ATP의 혼합물에서 ATP 농도는 25μM이었고 PDKtide 농도는 0.5mg/mL이었다. 기질과 ATP의 혼합 용액은 사용하기 전에 얼음에 보관하였다.
6) 마이크로플레이트에 기질과 ATP의 혼합 용액을 2μL/웰씩 첨가하였다. 이제 기질 농도는 0.2 mg/mL, ATP 농도는 10 μM, DMSO 농도는 1%였다.
7) 마이크로플레이트를 멤브레인으로 밀봉하고 25 ℃에서 60분 동안 배양하였다.
8) ADP-Glo™ 시약과 키나제 분석 용액은 사용하기 전에 상온에서 평형을 이루어야 한다.
9) 배양 후 마이크로플레이트에 ADP-GloTM 시약 5 μL/웰을 첨가하고 마이크로플레이트를 멤브레인으로 밀봉한 후 25 ℃에서 40분 동안 배양하였다.
10) 배양 후 마이크로플레이트에 10 μL/웰의 키나제 분석 용액을 첨가하고 마이크로플레이트를 멤브레인으로 밀봉한 후 25℃에서 30분 동안 배양하였다.
11) 배양 후, Nivo에서 발광을 측정하고, 발광 판독(RLU)을 취하였다.
12) 효소활성율을 계산하였다:
% 효소 활성 = [(RLU(화합물) - RLU(블랭크)) / (RLU(양성) - RLU(블랭크))] × 100%
실험 결과
효소 활성 백분율은 계산 공식에 따라 원래 판독값에서 계산되었다. 그런 다음 프리즘을 사용하여 그래프를 플로팅하고 화합물의 IC50을 계산했다. 결과는 아래 표에 나와 있다.
결론: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A는 효소 CDC7/DBF4에 대해 비교적 강한 억제 효과를 갖는다.
실시예 10: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A에 대한 세포 생존능 검정
분석에서, CDC7을 고발현하는 결장직장 세포 COLO205의 증식에 대한 화학식 II의 화합물의 결정형 A의 억제 효과를 조사하였다.
시약 및 소모품:
1) 화합물
화학식 II의 화합물의 결정 형태 A.
2) 주요 기구
3)세포
4) 주요 시약 및 소모품
1640 배지, 생물 산업; 이중특이성 항체, Procell; 0.25% 판크레아틴, 베이스 미디어; 태아 소 혈청, Biosera; DMSO, 시노팜; 96-웰 세포 배양 플레이트, Corning; 96-웰 컴파운드 플레이트, Shanghai Jingrao Biotech Ltd.; CellTiter-Glo® 발광성 세포 생존능 분석, Promega; 세포 배양 접시, Nest.
원칙:
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay는 ATP 정량화를 통해 배양액에서 살아있는 세포의 생존력에 대한 균일하고 신속한 분석이다. ATP는 살아있는 세포의 대사 지표이다. 생성된 세포 용해 및 발광 신호는 존재하는 ATP의 양에 정비례하고, ATP의 양은 배양액에서 살아있는 세포의 수에 정비례한다.
방법:
1) 세포 통과
0%-90% 세포 융합을 달성한 세포를 판크레아틴으로 소화시켰다. 1 mL의 배양액으로 소화를 멈춘 후 세포를 적절한 비율에 따라 새 배양접시에 옮기고 10 mL의 신선한 세포배양액을 배양접시에 넣었다. 그런 다음 세포 배양 접시를 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣어 배양을 계속했다.
2) 복합작동액 농도의 조제
화합물을 100% DMSO로 2mM로 희석했다. 즉, 5μL의 10mM 화합물 스톡 용액을 96-웰 화합물 플레이트의 컬럼 1로 옮긴 다음 20μL의 100% DMSO를 첨가하고 혼합물을 잘 혼합했다. 96-웰 컴파운드 플레이트의 컬럼 2 내지 컬럼 9에 20 μL의 100% DMSO를 첨가하였다. 컬럼 1에서 10 μL의 화합물을 컬럼 2로 옮기고 혼합물을 잘 섞는다. 그런 다음 10 μL의 화합물을 컬럼 2에서 컬럼 3으로 옮기고 혼합물을 잘 섞는다. 이 절차를 컬럼 9까지 반복하여 화합물의 연속 희석을 완료했다. 복합 작업 용액의 준비: 복합 플레이트에서 2 μL/웰의 화합물을 새로운 96-웰 복합 플레이트로 옮기고 78 μL/웰의 세포 배양 배지를 첨가하였다. 음성 대조군 웰에 2 μL의 100% DMSO를 첨가한 다음 78 μL의 세포 배양 배지를 첨가했다. 화합물 농도가 최종 농도였다. 블랭크 대조군 웰은 세포를 포함하지 않는 배양 배지 웰이었다. 음성 대조군은 0.5% DMSO였다.
3) 세포 접종 및 약물 치료
80%-90% 세포 융합을 달성한 COLO205 세포를 판크레아틴으로 분해하고 계수하였다. 계수 후, 세포 현탁액을 원하는 밀도로 세포 배양 배지로 희석하였다. 셀 밀도는 아래 표에 나와 있다. 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 80 μL의 세포 현탁액을 접종하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에서 밤새 배양했다. 실험 당일, 20 μL의 복합 작업 용액을 세포 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 다른 시간 동안 인큐베이션하였다. 특정 세포 도말 밀도와 배양 일수는 아래 표에 나와 있다.
COLO205 세포의 도말 밀도 및 세포와 화합물의 공동 배양 기간
배양 후, 100 μL의 CTG 분석 시약을 세포 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 25℃에서 10분 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, Envision에서 발광 신호를 측정하였다.
실험 결과:
표준화를 위해 각 그룹의 측정된 신호 값에서 배경 블랭크 컨트롤 웰의 신호 값을 뺀다. 표준화된 데이터를 사용하여 다음 공식에 따라 화합물 처리 후 세포 생존율을 계산했다: %억제 = [1 - (RFU화합물 - RFU 블랭크 대조군) / (RFU양성 대조군 - RFU블랭크 대조군)] × 100%. 블랭크 대조군: 세포 없이 배양 배지만을 포함하는 처리. 양성 대조군: 0.5% DMSO로 처리된 세포; 그런 다음 프리즘을 사용하여 그래프를 플로팅하고 화합물의 IC50 값을 계산했다.
억제 백분율은 계산식에 따라 원래 판독값으로부터 계산되었다. 그런 다음 프리즘을 사용하여 그래프를 플로팅하고 화합물의 IC50을 계산했다.
COLO205 세포의 증식에 대한 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A의 억제 효과 IC50을 하기 표에 나타내었다.
결론: 화학식 II의 화합물의 결정 형태 A는 COLO205 세포에 대해 비교적 강한 억제 효과를 갖는다.
실시예 11: 화학식 I의 화합물의 입체 배열 확인
화학식 I의 화합물의 입체 배열은 단결정 X선 회절에 의해 확인되었다.
화학식 I의 화합물의 단결정의 제조:
화학식 I의 화합물의 20 mg 샘플을 측정하고 실온에서 1 mL의 메탄올/메틸 tert-부틸 에테르(1:1)에 용해시키고, 샘플 용액을 4 mL 반투명 용기에 넣어 용매가 실온에서 천천히 휘발될 수 있도록 하였다. 3일째에 무색의 주상 결정을 얻었고 그 구조를 단결정 X선 회절로 분석하였다.
실험 결과: 화학식 I의 화합물의 3차원 구조의 타원체 플롯을 도 12에 나타내었으며, S 구성을 나타낸다. 화학식 I의 화합물 결정의 구조 데이터 및 매개변수를 표 9, 10, 11 및 12에 나타내었다.
화학식 I의 화합물 결정의 구조 데이터 및 측정 파라미터
파라미터 화학식 I의 화합물의 결정
실험 단결정 X선 회절
분자 무게 367.47
온도 100.2(7)K
파장 1.54184Å
수정계·공간군 단사정(Monoclinic), P21
단위 셀 치수 a = 10.79027(8) Å
b = 7.07640(4) Å
c = 11.65192(13) Å
α = 90°
β = 107.4021(10)°
γ = 90°
용량 848.974(13) Å3
Z, 계산된 밀도 2, 1.437Mg/m3
흡수 계수 1.852mm-1
F(000) 388.0
결정의 치수 0.40 × 0.10 × 0.10 mm
데이터 수집을 위한 각도 범위 7.952 to 133.152°deg.
제한 지수 -12h 12, -8k 8, -13 l 11
리플렉션 수집/고유성 29867 / 2973 [R(int) = 0.0731]
화학식 I의 화합물 결정의 원자 좌표(×104) 및 등가 등방성 변위 파라미터(Å2×103)
x y z U(eq)
S(1) -9198.8(5) -2477.2(8) -9046.0(5) 13.62(17)
N(3) -9633.4(18) -2566(4) -12504.5(18) 14.5(4)
N(4) -7382.9(19) -2306(3) -11549.5(19) 15.4(5)
N(5) -6799.4(19) -2265(4) -13637.7(19) 15.7(5)
C(11) -9769(2) -2594(4) -11361(2) 13.3(5)
O(1) -6414.0(16) -2223(3) -9505.8(16) 18.2(4)
C(4) -11810(2) -2603(4) -9284(2) 13.5(5)
C(12) -8448(2) -2389(4) -12538(2) 14.8(5)
C(1) -7416(2) -2336(4) -10369(2) 14.4(5)
N(2) -13650(2) -2593(4) -8855(2) 16.4(5)
C(6) -13147(2) -2436(4) -9779(2) 14.3(5)
C(10) -10992(2) -2651(4) -11116(2) 13.4(5)
C(5) -11626(2) -2829(4) -8038(2) 16.0(6)
C(3) -10828(2) -2584(4) -9903(2) 14.0(5)
C(2) -8718(2) -2499(4) -10321(2) 14.2(5)
N(1) -12736(2) -2839(3) -7767(2) 18.8(5)
C(9) -12276(2) -2805(4) -12083(2) 16.6(6)
C(16) -7612(3) -1984(4) -15874(3) 21.4(6)
C(17) -6612(3) -1287(4) -14692(3) 21.3(6)
C(13) -8196(2) -2109(4) -13739(2) 15.3(6)
C(8) -13330(3) -1465(4) -11937(3) 16.9(6)
C(19) -6441(3) -4276(4) -13691(3) 18.5(6)
C(7) -14010(2) -2138(4) -11034(2) 17.4(6)
C(15) -8218(3) -3823(4) -15597(3) 18.7(6)
C(18) -7124(3) -5161(4) -14938(3) 22.3(6)
C(14) -9035(3) -3386(4) -14752(2) 17.1(6)
화학식 I의 화합물 결정의 결합 길이(Å) 및 결합각[deg]
결합 길이 결합 각도 결합 길이 결합 각도
S(1) C(3) 1.745(2) C(1) C(2) 1.428(3)
S(1) C(2) 1.714(2) N(2) C(6) 1.348(3)
N(3) C(11) 1.383(3) N(2) N(1) 1.365(3)
N(3)C(12) 1.297(3) C(6)C(7) 1.495(4)
N(4)C(12) 1.364(3) C(10)C(3) 1.372(4)
N(4)C(1) 1.387(3) C(10)C(9) 1.506(3)
N(5)C(17) 1.476(4) C(5)N(1) 1.327(4)
N(5)C(13) 1.480(3) C(9)C(8) 1.529(4)
N(5)C(19) 1.481(4) C(16)C(17) 1.554(4)
C(11)C(10) 1.432(3) C(16)C(15) 1.534(4)
C(11)C(2) 1.391(3) C(13)C(14) 1.546(4)
O(1)C(1) 1.240(3) C(8)C(7) 1.527(4)
C(4)C(6) 1.389(3) C(19)C(18) 1.551(4)
C(4)C(5) 1.414(4) C(15)C(18) 1.528(4)
C(4)C(3) 1.449(3) C(15)C(14) 1.537(4)
C(12)C(13) 1.517(4)
화학식 I의 화합물 결정의 비틀림각[deg]
N(3) C(11) C(10) C(3) -177.3(3) C(10) C(9) C(8) C(7) -80.2(3)
N(3) C(11) C(10) C(9) 3.8(5) C(5) C(4) C(6) N(2) -0.9(3)
N(3) C(11) C(2) S(1) 177.8(2) C(5) C(4) C(6) C(7) 178.9(3)
N(3) C(11) C(2) C(1) 1.0(4) C(5) C(4) C(3) S(1) -10.3(4)
N(3) C(12) C(13) N(5) -170.1(3) C(5) C(4) C(3) C(10) 169.2(3)
N(3) C(12) C(13) C(14) -42.4(4) C(3) S(1) C(2) C(11) -0.3(2)
N(4) C(12) C(13) N(5) 14.2(3) C(3) S(1) C(2) C(1) 176.4(3)
N(4) C(12) C(13) C(14) 141.8(3) C(3) C(4) C(6) N(2) 178.2(3)
N(4) C(1) C(2) S(1) -176.8(2) C(3) C(4) C(6) C(7) -2.0(6)
N(4) C(1) C(2) C(11) -0.4(4) C(3) C(4) C(5) N(1) -178.0(3)
N(5) C(13) C(14) C(15) -20.2(3) C(3) C(10) C(9) C(8) 46.5(4)
N(5) C(19) C(18) C(15) -14.7(3) C(2) S(1) C(3) C(4) -179.8(2)
C(11) N(3) C(12) N(4) 2.5(4) C(2) S(1) C(3) C(10) 0.6(2)
C(11) N(3) C(12) C(13) -172.8(2) C(2) C(11) C(10) C(3) 0.5(4)
C(11) C(10) C(3) S(1) -0.7(3) C(2) C(11) C(10) C(9) -178.4(2)
C(11) C(10) C(3) C(4) 179.8(3) N(1) N(2) C(6) C(4) 0.5(3)
C(11) C(10) C(9) C(8) -134.8(3) N(1) N(2) C(6) C(7) -179.3(2)
O(1) C(1) C(2) S(1) 2.9(5) C(9) C(10) C(3) S(1) 178.2(2)
O(1) C(1) C(2) C(11) 179.2(3) C(9) C(10) C(3) C(4) -1.4(5)
C(4) C(6) C(7) C(8) -15.4(5) C(9) C(8) C(7) C(6) 59.2(3)
C(4) C(5) N(1) N(2) -0.7(3) C(16) C(15) C(18) C(19) 67.0(3)
C(12) N(3) C(11) C(10) 175.7(3) C(16) C(15) C(14) C(13) -46.9(3)
C(12) N(3) C(11) C(2) -1.9(4) C(17) N(5) C(13) C(12) -159.0(2)
C(12) N(4) C(1) O(1) -178.7(3) C(17) N(5) C(13) C(14) 72.2(3)
C(12) N(4) C(1) C(2) 1.0(4) C(17) N(5) C(19) C(18) -50.5(3)
C(12) C(13) C(14) C(15) -148.1(2) C(17) C(16) C(15) C(18) -50.5(3)
C(1) N(4) C(12) N(3) -2.2(5) C(17) C(16) C(15) C(14) 66.9(3)
C(1) N(4) C(12) C(13) 173.2(2) C(13) N(5) C(17) C(16) -50.4(3)
N(2) C(6) C(7) C(8) 164.4(3) C(13) N(5) C(19) C(18) 65.8(3)
C(6) C(4) C(5) N(1) 1.0(3) C(19) N(5) C(17) C(16) 67.9(3)
C(6) C(4) C(3) S(1) 170.9(3) C(19) N(5) C(13) C(12) 83.8(3)
C(6) C(4) C(3) C(10) -9.6(5) C(19) N(5) C(13) C(14) -45.0(3)
C(6) N(2) N(1) C(5) 0.1(3) C(15) C(16) C(17) N(5) -15.2(3)
C(10) C(11) C(2) S(1) 0.0(3) C(18) C(15) C(14) C(13) 70.9(3)
C(10) C(11) C(2) C(1) -176.9(3) C(14) C(15) C(18) C(19) -51.0(3)

Claims (14)

  1. 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태:
    [화학식 II]
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴은 11.46 ± 0.20°, 24.03 ± 0.20° 및 25.16 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴은 11.46 ± 0.20°, 12.06 ± 0.20°, 16.96 ± 0.20°, 17.60 ± 0.20°, 18.48 ± 0.20°, 19.55 ± 0.20°, 24.03 ± 0.20° 및 25.16 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 가지거나; 6.46° ± 0.20°, 9.36° ± 0.20°, 11.46° ± 0.20°, 12.06° ± 0.20°, 12.39° ± 0.20°, 12.89° ± 0.20°, 13.37° ± 0.20°, 13.87° ± 0.20°, 14.09° ± 0.20°, 16.10° ± 0.20°, 16.96° ± 0.20°, 17.19° ± 0.20°, 17.60° ± 0.20°, 18.48° ± 0.20°, 18.75° ± 0.20°, 19.37° ± 0.20°, 19.55° ± 0.20°, 21.21° ± 0.20°, 21.65° ± 0.20°, 22.36° ± 0.20°, 23.06° ± 0.20°, 23.42° ± 0.20°, 23.74° ± 0.20°, 24.03° ± 0.20°, 25.16° ± 0.20°, 25.47° ± 0.20°, 26.59° ± 0.20°, 27.32° ± 0.20°, 28.11° ± 0.20°, 28.77° ± 0.20°, 29.73° ± 0.20°, 31.81° ± 0.20°, 33.09° ± 0.20°, 33.80° ± 0.20°, 34.19° ± 0.20°, 35.49° ± 0.20°, 35.99° ± 0.20°, 37.66° ± 0.20°, 38.14° ± 0.20°, 38.77° ± 0.20° 및 39.38° ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 가지거나; 다음의 X선 분말 회절 패턴 데이터를 갖으며, X선 분말 회절 패턴은 도 1에 도시된 것을 특징으로 하는 화학식 II 의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정 형태의 DSC 곡선이 230.7℃ ± 3℃에서 흡열 피크 시작점을 갖으며, 결정 형태의 DSC 프로파일은 도 4에 도시된 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴이 5.86 ± 0.20°, 17.64 ± 0.20° 및 24.89 ± 0.20의 2θ 값에서 특징적인 피크를 가지는 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴은 5.86 ± 0.20°, 10.17 ± 0.20°, 11.73 ± 0.20°, 15.83 ± 0.20°, 17.64 ± 0.20°, 23.59 ± 0.20°, 24.89 ± 0.20° 및 25.80 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 가지거나; 5.86° ± 0.20°, 10.17° ± 0.20°, 11.73° ± 0.20°, 12.57° ± 0.20°, 14.15° ± 0.20°, 14.40° ± 0.20°, 15.23° ± 0.20°, 15.83° ± 0.20°, 16.26° ± 0.20°, 16.71° ± 0.20°, 17.64° ± 0.20°, 18.04° ± 0.20°, 18.73° ± 0.20°, 19.99° ± 0.20°, 20.57° ± 0.20°, 21.08° ± 0.20°, 23.59° ± 0.20°, 24.36° ± 0.20°, 24.89° ± 0.20°, 25.41° ± 0.20°, 25.80° ± 0.20°, 27.20° ± 0.20°, 27.90° ± 0.20°, 28.90° ± 0.20°, 29.39° ± 0.20°, 29.70° ± 0.20°, 30.52° ± 0.20°, 30.81° ± 0.20°, 31.99° ± 0.20°, 34.29° ± 0.20°, 35.83° ± 0.20°, 39.64° ± 0.20°, 28.90° ± 0.20°, 29.39° ± 0.20°, 29.70° ± 0.20°, 30.52° ± 0.20°, 30.81° ± 0.20°, 31.99° ± 0.20°, 34.29° ± 0.20°, 35.83° ± 0.20° 및 39.64° ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 가지거나; 다음의 X선 분말 회절 패턴 데이터를 갖으며, X선 분말 회절 패턴은 도 2에 도시된 것을 특징으로 하는 화학식 II 의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  7. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정 형태의 DSC 곡선이 65.1℃±3℃, 113.7℃±3℃, 208.8℃ ± 3℃ 및 221.1℃ ± 3℃ 에서 흡열 피크 시작점을 갖으며, 결정 형태의 DSC 프로파일은 도 7에 도시된 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴이 7.40 ± 0.20°, 11.21 ± 0.20° 및 22.18 ± 0.20 °의 2θ 값에서 특징적인 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 결정 형태의 X선 분말 회절 패턴이 7.40 ± 0.20°, 11.21 ± 0.20°, 13.95 ± 0.20°, 15.01 ± 0.20°, 15.72 ± 0.20°, 20.61 ± 0.20°, 22.18 ± 0.20° 및 23.82 ± 0.20°의 2θ 값에서 특징적인 피크를 가지거나; 7.40° ± 0.20°, 10.50° ± 0.20°, 11.21° ± 0.20°, 11.81° ± 0.20°, 13.05° ± 0.20°, 13.95° ± 0.20°, 15.01° ± 0.20°, 15.72°, 16.28°, 17.64°, 18.35°, 18.73°, 19.53°, 20.14°, 20.61°, 22.18°, 22.51°, 23.82°, 24.37 °, 25.49°, 26.36° ± 0.20°, 27.19° ± 0.20°, 28.93° ± 0.20°, 30.70° ± 0.20°, 31.60° ± 0.20°, 32.50° ± 0.20° 및 34.33° ± 0.20°의 2θ 값 에서 특징적인 피크를 가지거나; 다음의 X선 분말 회절 패턴 데이터를 갖으며, X선 분말 회절 패턴은 도 3에 도시된 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  10. 제8항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정 형태의 DSC 곡선이 219.9℃ ± 3℃에서 흡열 피크 시작점을 갖으며, 결정 형태의 DSC 프로파일은 도 9에 도시된 것을 특징으로 하는 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화학식 II 화합물의 결정 형태 제조방법으로서, 상기 제조방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 II 화합물의 결정 형태 제조방법:
    (1) 하기 화학식 I의 화합물을 메탄올과 혼합하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 혼합물에 말레산을 첨가하는 단계;
    (3) 여과 및 건조를 수행하여 제2항에 따른 결정 형태 또는 제8항에 따른 결정 형태를 얻는 단계; 및
    (4) 제2항에 따른 결정 형태를 아세토니트릴 및 물과 혼합하고, 고체를 용해시킨 후 용매를 완전히 휘발시켜 제5항에 따른 결정 형태를 얻는 단계.
    [화학식 1]
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화학식 II 화합물의 결정 형태를 포함하는 결정성 조성물로서, 상기 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화학식 II 화합물의 결정 형태는 결정성 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 75 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 결정성 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화학식 II의 화합물 또는 그의 결정 형태 또는 제12항에 따른 결정성 조성물 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화학식 II의 화합물 또는 이의 결정 형태, 제12항에 따른 결정성 조성물 또는 제13항에 따른 약학 조성물의 CDC7 키나제 매개 질환을 예방 또는 치료하거나 CDC7 키나제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 용도로서, 상기 CDC7 키나제 매개 질환은 바람직하게는 종양이고; 보다 바람직하게는 종양은 결장직장암 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 CDC7 키나제 매개 질환을 예방 또는 치료하거나 CDC7 키나제 매개 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.



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